RU1779258C

RU1779258C - Способ получени N-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтических солей

Info

Publication number: RU1779258C
Application number: SU904743571A
Authority: RU
Inventors: Шушкович Божидар; Наумски Радмила; Гомерчич Вера; Мубрин Зденко
Original assignee: Плива Фармацойтска, Кемийска, Прерамбена И Козметичка Индустрия С.Р.О.
Priority date: 1989-03-27
Filing date: 1990-03-26
Publication date: 1992-11-30
Also published as: CS149090A2; EP0390039A3; YU62689A; PL162969B1; CA2013065A1; BG51456A3; HU901831D0; RO105699B1; EP0390039A2; JPH04193898A; HU202546B; DD296085A5; US5153173A; HUT53661A

Abstract

ИСПОЛЬЗОЕ ание в биологии и медицине. Сущность изобретени получение М-ациИзобретение относитс к способу получени новых биологических активных соединении - N-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтически примен емых солей, которые могут найти применение в биологии и медицине . Известен мономер пептидогликана (PGM), обладающий им,муномодулирующей и актиметастатической активностью PGM - нетоксичное и апирогенное соединение, ходильных производных пептидогликанового мономера формулы I Ctfj СН) но H«jCСН2ОН |Hjr--0((n2v,OH /ф-WWCOWHCHCOVHCHCaW кноссн,/мсссн,,е ЈНнг 7CHJ и / / f 5CHCOWHCHCOWHCHCOC4 , I,п..н % Ь RHtVtH-COV/h сн&amp; С% где R - С2 - Cie ацил неразаветвленной кислоты, Cs разветсленной кислоты, Cis-ал- кенилкарбоновой кислоты, С ароматической карбоновой кислоты. Реагент 1. соединение I, где R - Н, реагент 2- ROH. Услови реакции: основание, продукты выдел ют в свободном виде или в виде соли 2 та б л рошо растворимо в воде, но не растворимо в органических растворител х Благодар высоко гидрофильной и липофобной природе оно не способно проникать через липо- фильные мембранв в организме Степень гидрофильности и липофильности таких соединений может значительно вли ть на их активность. Цель изобретени - способ получени новых производных пептидогликанового маномера, обладающих более высокой имXJ Ч« Ю to сл 00 СА)

Description

мунологической активностью, малотоксичных с более высокой степенью липофильно- сти.

Поставленна ц ель достигаетс описываемым способом получени М-ацильных производных пептидогликанового мономера общей формулы I сн2он

NHOCCHj/ NHOCCH, / снз

CHjCHCONHCHCONHCHCOMH2

VCH2

СН2CHj СН3

CO-NHCHCONHCHCONHCHCOOH

но

сн,он

«Г -бн

1

фг, снг сн,

RHN-CH-CONH2

где R - ацидильна группа;

Са - Cis - алкилкарбоновой кислоты с пр мой цепью;

Сз- а/усилкарбоновой кислоты с разветвленной цепью,

Cie - алкенилкарбоновой кислоты,

С ароматической карбоновой кислоты или их фармацевтически приемлемых солей,

заключающимс в том, что пептидолглика- новый маномер формулы II

О

СН2ОН

-О - Г-0

сн,он

J-0 Ъ ОН

NHOCCH

NHOCCH,

сн,

CHjCHCONHCHCONHCHCONH

г.

/снг снгсн3 сн3

CO-NHCHCONHCHCONHCHCOOH :СНг

снг снг

. H-HN-CH-CONHZ

ввод т во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы 111

R -ОН,

где значени R указаны выше. Процесс ведут в присутствии основани и целевой-про- даукт выдел ют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых солей .

За ходом реакции след т с помощью тонко-слойнои хроматографии (ТСХ) на матрице из силикагнел в качестве адсорбента, и в системе растворител , котора вл етс

подход щей дл разделени продуктов от исходных реагентов, такой как система растворител н-пропанол-вода 7:3 (объем/объем ) (система А).

