RS60916B1

RS60916B1 - Anti-cd3 antitela, anti-cd123 antitela i bispecifična antitela koja se specifično vezuju za cd3 i/ili cd123

Info

Publication number: RS60916B1
Application number: RS20201167A
Authority: RS
Inventors: Jana Albrecht; Cédric Barriere; Christian Beil; Jochen Beninga; Chantal Carrez; Stéphane Guerif; Katja Kroll; Christian Lange; Cendrine Lemoine; Wulf-Dirk Leuschner; Ercole Rao; Marion Schneider; Marie-Cécile Wetzel; Peter Wonerow
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2020-11-30
Also published as: CA3251582A1; PT3247725T; KR20170101311A; MX2021011696A; KR102680151B1; CR20170383A; KR20240104220A; TN2017000275A1; TW201639885A; JP7269215B2; JP2021072784A; EP4039710A2; TW202130662A; CA2974453A1; MX2021011697A; CN120988137A; JP6817211B2; UA126269C2; NZ772085A; US20180057597A1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na vezujući protein sličan antitelu, koji se specifično vezuje za CD3 i specifično se vezuje za barem još jedan antigen koji je CD123. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske sastave koji sadrže vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku i njihovu upotrebu u tretmanu raka.

[0002] Prva generacija bispecifičnih antitela razvijena je pre više od 20 godina. Od tada su brojne kliničke studije testirale bispecifična antitela napravljena da ciljaju antigene površine ćelije raka. Ova grupa fuzionih proteina protiv raka sadrži dva ili više funkcionalnih domena koji lokalizuju imune efektorske ćelije u blizini ciljanih ćelija raka kako bi postigli aktivnost protiv raka.

[0003] Kako se razvijala tehnologija bispecifičnih antitela, generisana je druga grupa fuzionih proteina nazvana bispecifični angažovane T-ćelije (BiTE) povezivanjem dva jednolačnana varijabilna regiona antitela (scFv) (nisu uključeni Fc segmenti aminokiselina) sa fleksibilnim veznikom, gde jedan scFv vezuje ciljane ćelije, a drugi vezuje CD3 za površinu T ćelije. Jedan BiTE, blinatumomab, sa CD19xCD3 bispecifičnim vezujućim aktivnostima pokazao je obećavajuće rezultate u Fazi II kliničkih ispitivanja za pacijente sa minimalnom rezidualnom bolešću u akutnoj limfoblastici B-soja.

[0004] CD123 (alfa lanac interleukin-3 receptora IL-3Rα) je tumorski antigen prekomerno eksprimiran u raznim hematološkim neoplazmima. Većina AML blasta eksprimira površinski CD123 i ovo eksprimiranje se ne razlikuje u zavisnosti od podtipa AML. Primećeno je da je veće eksprimiranje CD123 pri AML dijagnozi povezano sa lošijom prognozom. Primećeno je da se CD123 eksprimira na leukemičnim matičnim ćelijama (LSC). Sve je više dokaza koji ukazuju na to da AML potiče od ovih leukemičnih matičnih ćelija (LSC) za koje se pokazalo da su mirne i relativno otporne na hemoterapiju koja oštećuje DNK.

[0005] Povećano eksprimiranje CD123 na LSC u poređenju sa hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC) predstavlja stoga priliku za terapijsko ciljanje AML-LSC.

[0006] Prethodno je pokazano da monoklonsko antitelo (MAb) 7G3, podignuto protiv CD123, inhibira proliferaciju posredovanu sa IL-3 i aktivaciju i leukemičnih ćelijskih linija i primarnih ćelija (SAD patent br.6,177,078). Međutim, ostalo je nejasno da li ciljanje CD123 može funkcionalno oštetiti AML-LSC.

[0007] Upotreba CD123xCD3 vezujućeg proteina sličnog antitelu dovodi do ubijanja ćelija tumora, kao što su ovde pokazali pronalazači.

[0008] Ideja o proizvodnji bispecifičnog vezujućeg proteina sličnog antitelu sa bispecifičnim vezujućim aktivnostima CD123xCD3 već je predložena i opisana u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2013/173820.

[0009] Dalje, molekul bispecifičnog antitela na bazi re-targetiranja CD123 x CD3 dvostrukog afiniteta (DART) od MacroGenics ušao je u fazu I kliničkih ispitivanja 2014. godine.

[0010] Međutim, kako su pronalazači pokazali, molekul bispecifičnog antitela na bazi retargetiranja CD123xCD3 dvostrukog afiniteta (DART) od MacroGenics, na primer, ima aktivaciju 82% za T-ćelije koje eksprimiraju CD4+ i 83% za T-ćelije koje eksprimiraju CD8+ u odsustvu ciljanih ćelija. Neodgovarajuća aktiviranje T-ćelija može dovesti do ozbiljnih neželjenih efekata, poput sindroma oslobađanja citokina. Sindrom oslobađanja citokina odnosi se na oslobađanje citokina od strane aktiviranih T ćelija proizvodeći sistemski upalni odgovor sličan onome koji se nalazi kod teških infekcija i koji karakterišu hipotenzija, pireksija i tegobe. Zabeleženi su slučajevi smrti usled sindroma oslobađanja citokina, na primer za OKT3.

[0011] Međunarodna patentnu prijavu objavljena kao WO2013173820, i članak od Kuo i Liu, Protein Engineering, Design & Selection vol.25 no.10 pp.561-569, 2012, obelodanjuju bispecifičnu imunofuziju scFv koja sadrži anti-CD 123 jednolančani Fv (scFv) domen fuzionisan na N-terminusu ljudskog IgG1 zglob-CH2-CH3, i anti-CD3 scFv fuzionisan na C-terminusu (CD123xCD3 Blf).

[0012] Stoga, uprkos ovom napretku u tehnologiji bispecifičnih antitela, ostaje potreba za dodatnim terapijskim lekovima protiv raka, posebno onima koji efikasno ciljaju i ubijaju ćelije raka, bilo direktno ili indirektno.

[0013] Pronalazači su uspeli da generišu, pregledaju i odaberu specifična pacovska anti-CD3 antitela koja pokazuju visok afinitet i za ljudski i za Macaca fascicularis CD3 protein.

[0014] Pronalazači su razvili vezujuće proteine slične antitelu koji imaju biološku i imunu specifičnost za antigen CD3 i bar još jedan ciljani antigen. U jednom primeru, kako bi demonstrirali upotrebu ovih anti-CD3 antitela u generisanju bispecifičnih vezujućih proteina sličnih antitelu, pronalazači su generisali vezujuće proteine slične anti-CD3/anti-CD123 antitelu i pokazali njihovu terapeutsku upotrebu. Ti bispecifični vezujući proteini slični anti-CD3/anti-CD123 antitelima imaju nisku aktivaciju T-ćelija, kao što je primećeno samo za anti-CD3 antitela. Međutim, kada CD123 eksprimiraju ciljane ćelije, kao što su THP-1 ćelije, prisutni, bispecifični vezujući protein sličan anti-CD3/anti-CD123 antitelima pokazuje visoku aktivaciju T-ćelija. Shodno tome, gore definisano anti-CD3 antitelo prema pronalasku je posebno korisno za pripremu vezujućih proteina sličnih antitelu prema pronalasku.

[0015] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Definicije

[0016] Tokom predmetne prijave, izraz „i/ili“ je gramatički veznik koji treba tumačiti tako da obuhvata jedan ili više slučajeva koje povezuje. Na primer, formulacija „takvi proteini nativne sekvence mogu se pripremiti korišćenjem standardnih rekombinantnih i/ili sintetičkih postupaka“ ukazuje na to da se proteini nativne sekvence mogu pripremiti pomoću standardnih rekombinantnih i sintetičkih postupaka ili se proteini nativne sekvence mogu pripremiti pomoću standardnih rekombinantnih postupaka ili se proteini nativne sekvence mogu pripremiti pomoću sintetičkih postupaka.

[0017] Dalje, tokom predmetne prijave izraz „obuhvata“ treba tumačiti kao da obuhvata sve posebno navedene karakteristike, kao i opcione, dodatne, nespecifikovane karakteristike. Kako se ovde koristi, upotreba izraza „obuhvata“ takođe obelodanjuje otelotvorenje u kom nisu prisutne nikakve karakteristike osim specifično navedenih karakteristika (tj. „sastoji se od“). Štaviše, oblici jednine ne isključuju množinu. Sama činjenica da se određene mere iznose u međusobno različitim zavisnim patentnim zahtevima ne ukazuje na to da se kombinacija ovih mera ne može pogodno koristiti.

[0018] Izraz „gen“ označava DNK sekvencu koja kodira, ili odgovara, određenoj sekvenci aminokiselina koja sadrži ceo ili deo jednog ili više proteina ili enzima, i može ali ne mora uključivati regulatorne DNK sekvence, kao što su promotorske sekvence, koje određuju na primer uslovi pod kojima se gen eksprimira. Neki geni, koji nisu strukturni geni, mogu se transkribovati iz DNK u RNK, ali se ne prevode u aminokiselinsku sekvencu. Ostali geni mogu funkcionisati kao regulatori strukturnih gena ili kao regulatori transkripcije DNK. Naročito, izraz gen može biti namenjen genomskoj sekvenci koja kodira protein, tj. sekvenci koja sadrži sekvence regulatora, promotora, introna i egzona.

[0019] Sekvenca „najmanje 85% identična referentnoj sekvenci“ je sekvenca koja u celoj svojoj dužini ima 85% ili više, posebno 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa čitavom dužinom referentne sekvence.

[0020] U kontekstu predmetne prijave, „procenat identičnosti“ izračunava se pomoću globalnog poravnanja u paru (tj. dve sekvence se porede po celoj dužini). Postupci za upoređivanje identičnosti dve ili više sekvenci dobro su poznati u struci. Na primer, može se koristiti program « needle », koji koristi Needleman-Wunsch algoritam globalnog poravnanja (Needleman i Wunsch, 1970 J. Mol. Biol.48:443-453) kako bi se pronašlo optimalno poravnanje (uključujući praznine) dve sekvence kada se razmatra njihova cela dužina.

Program needle je, na primer, dostupan na veb stranici ebi.ac.uk. Procenat identičnosti između dva polipeptida, prema pronalasku, izračunava se pomoću programa EMBOSS: needle (globalnog) programa sa „Gap Open“ parametrom jednakim 10,0, „Gap

Extend“ parametrom jednakim 0,5 i Blosum62 matricom.

[0021] Proteini koji se sastoje od aminokiselinske sekvence „najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične“ referentnoj sekvenci mogu sadržati mutacije kao što su brisanja, umetanja i/ili supstitucije u poređenju sa referentnom sekvencom. U slučaju supstitucija, protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične referentnoj sekvenci može odgovarati homolognoj sekvenci izvedenoj od druge vrste osim referentne sekvence.

[0022] „Aminokiselinska supstitucija“ može biti konzervativna ili nekonzervativna. Poželjno je da su supstitucije konzervativne supstitucije, u kojima je jedna aminokiselina supstituisana drugom aminokiselinom sa sličnim strukturnim i/ili hemijskim svojstvima. Supstitucija poželjno odgovara konzervativnoj supstituciji, kao što je naznačeno u tabeli u nastavku.

[0023] „Antitelo“ takođe nazvano „imunoglobulin“ može biti prirodno ili konvencionalno antitelo u kom su dva teška lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i svaki teški lanac je povezan sa lakim lancem disulfidnom vezom. Postoje dve vrste lakog lanca, lambda (I) i kappa (k). Postoji pet glavnih klasa teških lanaca (ili izotipova) koje određuju funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Svaki lanac sadrži različite domene sekvence. Laki lanac uključuje dva domena ili regiona, varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL). Teški lanac uključuje četiri domena, varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3, zajednički nazvani CH). Varijabilni domeni lakih (VL) i teških (VH) lanaca određuju prepoznavanje vezivanja i specifičnost antigena. Domeni konstantnog regiona lakog (CL) i teškog (CH) lanca pružaju važna biološka svojstva kao što su povezivanje lanca antitela, sekrecija, trans-placentalna pokretljivost, komplementarno vezivanje, i vezivanje za Fc receptore (FcR). Fv fragment je N-terminalni deo Fab fragmenta imunoglobulina i sastoji se od varijabilnih delova jednog lakog i jednog teškog lanca.

Specifičnost antitela leži u strukturnoj komplementarnosti između mesta kombinovanja antitela i antigenske odrednice. Mesto kombinovanja antitela sastoji se od ostataka koji su prvenstveno iz hipervarijabilnih regiona ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Povremeno, ostaci iz nehipervarijabilnih ili okvirnih regiona (FR) utiču na ukupnu strukturu domena, i time i na mesto kombinovanja. Regioni za određivanje komplementarnosti ili CDR se odnose na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona nativnog mesta vezivanja imunoglobulina. Laki i teški lanci imunoglobulina imaju po tri CDR, označena kao CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L i CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H. Konvencionalno antitelo mesto vezivanja antigena, prema tome, uključuje šest CDR, koji sadrže CDR set iz svakog od teškog i lakog lanca V.

[0024] U kontekstu pronalaska, antitelo ili imunoglobulin su IgM, IgD, IgG, IgA i IgE.

[0025] „Okvirni regioni"(FR) se odnose na aminokiselinske sekvence umetnute između CDR, odnosno na one delove varijabilnih regiona lakog i teškog lanca imunoglobulina koji su relativno očuvani među različitim imunoglobulinima u jednoj vrsti. Laki i teški lanci imunoglobulina imaju po četiri FR, označeni FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, odnosno FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H. Prema tome, varijabilni domen lakog lanca tako može biti označen kao (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L) i varijabilni domen teškog lanca tako mogu biti označen kao (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H).

[0026] Poznajući aminokiselinsku sekvencu od CDR, stručnjak može lako odrediti okvirne regione FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L i/ili FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

[0027] Kako se ovde koristi, „ljudski okvirni region“ je okvirni region koji je u suštini identičan (oko 85%, ili više, posebno 90%, 95%, 97%, 99% ili 100%) okvirnom regionu prirodnog ljudskog antitela.

[0028] U kontekstu pronalaska, CDR/FR definicija u lakom ili teškom lancu imunoglobulina treba da se odredi na osnovu IMGT definicije (Lefranc i dr. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).

[0029] Kako se ovde koristi, izraz „antitelo“ označava konvencionalna antitela i njihove fragmente, kao i antitela sa jednim domenom i njihove fragmente, posebno varijabilni teški lanac antitela sa jednim domenom, i himerna, humanizovana, bispecifična ili multispecifična antitela.

[0030] Kako se ovde koristi, antitelo ili imunoglobulin takođe uključuje „antitela sa jednim domenom“ koja su nedavno opisana i koja su antitela čiji su regioni za određivanje komplementarnosti deo polipeptida sa jednim domenom. Primeri antitela sa jednim domenom uključuju antitela teškog lanca, antitela koja su prirodno lišena lakih lanaca, antitela sa jednim domenom izvedena iz konvencionalnih antitela sa četiri lanca, konstruisana antitela sa jednim domenom. Antitela sa jednim domenom mogu biti izvedena iz bilo koje vrste, uključujući, ali bez ograničavanja, miša, čoveka, kamilu, lamu, kozu, zeca, goveda. Antitela sa jednim domenom mogu biti antitela sa jednim domenom poznata kao antitela teškog lanca lišena lakih lanaca. Naročito, Camelidae vrste, na primer dvogrba kamila, jednogrba kamila, lama, alpaka i gvanako, proizvode antitela teškog lanca koja su prirodno lišena lakog lanca. Kamilja antitela teškog lanca takođe nemaju CH1 domen.

[0031] Varijabilni teški lanac ovih antitela sa jednim domenom lišenih lakih lanaca u struci je poznat kao „VHH“ ili „nanotelo“. Slično konvencionalnim VH domenima, VHH sadrže četiri FR i tri CDR. Nanotela imaju prednosti u odnosu na konvencionalna antitela: ona su oko deset puta manja od IgG molekula, i kao posledica toga pravilno savijena funkcionalna nanotela mogu se proizvesti in vitro eksprimiranjem uz postizanje visokog prinosa. Dalje, nanotela su vrlo stabilna i otporna na delovanje proteaza. Svojstva i proizvodnja nanotela opisani su kod Harmsen i De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).

[0032] Izraz „monoklonsko antitelo“ ili „mAb“ kako se ovde koristi odnosi se na molekul antitela sa jednim aminokiselinskim sastavom koji je usmeren protiv određenog antigena i ne sme se tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom.

Monoklonsko antitelo može se proizvesti od jednog klona B ćelija ili hibridoma, ali može biti i rekombinantno, odnosno proizvedeno proteinskim inženjeringom.

[0033] Izraz „himerno antitelo“ odnosi se na konstruisano antitelo koje u svom najširem smislu sadrži jedan ili više regiona jednog antitela i jedan ili više regiona jednog ili više drugih antitela. Naročito, himerno antitelo sadrži VH domen i VL domen antitela izvedenog iz životinje koja nije čovek, u saradnji sa domenom CH i domenom CL drugog antitela, posebno ljudskog antitela. Kao životinja koja nije čovek, može se koristiti svaka životinja poput miša, pacova, hrčka, zeca ili slično. Himerno antitelo takođe može označavati multispecifično antitelo koje ima specifičnost za najmanje dva različita antigena.

[0034] Izraz „humanizovano antitelo“ odnosi se na antitelo koje je u potpunosti ili delimično ne-ljudskog porekla i koje je modifikovano kako bi se zamenile određene aminokiseline, posebno u okvirima teškog i lakog lanca, kako bi se izbegao ili minimizovao imuni odgovor kod ljudi. Konstantni domeni humanizovanog antitela su većinu vremena ljudski CH i CL domeni.

Brojni postupci za humanizaciju sekvence antitela su poznati u struci; pogledati npr. pregled od Almagro & Fransson (2008) Front Biosci.13: 1619-1633. Jedan od najčešće korišćenih postupaka je CDR graftovanje ili preoblikovanje antitela, koje uključuje CDR graftovanje sekvenci donorskog antitela, obično mišjeg antitela, u okvirnu skelu ljudskog antitela različite specifičnosti. Pošto CDR graftovanje može smanjiti specifičnost i afinitet vezivanja, i samim tim i biološku aktivnost, CDR graftovanog ne-ljudskog antitela, mogu se uvesti povratne mutacije na odabranim položajima CDR graftovanog antitela kako bi se zadržala specifičnost vezivanja i afinitet roditeljskog antitela. Identifikacija položaja za moguće povratne mutacije može se izvršiti koristeći informacije dostupne u literaturi i u bazama podataka antitela. Aminokiselinski ostaci koji su kandidati za povratne mutacije obično su oni koji se nalaze na površini molekula antitela, dok ostaci koji su zakopani ili koji imaju nizak stepen površinske izloženosti obično neće biti promenjeni. Alternativna tehnika humanizacije u odnosu na CDR graftovanje i povratne mutacije je ponovno izvlačenje na površinu, gde se zadržavaju ostaci ne-ljudskog porekla koji nisu izloženi površini, dok se površinski ostaci menjaju na ljudske ostatke. Druga alternativna tehnika poznata je kao „vođeni odabir“ (Jespers i dr. (1994) Biotechnology 12, 899) i može se koristiti za otelotvorenje iz, na primer, mišjeg ili pacovskog antitela, potpuno ljudskog antitela koje čuva epitop i karakteristike vezivanja roditeljskog antitela. Naredni postupak humanizacije je takozvana 4D humanizacija. 4D protokol humanizacije je opisan u US20110027266 A1 (WO2009032661A1) patentnoj prijavi i ilustrovan je narednim primenama 4D humanizacije za humanizaciju varijabilnih lakih (VL) i teških (VH) domena pacovskog antitela. U jednom primeru, model homologije pacovskog antitela urađen je sa tipično sa MOE softverom (v.2011.10- Chemical Computing Group, Quebec, Canada) koristeći PDB strukture (Berman i dr., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242) kao šablone i naknadno je smanjena energija upotrebom standardnih postupaka primenjenih u MOE. Zatim je izvedena simulacija molekularne dinamike (MD) na minimalizovanom 3D modelu homologije (urađenom pomoću MOE softvera) pacovskog antitela i upoređena sa, na primer, 49 ljudskih modela izvedenih iz sedam reprezentativnih lakih lanaca (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) i sedam reprezentativnih teških lanaca (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) koji su dizajnirani pomoću LGCR/SDI i dostupni su u okviru MOE. Na primer, jedan model para lanaca (Vkx-Vhx) sa najboljim i hidrofobnim, elektrostatičkim komponentama i identičnosti sekvence izvan CDR izabran je za „4D humanizaciju“. Za povezanost parova između varijabilnog domena pacovskog antitela i izabranog modela, sekvence su poravnate na osnovu tipične optimalne 3D superpozicije alfa ugljenika odgovarajućih modela homologije. Potom su neželjeni motivi razmatrani i mutirani. Na kraju, rezultujuće humanizovane sekvence izbačene su zbog sličnosti sekvenci u odnosu na, na primer, IEDB bazu podataka (http://www.immuneepitope.org; verzija 2012/01/30 dostupna lokalno) kako bi se osiguralo da nijedna sekvenca ne sadrži bilo koji naveden poznati B- ili T-ćelijski epitop.

[0035] Za himerna antitela, humanizacija tipično uključuje modifikaciju okvirnih regiona sekvenci varijabilnog regiona.

[0036] Aminokiselinski ostaci koji su deo CDR obično se neće menjati u vezi sa humanizacijom, mada u određenim slučajevima može biti poželjno izmeniti pojedinačne CDR aminokiselinske ostatke, na primer za uklanjanje mesta glikozilacije, mesta deamidacije ili neželjenog cisteinskog ostatka. N-vezana glikozilacija se javlja vezivanjem oligosaharidnog lanca za ostatak asparagina u tripeptidnoj sekvenci Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro. Uklanjanje mesta N-glikozilacije može se postići mutiranjem bilo Asn, bilo Ser/Thr ostataka na drugi ostatak, posebno konzervativnom supstitucijom. Do deamidacije ostataka asparagina i glutamina može doći u zavisnosti od faktora kao što su pH i površinska izloženost. Ostaci asparagina su posebno podložni deamidaciji, prvenstveno kada su prisutni u Asn-Gly sekvenci, i u manjoj meri u drugim dipeptidnim sekvencama kao što je Asn-Ala. Kada je takvo mesto deamidacije, naročito Asn-Gly, prisutno u CDR sekvenci, može biti poželjno ukloniti mesto, tipično konzervativnom supstitucijom kako bi se uklonio jedan od impliciranih ostataka. Supstitucija u CDR sekvenci radi uklanjanja jednog od impliciranih ostataka takođe je predviđena da bude obuhvaćena predmetnim pronalaskom.

[0037] „Fragmenti“ (konvencionalnih) antitela sadrže deo netaknutog antitela, posebno region vezanja antigena ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, dijatela, bispecifična i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela. Fragment konvencionalnog antitela takođe može biti antitelo sa jednim domenom, poput antitela teškog lanca ili VHH.

[0038] Izraz „Fab' označava fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 50.000 i

1

aktivnost vezivanja antigena, u kom su oko polovina N-terminalne strane H lanca i čitavog L lanca, među fragmentima dobijenim tretiranjem IgG proteazom, papainom, povezane zajedno disulfidnom vezom.

[0039] Izraz „F(ab')2“ odnosi se na fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 100.000 i aktivnost vezivanja antigena, koja je nešto veća od Fab vezanog disulfidnom vezom zglobnog regiona, među fragmentima dobijenim tretiranjem IgG proteazom, pepsinom.

[0040] Izraz „Fab' se odnosi na fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 50.000 i aktivnost vezivanja antigena, koja se dobija presecanjem disulfidne veze zglobnog regiona F(ab')2.

[0041] Jednolančani Fv („scFv“) polipeptid je kovalentno povezan VH::VL heterodimer koji se obično eksprimira iz fuzije gena, uključujući gene koji kodiraju VH i VL, povezane veznikom koji kodira peptid. Ljudski scFv fragment uključuje CDR koji se drže u odgovarajućoj konformaciji, naročito korišćenjem tehnika rekombinacije gena. Dvovalentni i multivalentni fragmenti antitela mogu se formirati bilo spontano udruživanjem monovalentnih scFv, ili mogu nastati spajanjem monovalentnih scFv peptidnim veznikom, kao što je dvovalentni sc(Fv)2. „dsFv“ je VH::VL heterodimer stabilizovan disulfidnom vezom. „(dsFv)2“ označava dva dsFv povezana peptidnim veznikom.

[0042] Izraz „bispecifično antitelo“ ili „BsAb“ tipično označava antitelo, koje kombinuje mesta za vezivanje antigena dva antitela u jednom molekulu. Dakle, BsAb su u stanju da istovremeno vezuju dva različita antigena. Genetski inženjering se sve češće koristi za dizajniranje, modifikovanje i proizvodnju antitela ili derivata antitela sa željenim skupom svojstava vezivanja i efektorskih funkcija, kao što je opisano na primer u EP 2050 764 A1.

[0043] Izraz „multispecifično antitelo“ označava antitelo koje kombinuje mesta za vezivanje antigena dva ili više antitela unutar jednog molekula.

[0044] Izraz „dijatela“ odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem veznika koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta za vezivanje antigena.

[0045] Izraz „hibridoma“ označava ćeliju, koja se dobija podvrgavanjem B ćelije, pripremljene imunizacijom sisara koji nije čovek sa antigenom, ćelijskoj fuziji sa ćelijom mijeloma izvedenom od miša, ili slično, koja proizvodi željeno monoklonsko antitelo koje ima antigensku specifičnost.

[0046] Pod „prečišćen“ i „izolovan“ podrazumeva se, kada se govori o polipeptidu (tj. antitelu prema pronalasku) ili nukleotidnoj sekvenci, da je naznačeni molekul prisutan u suštinskom odsustvu drugih bioloških makromolekula istog tipa. Izraz „prečišćen“ kako se ovde koristi, posebno znači najmanje 75%, 85%, 95% ili 98% masenog udela bioloških makromolekula iste vrste. „Izolovan“ molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u suštini bez drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; međutim, molekul može da sadrži neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike sastava.

[0047] Izraz „antigen“ ili „ciljani antigen“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da se vezuje antitelom ili vezujućim proteinom sličnim antitelu. Izraz se dalje odnosi na molekul ili deo molekula koji je sposoban za upotrebu na životinji kako bi se proizvela antitela koja su sposobna da se vezuju za epitop tog antigena. Ciljani antigen može imati jedan ili više epitopa. U odnosu na svaki ciljani antigen prepoznat od strane antitela ili od vezujućeg proteina sličnog antitelu, vezujući protein sličan antitelu sposoban je da se nadmeće sa netaknutim antitelom koje prepoznaje ciljani antigen.

[0048] „Afinitet“ je u teoriji definisan ravnotežnom asocijacijom između celog antitela i antigena. Afinitet se može eksprimirati, na primer, u polu-maksimalnoj efektivnoj koncentraciji (EC50) ili konstanti disocijacione ravnoteže (KD).

[0049] „Polovina maksimalne efektivne koncentracije“, takođe nazvana „EC50“, odnosi se na koncentraciju leka, antitela ili toksikanta koja indukuje odgovor na pola puta između osnovne i maksimalne vrednosti nakon određenog vremena izlaganja. EC50i afinitet su obrnuto povezani, što je niža EC50vrednost veći je afinitet antitela.

[0050] „KD“ je konstanta disocijacione ravnoteže, odnos koff/kon, između antitela i njegovog antigena. KDi afinitet su obrnuto povezani. KDvrednost se odnosi na koncentraciju antitela i nižu KDvrednost i veći afinitet antitela. Afinitet se može eksperimentalno proceniti različitim poznatim postupcima, kao što su merenje asocijacije i brzine disocijacije sa površinskom plazmonskom rezonancom ili merenje EC50u imunohemijskom testu (ELISA, FACS).

Enzimski povezani imunosorbentni test (ELISA) je biohemijski test koji koristi enzimski imuni test u čvrstoj fazi za detektovanje prisustva supstance, obično antigena, u tečnom uzorku ili mokrom uzorku. Antigeni iz uzorka su pričvršćeni za površinu. Zatim se na površinu nanosi još jedno specifično antitelo kako bi se moglo vezati za antigen. Ovo antitelo je povezano sa enzimom i u završnom koraku se dodaje supstanca koja sadrži supstrat enzima. Kasnija reakcija proizvodi signal koji se može detektovati, najčešće promenu boje na podlozi. Sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS) pruža postupak za sortiranje heterogene smeše bioloških ćelija u dva ili više kontejnera, jednu po jednu ćeliju, na osnovu specifičnog rasejanja svetlosti i fluorescentnih karakteristika svake ćelije. U ovim testovima, EC50je koncentracija antitela koja indukuje odgovor na pola puta između početne i maksimalne vrednosti nakon određenog vremena izlaganja na definisanoj koncentraciji antigena pomoću ELISA (enzimski-povezan imuno-sorbentni test) ili ćelije koja eksprimira antigen pomoću FACS (sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom). Površinska plazmonska rezonanca je postupak bez oznaka kod kog se vezivanje molekula u rastvorljivoj fazi („analit“) direktno meri sa molekulom „liganda“ imobilisanim na površini senzora. U senzorskom uređaju vezivanje liganda se prati optičkim fenomenom nazvanim površinski plazmon. Naročito, kada se molekul „analita“ disocira od molekula „liganda“, primećuje se smanjenje SPR signala (eksprimirano u jedinicama rezonancije, RU). Stope asocijacije („stopa na“, ka) i disocijacije („stopa van“, kd) dobijaju se iz signala dobijenog tokom asocijacije i disocijacije i ravnotežna konstanta disocijacije („konstanta vezivanja“, KD) može se izračunati iz toga. Signal koji se daje u jedinicama rezonancije (RU) zavisi od veličine liganda koji je prisutan u analitu, međutim u slučaju da su eksperimentalni uslovi isti, odnosno da je ligand isti molekul pod istim uslovima, dobijeni RU može da ukazuje na afinitet, odnosno što je veći dobijeni signal u RU, veće je vezivanje.

[0051] Monoklonsko antitelo koje se vezuje za antigen 1 (Ag1) je „unakrsno reaktivno“ na antigen 2 (Ag2) kada su EC50u sličnom rasponu za oba antigena. U predmetnoj prijavi, monoklonsko antitelo koje se vezuje za Ag1 je unakrsno reaktivno za Ag2 kada je odnos

1

afiniteta Ag2 prema afinitetu Ag1 jednak ili manji od 10 (naročito 5, 2, 1 ili 0,5), afiniteti se mere sa ista postupak za oba antigena.

[0052] Monoklonsko antitelo koje se vezuje za Ag1 je „nije značajno unakrsno reaktivno“ na Ag2 kada su afiniteti veoma različiti za dva antigena. Afinitet za Ag2 možda neće biti merljiv ako je odgovor na vezivanje prenizak. U predmetnoj prijavi, monoklonsko antitelo koje se vezuje za Ag1 nije značajno unakrsno reaktivno za Ag2, kada je odgovor vezivanja monoklonskog antitela za Ag2 manji od 5% odgovora vezivanja istog monoklonskog antitela za Ag1 u istom eksperimentalnom okruženju i pri istoj koncentraciji antitela. U praksi koncentracija antitela koja se koristi može biti EC50ili koncentracija potrebna za postizanje zasićenog platoa dobijenog sa Ag1.

[0053] Kako se ovde koristi, „specifičnost“ označava sposobnost antitela da diskriminiše ciljanu peptidnu sekvencu za koji se vezuje („epitop“) od usko srodnih, visoko homolognih peptidnih sekvenci.

[0054] Monoklonsko antitelo „se specifično vezuje“ za Ag1 kada nije značajno unakrsno reaktivno za Ag2.

[0055] „Domen“ može biti bilo koji region proteina, generalno definisan na osnovu homologija sekvenci i često je povezan sa određenim strukturnim ili funkcionalnim entitetom.

[0056] „Rekombinantni“ molekul je onaj koji je pripremljen, eksprimiran, stvoren ili izolovan rekombinantnim načinima.

[0057] Kako se ovde koristi, izraz „pacijent“ označava sisara, kao što su glodar, mačka, pas i primat. Naročito, pacijent prema pronalasku je čovek.

Anti CD3 antitela

[0058] „CD3“ označava antigen koji se eksprimira na T-ćelijama kao deo multimolekularnog kompleksa T-ćelijskih receptora i koji se sastoji od najmanje tri različita lanca CD3ε, CD3δ i CD3γ. CD3δ i CD3γ imaju nisku identičnost sekvence i/ili sličnost sa ljudskim CD3ε (sličnost i identičnost su manji od 20%). CD3ε i CDR3δ mogu zajedno formirati kompleks, ovde nazvan „CD3ε/δ-kompleks“. CD3ε takođe sa CDR3i formira kompleks, takozvani „CD3ε/γ-kompleks“ Grupisanje CD3 na T-ćelijama, na primer, imobilisanim anti-CD3-antitelima, dovodi do aktivacije T-ćelija slično angažovanju receptora T-ćelija, ali nezavisno od tipične specifičnosti njegovog klona. „CD3ε“ sadrži tri domena, unutarćelijski domen, transmembranski domen i vanćelijski domen.

[0059] Većina anti-CD3 antitela iz stanja tehnike prepoznaju CD3ε lanac. Jedno od takvih anti-CD3 antitela iz stanja tehnike je OKT3. Stanje tehnike ilustrovalo je događaje aktivacije T ćelija koji koriste molekule antitela, na primer, primenom molekula antitela OKT3. Anti-CD3 antitelo i njegova varijanta su opisani u stanju tehnike (US 4,361,549 ; US 4,361,549 ; US 5,885,573 ; US 5,929,212 ; i WO 98/52975 ili US 5,955,358). OKT3 se dalje koristi kao snažan imunosupresivni agens u kliničkoj transplantaciji za tretman odbacivanja alografta (Thistlethwaite 1984, Transplantation 38, 695-701; Woodle 1991, Transplantation 51, 1207-1212; Choi 2001, Eur. J. Immunol. 31(1), 94-106).

[0060] Glavni nedostaci ove terapije su aktiviranje T ćelija koja se manifestuje u oslobađanju citokina usled unakrsnog povezivanja između T ćelija i ćelija koje nose FcyR i odgovor ljudskog antimišjeg antitela (HAMA). Nekoliko publikacija je opisalo promene kao što je humanizacija OKT3 radi smanjenja ovih neželjenih efekata: US 5,929,212; US 5,885,573 i drugi. S druge strane, OKT3 ili druga anti-CD3 antitela mogu se koristiti kao imunopotencirajući agensi za stimulisanje aktivacije i proliferacije T ćelija (US 6,406,696 Bluestone; US 6,143,297 Bluestone; US 6,113,901 Bluestone; Yannelly 1990, J. Immunol. Meth. 1 , 91-100). Anti-CD3-antitela su takođe opisana kao agensi koji se koriste u kombinaciji sa anti-CD28-antitelima za indukciju proliferacije T ćelija (US 6,352,694). OKT3 se dalje koristi sam po sebi ili kao komponenta bispecifičnog antitela za ciljanje citotoksičnih T ćelija na ćelije tumora ili ćelije zaražene virusom (Nitta 1990, Lancet 335, 368-376; Sanna 1995, Bio/Technology 13, 1221-1224; WO 99/54440).

[0061] Dosadašnji pristupi korišćenju antitela kao agensa za regrutovanje T-ćelija naišli su na probleme u nekoliko nalaza. Prvo, prirodna ili konstruisana antitela koja imaju visok afinitet za vezivanje za T-ćelije često ne aktiviraju T-ćelije za koje su vezane. Drugo, prirodna ili konstruisana antitela koja imaju nizak afinitet za vezivanje za T-ćelije takođe su često neefikasna u smislu njihove sposobnosti da pokreću ćelijsku lizu posredovanu T-ćelijama.

1

[0062] Referentna sekvenca ljudskog CD3ε proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kakva je bila dostupna je iz baze podataka Uniprot pod pristupnim brojem P07766, i ovde je priložena pod SEQ ID NO: 1 (kakva je bila dostupna 12. decembra 2014).

[0063] Referentna sekvenca pune dužine Macaca fascicularis CD3ε proteina, uključujući signalni peptid, kakva je bila dostupna je iz baze podataka Uniprot pod pristupnim brojem Q95LI5 i ovde je priložena pod SEQ ID NO: 2 (kakva je bila dostupna 12. decembra 2014).

[0064] Sekvenca zrelih ljudskih CD3ε His-označenih Fc-fuzionih proteina, koje su pronalazači klonirali iz genomske DNK, obelodanjena je pod SEQ ID NO: 3. Navedeni zreli ljudski CD3ε His-označeni Fc-fuzioni protein sadrži aminokiseline 23 do 126 ljudskog CD3ε proteina pune dužine, i tako sadrži vanćelijski domen ljudskog CD3ε.

[0065] Sekvenca zrelog Macaca fascicularis CD3ε Fc-fuzionog proteina, koji su pronalazači klonirali iz genomske DNK, obelodanjena je pod SEQ ID NO: 4. Naveden zreo Macaca fascicularis CD3ε Fc-fuzioni protein sadrži aminokiseline 23 do 117 Macaca fascicularis CD3ε proteina pune dužine, i tako sadrži vanćelijski domen ljudskog ili Macaca fascicularis CD3ε, koji sadrži jednu razmenu alanina i valina na aminokiselinskom položaju 35 u poređenju sa aminokiselinskim položajem 57 divljeg tipa sekvence.

[0066] Organizacija domena ljudskog i Macaca fascicularis CD3ε je kako sledi (na osnovu Uniprot P07766 sekvence (čovek) i Uniprot Q95LI5 sekvence (Macaca fascicularis)):

[0067] Shodno tome, vanćelijski domen ljudskog CD3ε sastoji se od aminokiselina na položajima 23 – 126 od SEQ ID NO: 1 i vanćelijski domen Macaca fascicularis CD3ε se sastoji od aminokiselina na položajima 22 - 117 SEQ ID NO: 2.

1

[0068] Pronalazači su uspeli da generišu, pregledaju i odaberu specifična antitela mišja i pacovska anti-CD3 antitela. Ova anti-CD3 antitela pokazuju visok afinitet i za ljudski i za Macaca fascicularis CD3 protein, ali imaju nisku aktivaciju T-ćelija u odsustvu ciljanih ćelija.

[0069] Pronalazači su utvrdili sekvencu varijabilnih teških i lakih lanaca takvih monoklonskih antitela, takozvana anti-CD3 antitela „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“ i „8H2“.

[0070] Takozvano „20G6-F3“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKS NS YATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGQ GVM VTVSS (SEQ ID NO: 5, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVS N RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 9, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0071] Takozvano „4B4-D7“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKARS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQ GVM VTVSS (SEQ ID NO: 12, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su)

1

koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVS N RFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 16, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0072] Takozvano „4E7-C9“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKS NN YATYYAESLKGRFTISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWG QGT SVTVSS (SEQ ID NO: 18, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 20, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLOKPGOSPQPLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELK

(SEQ ID NO: 21, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0073] Takozvano „18F5-H10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKOLEWVAQIKDKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWG RGT SVSVSS (SEQ ID NO: 23, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 25, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVLMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVS

1

NR LSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 26, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO:28.

[0074] Takozvano „12D2-E5“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFYAYWMGWVRQAPGKGLEWIGEIKKD GTTI NYTPSLKDRFTISRDNAQNTLYLQMTKLGSEDTALYYCAREERDGYFDYWGQGVM VTV SS (SEQ ID NO: 29, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H ,od sekvence SEQ ID NO: 30, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 31, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRP DG VPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGIVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 33, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 34, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „RDD“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 35.

