RU2144959C1 - Ферментативный гидролиз 4-метилтиобутиронитрилов - Google Patents
Ферментативный гидролиз 4-метилтиобутиронитрилов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2144959C1 RU2144959C1 RU97106337/13A RU97106337A RU2144959C1 RU 2144959 C1 RU2144959 C1 RU 2144959C1 RU 97106337/13 A RU97106337/13 A RU 97106337/13A RU 97106337 A RU97106337 A RU 97106337A RU 2144959 C1 RU2144959 C1 RU 2144959C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydrolysis
- mmol
- nitrile
- nitrilase
- concentration
- Prior art date
Links
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 title abstract 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 title abstract 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 30
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 claims abstract description 11
- -1 α-substituted 4-methylthiobutyronitrile Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 claims abstract description 9
- OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N pentanethioic s-acid Chemical class CCCCC(S)=O OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanenitrile Chemical group CSCCC(O)C#N VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 241000203751 Gordonia <actinomycete> Species 0.000 claims description 2
- UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N tetrachlorvinphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(=C/Cl)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N 0.000 claims description 2
- JPWPMBYFDCHLKL-UHFFFAOYSA-N 4-methylthiobutyronitrile Natural products CSCCCC#N JPWPMBYFDCHLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000203747 Gordonia terrae Species 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N mandelonitrile Chemical compound N#CC(O)C1=CC=CC=C1 NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-N (R)-mandelic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 3
- DTSSQKXKIMHICE-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethylsulfanyl)butanenitrile Chemical compound CCC(C#N)SCO DTSSQKXKIMHICE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 2
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- LWHSDXDOXPZZSD-UHFFFAOYSA-N azanium;4-hydroxy-2-methylbutanethioate Chemical compound [NH4+].[O-]C(=S)C(C)CCO LWHSDXDOXPZZSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 2
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- MWLKEJXYXYRWIH-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CSCCC(N)C#N MWLKEJXYXYRWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AANFRDGJHYLLAE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypentanenitrile Chemical compound CCCC(O)C#N AANFRDGJHYLLAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000588810 Alcaligenes sp. Species 0.000 description 1
- 241001118187 Alcaligenes sp. BC Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- RENMDAKOXSCIGH-UHFFFAOYSA-N Chloroacetonitrile Chemical compound ClCC#N RENMDAKOXSCIGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000131747 Exiguobacterium acetylicum Species 0.000 description 1
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzenecarboxaldehyde Natural products O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002560 nitrile group Chemical group 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Способ ферментативного гидролиза 4-метилтиобутиронитрилов до рацемических 4-метилтиобутановых кислот осуществляют с помощью нитрилазы из Alcaligenes faccalis АТСС-8750, или Rhodococcus sp. НТ 29-7 FЕRМ-3857, или Gordona terrae FERM ВР-4535. Процесс ведут при рН 4-11 и 30-60°С. Концентрация субстрата -α- замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 10-400 ммоль/л, предпочтительно 50 - 200 ммоль/л. Процесс гидролиза протекает без какой-либо селективности в отношении энантиомеров. 5 з.п.ф-лы, 1 ил. 17 табл.
Description
Изобретение относится к использованию нитрилазы в качестве катализатора гидролиза нитрильной группы до карбоксильной группы. Более конкретно оно относится к использованию нитрилазы, выбираемой из нитрилаз микроорганизмов вида Alcaligenes, Rhodococcus или Gordona, и более конкретно Alcaligenes faecalis, депонированного под номером АТСС 8750, Rhodococcus р. HT 29-7, депонированного под номером FERM ВР-3857, или Gordona terrae MA-1, депонированного под номером FERM ВР-4535.
Нитрилаза Alcaligenes faecalis описывается, например, в европейском и японском патентах, опубликованных под соответствующими номерами EP 348 901 и JP 03 224 496, причем оба патента принадлежат фирме Асахи. В этих патентах, в частности в европейском патенте, нитрилазу используют для получения из рацемических нитрилов оптически активных кислот. Предпочтительные исходные нитрилы замещены в α-положении и включают алкильную цепь, содержащую предпочтительно 1-3 атома углерода, или ароматический радикал. В примере 11 вышеуказанного европейского патента описывается гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты с помощью Alcaligenes faecalis: R - (-)-миндальную кислоту получают с избытком энантиомера равным 91%. В европейском патенте 486 289 и в соответствующем ему американском патенте США 5 326 702 фирмы NITTO CHEMICAI описывается использование Alcaligenes sp.BC 35-2 (FERM N 11265 или FERM-BP-3318) для гидролиза нитрила миндальной кислоты в присутствии сульфита; в этом случае миндальную кислоту получают с избытком одного энантиомера около 98%.
