KR100398595B1

KR100398595B1 - 4-메틸티오부티로니트릴의효소가수분해방법

Info

Publication number: KR100398595B1
Application number: KR1019970701858A
Authority: KR
Inventors: 올리비에 파브르-불르; 마리-끌로드 봉투; 데니 라르쥐; 앙드레 아리아노
Original assignee: 롱프랑 뉴트리시옹 아니말
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2004-03-20
Anticipated expiration: 2015-09-19
Also published as: PL180871B1; UA48953C2; KR970706401A; DK0782629T3; CZ84497A3; DE69506430D1; NZ292559A; CN1077599C; HUT77079A; JPH10507631A; HU220860B1; EP0782629A1; CA2200100A1; DE69506430T2; ATE174059T1; BR9509176A; AU3476495A; ES2126313T3; SK37697A3; SK281956B6

Abstract

알칼리진스 피칼리스, 로도코커스 종 HT 29-7 또는 고르도나 테래의 니트릴라제를 사용하여 4-메틸티오부티로니트릴을 4-메틸티오부티르산 라세미체로 효소 가수분해하는 신규 방법.

Description

4-메틸티오부티로니트릴의 효소 가수분해 방법

알칼리진스 피칼리스의 니트릴라제는 예를 들면, Asahi사의 유럽 특허 EP 348,901 및 일본 특허 JP 03 224 496에 기술되어 있다. 이들 특허문헌, 특히 유럽 특허에서는 니트릴라제가 라세미체 니트릴로부터 광학 활성 산을 생성하는 데 사용되고 있다. 바람직한 출발물질 니트릴은 α-치환되고 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소원자를 함유하는 알킬쇄 또는 방향족 라디칼을 함유한다. 전술한 유럽 특허의 실시예 11은 알칼리진스 피칼리스를 사용한 라세미체 만델로니트릴의 가수분해에 대하여 기술하고 있으며; R-(-)-만델산이 91% 과량의 거울상 이성질체 형태로 수득된다. Nitto Chemical사의 유럽 특허 제 4,86,289 호 및 이의 대응 미국 특허 US 제 5,326,702 호는 설파이트 존재하 만델로니트릴을 가수분해하기 위한 알칼리진스종 BC35-2(FERM No. 11265 또는 FERM-BP-3318)의 사용에 대하여 기술하고 있으며; 이 경우에 있어서, 만델산은 약 98% 과량의 거울상 이성질체 형태로 수득된다.

Asahi사의 특허 JP 04 341 185 또한 이들의 라세미체 니트릴로부터 광학적으로 순수한 화합물 제조와 관련한 문제점을 해결하기 위하여 알칼리진스 피칼리스 ATCC 8750으로부터의 니트릴라제의 제조 및 사용에 관하여 기술하고 있다. 전술한 일본 특허에 기술되어 있는 거울상 이성질체 선택적 니트릴라제는 더욱 바람직하게는 하기 화학식(I)의 2-하이드록시니트릴을 하기 화학식(II)의 2-하이드록시카복실산으로 가수분해할 수 있다.

[화학식 I]

[화학식 II]

상기식에서,

R은 임의로 치환된 아릴 그룹 또는 임의로 치환된 헤테로사이클릭 그룹이다.

상기 특허에는 니트릴라제로 만델산의 니트릴을 가수분해함으로써 R-(-)-만델산의 100% 거울상 이성질체 과량을 수득할 수 있음이 언급되어 있다. 실시예 5에는 발레로니트릴, 아크릴로니트릴, 2-할로프로피오니트릴 및 클로로아세토니트릴과 같은 지방족 니트릴의 가수분해에 니트릴라제가 사용될 수 있음이 언급되어 있다. 비대칭 중심을 갖는 지방족 니트릴에 대한 이러한 거울상 이성질체 선택적 가수분해에 관해서는 전혀 명시되어 있지 않다.

상기 특허는 또한 알칼리진스 피칼리스의 니트릴라제가 pH 6.5 내지 8.0에서 최적의 활성을 가짐을 명시하고 있으며; 효소의 사용 온도는 문헌에 따르면 항상 45℃ 이하여야 한다.

