[go: up one dir, main page]

RS64771B1 - Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini - Google Patents

Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini

Info

Publication number
RS64771B1
RS64771B1 RS20230996A RSP20230996A RS64771B1 RS 64771 B1 RS64771 B1 RS 64771B1 RS 20230996 A RS20230996 A RS 20230996A RS P20230996 A RSP20230996 A RS P20230996A RS 64771 B1 RS64771 B1 RS 64771B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
cdr
binding protein
Prior art date
Application number
RS20230996A
Other languages
English (en)
Inventor
Zhi-Yong Yang
Gary J Nabel
Lan Wu
Edward Seung
Ronnie Wei
Jochen Beninga
Ercole Rao
Wulf Dirk Leuschner
Christian Beil
Christian Lange
Carsten Corvey
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Priority claimed from EP17732263.3A external-priority patent/EP3443006B1/en
Publication of RS64771B1 publication Critical patent/RS64771B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovo otkriće se odnosi na trispecifične i/ili trovalentne vezujuće proteine koji sadrže četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više ciljnih proteina, pri čemu prvi par polipeptida koji formira vezujući protein poseduje dvostruke varijabilne domene koji imaju unakrsnu orijentaciju i pri čemu drugi par polipeptida koji formira vezujući protein poseduje jedan varijabilni domen. Ovo otkriće se takođe odnosi na vektore ekspresije i izolovane ćelije domaćina za stvaranje trispecifičnih i/ili trovalentnih vezujućih proteina i takvih vezujućih proteina za primenu u prevenciji i/ili lečenju karcinoma ili inflamatorne bolesti ili poremećaja.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Bioterapeutici zasnovani na monoklonskim antitelima predstavljaju značajan novi put za razvoj inovativnih lekova. Tehnologija monoklonskih antitela nudi specifično targetiranje, precizno prenošenje signala i/ili materijala određenoj populaciji ćelija i obezbeđuje dugotrajan biološki efekat zahvaljujući svojim Fc funkcijama. Napori koji se preduzimaju u inženjeringu antitela omogućili su razvoj bispecifičnih antitela u kojima se kombinuju specifične karakteristike dva monoklonska antitela za različite biološke primene, proširujući tako obim razvoja lekova zasnovanih na antitelima. Novootkrivena neutralizirajuća antitela sa poboljšanom širinom i potencijom pružaju više opcija za razvoj bioterapeutika za lečenje kompleksnih oboljenja kao što su karcinoma, artritis i/ili inflamatorni poremećaji. WO 2014/116846 se odnosi na multispecifične vezujuće proteine i metode za primenu ovih multispecifičnih vezujućih proteina u modulaciji aktivacije imunih ćelija.
KRATAK REZIME
[0003] Ovde su navedeni multispecifični vezujući proteini (npr. antitela), koji formiraju tri mesta vezivanja antigena. Ovi vezujući proteini mogu specifično da vežu jedan, dva ili tri ciljna antigena ili ciljna proteina.
[0004] U jednom otelotvorenju, ovo otkriće navodi vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0005] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljana antitela. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je trovalentan, ali bispecifičan, i sposoban da specifično veže tri ciljna antigena od kojih su dva identična. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema ovom otkriću je trovalentan, ali monospecifičan, i sposoban da specifično veže tri ciljna antigena, pri čemu su svi identični. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkciju jednog ili više ciljnih proteina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljana antitela.
[0006] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži jedan, dva ili tri antigen vezujuća mesta koja specifično vezuju ciljni protein izabran između A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (takođe poznat kao VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (takođe poznat kao MCP-1), CCL3 (takođe poznat kao MIP-1a), CCL4 (takođe poznat kao MIP-1b), CCL5 (takođe poznat kao RANTES), CCL7 (takođe poznat kao MCP-3), CCL8 (takođe poznat kao mcp-2), CCL11 (takođe poznat kao eotaksin), CCL15 (takođe poznat kao MIP-1d), CCL17 (takođe poznat kao TARC), CCL19 (takođe poznat kao MIP-3b), CCL20 (takođe poznat kaoMIP-3a), CCL21 (takođe poznat kao MIP-2), CCL24 (takođe poznat kao MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (takođe poznat kao TECK), CCL26 (takođe poznat kao eotaksin-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (takođe poznat kao FCER2, receptor za IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (takođe poznat kao B7-1), CD86 (takođe poznat kao B7-2), CD122, CD137 (takođe poznat kao 41BB), CD137L, CD152 (takođe poznat kao CTLA4), CD154 (takođe poznat kao CD40L), CD160, CD272, CD273 (takođe poznat kao PDL2), CD274 (takođe poznat kao PDL1), CD275 (takođe poznat kao B7H2), CD276 (takođe poznat kao B7H3), CD278 (takođe poznat kao ICOS), CD279 (takođe poznat kao PD-1), CDH1 (takođe poznat kao E-kadherin), hitinaza, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (takođe poznat kao M-CSF), CSF-2 (takođe poznat kao GM-CSF), CSF-3 (takođe poznat kao GCSF), CX3CL1 (takođe poznat kao SCYD1), CXCL12 (takođe poznat kao SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1,ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (takođe poznat kao receptor za IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (takođe poznat kao b4 integrin), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptin, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaza-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (takođe poznat kao receptor za IL33), STEAP2, Syk kinaza, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (takođe poznat kao ko-receptor za IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1 (takođe poznat kao GPR5/CCXCR1). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više od gore navedenih ciljnih antigena su ciljni humani antigeni. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića je trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljna antigena izabrana sa gornje liste. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića je trovalentan, ali bispecifičan, i sposoban da specifično veže tri ciljna antigena izabrana sa gornje liste od kojih su dva identična. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića je trovalentan, ali monospecifičan, i sposoban da specifično veže tri ciljna antigena izabrana sa gornje liste, pri čemu su svi identični. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein specifično vezuje tri ciljna proteina koji korespondiraju dvama ciljnih proteina na T ćelijama i jednom ciljnom proteinu tumora. U nekim otelotvorenjima, jedan od navedenih ciljnih proteina na T ćelijama je CD3. U nekim otelotvorenjima, jedan od navedenih ciljnih proteina na T ćelijama je CD28. U nekim otelotvorenjima, navedeni ciljni protein tumora je CD38. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein specifično vezuje tri ciljna proteina koji korespondiraju dvama ciljnih proteina na T ćelijama i jednom ciljnom proteinu izabranom iz grupe koja se sastoji od A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, hitinaze, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaze-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptora trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk kinaze, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1.
[0007] U drugom otelotvorenju, ovo otkriće navodi vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
(a) VL1, VL2i VL3su svaki nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kao što je definisano u bilo kom od SEQ ID NO: 2, 4, 10, 14, 18, 22, 115;
(b) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125;
(c) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 i 167.
(d) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140 ili 149; ili
(e) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
pri čemu:
(a) VH1, VH2i VH3su svaki nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kao što je definisano u bilo kom od SEQ ID NO: 1, 3, 9, 13, 17, 21, 114;
(b) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122;
(c) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164 i 166;
(d) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122 i 126-128; ili
(e) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
[0008] U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, i 167; i VH1, VH2, i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, i 166. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140 i 149; i (d) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122, i 126-128.
[0009] U nekim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih vezujućih proteina, (a) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; (b) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; (c) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; (d) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; (e) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; (f) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; (g) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:126, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:128; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:138, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:140; (h) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:126, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:128; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:138, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:140; (i) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:121 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:122; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:123, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:124 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:125; ili (j) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:121 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:122; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:123, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:124 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:125. U nekim otelotvorenjima, (a) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45.
[0010] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži jedano mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje površinski protein T ćelija i drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni antigen, npr. ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za CD3, mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1. U nekim otelotvorenjima, VH1i VL1formiraju prvo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD3, VH2i VL2formiraju drugo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD28, a VH3i VL3formiraju treće vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, VH1i VL1formiraju prvo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD28, VH2i VL2formiraju drugo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD3, a VH3i VL3formiraju treće vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena specifično vezuje humani ciljni protein tumora izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; ili (b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u Tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161; ili (b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u Tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuju ciljni protein tumora sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; (c) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165; (d) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151; ili (e) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži šest CDR-a, ili varijabilni domen teškog lanca i lakog lanca, anti-Her2, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD38 ili anti-LAMP1 vezujući domen prikazan u Tabelama 2-5.
[0011] U drugom otelotvorenju, ovo otkriće navodi vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
(a) VL1, VL2i VL3su svaki nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kao što je definisano u bilo kom od SEQ ID NO: 61, 63, 69, 71, 74, 76, 82, 86, 88, 94;
(b) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena najmanje jedne aminokiselinske sekvence navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 61, 63, 69, 71, 74, 76, 82, 86, 88, 94;
(c) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 169, 171 i 173;
(d) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 141-147, 178 i 179; ili
(e) VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
pri čemu:
(a) VH1, VH2i VH3su svaki nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kao što je definisano u bilo kom od SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81, 85, 87, 93;
(b) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca varijabilnog domena najmanje jedne aminokiselinske sekvence navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81, 85, 87, 93;
(c) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 168, 170 i 172;
(d) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 129-137;
(e) VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
[0012] U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 169, 171, i 173; i VH1, VH2, i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 168, 170, i 172. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 141-147, 178-179; i VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 129-137.
[0013] U nekim otelotvorenjima bilo kog od vezujućih proteina koji su ovde opisani, (a) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; (b) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; (c) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; (d) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; (e) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; (f) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:131; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; (g) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; (h) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; (i) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; ili (j) VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; a VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144. U nekim otelotvorenjima, jedno ili više VH1, VL1, VH2, VL2, VH3i VL3sadrže jednu, dve ili tri CDR sekvence antitela prikazane u Tabelama 2-5.
[0014] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži tri mesta vezivanja antigena, gde jedno, dva ili tri mesta vezivanja antigena specifično vezuju ciljni protein citokina izabran iz grupe koju čine IL-4, IL-13 i TNFa. U nekim otelotvorenjima, (a) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa, VH2i VL2formiraju mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13, a VH3i VL3formiraju mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4; (b) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa, VH2i VL2formiraju drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4, a VH3i VL3formiraju treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13; (c) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4, VH2i VL2formiraju drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa, a VH3i VL3formiraju treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13; (d) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4, VH2i VL2formiraju drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13, a VH3i VL3formiraju treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa; (e) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13, VH2i VL2formiraju drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4, a VH3i VL3formiraju treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa; ili (f) VH1i VL1formiraju prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13, VH2i VL2formiraju drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa, a VH3i VL3formiraju treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani TNFa obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:168 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:169. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL4 obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:170 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:171. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani IL13 obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173.
[0015] U nekim otelotvorenjima bilo kog od vezujućih proteina opisanih ovde, drugi i/ili treći polipeptidni lanac dalje sadrže Fc region povezan sa CH1, pri čemu Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedno L1, L2, L3ili L4nezavisno ima dužinu od 0 amino kiselina. U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3ili L4svako nezavisno ima najmanje jednu amino kiselinu u dužini. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljana antitela. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljana antitela. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkciju jednog ili više ciljnih proteina.
[0016] U nekim otelotvorenjima bilo kog od ovde opisanih vezujućih proteina, najmanje jedno L1, L2, L3ili L4nezavisno ima dužinu od 0 amino kiselina. U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3ili L4svako nezavisno ima najmanje jednu amino kiselinu u dužini. U nekim otelotvorenjima, jedan, dva, tri ili sva četiri L1, L2, L3i L4imaju između 0 i 15 amino kiselina u dužini. U nekim otelotvorenjima, najmanje dva L1, L2, L3i L4imaju između 1 i 15 amino kiselina u dužini. U nekim otelotvorenjima (a) L1, L2, L3i L4svako nezavisno ima nula aminokiselina u dužini ili sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148); ili (b) L1, L2, L3i L4svako nezavisno sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L2sadrži sekvencu TKGPS (SEQ ID NO:106), L3sadrži sekvencu S, a L4sadrži sekvencu RT; L1sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L2sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L3ima 0 amino kiselina u dužini, a L4ima 0 amino kiselina u dužini; L1sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L2sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L3ima 0 amino kiselina u dužini, a L4ima 0 amino kiselina u dužini; ili L1sadrži sekvencu GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), L2ima 0 amino kiselina u dužini, L3sadrži sekvencu GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), a L4ima 0 amino kiselina u dužini.