В патенте Японии JP 04 341 185 фирмы Асахи описывается получение и использование нитрилазы Alcaligenes faecalis АТСС 8750 для решения проблем получения оптически чистых соединений из их рацемических нитрилов. Селективная в отношении одного из энантиомеров нитрилаза, описываемая в вышеуказанном патенте Японии, предпочтительно гидролизует 2-гидроксинитрил следующей ниже общей формулы (I) до 2-гидроксикарбоновой кислоты формулы (II);
в которых R означает возможно замещенную арильную группу или возможно замещенную гетероциклическую группу. В этом патенте указывается, что гидролиз нитрила миндальной кислоты с помощью вышеуказанной нитрилазы позволяет получать 100 % избытка одного энантиомера в виде R-(-)-миндальной кислоты. В примере 5 указывается, что вышеуказанную нитрилазу можно использовать для гидролиза алифатических нитрилов, как валеронитрил, акрилонитрил, 2-галогенпропионитрилы, хлорацетонитрил. Однако, здесь ничего не говорится об энантиоселективности этого гидролиза в отношении алифатических нитрилов, обладающих асимметрическим центром.
в которых R означает возможно замещенную арильную группу или возможно замещенную гетероциклическую группу. В этом патенте указывается, что гидролиз нитрила миндальной кислоты с помощью вышеуказанной нитрилазы позволяет получать 100 % избытка одного энантиомера в виде R-(-)-миндальной кислоты. В примере 5 указывается, что вышеуказанную нитрилазу можно использовать для гидролиза алифатических нитрилов, как валеронитрил, акрилонитрил, 2-галогенпропионитрилы, хлорацетонитрил. Однако, здесь ничего не говорится об энантиоселективности этого гидролиза в отношении алифатических нитрилов, обладающих асимметрическим центром.
В тексте этого патента также уточняется, что нитрилаза Alcaligenes faecalis обладает оптимальной активностью при pH-значении от 6,5 до 8,0; температура использования вышеуказанного фермента, согласно этой ссылке, всегда должна быть ниже 45oC.
Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Alcaligenes faecalis АТСС 8750 использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении оптически чистых изомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без всякого предпочтения в отношении того или другого из изомеров.
Нитрилаза Rhodococcus sp. HT 29-7, депонированная под номером FERM BP-3857, описывается, например, в европейском и американском патентах, опубликованных под соответствующими номерами ЕР 610 049 и США 5 296 373, причем оба принадлежат фирме NITTO.
Согласно этим патентам, и в частности патенту США, нитрилазу используют для получения оптически активных кислот из рацемических нитрилов, содержащих фенильную группу. Все исходные нитрилы содержат ароматический радикал, причем речь идет по существу о гидролизе нитрила миндальной кислоты или его производных, замещенных в ароматическом ядре. В примере 1 вышеуказанного патента США описывается гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты с помощью Rhodococcus sp. HT 29-7, причем R (-)-миндальную кислоту получают с избытком энантиомера 100%. В примере 2 описывается гидролиз замещенных в ароматическом ядре производных нитрила миндальной кислоты, причем избыток одного из энантиомеров производного миндальной кислоты также составляет 100%; то же самое наблюдают, когда проводят гидролиз нитрилов бензальдегида.
В европейском патенте 610 049 фирмы NITTO CHEMICAL описывается использование Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM ВР-3857), Alcaligenes sp. BC 35-2 (FERM ВР-3318) или Brevibacterium acetylicum IAM 1790 для гидролиза α-гидроксинитрилов, замещенных в гамма-положении ароматическим ядром, до оптически активной α-гидроксикарбоновой кислоты, замещенной фенильной группой. Получаемые с помощью Rhodococcus sp. HT 29-7 кислоты всегда содержат избыток одного энантиомера, изменяющийся в зависимости от исходного нитрила и в зависимости от присутствия или отсутствия фосфорной кислоты (pH среды около 8,2).
Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM ВР-3857) использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без всякой селективности в отношении энантиомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного образования того или другого из изомеров.
Нитрилаза Gordona terrae МА-1, депонированная под номером FERM ВР-4535, описывается в европейском патенте 610 048 для гидролиза нитрилов, содержащих в гамма-положении фенильную группу и в альфа-положении гидроксильную группу, до соответствующей оптически активной кислоты. Избыток одного энантиомера во всех примерах составляет от 92% до 100%.
Совершенно неожиданно обнаружено, что если вышеуказанный фермент Gordona terrae МА-1 использовать для гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила, то этот гидролиз протекает без какой-либо селективности в отношении энантиомеров. Этот фермент гидролизует вышеуказанный нитрил с образованием рацемической смеси двух кислот без предпочтительного получения того или другого из изомеров.
Настоящее изобретение относится к способу получения рацемических альфа-замещенных 4-метилтиобутановых кислот путем гидролиза альфа-замещенных рацемических 4-метилтиобути-ронитрилов с помощью нитрилазы одного из следующих микроорганизмов: Alcaligenes faecalis, депонированный под номером АТСС 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7, депонированный под номером FERM ВР-3857, или Gordona terrae МА-1, депонированный под номером FERM ВР-4535.
Согласно способу изобретения микроорганизм может быть использован таким, какой есть, или иммобилизованным на хорошо известных специалисту носителях.