알칼리진스 피칼리스 ATCC 8750의 효소가 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴의 가수분해에 사용될 경우, 광학적 순도의 견지에서 어떠한 선택성도 없이 이러한 가수분해 과정을 수행하였다는 사실은 아주 놀라운 것으로 보인다. 이러한 효소는 니트릴을 가수분해하여 이성체 중 어느 쪽으로도 치우침이 없이 두 종류 산의 라세미체 혼합물을 생성한다.

FERM BP-3857 하의 로도코커스 종 HT 29-7의 니트릴라제는 예를 들면, Nitto사의 유럽 특허 EP 610,049 및 미국 특허 US 5,296,373에 기술되어 있다.

이들 특허문헌, 특히 미국 특허에는 페닐 그룹을 함유하는 라세미체 니트릴로부터 광학 활성 산의 생성에 니트릴라제가 사용되고 있다. 출발물질 니트릴은 모두 방향족 라디칼을 함유하고 있으며; 본질적으로 만델로니트릴 또는 방향족고리상에 치환된 이의 유도체의 가수분해를 수반한다. 상기 미국 특허의 실시예 1은 로도코커스 종 HT 29-7을 사용한 라세미체 만델로니트릴의 가수분해에 대하여 기술하고 있으며; 100%의 R-(-)-만델산이 과량의 거울상 이성질체 형태로 수득된다. 실시예 2는 고리 상에서 치환이 이루어진 만델로니트릴 유도체의 가수분해에 대하여 기술하고 있으며; 거울상 이성질체 형태의 과량의 만델산 유도체 또한 100%로 얻어지며 이러한 결과는 벤즈알데히드 니트릴에 대하여 가수분해를 수행하는 경우에서와 마찬가지이다.

Nitto Chemical사의 유럽 특허 제 610 049 호에는 γ위치에서 방향족 고리로로 치환된 α-하이드록시니트릴을 광학 활성 페닐 그룹으로 치환된 α-하이드록시카복실산으로 가수분해하기 위한 로도코커스 종 HT 29-7(FERM BP-3857), 알칼리진스 종 BC35-2(FERM BP-3318) 또는 브레비박테리움 아세틸리쿰(Brevibacterium acetylicum) IAM 1790의 사용에 대하여 기술되어 있다. 로도코커스 종 HT 29-7로 수득되는 산은 출발물질 니트릴 및 인산(약 8.2로 고정된 pH)의 존재 여부에 따라 항상 가변하는 과량의 거울상 이성질체를 갖는다.

로도코커스 종 HT 29-7(FERM BP-3318)의 효소가 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴의 가수분해에 사용될 경우, 어떠한 거울상 이성질체 선택성도 없이 이러한 가수분해를 수행하였다는 사실은 꽤 놀라운 것으로 보인다. 이러한 효소는 니트릴을 가수분해하여 이성질체 중 어느 쪽에도 치우침이 없는 두 종류 산의 라세미체 혼합물을 생성한다.

FERM BP-4535하의 고르도나 테래 MA-1의 니트릴라제를 사용하여 γ-페닐 그룹 및 α-하이드록시 그룹을 함유하는 니트릴을 상응하는 광학 활성 산으로 가수분해하는 것이 유럽 특허 제 0,610,048 호에 기술되어 있다. 과량의 거울상 이성질체는 모든 실시예에서 92 내지 100% 범위이다.

FERM BP-4535하의 고르도나 테래 MA-1의 효소가 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 가수분해에 사용될 경우, 어떠한 거울상 이성질체 선택성도 없이 이러한 가수분해를 수행하였다는 사실은 매우 놀라운 것으로 보인다. 이러한 효소는 니트릴을 가수분해하여 이성질체 중 어느 쪽에도 치우침이 없는 두 종류 산의 라세미체 혼합물을 생성한다.