Продукт получают после добавлени органического растворител , в котором он не растворим, такого как этилацетат (ЕтОАс). Его чист т с помощью обычных методов, таких, как хроматографи на колонке на раз0 личных адсорбентах, например, силикагеле, при элюировании названной выше системой А, или на Сефадексе при элюировании водой.

Изобретение иллюстрируетс следую5 щими примерами.

П р и м е р 1. Получение N а-соли N-аце- тил-P GM.

В раствор PGM (500 г, 0,495 м мол ) в воде (7 мл) добавл ют насыщенный водный

0 раствор бикарбоната натри (№НСОз, 2,75 мл) и раствор охлаждают на лед ной бане при 5°С. В охлажденную смесь добавл ют по капл м ангидрид уксусной кислоты (2,75 мл, 29 ммолей) и все перемешивают 24 ч при

5 20°С. Смесь затем концентрируют с помощью выпаривани при пониженном давлении , дава масл нистый осадок (0,95 г), который раствор ют в воде (2.5 мл) и раздел ют на колонке, заполненной 150 мл Сефа0 деке G-25 тонко-дисперсна , после чего элюируют водой. Продукты, включающие фракции, объедин ют и лиофилизируют, Выход 490 мг(92%)..Т.пл. 186 - 188°С, УФмакс. (вода) (нм) : 202, ИККВг () : 3400 - 3240,

5 1660, 1550, 1410.

1Н ЯМР (Д20) (млн.дол.): 1.90 (с..ЗН СНзСОМН-А2Рт), 1,96 (с., ЗН, СНзСО H-CIc), 2.03 (с., ЗН, С НзСОМН-Mur). Сокращени : А2рт-диаминопиметил

0 Mur-мурамоил

Glc-глкжозаминил

П р и м е р 2. Получение М-стеароил- РСМ.

В раствор PGM (1.546 мг, 1,53 ммол ) в

5 ДМФ (26.6 мл) добавл ют сукциниимидо- стеарат (800 мг, 2.09 ммол ) и триэтиламин (TEA) (0,4 мл, 2,18 ммол ), и смесь перемешивают 20 ч при 20 - 25°С. Получают жела- тинообразную суспензию, в которую

0 добавл ют по капл м при перемешивании ЕтОАс(180мл), и перемешивание продолжают еще в течение 5 ч. Осадок отдел ют с помощью фильтровани и сушат. Выход 2 г. Продукт очищают с помощью хроматогра55 фии на колонке на силикагеле (26 г) и при элюировании системой растворител А. Фракции, включающие продукт, объедин ют и концентрируют с помощью выпаривани растворител при пониженном давлении Выход 1,44 г (57%). Т.пл. 217 220°С , УФмакс (вода)(нм): 204; ИККВг (см 1): 3280,2910,2350, 1635, 1530.

П р и м. е р 3. Получение N-пивалоил- PGM. .

В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммол ) в ДМФ (10 мл) добавл лс сукцинимидо-пи- валат (137 мг, 0,688 ммол ) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл, 0,7 ммол ), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25°С. В прозрачный раствор добавл ют по капл м ЕЮАс (50 мл) и получающийс осадок хран т при перемешивании в течение 2 ч и отфильтровывают . Осадок промывают этилацетатом (2 х 5 мл) и сушат. Выход: 550 мг. Продукт очищают с помощью колонной хроматографии на силикагеле и при элюировании системой растворител А. Фракции, включающие продукт, объедин ют и концентрируют с помощью выпаривани растворител при пониженном давлении. Выход 270 мг (49,8%). Т.пл. 202 - 204°С, УФмакс (вода) (нм): 201;

-1

(см 1): 3400, 3300, 3080, 3050, 2980, 1650, 1540.

П р и м е р 4. Получение М-оленоил-PGM.