[0075] Takozvano „11D7-C3“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQFVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTATYYCRGLYYGLSPSDYWG QGV MVTVSS (SEQ ID NO: 36, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 38, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 39; gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28.

1

[0076] Takozvano „11 H3-E5“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYAYKPFDYWG QGV MVTVSS (SEQ ID NO: 40, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 41, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGQSPQVLIYKVS N RFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 42, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0077] Takozvano „13H2-C2“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EEELVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPDKQLEWVAQIKAKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRYVHYGLAPMDAWG QGT SVTVSS (SEQ ID NO: 43, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 44, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKAGQSPQLLIYKV SN RFSGISDRFSGSGSGTDFILKISRVEPDDLGVFYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 45, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0078] Takozvano „13C1-F6“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGTLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS

2

YATYYAESVKGRFTISRDDSKTSVYLQLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGQ GV MVTVSS (SEQ ID NO: 46, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQSPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQRSGQSPQLLIYKVS N RLSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTRLEIK

(SEQ ID NO: 48, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0079] Takozvano „18H11-F10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVATISISGS RTY YPDSVKGRFTVSRDNAKSSLYLQMNSLKSEDTATYYCATNNPGGWFVYWGQGTL VTV SS (SEQ ID NO: 49, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 50, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 51, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 52, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNINNDLAWYQQKLGEAPRLLIYNANSLQT GIPS RFSGSGSGADFTLTISSLQPEDVATYFCQQYSSGDTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 53, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 54, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „NAN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 55.

[0080] Takozvano „1E6-C9“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSYAWMHWVRQSPDKQLQWVAQIKAK SNN YATYYAESVEGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYGLLGLDAWG QGT SVTVSS (SEQ ID NO: 56, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 57, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 58, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVRLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWFLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGISDRFSGSASGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHVPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 59, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28.

[0081] Takozvano „10F4-C10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLKITCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS NNY ATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRAVNYGNYPLDYWGQG VMV TVSS (SEQ ID NO: 60, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 61, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWCLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 62, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0082] Takozvano „10E6-G6“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGGLVQSGKSLKLTCATSGFTVTNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAK SNN YETYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWG QGV MVTVSS (SEQ ID NO: 63, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 64, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 65, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 47, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGYTYLSWYLQKPGQSPQVFIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 66, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 67, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28.

[0083] Takozvano „18G9-H11“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWIQWVROSPEKQLEWVAQIKAKSN NY ATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTALYYCTWRHYYSSHTMDAW GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 68, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 69, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVAPTDLGVVYCGQGSQVPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 70, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 71.

[0084] Takozvano „11F3-B9“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLTLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWG QGT SVTVSS (SEQ ID NO: 72, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWYLQKPGOSPQLLIYKVS N RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 73, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

2

[0085] Takozvano „12G3-E8“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVRWETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSLAWMHWVRQSPEKKLEWVAQIKDKA NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNRLKEEDTAIYYCRGVYYGFSMTPFDY WGQ GVMVTVSS (SEQ ID NO: 74, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 75, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 77, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVAMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQVLIYKV SN RFSGISDRFSGSGSGADFTLKISRVEPDDLGVYYCGQSTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 78, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0086] Takozvano „5B1-G2“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFSFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKA NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKGSIYLQMNSLKEEDTAVYYCRGLYYGLFPSDYWG QGV MVTVSS (SEQ ID NO: 79, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 81, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLLKPGOSPOLLIYKVS NR FSGISDRFSGGGSGTDFTLKISRLEPDDLGIYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 82, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0087] Takozvano „16F8-A7“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu VETGGNLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNY ATY

YAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGQGTS VTV SS (SEQ ID NO: 83, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 85, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0088] Takozvano „11F9-F8“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGTLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAK SNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKTSVYLQLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGQ GV MVTVSS (SEQ ID NO: 46, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVLTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWSLQKPGQSPQVLIYKVS NR FSGISNRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGAHYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 87, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 88.

[0089] Takozvano „3G5-E10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFNFNVYWMGWVRQAPGKGLEWIGEIKKDS NSI NYTPSLKEKFTISRDNAQNTLYLQVNKLGSEDTAIYYCAREERDGYFDYWGQGVM VTVS S (SEQ ID NO: 89, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 90, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 91, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32, i

2

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYT GV PDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGVSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 93, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „GAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 94.

[0090] Takozvano „9D7-F3“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence AVQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTKP NNY ATYYADSVTGRFIISRDDSRSMVYLQMDNLQTEDTAMYYCTALISTAMAAWGQGT SVT VSS (SEQ ID NO: 95, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 96, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 97, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 98, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYHQMLGEAPKLVISNTNNLQA GIPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSGYTFGLGTKLELK (SEQ ID NO: 99, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „NTN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 101.

[0091] Takozvano „8C2-F7“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKQAPGNGLKWMGWINTQT GK PTYADGFKQRFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGQGVLVTVSS

(SEQ ID NO: 102, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGSHVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLEINRVEPDDLGVYYCGQGAQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 106, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata

2

CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0092] Takozvano „20E5-F10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGENLVQPGKSLRLTCATSGFSFSNAWMHWIRQSPEKQLEWVAQIKDKS NNY ATYYAESVNGRFTISRDDSKSSIYLHMQNLKEEDSAIYYCRYVHVGVRFFVTMDV WGOG TSVTVSS (SEQ ID NO: 107, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 108, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGDQVSISCRPSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPHPLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 109, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0093] Takozvano „20B5-F10“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSISSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRGVYYGFLGMDAWG QGT SVTVSS (SEQ ID NO: 110, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 111, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQRLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLVYK VSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTEYPFTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 112, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 113, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 114.

[0094] Takozvano „6C9-C9“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

2

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence AVQLVESGGGLVRPKESLKISCAASGFTFRNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTQP NNY AKYYADSVKDRFTISRDDSKSMVYLQMDNLKTEDTAMYYCTGLVVTAMDAWGQ GTSV TVSS (SEQ ID NO: 115, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 116, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 117, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 118, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYQQKLGEAPKLLIYVTNNLQTG IPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSMYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 119, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „VTN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 120.

[0095] Takozvano „3E8-G1“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQVVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMDWVRQAPKKGLEWVATITASG SRI YYPDSVKGRFTISRDNAKSSLYLLMNSLKSEDTATYYCARERTDAYFDYWGQGVM VTV SS (SEQ ID NO: 121, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 122, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 123, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 124, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence QFILTQPNSVSTILGSTVKLSCKRSTGNIGTNYVSWYQHHEGRSPTTMIYRDDKRPD GV PDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYISGLNPVFGGGSKLTVL (SEQ ID NO: 125, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 126, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „RDD“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 127.

[0096] Takozvano „3H6-D2“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVETGGRLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKS NN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSIIYLQMNSLKEEDTAIYYCRALTYYGYKRDAMDG

2

WGH GTSVTVSS (SEQ ID NO: 128, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 129, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVS N RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK

(SEQ ID NO: 130, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11.

[0097] Takozvano „8H2“ anti-CD3 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKQAPGNGLKWMGWINTQT GK PTYADGFKQRFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGQGVMVTVSS

(SEQ ID NO: 131, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105, i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DWMTQTPVSLSVAIGQPASISCKSSQSLVGTSGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSK LD SGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVETDDLGVYYCLQGSHFPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 132, gde su CDR prikazani podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 133, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „LVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 134.

[0098] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo se vezuje za ljudski CD3. U još jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo se dalje vezuje za Macaca fascicularis CD3. Naročito, anti-CD3 antitelo se vezuje za vanćelijski domen ljudskog CD3, ili i za ljudski i za Macaca fascicularis CD3. Preciznije, antitelo se vezuje za CD3ε. Preciznije, anti-CD3 antitelo se vezuje za ljudski i Macaca fascicularis vanćelijski domen CD3ε. Anti-CD3 antitelo se vezuje za CD3ε kada je prisutno u obliku kompleksa, kao što je CD3ε/δ kompleks, ili kada je prisutno kao pojedinačni protein, nevezano od toga da li je eksprimirano u izolovanom obliku, ili je prisutno u rastvorljivom vanćelijskom domenu ili u membranski usidrenom CD3ε pune dužine kakav je prisutan, na primer, u T-ćelijama.

2

[0099] Anti-CD3 antitelo je specifično za površinski ljudski protein CD3 ili i za ljudske i za Macaca fascicularis CD3 proteine, posebno za CD3ε.

[0100] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo ima odnos afiniteta za Macaca fascicularis CD3 i afiniteta za ljudski CD3 (KD(Macaca fascicularis)/KD(čovek)) koji iznosi ≤10, naročito ≤6, ≤5, ≤4, ≤3, na primer ≤2, ≤1 ili ≤0,5. Takav polipeptid se može koristiti u toksikološkim studijama izvedenim na majmunima, profil toksičnosti uočen kod majmuna relevantan za predviđanje potencijalnih neželjenih efekata na ljude.

[0101] Naročito, anti-CD3 antitelo se ne vezuje ili ne reaguje značajno unakrsno sa CD3γ i/ili CD3δ proteinima.

[0102] Naročito, antitelo se ne vezuje ili ne reaguje značajno sa vanćelijskim domenom gore navedenog ljudskog i Macaca fascicularis CD3γ i/ili CD3δ proteina.

[0103] Sekvenca ljudskog CD3δ proteina pune dužine dostupna je u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P04234 (SEQ ID NO: 86, kakva je bila dostupna 14. decembra 2014). Vanćelijski domen ljudskog CD3δ sastoji se od aminokiselina na položajima 22-105 SEQ ID NO: 86.

[0104] Sekvenca ljudskog CD3γ proteina pune dužine dostupna je u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P09693 (SEQ ID NO: 185, kakva je bila dostupna 14. decembra 2014). Vanćelijski domen ljudskog CD3γ sastoji se od aminokiselina na položajima 23-116 od SEQ ID NO: 185.

[0105] Dalje, anti-CD3 antitelo ima afinitet (KD) prema ljudskom CD3 ili Macaca fascicularis CD3, ili oba, koji iznosi ≤90nM, ≤50nM ili ≤30nM, na primer ≤ 20nM, ≤ 10nM, ≤ 8nM, ≤ 6nM, ≤ 4nM ili ≤2nM, na primer afinitet od 0,1 nM do 10 nM, posebno od 0,1 nM do 8 nM, ili od 0,1 nM do 4 nM.

[0106] Afinitet za ljudski CD3 ili za Macaca fascicularis CD3 se određuje kao KD vrednost sa površinskom plazmonskom rezonancom korišćenjem rastvorljivog rekombinantnog CD3ε/δ kompleksa od ljudi i Macaca fascicularis kao antigen za hvatanje.

[0107] U jednom primeru, afiniteti vezivanja anti-CD3 antitela mere se površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći, na primer, Biacore3000 instrument(GE Healthcare). Pufer za ispitivanje je, na primer, HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Kao antigen mogu da se koriste, na primer, podjedinice konstrukata vanćelijskog domena ljudskog CD3ε i ljudskog CD3δ, uključujući signalni peptid, u obliku Fc-fuzionih proteina kako je opisano u primerima. Kao alternativa, može se koristiti, kao antigen, podjedinice konstrukata vanćelijskog domena Macaca fascicularis CD3ε i Macaca fascicularis CD3δ, uključujući signalni peptid, u obliku Fc-fuzionih proteina kako je opisano u primerima. Hvatanje ljudskih ili Macaca fascicularis CD3ε/δ-Fc fuzionih proteina se postiže korišćenjem, na primer, kompleta za hvatanje ljudskih antitela (GE Healthcare). Na primer, antitelo za hvatanje može biti povezano sa CM5 čipovima (BR-1001-88, GE Healthcare), na primer približno 12.000 RU koristeći na primer komplet za spajanje amina (BR-100-50, GE Healthcare). Fuzioni proteini CD3ε/δ-Fc hvataju se pri 10 µl/min do približno 70 RU radi dobijanja Rmax vrednosti od 30 RU. Kinetika vezivanja za anti-CD3 antitelo može se meriti, na primer, na 30 µl/min tokom 240 s i 600 s, za fazu asocijacije i disocijacije, respektivno. Na primer, mogu se koristiti dvostruka razblaženja anti-CD3 antitela od 3 do 400 nM u puferu za ispitivanje. Regeneracija površine hvatanja može se izvesti, na primer, injekcijom od 1 min, na primer 3M MgCl2rastvora pri 30 µl/min. Za analizu podataka, na primer, može se koristiti BIA softver za procenu v.4.1 (GE Healthcare). Podaci se mogu globalno uklopiti pomoću 1:1 Langmuirovog modela sa prenosom mase.

[0108] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo takođe ima očigledan EC50kao što je, na primer, utvrđeno FACS analizom na ljudskim T-ćelijama, koji iznosi ≤60nM, na primer ≤50nM, ≤40nM, ≤30nM, ≤20nM ili ≤15nM. Tipično, očigledan EC50je u rasponu od 1 do 60 nM, posebno od 1 do 30 nM, na primer od 1 do 20 nM.

[0109] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo ima aktivaciju T-ćelija koja je manja od 10%, manja od 8%, manja od 6%, manja od 4%, manja od 2%, manja od 1%, na primer manja od 0,5% u odsustvu ciljanih ćelija.

[0110] Izraz „aktiviranje T-ćelija“ ovde se odnosi na aktiviranje CD3 signalizacije koja uključuje citotoksičnu fuziju granula, prolazno oslobađanje citokina i proliferaciju. Vezujući protein sličan antitelu i anti-CD3 antitela pronalaska ciljaju na CD3ε i aktiviraju T-ćelije u

1

prisustvu ciljanih ćelija; ova aktivnost se takođe naziva „efekat angažovanja T-ćelija“. Efekat angažovanja T-ćelija indukuje citotoksičnost u ciljanoj ćeliji.

[0111] Kao što je poznato stručnjaku u ovoj oblasti, aktiviranje T-ćelija indukuje eksprimiranje površinskog markera kao što su CD69 i CD25. Aktivacija T-ćelija se tako može izmeriti detektovanjem i merenjem eksprimiranja CD4+/CD25+, CD4+/CD69+, CD8+/CD25+ ili CD8+/CD69+ T ćelija. Postupci za merenje aktiviranja T-ćelija poznati su stručnjacima u oblasti.

[0112] Postupak za merenje aktiviranja T-ćelija je dalje obelodanjen u odeljku primera (Primer 3.3). U skladu sa tim, u kontekstu pronalaska, aktiviranje T-ćelija se meri ili kao procenat ćelija koje eksprimiraju CD69 kao % od ukupnog broja ćelija, ili kao procenat ćelija koje eksprimiraju CD4 i CD69 kao % od ukupnog broja ćelija, ili kao procenat ćelija koje eksprimiraju CD8 i CD69 kao % od ukupnog broja ćelija.

[0113] „Nisko aktiviranje T-ćelija“ u kontekstu anti-CD3 antitela prema pronalasku odnosi se na manje od 10%, manje od 8%, manje od 6%, manje od 4%, manje od 2%, manje od 1%, na primer manje od 0,5% aktiviranja T-ćelija u odsustvu ciljanih ćelija.

[0114] Izvedena su poravnanja sekvenci VH i VL regiona od „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-G9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“ i „8H2“ anti-CD3 antitela. Poređenje CDR-H i CDR-L sekvenci pokazuje da su, strukturno, „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“ i „3H6-D2“ blisko povezani, i navedena antitela se verovatno vezuju za isti epitop. Poređenje CDR-H i CDR-L sekvenci navedenih srodnih antitela predstavljeno je na Slikama 1 i 2, respektivno. Identifikovani su CDR položaji koji su striktno očuvani između antitela i za koje se pretpostavlja da su važni za specifičnost, dok bi drugi položaji mogli podržati supstituciju.

[0115] U skladu sa tim, antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H koji se sastoji od sekvence

2

GFX1X2X3X4AW (SEQ ID NO: 331) gde X1predstavlja T ili S, X2predstavlja F ili V, X3predstavlja S ili T i X4predstavlja N, K, L ili Y, ili bilo koja njihova kombinacija i a CDR2-H koji se sastoji od sekvence IKX1X2X3NX4YX5T (SEQ ID NO: 332) gde X1predstavlja A ili D, X2is K ili R, X3predstavlja S ili A, X4predstavlja N ili S i X5predstavlja A ili E, ili bilo koja njihova kombinacija i

a CDR3-H koji se sastoji od sekvence TWRHYYSSHTMDA (SEQ ID NO: 69) ili RALTYYGYKRDAMDG (SEQ ID NO: 129) ili RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO: 333) gde X1predstavlja Y, G ili A, X2predstavlja V, T ili L, X3predstavlja H, N, Y ili Q, X4predstavlja G, R ili A, X5predstavlja F ili V ili je bez aminokiseline, X6predstavlja R ili je bez aminokiseline, X7predstavlja F, S ili I ili je bez aminokiseline, X8predstavlja F, L, N, M, Y, S, A ili G, X9predstavlja Y, A, K, S, N, T, F ili L, X10predstavlja A, P, G ili T, X11is M, L, F ili S i X12predstavlja A, V ili Y, ili bilo koja njihova kombinacija, i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L koji se sastoji od sekvence QX1LX2HX3NGX4TY (SEQ ID NO: 334) gde X1predstavlja R ili S, X2predstavlja V ili E, X3predstavlja N, D ili T, i X4predstavlja N ili Y, ili bilo koja njihova kombinacija i a CDR2-L koji se sastoji od sekvence „KVS'; i

a CDR3-L koji se sastoji od sekvence GQGX1X2YPFT (SEQ ID NO: 335) gde X1predstavlja T, A ili S i X2predstavlja H, E ili Q, ili bilo koja njihova kombinacija.

[0116] Prema otelotvorenju, anti-CD3 antitelo obuhvata CDR sekvence teškog ili lakog lanca jednog od 28 takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“ i „8H2“ anti-CD3 antitela navedenih iznad.

[0117] Stoga, ovde je obelodanjeno anti-CD3 antitelo, koje obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 6 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 7 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 8 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 142 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 142 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 14 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 15 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

c) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 19 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 20 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 20 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 22 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 22 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

d) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 24 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 24 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 19 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 25 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 25 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 27 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 27 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28 ili sekvence koja se

4

razlikuje od SEQ ID NO: 28 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

e) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 30 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 30 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 31 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 31 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 32 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 34 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 34 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „RDD“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „RDD“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 35 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 35 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

f) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 38 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 38 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 28 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

g) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 41 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 41 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 17 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

h) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 44 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 44 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

i) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 47 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

j) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 50 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 50 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 51 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 51 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 52 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 52 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 54 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 54 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „NAN“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „NAN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 55 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 55 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

k) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 57 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 57 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 58 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 58 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 28 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

l) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 61 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 61 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

m) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 64 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 64 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 65 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 65 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 47 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 67 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 67 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 28 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

n) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 69 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 69 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 71 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 71 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

o) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 84 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

p) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 75 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 75 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 76 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 77 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 77 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

q) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 80 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 76 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 81 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 81 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

r) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 84 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

s) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 47 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 88 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 88 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

t) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 90 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 90 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 91 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 91 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 32 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 93 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 93 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „GAS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „GAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 94 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 94 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

u) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 96 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 96 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 97 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 97 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 98 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 98 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 100 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-L od sekvence „NTN“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „NTN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 101 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 101 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

v) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 103 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 104 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 105 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 11 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

w) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 80 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 19 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 108 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 108 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

x) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 37 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 111 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 111 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 113 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 113 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-L od sekvence „KVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „KVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 114 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 114 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

y) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 116 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 116 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 117 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 117 po

4

jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 118 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 118 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 100 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-L od sekvence „VTN“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „VTN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 120 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 120 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

z) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 122 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 122 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 123 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 123 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 124 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 124 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 126 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 126 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-L od sekvence „RDD“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „RDD“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 127 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 127 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

aa) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 19 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 129 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 129 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

bb) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 103 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 104 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 105 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 133 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 133 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „LVS“ ili sekvence koja se razlikuje od sekvence „LVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 134 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 134 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji.

[0118] Jedna ili više pojedinačnih aminokiselina mogu se izmeniti supstitucijom, naročito konzervativnom supstitucijom, u jednoj ili više gore navedenih CDR sekvenci. Takva promena može biti namenjena, na primer, uklanjanju mesta glikozilacije ili deamidacije, u vezi sa humanizacijom antitela.

[0119] Na osnovu poravnanja sekvenci VH i VL regiona od „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“ i „3H6-D2“ identifikovane su različite aminokiselinske supstitucije. Stoga, u jednom otelotvorenju, aminokiselina je supstituisana:

na CDR1-H na jednom ili više položaja 3 do 6, na primer na položaju 3, 5 ili 6 od CDR1-H od sekvence GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13) ili na primer na položaju 4 i 5 od CDR1-H od sekvence GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13); i/ili

na CDR2-H, na jednom ili više položaja 3 do 5, 7 i 9, na primer na položajima 3, 4, 5, 7 ili 9 od CDR2-H od sekvence IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37), ili na primer na položajima 3 i 5 ili 3 i 7 od CDR2-H od sekvence IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37); i/ili

na CDR3-H, na jednom ili više položaja 2 do 4, 7 do 10 i 12, na primer na položajima 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 i 10 ili na položajima 2, 4, 6, 8, 10 i 12 ili na položajima 2, 3, 7 i 8 od CDR3-H od sekvence RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:8), ili na položaju 7 i 8 od CDR3-H od sekvence RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38), ili na položaju na položajima 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 i 10 od CDR3-H od sekvence RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38); i/ili

na CDR1-L, na jednom ili više položaja 2, 4, 6, i 9, na primer na položaju 6 od CDR1-L od sekvence QSLVHDNGNTY (SEQ ID NO: 17) ili QSLVHTNGNTY (SEQ ID NO: 27) ili na položaju 2 od CDR1-L od sekvence QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO : 10) ili QRLVHNNGNTY (SEQ ID NO : 113) ili na položaju 4, 6 i 9 od CDR1-L od sekvence QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO : 10); i/ili

na CDR3-L, na jednom ili više položaja 4 i 5, na primer na položaju 4 od CDR3-L od sekvence GQGSQYPFT (SEQ ID NO: 71) ili GQGTQYPFT (SEQ ID NO: 11), ili na položaju 4 i 5 od CDR3-L od sekvence GQGAHYPFT (SEQ ID NO: 88) ili položaju 5 od CDR3-L od sekvence GQGTHYPFT (SEQ ID NO: 28) ili GQGTEYPFT (SEQ ID NO: 114).

[0120] Anti-CD3 antitelo je naročito konvencionalno antitelo, posebno konvencionalno monoklonsko antitelo, ili njegov fragment, bispecifično ili multispecifično antitelo.

[0121] Anti-CD3 antitelo naročito sadrži ili se sastoji od IgG, ili njegovog fragmenta.

[0122] Takođe je obelodanjeno anti-CD3 antitelo, koje obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili c) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 20 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

d) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 25 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28; ili

e) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 30, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 31, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 34, CDR2-L od sekvence „RDD“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 35; ili

f) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 38 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28; ili

g) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 41 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2-L

4

od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

h) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 44 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

i) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

j) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 50, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 51, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 52 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 54, CDR2-L od sekvence „NAN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 55; ili

k) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 57, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 58 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28; ili

I) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 61 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

m)varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 64, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 65, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 67, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28; ili

n) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 69 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 71; ili

o) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

p) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 75, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 77 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

q) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 76, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 81 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

r) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 84 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

s) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 47 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 88; ili

t) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 90, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 91, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 32 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 93, CDR2-L od sekvence „GAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 94; ili

u) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 96, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 97, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 98 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100, CDR2-L od sekvence „NTN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 101; ili

v) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

w) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 80, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 108 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

x) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 37, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 111 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 113, CDR2-L od

4

sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 114; ili

y) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 116, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 117, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 118 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 100, CDR2-L od sekvence „VTN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 120; ili

z) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 122, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 123, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 124 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 126, CDR2-L od sekvence „RDD“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 127; ili

aa)varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 129 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

bb) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 103, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 104, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 105; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 133, CDR2-L od sekvence „LVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 134.

[0123] Obelodanjenje takođe pruža anti-CD3 antitelo koje sadrži barem varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca jednog od takozvanih anti-CD3 antitela koja su navedena iznad.

[0124] Stoga, ovde je naročito obelodanjeno anti-CD3 antitelo, koje obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 5 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 9, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

b) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 12 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 16, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

c) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 18 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 21, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

d) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 23 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 26, ili

4

sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

e) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 29 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 33, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

f) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 36 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 39, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

g) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 40 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 42, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

h) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 43 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 45, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

i) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 46 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 48, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

j) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 49 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 53, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

k) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 56 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 59, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

I) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 60 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 62, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

m) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 63 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 66, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

n) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 68 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 70, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

o) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 72 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 73, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

4

p) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 74 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 78, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

q) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 79 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 82, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

r) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 83 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 85, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

s) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 46 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 87, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

t) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 89 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 92, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

u) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 95 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 99, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

v) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 102 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 106, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

w) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 107 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 109, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

x) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 110 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 112, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

y) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 115 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 119, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

z) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 121 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 125, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

aa) varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 128 ili sekvence koja je

4

najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 130, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

bb)varijabilni domen teškog lanca od sekvence SEQ ID NO: 131 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca od sekvence SEQ ID NO: 132, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom.

[0125] Na primer, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može se razlikovati od referentne sekvence SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, prema potrebi, po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija, posebno jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili supstitucija sa kanonskim ostacima. Naročito, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može se razlikovati od referentne sekvence SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132,, samo po konzervativnoj aminokiselinskoj supstituciji.

[0126] Promene sekvence u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132 posebno će biti prisutne u suštini u jednom ili više okvirnih regiona, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L i/ili FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

[0127] Međutim, moguće su i aminokiselinske supstitucije u jednom ili više CDR. Naročito, sekvenca varijabilnog domena lakog lanca može se razlikovati od sekvence SEQ ID NO: 9 barem S do R supstitucijom na položaju 28 od SEQ ID NO: 9 (na CDR1-L), i/ili barem V do E supstitucijom na položaju 30 od SEQ ID NO: 9 (na CDR1-L), i/ili barem N do D ili T supstitucijom na položaju 33 od SEQ ID NO: 9 (na CDR1-L), i/ili barem N do Y supstitucijom na položaju 35 od SEQ ID NO: 9 (na CDR1-L) i/ili se sekvenca varijabilnog domena lakog lanca može razlikovati od sekvence SEQ ID NO: 9 barem T do S ili A supstitucijom na položaju 97 od SEQ ID NO: 9 (na CDR3-L), i/ili barem Q do H ili E supstitucijom na položaju 98 od SEQ ID NO: 9 (na CDR3-L) i/ili se varijabilni domen teškog lanca može razlikovati od sekvence SEQ ID NO: 5 barem T do N ili S supstitucijom na položaju 28 od SEQ ID NO: 5 (na CDR1-H), i/ili barem F do V supstitucijom na položaju 29

4

od SEQ ID NO: 5 (na CDR1-H), ili barem T do N ili Y supstitucijom na položaju 30 od SEQ ID NO: 5 (na CDR1-H), ili barem K do L ili Y supstitucijom na položaju 31 od SEQ ID NO: 5 (na CDR1-H) i/ili se varijabilni domen teškog lanca može razlikovati od sekvence SEQ ID NO: 5 barem D do A supstitucijom na položaju 53 od SEQ ID NO: 5 (na CDR2-H), ili barem K do R supstitucijom na položaju 54 od SEQ ID NO: 5 (na CDR2-H), ili barem S do A supstitucijom na položaju 55 od SEQ ID NO: 5 (na CDR2-H), ili barem S do N supstitucijom na položaju 57 od SEQ ID NO: 5 (na CDR2-H), ili barem A do E supstitucijom na položaju 59 od SEQ ID NO: 5 (na CDR2-H) i/ili se varijabilni domen teškog lanca može razlikovati od sekvence SEQ ID NO: 5 barem G do A supstitucijom na položaju 100 od SEQ ID NO: 5 (na CDR3-H) i/ili barem T do V supstitucijom na položaju 101 od SEQ ID NO: 5 (na CDR3-H) barem Q do Y supstitucijom na položaju 102 od SEQ ID NO: 5 (na CDR3-H).

[0128] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo i njegov fragment su, respektivno, pacovsko antitelo ili njegov fragment.

[0129] U jednom aspektu pronalaska, anti-CD3 antitelo takođe može biti himerno antitelo, i naročito pacovsko/ljudsko antitelo, npr. antitelo koje sadrži pacovske varijabilne domene teškog i lakog lanca i CH domen i CL domen ljudskog antitela.

[0130] U daljem aspektu, anti-CD3 antitelo takođe može biti humanizovano antitelo ili fragment humanizovanog antitela dobijen, na primer, CDR-graftovanjem ili 4D postupkom (US20110027266).

[0131] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo je humanizovano antitelo koje sadrži

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 , ili

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 182.

[0132] Prema daljem otelotvorenju, anti-CD3 antitelo je humanizovano antitelo koje sadrži: a) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 138 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 143; ili

b) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 171 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 158; ili

c) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 176 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 164.

[0133] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo sadrži tri CDR sekvence ili varijabilni domen teškog lanca, ili šest CDR sekvenci ili varijabilne domene teškog i lakog lanca jednog od takozvanih anti-CD3 antitela navedenih iznad.

[0134] Pronalazak se dalje odnosi na fragment humanizovanog anti-CD3 antitela kako je definisano iznad. U jednom aspektu, humanizovano anti-CD3 antitelo opisano iznad je himerno antitelo.

[0135] Anti-CD3 antitelo može takođe biti antitelo sa jednim domenom ili njegov fragment. Naročito, fragment antitela sa jednim domenom može se sastojati od varijabilnog teškog lanca (VHH) koji sadrži CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H jednog od gore opisanih antitela. Anti-CD3 antitelo takođe može biti antitelo teškog lanca, tj. antitelo lišeno lakog lanca, koje može ali ne mora da sadrži CH1 domen.

[0136] Antitelo sa jednim domenom ili njegov fragment može takođe sadržati okvirne regione kamiljeg antitela sa jednim domenom, i opciono konstantni domen kamiljeg antitela sa jednim domenom.

1

[0137] Anti-CD3 antitelo takođe može biti fragment antitela, posebno fragment humanizovanog antitela, odabran iz grupe koju čine Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, i dijatela.

[0138] Shodno tome, anti-CD3 antitelo je Fab koji sadrži ili se sastoji od

a) aminokiselinske sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 186 i/ili aminokiselinske sekvence lakog lanca sekvenca SEQ ID NO: 187; ili

b) aminokiselinske sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 188 i/ili aminokiselinske sekvence lakog lanca sekvenca SEQ ID NO: 189; ili

c) aminokiselinske sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 190 i/ili aminokiselinske sekvence lakog lanca sekvenca SEQ ID NO: 191; ili

d) aminokiselinske sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 192 i/ili aminokiselinske sekvence lakog lanca sekvenca SEQ ID NO: 193.

[0139] U jednom otelotvorenju, CD3-antitelo je bispecifično ili multispecifično antitelo formirano od najmanje jednog fragmenta antitela ili najmanje jednog varijabilnog domena anti-CD3 antitela kako je ovde opisano. Multispecifična antitela su polivalentni proteinski kompleksi kao što je opisano na primer u EP 2050 764 A1 ili US 2005/0003403 A1.

[0140] Bispecifična ili multispecifična CD3-antitela prema pronalasku imaju specifičnost za (a) vanćelijski domen ljudskog ili ljudskog i Macaca fascicularis CD3, ciljano jednim od gore opisanih anti-CD3 antitela i (b) najmanje jedan drugi antigen koji je CD123. Shodno tome, rezultujuće bispecifično antitelo je CD3/CD123 bispecifično antitelo. Konvencionalna bispecifična antitela mogu se proizvesti tehnikama koje su poznate stručnjacima.

[0141] Antitela i fragmenti anti-CD3 antitela prema pronalasku mogu se koristiti u izolovanom (na primer, prečišćenom) obliku ili biti sadržana u vektoru, kao što je membrana ili lipidna vezikula (npr. lipozom).

[0142] U jednom daljem obelodanjenju, anti-CD3 antitelo je za upotrebu u pripremi vezujućeg proteina sličnog antitelu prema pronalasku, dalje definisanog u odeljku „vezujući protein sličan antitelu“.

[0143] Bilo koja kombinacija gore navedenih otelotvorenja pronalaska čini deo pronalaska.

2

Anti CD123 antitela

[0144] „CD123“ (Klaster diferencijacije 123) poznat je i kao„Interleukin 3 receptor, alfa (IL3RA)“ ili „IL3R“, „IL3RX“, „IL3RY“, „IL3RAY“, „hIL-3Ra"i označava interleukin 3 specifičnu podjedinicu heterodimernog receptora citokina. Funkcionalni receptor interleukin 3 je heterodimer koji sadrži specifični alfa lanac (IL-3A; CD123) i beta lanac IL-3 receptora (β0; CD 131) koji se deli sa receptorima za faktor stimulisanja kolonije granulocitnih makrofaga (GM-CSF) i interleukin 5 (IL-5). CD123 je integralni transmembranski protein tipa I sa utvrđenom molekularnom težinom od oko 43 kDa koji sadrži vanćelijski domen uključen u vezivanje IL-3, transmembranski domen i kratki citoplazmatski rep od oko 50 aminokiselina. Vanćelijski domen se sastoji od dva regiona: N-terminalnog regiona od oko 100 aminokiselina, čija sekvenca pokazuje sličnost sa ekvivalentnim regionima GM-CSF i IL-5 receptora alfa-lanaca; i region proksimalan transmembranskom domenu koji sadrži četiri očuvana ostatka cisteina i WSXWS motiv, zajednički ostalim članovima ove porodice receptora citokina. IL-3 vezujući domen sadrži oko 200 motiva aminokiselinskih ostataka citokinskih receptora (CRM), sačinjenih od dva Ig-slična preklopna domena. Vanćelijski domen CD123 je visoko glikozilovan, sa N-glikozilacijom neophodnom kako za vezivanje liganda, tako i za signalizaciju receptora. Porodica proteina okuplja tri člana: IL3RA (CD123A), CSF2RA i IL5RA. Ukupna struktura je dobro očuvana između tri člana, ali homologije sekvence su vrlo niske. Do sada je obelodanjen jedan izoform CD123 dugačak 300 aminokiselina, ali samo na nivou RNK koji je dostupna u Getentry bazi podataka pod pristupnim brojem ACM24116.1.

[0145] SAD patent br.6,177,078 obelodanjuje anti-IL-3Receptor alfa lanac (IL-3Rα, CD123) monoklonsko antitelo 7G3 i sposobnost 7G3 da se vezuje za N-terminalni domen, posebno aminokiselinske ostatke 19-49, IL-3Rα. SAD patent br.6,733,743 obelodanjuje postupak oštećenja progenitornih ćelija hematološkog raka koje eksprimiraju CD123, ali ne eksprimiraju značajno CD131, dovođenjem u dodir ćelije sa sastavom antitela i citotoksičnog agensa (odabranog od hemoterapeutskog agensa, toksina ili radioizotopa koji emituje alfa) gde se sastav selektivno vezuje za CD123 u količini koja je efikasna da izazove ćelijsku smrt. Međutim, ostalo je nejasno da li ciljanje CD123 može funkcionalno oštetiti AML-LSC.

[0146] Referentna sekvenca ljudskog CD123 proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kakva je bila dostupna je iz NCBI baze podataka pod pristupnim brojem NP_002174.1 i pod Uniprot pristupnim brojem P26951 i ovde je obelodanjena pod SEQ ID NO: 194 (kakva je bila dostupna 14. decembra 2014). Referentna sekvenca pune dužine Macaca fascicularis CD123 proteina, uključujući signalni peptid, dostupna je iz GenBank baze podataka pod pristupnim brojem EHH61867.1 i pod Uniprot pristupnim brojem G8F3K3 i ovde je obelodanjena pod SEQ ID NO: 195 (kakva je bila dostupna 14. decembra 2014).

[0147] Sekvenca zrelog ljudskog CD123 Strep-II označenog Fc-fuzionog proteina, koji su pronalazači klonirali iz genomske DNK, obelodanjena je pod SEQ ID NO: 196. Navedeni zreli ljudski CD123 Fc-fuzioni protein sadrži aminokiseline 19 do 305 ljudskog CD123 proteina pune dužine, i tako sadrži vanćelijski domen ljudskog CD123.

[0148] Sekvenca zrelog Macaca fascicularis CD123 Strep-II označenog Fc-fuzionog proteina, koji su pronalazači klonirali iz cDNK, obelodanjena je pod SEQ ID NO: 197.

Navedeni zreli Macaca fascicularis CD123 Fc-fuzioni protein sadrži aminokiseline 19 do 305 Macaca fascicularis CD123 proteina pune dužine, i tako sadrži vanćelijski domen Macaca fascicularis CD123.

[0149] Organizacija domena ljudskog i Macaca fascicularis CD123 je kako sledi (na osnovu ljudske CD123 sekvence dostupne u NCBI bazi podataka pod pristupnim brojem NP_002174.1 (SEQ ID NO: 194) i na osnovu Macaca fascicularis CD123 sekvence dostupne u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem G8F3K3, SEQ ID NO: 195):

[0150] Shodno tome, vanćelijski domen ljudskog CD123 sastoji se od aminokiselina na položajima 19 - 305 od SEQ ID NO: 194.

4

[0151] CD123 (alfa lanac interleukin-3 receptora IL-3Rα) je tumorski antigen prekomerno eksprimiran u raznim hematološkim neoplazmima. Većina AML blasta eksprimira površinski CD123 i ovo eksprimiranje se ne razlikuje u zavisnosti od podtipa AML. Prijavljeno je da je veće eksprimiranje CD123 na AML u dijagnozi povezano sa lošijom prognozom.

Eksprimiranje CD123 je zabeleženo kod drugih hematoloških malignih oboljenja, uključujući mijelodisplaziju, sistemsku mastocitozu, blastičnu neoplazmu plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (BPDCN), ALL i leukemiju dlakavih ćelija.

[0152] CD123 je eksprimiran na AML leukemičnim matičnim ćelijama i sve više dokaza sugeriše da AML potiče od ovih LSC, za koje se pokazalo da su mirni i relativno otporni na hemoterapiju koja oštećuje DNK. Pretpostavlja se da postojanost LSC podleže relapsu nakon početne remisije, i samim tim se iskorenjivanje LSC može smatrati zahtevom za izlečenje i važnim terapijskim ciljem.

[0153] „Leukemične matične ćelije (LSC)“ su ćelije raka koje poseduju karakteristike povezane sa normalnim matičnim ćelijama, to jest svojstvo samoobnavljanja i sposobnost razvijanja višestrukih sojeva. Predloženo je da takve ćelije opstanu u hematološkim rakovima, kao što je AML, kao različite populacije. LCS prisutan kod AML pacijenata se naziva „AML-LCS“.