본 발명은 니트릴라제의 니트릴기를 카르복실기로 가수분해하는 촉매로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 더 구체적으로 말해서 알칼리진스(Alcaligenes) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 또는 고르도나(Gordona) 속 미생물 및 구체적으로 ATCC 8750 하의 알칼리진스 피칼리스(A. faecalis), FERM BP-3857 하의 로도코커스 종 HT 29-7 또는 FERM BP-4535 하의 고르도나 테래(G. terrae) MA-1의 니트릴라제로부터 선택된 니트릴라제의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 α-치환된 4-메틸티오부티로니트릴 라세미체를 하기 미생물 중 하나의 니트릴라제로 가수분해함에 의한 α-치환된 4-메틸티오부티르산 라세미체의 제조방법에 관한 것이다:

ATCC 8750하의 알칼리진스 피칼리스, FERM BP-3857하의 로도코커스 종 HT 29-7 또는 FERM BP-4535하의 고르도나 테래 MA-1.

본 발명의 방법에 따라, 미생물은 그 자체로 사용되거나 당해 분야의 전문가에게 익히 공지되어 있는 지지체 상에 고정시킬 수 있다.

더욱이, 효소를 암호화하는 유전 정보는 모균주 미생물(예를 들면, 알칼리진스 피칼리스 ATCC 8750 등)로부터 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilts)와 같은 미생물 중으로 전달될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 변경된 방법 중 하나는 미생물 대신에 전체 또는 부분적으로 정제된 상응하는 양의 유리형 또는 부동형 효소를 사용하는 것으로 이루어진다.

α-치환된 4-메틸티오부티로니트릴 중에서, 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴을 사용하는 것이 바람직하며, 이로해서 라세미체 메티오닌의 하이드록시 동족체를 제조하는 것이 가능해진다. 메티오닌 유도체 제조에 이러한 기술을 사용함으로써 폐기시 환경 보호 억제책을 고려할 때 항시-증가하는 문제점을 야기하는 대량의 무기 부산물 형성을 피할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 볼 때, 이들 효소는 4 내지 11 범위의 pH에서 니트릴라제 활성 및 5 내지 9의 pH에서 최적 활성을 갖는다. 이들의 최적 사용 온도는 30 내지 60℃이지만; 30 내지 50℃의 온도를 사용하는 것이 바람직하다.

10 내지 400 mmol/ℓ, 바람직하게는 50 내지 200 mmol/ℓ의 출발 용액내 니트릴 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 수득된 산의 암모늄염 농도는 2mol/ℓ미만, 바람직하게는 0.1 내지 1.5 mol/ℓ일 때 효소의 활성에는 거의 영향을 미치지 않는다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 구체적으로 기술되며, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.

실시예 1

미생물 알칼리진스 피칼리스 ATCC 8750을 하기의 배지에서 배양한다:

암모늄 아세테이트 10 g/ℓ

효모 추출물 5 g/ℓ

펩톤 5 g/ℓ

K₂HPO₄5 g/ℓ

MgSO_4·7H₂O 0.2 g/ℓ

FeSO_4·7H₂O 30 mg/ℓ

NaCl 1 g/ℓ

벤조니트릴 0.5 g/ℓ

pH 7.2

600 ㎖의 배지를 함유하는 2ℓ들이 삼각 플라스크내 30℃에서 배양한다. 혼합물 전체를 150 회전/분으로 30 시간 동안 교반한다. 세포 펠릿을 회수하고, 9 g/ℓ NaCl 용액으로 세척한 다음 동결시킨다.

부티로니트릴 가수분해 작업 조건:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 50 mM

세포 5 mg/㎖

인산 완충액 200 mM

온도 30℃

지속기간 4 시간

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 가수분해의 동력학 연구 결과 시간 당 및 건조 세포의 mg 당 메티오닌의 하이드록시 동족체 2.8 ㎛ol의 선형 생성으로 나타났다. 형성된 산의 거울상 이성질체 과량을 액체 크로마토그래피로 측정하였는데 이는 산의 수율 80%에 대한 0 %와 같다.