В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммол ) в ДМФ (9 мл) добавл ют сукцинимидо-олеат (258 мл, 0,679 ммол ) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл, 0,7 ммол ), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25°С. Добавл ют по капл м этилацетат (50 мл), и получающийс осадок хран т при перемешивании в течение 3 ч. Осадок отдел ют фильтрованием и сушат. Выход 680 мг. Осадок чист т с помощью колонной хроматографии на силикагеле, элюировани системой растворителей А. Фракции, включающие продукт, объедин ют и концентрируют с помощью выпарива- ни растворител при пониженном давлении. Выход 0,345 г (54,6%). Т.пл. 204 - 206°С, УФмакс. (вода) (нм): 198; ИККВг (см 1): 3300, 2950, 2875, 1640, 1555.

П р и м е р 5. Получение М-бензоил-PGM.

В раствор PGM (1,346 мг, 1,33 ммол ) в ДМФ (23,3 мл) добавл ютсукцинимидо-бен- зоат (400 мг, 1,825 ммол ) и триэтиламин (TEA) (0,35 мл), и смесь перемешивают 24 ч при 25°С. Добавл ют по капл м этилацетат (160 мл) и полученную суспензию выдерживают при перемешивании 5 ч. Осадок отде- л ют фильтрованием, промывают этилацетатом (2 х 10 мл) и сушат. Выход 1,45 г. Продукт чист т с помощью хроматографии на колонке на силикагеле при элюировании системой растворител А. Фракции, включающие продукт, объедин ют и концентрируют с помощью выпаривани растворител при пониженном давлении. Выход 1,04 г (69,1%) Т.пл. 173 - 175°С, УФмакс .(вода) (нм): 203, 224 (плечо); ИКкВг (см 1) 3260, 1680, 1515.

Примерыб-9. Аналогичным образом, как описано в примерах 2-5, получают следующие PGM производные: кзприлоиль- ное, лауроильное и пальмитоильное. Оенов- 5 ные физические характеристики указанных производных представлены в табл.1.

П р и м е р 10. Получение N-стеароил- PGM.

В раствор стеариновой кислоты (284,5

0 мг, 1 ммоль) в смеси растворителей этилаце- тат-тетрагидрофуран (1:1, объем/объем, 25 мл) добавл ют N-гидрокси-бензотиазол (HOBt) (162.2 мг, 1,2 ммол ) и ДСС (247 мг, 1,2 ммол ), и смесь перемешивают 16ч при

5 20 - 25°С. Полученный осадок отдел ют с помощью фильтровани и промывают на фильтре этилацетатом (2x3 мл). Маточную жидкость и экстракты объедин ют и выпаривают досуха при пониженном давлении

0 Нечищенный продукт (470 мл) чист т с помощью хроматографии на колонке на силикагеле (5 г) с элюированием системой растворител хлороформ-метанол (100 : 1, объем/объем). Получают 350 мл очищенного

5 N-бензтриазол-стеарата, который раствор ют в ДМФ (20 мл), добавл ют PGM (511 мг, 0,499 ммол ) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл), и смесь перемешивают 16 ч при 20 - 25°С. Получают желатинообразный осадок, к ко0 торому добавл ют этилацетат (88 мл), и пе- ремешивание продолжают в течение дополнительного часа. Осадок отдел ют фильтрованием, повторно суспендируют в этилацетате (45 мл), перемешивают 1 ч и

5 еще раз отфильтровывают и сушат. Выход 621 мг. Продукты чист т с помощью5 хроматографии на колонке на силикагеле (8 г) при элюировании системой растворител А. Фракции, содержащие продукт, объедин 0 ют, растворитель выпаривают при пониженном давлени, и продукт сушат. Выход 542.5 мг(85%). Продукт был индентичен продукту примера 2.

П р и м е р 11. Получение натриевой соли

5 М-стеароил-PGM.