[0017] U nekim otelotvorenjima bilo kog od vezujućih proteina opisanih ovde, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu prvi i/ili drugi Fc regioni sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V. U nekim otelotvorenjima, CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W. U nekim otelotvorenjima, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca oba obuhvataju supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; i pri samo jedan, prvi ili drugi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F. U nekim otelotvorenjima, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG1 CH3domeni, pri čemu samo jedan od CH3domena obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i/ili drugi Fc regioni humani IgG4 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 228 i 409 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S228P i R409K. U nekim otelotvorenjima, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG4 CH3domeni i pri čemu CH3domeni svaki obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 228 i 409 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S228P i R409K. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i/ili drugi Fc regioni humani IgG4 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije F234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG4 CH3domeni i pri čemu CH3domeni svaki obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije F234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i/ili drugi Fc regioni humani IgG1 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG1 CH3domeni i pri čemu CH3domeni svaki obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG1 Fc regioni. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni.
[0018] U nekim otelotvorenjima ovde opisanih vezujućih proteina, CLdomen prvog polipeptidnog lanca je humani kapa CLdomen, a CLdomen četvrtog polipeptidnog lanca je humani lambda CLdomen; ili je CLdomen prvog polipeptidnog lanca humani lambda CLdomen, a CLdomen četvrtog polipeptidnog lanca je humani kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354, 366, 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C, T366W, H435R i Y436F; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen. U nekim otelotvorenjima, drugi i/ili treći polipeptidni lanac sadrže Fc region humanog IgG1 ili IgG4.
[0019] U drugom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje vezujući protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac, drugi polipeptidni lanac, treći polipeptidni lanac i četvrti polipeptidni lanac pri čemu:
(a) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 2;
(b) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 2;
(c) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 13; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 14;
(d) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 13; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 14;
(e) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 17; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 18
(f) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 17; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 18;
(g) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 21; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 22;
(h) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 21; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 22;
(i) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 61;
(j) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 61;
(k) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 71;
(l) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 76; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 75; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74;
(m) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 82; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:81; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74;
(n) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:88; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 87; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86;
(o) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 94; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 93; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86;
(p) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74;
(q) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86;
(r) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74;
(s) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86;
(t) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 114; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 115; ili
(u) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 114; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 115.
[0020] U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vezujući protein ili njegov polipeptid u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa jednim od gore navedenih otelotvorenja. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, izolovana ćelija domaćin je ćelija sisara ili ćelija insekta. U jednom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje sistem vektora koji se sastoji od jednog ili više vektora koji kodiraju prvi, drugi, treći ili četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, drugi vektor koji kodira drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, treći vektor koji kodira treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i četvrti vektor koji kodira četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina i drugi vektor koji kodira treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više vektora su ekspresioni vektori. U jednom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži vektorski sistem prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja. U jednom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje metodu proizvodnje vezujućeg proteina, pri čemu se metoda sastoji od: a) kultivacije ćelije domaćina u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja pod uslovima u kojima ćelija domaćin eksprimira vezujući protein; i b) izolacije vezujućeg proteina iz ćelije domaćina. U jednom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži vezujući protein u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0021] U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje najmanje jedan vezujući protein ili farmaceutski sastav u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za primenu u metodi prevencije i/ili lečenja karcinoma kod pacijenta. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein ili farmaceutski sastav u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za primenu u prevenciji i/ili lečenju karcinoma kod pacijenta. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za proizvodnju medikamenta za prevenciju i/ili lečenje karcinoma kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži jedno mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje površinski protein T ćelije i drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za CD3, mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje zajedno sa hemoterapijskim agensom. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkcionisanje jednog ili više ciljnih proteina izabranih iz grupe koja se sastoji od A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, hitinaze, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaze-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptora trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk kinaze, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1.
[0022] U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje najmanje jedan vezujući protein ili farmaceutski sastav u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za primenu u metodi prevencije i/ili lečenja inflamatorne bolesti ili poremećaja kod pacijenta. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein ili farmaceutski sastav u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za primenu u metodi prevencije i/ili lečenja inflamatorne bolesti ili poremećaja kod pacijenta. U drugom otelotvorenju, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein u skladu sa bilo kojim od gore navedenih otelotvorenja za proizvodnju medikamenta za prevenciju i/ili lečenje inflamatorne bolesti ili poremećaja kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži tri mesta vezivanja antigena od kojih svako specifično vezuje ciljni protein citokina izabran iz grupe koju čine IL-4, IL-13 i TNFa. U nekim otelotvorenjima, dva ili tri vezujuća mesta specifično vezuju ciljni protein citokina izabran iz grupe koju čine IL-4, IL-13 i TNFa. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje zajedno sa antiinflamatornim agensom. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkcionisanje jednog ili više ciljnih proteina izabranih iz grupe koja se sastoji od A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, hitinaze, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaze-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptora trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk kinaze, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1.
[0023] Ova i druga otelotvorenja pronalaska su dalje opisana u detaljnom opisu koji sledi.
KRATAK OPIS SLIKA
[0024]
SL. 1A-1C prikazuju šematski prikazi trispecifičnih vezujućih proteina koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju tri ciljna proteina, pri čemu prvi par polipeptida poseduje dvostruke varijabilne domene koji imaju unakrsnu orijentaciju (VH1-VH2 i VL2-VL1) formirajući dva mesta vezivanja antigena, i pri čemu drugi par polipeptida poseduje jedan varijabilni domen (VH3 i VL3) koji formira jedno mesto vezivanja antigena. SL.1A prikazuje trispecifični vezujući protein koji sadrži mutaciju „ispupčenja u udubljenja“, gde se ispupčenje nalazi na drugom paru polipeptida sa jednim varijabilnim domenom. SL.
1B prikazuje trispecifični vezujući protein koji sadrži mutaciju „ispupčenja u udubljenja“, gde se ispupčenje nalazi na prvom paru polipeptida koji imaju unakrsnu orijentaciju. SL. 1C prikazuje orijentaciju varijabilnih domena na polipeptidnim lancima, i orijentaciju ispupčenja/udubljenja za vezujuće proteine prikazane u Tabelama 1-3. „Teški lanac A“ (npr. treći polipeptidni lanac iz ovog otkrića) ukazuje na varijabilni domen teškog lanca A. „Laki lanac A“ (npr. četvrti polipeptidni lanac iz ovog otkrića) ukazuje na varijabilni domen lakog lanca A. „Teški lanac B“ (npr. drugi polipeptidni lanac iz ovog otkrića) ukazuje na varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 teškog lanca B. „Laki lanac B“ (npr. prvi polipeptidni lanac iz ovog otkrića) ukazuje na varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 lakog lanca B.
SL. 2 prikazuje rezultate ELISA testa koji određuje vezivanje anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (Vezujući protein 1) ili kontrolnog antitela izotipa, za humani CD3, CD28 i Her2. Vezana antitela su otkrivena korišćenjem sekundarnog antitela anti-Fab konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP).
SL. 3A-3C prikazuju rezultate specifičnog ubijanja Her2<+>ćelija karcinoma dojke posredovanog antitelima korišćenjem anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (koje se ovde pominje kao „vezujući protein 1”), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-Her2 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1), koristeći humane PBMC u razmeri E:T=10. SL.3A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija ZR-75-1 posredovanog trispecifičnim antitelom.
SL. 3B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija AU565 posredovanog trispecifičnim antitelom. SL.3C prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija na površini ćelije naznačenih markera na ćelijama ZR-75-1 i AU565.
SL. 4 i 5 prikazuju rezultate specifičnog ubijanja Her2<+>ćelija karcinoma posredovanog antitelom korišćenjem anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 1), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-Her2 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1). SL.4 prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija ZR-75-1 posredovanog antitelom korišćenjem mononuklearnih ćelija humane periferne krvi (PBMC) donora KP45926 na E:T=10. SL.5 prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija AU565 posredovanog antitelom korišćenjem humanih PBMC od donora KP45944 na E:T=10. SL.4 i 5 potvrđuju slične rezultate ubijanja ćelija kao što je prikazano na SL.3A-3C korišćenjem PBMC od drugog donora.
SL. 6A i 6B prikazuju aktivaciju (CD69<+>) i proliferaciju humanih T ćelija tretiranih anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnim vezujućim proteinom (HER2/CD28supxCD3mid; koji se ovde naziva „vezujući protein 1“), anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnim vezujućim proteinom bez anti-CD28 vezujućeg domena (HER2/ΔCD28supxCD3mid), anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnim vezujućim proteinom bez anti-CD3 vezujućeg domena (HER2/CD28supxΔCD3mid), anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnim vezujućim proteinom bez anti-CD28 i anti-CD3 vezujućih domena (HER2/Δ(CD28supxΔCD3mid)), kontrolnim anti-CD3 monoklonskim antitelom ili kontrolnim IgG4 antitelom. SL.6A prikazuje aktivaciju (CD69<+>) humanih CD4<+>T ćelija od tri donora. SL.6B prikazuje aktivaciju (CD69<+>) humanih CD8<+>T ćelija od tri donora. CD28sup: anti-CD28 superagonističko antitelo. CD3mid: anti-CD3 antitelo.
SL. 7A-C prikazuje IL-2, NFκB i nuklearni faktor aktivacije puta aktiviranih T-ćelija (NFAT) putem anti-CD3 i anti-CD28 signalizacije, što je mereno testom luciferaze korišćenjem humanih Jurkat T ćelija sa konstruktom IL-2 promoter-luciferaza (SL.
7A), konstruktom NFκB promoter-luciferaza (SL. 7B) ili konstruktom NFAT promoter-luciferaza (SL. 7C). Ispitana antitela su ona koja su opisana gore u opisu SL. 6A-6D.
SL. 8 prikazuje rezultate ELISA testa koji određuje vezivanje anti-CD19 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (koje se ovde pominje kao „vezujući protein 3”), ili kontrolnog antitela izotipa, za CD3, CD28 i CD19. Vezana antitela su otkrivena korišćenjem sekundarnog antitela anti-Fab konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP).
SL. 9A-9N prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD19<+>humanih GCB ćelija limfoma posredovanog antitelom korišćenjem anti-CD19 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (koje se ovde pominje kao „vezujući protein 3”), ili naznačene kontrole, koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL. 9A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OCI-LY19 posredovanog antitelima. SL.9B prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija na površini ćelije naznačenih markera na ćelijama OCI-L Y19. SL. 9C prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OCI-LY19 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48572 na E:T=10. SL. 9D prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OCI-LY19 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48573 na E:T=10.
SL. 9E prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija humanog limfoma KARPASS-422 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48572 pri E:T=10. SL. 9F prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija KARPASS-422 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48573 na E:T=10. SL. 9G prikazuje rezultate specifičnog ubijanja MeC1 ćelija humane hronične B ćelijske leukemije posredovanog antitelom korišćenjem PBMC od donora KP48572 na E:T=10. SL.9H prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija humanog multiplog mijeloma RPMI8226 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48775 pri E:T=10. SL.9I prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija humanog Burkitovog limfoma Raji posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48572 pri E:T=10. SL.9J prikazuje rezultate specifičnog ubijanja HBL1 ćelija humanog difuznog B-ćelijskog limfoma posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48775 na E:T=10. SL. 9K prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija krupnoćelijskog limfoma SUDHL8 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48572 na E:T=10. SL. 9L prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija SUDHL8 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48573 na E:T=10. SL.9M prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija humanog B-ćelijskog limfoma ARH77 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48775 na E:T=10. SL.9N prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OCI-Ly3 posredovanog antitelima korišćenjem PBMC od donora KP48775 na E:T=10.
SL. 10 prikazuje rezultate ELISA testa koji određuje vezivanje anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), ili kontrolnog antitela izotipa, za CD3, CD28 i CD38. Vezana antitela su otkrivena korišćenjem sekundarnog antitela anti-Fab konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP).
SL. 11A-11D prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma humanog multiplog mijeloma posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1). SL.11A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja MOLP-8 ćelija posredovanog antitelima koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL.11B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja RPMI-8226 ćelija posredovanog antitelima koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10.
SL. 11C prikazuje rezultate specifičnog ubijanja KMS-12-BM ćelija posredovanog antitelima koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL.11D prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija naznačenih markera na površini ćelije na ćelijama MOLP-8, RPMI-8226 i KMS-12-BM.