실시예 2

효소의 안정성은 유리 세포를 사용하여 180 시간에 걸쳐서 메티오닌의 하이드록시 동족체 생성의 동력학에 따라 평가한다.

작업 조건은 다음과 같다:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 100 mM

세포 10 mg/㎖

인산 완충액 300 mM 5 ㎖

온도 25℃

고갈된 후 100 mmol의 니트릴을 가함으로써 니트릴을 순차적으로 가한다. 상응하는 산의 형성을 표 I에 나타냈다.

초기 활성은 2 μmol/h·mg건조 세포이다. 본 실시예는 산이 고농도로 존재함에도 불구하고(메티오닌의 하이드록시 동족체 0.9 mol) 효소가 안정함을 보여주고 있다.

실시예 3

기질의 양과 형성된 산의 양의 함수로서 효소의 안정성도 하기 조건하에서 측정한다:

기질 양의 함수로서 효소의 안정성

니트릴 결과표 참조

세포 10 mg/㎖

인산 완충액 300 mM

pH 7.0 5 ㎖

온도 25℃

지속기간 1 시간

형성된 산의 양의 함수로서 효소의 안정성

작업 조건:

니트릴 50 mM

세포 2.5 mg/㎖

인산 완충액 100 mM

pH 7.0 1 ㎖

온도 30℃

지속기간 2 시간

실시예 4

니트릴라제의 정제

알칼리진스 피칼리스 세포를 24 시간 동안 30℃에서 실시예 1에서 기술한 배지에서 배양한다.

배양액을 원심분리한 후, 펠릿을 pH 7.5 완충액(25 mM 트리스HCl, 10%(w/v) 글리세롤)에 용해시킨다. 세포 현탁액을 초음파처리하고 이어서 원심분리하여 조 추출물을 수득한다. 이어서, 조 추출물을 황산암모늄으로 처리하여 30% 포화되게 한다. 수득된 침전물을 pH 7.5 완충액에 재현탁시키고, 이어서 동일 완충액 2ℓ에대하여 밤새 투석한다.

이어서, 수득 용액을 pH 7.5 완충액으로 예비평형시킨 Q 세파로스 고속 유동 HR 26/10

음이온 교환 컬럼 상에 부하한다. 이어서, 0 내지 1 M NaCl의 구배로 활성을 용출시킨다.

이어서, 활성 분획을 pH 7.5 완충액으로 예비평형시킨 모노 Q HR 5/5

음이온 교환 컬럼 상에 부하한다. 0 내지 1 M NaCl의 구배를 사용하여 니트릴라제를 용출시킨다.

최종적으로, 활성 함유 분획을 합하고 이어서 1 M 황산암모늄을 가한다. 이 용액을 pH 7.5 완충액으로 예비평형시킨 페닐 세파로스 HR 5/5

소수성 작용 컬럼 상에 부하하고 여기에 1 M(NH₄)₂SO₄를 가한다. 이어서 1 내지 0 M 황산암모늄 구배로 활성을 용출시킨다.

겔 여과로 단백질의 분자량을 측정한다. 분자량은 약 260 kDa이다. 43 kDa의 단일 밴드가 SDS-PAGE에서 관찰된다(순도 95%).

알칼리진스 피칼리스의 니트릴라제를 사용한 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴의 메티오닌의 하이드록시 동족체로의 가수분해 동력학은 선형이다.

실시예 5

pH의 영향

작업 조건:

니트릴 50 mM

단백질 50 ㎍/㎖

아세테이트 완충액 100 mM, pH 4 내지 5

인산 완충액 100 mM, pH 6 내지 7 1㎖

트리스-HCl 완충액 100 mM, pH 8 내지 9

보레이트 완충액 100 mM, pH 10 내지 11

온도 30℃

지속기간 1 내지 2 시간

실시예 6

온도의 영향

작업 조건:

니트릴 50 mM

단백질 50 ㎍/㎖

인산 완충액 100 mM, pH 7.0

가변 온도 4 내지 60℃

지속기간 1 시간

효소의 최적 사용 온도는 50℃이다.