Кроме того, генетическая информация, которая кодирует фермент, может быть передана от одного родственного микроорганизма (такого, как А.faecalis АТСС 8750...) к другому микроорганизму, такому как Bacillus subtilis.
В качестве одного из вариантов способа согласно изобретению вместо микроорганизма в свободном виде или в иммобилизованном используют соответствующее количество фермента, который полностью или частично очищен.
Из альфа-замещенных 4-метилтиобутиронитрилов предпочтительно используют 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил, который позволяет получать гидрокси-аналог рацемического метионина. При таком варианте получения производных метионина избегают образования побочных неорганических соединений в значительных количествах, удаление которых вызывает все больше и больше проблем в связи с защитой окружающей среды.
Эти ферменты в рамках настоящего изобретения обладают нитрилазной активностью в области pH-значений, составляющих от 4 до 11, и оптимальной активностью при pH-значений в пределах от 5 до 9. Оптимальная температура их использования составляет 30-60oC, однако предпочтительно их использовать при температуре в пределах от 30 до 50oC.
Предпочтительно работают с концентрациями нитрила в исходном растворе от 10 ммоль до 400 ммоль на литр и предпочтительно от 50 ммоль до 200 ммоль на литр. Концентрация получаемой аммониевой соли кислоты мало влияет на активность фермента, если эта концентрация ниже 2 моль на литр, предпочтительно, от 0,1 до 1,5 моль на литр.
Изобретение более полно описывается с помощью нижеследующих примеров, которые не ограничивают его.
Пример 1.
Микроорганизм Alcaligenes faecalis АТСС 8750 выращивают в следующей среде:
ацетат аммония - 10 г/л,
дрожжевой экстракт - 5 г/л,
пептон - 5 г/л,
дигидрофосфат калия (K2HPO4) - 5 г/л,
гептагидрат сульфата магния (MgSO4 • 7H2O) - 0,2 г/л,
гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO4 • 7H2O) - 30 мг/л,
хлорид натрия - 1 г/л,
бензонитрил pH 2 - 0,5 г/л,
Культивирование осуществляют при 30oC в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, содержащих 600 мл среды. Содержимое перемешивают в течение 30 часов со скоростью 150 оборотов в минуту. Осадок из клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9 г/л, затем замораживают.
ацетат аммония - 10 г/л,
дрожжевой экстракт - 5 г/л,
пептон - 5 г/л,
дигидрофосфат калия (K2HPO4) - 5 г/л,
гептагидрат сульфата магния (MgSO4 • 7H2O) - 0,2 г/л,
гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO4 • 7H2O) - 30 мг/л,
хлорид натрия - 1 г/л,
бензонитрил pH 2 - 0,5 г/л,
Культивирование осуществляют при 30oC в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, содержащих 600 мл среды. Содержимое перемешивают в течение 30 часов со скоростью 150 оборотов в минуту. Осадок из клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9 г/л, затем замораживают.
Рабочие условия для гидролиза бутиронитрила следующие:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 50 ммоль,
клетки - 5 мг/мл,
фосфатный буфер - 200 ммоль,
температура - 30oC,
продолжительность - 4 ч.
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 50 ммоль,
клетки - 5 мг/мл,
фосфатный буфер - 200 ммоль,
температура - 30oC,
продолжительность - 4 ч.
Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила показывает линейное продуцирование 2,8 мкмоль гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток. Избыток одного из энантиомеров образующейся кислоты определяют с помощью жидкостной хроматографии: он составляет 0% при выходе кислоты 80%.
Пример 2.
Оценивают стабильность фермента, наблюдая за кинетикой продуцирования гидрокси-аналога метионина в течение 180 часов при использовании свободных клеток.
Рабочие условия следующие:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ - 5 мл.
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ - 5 мл.
температура - 25oC.
Нитрил вводят последовательно путем добавления 100 ммоль по мере потребления нитрила. Образование соответствующей кислоты представлено в табл. 1.
Начальная активность составляет 2 мкмоль/ч мг сухих клеток. Этот пример доказывает стабильность фермента, несмотря на присутствие кислоты в высоких концентрациях (0,9 моль гидрокси-аналога метионина).
Пример 3.
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата и количества образовавшейся кислоты была измерена в следующих условиях:
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата;
нитрил - см. табл. 2,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ, pH = 7,0 - 5 мл,
температура - 25oC,
продолжительность - 1 час.
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата;
нитрил - см. табл. 2,
клетки - 10 мг/мл,
фосфатный буфер 300 мМ, pH = 7,0 - 5 мл,
температура - 25oC,
продолжительность - 1 час.
Стабильность фермента в зависимости от количества образовавшейся кислоты (см.табл. 3):
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
клетки - 2,5 мг/мл,
фосфатный 100 мМ буфер, pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30oC,
продолжительность - 2 часа.
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
клетки - 2,5 мг/мл,
фосфатный 100 мМ буфер, pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30oC,
продолжительность - 2 часа.