[0154] „Akutna mijeloidna leukemija (AML)“ je klonski poremećaj koji se klinički predstavlja kao povećana proliferacija heterogenih i nediferenciranih mijeloidnih blasta. Leukemijsku hijerarhiju održava mala populacija LSC (AML-LCS), koji imaju izrazitu sposobnost samoobnavljanja i koji mogu da se diferenciraju u leukemične progenitore. Ovi progenitori generišu veliki broj leukemičnih blasta lako uočljivih kod pacijenata prilikom dijagnoze i recidiva, što na posletku dovodi do smrti. AML-LSC su često prijavljivani kao mirujuće ćelije, za razliku od brzo podeljenih klonogenih progenitora. Ovo svojstvo AML-LSC čini konvencionalne hemoterapeutike koji ciljaju proliferirajuće ćelije manje efikasnim, potencijalno objašnjavajući trenutno iskustvo u kom visok procenat obolelih od AML ulazi u potpunu remisiju, ali gotovo uvek dolazi do recidiva, i <30% odraslih preživljava duže od 4 godine. Pored toga, minimalno rezidualna pojava bolesti i loše preživljavanje pripisani su visokoj učestalosti LSC pri dijagnozi kod AML pacijenata. Shodno tome, imperativ za dugoročno tretman AML (i slično ostalim gore navedenim stanjima hematološkog raka) je da se razviju novi tretmani koji će specifično eliminisati LSC.

[0155] Zabeleženo je prekomerno eksprimiranje CD123 na AML blastima i na CD34+/CD38 AML-LSC u odnosu na normalne hematopoetske ćelije.

[0156] CD123 stoga pruža važan terapeutski cilj za terapiju raka, posebno za terapiju raka kod pacijenata sa lošom prognozom.

[0157] Pronalazači su uspeli da generišu, pregledaju i odaberu specifična mišja i pacovska anti-CD123 antitela koja pokazuju visok afinitet i za ljudski i za Macaca fascicularis CD123 protein, i koja ne reaguju značajno sa ljudskim CSF2RA i IL5RA proteine, kao ni sa Macaca fascicularis CD3 proteinima.

[0158] Pronalazači su utvrdili sekvencu varijabilnog teškog i lakog lanca takvih monoklonskih antitela, takozvana „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

[0159] Takozvano „3E3-D3“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNGGI T DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTL VT VSS (SEQ ID NO: 226, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 227, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 228, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 229, ili

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQNAGI T DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEPTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTL VT VSS (SEQ ID NO: 277, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 227, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO:353, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 229, ili

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence

QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQDGGI DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTL VT VSS (SEQ ID NO: 278, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 227, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 279, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 229, i- varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRP D GVPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 230, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 231, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „RDD“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 232.

[0160] Takozvano „1E1-G5“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKAFGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSG GT NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAICYCALNYGSYYAMDAWGQGTS V TVSS (SEQ ID NO: 198, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASLGQTVTIECRPSEDIYSNLAWFQQKPGSSPQLLIYDANNLADGV P SRFSGSGSGTOYSLKINSLOSEDVASYFCQQYNKYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 202, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 203, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „DAN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 204.

[0161] Takozvano „2B8-F3“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYNMAWVRQAPKKGLEWVATILYDG G RTYYRGSVKGRFTISRDNAKSTLYLRMDSLRSEDTATYYCATHSRGTDYFDYWGQ GV MVTVSS (SEQ ID NO: 205, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 206, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 207, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 208 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence EIVLTQSPTSMTASPGEQVTITCRASSSINYMHWYQQKPGASPRPWIYETSKLASGVP DRFSGSASGTSYSLTINNMEAEDAATYYCQQWNYPSWTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 209, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 210, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „ETS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 211.

[0162] Takozvano „2F8-D6“ anti-CD 123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence OVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIATISSAGST Y YDLVLKSRLSITRDTSKSQVFLKVHSLQTEDTAIYLCARDAPVFNYGSYNAMDSWG QG TSVTVSS (SEQ ID NO: 212, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 213, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 214, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 215 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPSFLSATVGDRVTINCKASQNINKYLNWYQQKLGEAPKRLIYNTNSLQTG IP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLQHKSGLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 216, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 217, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „NTN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO:218.

[0163] Takozvano „3B10-E6“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQQSGPELRRPGSSVRLSCKASGYRIKDFLIHWIKNRPEHGLEWIGWIDPEDGE T KYAQKFQTKATLTADTSSNTAYMOLSSLTSEDTATYFCARWGDVYYGLMRGHVM DA WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 219, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 220, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 221, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 222 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DVLMTQTPVSLPVSLGGQVSISCRSSQSLVHSDGDTYLHWYLQKPGOSPOLLIYRVS N RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGLYYCLQTTHFPPWTFGGGTKLEMK

(SEQ ID NO: 223, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 224, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „RVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 225.

[0164] Takozvano „5A5-B4“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QIQIVQSGSDVTSTCNGCGTCYFSGFSLSTTGICVSWIRQPSGKGQEWLADFCWDD G KGYNPSLKNRLSISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARRRVYYGIYFDYWGQG VM VTVSS (SEQ ID NO: 233, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 234, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 235, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 236 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIVMTQSPALAVSPGERVSISCRASNSVSTRMHWYQQKPGQQPKLLIYGASNLESGV P ARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDIATYFCQQSWNDPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 237, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 238, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „GAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 239.

[0165] Takozvano „6B10-E4“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYNMAWVRQAPKKGLEWVATITYDD HS TYYRDSVKGRFTISRDTAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARLVNYAFAYWGQGTL VTV SS (SEQ ID NO: 240, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 241, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 242, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 243 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence NIVMTOSPKSMSISVGDRVTMNCKASQTVGNNIAWYQQKPGLSPQLLIDYASNRYT GV PNRFTGGGYGTDFILTINSVQAEDAAFYYCQRMYNSPTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 244, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 245, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „YAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 246.

[0166] Takozvano „6C10-C4“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLQESGPSLVQPSETLSLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQHSGKSLEWMGRMWNDG D TSYNSAFTSRLSISRDTSKGQVFLKMNSLQTEDTGTYYCARGHRTPFDYWGQGVM VT VSS (SEQ ID NO: 247, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 248, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 249, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 250 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGQSPKLLIYWA S TRHSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 251, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 252, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253.

[0167] Takozvano „6D6-B8“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASAYTFTDNIIHWVKQSHGKSLDWIGYINPYSG GT NYNGWFRSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSDDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGQGT S VTVSS (SEQ ID NO: 254, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 255, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASLGETVTIDCRPSEDIFNNLAWYQQKPGNSPQLLIYDANSLADGV P SRFSGSGSGTaYSLMIIRLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 256, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 257, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „DAN“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258.

[0168] Takozvano „8B11-B7“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPTLVNPGDSVKMSCKASGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSG GA NYNGKFKSKATLTIDKSSSTAYMEFSRLTSGDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGQGTS VT VSS (SEQ ID NO: 259, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 260, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRTSKDIYSNLAWFQQEPGNSPQLLIYDASNLADGV P SRFSGSGSGTQYSLQINNLQSEDVASYFCHQYNNYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 261, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 262, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „DAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 263.

[0169] Takozvano „9B8-G6“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLQESGPSLVQSSQTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDG D TSYSSALKSRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGDYSSYIYLWFAYWG QG TLVTVSS (SEQ ID NO: 264, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 267 i

[0170] Takozvano „9D7-C8“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLQESGPSLVQSSQTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQTPGKGLEWMGVMWSDG D TSYNSALKSRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGYYSSYLYLWFAYWG Q GTLVTVSS (SEQ ID NO: 268, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 269 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence

1

DIVMTQSPSSLAVSEGETVTINCKSSQSFLSSGDGKNYVAWYQYKPGOSPKLLIYW AS TRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISTVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK

(SEQ ID NO: 270, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 271, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253.

[0171] Takozvano „9F6-G3“ anti-CD123 antitelo obuhvata:

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSD GT NYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMEFSRLTSEDSAIYFCALNYGSYYAMDAWGQGTS V TVSS (SEQ ID NO: 272, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 273, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 274, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRPSEDIHSNVAWYQQKPGNSPQLLIYDASNLADGV P SRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 275, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 276, CDR2-L koji se sastoji od sekvence „DAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258.

[0172] U jednom aspektu, anti-CD123 antitelo se vezuje za ljudski CD123. U drugom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo se dalje vezuje za Macaca fascicularis CD123. Naročito, anti-CD123 antitelo se vezuje za vanćelijski domen ljudskog CD123, ili i za ljudski i za Macaca fascicularis CD123. Preciznije, anti-CD123 antitelo se vezuje za distalni deo CD123, na primer, za aminokiseline na položaju 19 do 49 ljudskog CD123 od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 194. Anti-CD123 antitelo se vezuje za CD123, bez obzira da li je bilo eksprimirano u izolovanom obliku, ili je prisutno u rastvorljivom vanćelijskom domenu ili je membranski-usidren CD123 pune dužine, kao što je prisutan u ćelijama koje eksprimiraju CD123, kao što su AML ćelije ili CD123 transficirane ćelije. Anti-CD123 antitelo je specifično za ćelije koje eksprimiraju ljudske i Macaca fascicularis CD123 proteine na svojoj površini, na primer CD123 koji eksprimiraju ćelije raka.

[0173] Anti-CD123 antitelo ima odnos afiniteta za Macaca fascicularis CD123 u odnosu na

2

afinitet za ljudski CD123 (KD (Macaca fascicularis)/KD(čovek) koji iznosi ≤10, naročito ≤6, ≤5, ≤4, ≤3, ≤2, ≤1 ili ≤0,5. Prema tome, polipeptid se može koristiti u toksikološkim studijama izvedenim na majmunima, profil toksičnosti uočen kod majmuna relevantan je za predviđanje potencijalnih neželjenih efekata na ljude.

[0174] Naročito, anti-CD123 antitelo se ne vezuje ili ne reaguje značajno sa CSF2RA i IL5RA proteinima.

[0175] Naročito, antitelo se ne vezuje ili ne reaguje značajno sa vanćelijskim domenom gore navedenih ljudskih i Macaca fascicularis CSF2RA i IL5RA proteina.

[0176] Dalje, anti-CD123 antitelo ima afinitet (KD) prema ljudskom CD123 ili Macaca fascicularis CD123, ili oba, od ≤50nM, ≤40nM, ≤30nM na primer ≤ 20nM, ≤ 15nM, ≤ 10nM, ≤ 8nM, ≤ 6nM, ≤ 4nM, ≤2nM, ≤1nM ili ≤0,5 nM, na primer afinitet 0,1 nM do 20 nM, na primer 0,1 nM do 10 nM, posebno od 0,1 nM do 2 nM ili od 0,1 nM do 1 nM.

[0177] U jednom primeru, afinitet za ljudski CD3 ili za Macaca fascicularis CD3 se određuje kao KD vrednost površinskom plazmonskom rezonancom korišćenjem rekombinantnog CD123 proteina od čoveka i Macaca fascicularis kao antigen za hvatanje, na primer sa ljudskim i Macaca fascicularis CD123-Fc fuzionim proteinom.

[0178] Kao antigen se mogu koristiti na primer ljudski ili Macaca fascicularis vanćelijski domen CD123, uključujući signalnu sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci od položaja M1 do R305 proteina divljeg tipa (SEQ ID NO: 194 (čovek), SEQ ID NO: 195 (Macaca fascicularis)). Dobijena aminokiselinska sekvenca za ljudski ili Macaca fascicularis zreli CD123 protein navedena je kao SEQ ID NO: 196, odnosno SEQ ID NO: 197. Biacore merenja su poznata stručnjaku. U ovom primeru, Biacore merenje može se izvršiti kako je opisano u odeljku „anti-CD3 antitela“ iznad.

[0179] Anti-CD123 antitelo takođe može imati očiglednu konstantu afiniteta (očigledni KD), kao što je, na primer, utvrđeno FACS analizom na ćelijama koje eksprimiraju CD123, kao što su CD123 transficirane HEK293 ćelije korišćenjem neprečišćenog anti-CD123 antitela u hibridoma supernatantu, koji iznosi ≤20nM, na primer ≤15nM, ≤10nM, ≤6nM, ≤5nM, ≤4nM, ≤3nM, ≤2nM ili ≤1nM. Tipično, očigledni KD je u rasponu 0,1 do 20 nM, naročito 0,1 do 10 nM, na primer 0,1 do 5 nM.

[0180] Poravnanja sekvenci VH i VL regiona takozvanih „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.. Poređenje CDR-H i CDR-L sekvenci pokazuje da su, strukturno, „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“ i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela, sa jedne strane, i „6C10-C4“, 9B8-G6“, „9D7-C8“ anti-CD123 antitela, sa druge strane, blisko povezana, i navedena antitela se verovatno vezuju za isti epitop. Poravnjanje takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“ i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela i „6C10-C4“, 9B8-G6“, „9D7-C8“ anti-CD123 antitela je prikazano na slikama 3 i 4, respektivno.

Poređenje CDR-H i CDR-L sekvenci dalje identifikuje CDR položaje koji su strogo očuvani između dve grupe antitela, i za koje se pretpostavlja da su važni za specifičnost, dok bi drugi položaji mogli podržati supstituciju.

[0181] U skladu sa tim, antitelo obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H koji se sastoji od sekvence X1YTFTDX2I (SEQ ID NO: 336) gde X1predstavlja G ili A i X2predstavlja H, Y ili N, ili bilo koja njihova kombinacija i

a CDR2-H koji se sastoji od sekvence INPYSX1GX2(SEQ ID NO: 337) gde X1predstavlja G ili D i X2predstavlja T ili A, ili bilo koja njihova kombinacija i

a CDR3-H koji se sastoji od sekvence ALNYGSYYAMDA (SEQ ID NO 201), i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L koji se sastoji od sekvence X1DIX2X3N (SEQ ID NO: 338) gde X1is E ili K, X2predstavlja F, H ili Y i X3 predstavlja N ili S, ili bilo koja njihova kombinacija i

a CDR2-L koji se sastoji od sekvence „DAN“ ili „DAS'; i

a CDR3-L koji se sastoji od sekvence X1QYNX2YPYT (SEQ ID NO: 339) gde X1predstavlja H ili Q i X2is I, K ili N, ili bilo koja njihova kombinacija ili

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H koji se sastoji od sekvence GFSLTSYX1(SEQ ID NO: 340) gde X1predstavlja H ili S; i

a CDR2-H koji se sastoji od sekvence MWX1DGDT (SEQ ID NO: 341) gde X1predstavlja S ili N; i

a CDR3-H koji se sastoji od sekvence ARGX1X2X3X4X5X6X7X8X9FX10Y (SEQ ID NO: 342) gde X1is D, Y ili H, X2predstavlja Y ili R, X3predstavlja S ili T, X4predstavlja S ili P, X5predstavlja Y ili je bez aminokiseline, X6is L, I ili je bez aminokiseline, X7predstavlja Y ili

4

je bez aminokiseline, X8is L ili je bez aminokiseline, X9is W ili je bez aminokiseline, X10predstavlja A ili D, ili bilo koja njihova kombinacija, i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L koji se sastoji od sekvence QSFLSSGDX1X2NY (SEQ ID NO: 343) gde X1is E ili G i X2predstavlja R ili K, ili bilo koja njihova kombinacija i

a CDR2-L koji se sastoji od sekvence „WAS'; i

a CDR3-L koji se sastoji od sekvence QQYYDTPLT (SEQ ID NO: 253).

[0182] Prema otelotvorenju, anti-CD123 antitelo obuhvata CDR sekvence teškog ili lakog lanca od one od 13 Takozvano „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela navedenih iznad.

[0183] Stoga, ovde je obelodanjeno anti-CD123 antitelo, koje obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 227 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 227 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 228 ili SEQ ID NO: 353 ili SEQ ID NO: 279 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 228 ili SEQ ID NO: 353 ili SEQ ID NO: 279 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 229 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 229 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 231 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 231 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „RDD“ ili sekvence koja se razlikuje od „RDD“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 232 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 232 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 199 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 200 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 201 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 203 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 203 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „DAN“ ili sekvence koja se razlikuje od „DAN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 204 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 204 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

c) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 206 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 206 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 207 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 207 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 208 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 208 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 210 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 210 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „ETS“ ili sekvence koja se razlikuje od „ETS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 211 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 211 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

d) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 213 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 213 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 214 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 214 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 215 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 215 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 217 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 217 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „NTN“ ili sekvence koja se razlikuje od „NTN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 218 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 218 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

e) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 220 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 220 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 221 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 221 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 222 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 222 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 224 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 224 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „RVS“ ili sekvence koja se razlikuje od „RVS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 225 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 225 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

f) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 234 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 234 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 235 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 235 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 236 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 236 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 238 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 238 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „GAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „GAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 239 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 239 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

g) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 241 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 241 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 242 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 242 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 243 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 243 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 245 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 245 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „YAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „YAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 246 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 246 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

h) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 248 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 248 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 249 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 249 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 250 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 250 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 252 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 252 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „WAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „WAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 253 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

i) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 255 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 255 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 200 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 201 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 257 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 257 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „DAN“ ili sekvence koja se razlikuje od „DAN“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 258 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

j) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 199 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 260 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 260 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 201 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 262 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 262 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „DAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „DAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 263 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 263 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

k) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 265 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 266 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 267 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 267 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 252 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 252 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „WAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „WAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 253 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

l) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 265 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 266 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 269 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 269 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 271 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 271 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L od sekvence „WAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „WAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 253 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili

m) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 273 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 273 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 274 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 274 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 201 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 276 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 276 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji;

CDR2-L od sekvence „DAS“ ili sekvence koja se razlikuje od „DAS“ po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258 ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO: 258 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji.

[0184] Jedna ili više pojedinačnih aminokiselina mogu se izmeniti supstitucijom, naročito konzervativnom supstitucijom, u jednoj ili više gore navedenih CDR sekvenci. Takva izmena može biti namenjena, na primer, uklanjanju mesta glikozilacije ili deamidacije, u vezi sa humanizacijom antitela.

[0185] Na osnovu poravnanja sekvenci VH i VL regiona od „1 E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela identifikovane su različite aminokiselinske supstitucije. Stoga, u jednom otelotvorenju, aminokiselina može biti supstituisana:

na CDR1-H na jednom ili više položaja 1 i 7, na primer na položaju 7 od CDR1-H od sekvence GYTFTDHI (SEQ ID NO:199) ili GYTFTDYI (SEQ ID NO:273) na primer na položaju 1 i 5 od CDR1-H od sekvence AYTFTDNI (SEQ ID NO: 255); i/ili

na CDR2-H, na jednom ili više položaja 6 i 8, na primer na položajima 6 i/ili 8 od CDR2-H od sekvence INPYSGGT (SEQ ID NO: 200) ili INPYSDGT (SEQ ID NO: 274) ili INPYSGGA (SEQ ID NO : 260); i/ili

na CDR1-L, na jednom ili više položaja 1, 4 i 5, na primer na položaju 1 ili 1, 4 i 5 od CDR1-L od sekvence KDIYSN (SEQ ID NO : 262) ili EDIFNN (SEQ ID NO: 257); i/ili

na CDR2-L, na položajima 3 od sekvence „DAN“ ili „DAS'; i/ili

na CDR3-L, na jednom ili više položaja 1 i 5, na primer na položaju 1 i/ili 5 od CDR3-L od sekvence HQYNIYPYT (SEQ ID NO: 258) ili QQYNKYPYT (SEQ ID NO: 204) ili HQYNNYPYT (SEQ ID NO : 263).

[0186] U daljem otelotvorenju, aminokiselina je supstituisana:

na CDR1-H na položaju 8, na primer na položaju 8 od CDR1-H od sekvence GFSLTSYH (SEQ ID NO:265) ili GFSLTSYS (SEQ ID NO: 248); i/ili

na CDR2-H na položajima 3, na primer na položajima 3 od CDR2-H od sekvence MWSDGD (SEQ ID NO: 265) ili MWNDGD (SEQ ID NO: 248); i/ili

na CDR3-H na položajima 4 i 9, na primer na položajima 4 i 9 od CDR3-H od sekvence ARGDYSSYIYLWFAY (SEQ ID NO : 267) ili ARGYYSSYLYLWFAY(SEQ ID NO : 269); i/ili

na CDR1-L, na jednom ili više položaja 9 i 10, na primer na položaju 9 i 10 od CDR1-L od sekvence QSFLSSGDERNY (SEQ ID NO: 252) ili QSFLSSGDGKNY (SEQ ID NO: 271).

[0187] Prema otelotvorenju, antitelo obuhvata

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 227, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:279, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 229, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 231, CDR2-L od sekvence „RDD“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 232; ili

n) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 , i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 203, CDR2-L od sekvence „DAN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 204; ili

o) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 206, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 207, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 208, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 210, CDR2-L od sekvence „ETS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 211; ili

p) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 213, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 214, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 215, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 217, CDR2-L od sekvence „NTN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 218; ili

q) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 220, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 221, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 222, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 224, CDR2-L od sekvence „RVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 225; ili

r) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 234, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 235, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 236, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 238, CDR2-L od sekvence „GAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 239; ili

s) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 241, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 242, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 243 , i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 245, CDR2-L od sekvence „YAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 246; ili

t)varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 248, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 249, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 250, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 252, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253; ili

u) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 255, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 200, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 257, CDR2-L od sekvence „DAN“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258; ili

v) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 199, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 260, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 , i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 262, CDR2-L od sekvence „DAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 263; ili

w) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 267, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 252, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253; ili

x) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 265, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 266, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 269, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 271, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 253; ili

y) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 273, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 274, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 201 , i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 276, CDR2-L od sekvence „DAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 258.

[0188] Anti-CD123 antitelo je naročito konvencionalno antitelo, posebno konvencionalno monoklonsko antitelo, ili njegov fragment, bispecifično ili multispecifično antitelo.

[0189] Anti-CD123 antitelo naročito sadrži ili se sastoji od IgG, ili njegovog fragmenta.

[0190] Obelodanjenje takođe pruža anti-CD123 antitelo, kako je definisano iznad, koje dalje

1

sadrži najmanje varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca jednog od takozvanih anti-CD123 antitela navedenih iznad.

[0191] Stoga, ovde je naročito obelodanjeno do anti-CD123 antitelo, koje obuhvata: a) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 226 ili SEQ ID NO: 277 ili SEQ ID NO: 278 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 230, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili b) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 198 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 202, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

c) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 205 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 209, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

d) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 212 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 216, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

e) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 219 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 223, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

f) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 233 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 237, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

g) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 240 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 244, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

h) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 247 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 251, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

i) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 254 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 256, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

j) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 259 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 261, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

2

k) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 264 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 251, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

l) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 268 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 270, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

m) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 272 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 275, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom.

[0192] Na primer, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može se razlikovati od referentne sekvence SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 ili 275, prema potrebi, po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija, naročito po jednoj ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili supstitucija sa kanonskim ostacima.

Naročito, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može se razlikovati od referentne sekvence SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 ili 275 samo po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

[0193] Promene sekvence u poređenju sa sekvencom SSEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 ili 275 naročito će biti prisutne u suštini u jednom ili više okvirnih regiona, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L i/ili FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

[0194] U jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo i njegov fragment je, respektivno, pacovsko antitelo ili fragment pacovskog antitela.

[0195] Anti-CD123 antitelo može takođe biti himerno antitelo, i naročito pacovsko/ljudsko antitelo, npr. antitelo koje sadrži pacovske varijabilne domene teškog i lakog lanca i CH domen i CL domen ljudskog antitela. Polipeptid može biti fragment takvog antitela. Anti-CD123 antitelo može takođe biti humanizovano antitelo, ili fragment humanizovanog antitela, dobijeno CDR graftovanjem ili 4D postupkom (US20110027266).

[0196] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo je humanizovano antitelo koje sadrži:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 301 i SEQ ID NO: 302; i b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304 i SEQ ID NO: 305.

[0197] U jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo sadrži tri CDR sekvence ili varijabilni domen teškog lanca, ili šest CDR sekvenci ili varijabilne domene teškog i lakog lanca jednog od takozvanih anti-CD123 antitela navedenih iznad.

[0198] Obelodanjenje se dalje odnosi na fragment humanizovanog anti-CD123 antitela kako je definisano iznad. U jednom aspektu, gore opisano humanizovano anti-CD123 antitelo je himerno antitelo.

[0199] Anti-CD123 antitelo takođe može biti antitelo sa jednim domenom ili njegov fragment. Naročito, fragment antitela sa jednim domenom može se sastojati od varijabilnog teškog lanca (VHH) koji sadrži CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H jednog od gore opisanih antitela. CD123-antitelo takođe može biti antitelo teškog lanca, tj. antitelo lišeno lakog lanca, koje može ali ne mora da sadrži CH1 domen.

[0200] Antitelo sa jednim domenom ili njegov fragment mogu takođe da sadrže okvirne regione kamiljeg antitela sa jednim domenom, i opciono i konstantni domen kamiljeg antitela sa jednim domenom.

[0201] Anti-CD123 antitelo takođe može biti fragment antitela, posebno fragment humanizovanog antitela, odabran iz grupe koju čine Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 i dijatela.

[0202] CD123-antitelo takođe može biti bispecifično ili multispecifično antitelo formirano od

4

najmanje jednog fragmenta antitela ili najmanje jednog varijabilnog domena anti-CD123 antitela pronalaska. Multispecifična antitela su polivalentni proteinski kompleksi kao što je opisano na primer u EP 2050 764 A1 ili US 2005/0003403 A1.

[0203] Bispecifična ili multispecifična CD123-antitela mogu imati specifičnost za (a) vanćelijski domen ljudskog ili ljudskog i Macaca fascicularis CD123 ciljanog od strane jednog od gore opisanih anti-CD123 antitela i (b) najmanje jedan drugi antigen.

[0204] Prema pronalasku, drugi antigen je CD3 i shodno tome rezultujuće bispecifično antitelo je CD3/CD123 bispecifično antitelo. Konvencionalna bispecifična antitela mogu se proizvesti tehnikama koje su poznate stručnjacima.

[0205] Antitela i njihovi fragmenti se mogu koristiti u izolovanom (na primer, prečišćenom) obliku ili mogu biti sadržana u vektoru, kao što je membrana ili lipidna vezikula (npr. lipozom).

[0206] U još jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo se koristi za pripremu vezujućeg proteina sličan antitelu, i koji je dalje definisan u odeljku „vezujući protein sličan antitelu“.

[0207] Bilo koja kombinacija gore navedenih otelotvorenja čini deo pronalaska.

Vezujući proteini slični antitelu

[0208] Pronalazači su generisali nekoliko vezujućih proteina sličnih antitelu, takozvani „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ „hz20G6x7G3-TL4“ i „hz20G6xhz7G3“ vezujući proteini slični antitelu, gde izraz „hz“ označava humanizovana antitela. Ovi vezujući proteini slični antitelu imaju CODV dizajn, posebno CODV-Fab ili CODV-Ig dizajn.

[0209] „CODV format“ u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na unakrsnu dvostruko varijabilnu (CODV) konfiguraciju bispecifičnih antitela ili multispecifičnih antitela. CODV format omogućava međusobnu zamenjivost varijabilnih domena uz zadržavanje savijanja i krajnjeg afiniteta vezivanja.

[0210] CODV format je prethodno opisan u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2012/135345. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu iz pronalaska je u CODV formatu kako je prethodno opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2012/135345.

[0211] Pronalazak se odnosi na vezujući protein sličan antitelu u CODV-Fab formatu.

Shodno tome, pronalazak se odnosi na vezujući protein sličan antitelu koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i za bar još jedan ciljani antigen koji je CD123, koji sadrži dva polipeptidna lanca koji čine dva mesta za vezivanje antigena, gde prvi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i drugi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [II]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD3je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i

gde VD1i VD2su oba bilo varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4su oba varijabilni domeni teških lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni lakih lanaca, ili VD3i VD4su oba varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni teških lanaca,

gde je navedeni prvi ili drugi imunoglobulin antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen ljudskog CD3ε proteina i koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; i

gde je drugi od navedenog prvog ili drugog imunoglobulina anti-CD123 antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379.

[0212] Dodavanje Fc domena vezujućem proteinu sličnom antitelu u CODV-Fab dalje stabilizuje vezivni protein sličan antitelu. Preciznije, dodavanje Fc domena polipeptidu formule (II) vezujućeg proteina sličnog antitelu u CODV-Fab povećava poluživot vezujućeg proteina sličnog antitelu i na taj način poboljšava farmakokinetički profil vezujućeg proteina sličnog antitelu. Dodavanje jednog Fc regiona u CODV-Fab rezultuje dimerizacijom polipeptida koji sadrže Fc domen, i rezultujući vezujući protein sličan antitelu je vezujući protein sličan antitelu u CODV-Ig formatu.

[0213] Pronalazak se, prema tome, dalje odnosi na vezujući protein sličan antitelu u CODV-Ig formatu.

[0214] Stoga, pronalazak se dalje odnosi na vezujući protein sličan antitelu koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji čine četiri mesta za vezivanje antigena, gde dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

Fcje zglobni region imunoglobulina i CH2, CH3su konstantni domeni teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

i gde polipeptidi formule I i polipeptidi formule III formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i

gde su VD1i VD2oba bilo varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4su oba varijabilni domeni teških lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni lakih lanaca, ili su VD3i VD4oba varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni teških lanaca,

gde je drugi od navedenog prvog ili drugog imunoglobulina anti-CD123 antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379..

[0215] U navedenom CODV-Ig formatu, dva polipeptidna lanca koja imaju strukturu predstavljenu formulom [III] dimerizuju kroz svoje Fcdomene.

[0216] U daljem otelotvorenju, prvi Fcdomen je dodat polipeptidu formule [II] vezujućeg proteina sličnog antitelu CODV-Fab, i drugi Fcdomen (nazvan Fc2) je dodat polipeptidu formule [I] vezujućeg proteina sličnog antitelu CODV-Fab. Dalje, u istom otelotvorenju veznik L5je prisutan između CLi Fc2domena polipeptidnih lanaca formule [I] što rezultuje polipeptidnim lancima formule [IV].

[0217] U skladu sa tim, pronalazak se dalje odnosi na vezujući protein sličan antitelu koji obuhvata dva polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [IV]:

VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]

i jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

Fc2je zglobni region imunoglobulina i CH2, CH3su konstantni domeni teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, L4i L3su aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule [IV] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i

[0218] Ovaj CODV format, u kom se polipeptidni lanci predstavljeni formulama [III] i [IV] dimerizuju kroz svoje odgovarajuće Fc2i Fcregione, ovde se naziva CODV-Fab-TL.

[0219] U još jednom otelotvorenju CODV-Fab, prvi Fcdomen se dodaje polipeptidnom lancu predstavljenom formulom [II] (što rezultuje formulom [III]), i vezujući protein sličan antitelu sadrži treći polipeptidni lanac koji sadrži ili se sastoji od drugog Fcdomena (nazvan Fc3).

[0220] Pronalazak se dalje odnosi na vezujući protein sličan antitelu koje obuhvata tri polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde

a prvi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

a drugi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc(III)

treći polipeptid Fc3(takođe se naziva Fc patrljak") koji je zglobni region imunoglobulina i CH2, CH3su konstantni domeni teškog lanca imunoglobulina;

gde

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule [I] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i

gde su VD1i VD2oba bilo varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4su oba varijabilni domeni teških lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni lakih lanaca, ili su VD3i VD4oba varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni teških lanaca;

gde je navedeni prvi ili drugi imunoglobulin antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen ljudskog CD3ε proteina i koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; i gde je drugi od navedenog prvog ili drugog imunoglobulina anti-CD123 antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379.

i gde polipeptid formule [III] heterodimerizuje sa trećim polipeptidom kroz njegov Fcdomen.

[0221] Shodno tome, u navedenom otelotvorenju, takozvani „Fc patrljak“ (Fc3) heterodimerizuje sa Fc regionom polipeptida prema formuli III. Ovaj CODV format se ovde naziva CODV-Fab-OL. Ova konstrukt izbegava da CODV-Fab formiraju agregate.

[0222] U jednom otelotvorenju CODV-Fab-OL, i Fci Fc3su varijante imunoglobulina u kojima je modifikovan CH3 domen: svaki od Fci Fc3je genetski konstruisan na CH3-CH3 interfejsu kako bi promovisao stvaranje heteromultimera prema takozvanoj „čvor-urupi“ tehnologiji koja je značajno opisana u patentima US5731168 i US8216805.

[0223] Shodno tome, u jednom otelotvorenju CH3 domen jednog od Fci Fc3sadrži mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V, dok CH3 domen drugog od Fci Fc3sadrži mutacije S354C i T366W (položaj aminokiselina je naznačen pozivanjem na sekvencu IgG1).

[0224] Primeri pogodnih Fci Fc3parova uključuju par SEQ ID NO: 396 (Fc) i SEQ ID NO: 397 (Fc3) i par SEQ ID NO: 394 (Fc) i SEQ ID NO: 398 (Fc3).

[0225] Prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin je jedno anti-CD3 antitelo kako je definisano u odeljku «anti-CD3 antitela» iznad.

[0226] Prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin je jedno anti-CD123 antitelo kako je definisano u odeljku «anti-CD123 antitela» iznad.

1

[0227] Prema jednom otelotvorenju pronalaska, VD1i VD2polipeptida formule I ili formule [IV] su ili varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4polipeptida II ili III su oba varijabilni domeni teških ili lakih lanaca. Ova mogućnost međusobne zamene se takođe naziva „zamenjivost“ i na taj način se određuje unakrsna dvostruka varijabilna (CODV) konfiguracija vezujućih proteina sličnih antitelu prema pronalasku.

[0228] Prema gornjoj definiciji, VD1i VD4su varijabilni domeni teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina i VD2i VD3su varijabilni domeni teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina, VD1i VD4stoga treba smatrati srodnim domenima, kao i VD2i VD3.

[0229] Shodno tome, izraz „ukrštanje“ odnosi se na zamenjeno poravnanje VD1ili VD2polipeptida formule [I] ili formule [IV] u odnosu na njihov srodni varijabilni domen VD4ili VD3polipeptida formule [II] ili formule [III].

[0230] U jednom određenom otelotvorenju, VD1i VD2su varijabilni domeni lakog lanca i VD3i VD4su varijabilni domeni teškog lanca.

[0231] Vezujući proteini slični antitelu prema pronalasku mogu se pripremiti korišćenjem domena ili sekvenci dobijenih ili izvedenih iz bilo kog ljudskog ili ne-ljudskog antitela, uključujući, na primer, ljudska, pacovska ili humanizovana antitela.

[0232] U jednom otelotvorenju, imunoglobulin je IgG imunoglobulin.

[0233] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, CLje konstantni domen lakog lanca IgG imunoglobulina. U daljem otelotvorenju, CH1je CH1konstantni domen teškog lanca IgG imunoglobulina.

[0234] Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku može se pripremiti korišćenjem ovde opisanih domena ili sekvenci anti-CD3 antitela i anti-CD123 antitela.

[0235] Izraz „veznik“ kako se ovde koristi odnosi se na jedan ili više aminokiselinskih ostataka umetnutih između domena imunoglobulina kako bi se pružila dovoljna pokretljivost

2

domena lakog i teškog lanca da se preklope u imunoglobuline sa dvostrukim varijabilnim regionom. U nekim otelotvorenjima, veznik se sastoji od 0 aminokiselina što znači da je veznik odsutan. Veznik se ubacuje na prelazu između varijabilnih domena ili između varijabilnih i konstantnih domena, na nivou sekvence. Prelaz između domena može se identifikovati, jer se približna veličina domena imunoglobulina dobro poznata. Precizno mesto prelaza domena može se odrediti lociranjem peptidnih delova koji ne formiraju sekundarne strukturne elemente kao što su beta-listovi ili alfa-heliksi, što pokazuju eksperimentalni podaci, ili kako se može pretpostaviti tehnikama modeliranja ili predviđanja sekundarne strukture. Veznici opisani u kontekstu pronalaska su veznici L1, L2, L3, L4i L5. L1nalazi se između N-terminala VD1domena i VD2domena; L2nalazi se između VD2i C-terminala CLdomena. Veznici L3i L4nalaze se na polipeptidu kako je definisano prema formuli II ili III vezujućih proteina sličnih antitelu. Tačnije, L3nalazi se između N-terminala VD3i VD4domena i L4se nalazi između VD4i C-terminala CH1-Fc domena. L5se nalazi između CLi N-terminala Fc2. Veznici L1, L2, L3, L4i L5su nezavisni, ali u nekim otelotvorenjima imaju istu sekvencu i/ili dužinu.

[0236] U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelu pronalaska, dužina L3je najmanje dvostruka dužina L1. U ostalim vezujućim proteinima sličnim antitelu prema pronalasku, dužina L4je najmanje dvostruka dužina L2. U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelu pronalaska, dužina L1je najmanje dvostruka dužina L3. U ostalim vezujućim proteinima sličnim antitelu prema pronalasku, dužina L2je najmanje dvostruka dužina L4.

[0237] U jednom otelotvorenju, veznici L1, L2, L3i L4sadrže 0 do 20 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, L5sadrži 0 do 10 aminokiselina.

[0238] U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelu pronalaska, L1je 3 do 12 aminokiselinskih ostataka dugačak, L2je 3 do 14 aminokiselinskih ostataka dugačak, L3je 1 do 8 aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 1 do 3 aminokiselinskih ostataka dugačak. U drugim vezujućim proteinima sličnim antitelu, L1je 5 do 10 aminokiselinskih ostataka dugačak, L2je 5 do 8 aminokiselinskih ostataka dugačak, L3je 1 do 5. aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 1 do 2 aminokiselinska ostatka dugačak. U poželjnom vezujućem proteinu sličnom antitelu L1je 7 aminokiselinskih ostataka dugačak, L2je 5 aminokiselinskih ostataka dugačak, L3je 1 aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 2 aminokiselinska ostatka dugačak.

[0239] U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelu pronalaska, L1je 1 do 3 aminokiselinskih ostataka dugačak, L2je 1 do 4 aminokiselinskih ostataka dugačak, L3je 2 do 15 aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 2 do 15 aminokiselinskih ostataka dugačak. U drugim vezujućim proteinima sličnim antitelu, Li je 1 do 2 aminokiselinska ostatka dugačak, L2je 1 do 2 aminokiselinska ostatka dugačak, L3je 4 do 12 aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 2 do 12 aminokiselinskih ostataka dugačak. U poželjnom vezujućem proteinu sličnom antitelu L1je 1 aminokiselinski ostatak dugačak, L2je 2 aminokiselinska ostatka dugačak, L3je 7 aminokiselinskih ostataka dugačak, i L4je 5 aminokiselinskih ostataka dugačak.

[0240] U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelu pronalaska, L1, L3, ili L4mogu biti jednaki nuli. Međutim, u vezujućim proteinima sličnim antitelu, gde su L3, ili L4jednaki nuli, odgovarajući prelazni veznik između varijabilnog regiona i konstantnog regiona ili između dvostrukih varijabilnih domena na drugom lancu ne može biti jednak nuli. U nekim otelotvorenjima, L1je jednak nuli i L3je 2 ili više aminokiselinskih ostataka, L3je jednak nuli i L1je jednak 1 ili više aminokiselinskih ostataka, ili L4je jednako 0 i L2je 3 ili više aminokiselinskih ostataka.

[0241] U nekim vezujućim proteinima sličnim antitelima pronalaska, najmanje jedan od veznika odabran iz grupe koju čine L2, L3, i L4sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak.