SL. 12A-12D prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma humanog multiplog mijeloma posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1), koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL. 12A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija NCI-H929 posredovanog antitelima. SL. 12B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija MM.1S posredovanog antitelima. SL.12C prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija MM.1R posredovanog antitelima. SL.12D prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija naznačenih markera na površini ćelije na ćelijama NCI-H929, MM.1S i MM.1R.
SL. 13A-13D prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma humanog multiplog mijeloma posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1), koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL. 13A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OPM-2 posredovanog antitelima. SL. 13B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija KMS-26 posredovanog antitelima. SL.13C prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija U266 posredovanog antitelima. SL.13D prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija naznačenih markera na površini ćelije na ćelijama OPM-2, KMS-26 i U226.
SL. 14A-14C prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma humanog limfoma posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1), koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL. 14A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija SUDHL-8 posredovanog antitelima. SL. 14B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija OCI-LY19 posredovanog antitelima. SL.14C prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija na površini ćelije naznačenih markera na ćelijama SUDHL-8 i OCI-LY19.
SL. 15A-15D prikazuju rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma ALL posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnog antitela (humani-IgG1), koristeći humane PBMC kao efektorske ćelije na E:T=10. SL. 15A prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija KOPN-8 posredovanog antitelima. SL.15B prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija HAL-1 posredovanog antitelima. SL. 15C prikazuje rezultate specifičnog ubijanja ćelija CCRF-SB posredovanog antitelima. SL.
15D prikazuje rezultate FACS analize kojom se utvrđuje ekspresija naznačenih markera na površini ćelije na ćelijama KOPN-8, HAL-1 i CCRF-SB.
SL. 16 prikazuje rezultate specifičnog ubijanja CD38<+>ćelija karcinoma mijeloma posredovanog antitelima korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnih antitela (koja se ovde spominju kao „vezujući protein 5” i „vezujući protein 6”, u zavisnosti od korišćenog specifičnog domena koji vezuje anti-CD28), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnih antitela (huCD28 × CD3), anti-CD38 IgG1 antitela, kontrolnih anti-CD38 IgG1 antitela ili kontrolnih antitela (humani-IgG1), koristeći PBMC od donora PK45926 na E:T=10.
SL. 17A i 17B prikazuju IL-2, NFkB i nuklearni faktor aktivacije putanje aktiviranih T-ćelija (NFAT) putem anti-CD3 i anti-CD28 signalizacije, što je mereno testom luciferaze korišćenjem humanih Jurkat T ćelija sa konstruktom IL-2 promoterluciferaza (SL.17A) ili konstruktom NFAT promoter-luciferaza (SL.17B). Testirana antitela su bila anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifična IgG4 antitela (vezujući protein 5, označena kao „Tri-At”), anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifična IgG4 antitela bez CD28 vezujućeg domena (označena kao „Tri” At (ΔCD28)), anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifična IgG4 antitela bez CD3 vezujućeg domena (označena kao „Tri-At (ΔCD3)) i anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifična IgG4 antitela bez CD3 i CD28 vezujućih domena (označena kao „Tri-At (ΔCD28x DCD3)). Luciferazni testovi su izvedeni u duplikatu za svako od naznačenih Tri-At.
SL. 18A-18E pokazuju rezultate studije toksičnosti povećanja doze koristeći anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifično antitelo (koje se ovde spominje kao „vezujući protein 1”) kod neljudskih primata (sa povećanjem doze od 0,1, 0,5, 2,5, 5, 10, do 100 µg/kg; životinje označene kao „409“ i „410“). SL. 18A prikazuje rezultate procenta cirkulišućih CD4<+>T ćelija kod svake životinje, 6 sati nakon primene anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela. SL.18B prikazuje rezultate procenta cirkulišućih CD8<+>T ćelija kod svake životinje, 6 sati nakon primene anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela. SL.18C prikazuje rezultate aktivacije (CD69<+>) cirkulišućih CD4<+>T ćelija 6 sati nakon doziranja. SL.18D prikazuje rezultate aktivacije (CD69<+>) cirkulišućih CD8<+>T ćelija 6 sati nakon doziranja. SL.18E pokazuje oslobađanje inflamatornog citokina uočeno 6 sati nakon primene anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela pri svakom doziranju.
SL. 19A-B prikazuju in vivo anti-tumorsku aktivnost anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (koje se ovde spominje kao „vezujući protein 1”) u humanizovanom modelu NSG miša sa ćelijama krvi pupčane vrpce CD34<+>implantiranom sa BT474 ćelijama. SL. 19A prikazuje promenu u telesnoj težini miševa tretiranih naznačenim koncentracijama anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole. SL. 19B pokazuje promenu u zapremini tumora kod miševa tretiranih naznačenim koncentracijama anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole.
SL. 20A-20H prikazuju in vivo anti-tumorsku aktivnost anti-Her2 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (koje se ovde spominje kao „vezujući protein 1”) u humanizovanom modelu NSG miša sa humanim PBMC imlantiranom sa BT474 ćelijama. SL. 20A prikazuje efekat primene naznačenih koncentracija anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina, naznačenih koncentracija Herceptina, ili kontrole nosača, na telesnu težinu miševa. SL.20B prikazuje antitumorsku aktivnost anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina, Herceptina ili indiciranih kontrola, zavisnu od doze, kod pojedinačnih miševa. SL.20C prikazuje prosečnu zapreminu tumora kod miševa nakon primene naznačenih koncentracija anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole. SL.20D prikazuje prosečnu zapreminu tumora kod miševa nakon primene naznačenih koncentracija Herceptina ili PBS kontrole. SL.20E prikazuje trakaste dijagrame prosečne zapremine tumora 34. dana kod miševa nakon primene naznačenih koncentracija anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina, naznačenih koncentracija Herceptina ili PBS kontrole. SL.20F prikazuje prosečnu težinu tumora 34. dana kod miševa nakon primene naznačenih koncentracija anti-Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina, naznačene koncentracije Herceptina ili PBS kontrole. SL.20G prikazuje humane CD45+, CD3+, CD4+, CD8+ ćelije u krvi miševa na kraju studije. SL.20H prikazuje humane CD45+, CD3+, CD4+, CD8+ ćelije u slezinama miševa na kraju studije.
SL. 21A-F prikazuju rezultate studije toksičnosti povećanja doze korišćenjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5) kod neljudskih primata (sa porastom doze od 0,1, 0,5, 2,5, 5, 10, na 100 µg/kg ). SL. 21A prikazuje aktivaciju T ćelija (CD69<+>) (linijski grafikon) i proliferaciju (stubasti grafikon) cirkulišućih CD4<+>T ćelija nakon administracije anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela. SL.21B prikazuje aktivaciju T ćelija (CD69<+>) (linijski grafikon) i proliferaciju (stubasti grafikon) cirkulišućih CD8<+>T ćelija nakon administracije anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela. SL.21C prikazuje oslobađanje IL6 kod životinja koje primaju anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifično antitelo 6 sati nakon svake doze po pojedinačnoj životinji. SL.21D prikazuje oslobađanje IL10 kod životinja koje primaju anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifično antitelo 6 sati nakon svake doze po pojedinačnoj životinji. SL.21E prikazuje oslobađanje TNFα kod životinja koje primaju anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifično antitelo. SL.21F prikazuje oslobađanje IFNγ kod životinja koje primaju anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifično antitelo 6 sati nakon svakog doziranja po pojedinačnoj životinji.
SL. 22A-22C prikazuju in vivo anti-tumorsku aktivnost anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5) u CD34+ ćelijama krvi pupčane vrpce humanizovanog mišjeg modela NSG implantiranog sa ćelijama multiplog mijeloma RPMI-8226 transdukovanim sa CD38 i PD-L1. Kao pilot studija, ovim eksperimentom je utvrđen opseg radne doze za vezujući protein 5. SL. 22A prikazuje in vivo krivulju rasta tumora u grupama naznačenih koncentracija anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili kontrola. SL. 22B prikazuje humane CD8<+>T ćelije koje se infiltriraju u tumor kod miševa kojima je primenjen anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifični vezujući protein ili naznačene kontrole. SL.22C prikazuje humane CD4<+>T ćelije koje se infiltriraju u tumor kod miševa kojima je primenjen anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifični vezujući protein ili naznačene kontrole.
SL. 23A-23D prikazuju in vivo aktivnost anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5) u CD34+ ćelijama krvi pupčane vrpce humanizovanog mišjeg modela NSG implantiranog sa RPMI-8226 ćelijama transdukovanim sa CD38 i PD-L1. SL. 23A prikazuje promenu u telesnoj težini miševa tretiranih naznačenim koncentracijama anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole. SL. 23B pokazuje promenu u zapremini tumora kod miševa tretiranih naznačenim koncentracijama anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole. SL. 23C prikazuje zapremine tumora u svakoj grupi 19. dana. Zapremine tumora u svim tretiranim grupama su pokazale značajno smanjenje, sa statističkom razlikom u odnosu na PBS kontrolnu grupu. SL.23D prikazuje serumsku koncentraciju inflamatornih citokina IFN-g, TNF i IL-2 kod miševa četiri sata nakon prve doze naznačenih koncentracija anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina ili PBS kontrole.
SL. 24 i 25 prikazuju in vivo aktivaciju T ćelija u CD34+ ćelijama krvi pupčane vrpce humanizovanog mišjeg modela NSG davanjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5; trouglovi), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifično antitela (kvadrati), ili anti-CD28 IgG4 antitela (krugovi) određivanjem povećanja procenta CD69<+>T ćelija. SL.24 prikazuje in vivo aktivaciju CD4<+>T ćelija.
SL. 25 prikazuje in vivo aktivaciju CD8<+>T ćelija.
SL. 26A-26C prikazuju in vivo aktivaciju T ćelija u CD34+ ćelijama krvi pupčane vrpce humanizovanog mišjeg modela NSG davanjem anti-CD38 × CD28 × CD3 IgG4 trispecifičnog antitela (vezujući protein 5; trouglovi), anti-CD28 × CD3 IgG4 bispecifičnog antitela (kvadrati) ili anti-CD28 IgG4 antitela (krugovi) određivanjem nivoa inflamatornih citokina u serumu. SL.26A prikazuje nivoe IL-2 u serumu. SL.
26B prikazuje nivoe TNF u serumu. SL. 26C prikazuje nivoe IFN-γ u serumu.
SL. 27A i 27B prikazuju prečišćavanje naznačenih proteina hromatografijom isključivanja veličine. SL.27A prikazuje prečišćavanje vezujućih proteina 9-15 hromatografijom isključivanja veličine. SL.27B prikazuje prečišćavanje vezujućih proteina 16-19 hromatografijom isključivanja veličine.
SL. 28A prikazuje trispecifični vezujući protein koji se koristi u eksperimentima za optimizaciju šeme prečišćavanja i konfiguracije opcionih karakteristika vezujućeg proteina (npr. kapa/lambda laki lanci, mutacije ispupčenja/udubljenja i mutacije H435R/Y436F).
SL. 28B prikazuje svaku od ispitanih konfiguracija.
SL. 29 prikazuje reprezentativne hromatograme iz analitičke hidrofobne interakcijske hromatografije (HIC), pokazujući da se trispecifični vezujući proteini razlikuju od pogrešno uparenih vrsta.
SL. 30A i 30B pokazuju uspešno prečišćavanje vezujućeg proteina sa lambda lakim lancem za CODV krak, kapa lakim lancem za Fab krak, mutacije ispupčenja na CODV kraku, mutacije udubljenja na Fab kraku i RF mutacije na Fab kraku zahvaljujući koracima prečišćavanja Protein A praćenog KappaSelect-om (GE Healthcare). Uspešno prečišćavanje vezujućeg proteina iz pogrešno uparenih vrsta je demonstrirano hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC; SL.30A) i SDS-PAGE (SL. 30B).
DETALJAN OPIS
[0025] Ovo otkriće obezbeđuje trispecifične i/ili trovalentne vezujuće proteine koji sadrže četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više ciljnih proteina, pri čemu prvi par polipeptida koji formira vezujući protein poseduje dvostruke varijabilne domene koji imaju unakrsnu orijentaciju i pri čemu drugi par polipeptida koji formira vezujući protein poseduje jedan varijabilni domen.