Пример 4: Очистка нитрилазы
Клетки Alcaligenes faecalis культивируют в течение 24-х часов при 30oC в среде, описанной в примере 1.
Клетки Alcaligenes faecalis культивируют в течение 24-х часов при 30oC в среде, описанной в примере 1.
После центрифугирования культуры осадок обрабатывают буфером с PH = 7,5 (25 мМ ТРИС-HCl, 10% (вес/объем) глицерина). Суспензию клеток подвергают ультразвуковой обработке, затем центрифугируют, чтобы получить неочищенный экстракт. Этот неочищенный экстракт затем обрабатывают сульфатом аммония до 30% насыщения. Полученный осадок снова суспендируют в буфере с pH=7,5, затем подвергают диализу против 2 л того же самого буфера в течение ночи.
Полученный раствор затем вносят в анионообменную колонку с Q - Сефарозой Fast Flow HR 26/10®, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH= 7,5. Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от 0 до 1М раствора хлорида натрия.
Активные фракции затем помещают в анионообменную колонку с моно-Q - HR 5/5®, предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH=7,5. Нитрилазу элюируют с помощью градиента от 0 до 1 М раствора хлорида натрия.
Содержащие активную нитрилазу фракции объединяют, затем добавляют 1М раствор сульфата аммония. Этот раствор вносят в колонку для гидрофобных взаимодействий с фенил-сефарозой HR 5/5® предварительно уравновешенной с буфером, имеющим pH=7,5, к которому добавлен 1 моль сульфата аммония. Активную нитрилазу затем элюируют с помощью градиента от 1 до 0 М раствора сульфата аммония.
Молекулярную массу протеина определяют путем гель-фильтрации. Она составляет около 260 килодальтонов. При электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия наблюдают единственную полосу 43 килодальтона (чистота 95 %).
Кинетика гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила до гидрокси-аналога метионина с помощью нитрилазы A.faecalis является линейной (см. табл. 4).
Пример 5: Влияние pH-значения (см. табл. 5)
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
ацетатный 100 мМ буфер с pH = 4 - 5
фосфатный 100 мМ буфер с pH = 6 - 7 - 1 мл,
буфер ТРИС-HCl, 100 мМ с pH = 8-9
боратный 100 мМ буфер с pH = 10-11
температура - 30oC,
продолжительность - 1 - 2 часа
Пример 6: Влияние температуры (см. табл. 6).
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
ацетатный 100 мМ буфер с pH = 4 - 5
фосфатный 100 мМ буфер с pH = 6 - 7 - 1 мл,
буфер ТРИС-HCl, 100 мМ с pH = 8-9
боратный 100 мМ буфер с pH = 10-11
температура - 30oC,
продолжительность - 1 - 2 часа
Пример 6: Влияние температуры (см. табл. 6).
Рабочие условия:
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с рH = 7,0
температуры, изменяющиеся от 4oC до 60oC
продолжительность - 1 час.
нитрил - 50 ммоль,
протеин - 50 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с рH = 7,0
температуры, изменяющиеся от 4oC до 60oC
продолжительность - 1 час.
Оптимальная температура функционирования фермента составляет 50oC.
Сравнительный пример с нитрилом миндальной кислоты (см. табл. 7).
Рабочие условия:
нитрил миндальной кислоты - 7 ммоль,
протеин - 5 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30oC.
нитрил миндальной кислоты - 7 ммоль,
протеин - 5 мкг/мл,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30oC.
Очищенная нитрилаза, следовательно, энантиоселективна в отношении нитрила миндальной кислоты, но не энантиоселективна в отношении 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила.
Пример 7: Гидролиз 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила с помощью Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857:
Микроорганизм Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 культивируют в следующей среде:
глицерин - 20 г/л,
дрожжевой экстракт (ДИФКО) - 3 г/л,
дигидрофосфат калия KH2PO4 - 1 г/л,
динатрийгидрофосфат 12 H2O Na2HPO4 • 12H2O - 4,4 г/л,
сульфат натрия Na2SO4 - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния (MgCl2 • 6H2O) - 0,85 г/л,
дигидрат хлорида кальция (CaCl2 • 2H2O) - 0,05 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) (MnSO4 • H2O) - 0,033 г/л,
гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO4 • 7H2O) - 0,013 г/л,
гептагидрат сульфата цинка (ZnO4 • 7H2O) - 0,005 г/л,
бензонитрил pH = 7,5 - 0,05 г/л.
Микроорганизм Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 культивируют в следующей среде:
глицерин - 20 г/л,
дрожжевой экстракт (ДИФКО) - 3 г/л,
дигидрофосфат калия KH2PO4 - 1 г/л,
динатрийгидрофосфат 12 H2O Na2HPO4 • 12H2O - 4,4 г/л,
сульфат натрия Na2SO4 - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния (MgCl2 • 6H2O) - 0,85 г/л,
дигидрат хлорида кальция (CaCl2 • 2H2O) - 0,05 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) (MnSO4 • H2O) - 0,033 г/л,
гептагидрат сульфата железа-(II) (FeSO4 • 7H2O) - 0,013 г/л,
гептагидрат сульфата цинка (ZnO4 • 7H2O) - 0,005 г/л,
бензонитрил pH = 7,5 - 0,05 г/л.