[0242] Primeri pogodnih veznika uključuju pojedinačni ostatak glicina, treonina ili serina; dipeptid kao što je diglicin peptid, histidin-treonin peptid ili glicin-serin dipeptid; tripeptid sa tri glicina, tripeptid Thr-His-Thr, tripeptid Gly-Gly-Ser; peptid sa četiri ostatka glicina; peptid sa pet ostataka glicina; peptid sa šest ostataka glicina; peptid sa sedam ostataka glicina; peptid sa osam ostataka glicina. Mogu se koristiti i druge kombinacije aminokiselinskih ostataka, kao što su peptid Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 354), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), peptid Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 355), peptid Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 356), peptid Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 357), peptid Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 358), i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345). Drugi odgovarajući veznici uključuju pojedinačni Ser, i Val ostatak; dipeptid Arg-Thr, Gin-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, i Ser-Leu; Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-

4

Thr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373); Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 346), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 347), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 348); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 349), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 350), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 351), i Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389). Gore navedeni primeri nisu namenjeni ograničavanju obima pronalaska na bilo koji način, i veznici koji sadrže nasumično odabrane aminokiseline odabrane iz grupe koju čine valin, leukin, izoleukin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat, glutamat, asparagin, glutamin, glicin i prolin pokazali su se pogodnim u vezujućim proteinima sličnim antitelu prema pronalasku.

[0243] Identičnost i sekvenca aminokiselinskih ostataka u vezniku mogu se razlikovati u zavisnosti od vrste sekundarnog strukturnog elementa neophodnog da bude postignut u vezniku. Na primer, glicin, serin i alanin su najbolji za veznike koji imaju maksimalnu fleksibilnost. Neke kombinacije glicina, prolina, treonina i serina su korisne ako je neophodan rigidniji i produžen veznik. Bilo koji aminokiselinski ostatak može se smatrati veznikom u kombinaciji sa drugim aminokiselinskim ostacima za izgradnju većih peptidnih veznika po potrebi u zavisnosti od željenih svojstava.

[0244] U jednom otelotvorenju, veznik L1ima sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), veznik L2ima sekvencu Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), veznik L3ima sekvencu „S“ i veznik L4ima sekvencu „RT“.

[0245] U daljem otelotvorenu, sekvence veznika L1, L2, L3, i L4su izabrane iz grupe koja se sastoji od treonina; dipeptid kao što je histidin-treonin peptid; tripeptida Thr-His-Thr, Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373) i Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374). U jednom otelotvorenju sekvenca veznika L5je odabrana iz grupe kou čine jedan ostatak serina, dipeptid kao što je glicin-serin dipeptid; tripeptid Gly-Gly-Ser, peptid Gly-Gly-Gly- Ser (SEQ ID NO: 354), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), peptid Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 355), peptid Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 356), peptid Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 357), peptid Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 358), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345), i peptid Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389).

[0246] Izraz „Fc domen“ kako se ovde koristi uključuje nativne Fc i Fc varijante i sekvence kako su gore definisane. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc molekula, izraz „Fc domen“ uključuje molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da se digestiraju iz celog antitela ili proizvode na drugi način.

[0247] Izraz „nativni Fc“ kako se ovde koristi odnosi se na molekul koji sadrži sekvencu fragmenta koji ne vezuje antigen, ili je rezultovao digestijom antitela ili je proizveden na drugi način, bilo u monomernom ili multimernom obliku, i može da sadrži zglobni region. Originalni izvor imunoglobulina nativnog Fc je, naročito, ljudskog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, mada se preferiraju IgG1 i IgG2. Nativni Fc molekuli sastoje se od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne ili multimerne oblike kovalentnom (tj. disulfidna veza) i nekovalentnom vezom. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih molekula Fc kreće se od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr. IgG, IgA i IgE) ili potklase (npr. IgGI, IgG2, IgG3, IgAI i IgGA2). Jedan primer nativnog Fc je dimer vezan disulfidom koji nastaje digestijom IgG papainom. Izraz „nativni Fc“, kako se ovde koristi, generički je za monomerne, dimerne i multimerne oblike.

[0248] Izraz „Fc varijanta“ kako se ovde koristi odnosi se na molekul ili sekvencu koji su modifikovani od nativnog Fc, ali i dalje sadrži mesto vezivanja za receptor za spašavanje, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primerne varijante Fc i njihova interakcija sa receptorom za spašavanje su poznate u struci. Prema tome, izraz „Fc varijanta“ može da sadrži molekul ili sekvencu koji su humanizovani iz ne-ljudskog nativnog Fc. Dalje, nativni Fc sadrži regione koji se mogu ukloniti jer pružaju strukturne karakteristike ili biološku aktivnost koje nisu potrebne za vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku. Dakle, izraz „Fc varijanta“ uključuje molekul ili sekvencu kojima nedostaju jedno ili više nativnih Fc mesta ili ostataka, ili u kojima su modifikovani jedno ili više Fc mesta ili ostataka, koji utiču ili su uključeni u: (1) formiranje disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa odabranom ćelijom domaćina, (3) N-terminalnu heterogenost pri eksprimiranju u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor koji nije receptor za spašavanje ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).

[0249] U nekim otelotvorenjima, kada vezujući protein sličan antitelu sadrži dva Fcdomena, tj. u CODV-Ig (Fc i Fc 2), CODV-Fab-TL (dva Fcdomena) i CODV-Fab-OL (Fci Fc3), dva Fcdomena su istog podtipa izotipa ili izotipa imunoglobulina. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima oba Fci Fc 2od CODV-Ig, ili oba Fcdomena od CODV-Fab-TL, ili oba Fci Fc3od CODV-Fab-OL spadaju u potklasu IgG1, ili u IgG2, ili u IgG3, ili u IgG4.

[0250] Svi vezujući proteini slični antitelu, kao što je ovde opisano, nemaju efektorsku funkciju. To znači da kada antitelo poput vezujućeg proteina sadrži jedan ili više Fcdomena (a) tj. Fcu formuli [III], Fc2u formuli [IV] [i/ili Fc3) potklase IgG1, navedeni jedan ili više Fcdomena IgG1 kičme sadrže duplu mutaciju L234A i L235A (takozvana „LALA mutacija“) koja ukida funkciju efektora Fc. Fc dvostruki mutanti L234A i L235A ne vezuju se za FcγR ili C1q, i ukidaju se i ADCC i CDC funkcije Fc domena potklase IgG1 (Hezareh, M. i dr.,J Virol. 2001 Dec; 75(24): 12161-12168).

[0251] U jednom primeru, Fcregion obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 394 ili SEQ ID NO: 396. U jednom otelotvorenju, FC2region obuhvata dve razmene aminokiselina unutar CH3 domena H435R i Y436F, kako je opisano kod Jendeberg, L. i dr. (1997, J. Immunological Meth.201: 25-34). Prema tome, u jednom otelotvorenju Fc2region obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 327. U drugom otelotvorenju, Fc2region obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 392.

[0252] Takozvani CODV-Fab „7G3x20G6“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSL VHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLE IKGQPK AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLI Y WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEI K TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 306, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 9, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 308, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i

jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG A TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSASEVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWV AQ IKDKSNSYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPF DY WGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS G ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 311, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 312, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 5, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0253] Takozvani CODV-Fab „7G3x4E7“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVS N RFSGISDFLFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELKGQP K AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLI Y WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEI K TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 314, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 21, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 308, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG A TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSASEVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWV A QIKDKSNNYATYYAESLKGRFTISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIG YA MDAWGQGTSVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS W NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 315, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 312, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 18, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0254] Takozvani CODV-Fab „7G3x4B4“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVS NRFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIKGQP KAAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKL L IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKL EI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 316, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 16, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 308, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG A TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSASEVQLVETGGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWV A QIKARSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASK PF DYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 317, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 312, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 12, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0255] Takozvani CODV-Fab „7G3x18F5“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DVLMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVS N RLSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELKGQP K

AAPDFVMTOSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLI Y WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEI K TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 318, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 26, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 308, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CL od sekvence SEQ ID NO: 310, i jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG A TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSASEVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKQLEWV A QIKDKSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFA YAL DAWGRGTSVSVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 319, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 312, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 23, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0256] Takozvani CODV-Fab „hz20G6x7G3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYW A STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKG Q PKAAPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

1

(SEQ ID NO: 320, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 308, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 143, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS N SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLE WI GDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRAS WF AYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW N SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 321, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 312, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0257] Takozvani CODV-Fab „7G3xhz4B4“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DVVMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVS N RFSGVSSRFTGSGSGTDFTLKISSVQPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPK AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLI Y WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEI K TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 322, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 158, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 308, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG

2

TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSASQVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWV A QIKARSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKP FD YWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN S GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

(SEQ ID NO: 323, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 312, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 171, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0258] Takozvani CODV-Fab „hz4B4x3E3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRP D GVPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVLGQPKA APDVVMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYK V SNRFSGVSSRFTGSGSGTDFTLKISSVQPDDLGVYYCGQGTOYPFTFGSGTKLEIKTK GPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 324, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 230, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 158, L2od sekvence SEQ ID NO: 309 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i

jedan polipeptid prema formuli II aminokiselinske sekvence QVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARS N NYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQ G VMVTVSSSQVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWM GRIQNGGITDYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDT AMYFCAKTGSYFYAFDH

WGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 325, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 171, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 226, L4aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0259] Takozvani CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata: jedan polipeptid prema formuli [I] koji se značajno sastoji od aminokiselinske sekvence: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWA S TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV D NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS F NRGEC (SEQ ID NO: 388, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, i

jedan polipeptid prema formuli [II] koji se značajno sastoji od aminokiselinske sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS N SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 390) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383 (u kurzivu i podvučeno), L4je 0 aminokiselina i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0260] U one example, polipeptidi prema formuli II od Takozvani CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ i

4

„hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu dalje obuhvata sekvencu EPKSCDKTHTHHHHHH (SEQ ID NO: 352) koja odgovara zglobnoj sekvenci i Histag je korišćen, na primer, za prečišćavanje.

[0261] Takozvani CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ (takođe se naziva CODV-Fab-TL4 „hz20G6x7G3") vezujući protein sličan antitelu obuhvata:

jedan polipeptid prema formuli [IV] koji se značajno sastoji od aminokiselinske sekvence DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYW A STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKG Q PKAAPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECES K YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG

(SEQ ID NO: 326, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 308, L1od sekvence SEQ ID NO: 307, VD2od sekvence SEQ ID NO: 143, L2od sekvence SEQ ID NO: 309, CLod sekvence SEQ ID NO: 310 i Fc2(podvučeno) od sekvence SEQ ID NO: 327, i

jedan polipeptid prema formuli [III] aminokiselinske sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS N SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLE WI GDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRAS AYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE S KYGPPGPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

(SEQ ID NO: 328, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3aminokiselinske sekvence „S“, VD4od sekvence SEQ ID NO: 312, L4aminokiselinske sekvence „RT“, i CH1od sekvence SEQ ID NO: 329, i Fcod sekvence SEQ ID NO: 330.

[0262] U gornjem CODV-Fab-TL4 „hz20G6x7G3“ vezujućem proteinu sličnom antitelu, Fc od sekvence SEQ ID NO: 330 i Fc2od sekvence SEQ ID NO: 327 su od IgG4 kičme.

Navedeni vezujući protein sličan antitelu je u CODV-Fab-TL formatu i sadrži ili se sastoji od jednog polipeptida formule III i jednog polipeptida formule IV.

[0263] Takozvani CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata:

jedan polipeptid prema formuli IV aminokiselinske sekvence DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWA S TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV D NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS F NRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 391, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, CLod sekvence SEQ ID NO: 310, L5koji contains 0 aminokiselina, i Fc2(podvučeno) od sekvence SEQ ID NO: 392; i

jedan polipeptid prema formuli III aminokiselinske sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS N SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS C DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT T PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO : 393) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383 (u kurzivu), L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i i Fc(podvučeno) od sekvence SEQ ID NO: 394.

[0264] U CODV-Fab-TL1 „hz20G6x7G3“ vezujućem proteinu sličnom antitelu, Fc od sekvence SEQ ID NO: 394 i Fc2od sekvence SEQ ID NO: 392 su od IgG1 kičme. Navedeni vezujući protein sličan antitelu je u CODV-Fab-TL formatu. On sadrži ili se sastoji od jednog polipeptida formule IV i jednog polipeptida formule III.

[0265] Takozvani CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata:

jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWA TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV D NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS F NRGEC

(SEQ ID NO: 388, veznici su naznačeni podebljanim slovima i podvučeni su) koji obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, i CLod sekvence SEQ ID NO: 310; i jedan polipeptid prema formuli III aminokiselinske sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS N SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS C DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO : 395) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383 (u kurzivu i podvučeno), L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i Fc(podvučeno) od sekvence SEQ ID NO: 396;

i gde Takozvani CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu dalje obuhvata Fc patrljak (Fc3) aminokiselinske sekvence:

GSDKTHTCPPCPAPFAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTGVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIE

KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN Y KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO: 397) i koji heterodimerises with Fc region od polipeptid prema formuli III.

[0266] Navedeni vezujući protein sličan antitelu je u CODV-Fab-OL formatu, tj. sadrži ili se sastoji od jednog polipeptida formule I, jednog polipeptida formule III, i jednog Fc patrljka. Its Fci Fc3sekvence have su dizajnirane prema „čvor-u-rupi“ tehnologiji i dalje sadrže dvostruku mutaciju L234A i L235A.

[0267] Fcsekvenca odsekvence SEQ ID NO: 396 je dizajnirana da sadrži RF ostatke na položajima 200-221 (podebljano iznad), umesto HY ostataka koji bi inače bili prisutni na ovim položajima Fc regiona. Mutacija HY > RF (tj. H435R i Y436F u CH3 domenu kako je opisano kod Jendeberg, L. i dr.1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34) je pogodna za prečišćavanje jer ukida vezivanje za protein A. U slučaju CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“, Fcpatrljak sekvence SEQ ID NO: 397 sadrži HY ostatke na položajima 217-218 (podebljano iznad).

[0268] Takozvani CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu obuhvata:

jedan polipeptid prema formuli I aminokiselinske sekvence DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWA S TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYVCQNOVSVPYTFGOGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV D NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS F NRGEC

(SEQ ID NO: 388) koje obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, i CLod sekvence SEQ ID NO: 310;

jedan polipeptid prema formuli III aminokiselinske sekvence:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYW GQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS C DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO: 399) koji obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383 (u kurzivu i podvučeno), L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i Fc(podvučeno) od sekvence SEQ ID NO: 400;

i gde Takozvani CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujući protein sličan antitelu dalje obuhvata Fc patrljak (Fc3) aminokiselinske sekvence:

GSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN Y KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO: 398) koji heterodimerizuje sa Fc regionom polipeptida prema formuli III.

[0269] Fcod sekvence SEQ ID NO: 400 obuhvata HY ostatke na položajima 200-221 (podebljano iznad) dok Fcpatrljak od sekvence SEQ ID NO: 398 obuhvata RF ostatke na položajima 217-218 (podebljano iznad).

[0270] Navedeni vezujući protein sličan antitelu je u CODV-Fab-OL formatu, tj. sadrži ili se sastoji od jednog polipeptida formule I, jednog polipeptida formule III i jednog Fc patrljka. Njegove Fci Fc3sekvence su dizajnirane prema „čvor-u-rupi“ tehnologiji i sadrže dvostruku mutaciju L234A i L235A.

1

[0271] Prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin mogu biti jedno anti-CD123 antitelo izabrano od takozvanih „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela, ili njihovih humanizovanih oblika, ili anti-CD123 antitela „7G3“ opisanog u nastavku, na primer anti-CD123 antitela „3E3-D3“ ili „7G3“, ili njihovih humanizovanih oblika.

[0272] Prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin mogu biti jedno anti-CD3 antitelo izabrano od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“, i „8H2“ anti-CD3 antitela, ili njihovih humanizovanih oblika, na primer takozvana „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, i „hz20G6“ anti-CD3 antitela, na primer takozvana „20G6-F3“, „4B4-D7“ anti-CD3 antitela.

[0273] U skladu sa tim, VD1i VD4, ili VD2i VD3su varijabilni domeni teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo može da sadrži:

b) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

c) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 20 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; ili

d) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 25 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 28,i

1 1

gde VD1je varijabilni domen teškog lanca kako je definisano iznad ako je VD4varijabilni domen lakog lanca ili je VD1varijabilni domen lakog lanca kako je definisano iznad ako je VD4varijabilni domen teškog lanca, ili je VD2varijabilni domen teškog lanca kako je definisano iznad ako je VD3varijabilni domen lakog lanca ili je VD2varijabilni domen lakog lanca kako je definisano iznad ako je VD3varijabilni domen teškog lanca.

[0274] U daljem obelodanjenju, VD1i VD4ili VD2i VD3su varijabilni domeni teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde je navedeno anti-CD3 antitelo humanizovano antitelo i obuhvata: a) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 138, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 143, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

b) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 171, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 158, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

c) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 176, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 164, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom; ili

gde VD1je varijabilni domen teškog lanca kako je definisano iznad ako je VD4varijabilni domen lakog lanca ili VD1je varijabilni domen lakog lanca kako je definisano iznad ako je VD4varijabilni domen teškog lanca, ili

VD2je varijabilni domen teškog lanca kako je definisano iznad ako VD3je varijabilni domen lakog lanca ili VD2je varijabilni domen lakog lanca kako je definisano iznad ako VD3je varijabilni domen teškog lanca.

[0275] U navedenoj sekvenci koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176, ili SEQ ID NO: 164, sekvence od 6 CDR su nepromenjene u poređenju sa 6 CDR prisutnim u referentnoj sekvenci SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176, ili SEQ ID NO: 164.

[0276] Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku vezuje se za ljudski CD3. U još jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku dalje se vezuje za Macaca fascicularis CD3. Naročito, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku vezuje se za vanćelijski domen ljudskog CD3, ili i za ljudski i za Macaca fascicularis CD3.

1 2

Preciznije, antitelo se vezuje za CD3ε. Preciznije, vezujući protein sličan antitelu vezuje se za ljudski ili i za ljudski i Macaca fascicularis vanćelijski domen CD3ε. Vezujući protein sličan antitelu vezuje se za CD3ε kada je prisutan u obliku kompleksa, kao što je CD3ε/δ kompleks, ili kada je prisutan kao pojedinačni protein, bez obzira da li je eksprimiran u izolovanom obliku, ili je prisutan u rastvorljivom vanćelijskom domenu ili je membranski-usidrenom CD3ε pune dužine, kako je prisutno, na primer, u T-ćelijama. Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku je specifičan za površinski ljudski CD3 protein, ili i za ljudske i za Macaca fascicularis CD3 proteine, posebno za CD3ε.

[0277] Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku ima odnos afiniteta za Macaca fascicularis CD3 u odnosu na afinitet za ljudski CD3 (KD (Macaca fascicularis)/KD (čovek) koji iznosi ≤10, naročito ≤6, ≤5, ≤4, ≤3, ≤2, ≤1 ili ≤0,5. Prema tome, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku može se koristiti u toksikološkim studijama izvedenim na majmunima, profil toksičnosti uočen kod majmuna relevantan je za predviđanje potencijalnih neželjenih efekata na ljude.

[0278] Dalje, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku ima afinitet (KD) za ljudski CD3 ili Macaca fascicularis CD3, ili oboje, koji iznosi ≤50nM, ≤40nM ili ≤30nM, na primer ≤ 20nM, na primer afinitet od 0,1 nM do 30 nM, posebno od 0,4 nM do 20 nM, ili od 0,4 nM do 15 nM.

[0279] U jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu ima aktivaciju T-ćelija koja je niža od 20%, niža od 18%, niža od 16%, niža od 14%, niža od 12%, niža od 10% u odsustvu ciljanih ćelija.

[0280] U jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu ima aktivaciju T-ćelija koja je viša od 55%, viša od 60%, viša od 62%, viša od 64%, viša od 66%, viša od 68 %, viša od 70% u prisustvu ciljanih ćelija.

[0281] „Nisko aktiviranje T-ćelija“ u kontekstu vezujućih proteina sličnih antitelu prema pronalasku odnosi se na aktivaciju T-ćelija nižu od 20%, nižu od 18%, nižu od 16%, nižu od 14%, nižu od 12%, nižu od 10%.

[0282] „Ciljane ćelije“ ovde se odnose na ćelije koje eksprimiraju drugi antigen, u jednom

1

primeru se ciljane ćelije ovde odnose na ćelije koje eksprimiraju CD123 kao što su THP-1 ćelije.

[0283] „Visoko aktiviranje T-ćelija“ ovde se odnosi na aktivaciju T-ćelija višu od 50%, višu od 55%, višu od 60%, višu od 62%, višu od 64%, višu od 66%, višu od 68%, višu od 70%.

[0284] Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku ima efekat angažovanja T-ćelija. Ovaj efekat angažovanja T-ćelija indukuje citotoksičnost u ciljanoj ćeliji. U jednom otelotvorenju, ciljana ćelija je ćelija koja eksprimira CD123, kao što je ćelija raka koja eksprimira CD123, na primer THP-1 ili TF-1.

[0285] Shodno tome, u jednom otelotvorenju vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku može da angažuje primarne T-ćelije i da lizira ciljane ćelije in vitro gde (EC50) iznosi ≤40pM, ≤35pM, na primer ≤30pM.

[0286] „Citotoksičnost“ ovde se odnosi na kvalitet jedinjenja, kao što je vezujući protein sličan antitelu ili anti-CD123 antitelo prema pronalasku, kako bi bilo toksično za ćelije. Citotoksičnost se može indukovati različitim mehanizmima delovanja i na taj način se može podeliti na ćelijski posredovanu citotoksičnost, apoptozu, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC).

[0287] „Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na ćelijski posredovan mehanizam imune odbrane, gde efektorska ćelija imunog sistema aktivno lizira ciljanu ćeliju, čiji su antigeni na površini membrane vezani specifičnim antitelima.

[0288] „Citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili u kontekstu pronalaska, odnosi se na lizu ciljane ćelije u prisustvu proteina sistema komplementa.

[0289] „Ćelijski posredovana citotokstičnost“ odnosi se na citolizu ciljane ćelije pomoću efektorskih limfocita, kao što su citotoksični T limfociti ili ćelije prirodne ubice, i stoga se mogu razlikovati citotoksičnost posredovana T-ćelijama i citotoksičnost NK-ćelija.

[0290] U jednom otelotvorenju, citotoksičnost se ovde odnosi na citotoksičnost posredovanu ćelijama, na primer citotoksičnost posredovanu T-ćelijama.

1 4

[0291] Dalje, u jednom otelotvorenju ćelijski posredovana citotoksičnost odnosi se na ćelijski posredovanu citotoksičnost od strane T-ćelija.

[0292] Shodno tome, vezujući protein sličnim antitelu prema pronalasku indukuje ćelijski posredovanu citotoksičnost u ciljanoj ćeliji posredovanu T-ćelijama.

[0293] Postupci za merenje citotoksičnosti poznati su stručnjacima i uključuju upotrebu testa oslobađanja 51-hroma (Cr), bojenje živih/mrtvih ciljanih ćelija, uključujući propidijum jodid, 7-AAD i druge boje koje su poznate stručnjacima, detektovanje litičkih molekula koje oslobađaju T ćelije, uključujući granzim i perforin pomoću protočne citometrije ili ELISA, detektovanje laktat dehidrogenaze (LDH) koja se oslobađa u medijum iz oštećenih ćelija kao biomarker za ćelijsku citotoksičnost i citolizu, detektovanje mobilizacije CD107a na ćelijskoj površini, Aneksin V (kalcijum-zavisni fosfolipid-vezujući proteini) bojenje apoptotičnih ciljanih ćelija i na primer detektovanje aktivirane Kaspaze-3 (CASP3). Dalje, stručnjaci mogu da razlikuju različite mehanizme citotoksičnosti na osnovu testa odabranog i zasnovan na eksperimentalnoj postavci.

[0294] U jednom primeru, ćelijski posredovana citotokstičnost može se na primer meriti upotrebom CFSE za obeležavanje ciljanih ćelija i 7-AAD za obeležavanje mrtvih ćelija, kako je opisano, na primer, u primeru 3.2.

[0295] Vezujući protein sličan antitelu sposoban je da se vezuje za CD3 i najmanje još jedan cilj antigena, i to je CD123.

[0296] U jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu je sposoban da inhibira funkciju ovog daljeg cilja CD123 antigena.

[0297] U jednom aspektu pronalaska, vezujući protein sličan antitelu vezuje se za ljudski CD123. U još jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu dalje se vezuje za Macaca fascicularis CD123. Naročito, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku vezuje se za vanćelijski domen ljudskog CD123, ili i za ljudski i za Macaca fascicularis CD123. Preciznije, vezujući protein sličan antitelu vezuje se za distalni deo CD123, na primer, za aminokiseline počev od položaja 19 do 49 ljudskog CD123 aminokiselinske

1

sekvence SEQ ID NO: 104. Vezujući protein sličan antitelu vezuje se za CD123, bez obzira da li je eksprimiran u izolovanom obliku, ili je prisutan u rastvorljivom vanćelijskom domenu ili membranski-usidren CD123 pune dužine, koji je prisutan u ćelijama koje eksprimiraju CD123, kao što su AML ćelije ili CD123 transficirane ćelije. Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku je specifičan za ćelije koje eksprimiraju ljudske ili ljudske i Macaca fascicularis CD123 proteine na svojoj površini, na primer ćelije raka koje eksprimiraju CD123.

[0298] Shodno tome, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku ima afinitet (KD) za ljudski CD123 ili Macaca fascicularis CD123, ili za oba, koji iznosi ≤20nM, ≤15nM ili ≤10nM, na primer ≤ 5nM, na primer afinitet od 0,01 nM do 5 nM, posebno od 0,1 nM do 5 nM.

[0299] Prema obelodanjenju, prvi imunoglobulin je jedno anti-CD3 antitelo izabrano od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“, i „8H2“ anti-CD3 antitela, ili njihovih humanizovanih oblika, na primer takozvana „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „hz4B4“ i „hz20G6“ anti-CD3 antitela, i drugi imunoglobulin je jedno anti-CD123 antitelo izabrano od takozvanih „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

[0300] Prema obelodanjenju, drugi imunoglobulin je jedno anti-CD3 antitelo izabrano od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „12D2-E5“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „18H11-F10“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „3G5-E10“, „9D7-F3“, „8C2-F7“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „6C9-C9“, „3E8-G1“, „3H6-D2“, i „8H2“ anti-CD3 antitela, ili njihovih humanizovanih oblika, na primer takozvana „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „hz4B4“ i „hz20G6“ anti-CD3 antitela, i prvi imunoglobulin je jedno anti-CD123 antitelo izabrano od takozvanih „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

1

[0301] Prema obelodanjenju, VD1i VD4ili VD2i VD3obuhvataju varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, od kojih je svaki ili definisan sa tri CDR sekvence ili sa i varijabilnim domenom teškog i lakog lanca sekvence od jednog od 13 takozvanih „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako je definisano iznad,

gde VD1i VD4, i jedan i drugi obuhvataju tri CDR sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca sekvence jednog od anti-CD123 antitela kako je definisano iznad, ako VD2i VD3, i jedan i drugi obuhvataju tri CDR sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca sekvence jednog od anti-CD3 antitela kako je definisano iznad, ili

gde VD2i VD3, i jedan i drugi obuhvataju tri CDR varijabilnog domena teškog i lakog lanca sekvence jednog od anti-CD123 antitela kako je definisano iznad, ako VD1i VD4obuhvataju CDR sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca sekvence jednog od anti-CD3 antitela kako je definisano iznad.

[0302] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

gde su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ili su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ako su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca.

[0303] Prema obelodanjenju, VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L

1

od sekvence SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 i VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0304] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0305] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 13, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 15 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 184, CDR2-L od sekvence „KVS“ i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

1

[0306] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 138 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 143 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0307] Prema obelodanjenju, VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 138 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 143 i VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0308] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 171 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 158 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

gde su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD3i VD4i jedan i

1

drugi varijabilni domeni teških lanaca ili su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ako su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca.

[0309] Prema obelodanjenju, VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 171 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 158 i VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0310] Prema obelodanjenju, VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 176 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 164 i VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

[0311] Prema obelodanjenju, VD2i VD3su varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanizovanog anti-CD3 antitela, gde navedeno anti-CD3 antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 176 i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 164 i VD1i VD4su varijabilni domen teškog ili lakog lanca anti-CD123 antitela izabranog iz grupe koju čine „3E3-D3“, „1E1-G5“, „2B8-F3“, „2F8-D6“, „3B10-E6“, „5A5-B4“, „6B10-E4“, „6C10-C4“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9B8-G6“, „9D7-C8“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela kako su opisana iznad pod odeljkom „anti-CD123 antitela“,

gde su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ili su VD1i VD2i jedan i drugi varijabilni domeni teških

11

lanaca ako su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca.

[0312] Prema pronalasku, prvi ili drugi imunoglobulin je anti-CD123 antitelo 7G3. Prema obelodanjenju, VD1i VD4ili VD2i VD3obuhvataju varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kako je definisano CDR sekvencom varijabilnog domena teškog i lakog lanca sekvence antitela 7G3 kako je ovde definisano u nastavku. U jednom otelotvorenju VD1i VD4, ili VD2i VD3obuhvataju varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela 7G3 kako je opisano u patentnoj prijavi WO2013/173820.

[0313] Takozvano „7G3“ anti-CD123 antitelo kako se ovde koristi obuhvata: varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNG A TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQ GT LVTVSA (SEQ ID NO: 312, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 375, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 376, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 377 i

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNOKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYW A STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK

(SEQ ID NO: 308, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379.

[0314] Prema pronalasku, antitelo 7G3 je humanizovano antitelo ili fragment humanizovanog antitela. Humanizovano 7G3 antitelo može da sadrži

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSN GA TFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQ GT MVTVSS (SEQ ID NO: 380, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 377, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382, ili

varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSS GA TFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQ GT MVTVSS (SEQ ID NO: 383, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382, ili

varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNOKNYLTWYQQKPGOPPKPLIYW AS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLE IK

(SEQ ID NO: 385, gde su CDR prikazani podebljanim slovima) koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379.

[0315] Prema obelodanjenju, vezujući protein sličan antitelu koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i ljudski CD123 obuhvata

a) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 5 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, ili

b) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 18 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, ili

c) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO 12 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, ili

d) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 26 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugi imunoglobulin (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 23 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, ili

e) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 143 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 138 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, ili

f) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 158 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 308 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 312 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 171 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa

11

njom,

g) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 230 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 158 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 171 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 226 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom,

h) varijabilni domen lakog lanca prvog imunoglobulina (VD1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 385 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen lakog lanca drugog imunoglobulina (VD2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 141 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, varijabilni domen teškog lanca drugog imunoglobulina (VD3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 138 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom i varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulina (VD4) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 383 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom.

[0316] U navedenoj sekvenci iznad koja je najmanje 85% identična sa referentnom sekvencom (npr. sekvenca je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 383 ili SEQ ID NO: 385), sekvence od 6 CDR su nepromenjene u poređenju sa 6 CDR prisutnih u referentnoj sekvenci.

[0317] U jednom otelotvorenju antitelo vezujući protein prema bilo kojoj od definicija a) do g) dalje sadrži veznik L1od sekvence SEQ ID NO: 307, L2od sekvence SEQ ID NO: 309, L3od aminokiselinske sekvence „S“, L4od aminokiselinske sekvence „RT“ i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0318] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein prema bilo kojoj od definicija a) do g) dalje sadrži Fc 2od sekvence SEQ ID NO: 327.

[0319] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein prema definiciji h) dalje sadrži veznik L1od sekvence SEQ ID NO: 389, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, L3i L4koji se sastoje od 0 aminokiselina i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

[0320] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein prema definiciji h) dalje sadrži Fc2od sekvence SEQ ID NO: 392.

[0321] U jednom otelotvorenju, L5od proteina koji vezuje antitelo prema bilo kojoj od definicija a) do h) sadrži 0 aminokiselina.

[0322] U daljem otelotvorenju antitelo vezujući protein prema bilo kojoj od definicija a) do g) dalje sadrži veznik L1od sekvence SEQ ID NO: 307, L2od sekvence SEQ ID NO: 309, L3od aminokiselinske sekvence „S“, L4od aminokiselinske sekvence „RT“, CH1od sekvence SEQ ID NO: 329 i Fcod sekvence SEQ ID NO: 330.

[0323] U daljem otelotvorenju, antitelo vezujući protein prema definiciji h) dalje sadrži veznik L1od sekvence SEQ ID NO: 389, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, L3i L4koji se sastoje od 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313 i Fcod sekvence SEQ ID NO: 394.

[0324] U daljem otelotvorenju, antitelo vezujući protein prema definiciji h) dalje sadrži Fc patrljak sekvence SEQ ID NO: 397 ili SEQ ID NO: 398, ili sekvencu koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 397 ili SEQ ID NE: 398.

[0325] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i ljudski CD123 obuhvata, ili ga suštinski čine:

a) jedan polipeptid formule [I] koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 388 (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310),

ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 388 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 378, „WAS“ i SEQ ID NO: 379 od hz7G3 varijabilni domen lakog lanca (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:142, „KVS“ i SEQ ID NO:11 od hz20G6 varijabilni domen lakog lanca (VD2od sekvence SEQ ID NO: 141); i

b) jedan polipeptid formule [II] koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 390 (VD3od

11

sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313), ili

sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 390 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, i SEQ ID NO: 382 od hz7G3 varijabilni domen teškog lanca (VD4od sekvence SEQ ID NO: 383), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 od hz20G6 varijabilni domen teškog lanca (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138);

i gde polipeptid formule [I] i polipeptid formule [II] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

[0326] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i ljudski CD123 obuhvata, ili ga suštinski čine:

a) jedan polipeptid prema formuli [IV] aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 391 (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, CLod sekvence SEQ ID NO: 310, L5koji sadrži 0 aminokiselina, i Fc2od sekvence SEQ ID NO: 392), ili

sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 391 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 378, „WAS“ i SEQ ID NO: 379 od hz7G3 varijabilni domen lakog lanca (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:142, „KVS“ i SEQ ID NO:11 od hz20G6 varijabilni domen lakog lanca (VD2od sekvence SEQ ID NO: 141); i

b) jedan polipeptid prema formuli [III] aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 393 (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i i Fcod sekvence SEQ ID NO: 394), ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO : 393 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, i SEQ ID NO: 382 od hz7G3 varijabilni domen teškog lanca (VD4od sekvence SEQ ID NO: 383), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 od hz20G6 varijabilni domen teškog lanca (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138);

i gde polipeptid formule [IV] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

[0327] U navedenom vezujućem proteinu sličnom antitelu, polipeptidni lanci predstavljeni formulama [III] i [IV] dimerizuju kroz svoje odgovarajuće Fc2i Fcregione.

11

[0328] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i ljudski CD123 obuhvata, ili ga suštinski čine:

a) jedan polipeptid prema formuli [I] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 388 (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389 i CLod sekvence SEQ ID NO: 310) ili

sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 388 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 378, „WAS“ i SEQ ID NO: 379 od hz7G3 varijabilni domen lakog lanca (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:142, „KVS“ i SEQ ID NO:11 od hz20G6 varijabilni domen lakog lanca (VD2od sekvence SEQ ID NO: 141); i

b) jedan polipeptid prema formuli [III] aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 395 (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i Fcod sekvence SEQ ID NO: 396), ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO : 395 koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, i SEQ ID NO: 382 od hz7G3 varijabilni domen teškog lanca (VD4od sekvence SEQ ID NO: 383), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 od hz20G6 varijabilni domen teškog lanca (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138); i

c) jedan Fc patrljak (polipeptid Fc3) aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 397, ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa njom, gde navedeni Fc3patrljak ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa njom heterodimerizuju sa Fcregionom polipeptida prema formuli [III];

i gde polipeptid formule [I] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

[0329] U jednom otelotvorenju, antitelo vezujući protein koji se specifično vezuje za ljudski CD3ε i ljudski CD123 obuhvata, ili ga suštinski čine:

sekvenca koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 388 u koji 3 CDR od sekvenci SEQ

11

ID NO: 378, „WAS“ i SEQ ID NO: 379 od hz7G3 varijabilni domen lakog lanca (VD1od sekvence SEQ ID NO: 385), i 3 CDR od sekvenci. SEQ ID NO:142, „KVS“ i SEQ ID NO:11 od hz20G6 varijabilni domen lakog lanca (VD2od sekvence SEQ ID NO: 141) su neizmenjeni;

b) polipeptid prema formuli [III] aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 399 (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i Fcod sekvence SEQ ID NO: 400), ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa njom koji obuhvata 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, i SEQ ID NO: 382 od hz7G3 varijabilni domen teškog lanca (VD4od sekvence SEQ ID NO: 383), i 3 CDR od sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 od hz20G6 varijabilni domen teškog lanca (VD3od sekvence SEQ ID NO: 138); i c) jedan Fc patrljak (polipeptid Fc3) aminokiselinske sekvence SEQ ID NO : 398, ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa njom, gde navedeni Fc3patrljak ili sekvenca koja je najmanje 85% identična sa njom heterodimerizuju sa Fc regionom polipeptida prema formuli [III];

Imunokonjugati

[0330] U jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo pronalaska je konjugovano ili povezano sa agensom za inhibiciju rasta, citotoksičnim agensom ili enzimom koji aktivira prolek. Naročito, anti-CD123 antitela prema pronalasku su zaista korisna za ciljanje navedenog agensa za inhibiciju rasta, citotoksičnog agensa ili proleka na ćelije raka koje eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju CD123 na svojoj površini.

Nukleinske kiseline, vektori i rekombinantne ćelije domaćina

[0331] Dalje obelodanjenje se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži ili se sastoji od sekvence koja kodira anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu, kako je definisano iznad.

[0332] Tipično, navedena nukleinska kiselina je molekul DNK ili RNK, koji može biti uključen u bilo koji pogodan vektor, kao što je plazmid, kozmid, epizom, veštački hromozom, fag ili virusni vektor.

11

[0333] Izrazi „vektor“, „vektor kloniranja“ i „vektor eksprimiranja“ označavaju nosač pomoću kog se DNK ili RNK sekvenca (npr. strani gen) može uvesti u ćeliju domaćina, tako da transformiše domaćina i pospešuje eksprimiranje (npr. transkripciju i translaciju) uvedene sekvence.

[0334] Dakle, dalji cilj se odnosi na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku.

[0335] Takvi vektori mogu sadržati regulatorne elemente, poput promotora, pojačivača, terminatora i slično, kako bi izazvali ili usmerili eksprimiranje navedenog polipeptida nakon primene pacijentu. Primeri promotora i pojačivača koji se koriste u vektoru eksprimiranja za životinjske ćelije uključuju rani promotor i pojačivač SV40 (Mizukami T. i dr.1987), LTR promotor i pojačivač Moloney virusa mišje leukemije (Kuwana Y i dr.1987), promoter (Mason JO i dr.1985) i pojačivač (Gillies SD i dr.1983) H lanca imunoglobulina i slično.

[0336] Može se koristiti bilo koji vektor eksprimiranja za životinjske ćelije, sve dok se može ubaciti i eksprimirati gen koji kodira C region ljudskog antitela. Primeri pogodnih vektora uključuju pAGE107 (Miyaji H i dr.1990), pAGE103 (Mizukami T i dr.1987), pHSG274 (Brady G i dr.1984), pKCR (O'Hare K i dr.1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H i dr.1990) i slično. Ostali primeri plazmida uključuju replicirajuće plazmide koji sadrže poreklo replikacije ili integrativne plazmide, kao što su na primer pUC, pcDNK, pBR i slično.