만델로니트릴을 사용한 비교 실시예

작업 조건:

만델로니트릴 7 mM

단백질 5 ㎍/㎖

인산 완충액 100 mM, pH 7.0, 1㎖

온도 30℃

따라서 정제된 니트릴라제는 만델로니트릴에 대하여 거울상 이성질체 선택성이지만 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴에 대해서는 아니다.

실시예 7

로도코커스 HT 29-7 FERM BP-3857을 사용한 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴의 가수분해

미생물 로도코커스 종 HT 29-7 FERM BP-3857을 하기 배지에서 배양한다:

글리세롤 20 g/ℓ

효모 추출물(DIFCO) 3 g/ℓ

KH₂PO₄1 g/ℓ

Na₂HPO_4·12H₂O4.4 g/ℓ

Na₂SO₄2.8 g/ℓ

MgCl_2·6H₂O 0.85 g/ℓ

CaCl_2·2H₂O 0.05 g/ℓ

MnSO_4·H₂O 0.033 g/ℓ

FeSO_4·7H₂O 0.013 g/ℓ

ZnSO_4·7H₂O 0.005 g/ℓ

벤조니트릴 0.5 g/ℓ

pH 7.5

600 ㎖의 배지를 함유하는 2ℓ들이 삼각 플라스크내 30℃에서 배양한다. 혼합물 전체를 150 회전/분으로 140 시간 동안 교반한다. 세포 펠릿을 회수하고, 9 g/ℓ NaCl 용액으로 세척한 다음 동결시킨다.

가수분해에 미치는 pH의 영향:

작업 조건:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 100 mM

660 nm에서의 흡광도 15

아세테이트 완충액 100 mM, pH 4 내지 5

인산 완충액 100 mM, pH 6.0 내지 7.0 1㎖

트리스-HCl 완충액 100 mM, pH 8.0 내지 9.0

보레이트 완충액 100 mM, pH 10.0 내지 11.0

온도 30℃

지속기간 10 시간

실시예 8

기질 농도의 영향

기질 양의 함수로서 효소의 안정성도 하기 조건하에서 측정한다:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 결과표 참조

660 nm에서의 흡광도 20

인산 완충액 300 mM, pH 7.0 5 ㎖

온도 30℃

지속기간 2 시간

실시예 9

형성된 산의 양 함수로서 효소의 안정성

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 100 mM

660 nm에서의 흡광도 15

인산 완충액 100 mM, pH 7.0 1 ㎖

온도 30℃

지속기간 6 시간

실시예 10

거울상이성질체 과량

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 140 mM

660 nm에서의 흡광도 14

인산 완충액 100 mM, pH 7.0 1 ㎖

온도 20℃

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 가수분해의 동력학 연구 결과 시간 당 및 건조 세포 mg 당 메티오닌의 하이드록시 동족체의 선형 생성으로 나타났다. 형성된 산의 거울상 이성질체 과량을 액체 크로마토그래피로 측정하고; 이는 산의 수율 15 내지 100%에 대한 0 %와 동등하다.

실시예 11

온도의 영향

작업 조건:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 100 mM

660 nm에서의 흡광도 15

인산 완충액 100 mM, pH 7.0 1 ㎖

온도 표 참조

지속기간 6 시간

실시예 12

4-메틸티오-2-아미노부티로니트릴의 가수분해

작업 조건:

4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴 23 mM

660 nm에서의 흡광도 15

인산 완충액 100 mM, pH 7.0 1 ㎖

온도 30℃

실시예 13

고르도나 테래 MA-1(FERM BP-4535)에 대해 사용된 배양 조건은 다음과 같다:

글리세롤 10 g/ℓ

효모 추출물 0.4 g/ℓ

K₂HPO₄6.8 g/ℓ

Na₂HPO_4·12H₂O 7.1 g/ℓ

Na₂SO₄2.8 g/ℓ

MgCl_2·6H₂O 0.4 g/ℓ

CaCl_2·2H₂O 40 mg/ℓ

MnSO_4·H₂O 4 mg/㎖

FeCl₃0.6 mg/ℓ

ZnSO₄0.3 mg/ℓ

벤조니트릴 0.5 g/ℓ

pH 7.2

효소의 활성

이어서, 배양 세포를 세척한 다음 하이드록시메틸티오부티로니트릴과 접촉시켜 활성을 분석한다.