Культивирование осуществляют при 30oC в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, содержащих 600 мл среды. Содержимое перемешивают в течение 140 часов со скоростью 150 оборотов в минуту. Осадок клеток извлекают, промывают раствором хлорида натрия с концентрацией 9 г/л, затем замораживают.
Влияние pH-значения на гидролиз (см. табл. 8):
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
ацетатный буфер 100 мМ с pH= 4 - 5
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 6,0 -7,0 - 1 мл,
100 мМ буфер ТРИС-HCl с pH = 8,0 - 9,0
боратный буфер 100 мМ с pH = 10,0 - 11,0
температура - 30oC,
продолжительность - 10 часов.
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
ацетатный буфер 100 мМ с pH= 4 - 5
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 6,0 -7,0 - 1 мл,
100 мМ буфер ТРИС-HCl с pH = 8,0 - 9,0
боратный буфер 100 мМ с pH = 10,0 - 11,0
температура - 30oC,
продолжительность - 10 часов.
Пример 8: Влияние концентрации субстрата (см. табл. 9),
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата также определяют в следующих условиях:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - см. таблицу
оптическая плотность при 660 нм - 20
фосфатный буфер 300 нМ с pH = 7,0 - 5 мл
температура - 30oC
продолжительность - 2 часа
Пример 9: Стабильность фермента в зависимости от количества образующейся кислоты (см. табл. 10).
Стабильность фермента в зависимости от количества субстрата также определяют в следующих условиях:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - см. таблицу
оптическая плотность при 660 нм - 20
фосфатный буфер 300 нМ с pH = 7,0 - 5 мл
температура - 30oC
продолжительность - 2 часа
Пример 9: Стабильность фермента в зависимости от количества образующейся кислоты (см. табл. 10).
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30oC,
продолжительность - 6 часов.
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл,
температура - 30oC,
продолжительность - 6 часов.
Пример 10: Избыток энантиомера (см. табл. 11).
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 140 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 14,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл
температура - 20oC,
Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила показывает продуцирование по линейной зависимости гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток. С помощью жидкостной хроматографии определяют наличие избытка какого-либо энантиомера образовавшейся кислоты; этот избыток равен 0% при выходе кислоты от 15% до 100%.
оптическая плотность при 660 нм - 14,
фосфатный буфер 100 мМ с pH=7,0 - 1 мл
температура - 20oC,
Изучение кинетики гидролиза 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрила показывает продуцирование по линейной зависимости гидрокси-аналога метионина в час и на мг сухих клеток. С помощью жидкостной хроматографии определяют наличие избытка какого-либо энантиомера образовавшейся кислоты; этот избыток равен 0% при выходе кислоты от 15% до 100%.
Пример 11: Влияние температуры
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль
оптическая плотность при 660 нм - 15
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл
температура - см.табл. 12
продолжительность - 6 часов
Пример 12: Гидролиз 4-метилтио-2-аминобутиронитрила (см. табл. 13).
Рабочие условия:
4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил - 100 ммоль
оптическая плотность при 660 нм - 15
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл
температура - см.табл. 12
продолжительность - 6 часов
Пример 12: Гидролиз 4-метилтио-2-аминобутиронитрила (см. табл. 13).
Рабочие условия:
4-метил-2-гидроксибутиронитрил - 23 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30oC.
4-метил-2-гидроксибутиронитрил - 23 ммоль,
оптическая плотность при 660 нм - 15,
фосфатный буфер 100 мМ с pH = 7,0 - 1 мл,
температура - 30oC.
Пример 13:
Условия культивирования, используемые для Gordona terrae 2 MA-1 (FERM BP-4535), следующие:
глицерин - 10 г/л,
дрожжевой экстракт - 0,4 г/л,
гидрофосфат калия K2HPO4 - 6,8 г/л,
гидрофосфат натрия с 12 H2O (Na2HPO4 • 12H2O) - 7,1 г/л,
сульфат натрия Na2SO4 - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния MgCl2 • 6H2O - 0,4 г/л,
дигидрат хлорида кальция CaCl2 • 2H2O - 40 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) MnSO4 • H2O - 4 мг/л,
хлорид железа - (III) - 0,6 мг/л,
сульфат цинка - 0,3 мг/л,
бензонитрил - 0,5 г/л,
рН 7,2
Активность фермента
Культивированные клетки затем промывают, после чего вводят в контакт с гидроксиметилтиобутиронитрилом для количественного анализа активности.