[0337] Ostali primeri virusnih vektora uključuju adenovirusne, retrovirusne, herpes virusne i AAV vektore. Takvi rekombinantni virusi mogu se proizvesti tehnikama poznatim u struci, kao što su transfekcija ćelija za pakovanje ili privremena transfekcija pomoćnim plazmidima ili virusima. Tipični primeri ćelija za pakovanje virusa uključuju PA317 ćelije, PsiCRIP ćelije, GPenv+ ćelije, 293 ćelije itd. Detaljni protokoli za proizvodnju takvih rekombinantnih replikaciono oštećenih virusa mogu se naći, na primer, u WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 i WO 94/19478.

[0338] Naredni cilj odnosi se na ćeliju koja je transficirana, zaražena ili transformisana nukleinskom kiselinom i/ili vektorom prema pronalasku.

[0339] Izraz „transformacija“ znači uvođenje „stranog“ (tj. spoljašnjeg) gena, DNK ili RNK sekvence u ćeliju domaćina, tako da ćelija domaćin eksprimira uvedeni gen ili sekvencu kako

11

bi proizvela željenu supstancu, obično protein ili enzim koji kodira uvedeni gen ili sekvencu. Ćelija domaćin koja prima i eksprimira uvedenu DNK ili RNK je bila „transformisana“.

[0340] Nukleinske kiseline se mogu koristiti za proizvodnju rekombinantnog antitela pronalaska u pogodnom sistemu eksprimiranja. Izraz „sistem eksprimiranja“ označava ćeliju domaćina i kompatibilni vektor pod pogodnim uslovima, npr. za eksprimiranje proteina kodiranog stranom DNK koju nosi vektor i uveden u ćeliju domaćina.

[0341] Uobičajeni sistemi eksprimiranja uključuju E. coli ćelije domaćina i plazmidne vektore, ćelije domaćine insekata i bakulovirusne vektore i ćelije domaćine sisara i vektore. Ostali primeri ćelija domaćina uključuju, bez ograničenja, prokariotske ćelije (kao što su bakterije) i eukariotske ćelije (kao što su ćelije kvasca, ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije itd.). Konkretni primeri uključuju E. coli, Kluyveromyces ili Saccharomyces kvasci, ćelijske linije sisara (npr. Vero ćelije, CHO ćelije, 3T3 ćelije, COS ćelije itd.), kao i primarne ili ustaljene ćelijske kulture sisara (npr. proizvedene iz limfoblasta, fibroblasta, embrionalnih ćelija, epitelnih ćelija, nervnih ćelija, adipociti itd.). Primeri takođe uključuju mišju SP2/0-Ag14 ćeliju (ATCC CRL1581), mišju P3X63-Ag8.653 ćeliju (ATCC CRL1580), CHO ćeliju u kojoj je gen dihidrofolat reduktaze (u daljem tekstu „DHFR gen“) defektivan (Urlaub G i sar; 1980), pacovsku YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 ćeliju(ATCC CRL1662, u daljem tekstu „YB2/0 ćelija“), i slično. Poželjna je YB2/0 ćelija, pošto je ADCC aktivnost himernih ili humanizovanih antitela pojačana kada se eksprimiraju u ovoj ćeliji.

[0342] Naročito, za eksprimiranje humanizovanog antitela ili vezujućeg proteina sličnog antitelu, vektor eksprimiranja može biti bilo tipa u kom gen koji kodira teški lanac antitela i gen koji kodira laki lanac antitela postoji na odvojenim vektorima, ili tip u kom oba gena postoje na istom vektoru (tandemski tip). U pogledu lakoće konstruisanja vektora eksprimiranja humanizovanog antitela i vezujućeg proteina sličnog antitelu, lakoće uvođenja u životinjske ćelije i ravnoteže između nivoa eksprimiranja H i L lanaca antitela u životinjskim ćelijama, vektor eksprimiranja humanizovanog antitela tandemskog tipa je poželjan (Shitara K i dr. J Immunol Methods.1994 Jan.3;167(1-2):271-8). Primeri vektora eksprimiranja humanizovanog antitela tandemskog tipa uključuju pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 i slično.

[0343] Takođe je obelodanjen postupak za proizvodnju rekombinantne ćelije domaćina koja

12

eksprimira anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku, gde navedeni postupak koji obuhvata korake koji se sastoje od: (i) uvođenja in vitro ili ex vivo rekombinantne nukleinske kiseline ili vektora kako je opisano iznad u kompetentnu ćeliju domaćina, (ii) kultivisanje in vitro ili ex vivo dobijene rekombinantne ćelije domaćina i (iii), opciono, odabir ćelija koje eksprimiraju i/ili izlučuju navedeno antitelo.

[0344] Takve rekombinantne ćelije domaćina mogu se koristiti za proizvodnju anti-CD3 antitela, najmanje jednog anti-CD123 antitela ili najmanje jednog vezujućeg proteina sličnog antitelu prema pronalasku.

Postupci za proizvodnju antitela, vezujućeg proteina sličnog antitelu, prema pronalasku [0345] Takođe je pružen postupak pravljenja vezujućeg proteina sličnog antitelu koji obuhvata dva polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde prvi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i drugi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [II]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

gde su VD1i VD2oba bilo varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4su i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni lakih lanaca, ili su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni teških lanaca.

[0346] Obelodanjenje pruža postupak pravljenja vezujućeg proteina sličnog antitelu koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji čine četiri mesta za vezivanje antigena, gde dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom (III):

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

[0347] U daljem otelotvorenju, pronalazak pruža postupak pravljenja vezujućeg proteina sličnog antitelu koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji čine četiri mesta za vezivanje antigena, gde dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom [IV]:

VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]

i dva polipeptidna lanca imaju strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, L4i L5su aminokiselinski veznici;

[0348] U jednom aspektu, prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin su jedno anti-CD3 antitelo kako je definisano u odeljku «anti-CD3 antitela» iznad.

[0349] U drugom aspektu, prvi imunoglobulin ili drugi imunoglobulin su jedno anti-CD123 antitelo kako je definisano u odeljku «anti-CD123 antitela» iznad.

[0350] Anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo i/ili vezujući proteini slični antitelu mogu se proizvesti bilo kojom tehnikom poznatom u struci, kao što je, bez ograničenja, bilo koja hemijska, biološka, genetska ili enzimska tehnika, bilo sama ili u kombinaciji.

[0351] Poznavajući aminokiselinsku sekvencu željene sekvence, stručnjak može lako da

12

proizvede navedena antitela ili lance imunoglobulina, standardnim tehnikama za proizvodnju polipeptida. Na primer, mogu se sintetisati dobro poznatim postupkom u čvrstoj fazi, naročito korišćenjem komercijalno dostupnih aparata za sintezu peptida (poput onih napravljenih od strane Applied Biosistems, Foster City, California) i prateći uputstva proizvođača.

Alternativno, antitela, lanci imunoglobulina i proteini vezani za antitela pronalaska mogu se sintetisati tehnikama rekombinantne DNK, što je dobro poznato u struci. Na primer, ovi fragmenti se mogu dobiti kao proizvodi eksprimiranja DNK nakon ugradnje DNK sekvenci koje kodiraju željeni (poli)peptid u vektore eksprimiranja i uvođenje takvih vektora u pogodne eukariotske ili prokariotske domaćine koji će eksprimirati željeni polipeptid, iz kog kasnije mogu biti izolovani korišćenjem dobro poznatih tehnika.

[0352] Naročito, obelodanjenje se dalje odnosi na postupak za proizvodnju anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i/ili vezujućih proteina sličnih antitelu prema pronalasku, gde postupak sadrži korake koji se sastoje od: (i) kultivisanja transformisane ćelije domaćina prema pronalasku; (ii) eksprimiranja navedenog antitela ili polipeptida; i (iii) izvlačenja eksprimiranog antitela ili polipeptida.

[0353] Anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i/ili vezujući proteini slični antitelu se na odgovarajući način odvajaju od medijuma kulture konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.

[0354] U naročitom otelotvorenju, humanizovana himerna anti-CD3 antitela i/ili anti-CD123 mogu se proizvesti dobijanjem nukleinskih sekvenci koje kodiraju humanizovane VL i VH domene kako je prethodno opisano, konstruisanjem vektora eksprimiranja ljudskog himernog antitela njihovim ubacivanjem u vektor eksprimiranja za životinjsku ćeliju koja ima gene koji kodiraju CH ljudskog antitela i CL ljudskog antitela, i eksprimiraju kodirajuću sekvencu uvođenjem vektora eksprimiranja u životinjsku ćeliju. Analogno tome, humanizovani vezujući protein sličan antitelu može se dobiti upotrebom za varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog humanizovanog imunoglobulina (VD1), za varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog humanizovanog imunoglobulina (VD2), za varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog drugog imunoglobulina (VD3), i za varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina varijabilnih domena teškog i lakog lanca dva humanizovana antitela.

[0355] Kao CH domen ljudskog himernog antitela ili CH domen proteina koji se vezuju za antitela prema pronalasku, to može biti bilo koji region koji pripada teškim lancima ljudskog imunoglobulina, ali oni iz klase IgG su pogodni, i takođe se može koristiti bilo koja od potklasa koje pripadaju klasi IgG, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Takođe, kao CL ljudskog himernog antitela ili CL vezujućeg proteina sličnog antitelu prema pronalasku, to može biti bilo koji region koji pripada lakim lancima ljudskog imunoglobulina, i mogu se koristiti i oni kapa klase ili lambda klase.

[0356] Postupci za proizvodnju humanizovanih ili himernih antitela uključuju konvencionalne tehnike transfekcije DNK i gena dobro su poznati u struci (pogledati Morrison SL. i dr. (1984) i patentne dokumente US5,202,238; i US5,204, 244).

[0357] Postupci za proizvodnju humanizovanih antitela zasnovani na konvencionalnim tehnikama transfekcije DNK i genske transfekcije dobro su poznati u struci (pogledati, na primer, Riechmann L. i dr.1988; Neuberger MS. i dr.1985). Antitela se mogu humanizovati upotrebom različitih tehnika poznatih u struci, uključujući, na primer, tehniku obelodanjenu u prijavi WO2009/032661, CDR-graftovanje (EP 239,400; PCT publikacija WO91/09967; SAD patenti br.5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), furniranje ili menjanje površine (EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM i dr. (1994); Roguska MA. i dr. (1994)), i premeštanje lanaca (SAD patent br.5,565,332). Opšta tehnologija rekombinantne DNK za pripremu takvih antitela je takođe poznata (pogledati Evropsku patentnu prijavu EP 125023 i Međunarodnu patentnu prijavu WO 96/02576).

[0358] Fab se može dobiti tretiranjem antitela koje specifično reaguje sa CD3 ili CD123 sa proteazom, kao što je papain. Takođe, Fab se može dobiti umetanjem DNK sekvenci koje kodiraju oba lanca Fab antitela u vektor za prokariotsko eksprimiranje ili za eukariotsko eksprimiranje i uvođenjem vektora u prokariotske ili eukariotske ćelije (prema potrebi) kako bi eksprimirale Fab.

[0359] F(ab')2 se može dobiti tretiranjem antitela koje specifično reaguje sa CD3 ili CD123 sa proteazom, pepsinom. Takođe, F(ab')2 se može dobiti vezivanjem Fab' opisanog u nastavku putem tioetarske veze ili disulfidne veze.

12

[0360] Fab' se može dobiti tretiranjem F(ab')2 koji specifično reaguje sa CD3 ili CD123 sa redukcionim agensom, kao što je ditiotreitol. Takođe, Fab' se može dobiti umetanjem DNK sekvenci koje kodiraju Fab' lance antitela u vektor za prokariotsko eksprimiranje ili vektor za eukariotsko eksprimiranje i uvođenjem vektora u prokariotske ili eukariotske ćelije (prema potrebi) kako bi se izvršilo njihovo eksprimiranje.

[0361] ScFv se može dobiti uzimanjem sekvenci CDR ili VH i VL domena kako je prethodno opisano, konstruisanjem DNK koja kodira scFv fragment, umetanjem DNK u prokariotski ili eukariotski vektor eksprimiranja, i zatim uvođenjem vektora eksprimiranja u prokariotske ili eukariotske ćelije (prema potrebi) kako bi se eksprimirao scFv. Kako bi se generisao humanizovani scFv fragment, može se koristiti dobro poznata tehnologija koja se naziva CDR graftovanje, koja uključuje odabir regiona određivanja komplementarnosti (CDR) prema pronalasku i njihovo kalemljenje na okvir ljudskog scFv fragmenta poznate trodimenzionalne strukture (pogledati, na primer, WO98/45322; WO 87/02671;

US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494).

Modifikacija antitela pronalaska

[0362] Razmišlja se o modifikacijama aminokiselinskih sekvenci antitela ili vezujućih proteina sličnih antitelu kao što je ovde opisano. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela, ili vezujućeg proteina sličnog antitelu. Na primer, poznato je da kada se humanizovano antitelo proizvede jednostavnim graftovanjem samo CDR u VH i VL od antitela dobijenog od životinje koja nije čovek u FR od VH i VL ljudskog antitela, aktivnost vezivanja antigena može biti smanjena u poređenju sa izvornim antitelom izvedenim iz životinje koja nije čovek. Smatra se da nekoliko aminokiselinskih ostataka VH i VL ne-ljudskih antitela, ne samo u CDR, već i u FR, može biti direktno ili indirektno povezano sa aktivnošću vezivanja antigena. Stoga bi supstitucija ovih aminokiselinskih ostataka različitim aminokiselinskim ostacima izvedenim iz FR od VH i VL ljudskog antitela smanjila aktivnost vezivanja. Kako bi se rešio problem, u ljudskim antitelima graftovanim sa ne-ljudskim CDR, moraju se pokušati identifikovati, među aminokiselinskim ostacima koji su direktno povezani sa aminokiselinskim sekvencama iz FR od VH i VL ljudskih antitela, aminokiselinski ostaci koji su direktno povezani sa vezivanjem antitela, ili koji komunicira sa aminokiselinskim ostatkom od CDR ili koji održavaju trodimenzionalnu strukturu antitela, i koji su direktno povezani sa vezivanjem za antigen. Smanjena aktivnost vezivanja antigena može se povećati zamenom identifikovanih

12

aminokiselina sa aminokiselinskim ostacima originalnog antitela izvedenog od životinje koja nije čovek. Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku može da sadrži varijabilne regione humanizovanog antitela i stoga se ovde navedena razmatranja podjednako primenjuju i na vezujuće proteine slične antitelu prema pronalasku.

[0363] Mogu se izvršiti modifikacije i promene u strukturi antitela iz predmetnog pronalaska, i u DNK sekvencama koje ih kodiraju, a da se i dalje dobije funkcionalno antitelo, vezujući protein ili polipeptid sličan antitelu, sa poželjnim karakteristikama.

[0364] Pri vršenju promena u amino sekvencama polipeptida, može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Važnost hidropatskog indeksa aminokiselina u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije proteinu se generalno razume u struci. Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi rezultujućeg proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima, i slično. Svakoj aminokiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja: izoleukin (+4,5); valin (+4,2); leukin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9); i arginin (-4,5).

[0365] Dalji cilj predmetnog pronalaska takođe obuhvata konzervativne funkcije polipeptida anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i proteine koji vezuju antitela predmetnog pronalaska.

[0366] Na primer, određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama u strukturi proteina bez osetnog gubitka aktivnosti. Budući da interaktivni kapacitet i priroda proteina definišu njegovu biološku funkcionalnu aktivnost, određene aminokiselinske supstitucije mogu se izvršiti u sekvenci proteina, i naravno u sekvenci koja kodira DNK, dok se istovremeno dobija protein sa sličnim svojstvima. Stoga se smatra da se mogu izvršiti razne promene u sekvencama antitela prema pronalasku ili odgovarajućim DNK sekvencama koje kodiraju navedene polipeptide, bez osetnog gubitka njihove biološke aktivnosti.

[0367] U struci je poznato da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili rezultat, a još uvek rezultuju

12

proteinom sa sličnom biološkom aktivnošću, tj. i dalje se dobija biološki funkcionalno ekvivalentan protein. Takođe je moguće koristiti dobro uspostavljene tehnologije, kao što su pristupi skeniranju alanina, kako bi se u antitelu ili polipeptidu prema pronalasku identifikovale sve aminokiseline koje mogu biti supstituisane bez značajnog gubitka vezivanja za antigen. Takvi ostaci se mogu kvalifikovati kao neutralni, jer nisu uključeni u vezivanje antigena ili u održavanje strukture antitela. Jedan ili više ovih neutralnih položaja mogu biti zamenjeni alaninom ili drugom aminokiselinom bez promene glavnih karakteristika antitela ili polipeptida prema pronalasku.

[0368] Kao što je gore navedeno, supstitucije aminokiselina se, prema tome, zasnivaju na relativnoj sličnosti aminokiselinskih supstituenata bočnog lanca, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično. Primerne supstitucije koje uzimaju u obzir razne prethodno navedene karakteristike dobro su poznate stručnjacima i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leukin i izoleukin.

[0369] Takođe može biti poželjno modifikovati anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo i vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku s obzirom na efektorsku funkciju, npr. kako bi se poboljšala ili smanjila ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antigena (ADCC) i/ili cititoksičnost zavisna od komplementa (CDC) od antitela. Ovo se može postići uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc region antitela, koje se ovde takođe nazivaju Fc-varijante u kontekstu sa vezujućih proteina sličnih antitelu predmetnog pronalaska. Alternativno ili dodatno, ostaci cisteina mogu se uvesti u Fc region, čime se omogućava stvaranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu ili smanjenu sposobnost internalizacije i/ili povećano ubijanje ćelija posredovano komplementima i/ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) (Caron PC. i dr.1992; i Shopes B.1992).

[0370] Druga vrsta aminokiselinske modifikacije anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i vezujućeg proteina sličnog antitelu prema pronalasku može biti korisna za promenu originalnog obrasca glikozilacije anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i vezujućeg proteina sličnog antitelu, tj. brisanjem jednog ili više ugljovodoničnih delova koji se nalaze u anti-CD3 antitelu, anti-CD123 antitelu i vezujućem proteinu sličnom antitelu, i/ili dodavanjem jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u anti-CD3 antitelu, anti-CD123 antitelu

12

i vezujućem proteinu sličnom antitelu. Prisustvo bilo koje od tripeptidnih sekvenci asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, stvara potencijalno mesto glikozilacije. Dodavanje ili brisanje mesta glikozilacije anti-CD3 antitelu, anti-CD123 antitelu i vezujućem proteinu sličnom antitelu pogodno se postiže promenom aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezana mesta glikozilacije).

[0371] Druga vrsta modifikacije uključuje uklanjanje sekvenci koje su identifikovane, bilo in silico, bilo eksperimentalno, da potencijalno rezultuju proizvodima razgradnje ili heterogenošću sastava anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela i vezujućeg proteina sličnog antitelu. Kao primeri, deamidacija ostataka asparagina i glutamina može se desiti u zavisnosti od faktora kao što su pH i površinska izloženost. Ostaci asparagina su posebno podložni deamidaciji, prvenstveno kada su prisutni u Asn-Gly sekvenci, i u manjoj meri u drugim dipeptidnim sekvencama kao što je Asn-Ala. Kada je takvo mesto deamidacije, posebno Asn-Gly, prisutno u anti-CD3 antitelu, anti-CD123 antitelu i vezujućem proteinu ili polipeptidu sličnom antitelu prema pronalasku, možda će biti poželjno ukloniti mesto, obično putem konzervativne supstitucije radi uklanjanja jednog od impliciranih ostataka. Takve supstitucije u sekvenci za uklanjanje jednog ili više impliciranih ostataka takođe su predviđene da budu obuhvaćene predmetnim pronalaskom.

[0372] Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko povezivanje glikozida sa anti-CD3 antitelom, anti-CD123 antitelom i vezujućim proteinom sličnim antitelu. Ovi postupci su korisni po tome što ne zahtevaju proizvodnju anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela ili vezujućeg proteina sličnog antitelu u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- ili O-povezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina spajanja, šećeri mogu biti vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao one u cisteinu, (d) slobodne hidroksilne grupe kao one u serinu, treoninu, orhidroksiprolinu, (e) aromatične ostatke kao što su oni od fenilalanina, tirozina ili triptofana, ili (f) amidne grupe glutamina. Na primer, takvi postupci su opisani u WO87/05330.

[0373] Uklanjanje bilo kojih ugljovodoničnih ostataka prisutnih na anti-CD3 antitelu, antitelu na CD123 ili vezujućem proteinu sličnom antitelu može se izvršiti hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela ili

12

vezujućeg proteina sličnog antitelu jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman rezultuje cepanjem većine ili svih šećera, osim vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok antitelo ostaje netaknuto. Hemijsku deglikozilaciju su opisali Sojahr H. i dr. (1987) i Edge, AS. i dr. (1981). Enzimatsko cepanje ostataka ugljenih hidrata na antitelima može se postići upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano kod Thotakura, NR. i dr. (1987).

[0374] Druga vrsta kovalentne modifikacije anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela ili vezujućeg proteina sličnog antitelu obuhvata povezivanje antitela sa jednim od niza neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način naveden u SAD patentnim br.4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 ili 4,179,337.

Farmaceutski sastavi

[0375] Anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo i/ili vezujući protein sličan antitelu mogu se kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima i opciono matricama sa produženim oslobađanjem, kao što su biorazgradivi polimeri, kako bi se formirali terapeutski sastavi.

[0376] Prema tome, drugi cilj pronalaska odnosi se na farmaceutski sastav koji sadrži vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0377] Pronalazak se takođe odnosi na vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku, za upotrebu kao lek. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0378] Izrazi „farmaceutski sastav“ ili „terapeutski sastav“ kako se ovde koriste odnose se na jedinjenje ili sastav sposobne da izazovu željeni terapeutski efekat kada se pravilno primenjuju pacijentu.

[0379] Takvi terapeutski ili farmaceutski sastavi mogu sadržati terapeutski efikasnu količinu vezujućeg proteina sličnog antitelu ili njegove konjugate leka, u smeši sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim agensm za formulaciju odabranim u skladu sa načinom primene.

1

[0380] „Farmaceutski“ ili „farmaceutski prihvatljiv“ odnosi se na molekularne celine i sastave koji ne proizvode neželjenu, alergijsku ili drugu neprijatnu reakciju kada se primenjuju sisarima, posebno čoveku, prema potrebi. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens odnosi se na netoksično čvrsto, polučvrsto ili tečno punilo, razređivač, materijal za kapsuliranje ili pomoćni preparat bilo koje vrste.

[0381] Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljivi nosači“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri pogodnih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa uključuju jedno ili više od vode, aminokiselina, fizioloških rastvora, fizioloških rastvora puferisanih fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola i slično, kao i njihovu kombinaciju. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno da se u sastav uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, polialkoholi ili natrijum hlorid, i formulacija takođe može da sadrži antioksidans kao što je triptamin i agens za stabilizaciju kao što je Tween 20.

[0382] Oblik farmaceutskog sastava, način primene, doziranje i režim prirodno zavise od stanja koje se tretira, težine bolesti, starosti, težine i pola pacijenta, itd.

[0383] Farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu se formulisati za topikalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravensku, intramuskularnu, potkožnu ili intraokularnu primenu i slično.

[0384] Naročito, farmaceutski sastavi sadrže nosače koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja se može primeniti injekcijom. To mogu biti naročito izotonični, sterilni, fiziološki rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično ili smeše takvih soli), ili suvi, posebno liofilizovani sastavi koji nakon dodavanja, u zavisnosti od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora soli, dozvoljavaju sastavljanje rastvora za injekcije.

[0385] Doze koje se koriste za primenu mogu se prilagoditi u funkciji različitih parametara, i posebno u zavisnosti od načina primene koji se koristi, relevantne patologije ili, pak, željenog trajanja tretmana.

[0386] Za pripremu farmaceutskih sastava, efikasna količina antitela ili imunokonjugata

1 1

prema pronalasku može se rastvoriti ili raspršiti u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenom medijumu.

[0387] Farmaceutski oblici pogodni za injekcije uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje kikirikija ili vodeni rastvor propilen glikola; i sterilne praškovi za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do te mere da postoji laka mogućnost injektiranja. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od zagađujućeg delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.

[0388] Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi pogodno pomešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama.

[0389] Vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku može se formulisati u sastav u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kiselinske adicione soli (nastale sa slobodnim amino grupama proteina), koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, mandelinska, i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe da se dobiju iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvozdeni hidroksidi, i takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, glicin, histidin, prokain i slično.

[0390] Nosač takođe može biti rastvarač ili disprezioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), njihove odgovarajuće smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antimikotičnim agensima, na primer parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija sastava za injekcije može se postići upotrebom u sastavma agenasa koji

1 2

odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0391] Sterilni rastvori za injekcije se pripremaju uključivanjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa različitim ostalim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži bazni medijum za disperziju i ostale potrebne sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su tehnike vakuumskog sušenja i sušenja smrzavanjem koji primenjuju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilnog filtriranog rastvora.

[0392] Takođe se razmatra priprema više ili visoko koncentrovanih rastvora za direktne injekcije, gde se predviđa da upotreba DMSO kao rastvarača rezultuje izuzetno brzom penetracijom, dovodeći visoke koncentracije aktivnih agenasa do malog područja tumora.

[0393] Nakon formulacije, rastvori će se primeniti na način kompatibilan sa formulacijom doze, i u onoj količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim doznim oblicima, kao što je gore opisani tip injekcionih rastvora, ali takođe se mogu primeniti kapsule za oslobađanje leka i slično.

[0394] Na primer, za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, rastvor treba po potrebi puferisati, i tečni razblaživač prvo učiniti izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramuskularnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu. S tim u vezi, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u svetlu predmetnog obelodanjenja. Na primer, jedna doza se može rastvoriti u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i dodati u 1000 ml tečnosti za hipodermolizu ili primeniti injekcijom na predloženo mesto infuzije (pogledati na primer, „Remington's Pharmaceutical Sciences“ 15th Edition, stranice 1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju će se nužno dogoditi u zavisnosti od stanja pacijenta koji se tretira. Osoba odgovorna za primenu će u svakom slučaju odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog pacijenta.

[0395] U jednom otelotvorenju, vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku je formulisan u terapijskoj smeši koja sadrži oko 0,01 do 100 miligrama, po dozi ili slično.

1

[0396] Pored vezujućeg proteina sličnog antitelu formulisanog za parenteralnu primenu, kao što je intravenska ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste supstance za oralnu primenu; kapsule sa vremenskim oslobađanjem; i bilo koji drugi oblik koji se trenutno koristi.

[0397] U određenim otelotvorenjima, primena lipozoma i/ili nanočestica se predviđa za uvođenje polipeptida kao što su anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu u ćelije domaćine. Stvaranje i upotreba lipozoma i/ili nanočestica poznati su stručnjacima.

[0398] Nanokapsule uglavnom mogu da uhvate jedinjenja na stabilan način koji se može reprodukovati. Kako bi se izbegli neželjeni efekti usled unutarćelijskog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0,1 µm) su generalno dizajnirane pomoću polimera koji se mogu razgraditi in vivo. Biorazgradive nanočestice polialkil-cijanoakrilata koje ispunjavaju ove zahteve su predviđene za upotrebu u predmetnom pronalasku, i takve čestice se lako mogu napraviti.

[0399] Lipozomi nastaju od fosfolipida koji se raspršuju u vodenom medijumu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe nazvane multilamelarne vezikule (MLV)). MLV obično imaju prečnike od 25 nm do 4 µm. Sonifikacija MLV rezultuje stvaranjem malih unilamelarnih vezikula (SUV) prečnika od 200 do 500 Å, koji sadrže vodeni rastvor u jedru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske snage i prisustva dvovalentnih katjona.

[0400] Jednom kada je farmaceutski sastav formulisana, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji zahteva rekonstituciju pre primene.

Terapeutski postupci i upotreba

[0401] Pronalazači su prikazali nekoliko bispecifičnih jedinjenja pronalaska, kao što su „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ i „hz20G6x7G3-TL4“ T-ćelijski posredovana citotoksičnost na modelu CD123 pozitivnih tumorskih ćelijskih linija. Dalje, pronalazači su

1 4

pokazali sposobnost nekoliko bispecifičnih jedinjenja pronalaska da aktiviraju T-ćelije u prisustvu ciljanih ćelija, što dovodi do citotoksičnosti tumorskih ćelija. Pronalazači su dalje pokazali nisku aktivaciju T-ćelija u odsustvu aktivacije T-ćelija u odsustvu ciljanih ćelija.

[0402] Dobro je poznato da terapijska anti-CD123 monoklonska antitela mogu dovesti do iscrpljivanja ćelija koje nose antigen specifično prepoznat od strane antitela. Ovo iscrpljivanje može se posredovati kroz najmanje tri mehanizma: ćelijska citotoksičnost posredovana antitelima (ADCC), citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i direktna antitumorska inhibicija rasta tumora putem signala datih preko antigena kog cilja antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitela pronalaska indukuju citotoksičnost u ćeliji koja eksprimira CD123 putem ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelima (ADCC), citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC).

[0403] „Citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili odnosi se na lizu ciljane ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa pokreće se vezivanjem prve komponente sistema komplementa na antitela koja su vezana za njihov srodni antigen. Kako bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test, npr. kako je opisano kod Gazzano-Santoro i dr. (1997).

[0404] „Ćelijski posredovana citotokstičnost koja zavisi od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti u kom izlučena antitela vezana na Fc receptore (FcR) prisutna na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju ciljanu ćeliju koja nosi antigen i potom da ubiju ciljanu ćeliju. Kako bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je opisan u SAD patentu br. 5,500,362 ili 5,821,337.

[0405] Kao što je opisano iznad u odeljku „anti-CD3 antitela“, anti-CD3 antitela pronalaska imaju nisku aktivaciju T-ćelija, tako da imaju terapeutski potencijal kod pacijenta za upotrebu kao imunosupresivni agens.

[0406] Dalje, protein vezan za antitela, kako je definisano iznad, ima za cilj da poboljša imuni odgovor pacijenta na tumore ciljanjem T-ćelija na tumorske ćelije. U jednom otelotvorenju, protein vezan za antitela, kako je definisano iznad, cilja CD3ε podjedinicu

1

receptora za T-ćelije (TCR) na površini T-ćelije, i drugi krak cilja ćeliju raka koja eksprimira CD123, gde zajedničko angažovanje T-ćelije i tumorske ćelije od strane bispecifičnog konstrukta dovode do stvaranja citolitičke sinapse koja indukuje aktivaciju T-ćelija i rezultuje ubijanjem tumorskih ćelija. Ubijanje tumorskih ćelija može biti posredovano kroz najmanje dva mehanizma: ubijanje perforina/granzima i ubijanje FasL/Fas, na primer ubijanje perforina/granzima.

[0407] Prema tome, obelodanjenje pruža postupak tretmana ili sprečavanja bolesti ili poremećaja koji uključuje primenu pacijentu, koji ima potrebu za tim, terapeutski efikasne količine anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela, vezujućeg proteina sličnog antitelu ili farmaceutskog sastava pronalaska kako je definisano iznad u odeljku „Farmaceutski sastav“.

[0408] Obelodanjenje se dalje odnosi na upotrebu anti-CD3 antitela, anti-CD123 antitela, vezujućeg proteina sličnog antitelu ili farmaceutskog sastava pronalaska za pripremu leka za tretman ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod pacijenta. U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na upotrebu vezujućeg proteina sličnog antitelu ili farmaceutskog sastava za tretman ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod pacijenta.

[0409] Izraz „pacijent“ ili „pojedinac“ koriste se naizmenično i mogu biti, na primer, čovek ili sisar koji nije čovek. Na primer, pacijent je slepi miš; tvor; zec; mačka; pas; primat (majmun), konj; čovek, uključujući muškarca, ženu i dete. U jednom otelotvorenju „pacijent“ odnosi se na čoveka.

[0410] U kontekstu pronalaska, izraz „tretman“ ili „tretiranje“, odnosi se na terapijsku upotrebu (tj. na pacijentu koji ima određenu bolest) i znači preokret, ublažavanje, inhibiranje napretka jednog ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja. Prema tome, tretman se ne odnosi samo na tretman koji dovodi do potpunog izlečenja bolesti, već i na tretmane koji usporavaju napredovanje bolesti i/ili produžavaju preživljavanje pacijenta.

[0411] Pod „prevencijom“ podrazumeva se profilaktička upotreba (tj. na pacijentu podložnom razvoju date bolesti).

[0412] U jednom otelotvorenju, „bolest“ ili „poremećaj“ je bilo koje stanje koje bi imalo koristi od tretmana anti-CD123 antitelom ili vezujućim proteinom sličnim antitelu

1

pronalaska. U jednom otelotvorenju, ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju pacijenta za poremećaj u pitanju. Izraz „kom je potreban tretman“ odnosi se na pacijenta koji već ima poremećaj, kao i na onaj kod kog poremećaj treba sprečiti.

[0413] U jednom otelotvorenju, „bolest“ ili „poremećaj“ je bilo koje stanje koje bi imalo koristi od tretmana anti-CD3 antitelom iz pronalaska. Prema tome, u jednom aspektu, ovo uključuje bolesti ili poremećaje koje karakterišu patološki imuni odgovori.

[0414] „Patološki imuni odgovor"u kontekstu pronalaska je upalni imuni odgovor.

[0415] U jednom otelotvorenju, bolest koju karakteriše patološki imuni odgovor je autoimuna bolest, bolest povezana sa transplantacijom ili bolest povezana sa upalom.

[0416] Autoimuna bolest je, na primer, Kronova bolest, ulcerozni kolitis i dijabetes tipa 1 ili bolest povezana sa transplantacijom, poput bolesti transplantata protiv domaćina (GVHD.

[0417] Prema tome, u jednom otelotvorenju, dijagnostifikovano je da pacijent pati od bolesti ili poremećaja koji se karakterišu patološkim imunim odgovorom.

[0418] U jednom otelotvorenju, dijagnostifikovano je da pacijent pati od autoimune bolesti.

[0419] U još jednom otelotvorenju, poremećaj se odnosi na rak.

[0420] U daljem otelotvorenju, rak se odnosi na hematološki rak, posebno na hematološki rak povezan sa eksprimiranjem CD123.

[0421] U jednom otelotvorenju, eksprimiranje CD123 od strane ćelija raka se lako ispituje, na primer, korišćenjem anti-CD123 antitela prema pronalasku, kao što je opisano u narednom odeljku „Dijagnostičke primene“.

[0422] „Hematološki rakovi povezani sa eksprimiranjem CD123“ uključuju leukemije (kao što su akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična limfoidna leukemija, leukemija dlakavih ćelija i sindroma

1

mijelodisplazije) i maligna limfoproliferativna stanja, blastičnu neoplazmu plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (BPDCN), sistemske mastocitoze, uključujući limfome (takvih kao što su multipli mijelom, ne-Hodžkinov limfom, Burkitov limfom i folikularni limfom malih i velikih ćelija).

[0423] Kao što je opisano iznad u odeljku „anti-CD123 antitela“, LSC eksprimiraju CD123.

[0424] Prema tome, u povezanom otelotvorenju rak se odnosi na hematološki rak povezan sa leukemičnim matičnim ćelijama.

[0425] Stanja hematološkog raka povezana sa leukemičnim matičnim ćelijama (LSC) koje treba tretirati u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju leukemije (poput akutne mijeloidne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoidne leukemije, hronične limfoidne leukemije i sindroma mijelodisplazije) i maligna limfoproliferativna stanja, uključujući limfome (kao što su multipli mijelom, ne-Hodžkinov limfom, Burkitov limfom i folikularni limfom malih i velikih ćelija).

[0426] U jednom aspektu pronalaska, hematološki rak je akutna mijeloidna leukemija (AML).

[0427] U jednom otelotvorenju, dijagnostifikovano je da pacijent pati od AML.

[0428] U daljem otelotvorenju, pacijent je već tretiran hemoterapijom do potpune remisije, ali mu se bolest vratila.

[0429] „Rediciv/povratak bolesti“ se definiše kao ponovna pojava AML nakon potpune remisije.

[0430] „Potpuna remisija“ ili „CR“ definiše se na naredni način: normalne vrednosti za neutrofile (> 1,0<∗>10<9>/L), nivo hemoglobina od 10g/dL i broj trombocita (> 100<∗>10<9>/L) i nezavisnost od transfuzije crvenih ćelija; ćelije blasta manje od 5%, nema klastera ili kolekcija blasta i odsustvo Auerovih štapića na pregledu koštane srži; i normalno sazrevanje krvnih zrnaca (morfologija; mijelogram) i odsustvo ekstramedularne leukemije.

1

[0431] U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo, anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku se koristi samostalno ili u kombinaciji sa bilo kojim pogodnim agensom za inhibiciju rasta.

[0432] „Terapeutski efikasna količina“ polipeptida prema pronalasku podrazumeva dovoljnu količinu polipeptida za tretman navedene bolesti raka, uz razuman odnos koristi/rizika primenjiv na bilo koji medicinski tretman. Podrazumeva se, međutim, da će o ukupnoj dnevnoj upotrebi polipeptida i sastava predmetnog pronalaska odlučivati lekar u okviru razumne medicinske odluke. Specifična terapeutski efikasna doza za svakog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući poremećaj koji se tretira i težinu poremećaja; specifičnog upotrebljenog polipeptida; specifičnog upotrebljenog sastava, starosti, telesne težine, opšteg zdravlja, pola i ishrane pacijenta; vremena primene, puta primene i brzine izlučivanja određenog korišćenog polipeptida; trajanja lekova koji se koriste u kombinaciji ili paralelno sa određenim upotrebljenim polipeptidom, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj struci. Na primer, u struci je dobro poznato da se doze jedinjenja započinju na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje željenog terapeutskog efekta i da se postepeno povećava doza dok se ne postigne željeni efekat.

[0433] U jednom otelotvorenju, efikasnost tretmana anti-CD3 antitelom, anti-CD123 antitelom ili vezujućim proteinom sličnim antitelu prema pronalasku ili imunokonjugatom prema pronalasku, lako se ispituje in vivo, na primer u mišjem modelu raka i merenjem, na primer, promena zapremine tumora između tretirane i kontrolne grupe.

Dijagnostičke primene

[0434] Objavljeno je da je CD123 prekomerno eksprimiran na površini različitih hematoloških neoplazmi.

[0435] Prema tome, CD123 predstavlja marker raka i, prema tome, ima potencijal da se koristi za ukazivanje na efikasnost terapije protiv raka ili detektovanje recidiva bolesti.

[0436] U jednom aspektu, anti-CD123 antitelo se koristi kao komponenta testa u kontekstu terapije koja cilja CD123 koji eksprimira tumore, kako bi se utvrdila osetljivost pacijenta na terapijski agens, pratila efikasnost terapije protiv raka ili otkrio recidiv bolesti nakon tretmana. Naročito, isto anti-CD123 antitelo prema pronalasku se koristi i kao komponenta

1

terapijskog agensa i kao komponenta dijagnostičkog testa.

[0437] Prema tome, naredni cilj se odnosi na anti-CD123 antitelo za upotrebu pri in vivo detektovanju eksprimiranja CD123 kod pacijenta ili za upotrebu pri ex vivo detektovanju eksprimiranja CD123 u biološkom uzorku pacijenta. U jednom aspektu, navedeno detektovanje je namenjeno, posebno za:

a) dijagnostifikovanje prisustva raka kod pacijenta ili

b) određivanje osetljivosti pacijenta sa rakom na terapijski agens koje cilja CD123, naročito na anti-CD123 antitelo ili na vezujući protein sličan antitelu, prema pronalasku, ili c) praćenje efikasnosti anti-CD123 terapije raka ili detektovanje recidiva raka nakon anti-CD123 terapije raka, posebno za terapiju sa anti-CD123 antitelom ili vezujućim proteinom sličnim antitelu prema pronalasku; detektovanjem eksprimiranja površinskog CD123 proteina na ćelijama tumora.