Opšte definicije
[0026] Na način na koji se koriste u skladu sa ovim otkrićem, podrazumeva se da sledeći termini, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja. Osim ako nije drugačije propisano kontekstom, pojmovi u jednini uključuju množinu, a pojmovi u množini uključuju jedninu.
[0027] Termin „polinukleotid“ koji se ovde koristi odnosi se na jednolančane ili dvolančane polimere nukleinske kiseline dužine najmanje 10 nukleotida. U određenim otelotvorenjima, nukleotidi koji se sastoje od polinukleotida mogu biti ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Takve modifikacije uključuju modifikacije baze kao što su bromuridin, modifikacije riboze kao što su arabinozid i 2',3' -dideoksiriboza i modifikacije internukleotidnog povezivanja kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat. Termin „polinukleotid“ posebno uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0028] Izolovani polinukleotid je polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neka njihova kombinacija, koji: (1) nije povezan sa svim ili delom polinukleotida u kojem se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, (2) je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.
[0029] „Izolovani polipeptid“ je onaj koji: (1) je bez najmanje nekih drugih polipeptida sa kojima bi se normalno mogao naći, (2) je u suštini bez drugih polipeptida iz istog izvora, npr. iz iste vrste, (3) je eksprimiran od strane ćelije iz druge vrste, (4) je odvojen od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je povezan u prirodi, (5) nije povezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa delovima polipeptida sa kojima je „izolovani polipeptid“ povezan u prirodi, (6) je operativno povezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (7) se ne javlja u prirodi. Takav izolovani polipeptid može biti kodiran genomskom DNK, cDNK, mRNK ili drugom RNK, sintetičkog porekla, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Po mogućnosti, izolovani polipeptid je u suštini bez polipeptida ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koji bi ometali njegovu upotrebu (terapijski, dijagnostički, profilaktički, istraživački ili na drugi način).
[0030] Prirodna antitela se obično sastoje od tetramera. Svaki takav tetramer se obično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ lanac pune dužine (obično sa molekulskom težinom od oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac pune dužine (obično sa molekulskom težinom od oko 50-70 kDa). Termini „teški lanac“ i „laki lanac“ koji se ovde koriste odnose se na bilo koji imunoglobulinski polipeptid koji ima dovoljnu sekvencu varijabilnog domena da pruži specifičnost za ciljni antigen. Amino-terminalni deo svakog lakog i teškog lanca obično uključuje varijabilni domen od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koji je obično odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca obično definiše konstantan domen odgovoran za efektorsku funkciju. Dakle, u prirodnom antitelu, polipeptid imunoglobulina jakog lanca pune dužine uključuje varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2i CH3), pri čemu je VHdomen na aminoterminusu polipeptida i CH3domen je na karboksil-terminusu, a polipeptid imunoglobulina slabog lanca pune dužine uključuje varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL), pri čemu je VLdomen na amino-terminusu polipeptida i CLdomen je na karboksil-terminusu.
[0031] Humani laki lanci se obično klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci, a humani teški lanci se obično klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko potklasa, uključujući, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima potklase uključujući, bez ograničenja, IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljen u potklase uključujući, bez ograničenja, IgA1 i IgA2. U okviru lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni domeni su obično povezani „J“ regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje „D“ region od oko 10 aminokiselina više. Vidi npr. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989). Varijabilni regioni svakog para lakih/teških lanaca obično formiraju mesto vezivanja antigena. Varijabilni domeni prirodnih antitela obično pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih okvirnih regiona (FR) pridruženih trima hipervarijabilnim regionima, koji se nazivaju i regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi. CDR-ovi iz dva lanca svakog para obično su usklađeni sa okvirnim regionima, što može omogućiti vezivanje za određeni epitop. Od amino-terminusa do karboksil-terminusa, varijabilni domeni lakog i teškog lanca obično obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.
[0032] Termin „CDR komplet“ se odnosi na grupu od tri CDR-a koji se javljaju u jednom varijabilnom regionu sposobnom da veže antigen. Tačne granice ovih CDR-ova su različito definisane prema različitim sistemima. Sistem koji je opisao Kabat (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) ne samo da obezbeđuje nedvosmislen sistem numeracije rezidua primenljiv na bilo koji varijabilni region antitela, već takođe obezbeđuje precizne granice rezidua koje definišu tri CDR-a. Ovi CDR-ovi se mogu nazivati Kabat CDR-ovi. Chothia i saradnici (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) su utvrdili da određene podporcije u okviru Kabat CDR-ova usvajaju skoro identične osnovne peptidne konformacije, uprkos velikoj raznolikosti na nivou aminokiselinske sekvence. Ove podporcije su označene kao L1, L2 i L3 ili H1, H2 i H3 gde „L“ i „H“ označavaju regione lakog lanca i teškog lanca, respektivno. Ovi regioni se mogu nazvati Chothia CDR-ovi i imaju granice koje se preklapaju sa Kabat CDR-ovima. Ostale granice koje definišu CDR-ove koji se preklapaju sa Kabat CDR-ovima opisao je Padlan, 1995, FASEB J.9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol.262(5): 732-45; and Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol.27: 55-77. Ipak, druge definicije granica CDR-ova možda neće striktno pratiti jedan od ovde navedenih sistema, ali će se ipak preklapati sa Kabat CDR-ovima, iako se mogu skratiti ili produžiti u svetlu predviđanja ili eksperimentalnih nalaza da određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak čitavi CDR-ovi ne utiču značajno na vezivanje antigena. Metode koje se ovde koriste mogu koristiti CDR-ove definisane u skladu sa bilo kojim od ovih sistema, iako određena otelotvorenja koriste Kabat ili Chothia definisane CDR-ove. Identifikacija predviđenih CDR-ova korišćenjem sekvence aminokiselina je dobro poznata u praksi, npr. kod Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," In Antibody Engineering, Vol.2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p.33-51 (2010). Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog i/ili lakog lanca takođe se može pregledati da bi se identifikovale sekvence CDR-ova drugim konvencionalnim metodama, npr. poređenjem sa poznatim aminokiselinskim sekvencama drugih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca da bi se odredili regioni hipervarijabilnosti sekvence. Numerisane sekvence se mogu poravnati vizuelno ili korišćenjem programa za poravnanje kao što je jedan od CLUSTAL paketa programa, kao što je opisano kod Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Molekularni modeli se konvencionalno koriste za pravilno razgraničenje okvirnih i CDR regiona i na taj način koriguju dodele zasnovane na sekvencama.
[0033] Termin „Fc“ koji se ovde koristi odnosi se na molekul koji se sastoji od sekvence fragmenta koji se ne vezuje za antigen, a koji je rezultat digestije antitela ili je proizveden na drugi način, bilo u monomernom ili multimernom obliku, i može da sadrži region šarke. Originalni izvor imunoglobulina nativnog Fc je poželjno humanog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, iako se preferiraju IgG1 i IgG2. Fc molekuli se sastoje od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne ili multimerne oblike kovalentnim (tj. disulfidnim vezama) i nekovalentnim asocijacijama. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula kreće se od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr. IgG, IgA i IgE) ili potklase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 i IgGA2). Jedan primer Fc je dimer vezan disulfidom koji je rezultat papainske digestije IgG. Termin „nativni Fc“ koji se ovde koristi je generički za monomerne, dimerne i multimerne oblike.
[0034] Fragment F(ab) obično uključuje jedan laki lanac i domene VHi CH1jednog teškog lanca, pri čemu deo teškog lanca, pri čemu deo teškog lanca VH-CH1fragmenta F(ab) ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim polipeptidom teškog lanca. Na način na koji se koristi ovde, F(ab) fragment takođe može uključivati jedan laki lanac koji sadrži dva varijabilna domena odvojena aminokiselinskom vezom i jedan teški lanac koji sadrži dva varijabilna domena odvojena aminokiselinskom vezom i CH1domenom.
[0035] Fragment F(ab') obično uključuje jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži više konstantnog regiona (između CH1i CH2domena), tako da se između dva teška lanca može formirati disulfidna veza između dva teška lanca da bi se formirao molekul F(ab')2.
[0036] Termin „vezujući protein“ koji se ovde koristi odnosi se na neprirodno prisutan (ili rekombinantni ili inženjerski) molekul koji se specifično vezuje za najmanje jedan ciljni antigen i koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca koji formiraju najmanje tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1[II]
a treći polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:
VH3- CH1[III]
a četvrti polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:
VL3- CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0037] „Rekombinantni“ molekul je molekul koji je pripremljen, eksprimovan, kreiran ili izolovan rekombinantnim sredstvima.
[0038] Jedno otelotvorenje otkrića obezbeđuje vezujuće proteine koji imaju biološku i imunološku specifičnost za između jednog i tri ciljna antigena. Drugo otelotvorenje otkrića obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji se sastoje od nukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine. Drugo otelotvorenje otkrića obezbeđuje ekspresione vektore koji se sastoje od molekula nukleinske kiseline koji se sastoje od nukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine. Još jedno otelotvorenje otkrića obezbeđuje ćelije domaćine koje eksprimiraju takve vezujuće proteine (tj. sadrže molekule nukleinske kiseline ili vektore koji kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine).
[0039] Termin „zamenljivost“ koji se ovde koristi odnosi se na zamenljivost varijabilnih domena unutar formata vezujućeg proteina i sa zadržavanjem afiniteta preklapanja i konačnog vezivanja. „Potpuna zamenljivost“ se odnosi na sposobnost zamene reda i VH1i VH2domena, a samim tim i reda VL1i VL2domena, u polipeptidnom lancu formule I ili polipeptidnom lancu formule II (tj. obrtanja redosleda) uz održavanje pune funkcionalnosti vezujućeg proteina, što se dokazuje zadržavanjem afiniteta vezivanja. Dalje, treba napomenuti da se oznake VHi VLodnose samo na lokaciju domena na određenom proteinskom lancu u konačnom formatu. Na primer, VH1i VH2mogu biti izvedeni iz VL1i VL2domena u roditeljskim antitelima i smešteni u VH1i VH2pozicije u vezujućem proteinu. Isto tako, VL1i VL2mogu biti izvedeni iz VH1i VH2domena u roditeljskim antitelima i smešteni u VH1i VH2pozicije u vezujućem proteinu. Dakle, VHi VLoznake se odnose na sadašnju lokaciju, a ne na prvobitnu lokaciju u roditeljskom antitelu. VHi VLdomeni su stoga „zamenljivi“.
[0040] Termin „antigen“ ili „ciljni antigen“ ili „targetirani antigen“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da se veže vezujućim proteinom, a dodatno je sposoban da se koristi kod životinje za proizvodnju antitela koja su sposobna da se vezuju za epitop tog antigena. Ciljni antigen može imati jedan ili više epitopa. Što se tiče svakog ciljnog antigena koji je prepoznat od strane vezujućeg proteina, vezujući protein je sposoban da se takmiči sa netaknutim antitelima koja prepoznaju ciljni antigen.
[0041] Termin „Her2“ se odnosi na receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 koji je član porodice receptora epidermalnog faktora rasta.
[0042] „CD3“ je klaster polipeptida faktora diferencijacije 3 i površinski protein T-ćelija koji je obično deo kompleksa T-ćelijskog receptora (TCR).
[0043] „CD28“ je klaster diferencijacije 28 polipeptida i površinski protein T-ćelija koji pruža ko-stimulatorne signale za aktivaciju i preživljavanje T-ćelija.
[0044] „CD19“ je klaster diferencijacije 19 polipeptida i nalazi se na B-ćelijama.
[0045] „CD20“ je klaster diferencijacije 20 polipeptida i predstavlja aktivirani-glikozilirani fosfoprotein eksprimiran na površini B-ćelija.
[0046] „CD38“ je klaster diferencijacije 38 polipeptida i glikoprotein koji se nalazi na površini mnogih imunih ćelija.
[0047] „LAMP1“ je membranski protein 1 povezan sa lizozomima.
[0048] „IL-4“ je interleukin 4 i citokin koji indukuje diferencijaciju naivnih pomoćnih T ćelija.
[0049] „IL-13“ je interleukin 13 i citokin koji luče mnogi tipovi ćelija kao što su T-ćelije.
[0050] „TNFa“ je faktor tumorske nekroze alfa i citokin uključen u sistematsku upalu.