Условия культивирования, используемые для Gordona terrae 2 MA-1 (FERM BP-4535), следующие:
глицерин - 10 г/л,
дрожжевой экстракт - 0,4 г/л,
гидрофосфат калия K2HPO4 - 6,8 г/л,
гидрофосфат натрия с 12 H2O (Na2HPO4 • 12H2O) - 7,1 г/л,
сульфат натрия Na2SO4 - 2,8 г/л,
гексагидрат хлорида магния MgCl2 • 6H2O - 0,4 г/л,
дигидрат хлорида кальция CaCl2 • 2H2O - 40 г/л,
гидрат сульфата марганца-(II) MnSO4 • H2O - 4 мг/л,
хлорид железа - (III) - 0,6 мг/л,
сульфат цинка - 0,3 мг/л,
бензонитрил - 0,5 г/л,
рН 7,2
Активность фермента
Культивированные клетки затем промывают, после чего вводят в контакт с гидроксиметилтиобутиронитрилом для количественного анализа активности.
Рабочие условия:
концентрация нитрила - 23 ммоль,
концентрация клеток - 6,8 г/л.
концентрация нитрила - 23 ммоль,
концентрация клеток - 6,8 г/л.
100 мМ фосфатный буфер pH = 7,0;
температура = 35oC
Кинетика гидролиза гидроксиметилтиобутиронитрила линейная (фиг. 1).
температура = 35oC
Кинетика гидролиза гидроксиметилтиобутиронитрила линейная (фиг. 1).
Начальная скорость составляет 13 ммоль/ч г сухих клеток.
Пример 14: Влияние концентрации циангидрина АМТР на активность нитрилазы
Определяют влияние начальной концентрации гидроксиметилтиобутиронитрила на активность нитрилазы; результаты приводятся в табл. 14:
Рабочие условия:
концентрация клеток - 5,1 г/л
100 мМ фосфатный буфер pH 7,0;
температура = 35oC.
Определяют влияние начальной концентрации гидроксиметилтиобутиронитрила на активность нитрилазы; результаты приводятся в табл. 14:
Рабочие условия:
концентрация клеток - 5,1 г/л
100 мМ фосфатный буфер pH 7,0;
температура = 35oC.
Кинетику измеряют для времени 0,5, 1, 2 и 3 часов.
Вплоть до 200 ммоль активность мало изменяется с изменением концентрации субстрата.
Пример 15: Влияние концентрации гидрокси-аналога метионина на нитрилазную активность
В этом опыте исследуют влияние концентрации 4-гидрокси-2- метилтио-бутаноата аммония на нитрилазную активность.
В этом опыте исследуют влияние концентрации 4-гидрокси-2- метилтио-бутаноата аммония на нитрилазную активность.
Рабочие условия:
концентрация клеток - 5 г/л,
концентрация нитрила - 100 ммоль,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0,
температура - 35oC.
концентрация клеток - 5 г/л,
концентрация нитрила - 100 ммоль,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0,
температура - 35oC.
Концентрацию карбоксилата аммония изменяют в пределах от 0 до 1,5 моль (см. табл. 15).
Концентрация 4-гидрокси-2-метилтио-бутаноата аммония практически не изменяет начальную активность штамма Gordona terrae HT 29-7.
Пример 16: Влияние pH-значения и температуры (см. табл. 16)
Рабочие условия:
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ ацетатный буфер с pH=4-5
100 мМ фосфатный буфер с pH=6-7
100 мМ ТРИС-HCl буфер с pH=8-9
100 мМ боратный буфер с pH=10-11
температура - 30oC.
Рабочие условия:
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ ацетатный буфер с pH=4-5
100 мМ фосфатный буфер с pH=6-7
100 мМ ТРИС-HCl буфер с pH=8-9
100 мМ боратный буфер с pH=10-11
температура - 30oC.
кинетика за время 1, 2, 4 и 6 часов.
Оптимальное значение pH составляет около 8 - 9 в условиях, предложенных заявителем.
Влияние температуры на нитрилазную активность Gordona terrae MA-1 (см. табл. 17).
Рабочие условия:
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0
кинетика за 1 час
Оптимальная температура составляет 40 - 50oC.
концентрация нитрила - 100 ммоль,
концентрация клеток - 7,5 г/л,
100 мМ фосфатный буфер с pH=7,0
кинетика за 1 час
Оптимальная температура составляет 40 - 50oC.