[0438] U jednom aspektu, antitelo je namenjeno za in vitro ili ex vivo upotrebu. Na primer, CD123 je detektovan in vitro ili ex vivo u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, koristeći anti-CD123 antitelo. Upotreba takođe može biti in vivo upotreba. Na primer, anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu primenjuje se pacijentu i antitelo-ćelija kompleksi se detektuju i/ili kvantifikuju, gde detektovanje navedenih kompleksa ukazuje na rak.

[0439] Detektovanje se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak detektovanja prisustva raka kod pacijenta, koji obuhvata korake koji se sastoje od:

(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta sa anti-CD123 antitelom prema pronalasku, naročito u uslovima dovoljnim da antitelo formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;

(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,

(c) detektovanje prisustva raka upoređivanjem izmerenog nivoa vezanog antitela sa kontrolom, gde povećani nivo vezanog antitela u poređenju sa kontrolom ukazuje na rak.

[0440] Detektovanje se takođe odnosi na in vitro ili ex vivo postupak određivanja podložnosti pacijenta sa rakom na terapeutski agens koje cilja CD123, posebno na anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku, gde postupak sadrži korake koji se sastoje od:

(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji ima rak sa anti-CD123 antitelom prema

14

pronalasku, naročito u uslovima dovoljnim da antitelo formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;

(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,

(c) upoređivanje izmerenog nivoa vezanog antitela za navedeni biološki uzorak sa nivoom antitela vezanog za kontrolu;

gde povećani nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom ukazuje na pacijenta osetljivog na terapijski agens koje cilja barem CD123.

[0441] U gore navedenim postupcima, navedena kontrola može biti normalan, nekancerogeni, biološki uzorak istog tipa ili referentna vrednost određena kao reprezentativna za nivo vezivanja antitela u normalnom biološkom uzorku istog tipa.

[0442] U jednom otelotvorenju, anti-CD123 antitelo je korisno za dijagnostifikovanje hematoloških raka povezanih sa eksprimiranjem CD123, uključujući leukemije (kao što su akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna limfoidna leukemija, hronična limfoidna leukemija, leukemija dlakavih ćelija i sindrom mijelodisplazije) i maligna limfoproliferativna stanja, blastičnu neoplazmu plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (BPDCN), sistemsku mastocitozu, uključujući limfome (kao što su multipli mijelom, ne-Hodžkinov limfom, Burkitov limfom i folikularni limfom malih i velikih ćelija).

[0443] Pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak praćenja efikasnosti anti-CD123 terapije raka, koji obuhvata korake koji se sastoje od:

(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji se podvrgava anti-CD123 terapiji raka, sa vezujućim proteinom sličnim antitelu prema pronalasku, naročito u uslovima dovoljnim da antitelo formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;

(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,

(c) upoređivanje izmerenog nivoa vezanog antitela sa nivoom antitela vezanog za kontrolu; gde smanjeni nivo vezanog antitela za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom ukazuje na efikasnost navedene anti-CD123 terapije raka.

[0444] U navedenom postupku, povećani nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom ukazuje na neefikasnost navedene anti-CD123 terapije raka.

[0445] Navedena kontrola je naročito biološki uzorak iste vrste kao i biološki uzorak koji je podvrgnut analizi, ali koji je prethodno dobijen od pacijenta na vreme, tokom anti-CD123 terapije raka.

[0446] Pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak detektovanja recidiva raka nakon anti-CD123 terapije raka, koji obuhvata korake koji se sastoje od:

(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji je završio anti-CD123 terapiju raka, sa vezujućim proteinom sličnim anti-CD123 antitelu prema pronalasku, posebno u uslovima dovoljnim da antitelo formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;

(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,

(c) upoređivanje izmerenog nivoa vezanog antitela sa nivoom antitela vezanog za kontrolu; gde povećani nivo vezanog antitela za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom ukazuje na recidiv raka nakon anti-CD123 terapije raka.

[0447] Navedena kontrola je naročito biološki uzorak iste vrste kao i biološki uzorak koji je podvrgnut analizi, ali koji je dobijen od pacijenta ranije na vreme, nakon ili nakon završetka anti-CD123 terapije raka.

[0448] Navedena anti-CD123 terapija raka je naročito terapija koja koristi anti-CD123 antitelo ili vezujući protein sličan antitelu ili imunokonjugat prema pronalasku. Navedena anti-CD123 terapija cilja rak koji eksprimira CD123, naročito na hematološke rakove povezane sa eksprimiranjem CD123, uključujući leukemije (poput akutne mijeloidne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoidne leukemije, hronične limfoidne leukemije, leukemije dlakavih ćelija i sindroma mijelodisplazije) i maligna limfoproliferativna stanja, blastičnu neoplazmu plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (BPDCN), sistemsku mastocitozu, uključujući limfome (kao što su multipli mijelom, ne-Hodžkinov limfom, Burkitov limfom i folikularni limfom malih i velikih ćelija).

[0449] U jednom otelotvorenju, anti-CD123 je označen molekulom ili supstancom koja se može detektovati, kao što je fluorescentni molekul, radioaktivni molekul ili bilo koje druge oznake koje su u njemu poznate i koje pružaju (direktno ili indirektno) signal.

[0450] Kako se ovde koristi, izraz „označeno“, u odnosu na anti-CD123 antitelo prema pronalasku, namenjen je obuhvatanju direktnog označavanja anti-CD123 antitela spajanjem (tj. fizičkim povezivanjem) supstance koja se može detektovati, kao što je radioaktivni agens ili fluorofora (npr. fluorescein izotiocijanat (FITC) ili fikoeritrin (PE) ili indocijanin (Cy5)) sa polipeptidom, kao i indirektno označavanje polipeptida reaktivnošću sa supstancom koja se može detektovati.

[0451] U daljem otelotvorenju, anti-CD123 antitelo je označeno radioaktivnim molekulom bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer, radioaktivni molekuli uključuju, ali nisu ograničeni, radioaktivni atom za scintigrafijske studije kao što su II<123>, I<124>, In<111>, Re<186>, Re<188>, Tc<99>. U jednom primeru, polipeptidi pronalaska su takođe označeni spin oznakom za snimanje nuklearne magnetne rezonance (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MRI), kao što su jod-123, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.

[0452] „Biološki uzorak“ obuhvata razne vrste uzoraka dobijenih od pacijenta i može se koristiti u dijagnostičkom ili nadzornom testu. Biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na uzorke krvi i drugih tečnosti biološkog porekla, uzorke čvrstog tkiva kao što je uzorak biopsije ili kulture tkiva ili od njih izvedene ćelije i njihovo potomstvo. Zbog toga biološki uzorci obuhvataju kliničke uzorke, ćelije u kulturi, ćelijske supernatante, ćelijske lizate, serum, plazmu, biološku tečnost i uzorke tkiva, posebno uzorak tumora.

[0453] Detektovanje se takođe odnosi na in vivo postupak detektovanja prisustva raka kod pacijenta, koji obuhvata korake koji se sastoje od:

a) primene antitela prema pronalasku, koje je detektabilno označeno, pacijentu;

b) detektovanje lokalizacije navedenog detektovano označenog antitela kod pacijenta slikanjem.

[0454] U jednom otelotvorenju, antitela prema pronalasku su korisna za određivanje stadijuma raka (na primer, u radioslikanju). Koriste se, na primer, samostalno ili u kombinaciji sa drugim markerima raka.

[0455] Izrazi „detektovanje“ ili „detektovano“, kako se ovde koriste, uključuju kvalitativno i/ili kvantitativno detektovanje (merenje nivoa) sa ili bez pozivanja na kontrolu.

[0456] U smislu pronalaska, izraz „dijagnostifikovanje“, kako se ovde koristi, znači određivanje prirode zdravstvenog stanja namenjenog identifikovanju patologije koja utiče na

14

pacijenta iz niza prikupljenih podataka.

[0457] U navedenom postupku, rak je rak koji eksprimira CD123 kako je definisano iznad.

Kompleti

[0458] Konačno, obelodanjenje takođe pruža komplete koji sadrže najmanje jedno anti-CD3 antitelo, najmanje jedno anti-CD123 antitelo ili najmanje jedan vezujući protein sličan antitelu prema pronalasku. Kompleti koji sadrže anti-CD123 antitela ili anti-CD3 pronalaska pronalaze upotrebu u detektovanju površinskog CD123 ili CD3 proteina ili u terapijskim ili dijagnostičkim testovima. Kompleti prema pronalasku mogu sadržati polipeptid ili anti-CD3 antitelo, najmanje jedno anti-CD123 antitelo ili najmanje jedan vezujući protein sličan antitelu povezan sa čvrstim nosačem, npr. pločicom ili perle za kulturu tkiva (npr. sefaroza perle). Mogu se pružiti kompleti koji sadrže antitela za detektovanje i kvantifikovanje površinskog CD123 ili CD3 proteina in vitro, npr. u ELISA ili Western blot. U jednom otelotvorenju, navedeno antitelo je korisno za detektovanje i ima oznaku kao što je fluorescentna ili radiooznaka.

[0459] U jednom aspektu, obelodanjenje obuhvata komplete za proizvodnju jedinice za primenu u jednoj dozi. Svaki od ovih kompleta može da sadrži i prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. Takođe su obimom predmetnog pronalaska obuhvaćeni i kompleti koji sadrže jedno- i više-komorne unapred napunjene špriceve (npr. tečne špriceve i lizošpriceve).

[0460] Tokom predmetne prijave, izraz „obuhvata“ treba tumačiti kao da obuhvata sve posebno navedene karakteristike, kao i opcione, dodatne, nespecifikovane. Kako se ovde koristi, upotreba izraza „obuhvata“ takođe obelodanjuje otelotvorenje u kom nisu prisutne nikakve karakteristike osim specifično navedenih karakteristika (tj. „se sastoji od“). Dalje, oblik množine ne isključuje množinu. Sama činjenica da se određene mere navode u međusobno različitim zavisnim patentnim zahtevima ne ukazuje na to da se kombinacije ovih mera ne mogu povoljno koristiti.

[0461] Pronalazak će sada biti detaljnije opisan sa pozivanjem na prateće slike i primere. Dok je pronalazak ilustrovan i detaljno opisan u prethodnom opisu, primere treba smatrati ilustrativnim ili primernim, a ne restriktivnim.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0462]

SEQ ID NO: 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD3ε proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P07766.

SEQ ID NO: 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Macaca fascicularis CD3ε proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem Q95LI5.

SEQ ID NO: 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele ljudske CD3ε His-označene Fcfuzije koja obuhvata aminokiseline 23 do 126 divljeg tipa ljudskog CD3ε proteina pune dužine.

SEQ ID NO: 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele Macaca fascicularis CD3ε Fcfuzije koja obuhvata aminokiseline 23 do 117 divljeg tipa Macaca fascicularis CD3ε proteina pune dužine (SEQ ID NO:2) koji sadrži jednu Ala u Val zamenu na aminokiselinskom položaju 35 u poređenju sa aminokiselinskim položajem 57 sekvence divljeg tipa.

SEQ ID NO: 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „20G6-F3“ antitela.

SEQ ID NO: 6, 7 i 8 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „20G6-F3“ antitela.

SEQ ID NO: 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „20G6-F3“ antitela.

SEQ ID NO: 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „20G6-F3“, „11D7-C3“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9, „10F4-C10“, „18G9-H11“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „8C2-F7“, „20E5-F10“ i „3H6-D2“ antitela.

SEQ ID NO: 11 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „20G6-F3“, „4B4-D7“ , „11H3-E5“ , „13H2-C2“, „13C1-F6“, „10F4-C10“, „4E7-C9“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „20E5-F10“ i „3H6-D2“ antitela.

SEQ ID NO: 12 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „4B4-D7“ antitela.

SEQ ID NO: 13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-H od takozvanog „4B4-D7“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „10F4-C10“, „18G9-H11“, „4E7-C9“, „11F3-B9“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20B5-F10“ i „3H6-D2“ antitela.

SEQ ID NO: 14 i 15 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR2-H i CDR3-H od

14

takozvanog „4B4-D7“ antitela.

SEQ ID NO: 16 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od takozvanog „4B4-D7“ antitela.

SEQ ID NO: 17 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „4B4-D7“, „11H3-E5“ i „11 F3-B9“ antitela.

SEQ ID NO: 18 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „4E7-C9“ antitela.

SEQ ID NO: 19 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H od takozvanog „4E7-C9“, „18F5-H10“, „20E5-F10“ i „3H6-D2“ antitela.

SEQ ID NO: 20 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „4E7-C9“ antitela.

SEQ ID NO: 21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od takozvanog „4E7-C9“ antitela.

SEQ ID NO: 22 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-H od takozvanog „4E7-C9“ antitela.

SEQ ID NO: 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „18F5-H10“ antitela.

SEQ ID NO: 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-H od takozvanog „18F5-H10“ antitela.

SEQ ID NO: 25 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „18F5-H10“ antitela.

SEQ ID NO: 26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od takozvanog „18F5-H10“ antitela.

SEQ ID NO: 27 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „18F5-H10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 28 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „18F5-H10“, „11D7-C3“, „1E6-C9“ i „10E6-G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 29 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „12D2-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 30 i 31 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR2-H od takozvanog „12D2-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 32 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „12D2-E5“ i „3G5-E10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 33 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca

14

takozvanog „12D2-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 34 i 35 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR3-H od takozvanog „12D2-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 36 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „11D7-C3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 37 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H od takozvanog „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „16F8-A7“, „11F9-F8“ i „20B5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 38 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „11 D7-C3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 39 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „11D7-C3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 40 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „11H3-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 41 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „11H3-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 42 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „11H3-E5“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 43 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „13H2-C2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 44 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „13H2-C2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 45 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „13H2-C2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 46 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanih „13C1-F6“ i „11F9-F8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 47 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „13C1-F6“, „10E6-G6“ i „11F9-F8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 48 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „13H2-C2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 49 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „18H11-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 50, 51 i 52 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „18H11-F10“ anti-CD3 antitela.

14

SEQ ID NO: 53 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „18H11-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 54 i 55 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „18H11-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 56 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „1E6-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 57 i 58 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR3-H od takozvanog „1E6-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 59 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „1E6-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 60 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „10F4-C10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 61 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „10F4-C10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 62 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „10F4-C10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 63 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „10E6-G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 64 i 65 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR2-H od takozvanog „10E6-G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 66 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „10E6-G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 67 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „10E6-G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 68 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „18G9-H11“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 69 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „18G9-H11“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 70 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „18G9-H11“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 71 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „18G9-H11“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 72 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „11F3-B9“ anti-CD3 antitela.

14

SEQ ID NO: 73 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „11F3-B9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 74 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „12G3-E8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 75, 76 i 77 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „12G3-E8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 78 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „12G3-E8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 79 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „5B1-G2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 80 i 81 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR3-H od takozvanog „5B1-G2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 82 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „5B1-G2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 83 prikazuje aminokiselinsku sekvencu dela varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „16F8-A7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 84 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „16F8-A7“ i „11F3-B9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 85 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „16F8-A7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 86 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD3δ proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P04234.

SEQ ID NO: 87 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „11F9-F8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 88 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „11F9-F8“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 89 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „3G5-E10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 90 i 91 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR2-H od takozvanog „3G5-E10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 92 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „3G5-E10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 93 i 94 prikazuju sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „3G5-

14

E10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 95 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „9D7-F3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 96, 97 i 98 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „9D7-F3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 99 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „9D7-F3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 100 i 101 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „9D7-F3“ i „6C9-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 102 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „8C2-F7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 103, 104 i 105 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „8C2-F7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 106 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „8C2-F7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 107 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „20E5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 108 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „20E5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 109 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „20E5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 110 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „20B5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 111 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „20B5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 112 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „20B5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 113 i 114 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „20B5-F10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 115 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „6C9-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 116, 117 i 118 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „6C9-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 119 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca

1

takozvanog „6C9-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 120 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „6C9-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 121 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „3E8-G1“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 122, 123 i 124 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „3E8-G1“ anti-CD3 antitelo

SEQ ID NO: 125 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „3E8-G1“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 126 i 127 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „3E8-G1“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 128 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „3H6-D2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 129 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „3H6-D2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 130 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „3H6-D2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 131 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „8H2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 132 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „8H2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 133 i 134 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „8H2“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 135 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 136 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1b humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 137 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1c humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 138 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1d humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 139 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 140 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1b humanizovanog

1 1

„20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 141 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1c humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 142 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od VL1c varijante humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 143 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1d humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 144 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 145 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2b humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 146 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2c humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 147 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2d humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 148 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 149 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2b humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 150 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2c humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 151 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2d humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 152 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH3a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 153 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH3b humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 154 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL3a humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 155 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL3b humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 156 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL3c humanizovanog „20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 157 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL3d humanizovanog

1 2

„20G6“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 158 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1A humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 159 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1B humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 160 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2A humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 161 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2B humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 162 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Cmodif1

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 163 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Cmodif2

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 164 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Cmodif3

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 165 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Amodif1

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 166 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Amodif2

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 167 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Amodif3

humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 168 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2C humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 169 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2D humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 170 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2F humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 171 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1A humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 172 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1B humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 173 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2A humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 174 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2B humanizovanog

1

„4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 175 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6Bmodif1 humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 176 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6Bmodif2 humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 177 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6Amodif1 humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 178 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6Amodif2 humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 179 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6Amodif3 humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 180 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6C humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 181 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH6D humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 182 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence D7-VK3mut humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 183 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence D7-VH1mut humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 184 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od VL1B, VL2B, VL1Cmodif3 i VL2F varijante humanizovanog „4B4“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 185 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD3γ proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P09693.

SEQ ID NO: 186 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca od Fab od takozvanog „20G6-F3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 187 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca od Fab od takozvanog „220G6-F3“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 188 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca od Fab od takozvanog „24E7-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 189 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca od Fab od takozvanog „24E7-C9“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 190 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca od Fab od takozvanog „24B4-D7“ anti-CD3 antitela.

1 4

SEQ ID NO: 191 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca od Fab od takozvanog „24B4-D7“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 192 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca od Fab od takozvanog „218F5-H10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 193 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca od Fab od takozvanog „218F5-H10“ anti-CD3 antitela.

SEQ ID NO: 194 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ljudskog CD123 proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u NCBI bazi podataka pod NP_002174,1 i u Uniprot bazi podataka pod P26951.

SEQ ID NO: 195 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od Macaca fascicularis CD123 proteina pune dužine, uključujući signalni peptid, kako je dostupno u GenBank bazi podataka pod EHH61867,1 i Uniprot bazi podataka pod G8F3K3.

SEQ ID NO: 196 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele ljudske CD123 Strep-II označene Fc-fuzije koja obuhvata aminokiseline 22 do 305 od ljudskog CD123 proteina pune dužine (SEQ ID NO: 194).

SEQ ID NO: 197 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele Macaca fascicularis CD123 Strep-II označene Fc-fuzije koja obuhvata aminokiseline 22 do 305 od Macaca fascicularis CD123 proteina pune dužine (SEQ ID NO: 195).

SEQ ID NO: 198 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „1E1-G5“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 199 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-H od takozvanog „1E1-G5“ i „8B11-B7“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 200 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H od takozvanog „1E1-G5“ i „6D6-B8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 201 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR3-H od takozvanog „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“ i „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 202 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „1E1-G5“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 203 i 204 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „1E1-G5“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 205 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „2B8-F3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 206, 207 i 208 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „2B8-F3“ anti-CD123 antitela.

1

SEQ ID NO: 209 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „2B8-F3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 210 i 211 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „2B8-F3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 212 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „2F8-D6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 213, 214 i 215 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „2F8-D6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 216 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „2F8-D6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 217 i 218 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „2F8-D6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 219 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „3B10-E6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 220, 221 i 222 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „3B10-E6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 223 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „3B10-E6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 224 i 225 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „3B10-E6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 226 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „3E3-D3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 227, 228 i 229 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „3E3-D3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 230 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „3E3-D3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 231 i 232 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „3E3-D3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 233 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „5A5-B4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 234, 235 i 236 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „5A5-B4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 237 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „5A5-B4“ anti-CD123 antitela.

1

SEQ ID NO: 238 i 239 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „5A5-B4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 240 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „6B10-E4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 241, 242 i 243 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „6B10-E4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 244 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „6B10-E4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 245 i 246 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „6B10-E4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 247 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „6C10-C4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 248, 249 i 250 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „6C10-C4“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 251 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „6C10-C4“ i „9B8-G6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 252 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „6C10-C4“ i „9B8-G6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 253 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-L od takozvanog „6C10-C4“, „9B8-G6“ i „9D7-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 254 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „6D6-B8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 255 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-H od takozvanog „6D6-B8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 256 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „6D6-B8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 257 i 258 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „6D6-B8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 259 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „8B11-B7“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 260 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H od takozvanog „8B11-B7“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 261 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „8B11-B7“ anti-CD123 antitela.

1

SEQ ID NO: 262 i 263 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „8B11-B7“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 264 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „9B8-G6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 265 i 266 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR2-H od takozvanog „9B8-G6“ i „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 267 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „9B8-G6“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 268 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 269 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR3-H od takozvanog „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 270 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 271 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 272 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca takozvanog „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 273 i 274 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR2-H od takozvanog „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 275 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 276 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L od takozvanog „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 277 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH_G45A od „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 278 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VHmDG od „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 279 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H varijante VHmDG od „3E3“ anti-CD123 antitelo i CDR2-H varijante VH1Fm2DG humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 280 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1A humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 281 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1B humanizovanog

1

„3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 282 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1C humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 283 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1D humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 284 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1E humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 285 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1F humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 286 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1G humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 287 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1Fm1

humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 288 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1Fm2

humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 289 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1Fm2DG

humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 290 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1Dm1

humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 291 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH1Em1

humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela

SEQ ID NO: 292 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1A humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 293 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1B humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 294 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1C humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 295 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1D humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 296 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1E humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 297 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1F humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 298 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1G humanizovanog

1

„3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 299 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Fm1 humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 300 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL1Fm2 humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 301 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH2A humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 302 prikazuje VH varijantu aminokiselinske sekvence VH3A humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 303 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2A humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 304 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2Am1 humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 305 prikazuje VL varijantu aminokiselinske sekvence VL2Am2 humanizovanog „3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 306 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 307 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke L1 takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ i CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 308 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od 7G3 koji predstavlja VD1ili VD2domen takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“ i CODV- Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 309 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke L2 takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ i CODV- Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 310 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CL takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“ i „hz4B4x3E3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 311 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 312 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca od 7G3 koji ovde predstavlja VH1ili VH2domen takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“,

1

„7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“ i CODV- Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 313 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CH1takozvanog CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 314 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „7G3 x 4E7“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 315 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „7G3x4E7“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 316 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „7G3x4B4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 317 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „7G3x4B4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 318 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „7G3x18F5“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 319 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „7G3x18F5“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 320 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 321 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 322 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab 7G3xhz4B4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 323 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „7G3xhz4B4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 324 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „hz4B4x3E3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 325 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „hz4B4x3E3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 326 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3 TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu. SEQ ID NO: 327 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc2takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 328 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli III

1 1

takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 329 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CH1 takozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 330 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fctakozvanog CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 331 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 332 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR2-H od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO:333 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR3-H od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 334 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-L od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO:335 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR3-L od takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 336 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO:337 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR2-H od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

1 2

SEQ ID NO: 338 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-L od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 339 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR3-L od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 340 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od takozvanih „6C10-C4“, 9B8-G6“, „9D7-C8“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 341 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR2-H od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO:342 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR3-H od takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 343 prikazuje konsenzus sekvencu za CDR1-L od „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela na osnovu poravnanja sekvenci.

SEQ ID NO: 344 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 345 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 346 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Thr-Val-Ala-Ala-Pro).

SEQ ID NO: 347 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gln-Pro-Lys-Ala-Ala).

SEQ ID NO: 348 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gln-Arg-Ile-Glu-Gly).

SEQ ID NO: 349 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).

SEQ ID NO: 350 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).

SEQ ID NO: 351 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys).

SEQ ID NO: 352 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke i His-oznaka sekvence dodate C-terminalno polipeptidu prema formuli II takozvanih CODV-Fab „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“, „7G3x18F5“, „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“ i

„hz4B4x3E3“ vezujućih proteina sličnih antitelu, koja odgovara zglobnoj sekvenci i Hisoznaci koje se koriste, na primer, za prečišćavanje.

SEQ ID NO: 353 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H varijante takozvanih

1

„3E3“ anti-CD123 antitela.

SEQ ID NO: 354 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Gly-Ser). SEQ ID NO: 355 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Ser-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 356 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 357 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 358 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

SEQ ID NO: 359 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Lys-Thr-His-Thr). SEQ ID NO: 360 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Lys-Thr-His-Thr-Ser).

SEQ ID NO: 361 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser).

SEQ ID NO: 362 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).

SEQ ID NO: 363 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).

SEQ ID NO: 364 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro).

SEQ ID NO: 365 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).

SEQ ID NO: 366 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).

SEQ ID NO: 367 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)

SEQ ID NO: 368 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)

SEQ ID NO: 369 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).

SEQ ID NO: 370 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).

SEQ ID NO: 371 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Glu-Pro-Lys-

1 4

Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).

SEQ ID NO: 372 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)

SEQ ID NO: 373 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly).

SEQ ID NO: 374 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)

SEQ ID NO: 375, 376 i 377 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od takozvanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 378 i 379 prikazuju aminokiselinsku sekvencu od CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 380 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijante varijabilnog domena teškog lanca takozvanog humanizovanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 381 i 382 prikazuju aminokiselinske sekvence od CDR1-H i CDR3-H takozvanog humanizovanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 383 prikazuje aminokiselinsku sekvencu dalje varijante varijabilnog domena teškog lanca takozvanog humanizovanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 384 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od CDR2-H od one takozvanog humanizovanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO: 385 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca takozvanog humanizovanog „7G3“ antitela.

SEQ ID NO:386 prikazuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 kako je prikazano u WO2015026892.

SEQ ID NO: 387 prikazuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 kako je prikazano u WO2015026892.

SEQ ID NO: 388 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli I takozvanih CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“, CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ i CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujućih proteina sličnih antitelu.

SEQ ID NO: 389 prikazuje aminokiselinsku sekvencu vezničke sekvence (Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly).

SEQ ID NO: 390 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 391 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli IV takozvanog CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

1

SEQ ID NO: 392 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od Fc2region takozvanog CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 393 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli III takozvanog CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 394 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od Fcregion takozvanog CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“.

SEQ ID NO: 395 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 396 prikazuje aminokiselinsku sekvencu od Fcregion takozvanog CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 397 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc patrljka (Fc3) takozvanog CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 398 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc patrljka (Fc3) takozvanog CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 399 prikazuje aminokiselinsku sekvencu polipeptida prema formuli II takozvanog CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SEQ ID NO: 400 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc patrljka (Fc3) takozvanog CODV-Fab-OL1a „hz20G6xhz7G3“ vezujućeg proteina sličnog antitelu.

SLIKE

[0463]

Slika 1: Poravnanja sekvenci VH regiona takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela.

Slika 2: Poravnanja sekvenci VL regiona takozvanih „20G6-F3“, „4B4-D7“, „4E7-C9“, „18F5-H10“, „11D7-C3“, „11H3-E5“, „13H2-C2“, „13C1-F6“, „1E6-C9“, „10F4-C10“, „10E6-G6“, „18G9-H11“, „11F3-B9“, „12G3-E8“, „5B1-G2“, „16F8-A7“, „11F9-F8“, „20E5-F10“, „20B5-F10“, „3H6-D2“ anti-CD3 antitela.

Slika 3: Poravnanja sekvenci VH i VL regiona takozvanih „1E1-G5“, „6D6-B8“, „8B11-B7“, „, „9F6-G3“ anti-CD123 antitela.

Slika 4: Poravnanja sekvenci VH i VL regiona takozvanih „6C10-C4“, 9B8-G6“, „9D7-C8“ anti-CD123 antitela.

Slike 5 i 7: Potpuno ljudski CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ IV Q3d u prisustvu ljudskih

1

T ćelija inhibira rast Molm13 tumor u čitavom telu pri svim testiranim dozama.

Slike 6 i 8: Potpuno ljudski CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ IV Q3d u prisustvu ljudskih T ćelija je povezan sa regresijom tumora u dugačkim kostima pri svim testiranim dozama.

Slike 9 i 11: Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ IV u prisustvu ljudskih T ćelija inhibira rast tumora.

Slike 10 i 12: Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ IV u prisustvu ljudskih T ćelija je povezan sa regresijom tumora u dugačkim kostima.

Slike 13 i 15: Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ CIP u prisustvu ljudskih T ćelija inhibira rast tumora u čitavom telu pri dozi od 0,13 nmol/Kg/dan ili iznad.

Slike 14 i 16: Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ CIP u prisustvu ljudskih T ćelija inhibira rast tumora u dugačkim kostima pri dozi od 0,13 nmol/Kg/dan ili iznad. Slika 17: Dijagramski prikaz strukture CODV-Ig, CODV-Fab-TL i CODV-Fab-OL (dalje prikazuje LALA mutacije (kada se koristi Fc od IgG1 kičme) i čvor-u-rupi mutacije).

PRIMERI

Primer 1: Stvaranje antitela

1.1 konstrukt hCD3ε/δ-hFc fuzionog plazmida eksprimiranja (CD3ed-Fc)

[0464] Korišćenje plazmida koji sadrže cDNK kao šablon, ljudski i Macaca fascicularis fuzioni proteini CD3ε i CDδ su generisani, kao što je ovde detaljno opisano u nastavku, u okviru za čitanje sa konstantnim regionom teškog lanca, uključujući zglobni region, CH2 i CH3 domene ljudskog imunoglobulina IgG, koji dodatno nose 8 x His ili Strep-II oznaku za opciono tandem prečišćavanje.

[0465] Koristeći ljudsku genomsku DNK kao šablon, amplifikovani su vanćelijski domeni ljudske CD3ε i ljudske CDδ podjedinice, uključujući signalnu sekvencu. Dobijeni amplifikovani razdvojeni i prečišćeni PCR proizvodi kombinovani su ligacijom PCR i ligirani u sisarski vektor eksprimiranja pXL InFusion postupkom primenom Nhel i Hindlll mesta. Svaka podjedinica je klonirana na jedan plazmid. Sekvenca nastalog zrelog ljudskog CD3ε His-označenog Fc-fuzionog proteina ovde je obelodanjena pod SEQ ID NO: 3.

Aminokiseline 1 do 104 iz SEQ ID NO: 3 odgovaraju aminokiselinama 23 do 126 divljeg tipa ljudskog CD3ε proteina pune dužine (ovde obelodanjen pod SEQ ID NO: 1, dostupan u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem P07766), i samim tim vanćelijskom domenu ljudskog CD3ε.

1

[0466] Koristeći genomsku DNK cinomolgus majmuna kao šablon, amplifikovani su Macaca fascicularis CD3ε i CD3δ vanćelijski domeni , uključujući signalnu sekvencu. Dobijeni amplifikovani razdvojeni i prečišćen PCR i proizvodi kombinovani su ligacijom PCR i ligirani u sisarski vektor eksprimiranja pXL InFusion postupkom primenom Nhel i Hindlll. Svaka podjedinica je klonirana na jedan plazmid. Dobijene sekvence za zrele Macaca fascicularis CD3ε Fc-fuzione proteine obelodanjene su pod SEQ ID NO: 4. Aminokiseline 1 do 95 iz SEQ ID NO: 3 odgovaraju aminokiselinama 23 do 117 Macaca fascicularis CD3ε proteina pune dužine i tako sadrži vanćelijski domen divljeg tipa Macaca fascicularis CD3ε pune dužine (ovde obelodanjen pod SEQ ID NO: 2, dostupan u Uniprot bazi podataka pod pristupnim brojem Q95LI5). Klonirani fuzioni protein dalje sadrži jednu Alanin-Valin razmenu na aminokiselinskom položaju 35 u poređenju sa aminokiselinskim položajem 57 sekvence divljeg tipa.

1.2 Eksprimiranje i prečišćavanje ljudskog i cino CD3ed-Fc

[0467] Freestyle HEK293 ćelije koje rastu u F17 kulturi suspenzije bez seruma (Life) su transientno transficirane plazmidom eksprimiranja. Ko-transfekcija oba plazmida koji predstavljaju podjedinicu CD3ε i CD3δ ekstracelularnog domena (ECD) izvedena je korišćenjem Cellfectin reagensa za transfekciju (Life). Ćelije su kultivisane na 37°C tokom 7 dana. Supernatant kulture koji sadrži rekombinantni protein sakupljen je centrifugiranjem i pročišćen filtracijom (0,22 µm).

[0468] Za prečišćavanje, varijante Fc-fuzionog proteina su zarobljene na matrici proteina A (GE) i eluirane pH pomakom. Nakon poliranja proteina hromatografijom za isključivanje veličine (SEC) upotrebom Superdex 200 (GE) i konačnog koraka koncentracije ultrafiltracije, protein je korišćen za dalje testove.

[0469] Ljudski heterodimer je dodatno nanesen na His-Trap kolonu (GE) nakon hvatanja na proteinu A i desalinizovan. Eluirani protein je nanet na Strepavidin (GE) kolonu i eluiran sa d-destiobiotinom pre konačnog poliranja pomoću SEC koristeći Superdex 200 (GE). Ova strategija je korišćena za izolaciju heterodimera od homodimera.

1.3 Generisanje unakrsno reaktivnih anti-CD3 antitela kod ljudi/cinomolgous majmuna [0470] Ljudske i Macaca fascicularis CD3ε i CD3 δ cDNK klonirane su u Aldevron vlasničke imune vektore (pB8 i VV8) respektivno, i korišćene su za genetsku imunizaciju

1

pacova. Pacovi imunizacione grupe MR12-266 („CD3-cyno“) u početku su imunizovani sa ljudskim CD3ε i CD3δ cDNK, nakon čega su sledile još dve imunizacije smešom ljudskih i Macaca fascicularis CD3ε i CD3 δcDNK. Imuni serum je uzet dana 24 protokola imunizacije, nakon 4 genetske primene (IS24d-4). Serumi, razblaženi u PBS 1% BSA, testirani su protočnom citometrijom koristeći ćelije sisara koje su privremeno transficirane ciljanim cDNK u eksperimentima ko-transfekcije kako bi se dobili ljudski i Macaca fascicularis CD3ε i CD3δ TCR kompleksi. Pored toga, imuni serumi su testirani na narednim ćelijskim linijama: Jurkat E6-1 (eksprimira ljudski TCR), Jurkat-RT-T3.5 (negativan na TCR) i cino HSC-F (eksprimira cino TCR); nije bila dostupna negativna ćelijska linija za cino TCR. Kozji anti-pacovski IgG R-fikoeritrin konjugat (Southern Biotech, #3030-09) u količini od 10 µg/ml korišćen je kao sekundarno antitelo.

[0471] Specifična reaktivnost imunih seruma, posebno protiv ćelija transficiranih kombinacijama CD3ε i CD3δcDNK, mogla se detektovati kod imunizovanih životinja u poređenju sa ćelijama transficiranim irelevantnom cDNK. Isto važi i za test na TCR-pozitivnoj ćelijskoj liniji Jurkat (E6-1), u poređenju sa TCR-negativnom ćelijskom linijom (RT-T3.5), znatno slabiji signali su detektovani na cinomolgous HSC-F ćelijskoj liniji (pogledati tabelu 1).

1

je.

etri

om

cit

čne

proto

oću

. m po fu)(re nje

cijoti nživsce re ake

sv fluota kod

zite

ksa nte in ple om nog -ktivR

Crela T

vine i

ot

sred prake ijs um

etrser

geom unih

aoim iki

stjen no

avltiv

dst eak

pre ner

i su fičeci

odacsp P nje

ova

ekt

et

D

1:

a

abel

T

[0472] Pacovi imunizacione grupe MR12-265 („CD3-hum“) su imunizovani sa ljudskim CD3ε i CD3δ cDNK kloniranim u odgovarajuće vektore eksprimiranja. Imuni serum je uzet na dan 24 protokola imunizacije, nakon 4 genetske primene (IS24d-4). Serumi, razblaženi u PBS 1% BSA, testirani su protočnom citometrijom koristeći ćelije sisara privremeno transficirane gore navedenim ciljanim cDNK u eksperimentima ko-transfekcije kako bi se dobili ljudski i Macaca fascicularis CD3ε i CD3δ TCR kompleksi. Kozji anti-pacovski IgG R-fikoeritrin konjugat (Southern Biotech, #3030-09) u količini od 10 µg/ml korišćen je kao sekundarno antitelo. Pored toga, imuni serumi su testirani na narednim ćelijskim linijama: Jurkat E6-1 (koji eksprimira ljudski TCR), Jurkat-RT-T3.5 (negativan na TCR) i cino HSC-F (eksprimira cino TCR); nije bila dostupna negativna ćelijska linija za cino TCR. Kozji antipacovski IgG R-fikoeritrin konjugat (Southern Biotech, br.3030-09) u količini od 10 µg/ml korišćen je kao sekundarno antitelo.

[0473] Specifična reaktivnost imunih seruma, posebno protiv ćelija transficiranih kombinacijama CD3ε i CD3δ cDNK, mogla je da se detektuje kod imunizovanih životinja u poređenju sa ćelijama transficiranim irelevantnom cDNK. Isto važi i za test na TCR-pozitivnoj Jurkat ćelijskoj liniji (E6-1), u poređenju sa TCR-negativnom ćelijskom linijom (RT-T3.5), ali mnogo slabiji signali (međutim kod pozitivnih pacova i dalje značajni) su detektovani na cino HSC-F ćelijskoj liniji (pogledati tabelu 2)

1 1

ije

etr

tom

ci

e

očn

rot

p

oću

. m

po fu)e (rejnj

ci oti

cenživ

resake

sv fluota kod

itesa enzintplek m og n -kotivR

Crela T netiv disre pro a mjske ruetri semih geo un

aokiim

ost eni vnvljta ktisedrea

pru ne

ci sifič

daec o sp P e

anj

v

to

ek

te

D: 2

a

abel

T

[0474] Pacovi sa pozitivnim serumima su žrtvovani i B ćelije su sjedinjene sa mišjim ćelijama mijeloma. Dobijeni hibridomi su pregledani na HEK293 ćelijama transficiranim sa ljudskim ili cinomolgus CD3ε i CD3δ plazmidima eksprimiranja, na Jurkat E6.1 (CD3+) i Jurkat T3.5 (CD3-), pomoću protočne citometrije. Supernatant klonova hibridoma korišćen je za određivanje kinetike jednostruke tačke površinske plazmonske rezonance protiv ljudskog i Macaca fascicularis CD3ε/δ kompleksa fiksiranjem analita na 25nM (podaci su predstavljeni u tabeli 3).