[0051] Termin „aktivator T-ćelija“ odnosi se na vezujuće proteine usmerene na imunološki sistem domaćina, tačnije citotoksičnu aktivnost T-ćelija, kao i usmerene na ciljni tumorski protein.
[0052] Termin „monospecifični vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji se specifično vezuje za jednu antigensku metu.
[0053] Termin „monovalentni vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji ima jedno mesto vezivanja antigena.
[0054] Termin „bispecifični vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji se specifično vezuje za dva različita antigenska cilja.
[0055] Termin „bivalentni vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji ima dva mesta vezivanja.
[0056] Termin „trispecifični vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji se specifično vezuje za tri različita cilja antigena.
[0057] Termin „trovalentni vezujući protein“ se odnosi na vezujući protein koji ima tri mesta vezivanja. Konkretno, oličenja trovalentnog vezujućeg proteina mogu se vezati za jednu antigensku metu. U drugim otelotvorenjima, trovalentni vezujući protein može da se veže za dve antigenske mete. U drugim otelotvorenjima, trovalentni vezujući protein može da se veže za tri antigenske mete.
[0058] „Izolovani“ vezujući protein je onaj koji je identifikovan i izdvojen i/ili oporavljen iz komponente svog prirodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu vezujućeg proteina, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein će biti prečišćen: (1) na više od 95% po težini antitela kako je određeno Lowry metodom, a najpoželjnije više od 99% po težini, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem sekvencera sa rotirajućim čašama, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukcionim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovani vezujući proteini uključuju vezujući protein in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja vezujućeg proteina neće biti prisutna.
[0059] Termini „suštinski čist“ ili „suštinski prečišćen“, na način na koji se koriste ovde, odnose se na jedinjenje ili vrstu koja je dominantna prisutna vrsta (tj. na molarnoj osnovi obilnija je od bilo koje druge pojedinačne vrste u sastavu). U nekim otelotvorenjima, suštinski prečišćena frakcija je sastav u kojem vrsta obuhvata najmanje oko 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta. U drugim otelotvorenjima, suštinski čist sastav će činiti više od oko 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% svih makromolarnih vrsta prisutnih u sastavu. U drugim otelotvorenjima, vrsta se prečišćava do suštinske homogenosti (kontaminantna vrsta se ne može otkriti u sastavu konvencionalnim metodama detekcije) pri čemu se sastav u suštini sastoji od jedne makromolekularne vrste.
[0060] „Neutrališući“ vezujući protein, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na molekul koji je u stanju da blokira ili značajno smanji efektorsku funkciju ciljnog antigena na koji se vezuje. Na način na koji se koristi ovde, „značajno smanjenje“ znači najmanje oko 60%, poželjno najmanje oko 70%, poželjnije najmanje oko 75%, još poželjnije najmanje oko 80%, još poželjnije najmanje oko 85%, najpoželjnije najmanje oko 90% smanjenja efektorske funkcije ciljnog antigena.
[0061] Termin „epitop“ uključuje bilo koju determinantu, po mogućnosti polipeptidnu determinantu, koja se može specifično vezati za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. U određenim otelotvorenjima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforilne grupe ili sulfonilne grupe, i, u određenim otelotvorenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena koji je vezan antitelom ili vezujućim proteinom. U određenim otelotvorenjima, kaže se da se vezujući protein specifično vezuje za antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u složenoj mešavini proteina i/ili makromolekula. U nekim otelotvorenjima, kaže se da se vezujući protein specifično vezuje za antigen kada je konstanta disocijacije ravnoteže ≤ 10<-8>M, poželjnije kada je konstanta disocijacije ravnoteže ≤ 10<-9>M, a najpoželjnije kada je konstanta disocijacije ≤ 10<-10>M.
[0062] Konstanta disocijacije (KD) vezujućeg proteina može se odrediti, na primer, površinskom plazmonskom rezonancom. Generalno, analiza površinske plazmonske rezonance meri interakcije vezivanja u realnom vremenu između liganda (ciljni antigen na matrici biosenzora) i analita (vezujući protein u rastvoru) površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). Analiza površinskih plazmona se takođe može izvršiti imobilizacijom analita (vezujući protein na matrici biosenzora) i predstavljanjem liganda (ciljni antigen). Termin „KD“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na konstantu disocijacije interakcije između određenog vezujućeg proteina i ciljnog antigena.
[0063] Termin „specifično se vezuje“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na sposobnost vezujućeg proteina ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen da se veže za antigen koji sadrži epitop sa Kd od najmanje oko 1 × 10<-6>M, 1 × 10<-7>M, 1 × 10<-8>M, 1 × 10<-9>M, 1 × 10<-10>M, 1 × 10<-11>M, 1 × 10<-12>M ili više i/ili da se veže za epitop sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta za nespecifični antigen.
[0064] Termin „linker“ koji se ovde koristi odnosi se na jedan ili više aminokiselinskih ostataka umetnutih između domena imunoglobulina kako bi se obezbedila dovoljna pokretljivost da se domeni lakih i teških lanaca preklope u ukrštene imunoglobuline dvostrukog varijabilnog regiona. Linker se ubacuje na prelazu između varijabilnih domena ili između varijabilnih i konstantnih domena, respektivno, na nivou sekvence. Prelaz između domena se može identifikovati jer postoji dobro razumevanje približne veličine domena imunoglobulina. Precizna lokacija prelaza domena može se odrediti lociranjem peptidnih delova koji ne formiraju sekundarne strukturne elemente kao što su beta-listovi ili alfa-helisi, kao što je pokazano eksperimentalnim podacima ili kao što se može pretpostaviti tehnikama modeliranja ili predviđanja sekundarne strukture. Ovde opisani linkeri se nazivaju L1, koji se nalazi na lakom lancu između C-terminusa VL2i N-terminusa VL1domena; i L2, koji se nalazi na lakom lancu između C-terminusa VL1i N-terminus CLdomena. Linkeri teških lanaca su poznati kao L3, koji se nalazi između C-terminusa VH1i N-terminusa VH2domena; i L4, koji se nalazi između C-terminusa VH2i N-terminusa CH1domena.
[0065] Termin „vektor“ koji se ovde koristi odnosi se na bilo koji molekul (npr. nukleinsku kiselinu, plazmid ili virus) koji se koristi za prenos informacija o kodiranju u ćeliju domaćina. Termin „vektor“ uključuje molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružni dvolančani DNK molekul u koji se mogu ubaciti dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde se dodatni DNK segmenti mogu umetnuti u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju se unose (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomski vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon unošenja u ćeliju domaćina i time se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Pored toga, određeni vektori su sposobni da usmeravaju izražavanje gena sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ (ili jednostavno, „ekspresioni vektori“). Generalno, ekspresioni vektori korisnosti u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. Termini „plazmid“ i „vektor“ se ovde mogu koristiti naizmenično, jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, ovo otkriće ima za cilj da uključi druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. replikaciono defektni retrovirusi, adenovirusi i adeno-povezani virusi), koji služe ekvivalentnim funkcijama.
[0066] Fraza „rekombinantna ćelija domaćin“ (ili „ćelija domaćin“) koja se ovde koristi odnosi se na ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Termin rekombinantna ćelija domaćin ili ćelija domaćin odnosi se ne samo na određenu ćeliju subjekta, već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu pojaviti u narednim generacijama bilo zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo, u stvari, ne može biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u obim termina „ćelija domaćin“, kao što se ovde koristi. Širok spektar ekspresionih sistema ćelija domaćina može se koristiti za ekspresiju vezujućih proteina, uključujući sisteme ekspresije bakterija, kvasca, bakulovirusa i sisara (kao i ekspresione sisteme fagnog prikaza). Primer odgovarajućeg bakterijskog ekspresionog vektora je pUC19. Da bi se rekombinantno eksprimirao vezujući protein, ćelija domaćina se transformiše ili transfektuje jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose DNK fragmente koji kodiraju polipeptidne lance vezujućeg proteina tako da se polipeptidni lanci eksprimiraju u ćeliji domaćina i, po mogućnosti, izlučuju u medijum u kojem se ćelije domaćina uzgajaju, iz kog medija se može uzeti vezujući protein.
[0067] Termin „transformacija“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na promenu genetskih karakteristika ćelije, a ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK. Na primer, ćelija se transformiše tamo gde je genetski modifikovana iz svog izvornog stanja. Nakon transformacije, DNK koja se transformiše može se rekombinovati sa DNK ćelije fizičkom integracijom u hromozom ćelije, ili se može privremeno održavati kao epizomski element bez replikacije, ili se može samostalno replicirati kao plazmid. Smatra se da je ćelija stabilno transformisana kada se DNK replicira sa podelom ćelije. Termin „transfekcija“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na unos strane ili egzogene DNK od strane ćelije, a ćelija je „transfektovana“ kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su dobro poznate u struci. Takve tehnike se mogu koristiti za uvođenje jednog ili više egzogenih molekula DNK u odgovarajuće ćelije domaćina.
[0068] Termin „prirodna pojava“ koji se ovde koristi i primenjuje na objekat odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi i da njime čovek nije manipulisao. Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji je prisutan u organizmu (uključujući viruse) koji se može izolovati iz izvora u prirodi i koji čovek nije namerno modifikovao javlja se u vidu prirodne pojave. Slično tome, termin „neprirodna pojava“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na objekat koji se ne nalazi u prirodi ili koji je čovek strukturno modifikovao ili sintetizovao.
[0069] Na način na koji se koriste ovde, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Stereoizomeri (npr. D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina; neprirodne aminokiseline i analozi kao što su α-, αdisupstituisane aminokiseline, N-alkilne aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptidne lance vezujućih proteina. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N, N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfosferin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr.4-hidroksiprolin). U polipeptidnoj notaciji koja se ovde koristi, pravac leve strane je pravac amino terminala, a pravac desne strane je pravac karboksil terminala, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0070] Ostaci koji se prirodno javljaju mogu se podeliti u klase na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:
(1) hidrofobni: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
(2) polarni hidrofilni: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
(3) alifatski: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
(4) alifatski hidrofobni: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
(5) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(6) kiseli: Asp, Glu;
(7) bazni: His, Lys, Arg;
(8) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(9) aromatični: His, Trp, Tyr, Phe; and
10. (10) aromatični hidrofobni: Phe, Trp, Tyr.
[0071] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu uključivati razmenu člana jedne od ovih klasa sa drugim članom iste klase. Nekonzervativne supstitucije mogu uključivati zamenu člana jedne od ovih klasa za člana iz druge klase.
[0072] Kvalifikovani stručnjak će moći da odredi odgovarajuće varijante polipeptidnih lanaca vezujućih proteina koristeći poznate tehnike. Na primer, stručnjak u oblasti može identifikovati pogodne oblasti polipeptidnog lanca koje se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se ne veruje da su važni za aktivnost. Alternativno, stručnjak u oblasti može identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. Pored toga, čak i područja koja mogu biti važna za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti podložna konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez negativnog uticaja na polipeptidnu strukturu.
[0073] Termin „pacijent“ koji se ovde koristi uključuje ljudske i životinjske subjekte.
[0074] Termini „tretman“ ili „lečenje“ koji se ovde koriste odnose se i na terapijsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potrebno lečenje uključuju one koji imaju poremećaj, kao i one koji su skloni da imaju poremećaj ili one kod kojih poremećaj treba sprečiti. Konkretno, vezujući proteini se mogu koristiti za lečenje ljudi sa karcinomom, ili ljudi podložnih karcinomu, ili za ublažavanje karcinoma kod ljudskog subjekta. Vezujući proteini se takođe mogu koristiti za prevenciju karcinoma kod ljudskog pacijenta. U određenim otelotvorenjima, karcinom je multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, hronična limfocitna leukemija, akutna mijeloidna leukemija, limfom, karcinom dojke kao što je Her2+ karcinom dojke, limfom B-ćelija germinalnog centra ili B-ćelijska limfoblastna akutna leukemija. U drugim otelotvorenjima, vezujući proteini se mogu koristiti za lečenje ljudi sa inflamatornim poremećajima, ili ljudi podložnih inflamatornim poremećajima, ili za ublažavanje inflamatornih poremećaja kod ljudi.
[0075] Termini „farmaceutski sastav“ ili „terapijski sastav“, na način na koji se koriste ovde, odnose se na jedinjenje ili sastav koji mogu da izazovu željeni terapijski efekat kada se pravilno primenjuju kod pacijenta.