Claims (6)
1. Способ получения α-замещенных рацемических 4-метилтиобутановых кислот, отличающийся тем, что α-замещенные рацемические 4-метилтиобутиронитрилы гидролизуют с помощью нитрилазы, выбираемый из группы: Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 или Gordona terrac FERM BP-4535.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что α-замещенным рацемическим 4-метилтиобутиронитрилом является 4-метилтио-2-гидроксибутиронитрил.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH-значение среды составляет от 4 до 11 и предпочтительно от 5 до 9.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура гидролиза составляет 30 - 60oC и предпочтительно 30 - 50oC.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация α-замещенного 4-метилтиобутиронитрила в исходном растворе составляет 10 - 400 ммоль и предпочтительно 50 - 200 ммоль на литр.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация α-замещенной 4-метилтиобутановой кислоты в растворе составляет 10 - 2000 ммоль на литр и предпочтительно 100 - 1500 ммоль на литр.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9411301A FR2724931B1 (fr) | 1994-09-22 | 1994-09-22 | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitrile |
| FR94/11301 | 1994-09-22 | ||
| FR95/02615 | 1995-03-07 | ||
| FR9502615A FR2731438B1 (fr) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | Hydrolise enzymatique des 4-methylthiobutyronitriles |
| PCT/FR1995/001196 WO1996009403A1 (fr) | 1994-09-22 | 1995-09-19 | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitrile |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97106337A RU97106337A (ru) | 1999-07-20 |
| RU2144959C1 true RU2144959C1 (ru) | 2000-01-27 |
Family
ID=26231416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97106337/13A RU2144959C1 (ru) | 1994-09-22 | 1995-09-19 | Ферментативный гидролиз 4-метилтиобутиронитрилов |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5814497A (ru) |
| EP (1) | EP0782629B1 (ru) |
| JP (1) | JPH10507631A (ru) |
| KR (1) | KR100398595B1 (ru) |
| CN (1) | CN1077599C (ru) |
| AT (1) | ATE174059T1 (ru) |
| AU (1) | AU699625B2 (ru) |
| BR (1) | BR9509176A (ru) |
| CA (1) | CA2200100A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ84497A3 (ru) |
| DE (1) | DE69506430T2 (ru) |
| DK (1) | DK0782629T3 (ru) |
| ES (1) | ES2126313T3 (ru) |
| FI (1) | FI971198L (ru) |
| HU (1) | HU220860B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ292559A (ru) |
| PL (1) | PL180871B1 (ru) |
| RU (1) | RU2144959C1 (ru) |
| SK (1) | SK281956B6 (ru) |
| UA (1) | UA48953C2 (ru) |
| WO (1) | WO1996009403A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002081659A1 (en) * | 2001-04-03 | 2002-10-17 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo 'bioamid' | Bacterial strain alcaligenes denitrificans producing nitrilase |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2285728T3 (es) * | 1996-02-29 | 2007-11-16 | Nippon Soda Co., Ltd. | Procedimiento para la preparacion de alfa hidroxiacidos empleando un microorganismo, y un nuevo microorganismo. |
| FR2755143B1 (fr) | 1996-10-25 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase |
| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
| US5866379A (en) * | 1997-01-28 | 1999-02-02 | Novus International | Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha. |
| US6037155A (en) * | 1997-02-27 | 2000-03-14 | Nippon Soda Co., Ltd. | Process for preparing α-hydroxy acids using microorganism and novel microorganism |
| FR2787121B1 (fr) * | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| WO2002052027A1 (fr) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Nippon Soda Co., Ltd. | Procede de production d'une substance a l'aide d'un catalyseur microbien |
| ATE435278T1 (de) * | 2003-02-27 | 2009-07-15 | Basf Se | Modifizierte nitrilasen und deren verwendung in verfahren zur herstellung von carbonsäuren |
| DE10316110A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy-4-methylthio-buttersäure Ammoniumsalz |
| CN102911975A (zh) * | 2012-09-12 | 2013-02-06 | 浙江工业大学 | 重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK314989A (da) * | 1988-06-27 | 1989-12-28 | Asahi Chemical Ind | Fremgangsmaade til fremstilling af optisk aktive alfa-substituerede organiske syrer, samt mikroorganismer og enzymer anvendelige ved fremgangsmaaden |
| JP3009421B2 (ja) * | 1990-02-28 | 2000-02-14 | 秀明 山田 | 有機酸の生物学的製造法 |
| JPH0440899A (ja) * | 1990-06-08 | 1992-02-12 | Nitto Chem Ind Co Ltd | α―ヒドロキシ―４―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法 |
| JPH0440898A (ja) * | 1990-06-08 | 1992-02-12 | Nitto Chem Ind Co Ltd | α―ヒドロキシ―４―メチルチオ酪酸の生物学的製造法 |
| CA2103932A1 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-06 | Ramesh N. Patel | Stereoselective reduction of ketones |
| JP3218133B2 (ja) * | 1993-02-03 | 2001-10-15 | 三菱レイヨン株式会社 | フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