N-стеароил-РСМ Примера 2 (1.276.5 мг, 1 ммоль) добавл ют к воде (20 мл), где растворено эквимол рное количество гидроокиси натри . Чистый раствор переме0 шивают в течение 1 ч и лиофилизуют. Выход 1,281 мг.

Пример12. Получение натриевой соли М-стеароил-Р6М. ,

Согласно процессу примера 2 неочи5 щенный продукт, полученный после осаждени с помощью добавлени этилацетата, суспендируют в воде, нейтрализуют добавлением гидроокиси натри до рН 7, после чего прозрачный раствор выливают в колонку , заполненную Sephadex G-25 fine, после

чего осуществл ют элюирование водой, Фракции, включающие индентичный продукт , как в примере 11, объедин ют и лио- филизируют

Аналогичным образом, как описано в примерах 11 и 12, получают дополнительные фармацевтически приемлемые соли

Биологическа активность М-ацилпро- мзводных PGM,

Эффект N-ацилпроизводных PGM был исследован на иммунологическую активность . Примен лись два иммунологических метода. Один относитс к гуморальной, а другой к клеточной иммунной реактивности. Гуморальна имунна реактивность была выражена модификацией технологически клеткообразуемых плашек Jerhe и др (2),

Замедленный гип гиперчувстпительно- сти использовалс как метод выражени клеточного иммунного ответа (2).

Дл эксперимента использовались мышь-самец, линии СВА/1, 6-8 недельного возраста. В каждую экспериментальную группу включалось 5-8 мышей.

Отрицательной контрольной группе вводили обычный сол ной раствор.

Положительна контрольна группа получает МДР. Все активные вещества дают в эквимол рных концентраци х, обеспечивающих 100 мг МДР на мышь. Результаты выражают как абсолютное число PFC на мышь дл гуморальной и отек задней лапы в мм х 0,1 дл клеточной имуннореактивно- сти.

Дл статического анализа используют t-тест Student, потому, что незначительные отклонени от нормального распределени были найдены тестом Смирнова-Холмогорова . Уровень Р 0,05 рассматривалс значительным . Значимость различий оценивалась с помощью двойного испытани при уровне приемлемости, равном или менее 5%. Суммированные результаты действий индивидуальных N-ацильных производных на параметры иммунной ответной реакции приведены в табл.2 и на чертеже.

Статически значимое увеличение веса селезенки было обнаружено после применение натриевой соли М-стеароил-PGM и натриевой соли М-олеоил-PGIVt (13% и 21 % соответственно по сравнению с контрольными значени ми). Относительное увеличение веса селезенки было также найдено после использовани Na-соли М-бензоил- PGM, Na-соли М-лауроил-PGM и Na-соли N- гшвалоил-PGM различи по отношению к контрольным величинам не значительно увеличивались, хот имела место отчетливо выраженна тенденци улучшенной активности указанных производных. Изменени

числа лимфоцитов селезенки (абсолютное число в 1 мл) отличались дл каждого производного . В группе мышей, которые получали Na-соли N-лауроил-РСМ; наблюдалось статистически значимое уменьшение в 20% по сравнению с контрольными величинами. У мышей, которым давали Na-соль G-каприло- ил-PGM, имело место статистически значимое увеличение числа лимфоцитов

0 селезенки (19%). Уменшение 4-6% числа лимфоцитов селезенки было обнаружено у мышей после назначени им пивалоильных и ацетильных производных, тогда как увеличение 3 - 9% было найдено у мышей, кото5 рым давали олеоильное,-каприноильное и пальмитоиль.ное производное PGM. Хот имела место вно определенна тенденци в достигнутых изменени х, последние не представл ли статическую значимость. Ни0 какого эффекта на число лимфоцитов селе- ззнки не было со стороны Na-солей стеароильных и бензоильных производных PGM. фактически все проверенные вещества обнаружили увеличение PFC,-которое