[0076] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ ili „fiziološki prihvatljiv nosač“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na jedan ili više formulacionih materijala pogodnih za postizanje ili poboljšanje isporuke vezujućeg proteina.
[0077] Termini „efektivna količina“ i „terapijski efikasna količina“ kada se koriste u vezi sa farmaceutskim sastavom koji se sastoji od jednog ili više vezujućih proteina odnose se na količinu ili dozu dovoljnu da proizvede željeni terapijski rezultat. Preciznije, terapijski efikasna količina je količina vezujućeg proteina dovoljna da inhibira, tokom određenog vremenskog perioda, jedan ili više klinički definisanih patoloških procesa povezanih sa stanjem koje se leči. Efikasna količina može varirati u zavisnosti od specifičnog vezivnog proteina koji se koristi, a takođe zavisi od različitih faktora i stanja povezanih sa pacijentom koji se leči i težinom poremećaja. Na primer, ako se vezujući protein primenjuje in vivo, faktori kao što su starost, težina i zdravlje pacijenta, kao i krive odgovora na dozu i podaci o toksičnosti dobijeni u pretkliničkom radu na životinjama bili bi među tim faktorima.
Određivanje efikasne količine ili terapijski efikasne količine datog farmaceutskog sastava je u okviru sposobnosti stručnjaka u oblasti.
[0078] Jedno otelotvorenje ovog otkrića obezbeđuje farmaceutski sastav koji se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i terapijski efikasne količine vezujućeg proteina.
Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini
[0079] U jednom otelotvorenju, vezujući protein iz ovog otkrića je trispecifični i/ili trovalentni vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više (tj. tri) različitih ciljnih antigena ili ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3- CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3- CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje domene CH1i CH2; a L1, L2, L3i L4su linkeri amino kiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0080] U jednom otelotvorenju, vezujući protein iz ovog otkrića je trispecifični i/ili trovalentni vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više (tj. tri) različitih ciljnih antigena ili ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac čini struktura predstavljena formulom: VL2-L1-VL1-L2-CL[I] a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II] a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3- CH1-šarka-CH2-CH3[III] a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3- CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina; VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2; CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje domene CH1i CH2; a L1, L2, L3i L4su linkeri amino kiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0081] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac imaju unakrsnu orijentaciju koja formira dva različita mesta vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH1 i VL1 formiraju vezujući par i formiraju prvo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH2 i VL2 formiraju vezujući par i formiraju drugo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, treći polipeptid i četvrti polipeptid formiraju treće mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH3 i VL3 formiraju vezujući par i formiraju treće mesto vezivanja antigena.
[0082] U jednom otelotvorenju, vezujući protein iz ovog otkrića je trispecifični i/ili trovalentni vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više (tj. tri) različitih ciljnih antigena ili ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac čini struktura predstavljena formulom:
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3- CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3- CL[IV]
pri čemu:
VD1varijabilni domen teškog ili lakog lanca prvog imunoglobulina;
VD2varijabilni domen teškog ili lakog lanca drugog imunoglobulina;
VD3varijabilni domen teškog ili lakog lanca trećeg imunoglobulina;
VD4varijabilni domen teškog ili lakog lanca četvrtog imunoglobulina;
VH3varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VL3varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje domene CH1i CH2; a L1, L2, L3i L4su linkeri amino kiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0083] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića obuhvata tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan, dva ili tri ciljana antigena ili ciljna proteina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein vezuje tri ciljna antigena. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein vezuje tri različita ciljna antigena. U nekim otelotvorenjima, dva mesta vezivanja antigena vezuju isti ciljni antigen. U tim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži dva puta iste vezujuće domene, ili različite vezujuće domene, i/ili specifično vezuje različite antigene ili epitope na istom ciljnom antigenu. U nekim otelotvorenjima, tri mesta vezivanja antigena vezuju isti ciljni antigen. U tim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži tri puta iste vezujuće domene, ili različite vezujuće domene, i/ili specifično vezuje različite antigene ili epitope na istom ciljnom antigenu.
[0084] U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3predstavljaju nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 2, 4, 10, 14, 18, 22 ili 115; i VH1, VH2i VH3, predstavljaju nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 3, 9, 13, 17, 21 ili 114. U nekim drugim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3predstavljaju nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 61, 63, 69, 71, 74, 76, 82, 86, 88 ili 94; i VH1, VH2i VH3, predstavljaju nezavisno varijabilni domen izveden iz aminokiselinske sekvence kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81, 85, 87 ili 93. U drugim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125; i VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122. U drugim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 61, 63, 69, 71, 74, 76, 82, 86, 88 or 94; i VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81, 85, 87 ili 93. U nekim otelotvorenjima, VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
[0085] U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 169, 171, i 173; i/ili VH1, VH2, i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 168, 170, i 172. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 141-147, 178-179; i/ili VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 129-137. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, i 167; i/ili VH1, VH2, i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, i 166. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140, i 149; i VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122, i 126-128. U nekim otelotvorenjima, VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca i/ili sekvencu varijabilnog domena prikazanu u Tabelama 2-5.
[0086] U posebnim otelotvorenjima, redosled VH1i VH2domena, a samim tim i redosled VL1i VL2domena, u polipeptidnom lancu formule I ili polipeptidnom lancu formule II (npr. da bi se obrnuo redosled) se zamenjuju.
[0087] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 1; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 2 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 2.
[0088] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 1 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 1; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 2 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 2.
[0089] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 13 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 13; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 14 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 14.
[0090] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 13 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 13; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 14 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 14.
[0091] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 17 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 17; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 18 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 18.
[0092] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 17 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 17; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 18 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 18.
[0093] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 21 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 21; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 22 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 22.
[0094] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 21 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 21; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 22 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 22.
[0095] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 61 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 61.
[0096] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 61 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 61.
[0097] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 60 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 60; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 71 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 71.
[0098] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 76 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 76; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 75 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 75; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 74.
[0099] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 82 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 82; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 81, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 81; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 74.
[0100] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 88 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 88; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 87 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 87; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 86.
[0101] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 94 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 94; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 93 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 93; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 86.
[0102] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 74.
[0103] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 69 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 69; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 68 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 68; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 86.
[0104] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 73 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 73; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 74 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 74.
[0105] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 63 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 63; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 62 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 62; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 85 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 85; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 86 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 86.
[0106] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 4 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 3 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 114 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 114; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 115 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 115.
[0107] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 10 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 10; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 9 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 9; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 114 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 114; i polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115 ili sekvencu aminokiselina koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 115 i opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 115.
[0108] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac imaju unakrsnu orijentaciju koja formira dva različita mesta vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH1 i VL1 formiraju vezujući par i formiraju prvo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH2 i VL2 formiraju vezujući par i formiraju drugo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, treći polipeptid i četvrti polipeptid formiraju treće mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH3 i VL3 formiraju vezujući par i formiraju treće mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac i treći polipeptidni lanac sadrže jednu ili više modifikacija. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina su različiti, npr. imaju različite CH1, CH2, i/ili CH3domen(e) (kao što su oni koji uključuju modifikaciju koja je opisana u ovom dokumentu). U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac i četvrti polipeptidni lanac sadrže jednu ili više modifikacija. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina su različiti, npr. imaju različite CLdomene (kao što su oni koji uključuju modifikaciju koja je opisana u ovom dokumentu, i/ili lambda u odnosu na kapa CLdomene).
[0109] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 150, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 150, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 151, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 151. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 152, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 152, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 153, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 153. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 154, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 154, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 155, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 155. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 156, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 156, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 157, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 157. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 158, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 158, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 159, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 159. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 160, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 160, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 161, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 161. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 162, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 162, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 163, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 163. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 164, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 164, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 165, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 165. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 166, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 166, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 167, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 167. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 168, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 168, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 169, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 169. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 170, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 170, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 171, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 171. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, na najmanje 99%, ili 100% identičan SEQ ID NO: 172, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 172, i/ili varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 173, opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 173.
[0110] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića se vezuje za jednu, dve ili tri ciljna antigena sa ravnotežom konstante disocijacije (KD) koja je manja ili jednaka 1µM, 500nM, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM ili 1nM. Primeri testova za određivanje KDsu poznati u struci. Na primer, u nekim otelotvorenjima, KDse određuje merenjem kinetike vezivanja na temperaturama između 0 °C i 37 °C, npr. na 0 °C, 4 °C, 25 °C ili 37 °C) korišćenjem tehnika opisanih u Primeru 1. (npr. SPR ili ELISA).
[0111] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića aktivira CD4 i/ili CD8 T ćelije in vitro i/ili indukuje in vitro ubijanje ćelija posredovano antitelima u ćelijama koje eksprimiraju jedan ili više antigenskih ciljeva jednog ili više vezujućih domena vezujućih proteina. Primeri in vitro ispitivanja ubijanja ćelija i aktivacije T ćelija su poznati u struci. Na primer, u nekim otelotvorenjima, in vitro ubijanje ćelija i/ili aktivacija T ćelija se ispituje korišćenjem tehnika opisanih u Primeru 1.
[0112] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića se specifično vezuje za, i/ili blokira signalizaciju posredovanu jednim ili više citokina. Primeri ispitivanja oslobađanja citokina su poznati u struci. Na primer, u nekim otelotvorenjima, oslobađanje citokina se ispituje korišćenjem tehnika opisanih u Primeru 1.
[0113] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, i treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni antigen ili ciljni protein. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, i treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein na T ćelijama, i treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni humani protein tumora. U nekim otelotvorenjima, prvo i drugo mesto vezivanja antigena specifično vezuju ciljni protein tumora, na primer, izabran između CD3 i CD28, respektivno. U nekim otelotvorenjima, prvo i drugo mesto vezivanja antigena specifično vezuju ciljni protein tumora, na primer, izabran između CD28 i CD3, respektivno. U nekim otelotvorenjima, treće mesto vezivanja antigena specifično vezuje CD19, CD20, CD38, Her2 ili LAMP1. Dalji primeri takvih ciljeva i ciljnih proteina dati su u nastavku.
[0114] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni antigen ili ciljni protein. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD3 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni antigen ili ciljni protein. Dalji primeri takvih ciljnih antigena i ciljnih proteina dati su u nastavku. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni humani protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD3 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD3 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni humani protein tumora. U nekim otelotvorenjima, treće mesto vezivanja antigena specifično vezuje CD19, CD20, CD38, Her2 ili LAMP1. Dalji primeri takvih ciljnih antigena tumora i ciljnih proteina tumora dati su u nastavku.
[0115] U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155.
Dodatne VH, VL i/ili sekvence CDR-ova antitela koje specifično vezuju CD3 pogodne za upotrebu u bilo kom od ovde opisanih vezujućih proteina mogu se naći u međunarodnoj publikaciji br. WO2016/116626. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u Tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži (i) tri teška lanca CDR-ova SEQ ID NO: 34, 35 i 36, respektivno, i tri laka lanca CDR-ova SEQ ID NO: 52, 53 i 54, respektivno; ili (ii) tri teška lanca CDR-ova SEQ ID NO: 34, 35 i 36, respektivno, i tri laka lanca CDR-ova SEQ ID NO: 149, 53 i 54, respektivno. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 je deo polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci amino kiselina SEQ ID NO: 3 opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 je deo polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci amino kiselina SEQ ID NO: 4 opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4.
[0116] U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u Tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži (i) tri teška lanca CDR-ova SEQ ID NO: 28, 29 i 30, respektivno, i tri laka lanca CDR-ova SEQ ID NO: 46, 47 i 48, respektivno; ili (ii) tri teška lanca CDR-ova SEQ ID NO: 31, 32 i 33, respektivno, i tri laka lanca CDR-ova SEQ ID NO: 49, 50 i 51, respektivno. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 je deo polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 3 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci amino kiselina SEK ID NO: 3 opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 je deo polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci amino kiselina SEQ ID NO: 4 opciono sadrži CDR-ove koji su 100% identični CDR-ovima polipeptidnog lanca SEQ ID NO: 4.