Tabela 3: Detektovanje specifične reaktivnosti različitih supernanata klonova hibridoma pomoću protočne citometrije i Biacore analize. Supernatanti su testirani na različitim ćelijskim linijama (Jurkat E6-1, Jurkat-RT-T3.5 i cino HSC-F). Biacore analiza je izvršena protiv CD3e/d komplekasa od čoveka i cinomolgous majmuna, respektivno.

1

[0475] Pozitivni klonovi su prošireni i odgovarajuće cDNK za varijabilne teške i lake lance izolovane su pomoću RT-PCR. VH i VL sekvence su klonirane u vektore eksprimiranja u fuziji bilo sa ljudskim CH1, IGHG1-kičmom ili kppa lancem kako bi se eksprimirali Fabfragmenti kao i puni IgG.

1.4 Eksprimiranje IgG i Fab-fragmenata

[0476] Plazmidi eksprimiranja koji kodiraju teški i laki lanac IgG i Fab fragmenata su propagirani u E. Coli NEB 10-beta (DH10B derivat). Plazmidi korišćeni za transfekciju pripremljeni su iz E. Coli pomoću QIAGEN Plasmid Plus kompleta (kat. br.: 12991).

[0477] HEK 293-FS ćelije koje rastu u Freestyle medijumu (Invitrogen) transficirane su sa naznačenim LC i HC plazmidima koji kodiraju teške lance i lake lance, koristeći 293fectin (Invitrogen) reagens za transfekciju kako je opisao proizvođač. Ćelije su kultivisane na 37°C u Kuhner ISF1-X inkubatoru za mućkanje pri 110 o/min sa 8% CO2. Nakon 7 dana kultivacije ćelije su uklonjene centrifugiranjem, dodato je 10% v/v 1M Tris HCl pH 8,0 i supernatant je filtriran kroz 0,2µM gornji filter za boce kako bi se uklonile čestice. Konstrukti CODV-IgG1 su prečišćeni afinitetnom hromatografijom na protein A kolonama (HiTrap

1 4

Protein A HP kolone, GE Life Sciences). Nakon eluiranja iz kolone sa 0,1 M citrata, pH 3,0, CODV-IgG1 konstrukti su desalinizovani pomoću HiPrep 26/10 kolona za desalinizaciju, formulisanih u PBS (Gibco 14190-136).

[0478] Bispecifični CODV-Fab konstrukti prečišćeni su pomoću HisTrap kolona visokih performansi (GE Healthcare, kat. br.: 17-5248-02). Nakon eluiranja iz kolone (pufer za eluiranje: 20 mM natrijum fosfata, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazola, pH 7,4), fragmenti koji sadrže protein su objedinjeni i desalinizovane pomoću HiPrep 26/10 kolona za desalinizaciju, formulisanih u PBS (Gibco 14190-136).

[0479] Kako bi se monomeri odvojili od agregata, izveden je korak fragmentisanja visoke rezolucije u PBS (Gibco 14190-136) za oba konstrukta, CODV-IgG i CODV-Fab fragment, koristeći HiLoad Superdex 200 26/60320 ml kolonu (GE Healthcare kat. br.: 29-9893-36). Monomerni fragmenti su objedinjeni i koncentrovani do 1mg/ml, koristeći Vivaspin 20 centrifugirajuće kolone (VS2002 Sartorius Stedim biotech) i filtrirani koristeći 0,22 µm membranu (Millex® Syringe Filters SLGV033RS). Koncentracija proteina je određena merenjem apsorbancije na 280 nm. Svaka serija je analizirana pomoću SDS-PAGE pod redukcionim i neredukcionim uslovima kako bi se utvrdila čistoća i molekulska težina svake podjedinice i monomera.

1.5 Procena afiniteta anti-CD3 antitela

1.5.1 Procena afiniteta i za ljudski i za Macaca fascicularis CD3ε/δ

[0480] Afiniteti vezivanja za Fab koji vezuju anti-CD3 ili CODV-Fab izmereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću Biacore3000 instrumenta (GE Healthcare). Pufer za ispitivanje bio je HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Hvatanje OD3ε/δ-Fc fuzionih proteina postignuto je pomoću kompleta za hvatanje ljudskih antitela (GE Healthcare). Antitelo za hvatanje povezano je sa CM5 čipovima (BR-1001-88, GE Healthcare) na približno 12,000 RU koristeći komplet za spajanje amina (BR-100-50, GE Healthcare). CD3εδ-Fc fuzioni proteini uhvaćeni su brzinom od 10 µl/min do približno 70 RU radi dobijanja Rmax vrednosti od 30 RU. Kinetika vezivanja sa anti-CD3 Fab ili CODV-Fab merena je pri 30 μl/min tokom 240 sekundi i 600 sekundi za fazu asocijacije i disocijacije. Korišćena su dvostruka razblaženja Fab od 3 do 400 nM u puferu za ispitivanje. Sve koncentracije Fab pokrenute su u duplikatu, zajedno sa duplikatima praznih pufera za dvostruko referenciranje. Regeneracija površine hvatanja izvedena je injekcijom od 1 min 3M

1

rastvora MgCl2 pri 30 μl/min. Za analizu podataka korišćen je BIAevaluation v.4.1 softver (GE Healthcare). Podaci su globalno uklapani pomoću Langmuirovog modela 1:1 sa prenosom mase.

[0481] Merenje afiniteta vezivanja anti-CD3 IgG i CODV-Fc proteina izvedena je analogno testu vezivanja za Fab i CODV-Fab, sa izuzetkom antitela za hvatanje. U ovom slučaju je korišćen His Capture komplet (28-9950-56, GE Healthcare) za hvatanje ljudskog CD3-Fc proteina pomoću His-tag. Za test vezivanja sa Macaca fascicularis CD3-Fc, Strep-MAB klasično antitelo (2-1507-001, IBA) je korišćeno kao antitelo za hvatanje. U ovom slučaju rastvor za regeneraciju je bio 10mM glicin pufer pH2,0.

Tabela 4: Afiniteti izabranih CD3 antitela protiv ljudskog i Macaca fascicularis CD3ε/δ komplekasa izmereni koristeći Biacore.

1

1.5.2 Vezivanje anti-CD3 antitela za huCD3ε, huCD3δ i huCD3ε/δ eksprimiranim na površini HEK293F ćelija pomoću protočne citometrije

[0482] Kako bi se analiziralo vezivanje antitela za ljudski CD3ε i ljudski CD3δ eksprimirane na površini ćelija, HEK293F ćelije su transficirane sa oba konstrukta bilo samostalno ili u kotransfekciji, i signali su mereni protočnom citometrijom. Za postupak transfekcije korišćen je FuGENE HD reagens za transfekciju (Promega, #E2311) prema protokolu proizvođača.

[0483] HEK293F ćelije su posejane u Freestyle293 medijum (Gibco) pri 6E6 ćelija po epruveti u Cellstar Cellreactor epruvetama od 50 ml sa filterom (Greiner bio-one).

Transfekcije su izvršene prema FuGENE protokolu. Kompleksna priprema je rađena u OptiMEM bez fenol crvene (Gibco) u odnosu 3:1 (Protokol za transfekciju 293F ćelija uzgajanih u 8.000 µl medijuma u T-25 bocama upotrebom FuGENE®HD:DNK odnosa od 3.0:1, http://www.promega.com/techserv/tools/FugeneHdTool/default.aspx).

[0484] Ćelije su inkubirane u mikseru na 37°C i 5% CO2. Na dane jedan do tri nakon transfekcije, ćelije su sakupljene i vezivanje antitela je analizirano protočnom citometrijom.

[0485] Antitela za bojenje su posejana pri 1 μg u 50 µl po komorici pufera za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) u 96-komoričnim pločama za kulturu suspenzije sa U-dnom (Greiner bio-

1

one). Sakupljene transficirane ćelije su resuspendovane u puferu za bojenje sa FBS i dodavane su antitelima pri 50 µl po komorici. Ćelije su inkubirane na 4°C u mraku tokom 30 minuta i isprane dva puta.0,5 µg sekundarnog antitela kozje F(ab')2 anti-ljudsko IgG-FITC (Beckman Coulter, #732598) ili kozje F(ab')2 anti-ljudsko kapa-PE (Southern Biotech, #206209), u kombinaciji sa 0,5 µg 7-AAD po komorici dodato je u 100 µl pufera za bojenje sa FBS. Ćelije su inkubirane na 4°C u mraku tokom 15 minuta i isprane su dva puta. Za merenje, ćelije su resuspendovane u 200 µl pufera za bojenje sa FBS. Ćelije su merene korišćenjem MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat 7-AAD negativnih pojedinačnih ćelija pozitivnih na bojenje antitelima (podaci su predstavljeni u tabeli 5).

1.5.3 Vezivanje anti-CD3 Fab za huCD3ε/δ i huCD3ε/γ pomoću SPR

[0486] Vezivanje je testirano pomoću SPR koristeći BIAcore3000 instrument sa HBS-EP puferom. Rekombinantni huCD3 proteini (ε/δ (PB01226), ε/γ (PB01225)) uhvaćeni su pri 10 μl/min putem Fc-oznake sa anti-ljudskim Fc-antitelom za hvatanje MAB1302 (Millipore) imobilisanim na CM5 senzorskom čipu. Anti-CD3 Fab su korišćeni kao analiti na 100 nM sa vremenom asocijacije i disocijacije od 240 sekundi i 300 sekundi, respektivno pri 30µl/min. Nakon svakog ciklusa, površine su regenerisane dvominutnim pulsom od 10 mM glicin pufera pH2,5.

[0487] Kada je na površini HEK293F ćelija eksprimiran samo huCD3δ, protočnom citometrijom nije mogao da se detektuje signal. Nasuprot tome, skoro sva antitela mogu se vezati za ćelije transficirane sa huCD3ε isključivo ili u ko-transfekciji sa huCD3δ, što ukazuje da je huCD3ε neophodan kao epitop. U Biacore testovima prikazano je vezivanje za huCD3ε, bez obzira na to da li je δ ili γ lanac korišćen za rekombinantni protein, što sugeriše da je huCD3ε dovoljan kao antigen.12D2 antitelo se izuzetno vezivalo samo za huCD3ε kada je prisutan ko-lanac. Može postojati indirektni efekat ko-eksprimiranja g ili d lanca u odnosu na konformacionu strukturu proteina tako da prikaže epitop za ovo antitelo. Isti efekat je prikazan i za objavljeno OKT3 antitelo. Opisano je da ovo antitelo deluje u interakciji sa konformacionim epitopom nastalim nakon povezivanja huCD3ε sa huCD3δ ili γ (Salmeron i dr., 1991, The Journal of Immunology). Takođe je pokazano da se vezuje isključivo za huCD3ε podjedinicu (Kjer-Nielsen i dr., 2004, PNAS). Zbog sličnog ponašanja 12D2 i OKT3 interakcija sa huCD3ε je moguća za 12D2. Uzeto sve zajedno, čini se da je huCD3ε antigena

1

struktura za sva analizirana antitela (podaci su predstavljeni u tabeli 5).

Tabela 5: Afiniteti izabranih CD3 antitela protiv huCD3δ, huCD3ε, huCD3ε/δ i huCD3ε/γ komplekasa mereni koristeći protočnu citometriju i Biacore.

1.6 Vezivanje CD3 Fab za ljudske T ćelije

[0488] Kapacitet vezivanja CD3-Fab određen je protočnom citometrijom. Primarne ljudske T ćelije su korišćene kao ciljane ćelije. Zbog toga su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane iz 200 ml periferne krvi zdravih donora tretiranih sa EDTA centrifugiranjem Ficoll-ove gustine. 15 ml Histopaque (Sigma-Aldrich) je prethodno napunjeno na Leucosep epruvetu od 50 ml (Greiner bio-one). Krv je razblažena autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA (Miltenyi Biotec) i položena na membranu od ukupno deset pripremljenih epruveta. Epruvete su centrifugirane bez kočnice 10 minuta na 1000 xg. PBMC

1

su sakupljeni i isprani autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA tri puta. Na kraju, PBMC su resuspendovani u autoMACS puferu za punjenje (Miltenyi Biotec) za izolaciju T limfocita pomoću autoMACSpro tehnologije koristeći Pan T Cell izolacioni komplet (Miltenyi Biotec) u skladu sa uputstvima proizvođača. Čistoća odvojenih T ćelija je analizirana MACSQuant protočnom citometrijom koristeći ljudski sedmobojni komplet za imunofenotipizaciju (Miltenyi Biotec). Izolovane T ćelije su resuspendovane u puferu za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) i 1E5 ćelija u 100 µl po komorici su posejane u 96-okomorične ploče za kulturu suspenzije sa U-dnom (Greiner bio-one). Fab antitela su razblažena 1:3 u seriji u PBS (Invitrogen) i po 5 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 30000 ng/ml. Test je inkubiran 45 minuta na 4°C. Ćelije su isprane dva puta sa puferom za bojenje sa FBS i dodato je 1 µg sekundarnog antitela kozjeg F(ab')2 anti-ljudskog kapa-FITC (Beckman Coulter, #732621) po komorici u 100 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici. Test je inkubiran 20 minuta na 4°C i dva puta ispran. Ćelije su resuspendovane u 150 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici i merene su pomoću MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Pročitan je procenat ćelija pozitivnih na vezivanje antitela. Za postavljanje granica korišćene su ćelije tretirane samo sekundarnim ali nikakvim primarnim antitelom. EC50krive su izračunate pomoću XLfit (Algorithm 205), EC50vrednosti su izračunate kao tačka pregiba od nagiba (podaci su prikazani u tabeli 6).

Tabela 6: Afiniteti CD3 Fab za ljudske T ćelije mereno protočnom citometrijom.

Prikazane su srednje EC50vrednosti izračunate sa krivih.

1

1.7 Sigurnost CD3 Fab

[0489] 1.7.1 Sigurnost CD3 Fab merena eksprimiranjem CD25 i CD69 na ljudskim T ćelijama. Uticaj CD3 Fab antitela na status aktivacije T ćelija kao sigurnosno očitavanje analizirano je protočnom citometrijom na osnovu detektovanja eksprimiranja aktivacionog markera CD25 i CD69 na površini primarne ljudske T ćelije.

[0490] Izolovani primarni ljudski T limfociti su resuspendovani u RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% FCS (Invitrogen) i 2,5E5 ćelija je posejano u 96-komorične ploče sa U-dnom sa kulturama suspenzije (Greiner bio-one) u 100 µl po komorici.

[0491] 5µl Fab CD3 antitela je dodato ćelijama u konačnoj koncentraciji od 30000 ng/ml. Test je inkubiran 20 sati na 37°C u 5% CO2.

[0492] Nakon vremena inkubacije ćelije su zarotirane i bojene 15 minuta na 4°C u 100 µl pufera za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) po komorici sa narednim označenim antitelima: CD25-V450, CD69-APC

[0493] Ćelije su isprane dva puta nakon bojenja, resuspendovane u 150 µl pufera za bojenje sa FBS, i izmereno je 5000 ćelija upotrebom LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat CD25pos i CD69pos T ćelija (tabela 7).

1 1

Tabela 7: Sigurnost CD3 Fab merena eksprimiranjem CD25 i CD69 na ljudskim T ćelijama

1.7.2 Sigurnost CD3 Fab merena pomoću CD4+/CD69 , CD4+/CD25 , CD8+/CD69 i CD8+/CD25 eksprimiranja na ljudskim T ćelijama

[0494] Efekat CD3 Fab antitela na status aktivacije T ćelija kao sigurnosno očitavanje analiziran je protočnom citometrijom na osnovu detektovanja eksprimiranja aktivacionog markera CD25 i CD69 na površini primarnih ljudskih T ćelija. Izolovani primarni ljudski T limfociti su resuspendovani u RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% FCS (Invitrogen) i 2,5E5

1 2

ćelija je posejano u 96-komorične ploče sa U-dnom koje nose kulture suspenzije (Greiner bio-one) pri 50 µl po komorici. Ili su testirane isključivo T ćelije, i komorice su napunjene sa 50 µl RPMI GlutaMAX I 10% FCS, ili su ciljane ćelije (tj. THP-1 ćelijska linija) dodate sa 2,5E4 ćelija po komorici u 50 µl RPMI GlutaMAX I 10% FCS. Bispecifična antitela su razblažena u seriji 1:3 u PBS (Invitrogen) i po 5 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 30000 ng/ml. Test je inkubiran 20 sati na 37°C u 5% CO2. Nakon vremena inkubacije ćelije su zarotirane i bojene 15 minuta na 4°C u 100 µl pufera za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) po komorici sa narednim označenim antitelima: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69- PE-Cy7. Kako su T-ćelije aktivirane sa Fluorescence Minus One (FMO) kontrolom obojene kako je opisano iznad, ali je CD25 zamenjen svojim izotipom (Izotip APC-IG1k) u jednoj epruveti, i CD69 zamenjen svojim izotipom (Izotip PE-Cy7-IG1k) u drugoj cevi. Ćelije su isprane dva puta nakon bojenja, resuspendovane u 150 µl pufera za bojenje sa FBS, i izmereno je 5000 ćelija upotrebom protočnog citometra LSRII (BD). Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos i CD8posCD69pos T ćelija. Granice su postavljene u skladu sa FMO kontrolama (pogledati tabelu 8).

Tabela 8: Sigurnost CD3 Fab merena pomoću CD4+/CD69 , CD4+/CD25 , CD8+/CD69 i CD8+/CD25 eksprimiranja na ljudskim T ćelijama

1

Primer 2: CD123 sekvence

2.1 Konstrukt plazmida za eksprimiranje CD123 (IL3RA) -hFc fuzije (CD123-Fc)

[0495] Korišćenje plazmida koji sadrže cDNK kao šablon, ljudski i Macaca fascicularis fuzioni proteini CD123 su generisani u okviru za čitanje sa konstantnim regionom teškog lanca, uključujući GS-veznik (koristi se u Macaca proteinu), zglobnim regionom, CH2 i CH3 domenima ljudskog imunoglobulina IgG koji dodatno nose Strep-II oznaku (samo u verziji ljudskog proteina).

[0496] Koristeći ljudsku genomsku DNK kao šablon, amplifikovan je ljudski CD123 (IL3RA) vanćelijski domen, uključujući signalnu sekvencu. Dobijeni amplifikovani razdvojeni i prečišćeni PCR proizvodi kombinovani su ligacijom PCR i ligirani u sisarski vektor eksprimiranja pXL koristeći InFusion postupak primenom Nhel i Hindlll mesta.

Sekvenca rezultujućeg zrelog ljudskog CD123 Strep-II označenog Fc-fuzionog proteina obelodanjena je pod SEQ ID NO: 196. Aminokiseline 1 do 284 odgovaraju aminokiselinama 22 do 305 divljeg tipa ljudskog CD123 pune dužine (ovde obelodanjen pod SEQ ID NO: 194, dostupan iz NCBI baze podataka pod pristupnim brojem NP_002174.1) i samim tim vanćelijskom domenu ljudskog CD123.

[0497] Za kloniranje Macaca fascicularis CD123cDNK napravljen je od krvi Macaca fascicularis populacije. Koristeći ovu izolovanu cDNK kao šablon, amplifikovan je vanćelijski domen Macaca CD123 (IL3ra), uključujući signalnu sekvencu. Dobijeni amplifikovani razdvojeni i prečišćeni PCR proizvodi kombinovani su ligacijom PCR i ligirani u sisarski vektor eksprimiranja pXL koristeći InFusion postupak primenom Nhel i Hindlll. Sekvenca rezultujućeg zrelog ljudskog CD123 Strep-II označenog Fc-fuzionog proteina obelodanjena je pod SEQ ID NO: 197. Aminokiseline 1 do 284 odgovaraju aminokiselinama 22 do 305 divljeg tipa Macaca fascicularis CD123 pune dužine (ovde obelodanjen pod SEQ ID NO: 195, dostupan iz NCBI baze podataka pod pristupnim brojem NP_002174.1) i samim tim vanćelijskom domenu ljudskog CD123.

2.2 Eksprimiranje i prečišćavanje ljudskog i Macaca fascicularis CD123-Fc

[0498] Freestyle HEK293 ćelije koje rastu u kulturi suspenzije bez F17 seruma (Life) su transientno transficirane plazmidom eksprimiranja. Transfekcija je izvršena korišćenjem Cellfectin reagensa za transfekciju (Life). Ćelije su kultivisane na 37°C tokom 7 dana.

Supernatant kulture koji sadrži rekombinantni protein sakupljen je centrifugiranjem i

1 4

pročišćen filtracijom (0,22 µm).

[0499] Za prečišćavanje, varijante Fc-fuzionog proteina su uhvaćene na matrici proteina A (GE) i eluirane pomeranjem pH. Nakon poliranja proteina pomoću SEC u PBS koristeći Superdex 200 (GE) i završnog koraka koncentracije ultrafiltracije, protein je korišćen za dalja ispitivanja.

2.3 Procena afiniteta i za ljudski i za Macaca fascicularis CD123 Pacovaski IgG od hibridoma

[0500] Skrining anti-CD123 pacovskih IgG za afinitete vezivanja za ljudski CD123 i unakrsne reaktivnosti na cino CD123 izveden je sa supernatantima hibridoma koristeći Proteon XPR36 (Biorad) u jednom kinetičkom pristupu. Analiza hvatanja uspostavljena je pomoću kozjeg anti-pacovskog IgG (112-005-071, Jackson Immuno Research). Antitelo za hvatanje je obloženo na GLC čipove (176-5011, Biorad) na približno 8000 RU u vertikalnom smeru koristeći komplet za spajanje amina (176-2410, Biorad). Hvatanje pacovskih IgG na približno 200 RU u vertikalnom smeru rezultovalo je Rmax vrednostima do 100 RU za CD123-Fc. Kinetika vezivanja sa ljudskim i cino CD123-Fc fuzionim proteinom izmerena je pri 100 µl/min u horizontalnom smeru sa 120 sekundi i 600 sekundi za asocijaciju i disocijaciju, respektivno. CD123-Fc proteini su korišćeni u dvostrukim razblaženjima od 6 nM do 100 nM. PBSET pufer (176-2730, Biorad) je korišćen kao pufer za ispitivanje.

Regeneracija je postignuta injektiranjem 10mM glicin pufera pH 1,5 tokom 18 sekundi pri 30 µl/min. Obrada podataka i analiza izvršena je pomoću ProteonManager v3.0 softvera.

Postavljanje seenzograma izvedeno je pomoću Langmuir modela 1:1. Klonovi su odabrani na osnovu afiniteta za ljudski CD123 sa KD <1 nM i unakrsne reaktivnosti na cino CD123.

Fab i CODV-Fab

[0501] Afiniteti vezivanja za Fab koji vezuju anti-CD123 ili CODV-Fab izmereni su pomoću Biacore3000 instrumenta (GE Healthcare). Pufer za ispitivanje bio je HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Hvatanje fuzionih CD123 proteina-Fc postignuto je pomoću kompleta za hvatanje ljudskih antitela (GE Healthcare). Antitelo za hvatanje povezano je sa CM5 čipovima (BR-1001-88, GE Healthcare) na približno 12.000 RU koristeći komplet za spajanje amina (BR-100-50, GE Healthcare). CD123-Fc fuzioni proteini uhvaćeni su pri brzini od 10 µl/min do približno 70 RU radi dobijanja Rmax vrednosti od 30 RU. Kinetika vezivanja sa anti-CD123 Fab ili CODV-Fab je izmerena pri 30 µl/min tokom 240 sekundi i

1

600 sekundi za fazu asocijacije i disocijacije, respektivno. Korišćena su dvostruka razblaženja Fab od 3 do 200 nM u puferu za ispitivanje. Sve koncentracije Fab pokrenute su u duplikatu, zajedno sa duplikatima praznih pufera za dvostruko referenciranje. Regeneracija površine hvatanja izvedena je injekcijom 3M rastvora MgCl2 u trajanju od 1 minuta pri 30 µl/minut. Za analizu podataka korišćen je BIAevaluation v.4.1 softver (GE Healthcare). Podaci su globalno uklapani pomoću Langmuirovog modela 1:1 sa prenosom mase.

IgG i proteini CODV-Fc

[0502] Merenje afiniteta vezivanja anti-CD123 IgG i proteina CODV-Fc izvedeno je analogno testu vezivanja za Fab i CODV-Fab, sa izuzetkom antitela za hvatanje. U ovom slučaju, Strep-MAB klasično antitelo (2-1507-001, IBA) je korišćeno za hvatanje ljudskog CD123-Fc preko njegove Strepll-oznake. Ovde je rastvor za regeneraciju bio 10mM glicin pufera pH2.0.

2.4 Generisanje ljudskih i Macaca fascicularis unakrsno reaktivnih anti-CD123 antitela [0503] Ljudski i Macaca fascicularis CDD3 cDNK su klonirani u Aldevron vlasničke vektore imunizacije (pB8 i VV8). Tri pacova imunizacione grupe MR13-296 imunizovana su vektorom imunizacije IL3RA-hum.-ECD (aa19-305). Imuni serum je uzet na dan 24 protokola imunizacije, nakon 4 genetske primene (IS24d-4). Serumi, razblaženi u PBS 3% FBS, testirani su protočnom citometrijom primenom ćelija sisara privremeno transficiranih sa ljudskim i cino IL3RA cDNK varijantama IL3RA-hum.ECD i IL3RA-hum.D3.

[0504] Specifična reaktivnost imunog seruma protiv ćelija transfiricarnih sa pB1-IL3RA-hum.ECD, kao i sa IL3RA-cyno (pFF1262) i ćelijama THP-1 može se otkriti kod svih imunizovanih životinja u poređenju sa ćelijama transficiranim sa irelevantnom cDNK.

[0505] Pacovi sa pozitivnim serumima su žrtvovani i B ćelije su sjedinjene sa ćelijama mijeloma miša. Dobijeni hibridomi su pregledani na HEK293 ćelijama transficiranim ljudskim ili cinomolgus CD123 plazmidima eksprimiranja, na različitim ćelijskim linijama koje eksprimiraju CD123 protočnom citometrijom (podaci su prikazani u tabeli 10).

[0506] Ciljane ćelije su posejane na ćelijama 5E4 u 50 µl pufera za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) po komorici u 96-komoričnim pločama sa U-dnom koje drže kulturu suspenzije (Greiner bio-one). Supernatanti hibridoma su razblaženi u seriji 1:3 u PBS (Invitrogen) i po

1

50 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 1 µg/ml. Test je inkubiran 45 minuta na 4°C.

[0507] Ćelije su isprane dva puta sa puferom za bojenje sa FBS i dodato je 1 µg sekundarnog antitela kozjeg anti-pacovskog IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 (Invitrogen-Life Technologies, #MH10520) u 100 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici. Test je inkubiran 15 minuta na 4°C i dva puta ispran nakon toga.

[0508] Ćelije su resuspendovane u 200 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici i merene su upotrebom MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Pročitan je procenat ćelija pozitivnih na vezivanje antitela. Za postavljanje granica korišćene su ćelije tretirane samo sekundarnim ali nikakvim primarnim antitelom. Krive su izračunate pomoću XLfit (Algorithm 205).

[0509] Specifično vezivanje klonova za CD123 moglo bi se prikazati na površini transficiranih HEK293 u poređenju sa netransficiranim HEK293 ćelijama gde nije mogao da se detektuje signal (podaci nisu prikazani). Vezivanje antitela je zavisilo od koncentracije sa EC50vrednosti koja se kretala između 0,4 i 17,7 ng/ml (tabela 9).

Tabela 9: Specifično CD123 vezivanje od klonova pacovskih IgG u supernatantima hibridoma kako je detektovano protočnom citometrijom. Vezivanje antitela zavisno od koncentracije mereno je korišćenjem CD123 transficiranih HEK293 kao ciljanih ćelija i sekundarnog kozjeg anti-pacovski IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 antitela. Prikazane su izračunate EC50vrednosti sa krivih.

1

1 i ete

koj

lij nti

ujćeAan 3.

inuiv š 12 z D ve

o povr

C

tu

i

ac na

ean 3.

12 odanj

arij

D

.Piv Cez n)v

za 123

V

D .aregio

i C un 1anje 3 (D 12ajm ziv D m enu

veC

u ous

IL3 ajskrać ir olg

u sa m m ln u noeć pri ic inam ii d eks

d -ter na je lju N ko a ase odir dje

eliina

rim ost eć tesp bntn k

pro eso an 3ja spo 12 ko

bin

D u vu m Clijho o g ejićn

rek

ntno

naza zasi na albina

te odno

tirati om

se tes an rek

3 P2 36 12tiv

.S PR D pro X C ajom ni te njuetri atitel

miv iPro an

ito

3 ceć vez

12st i o D m i C no korac su oditetetoč

ro

in pfa je 10:P

aljuevano ab kazu

to

T poek

det

2.5 Humanizacija sekvenci anti-CD123 pacovskog antitela

[0510] Humanizacija pacovskih antitela izvedena je CDR-graftovanjem ili 4D postupkom (US20110027266). Za pacov-anti-CD3 antitelo 3E3, najbliža identifikovana Rattus-ova germlinijska sekvenca je IGHV2S48*01 i IGHJ3*01 za varijabilni region teškog lanca i IGLV3S2*01 i IGKJ3*01 za varijabilni region lakog lanca. Izračunati indeks germinalnosti pacova (samo okvirne sekvence) iznosi 94,51% za VH i 98,9% za VL.

[0511] Provereni su potencijalno problematični izloženi ostaci i modifikovan je jedan ostatak u CDRH2.

[0512] Korišćenjem metode graftovanja generisane su različite humanizovane varijante na osnovu identifikovanih najbližih ljudskih germlinijskih sekvenci: IGHV4-59*05 i IGHJ4*01 za VH (indeks germinalnosti na okvirima: 75,82%); IGLV6-57*01 i IGLj3*01 za VL (indeks germinalnosti na okvirima: 72,22%).

[0513] Pored CDR graftovanja, 4D protokol humanizacije (US20110027266) je korišćen za humanizaciju pacovskih anti-CD123 3E3 varijabilnih lakih (VL) i teških (VH) domena.

Izvedena je simulacija molekularne dinamike (MD) na minimalizovanom 3D modelu homologije (urađen sa MOE; PDB je korišćen: 1FLR) pacovskog anti-CD1233E3 i upoređen je sa 49 ljudskih modela izvedenih iz sedam reprezentativnih lakih lanaca (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) i sedam reprezentativnih teških lanaca (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) koje je dizajnirao LGCR/SDI i dostupni su u okviru MOE.

[0514] Dva modela su odabrana za „4D humanizaciju“: VI3-vh4 sa i VL3-VH2 sa najboljim i hidrofobnim i elektrostatičkim komponentama i identičnosti sekvence izvan CDR. Za uparenu povezanost između varijabilnog domena pacovskog anti-CD123 3E3 i dva izabrana modela, sekvence su poravnate na osnovu optimalne 3D superpozicije alfa ugljenika odgovarajućih modela homologije.

Primer 3: Antitela u bispecifičnom CODV-Fab formatu

3.1 Kloniranje odabranih CD3 sekvenci u kombinaciji sa anti-CD123 mAb 7G3 u bispecifičnom CODV-Fab formatu radi ispitivanja njihove aktivnosti angažovanja T-ćelija

[0515] Odabrane sekvence CD3 antitela, kao što su I2C, mAb2 (Macrogenics), i takozvani

1

„20G6-F3“, „4E7-C9“, „4B4-D7“ i „18F5-H10“, eksprimirani su kao monospecifični anti-CD3 Fab, Navedene izabrane sekvence su takođe dobro eksprimirane kao bispecifični CD3xCD123 CODV-Fab koristeći sekvence monoklonskog antitela 7G3, što je rezultovalo CODV-Fab konstruktima „I2Cx7G3“ i takozvanim „7G3x20G6“, „7G3x4E7“, „7G3x4B4“ i „7G3G4G4“, kao što je dalje opisano u odeljku „vezujući proteini slični antitelu“ iznad. Prečišćeni proteini su korišćeni u Biacore testu za poređenje afiniteta prema CD3ε/δ kompleksima (podaci su predstavljeni u tabeli 11). Biacore analizom nije bilo moguće otkriti promene afiniteta kada su CD3 sekvence uvedene u bispecifični CODV-Fab format.

Tabela 11: Poređenje afiniteta između Fab-fragmenata i CODV-Fab protiv CD3ε/δ komplekasa od čoveka i cinomolgous majmuna

3.2 Bispecifični CODV-Fab usmereni protiv CD123 i CD3 posreduju potentno preusmereno ubijanje T-ćelija

[0516] Takvi bispecifični CODV-Fab imaju sposobnost da lokalizuju T-ćeliju (vezivanjem takve T-ćelije za CD3-vezujući deo CD3-vezujućeg CODV-Fab) na mestu tumorske ćelije (vezivanjem takve ćelije raka za CD123 deo od CODV-Fab). Lokalizovana T-ćelija tada može da posreduje u ubijanju tumorske ćelije u procesu koji se ovde naziva „preusmereno“ ubijanje. Bispecifični CODV-Fab specifični za CD123 i CD3 konstruisani su tako da imaju varijabilne domene anti-CD123 monoklonskih antitela 7G3 i varijabilne domene anti-CD3 odabranih CD3 antitela generisanih u primeru 1.

1 1

[0517] Stoga su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane iz 200 ml periferne krvi zdravih donora tretiranih sa EDTA centrifugiranjem Ficoll-ove gustine. 15 ml Histopaque (Sigma-Aldrich) je prethodno stavljeno na Leucosep-epruvetu od 50 ml (Greiner bio-one). Krv je razblažena autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA (Miltenyi Biotec) i stavljena na membranu sa ukupno deset pripremljenih epruveta. Epruvete su centrifugirane bez kočnice 10 minuta na 1000 kg. PBMC su sakupljeni i isprani autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA tri puta. Na kraju, PBMC su resuspendovani u autoMACS puferu za punjenje (Miltenyi Biotec) za izolaciju T limfocita pomoću autoMACSpro tehnologije koristeći Pan T Cell izolacioni komplet (Miltenyi Biotec) u skladu sa uputstvima proizvođača. Čistoća odvojenih T ćelija je analizirana MACSQuant protočnom citometrijom koristeći ljudski sedmobojni komplet za imunofenotipizaciju (Miltenyi Biotec).

[0518] Efekat angažovanja T-ćelija od strane bispecifičnih antitela je analiziran citotoksičnim testom na osnovu protočne citometrije. Ciljane ćelije (tj. THP-1 ćelijska linija) su bojene tokom 15 minuta na 37°C sa 1 µM CFSE u 1 ml RPMI GlutaMAX I (Gibco) po 1E7 ćelija. Nakon toga, ćelije su isprane dva puta i resuspendovane u RPMI GlutaMAX I 10% FCS (Invitrogen). 2,5E4 ciljane ćelije su posejane u 96-komorične ploče sa U-dnom koje drže kulturu suspenzije (Greiner bio-one) sa 50 µl medijuma po komorici.

[0519] Izolovani primarni ljudski T limfociti su resuspendovani u RPMI GlutaMAX I 10% FCS i dodavani su ciljanim ćelijama u naznačenom efektor-cilj odnosu sa 50 µl po komorici (generalno E:T = 10:1).

[0520] Bispecifična antitela su razblažena u seriji 1:3 u PBS (Invitrogen) i po 5 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 3000 ng/ml. Test je inkubiran tokom 20 sati na 37°C u 5% CO2.

[0521] Kako bi se detektovale mrtve ciljane ćelije, sve ćelije su obojene sa 7-AAD. Prema tome, u svaku komoricu je dodato 5 µg/ml 7-AAD razređenog u puferu za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) i inkubirano je tokom 15 minuta na 4°C u mraku. Ćelije su merene korišćenjem MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat CFSE i 7-AAD dvostruko pozitivnih ćelija.

1 2

[0522] Rezultati ovih ispitivanja prikazani, na primer, u tabelama 20 do 22, pokazuju sposobnost CD123xCD3 CODV-Fab da posreduju u preusmerenom ubijanju tumorskih ćelija.

3.3 Procena bezbednosti preusmerenog ubijanja T-ćelija

[0523] Efekat bispecifičnih antitela na status aktivacije T ćelija kao sigurnosno očitavanje analiziran je detektovanjem eksprimiranja aktivacionog markera CD25 i CD69 na površini primarnih ljudskih T ćelija na osnovu protočne citometrije.

[0524] Izolovani primarni ljudski T limfociti su resuspendovani u RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% FCS (Invitrogen) i 2,5E5 ćelija je posejano u 96-komorične ploče sa U-dnom koje nose kulture suspenzije (Greiner bio-one) u 50 µl po komorici.

[0525] Ili su testirane isključivo T ćelije, i komorice su napunjene sa 50 µl RPMI GlutaMAX I 10% FCS, ili su ciljane ćelije (tj. Ćelijska linija THP-1) dodate sa 2,5E4 ćelija po komorici u 50 µl RPMI GlutaMAX I 10% FCS.

[0526] Bispecifična antitela su razblažena u seriji 1:3 u PBS (Invitrogen) i po 5 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 30000 ng/ml. Test je inkubiran 20 sati na 37°C u 5% CO2.

[0527] Nakon vremena inkubacije ćelije su zarotirane i bojene tokom 15 minuta na 4°C u 100 µl pufera za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) po komorici sa narednim označenim antitelima: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7

Kako su T-ćelije aktiviraneFluorescence Minus One (FMO) kontrolom obojene kako je opisano iznad, ali je CD25 zamenjen svojim izotipom (Izotip APC-IG1k) u jednoj epruveti, i CD69 zamenjen svojim izotipom (Izotip PE-Cy7-IG1k) u drugoj epruveti.

[0528] Ćelije su isprane dva puta nakon bojenja, resuspendovane u 150 µl pufera za bojenje sa FBS, i izmereno je 5000 ćelija upotrebom LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos i CD8posCD69pos T ćelija. Granice su postavljene prema FMO kontrolama (pogledati Tabelu 12).

1

Tabela 12: Aktivnost CD123 x CD3 CODV-Fab izmerena u citotoksičnom testu i sigurnost izmerena eksprimiranjem CD69

3.4 Humanizacija sekvenci anti-CD3 pacovskog antitela i bispecifičnih antitela [0529] Humanizacija pacovskog antitela izvedena je CDR-graftovanjem ili 4D postupkom (US20110027266).

[0530] Za pacovsko-anti-CD3 antitelo „20G6“ najbliže Rattusove germlinijske sekvence identifikovane su kao IGHV6S17*01 i IGHJ2*01 (za varijabilni region teškog lanca i IGKV1S21*01 i IGKJ4*01 za varijabilni region lakog lanca). Izračunati indeks germinalnosti pacova (samo okvirne sekvence) iznosi 97,80% za VH i 95,5% za VL.

[0531] Različite humanizovane varijante generisane su primenom postupka graftovanja na osnovu

1) najbližih identifikovanih ljudskih germlinijskih sekvenci IGHV3-30-01_IGHJ4-01 za VH sa indeksom germinalnosti u okviru 77%; IGK2D-29-02_IGKJ4-01 za VL sa indeksom germinalnosti u okviru 80%), ili

2) na osnovu najbližih identifikovanih germlinijskih sekvenci koje imaju niži PI IGVH3-48*02-IGHJ4-01 za VH sa indeksom germinalnosti u okviru 75%; IGKV2-28*01-IGKJ4-01 za VL sa indeksom geminitetnosti u okviru 77,5%, ili

3) koji se sastoji od udaljenije ljudske germlinijske sekvence (promena kladusa germlinija) (IGVH1-46*01-IGHJ4*01 za VH sa indeksom germinalnosti u okviru 56%; IGKV4*01-IGKJ4*01 za VL sa indeksom germinalnosti u okviru 67,5%).

humanizovane sekvence su zatim uvedene u CODV-Fab format takozvanog takozvanog CODV-Fab „7G3 x 20G6“ u kombinaciji sa anti-CD123 sekvencom iz antitela 7G3 kako je

1 4

prethodno opisano. Prečišćeni CD123 x CD3 CODV-Fab su korišćeni u Biacore testu za procenu afiniteta prema CD3ε/δ (pogledati tabelu 13).