5 варьировало в пределах 10 - 66% по сравнению с контрольными величинами. Статистически значима разница, однако, была обнаружена только в случае Na-солей N- бензоил, N-лауроил и N-папьмитоил прриз0 водных PGM. Все использованные вещества усиливали активность PFC, о чем свидетельствовали данные по отношению к числу лимфоцитов селезенки, .1 которые варьировали в пределах 9 - 75% по сравне5 нию с величинами, обнаруженными в контрольной группе мышей. Статистически значимое различие было найдено дл лауро- ильного производного PGM. Ясно выраженна усиливающа с тенденци была

0 обнаружена в случае бензоильного и ацетильного производных PGM, когда различи по сравнению с контрольными значени ми практически достигали статистически значимого уровн (0,5 р 0,1).

5На основании полученных результатов

можно сделать вывод, что все проверенные N-ацильные производные пептидогликано- вого мономера про вл ют определенную иммуностимулирующую активность, и тем

0 не менее индивидуальные производные отличаютс по их эффективности. Одна из воз- можных интерпретаций разнообрази получающихс различий в числе лимфоцитов и увеличении веса селезенки могла бы

5 заключатьс в различных механизмах активности PGM и его за вленных N-ацильных производных в отношении клеточной имун- ной системы. Другой возможной причиной мог бы быть тот факт, что они сходны по механизму активности, и все же отличаютс

по их внутренней (свойственный им) активности , Действие на гуморальный иммунитет очевидно на основании измерений активности PFC и отличаетс до некоторой степени от действи на число лимфицитов селезенки . Значительное вли ние на общую активность PFC было обнаружено в случае бензоильного, лауроильного и пальмито- ильного производных PGM, что существенно не измен ет и не уменьшает число лимфицитов в 1 мг ткани селезенки.

Структурные модификации молекулы PGM привели в результате к новой и неочевидной биологической активности описыва- емых N-ацильных произвольных PGM. продемонстрированной двум различными пут ми: значительное вли ние на клеточную иммунную ответвую реакцию, характерное дл лауроильного и каприлоильного произ- водного PGM; с другой стороны, бензоиль- ное, лауроильное и пальмитоильное производные PGM более значительно вовлечены были в гуморальный иммунитет. Полученные результаты продемонстирова- ли превосход щую активность соединений по изобретению вследствие их действи на клеточный и гуморальный иммунитет; кроме того, они показали лучшую активность по сравнению с исход- ными PGM, когда оно назначалось в той же концентрации При этом соединени по изобретению мало токсичны (от 1 - 5 г/кг) и обладает более высокой липо- фильностью.

Claims

Формула изобретени

Способ получени N-ацильных производных пептидогликанового мономера фор- 40 мулы

СН2ОНСНоОН

-ОL-0

он ЭГ-О- ОР -он

нг

с Ггсн, сн3

O-NHCHCONHCHCONHCHCOOH снг СНг ;

снг

RHN-CH-CONH.J

где R - ацильна группа С2 - Cia-алкилкар- боновой кислоты с пр мой цепью;

Cs-алкилкарбоновой кислоты с разветвленной цепью, Cie-алкиенилкарбоновой кислоты;

С - ароматической карбоновой кислоты ,

или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийс тем, что, пепти- догликановый мономер формулы

CHjOH

NHOCCH,/ NHOCCH,

7

CHjCHCOMH- СНСОШСН2ОН

-О (.0 Х-ОН

-сн-сомнг

СН,

Ун,

сн,

, н

CO-NH-CHCONHCHCONHCHCOOH

;снг

«гс

т«

н-нм-сн-сошг

ввод т во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы R-OH, где значени R указаны выше, процесс ведут в присутствии основани и целевой продукт выдел ют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых солей.

Таблица 1

Основные физические характеристики N-каприлоил-, N-каприноил, N-лауроил и

N-пальмитоил-производных PGM

Иммунологические эффекты производных N-ацил PGM

Таблица 2