[0117] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i treće mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD38, ili prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28, drugo mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje CD3, i treće mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje CD38, pri čemu:
● mesto vezanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži (i) tri CDR-a teškog lanca SEQ ID NO: 34, 35 i 36, respektivno, i tri CDR-a lakog lanca SEQ ID NO: 52, 53 i 54; ili (ii) tri CDR-a teškog lanca SEQ ID NO: 34, 35 i 36, odnosno tri CDR-a lakog lanca SEQ ID NO: 149, 53 i 54; i
● mesto vezanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži (i) tri CDR-a teškog lanca SEQ ID NO: 28, 29 i 30, respektivno, i tri CDR-a lakog lanca SEQ ID NO: 46, 47 i 48; ili (ii) tri CDR-a teškog lanca SEQ ID NO: 31, 32 i 33, respektivno, i tri CDR-a lakog lanca SEQ ID NO: 49, 50 i 51; i
● mesto vezanja antigena koje specifično vezuje CD38 sadrži (i) tri CDR-a teškog lanca SEQ ID NO: 40, 41 i 42, respektivno, i tri CDR-a lakog lanca SEQ ID NO: 58, 44 i 59, respektivno.
[0118] U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži šest CDR-ova, ili varijabilni domen teškog i lakog lanca, koji su prikazani u tabelama 2-5. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži šest CDR-ova anti-Her2, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD38 ili anti-LAMP1 vezujuće domene prikazane u tabelama 2-5.
[0119] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III] a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 169, 171 i 173; i
pri čemu:
VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 168, 170 i 172.
[0120] U nekim obelodanjivanjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 141-147, 178 i 179; i
pri čemu:
VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 129-137.
[0121] U nekim obelodanjivanjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 i 167; i
pri čemu:
VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži sekvencu varijabilnog domena kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164 i 166.
[0122] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
a drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II] a treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III] a četvrti polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina; VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina; CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2; CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3; šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac;
pri čemu:
VL1, VL2i VL3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140 i 149; i
pri čemu:
VH1, VH2i VH3svaki nezavisno sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-42, 120-122, i 126-128.
[0123] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje CD28 i mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni antigen koji nije CD3 ili CD28. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje humani CD3, mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani CD28 i mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje ciljni humani antigen nije CD3 ili CD28. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži (a) mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, pri čemu mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži (i) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; (ii) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155, (iii) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54, ili (iv) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži amino kiselinu sekvenca SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:149, CDR -L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; (b) mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28, pri čemu mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 obuhvata (i) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161; (ii) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163, (iii) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 30, i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili (iv) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33, i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; i (c) mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje cilj antigena koji nije CD3 ili CD28. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 10, drugi polipeptidni lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili 9, i treći i četvrti polipeptidni lanac, pri čemu treći i četvrti polipeptidni lanac formiraju domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje cilj antigena koji nije CD3 ili CD28. U nekim otelotvorenjima, mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni antigen koji nije CD3 ili CD28 vezuje ciljni antigena izabran od A2AR, APRIL, ATPDaza, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (takođe poznat kao VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (takođe poznat kao MCP-1), CCL3 (takođe poznat kao MIP-1a), CCL4 (takođe poznat kao MIP-1b) , CCL5 (takođe poznat kao RANTES), CCL7 (takođe poznat kao MCP-3), CCL8 (takođe poznat kao mcp-2), CCL11 (takođe poznat kao eotaksin), CCL15 (takođe poznat kao MIP-1d), CCL17 (takođe poznat kao TARC), CCL19 (takođe poznat kao MIP-3b), CCL20 (takođe poznat kao MIP-3a), CCL21 (takođe poznat kao MIP-2), CCL24 (takođe poznat kao MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (poznat i kao TECK), CCL26 (poznat i kao eotaksin-3), CCR3, CCR4, CD19, CD20, CD23 (takođe poznat kao FCER2, receptor za IgE), CD24, CD27, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (takođe poznat kao B7-1), CD86 (takođe poznat kao B7-2), CD122, CD137 (takođe poznat kao 41BB), CD137L, CD152 (takođe poznat kao CTLA4), CD154 (takođe poznat kao CD40L), CD160, CD272, CD273 (takođe poznat kao PDL2), CD274 (takođe poznat kao PDL1), CD275 (takođe poznat kao B7H2), CD276 (takođe poznat kao B7H3), CD278 (takođe poznat kao ICOS), CD279 (takođe poznat kao PD-1 ), CDH1 (takođe poznat kao E-kadherin), hitinaza, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (takođe poznat kao M-CSF), CSF-2 (takođe poznat kao GM-CSF), CSF-3 (takođe poznat kao GCSF), CX3CL1 (takođe poznat kao SCYD1), CXCL12 (takođe poznat kao SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaza 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (takođe poznat kao receptor za IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (takođe poznat kao b4 integrin), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptin, LPFS2, MHC klasa II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (takođe poznat kao receptor za IL33), STEAP2, Syk kinaza, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (takođe poznat kao koreceptor za IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1 (takođe poznat kao GPR5/CCXCR1).
[0124] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 45.
[0125] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45.
[0126] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45.
[0127] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 57.
[0128] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57.
[0129] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 59.
[0130] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59.
[0131] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 140.
[0132] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140.
[0133] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142.
[0134] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142.
[0135] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142.
[0136] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147.
[0137] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147.
[0138] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.
[0139] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.
[0140] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147.
[0141] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.
[0142] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147.
[0143] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.
[0144] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 122 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 125.
[0145] U nekim otelotvorenjima, VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36 ; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54 ; VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 122 ; i VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.
Ciljni antigeni
[0146] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića vezuje jedan ili više (npr. jedan, dva ili tri) od sledećih ciljnih antigena ili ciljnih proteina: A2AR, APRIL, ATPDaza, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (takođe poznat kao VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (takođe poznat kao MCP-1), CCL3 (takođe poznat kao MIP-1a), CCL4 (takođe poznat kao MIP-1b), CCL5 (takođe poznat kao RANTES), CCL7 (takođe poznat kao MCP-3), CCL8 (takođe poznat kao mcp-2), CCL11 (takođe poznat kao eotaxin), CCL15 (takođe poznat kao MIP-1d), CCL17 (takođe poznat kao TARC), CCL19 (takođe poznat kao MIP-3b), CCL20 (takođe poznat kao MIP-3a), CCL21 (takođe poznat kao MIP-2), CCL24 (takođe poznat kao MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (takođe poznat kao TECK), CCL26 (takođe poznat kao eotaksin-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (takođe poznat kao FCER2, receptor za IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (takođe poznat kao B7-1), CD86 (takođe poznat kao B7-2), CD122, CD137 (takođe poznat kao 41BB), CD137L, CD152 (takođe poznat kao CTLA4), CD154 (takođe poznat kao CD40L), CD160, CD272, CD273 (takođe poznat kao PDL2), CD274 (takođe poznat kao PDL1), CD275 (takođe poznat kao B7H2), CD276 (takođe poznat kao B7H3), CD278 (takođe poznat kao ICOS), CD279 (takođe poznat kao PD-1), CDH1 (takođe poznat kao E-kadherin), hitinaza, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (takođe poznat kao M-CSF), CSF-2 (takođe poznat kao GM-CSF), CSF-3 (takođe poznat kao GCSF), CX3CL1 (takođe poznat kao SCYD1), CXCL12 (takođe poznat kao SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaza 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (takođe poznat kao receptor za IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (takođe poznat kao b4 integrin), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptin, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaza-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (takođe poznat kao receptor za IL33), STEAP2, Syk kinaza, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (takođe poznat kao koreceptor za IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1 (takođe poznat kao GPR5/CCXCR1). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više od gore navedenih ciljnih antigena su ciljni humani antigeni.
[0147] U jednom otelotvorenju, vezujući proteini se specifično vezuju za jedan ili više ciljnih tumorskih antigena (npr. ciljni proteini). U drugim otelotvorenjima, vezujući proteini se specifično vezuju za jedan ili više ciljnih proteina tumora i jedan ili više ciljnih proteina na T ćeliji uključujući kompleks receptora T ćelija. Ovi vezujući proteini za uključivanje T ćelija sposobni su da privremeno regrutuju T ćelije u ciljne ćelije i, u isto vreme, aktiviraju citolitičku aktivnost T ćelija. Primeri ciljnih proteina na T ćelijama uključuju, između ostalog, CD3 i CD28, ali nisu ograničeni na njih. Dalji primeri takvih ciljnih antigena i ciljnih proteina dati su iznad. U nekim otelotvorenjima, trispecifični vezujući proteini mogu biti generisani kombinovanjem vezujućih domena antigena dva ili više monospecifičnih antitela (matična antitela) u jedno antitelo. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića vezuje jedan ili više (npr. jedan, dva ili tri) od sledećih ciljnih antigena: CD3, CD19, CD20, CD28, CD38, Her2, LAMP1, IL-4, IL-13 i TNFa.
[0148] U nekim otelotvorenjima otkrića, trovalentni vezujući protein je sposoban da veže tri ciljna antigena. U nekim otelotvorenjima otkrića, trovalentni vezujući protein je sposoban da veže tri različita ciljna antigena. U jednom otelotvorenju, vezujući protein je trispecifičan i jedan par laki lanac-teški lanac je sposoban da veže dva različita ciljna antigena ili epitopa i jedan par laki lanac-teški lanca je sposoban da veže jedan ciljni antigen ili epitop. U drugom otelotvorenju, vezujući protein je sposoban da veže tri ciljna tumorska antigena. U drugom otelotvorenju, vezujući protein je sposoban da veže tri različita ciljna tumorska antigena. U drugim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkciju jednog ili više ciljnih antigena.
[0149] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića vezuje jedan ili više ciljnih proteina tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri epitopa na jednom ciljnom proteinu tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri različita epitopa na jednom ciljnom proteinu tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da veže dva različita epitopa na prvom ciljnom proteinu tumora i jedan epitop na drugom ciljnom proteinu tumora. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi ciljni protein tumora su različiti. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri različita ciljna proteina tumora.
[0150] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića vezuje jedan ili više ciljnih proteina citokina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri epitopa na jednom ciljnom proteinu citokina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri različita epitopa na jednom ciljnom proteinu cikotina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da veže dva različita epitopa na prvom ciljnom proteinu cikotina i jedan epitop na drugom ciljnom proteinu cikotina. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi ciljni protein cikotina su različiti. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže tri različita ciljna proteina cikotina. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ciljnih proteina citokina su jedan ili više od IL-4, IL-13 i/ili TNFa. Dalji primeri ciljnih proteina citokina dati su u nastavku.
[0151] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića vezuje jedan ili više ciljnih proteina tumora i jedan ili više ciljnih proteina T ćelija. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže jedan ciljni protein tumora i dva različita epitopa na jednom ciljnom proteinu T ćelije. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže jedan ciljni protein tumora i dva različita ciljna proteina T ćelija (npr. CD28 i CD3). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže jedan ciljni protein T ćelije i dva različita epitopa na jednom ciljnom proteinu tumora. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže jedan ciljni protein T ćelije i dva različita ciljna proteina tumora. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi polipeptidni lanci vezujućeg proteina formiraju dva mesta vezivanja antigena koja specifično ciljaju dva ciljna proteina T ćelija, a treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina formiraju mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi polipeptidni lanci vezujućeg proteina formiraju dva mesta vezivanja antigena koja specifično ciljaju dva ciljna proteina tumora, a treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina formiraju mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein T ćelije. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ciljnih proteina tumora su jedan ili više od CD3, CD19, CD20, CD28, CD38, Her2, LAMP1, IL-4, IL-13 i/ili TNFa. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ciljnih proteina T ćelija su jedan ili više od CD3 i CD28. Dalji primeri ciljnih proteina tumora i ciljnih proteina T ćelija dati su iznad.
[0152] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića vezuje, nezavisno jedan od drugog, isti ili različiti, jedan, dva ili tri ciljana antigena ili ciljna proteina, izabrana od ciljnih proteina citokina, ciljnih antigena tumora ili ciljnih proteina tumora, ciljnih proteina T ćelija, inhibitora imunološke kontrolne tačke, modulatora imunološke kontrolne tačke, kostimulatornih molekula imunološke kontrolne tačke i/ili ciljnih molekula na površini imune ćelije. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića je trovalentan, ali bispecifičan, i sposoban da se dva puta specifično veže za iste ciljne antigene ili ciljne proteine. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića je sposoban da specifično veže dva različita epitopa na jedan ciljni protein citokina, ciljne antigene tumora ili ciljne proteine tumora, T ćelijske ciljne proteine, inhibitore imunološke kontrolne tačke, modulatore imunološke kontrolne tačke, kostimulatorne molekule imunološke kontrolne tačke i/ili ciljne molekule na površini imune ćelije. Dalji primeri takvih ciljnih antigena i ciljnih proteina dati su iznad.