| JP2720140B2 (ja) * | 1993-02-03 | 1998-02-25 | 日東化学工業株式会社 | フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
-
1995
- 1995-09-19 US US08/809,184 patent/US5814497A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 JP JP8510644A patent/JPH10507631A/ja not_active Ceased
- 1995-09-19 AU AU34764/95A patent/AU699625B2/en not_active Ceased
- 1995-09-19 CN CN95195224A patent/CN1077599C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 BR BR9509176A patent/BR9509176A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 ES ES95931259T patent/ES2126313T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-19 EP EP95931259A patent/EP0782629B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-19 WO PCT/FR1995/001196 patent/WO1996009403A1/fr active IP Right Grant
- 1995-09-19 RU RU97106337/13A patent/RU2144959C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 KR KR1019970701858A patent/KR100398595B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 CZ CZ97844A patent/CZ84497A3/cs unknown
- 1995-09-19 AT AT95931259T patent/ATE174059T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 DE DE69506430T patent/DE69506430T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 HU HU9702057A patent/HU220860B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 DK DK95931259T patent/DK0782629T3/da active
- 1995-09-19 NZ NZ292559A patent/NZ292559A/en unknown
- 1995-09-19 UA UA97041904A patent/UA48953C2/ru unknown
- 1995-09-19 PL PL95319298A patent/PL180871B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 CA CA002200100A patent/CA2200100A1/fr not_active Abandoned
- 1995-09-19 SK SK376-97A patent/SK281956B6/sk unknown
-
1997
- 1997-03-21 FI FI971198A patent/FI971198L/fi not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002081659A1 (en) * | 2001-04-03 | 2002-10-17 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo 'bioamid' | Bacterial strain alcaligenes denitrificans producing nitrilase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL180871B1 (pl) | 2001-04-30 |
| UA48953C2 (ru) | 2002-09-16 |
| KR970706401A (ko) | 1997-11-03 |
| DK0782629T3 (da) | 1999-08-16 |
| CZ84497A3 (en) | 1997-06-11 |
| DE69506430D1 (de) | 1999-01-14 |
| NZ292559A (en) | 1998-03-25 |
| CN1077599C (zh) | 2002-01-09 |
| HUT77079A (hu) | 1998-03-02 |
| JPH10507631A (ja) | 1998-07-28 |
| HU220860B1 (en) | 2002-06-29 |
| EP0782629A1 (fr) | 1997-07-09 |
| CA2200100A1 (fr) | 1996-03-28 |
| DE69506430T2 (de) | 1999-05-20 |
| ATE174059T1 (de) | 1998-12-15 |
| BR9509176A (pt) | 1997-12-23 |
| AU3476495A (en) | 1996-04-09 |
| ES2126313T3 (es) | 1999-03-16 |
| KR100398595B1 (ko) | 2004-03-20 |
| SK37697A3 (en) | 1997-10-08 |
| SK281956B6 (sk) | 2001-09-11 |
| US5814497A (en) | 1998-09-29 |
| EP0782629B1 (fr) | 1998-12-02 |
| WO1996009403A1 (fr) | 1996-03-28 |
| PL319298A1 (en) | 1997-08-04 |
| FI971198A0 (fi) | 1997-03-21 |
| FI971198L (fi) | 1997-03-21 |
| AU699625B2 (en) | 1998-12-10 |
| CN1158640A (zh) | 1997-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5283182A (en) | Preparation of immobilized hydantoinase stabilized with divalent metal ions | |
| EP0348901B1 (en) | Process for producing optically active alfa-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor | |
| FI95397B (fi) | Menetelmä (S)-ketoprofeenin valmistamiseksi | |
| RU2144959C1 (ru) | Ферментативный гидролиз 4-метилтиобутиронитрилов | |
| KR970000185B1 (ko) | 아실아미노산 라세마제, 그의 제조방법 및 용도 | |
| JP3409353B2 (ja) | アミド化合物の製造方法および使用される微生物 | |
| JPWO2007026860A1 (ja) | 光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法 | |
| CA1298800C (en) | Immobilized enzyme preparation and its use | |
| US6268185B1 (en) | Production of amino acids and enzymes used therefor | |
| JP2696127B2 (ja) | 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
| Yamanaka et al. | Efficient preparation of optically active p-trimethylsilylphenylalanine by using cell-free extract of Blastobacter sp. A17p-4 | |
| KR100463966B1 (ko) | 시아노카르복실산 에스테르로부터 디카르복실산모노에스테르의 제조 | |
| MXPA97002153A (en) | Enzymatic hydrolysis of 4-methyltiobutironitri | |
| JP2712331B2 (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
| IE63329B1 (en) | Process for preparing optically active 2-(aryloxy) - or 2-(arylthio) alkanoic acids | |
| US20060172393A1 (en) | Process for producing optically active alpha -methylcysteine derivative | |
| JPH0576390A (ja) | 光学活性なカルボン酸の製造方法 | |
| JP3960667B2 (ja) | β−カルバモイルイソ酪酸類及びその製造方法 | |
| JPH01104186A (ja) | Ｌ−トリプトファンの製造法 | |
| JPH08256771A (ja) | アミダーゼ活性を有する新規タンパク質およびそれをコードする遺伝子 | |
| FR2724931A1 (fr) | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitrile | |
| JPH08131189A (ja) | （２ｒ，３ｓ）−３−フェニルグリシド酸エステル系化合物の取得方法 | |
| JPH04144697A (ja) | 光学活性カルボン酸、ニトリル、アミドの製造方法 | |
| JPH1180113A (ja) | 光学活性β−シアノイソ酪酸類及びその製造方法 | |
| JP2001314197A (ja) | 光学活性なヒドロキシアルキル−α−アミノカルボン酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040920 |