Tabela 13: Povezivanje izabranih humanizovanih varijanti anti-CD3 antitela 20G6 sa rekombinantnim CD3ε/δ kompleksom..

[0532] Za pacovsko-anti-CD3 antitelo 4B4-D7 najbliže Rattusove germlinijske sekvence identifikovane su kao IGHV6S17*01 (identičnost 93%) i IGHJ2*01 (identičnost 87,5%) za varijabilni region teškog lanca i IGKV1S21*01 (identičnost od 93%) i IGKJ4*01 (identičnost od 100%) za varijabilni region lakog lanca.

[0533] Izračunati procenat identičnosti identifikovanih Rattusovih V-sekvenci sa ljudskom germinalnosti (samo okvirne sekvence) iznosi 79% za VH i 77,53% za VL.

[0534] Raznovrsni humanizovani parovi varijanti za VH i VL generisani su graftovanjem sa dodatnim inženjeringom sekvence, koristeći najbliže ljudske germlinijske sekvence (IGHV3-30*01_IGHJ6*02; IGKV2-30*02/IGKV2D-39*02_IGKJ2*01). Izračunati procenti ljudske germinalnosti (samo 4 IMGT okvirne sekvence) za humanizovane V-sekvence navedeni su u tabeli 14.

1

Tabela 14: Procenti ljudske germinalnosti za humanizovane V-sekvence dobijeni graftovanjem takozvanog „B4-D7“ antitela. Procenti su izračunati na osnovu samo 4 IMGT okvirne sekvence.

[0535] Pored CDR graftovanja, 4D protokol humanizacije opisan u SAD patentnoj prijavi US20110027266 je korišćen za humanizaciju pacovskih anti-CD34B4-D7 varijabilnih lakih (VL) i teških (VH) domena. Izvedena je simulacija molekularne dinamike (MD) na minimalizovanom 3D modelu homologije (urađen sa MOE; PDB korišćen: 1FLR) pacovskog anti-CD3 4B4-D7 i upoređen je sa 49 ljudskih modela izvedenih iz sedam reprezentativnih lakih lanaca (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) i sedam reprezentativnih teških lanaca (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) koji su dizajnirani pomoću LGCR/SDI i dostupno unutar MOE

[0536] Dva modela su izabrana za „4D humanizaciju“. vk1-vh6 sa najvećom 4D sličnošću, sa hidrofobnim i elektrostatičkim komponentama. vk2-vh3 sa najvećom identičnosti sekvence izvan CDR. Za uparenu povezanost između varijabilnog domena pacovskog anti-CD34B4-

1

D7 i dva izabrana modela, sekvence su poravnate na osnovu optimalne 3D superpozicije alfa ugljenika odgovarajućih modela homologije. Raznolikost drugih humanizovanih parova varijanti za VH i VL je dalje optimizovana.

[0537] Izračunati procenti ljudske germinalnosti (samo 4 IMGT okvirne sekvence) za humanizovane V-sekvence navedeni su u Tabeli 15:

Tabela 15: Procenti ljudske germinalnosti za humanizovane V-sekvence dobijene 4D humanizacijom takozvanog „B4-D7“ antitela. Procenti su izračunati na osnovu samo 4

IMGT okvirne sekvence.

[0538] Humanizovane sekvence su eksprimirane kao Fab-fragmenti i prečišćene, praćeno Biacore testom za procenu afiniteta za CD3ε/δ (podaci prikazani u tabeli 16).

Tabela 16: Afinitet izabranih humanizovanih varijanti anti-CD3 antitela 4B4-D7 za rekombinantni CD3ε/δ kompleksa.

1

3.5 Vezivanje CODV hu-Fab CD123 x CD3 za THP-1 i TF-1 ćelije

[0539] Sekvence odabranih CD123 antitela klonirane su u CODV-Fab format u kombinaciji sa CD3 vezujućom sekvencom i proteini su eksprimirani i prečišćeni.

[0540] Njihov kapacitet vezivanja za ćelije koje prirodno eksprimiraju CD123 određen je protočnom citometrijom. THP-1 ćelijska linija ili TF-1 ćelijska linija su korišćene kao ciljane

1

ćelije.

[0541] Ciljane ćelije su blokirane pomoću FcR-Blockera (Sigma). Zbog toga su ciljane ćelije resuspendovane u puferu za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) i blokirane sa 100 µl blokirajućeg reagensa po ml tokom 1 sata na 4°C. Ćelije su napunjene puferom za bojenje sa FBS i 1E5 ćelija u 50 µl po komorici je posejano u 96-komorične ploče sa U-dnom koje nose kulture suspenzije (Greiner bio-one).

Dodata su antitela pri 3 µg u 50 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici. Test je inkubiran 30 minuta na 4°C.

[0542] Ćelije su isprane dva puta sa puferom za bojenje sa FBS i dodat je 1 µg sekundarnog antitela kozjeg F(ab')2 anti-ljudskog kapa-FITC (Beckman Coulter, #732621) po komorici u 100 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici. Test je inkubiran 20 minuta na 4°C i dva puta ispran.

[0543] Ćelije su resuspendovane u 150 µl pufera za bojenje sa FBS po komorici i merene su pomoću MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Pročitan je procenat ćelija pozitivnih na vezivanje antitela. Za postavljanje granica korišćene su ćelije tretirane samo sekundarnim ali nikakvim primarnim antitelom.

[0544] Vezivanje CD123xCD3 CODV-Fab za CD123 prikazano je sa dve različite ćelijske linije koje eksprimiraju CD123 bilo sa ko-eksprimiranjem CD131 na ćelijskoj liniji TF-1 ili na površini THP-1 ćelija bez CD131 eksprimiranja. Primerno je prikazano pet različitih klonova koji se vezuju za ciljane ćelije. Kao negativna kontrola (kontrola specifičnosti) korišćen je CD19xCD3 CODV-Fab kao referenca, a CD123xCD3 CODV-Fab kao pozitivna kontrola (tabela 17).

1

Tabela 17: Specifično vezivanje CD123 ciljajućih sekvenci kloniranih u CODV-Fab kičmu u kombinaciji sa CD3 vezujućom sekvencom za THP-1 i TF-1 ćelijske linije.

Vezivanje antitela je detektovano korišćenjem CD123 koji eksprimira THP-1 i TF-1 kao ciljane ćelije. Dodato je 3 µg antitela i detektovano je sekundarnim kozjim anti-ljudskim kapa-FITC antitelom. Prikazani su procenti ciljanih ćelija pozitivnih na antitela.

3.6 Citotoksični efekat za THP-1 ćelije posredovan sa CODV-Fab CD123 x CD3

[0545] Efekti angažovanja T-ćelija bispecifičnih antitela koja se sastoje od novo generisane sekvence CD123 i iste CD3 vezujuće sekvence analizirani su citotoksičnim testom na osnovu protočne citometrije. Efektorske ćelije su primarne T ćelije izolovane iz pune krvi zdravih donora. THP-1 ćelije su korišćene kao CD123 koje eksprimiraju ciljane ćelije.

[0546] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz 200 ml periferne krvi zdravih donora tretiranih EDTA centrifugiranjem Ficoll-ove gustine.15 ml Histopaque (Sigma-Aldrich) je prethodno stavljeno na Leucosep-epruvetu od 50 ml (Greiner bio-one). Krv je razblažena autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA (Miltenyi Biotec) i stavljena na membranu od ukupno deset pripremljenih epruveta. Epruvete su centrifugirane bez kočnice 10 minuta na 1000 kg. PBMC su sakupljeni i isprani autoMACS puferom za ispiranje 1% BSA tri puta. Na kraju, PBMC su resuspendovani u autoMACS puferu za punjenje (Miltenyi Biotec) za izolaciju T limfocita pomoću autoMACSpro tehnologije koristeći Pan T Cell izolacioni komplet (Miltenyi Biotec) u skladu sa uputstvima proizvođača. Čistoća odvojenih T ćelija je analizirana MACSQuant protočnom citometrijom

2

koristeći ljudski sedmobojni komplet za imunofenotipizaciju (Miltenyi Biotec).

[0547] Ciljane ćelije (tj. THP-1 ćelijska linija) su bojene tokom 15 minuta na 37°C sa 1 µM CFSE u 1 ml RPMI GlutaMAX I 10% FCS (Invitrogen).2,5E4 ciljane ćelije su posejane u 96-komorične ploče sa U-dnom koje drže kulturu suspenzije (Greiner bio-one) u 50 µl medijuma po komorici.

[0548] Izolovani primarni ljudski T limfociti su resuspendovani u RPMI GlutaMAX I 10% FCS i dodavani su u naznačenom efektor-cilj odnosu sa 50 µl po komorici za ciljane ćelije (generalno E:T = 10:1).

[0549] Bispecifična antitela su razblažena 1:3 u seriji u PBS (Invitrogen) i po 5 µl je dodato ćelijama u konačnoj maksimalnoj koncentraciji od 3000 ng/ml. Test je inkubiran 20 sati na 37°C u 5% CO2.

[0550] Kako bi se detektovale mrtve ciljane ćelije, sve ćelije su obojene sa 7-AAD. Prema tome, u svaku komoricu je dodato 5 µg/ml 7-AAD razređenog u puferu za bojenje sa FBS (BD Pharmingen) i inkubirano je tokom 15 minuta na 4°C u mraku. Ćelije su merene korišćenjem MACSQuant (Miltenyi Biotec) ili LSRII (BD) protočnog citometra. Dalje analize podataka izvršene su pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.). Očitan je procenat CFSE i 7-AAD dvostruko pozitivnih ćelija. Krive su izračunate pomoću XLfit (Algorithm 205).

[0551] Kao što je primer prikazano u tabeli 18, bispecifična antitela su mogla da angažuju primarne T ćelije i da liziraju THP-1 ciljane ćelije in vitro. Povećanje mrtvih ciljanih ćelija zavisno od koncentracije antitela moglo se detektovati nakon 20 sati ko-inkubacije. Za ovde navedena antitela izračunate su EC50 vrednosti u rasponu između 12,2 i 429,3 ng/ml.

2 1

Tabela 18: Efekat angažovanja T-ćelija od bispecifičnog CODV-Fab CD123 x CD3 detektovan u testovima citotoksičnosti na osnovu protočne citometrije. Prikazane su srednje EC50 vrednosti izračunate sa krivih

[0552] Klon CD1233E3 kombinovan je sa humanizovanom varijantom anti-CD3 antitela 4B4 u formatu CODV-Fab. Njihov efekat angažovanja T-ćelija i njihova sposobnost da aktiviraju T-ćelije in vitro su analizirani.

[0553] Testovi citotoksičnosti su izvedeni kako je opisano iznad. Litički efekat primarnih ljudskih T ćelija na THP-1 ciljanu ćeliju posredovan ovim konstruktma je primerno prikazan u tabeli 20 pomoću CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E3. Citotoksična aktivnost se može pouzdano indukovati efektom zavisnim od koncentracije sa T ćelijama izolovanim od sedam različitih zdravih donora (tabela 19).

2 2

Tabela 19: Efekat angažovanja T-ćelija bispecifičnog CODV-Fab hz4B4 (4D_A) x 3E3 detektovan u testu citotoksičnosti na osnovu protočne citometrije. Prikazane su srednje EC50 vrednosti izračunate sa krivih.

3.7 Efekat aktiviranja T-ćelija CD123xCD3 CODV-Fab ili DART

[0554] Efekat bispecifičnih antitela na status aktivacije T ćelija kao sigurnosno očitavanje analiziran je detektovanjem eksprimiranja aktivacionog markera CD25 i CD69 na osnovu protočne citometrije na površini primarnih ljudskih T ćelija, kao što je prethodno opisano. Poređenje je uključivalo jednolančano CD123 x CD3 bispecifično telo u DART formatu (ovde nazvano „MGD006“) koje je opisano u WO2015026892 koje sadrži prvi polipeptidni lanac sekvence SEQ ID NO: 386 (koji je SEQ ID NO: 1 kao što je prikazano u WO2015026892) i drugi polipeptidni lanac sekvence SEQ ID NO: 387 (koji je SEQ ID NO: 3 kao što je prikazano u WO2015026892) međusobno kovalentno povezane disulfidnom vezom.

[0555] Kada su CODV-Fab inkubirani samo sa izolovanim T ćelijama, na površini CD4 pozitivnih i CD8 pozitivnih T ćelija nije moguće detektovati značajno povećanje eksprimiranja kasnog aktivacionog markera CD25 (podaci nisu prikazani). Jednako tako, nije bilo povećanja nivoa eksprimiranja ranog aktivacionog markera CD69 zavisnog od koncentracije u obe podgrupe T-ćelija (tabela 20). Zbog toga je konstrukt ocenjen kao neaktivan (NA). Nasuprot tome, ogroman porast nivoa eksprimiranja oba markera bio je merljiv kada su dodate ciljane THP-1 ćelije (podaci CD25 nisu prikazani, tabela podataka CD69 podataka 21).

2

Tabela 20: Efekat bispecifičnog CD123 x CD3 CODV-Fab ili DART na stanje aktivacije T ćelija detektovanih pomoću CD69 nivoa eksprimiranja u testu na osnovu protočne citometrije. Prikazani su srednji procenti aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija pri koncentraciji antitela od 100 nM i koncentracija minimalnog efekta u testovima isključivo sa T ćelijama.

[0556] Rezultati prikazani u tabeli 20 pokazuju da jednolančana antitela (DART) uzrokuju značajno više aktivacije T-ćelija u odsustvu ciljanih ćelija pod testiranim uslovima.

2 4

Tabela 21: Efekat bispecifičnog CODV-Fab hz4B4 (4D_A) x 3E3 na stanje aktivacije T ćelija detektovan pomoću CD69 nivoa eksprimiranja u testu na osnovu protočne citometrije. Prikazani su srednji procenti aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija pri maksimalnoj koncentraciji antitela (Cmax) i pri koncentraciji antitela pri EC50u citotoksičnom testu.

Analize su izvedene uz ko-inkubaciju THP-1 ciljanih ćelija i T ćelija.

Tabela 22: Efekat bispecifičnog potpuno humanizovanog 7G3 koji sadrži CODV molekule i jednolančani Dart na stanje aktivacije T ćelija detektovan pomoću CD69 nivoa eksprimiranja u testu na osnovu protočne citometrije. Prikazane su EC50 vrednosti reprezentativnih testova aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija u testu citotoksičnosti. Analize su izvedene uz ko-inkubaciju THP-1 ciljanih ćelija i T ćelija.

2

[0557] Kako bi se procenili citotoksični efekti novih CD123 antitela sa humanizovanim CD3 delovima, generisani su „hz20G6x7G3“, „7G3xhz4B4“, „hz4B4x3E3“ CODV-Fab koji sadrže različite kombinacije Fv. Takođe je generisana jedna varijanta koja sadrži Fc, gde je CODV-Fab „hz20G6x7G3-TL4“ Fc-označen na lakom lancu da bi formirao Fc heterodimere sa odgovarajućim teškim lancem (TL4 varijanta). Afiniteti prema CD3ε/δ-kompleksu i CD123 bispecifični konstrukti mereni su pomoću Biacore-a. Dalje, test citotoksičnosti je izveden kako je opisano iznad i izmerene su CD4+ aktivacija i CD8+ aktivacija.

Tabela 23: Afiniteti i aktivnosti bispecifičnih CD123 x CD3 CODV-molekula.

[0558] Takođe su procenjeni citotoksični efekti CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“, CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“, CODV-Fab-OL1 „hz20G6xhz7G3“ i jednolančanog Dart MGD006. Afiniteti CD3ε/δ-kompleksa i CD123 svakog bispecifičnog konstrukta izmereni su koristeći Biacore. Dalje, test citotoksičnosti je izveden kako je opisano iznad i izmerene su CD4+ aktivacija i CD8+ aktivacija.

2

Tabela 24: Afiniteti i aktivnosti bispecifičnih CD123 x CD3 CODV-molekula i DART

(MGD006)

[0559] Kako bi se procenio potencijal molekula da pokrenu aktivaciju T-ćelija u prisustvu (željeno) i odsustvu (neželjeno) ciljanih ćelija, primenjen je novi test. NFAT-RE-luc2 Jurkat ćelije (Promega #CS176403 ćelije) inkubirane su sa sveže izolovanim ljudskim T-ćelijama u ciljanom efektorskom odnosu od 1:1 na 37°C i 5% CO2 u RPMI 1640, sa 2 g/L (11 mM) Glukoza, sa GlutaMAX, sa 25 mM HEPES u 386-komoričnim pločama. Nakon 5 sati inkubacija je zaustavljena i merena je luminiscencija korišćenjem Bio-Glo sistema za ispitivanje luciferaze, Promega #G7940 u Luminescence HTS čitaču mikroploča.

Tabela 25: Aktivacija T-ćelija kao aktivacija indukovana od strane CD123 x CD3 CODV-molekula i MGD006 izmerena u Jurkat-NFAT-Luc-reporter ćelijskoj liniji.

2

[0560] Rezultati prikazani u Tabeli 25 pokazuju da sva antitela indukuju aktivaciju reporter ćelije sa EC50 vrednostima ispod nM u prisustvu ciljanih ćelija. Za pristupe angažovanja T-ćelija, aktiviranje T-ćelija treba da bude ograničeno na prisustvo ciljanih ćelija. To se vidi kod CODV molekula, jer nema značajnog signala luminiscencije u odsustvu ciljanih ćelija. Nasuprot tome, jednolančani DART molekul indukuje veću aktivaciju reporter ćelijske linije u odsustvu ciljanih ćelija. Ovi rezultati se slažu sa rezultatima dobijenim sa primarnim T-ćelijama.

3.8 In vivo antitumorska aktivnost CD123xCD3 bispecifičnog CODV-Fab-TL1 i CD123xCD3 bispecifičnog CODV-Fab

MATERIJALI I POSTUPCI

Izolacija ljudskog PBMC i T ćelija iz čitave krvi

[0561] PBMC su izolovani iz čitave krvi zdravih ljudskih donora Ficoll gradijent centrifugiranjem. Cela krv je razblažena 1:1 u sterilnom fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS). Zatim su dve zapremine od trideset i pet ml razblažene krvi stavljene u dve 50 ml Falcon epruvete u prisustvu 15 ml Ficoll-Paque. Epruvete su centrifugirane na 200 g tokom 40 minuta na sobnoj temperaturi bez kočnice. Izdvojena su dva puferisana sloja i stavljena u šest 50 ml Falcon epruveta sa 45 ml sterilnog PBS i tri puta centrifugirana (između svakog centrifugiranja supernatant je odbačen i dodato je 45 ml PBS) na 100 g tokom deset minuta na sobnoj temperaturi bez kočnice. Nakon poslednjeg centrifugiranja, dva peleta su stavljene zajedno u konačnu zapreminu od 50 ml, što je kompletirano sa PBS u 50 ml Falcon epruveti. Ukupan broj održivih PBMC definisan je Vicell prebrojavanjem. Pelet je zatim prikupljen u Automacs puferu za obradu od Miltenyi Biotech (130-091-221), i T ćelije su izolovane iz PBMC koristeći komplet za negativnu selekciju od Miltenyi Biotech (130-091-156) i Automacs prema uputstvima proizvođača. Prečišćene T ćelije su obnovljene i stavljene u kulturu u Xvivo-155% HIS peni-strepto1X medijum pri koncentraciji od 2,5 x10E 6 ćelija/ml.

Amplifikacija ljudskih T ćelija

[0562] Ljudska obogaćena populacija T ćelija aktivirana je i proširena in vitro tokom 14 dana korišćenjem kompleta za aktiviranje/proširenje T ćelija od Miltenyi Biotech (130-091-441)

2

Priprema ljudskih T ćelija za in vivo primenu

[0563] Ćelije i medijum ćelijske kulture centrifugirani su 10 minuta na 400 g. Pelet je izdvojen u koncentraciji od 2k10E+ 7 ćelija/ml u sterilnom PBS. Eliminisanje aktivirajućih zrna iz pojačanih T ćelija izvedeno je upotrebom MACsiMAG separatora iz Miltenyi Biotech (130-092-168) u skladu sa uputstvima proizvođača. Populacije obogaćenih T ćelija prebrojane su Vicell brojanjem i izvađene su u 25 ml sterilnog PBS u 50 ml Falcon epruveti. Nakon koraka centrifugiranja na 400 g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, ćelijsko pelet je izvađen u odgovarajućoj zapremini sterilnog PBS kako bi se dobila konačna koncentracija 5x10E+ 7 ćelija/ml.

Model tumora

[0564] Molm-13 ćelije ljudske akutne mijeloične leukemije koje eksprimiraju CD123 dobijene su od Leibniz-institut DSMZ-German kolekcije mikroorganizama i ćelijskih kultura (DSMZ Braunshweig, Nemačka). Ćelije su gajene u kulturi (37°C, 5% CO2, 95% vlažnost) u RPMI1640 Glutamax medijumu (upotpunjen fetalnim kravljim serumom 20%). Molm-13 ćelije zaražene su vektorom luciferaze (SV40-PGL4-Puro - tj. vektorom luciferaze koji se sastoji od promotera Simian virusa 40 povezan sa luciferazom 2 i sekvencama kasete rezistencije na Puromicin) kog nosi ne-replikativni lentivirusom.

[0565] Molm13-luc+ tumorske ćelije injektirane su intravenozno (IV) NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ NSG miševima (10E+6 ćelija po životinji u 200 µl PBS suspenzije).

Dvadeset i četiri sata kasnije, 10E+7 ljudskih T-ćelija je primenjeno intraperitonealno (IP) istim miševima pod zapreminom od 0,2 ml sterilnog PBS.

[0566] Snimanje osnovne bioluminiscencije trećeg dana nakon implantacije tumora izvedeno je korišćenjem IVIS100 snimača (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) sa Living Image 3.2 softverom za akviziciju (Perkin-Elmer, Waltham, M, USA). Životinjama su IP injektirane sa 120 mg/kg rastvorom kalijum luciferin soli od bube (serija 316019, Promega, Lion, Francuska) u PBS 15 minuta pre snimanja. Miševi su anestezirani koristeći ketamine®/Xylazine® (120 mg/kg; 6 mg/kg IM, 5 ml/kg) 5 minuta pre snimanja.

[0567] CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“, CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“, CD123xCD3 bispecifični DART konkurent (jednolančana antitela DART formata MGD006 ili bliski analog ovde nazvan „DART-alat“) ili PBS tretmani intravenskim putem (IV) ili neprekidnom

2

intraperitonealnom infuziju (CIP) započeli su četvrtog dana nakon implantacije tumora na utvrđenim tumorima koji se već mogu detektovati u kostima, kako je navedeno u tabeli 26 (CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“), tabeli 27 (CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ IV) i tabeli 28 (CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ CIP).

Tabela 26: Dizajn studije evaluacije intravenskog (IV) CD123xCD3 bispecifičnog CODV-Fab-TL1

Tabela 27: Dizajn studije evaluacije intravenskog (IV) CD123xCD3 bispecifičnog CODV-Fab

21

Tabela 28: Dizajn studije evaluacije neprekidne intraperitonealne infuzije (CIP)

CD123xCD3 bispecifičnog CODV-Fab

Prikupljanje podataka i kriterijumi efikasnosti

[0568] Telesna težina životinja praćena je od dana 3 do kraja testa kako bi se pratio uticaj terapije. Doza koja proizvodi 20% gubitka težine ili 15% gubitka težine tokom 3 uzastopna dana ili 10% ili više smrtnih slučajeva povezanih sa lekom, smatrala se preterano toksičnom dozom. Težine životinjskog tela uključuju težinu tumora.

[0569] Opterećenje tumora praćeno je neinvazivnim snimanjem bioluminiscencije (BLI). Početni BLI je izveden trećeg dana nakon implantacije tumora, 24 sata pre početka tretmana. Životinje su poslate u različite grupe na osnovu signala bioluminiscencije čitavog tela. Rast tumora praćen je merenjima BLI signala na čitavom telu i dugačkim kostima zadnjih nogu na dane 7, 10 i 14 nakon implantacije tumora. Signal dugačke kosti meren je segmentacijom i na njega bi mogao uticati obližnji loko-regionalni signal (npr. rezidualni signal u mekim tkivima u kasnijim vremenskim tačkama). Obrađene grupe su upoređene sa kontrolnim životinjama koje su nosile Molm13-luc+ diseminirani tumor i ljudske T ćelije.

[0570] Primarne krajnje tačke efikasnosti bile su odnos promena signalnog tumora u odnosu na osnovicu između tretirane i kontrolne grupe (dT/dC), broj delimičnih regresija tumora (PR) i broj potpune regresije tumora (CR).

[0571] Rast tumora zasnovan na krivama bioluminiscentnih signala (izražen u foton/sekunda) u vremenu praćen je za svaku životinju svake tretirane grupe i predstavljen je kao srednja kriva ± MAD, kako za sve segmentirane signale tela, tako i za kosti. Promene u signalu bioluminiscencije tumora izračunavaju se za svaku kontrolnu (C) ili tretiranu (T) životinju i za svaki dan oduzimanjem tumorskog signala na dan prvog tretmana (početni dan) od tumorskog signala određenog dana posmatranja. Medijana T izračunata je za tretiranu grupu, i medijana C je izračunata za kontrolnu grupu.

[0572] Tada se izračunava T/C odnos i izražava u procentima:

dT/dC = [(medijana T dan posmatranja – medijana T dan 3) / (medijana C dan posmatranja – medijana C dan 3)] x 100

[0573] Doza se smatra terapeutski aktivnom kada dT/dC na kraju eksperimenta (dan 14) iznosi manje od 42% i veoma aktivnom kada dT/dC iznosi manje od 10%.

[0574] Procenat regresije tumora definisan je kao % smanjenja tumorskog signala u tretiranoj grupi određenog dana posmatranja u poređenju sa signalom prvog dana tretmana. U određenom vremenskom trenutku i za svaku životinju, % regresije izračunava se kao:

[0575] S obzirom na rizik od varijabilnosti signala usled kinetike luciferina i mogućeg propusta ubrizgavanja IP, regresija signala za životinju smatra se pravom regresijom tumora samo kada se primeti u najmanje dve uzastopne vremenske tačke.

[0576] Delimična regresija (PR): Regresije su definisane kao delimične ako se signal tumora smanji ispod signala na početku tretmana u dve uzastopne vremenske tačke, od kojih jedna ostaje bolja od 50% početnog signala.

[0577] Kompletna regresija (CR): Regresije se definišu kao potpune ako se signal tumora smanji za više od 50% ispod signala na početku tretmana u dve uzastopne vremenske tačke.

Statistička analiza

Procena IV puta za primenu jedinjenja

[0578] Pojedinačni signal bioluminiscencije svake grupe tretmana poređen je sa drugim signalima korišćenjem Bonferroni-Holmovog prilagođavanja za višestruko upoređivanje parova prateći dvosmernu Anovu sa ponovljenim merenjima po danu: p> 0,05: NS, 0,05> p> 0,01: *, p <0,01:**. Statistička analiza se vrši kako za signale bioluminiscencije čitavog tela, tako i za signale bioluminiscencije dugačkih kostiju

Procena CIP puta za primenu jedinjenja

[0579] CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ evaluacija CIP puta rezultuje agregiranjem podataka dve nezavisne studije (prva studija o jedinjenjima u velikim dozama, druga studija za male doze, obe studije uključuju kontrolnu grupu za nosač i CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ 1,3 nmol/kg IV Qd pozitivnu kontrolnu grupu). Statistička analiza signala bioluminiscencije svakog miša svakog dana izvršena je nakon normalizacije podataka sa srednjom vrednosti signala bioluminiscencije grupe nosača istog dana istog eksperimenta (objedinjene kontrole nosača n=19; objedinjene pozitivne kontrole n=20). Pojedinačni normalizovani signal bioluminiscencije svake grupe tretmana upoređivan je sa ostalim grupama korišćenjem

21

Bonferroni-Holmovog prilagođavanja za višestruko upoređivanje parova, prateći dvosmernu Anovu sa ponovljenim merenjima po danu: p> 0,05: NS, 0,05> p> 0,01: *, p <0,01 : **. Statistička analiza se vrši kako za signale bioluminiscencije čitavog tela tako, i za signale bioluminiscencije dugačkih kostiju.

REZULTATI CD123xCD3 bispecifični CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ IV

[0580] Potpuno ljudski CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ IV Q3d u prisustvu ljudskih T ćelija inhibirao je rast Molm13 tumora u svim ispitivanim dozama (1,3, 0,13 i 0,013 nmol/kg Q3d) sa dT/dC od 20%, 14% i 38% u čitavom telu (Slike 5 i 7) i bio je povezan sa regresijom tumora u dugačkim kostima u svim ispitivanim dozama sa 4/7 CR, 6/8 CR i 2/6 CR (Slike 6 i 8).

[0581] Potpuno ljudski CODV-Fab-TL1 „hz20G6xhz7G3“ maksimalni odgovor dobijen je u čitavom telu i kostima pri 0,13 nmol/kg Q3d. U ovoj dozi, aktivnost se statistički nije razlikovala od DART 1,3 nmol/kg IV Qd (dT/dC čitavog tela 29% sa 1/7CR i 1/7PR u dugačkim kostima), i ekvivalentna je sa CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ 1,3 nmol/kg IV Qd (dT/dC čitavog tela 23% sa 1/8CR i 1/8PR regresijom tumora u dugačkim kostima). Podaci su potvrđeni terminalnom histopatološkom analizom (nije prikazano).

[0582] Razlike uočene između čitavog tela i dugačkih kostiju povezane su sa rezidualnim rastom tumora u jajnicima i trbušnoj masti uzastopno sa širenjem ekstra-medularnog tumora nakon IV injekcije.

CD123xCD3 bispecifični CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ IV

[0583] Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ IV u prisustvu ljudskih T ćelija inhibirao je rast tumora u svim testiranim dozama (1,3 i 0,13 nmol/kg Qd4-13) sa dT/dC od 14% odnosno 39% (Slike 9 i 11), povezan sa regresijom tumora na 1,3 nmol/kg u dugačkim kostima sa 5/8 CR (Slike 10 i 12).

[0584] DART 1,3 nmol/kg IV Qd4-13 je inhibirao rast tumora sa dT/dC 29% čitavog tela i regresiju 3/8 CR tumora u dugačkim kostima, što se nije značajno razlikovalo od CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ 1,3 nmol/Kg IV. DART je bio neaktivan u inhibiranju signala tumora čitavog tela pri 0,13 nmol/kg IV Qd4-13 (dT/dC 62%) uprkos regresiji tumora od 1/7PR u dugačkim kostima. Na kraju studije nije primećena značajna razlika kod iste doze potpuno ljudskog CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“. Nisu uočene statističke razlike između potpuno ljudskog CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ i delimično humanizovanog CODV-Fab hz20G6x7G3 jedinjenja kada se primenjuje u istoj dozi od 1,3 nmol/kg IV Qd4-13: u ovoj dozi CODV-Fab hz20G6x7G3 inhibira rast tumora čitavog tela sa dT/dC od 34% povezan sa regresijom tumora u dugačkim kostima (1/8CR i 1/8PR).

[0585] Razlike uočene između čitavog tela i dugačkih kostiju povezane su sa rezidualnim rastom tumora u jajnicima i trbušnoj masti uzastopno sa širenjem ekstra-medularnog tumora nakon IV injekcije.

CD123xCD3 bispecifični CODV-Fab CIP

[0586] Potpuno ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ CIP, u prisustvu ljudskih T ćelija, inhibirao je rast tumora čitavog tela pri 3,9, 1,3 i 0,13 nmol/kg/dan CIP4-14 i bio neaktivan pri 0,013 nmol/kg/dan sa odgovarajućim dT/dC od 2%, 3%, 21% i 57% u čitavom telu (Slike 13 i 15). Povezan je sa regresijom tumora pri 3,9, 1,3 i 0,13 nmol/kg u dugačkim kostima sa 5/9CR 3/9PR, 6/10CR 1/10PR i 7/8CR (Slike 14 i 16).

[0587] DART pri 3,9, 1,3 i 0,13 nmol/kg/dan CIP4-14, ali ne i 0,013 nmol/kg/dan, inhibirao je rast tumora čitavog tela sa dT/dC od 21%, 5%, 21% i 46% (slika 13) izazivanjem regresije tumora u dugačkim kostima pri 3,9, 1,3 i 0,13 nmol/kg sa 3/9 CR 3/9PR; 8/9CR; odnosno 4/8CR 2/8PR (slika 14).

[0588] Potpuni ljudski CODV-Fab „hz20G6xhz7G3“ pri 1,3 nmol/kg IV Qd4-13 inhibirao je rast tumora u čitavom telu sa dT/dC od 4% i 5% (odgovor prve i druge studije) povezan sa regresijom tumora na dugačkim kostima (8/10CR 1/10PR vs 8/10 CR u odgovoru prve i druge studije).

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

�

1

2

21

22

2

24

�

2

1

2

4

41

42

4

44

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

�

1

�

4

41

42

4

44

�

4

41

42

4

41

42

4

44

4

�

4

44

4

41

42

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Vezujući protein sličan antitelu koji se vezuje za CD3 i za barem jedan dalji ciljani antigen koji je CD123, koji obuhvata dva polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde prvi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i drugi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [II]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

gde su VD1i VD2oba bilo varijabilni domeni lakih lanaca, ili varijabilni domeni teških lanaca, i VD3i VD4su i jedan i drugi varijabilni domeni teških lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni lakih lanaca, ili su VD3i VD4i jedan i drugi varijabilni domeni lakih lanaca ako su VD1i VD2varijabilni domeni teških lanaca;

gde je navedeni prvi ili drugi imunoglobulin anti-CD3 antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 142, CDR2-L od sekvence „KVS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 11; i

gde je drugi od navedenog prvog ili drugog imunoglobulina anti-CD123 antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379.

4 4

2. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid formule [II] dalje obuhvata Fcdomen.

3. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji obuhvata dva polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

i jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule I i polipeptid formule III formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

4. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 2 ili 3, gde polipeptid formule [I] dalje obuhvata Fcdomen (Fc2).

5. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 2 do 4, koji obuhvata dva polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [IV]:

4

VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]

i jedan polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

gde:

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, L4i L5su aminokiselinski veznici;

gde polipeptid formule [IV] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

6. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 2 ili 3, koje obuhvata treći polipeptidni lanac koji obuhvata Fcdomen (Fc3).

7. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 2, 3, ili 6, koji obuhvata tri polipeptidna lanca koji formiraju dva mesta vezivanja antigena, gde prvi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL[I]

drugi polipeptid ima strukturu predstavljenu formulom [III]:

VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]

4

treći polipeptid, gde je Fc3zglobni region imunoglobulina i CH2, CH3su konstantni domeni teškog lanca imunoglobulina;

gde

VD1je varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;

VD2je varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;

VD4je varijabilni domen teškog ili lakog lanca navedenog prvog imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je CH1, je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina;

L1, L2, L3, i L4su aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule [I] i polipeptid formule [III] formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca; i

gde polipeptid formule [III] heterodimerizuje sa trećim polipeptidom kroz njegov Fcdomen.

8. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 7, gde su VD1i VD2varijabilni domeni lakog lanca i VD3i VD4su varijabilni domeni teškog lanca.

9. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 8, gde VD1obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379;

VD2obuhvata CDR4-L od sekvence SEQ ID NO: 142, CDR5-L od sekvence „KVS“, i CDR6-L od sekvence SEQ ID NO: 11;

VD3obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 8; i

VD4obuhvata CDR4-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR5-H od sekvence SEQ ID NO: 384, i CDR6-H od sekvence SEQ ID NO: 382.

10. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 9, gde vezujući protein sličan antitelu obuhvata VD1koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 385 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, VD2koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 141 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, VD3koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 138 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom, i VD4koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 383 ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa njom.

11. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 10, koje obuhvata veznik L1od sekvence SEQ ID NO: 389, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, L3i L4koji se sastoje od od 0 aminokiselina, i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313.

12. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 11, koji dalje obuhvata veznik L5koji se sastoji od 0 aminokiselina, Fc od sekvence SEQ ID NO: 394, ili Fc2od sekvence SEQ ID NO: 392.

13. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1, 2, 4, ili 6 do 12, koje obuhvata:

a) jedan polipeptid prema formuli [I] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 388 koje obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, i CLod sekvence SEQ ID NO: 310, ili

sekvence koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 388 koje obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379, CDR4-L od sekvenci SEQ ID NO: 142, CDR5-L od sekvence „KVS“, i CDR6-L od sekvence SEQ ID NO: 11; i

b) jedan polipeptid prema formuli [II] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 390 koje obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina, i CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 390 koje obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382, i CDR4-H od sekvence SEQ ID NO: 6, CDR5-H od sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR6-H od sekvence SEQ ID NO: 8;

14. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 13, koje obuhvata jedan polipeptid prema formuli [I] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 388 i jedan polipeptid prema formuli [II] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:

4

15. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 5, koje obuhvata: a) jedan polipeptid prema formuli [IV] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 391 koje obuhvata VD1od sekvence SEQ ID NO: 385, L1od sekvence SEQ ID NO: 389, VD2od sekvence SEQ ID NO: 141, L2od sekvence SEQ ID NO: 389, CLod sekvence SEQ ID NO: 310, L5koji sadrži 0 aminokiselina, i Fc2od sekvence SEQ ID NO: 392, ili sekvence koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 391 koje obuhvata CDR1-L od sekvence SEQ ID NO: 378, CDR2-L od sekvence „WAS“, CDR3-L od sekvence SEQ ID NO: 379, CDR4-L od sekvence SEQ ID NO: 142, CDR5-L od sekvence „KVS“, i CDR6-L od sekvence SEQ ID NO: 11; i

b) jedan polipeptid prema formuli [III] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 393 koje obuhvata VD3od sekvence SEQ ID NO: 138, L3je 0 aminokiselina, VD4od sekvence SEQ ID NO: 383, L4je 0 aminokiselina, CH1od sekvence SEQ ID NO: 313, i Fcod sekvence SEQ ID NO: 394, ili

sekvence koja je najmanje 85% identična sa SEQ ID NO: 393 koje obuhvata CDR1-H od sekvence SEQ ID NO: 381, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO: 384, CDR3-H od sekvence SEQ ID NO: 382, CDR4-H od sekvenci SEQ ID NO: 6, CDR5-H od sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR6-H od sekvence SEQ ID NO: 8;

16. Vezujući protein sličan antitelu prema patentnom zahtevu 15, koje obuhvata jedan polipeptid prema formuli [IV] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 391 i jedan polipeptid prema formuli [III] koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 393.

17. Vezujući protein sličan antitelu koje obuhvata jedan polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:391 i jedan polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:393, gde polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:391 i polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:393 formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

18. Farmaceutski sastav koji obuhvata vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom

4

patentnom zahtevu od 1 do 17, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 17, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 18 za primenu kao lek.

20. Vezujući protein sličan antitelu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 17, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 18, za primenu u tretmanu raka.

21. Vezujući protein sličan antitelu ili farmaceutski sastav za primenu prema patentnom zahtevu 20, gde je rak hematološki rak.

4