작업 조건:

[니트릴]=23 mM;

[세포]=6.8 g/ℓ;

인산 완충액 100 mM, pH 7.0, 35℃

도 3: 고르도나 테래 MA-1에 의한 AMTP의 사이아노하이드린의 가수분해

하이드록시메틸티오부티로니트릴의 가수분해 동력학은 선형이다. 초기 속도는 13 mmol/h·g 건조 세포에서 평가한다.

실시예 14

니트릴라제 활성에 미치는 AMTP의 사이아노하이드린 농도의 영향

니트릴라제 활성에 미치는 하이드록시메틸티오부티로니트릴 초기 농도의 영향을 측정하고, 결과를 하기의 표에 나타냈다.

작업 조건:

[세포]=5.1 g/ℓ;

인산 완충액 100 mM, pH 7.0; 35℃

0.5, 1, 2 및 3 시간에 걸쳐서 동력학을 수행한다.

200 mM까지는 활성이 기질 농도에 따라 약간 변화한다.

실시예 15

니트릴라제 활성에 미치는 메티오닌의 하이드록시 동족체 농도의 영향

본 시험에서, 본 출원인은 니트릴라제 활성에 미치는 암모늄 4-하이드록시-2-메틸티오부타노에이트 농도의 영향을 연구하였다.

작업 조건:

[세포]=5 g/ℓ;

[니트릴]=100 mM;

인산 완충액 100 mM, pH 7.0; 35℃

암모늄 카르복실레이트의 농도는 0 내지 1.5 M로 변화한다.

암모늄 4-하이드록시-2-메틸티오부타노에이트의 농도는 균주 고르도나 테래 HT29-7의 초기 활성을 전혀 변형시키지 않는다.

실시예 16

pH 및 온도의 영향

작업 조건:

[니트릴]=100 mM;

[세포]=7.5 g/ℓ;

아세테이트 완충액 100 mM, pH 4 내지 5;

인산 완충액 100 mM, pH 6 내지 7;

트리스-HCl 완충액 100 mM, pH 8 내지 9;

보레이트 완충액 100 mM, pH 10 내지 11; 3

30℃; 1, 2, 4 및 6 시간에 걸친 동력학.

최적 pH는 본 출원인의 작업 조건 하에서 약 8 내지 9이다.

고르도나 테래 MA-1의 니트릴라제 활성에 미치는 온도의 영향.

작업 조건:

[니트릴]=100 mM;

[세포]=7.5 g/ℓ;

인산 완충액 100 mM, pH 7.0;

1 시간에 걸친 동력학.

최적 온도는 약 40 내지 50℃이다.

Claims

α-치환된 4-메틸티오부티로니트릴 라세미체가 알칼리진스 피칼리스(Alcaligenes faecalis), ATCC 8750, 로도코커스(Rhodococcus) 종 HT 29-7 FERM BP 3857 또는 고르도나 테래(Gordona terrae) FERM BP 4535의 니트릴라제 중에서 선택된 니트릴라제에 의하여 가수분해됨을 특징으로 하는 α-치환된 4-메틸티오부티르산 라세미체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 α-치환된 4-메틸티오부티로니트릴 라세미체가 4-메틸티오-2-하이드록시부티로니트릴임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 배지의 pH가 4 내지 11임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 가수분해 온도가 30 내지 60℃임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, α-치환된 4-메틸티오부티로니트릴의 출발 용액내 농도가 10 내지 400 mmol/ℓ임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, α-치환된 4-메틸티오부티르산의 용액내 농도가 10 내지 2000 mmol/ℓ임을 특징으로 하는 방법.