[0153] Vezujući proteini iz ovog otkrića mogu biti pripremljeni korišćenjem domena ili sekvenci dobijenih ili izvedenih iz bilo kog humanog ili ne-humanog antitela, uključujući, na primer, humana, mišja ili humanizovana antitela.
Linkeri
[0154] U nekim otelotvorenjima, linkeri L1, L2, L3i L4su u rasponu od onih bez amino kiselina (dužina=0) do dužine od oko 100 amino kiselina, ili manje od 100, 50, 40, 30, 20 ili 15 ili manje amino kiselina. Linkeri takođe mogu biti dugački 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu. L1, L2, L3i L4u jednom vezujućem proteinu mogu svi imati istu sekvencu aminokiselina ili svi mogu imati različite sekvence aminokiselina.
[0155] Primeri pogodnih linkera uključuju jedan ostatak glicina (Gly); diglicin peptid (Gly-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri glicinska ostatka (Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 98); peptid sa pet glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 99); peptid sa šest glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 100); peptid sa sedam glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 101); peptid sa osam glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 102). Mogu se koristiti i druge kombinacije aminokiselinskih ostataka kao što je peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 103), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 104), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 105), i peptid Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO:148). Drugi pogodni linkeri uključuju jedan Ser i Val ostatak; dipeptid Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys i Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 106), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 107), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 108), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 109); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 110), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 111), Gly-GlnPro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 112), i His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 113). Gore navedeni primeri nemaju za cilj da ograniče obim otkrića ni na koji način, a linkeri koji sadrže nasumično odabrane aminokiseline izabrane iz grupe koju čine valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat, glutamat, asparagin, glutamin, glicin i prolin su se pokazali kao pogodni u vezujućim proteinima. Za dodatne opise sekvenci linkera, videti, npr. WO2012135345.
[0156] Identitet i sekvenca aminokiselinskih ostataka u linkeru mogu da variraju u zavisnosti od tipa sekundarnog strukturnog elementa neophodnog za postizanje u linkeru. Na primer, glicin, serin i alanin su najbolji za linkere koji imaju maksimalnu fleksibilnost. Neke kombinacije glicina, prolina, treonina i serina su korisne ako je neophodan čvršći i produženi linker. Bilo koji aminokiselinski ostatak može se smatrati linkerom u kombinaciji sa drugim aminokiselinskim ostacima da bi se, po potrebi, konstruisali veći peptidni linkeri u zavisnosti od željenih osobina.
[0157] U nekim otelotvorenjima, dužina L1je najmanje dvostruko veća od dužine L3. U nekim otelotvorenjima, dužina L2je najmanje dvostruko veća od dužine L4. U nekim otelotvorenjima, dužina L1je najmanje dvostruko veća od L3, a dužina L2je najmanje dvostruko veća od L4. U nekim otelotvorenjima, L1je dužine od 3 do 12 aminokiselinskih ostataka, L2je dužine od 3 do 14 aminokiselinskih ostataka, L3je dužine od 1 do 8 aminokiselinskih ostataka, a L4je dužine od 1 do 3 aminokiselinska ostatka. U nekim otelotvorenjima, L1je dužine od 5 do 10 aminokiselinskih ostataka, L2je dužine od 5 do 8 aminokiselinskih ostataka, L3je dužine od 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, a L4je dužine od 1 do 2 aminokiselinska ostatka. U nekim otelotvorenjima, L1je dužine 7 aminokiselinskih ostataka, L2je dužine 5 aminokiselinskih ostataka, L3je dužine 1 aminokiselinski ostatak, a L4je dužine 2 aminokiselinska ostatka. U nekim otelotvorenjima, L1je dužine 10 aminokiselinskih ostataka, L2je dužine 10 aminokiselinskih ostataka, L3je dužine 0 aminokiselinskih ostataka, a L4je dužine 0 aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i L4svaki ima nezavisno odabranu dužinu od 0 do 15 amino kiselina (npr. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ili 15 amino kiselina), pri čemu najmanje dva linkera imaju dužinu od 1 do 15 amino kiselina (npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina). U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i L4su dužine 0 aminokiselina.
[0158] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO 525). U nekim otelotvorenjim, L3sadrži sekvencu Asp-Lis-Thr-His-Thr (SEQ ID NO 525).
[0159] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu izvedenu iz sekvence koja se pojavljuje u prirodi na spoju između varijabilnog domena antitela i konstantnog domena antitela (npr. kao što je opisano u WO2012/135345). Na primer, u nekim otelotvorenjima, linker sadrži sekvencu koja se nalazi na prelazu između endogenog VHi CH1domena, ili između endogenog VLi CLdomena (npr. kapa ili lambda). U nekim otelotvorenjima, linker sadrži sekvencu koja se nalazi na prelazu između endogenog humanog VHi CH1domena, ili između endogenog humanog VLi CLdomena (npr. humanog kapa ili lambda).
[0160] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO 175). U nekim otelotvorenjim, L1sadrži sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO 175), L2sadrži sekvencu Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 176), L3sadrži sekvencu Ser, a L4sadrži sekvencu Arg-Thr. U nekim otelotvorenjima, L3sadrži sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO 175). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu Ser, L2sadrži sekvencu Arg-Thr, L3sadrži sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175), L4sadrži sekvencu Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 176).
[0161] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3i L4svaki nezavisno sadrži sekvencu izabranu od (GGGGS)n(gde je n ceo broj između 0 i 5; SEQ ID NO: 174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L2sadrži sekvencu TKGPS (SEQ ID NO: 106), L3sadrži sekvencu S, a L4sadrži sekvencu RT. U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L2sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104), L3je dužine 0 aminokiselina, a L4je dužine 0 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 148), L2sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 148), L3je dužine 0 aminokiselina, a L4je dužine 0 amino kiselina. U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 105), L2je dužine 0 aminokiselina, L3sadrži sekvencu GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 105), a L4je dužine 0 amino kiselina. U nekim otelotvorenjima, L1i L2imaju nula amino kiselina u dužini, a L3i L4oba sadrže nezavisno odabranu sekvencu između (GGGGS)n(pri čemu je n ceo broj između 0 i 5; SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148). U nekim otelotvorenjima, L3i L4imaju nula amino kiselina u dužini, a L1i L2oba sadrže nezavisno odabranu sekvencu između (GGGGS)n(pri čemu je n ceo broj između 0 i 5; SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148).
Fc regioni i konstantni domeni
[0162] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantnih domena teškog lanca imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, i treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina.
[0163] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića uključuje jednu ili dve varijante Fc. Izraz „varijanta Fc“ kako se ovde koristi odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana od nativnog Fc, ali još uvek sadrži mesto vezivanja za „salvage“ receptor, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primeri varijanti Fc i njihova interakcija sa „salvage“ receptorom su poznati u struci. Prema tome, izraz „varijanta Fc“ može da sadrži molekul ili sekvencu koja je humanizovana iz ne-humanog nativnog Fc. Štaviše, nativni Fc obuhvata regione koji se mogu ukloniti jer obezbeđuju strukturne karakteristike ili biološku aktivnost koja nije potrebna za vezujuće proteine poput antitela iz ovog otkrića. Dakle, izraz „varijanta Fc“ obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedno ili više nativnih Fc mesta ili ostataka, ili u kojima je jedno ili više Fc mesta ili ostataka modifikovano, a koji utiču ili su uključeni u: (1) formiranje disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćinom, (3) heterogenost N-terminala nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor koji nije „salvage“ receptor, ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
[0164] Da bi se poboljšao prinos vezujućih proteina, CH3domeni mogu biti promenjeni tehnologijom „ispupčenja u udubljenja“ koja je detaljno opisana sa nekoliko primera u, na primer, međunarodnoj publikaciji br. WO 96/027011, Ridgway et al.., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; and Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol.16: 677-81. Konkretno, površine interakcije dva CH3domena se menjaju da bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koja sadrže ova dva CH3domena. Svaki od dva CH3domena (od dva teška lanca) može biti „ispupčenje“, dok je drugi „udubljenje“. Uvođenje disulfidnog mosta dodatno stabilizuje heterodimere (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol.270: 26-35) i povećava prinos. U određenim otelotvorenjima, ispupčenje se nalazi na drugom paru polipeptida sa jednim varijabilnim domenom. U drugim otelotvorenjima, ispupčenje se nalazi na prvom paru polipeptida koji imaju unakrsnu orijentaciju. U nekim drugim otelotvorenjima, CH3domeni ne uključuju ispupčenje u udubljenju.
[0165] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutaciju „ispupčenja“ na drugom polipeptidnom lancu i mutaciju „udubljenja“ na trećem polipeptidnom lancu. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutaciju „ispupčenja“ na trećem polipeptidnom lancu i mutaciju „udubljenja“ na drugom polipeptidnom lancu. U nekim otelotvorenjima, mutacija „ispupčenja“ sadrži supstituciju(e) na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i/ili 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su S354C, T366W, T366Y, S354C i T366W, ili S354C i T366Y. U nekim otelotvorenjima, mutacija „ispupčenja“ sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i/ili 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su S354C i T366W. U nekim otelotvorenjima, mutacija „udubljenja“ sadrži supstituciju(e) na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 407 i/ili opciono, 349, 366 i/ili 368 i humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su Y407V ili Y407T, i opciono Y349C, T366S i/ili L368A. U nekim otelotvorenjima, mutacija „ispupčenja“ obuhvata supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su Y349C, T366S, L368A i Y407V.
[0166] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 366 i opciono 354 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije T366W ili T366Y i opciono S354C; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 407 i opciono 349, 366 i/ili 368 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y407V ili Y407T i opciono Y349C, T366S i/ili L368A.
[0167] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 407 i opciono 349, 366 i/ili 368 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y407V ili Y407T i opciono Y349C, T366S i/ili L368A; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 366 i opciono 354 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije T366W ili T366Y i opciono S354C.
[0168] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji koja odgovara poziciji 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu je aminokiselinska supstitucija T366W; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 366, 368 i/ili 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i/ili Y407V.
[0169] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži supstituciju(e) aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 366, 368 i/ili 407, i humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i/ili Y407V; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji koja odgovara poziciji 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu je aminokiselinska supstitucija T366W.
[0170] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C and T366W; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu drugi Fc region obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG1 Fc regioni. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni.
[0171] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži jednu ili više mutacija za poboljšanje poluživota seruma (videti npr. Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol.
176(1):346-56). U nekim otelotvorenjima, mutacija sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, i treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2 i CH3 konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, pri čemu prvi i/ili drugi Fc regioni sadrže supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutacije u obliku ispupčenja i udubljenja i jednu ili više mutacija za poboljšanje poluživota seruma. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG1 Fc regioni. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni.
[0172] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži jednu ili više mutacija za poboljšanje stabilnosti, npr. šarka regiona i/ili interfejsa dimera IgG4 (videti npr. Spiess, C. et al. (2013) J. Biol Chem., 288:26583-26593). U nekim otelotvorenjima, mutacija sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 228 i 409 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S228P i R409K. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, i treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i drugi Fc regioni humani IgG4 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 228 i 409 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S228P i R409K. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutacije u obliku ispupčenja i udubljenja i jednu ili više mutacija za poboljšanje stabilnosti. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni.
[0173] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži jednu ili više mutacija za poboljšanje prečišćavanja, npr. modulacijom afiniteta za reagens za prečišćavanje. Na primer, poznato je da heterodimerni vezujući proteini mogu biti selektivno prečišćeni od svojih homodimernih oblika ako jedan od dva Fc regiona heterodimernog oblika sadrži mutaciju(e) koje smanjuju ili eliminišu vezivanje za protein A, jer će heterodimerni oblik imati afinitet intermedijera za prečišćavanje zasnovano na proteinu A u odnosu na bilo koji homodimerni oblik, i koji se može selektivno eluirati iz proteina A, npr. korišćenjem različite pH (videti npr. Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943 ). U nekim otelotvorenjima, mutacija sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, a treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; i pri samo jedan, prvi ili drugi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutacije u obliku ispupčenja i udubljenja i jednu ili više mutacija za poboljšanje prečišćavanja. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG1 Fc regioni. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni.
[0174] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži jednu ili više mutacija za smanjenje efektorske funkcije, npr. ćelijska fagocitoza zavisna od antitela posredovana Fc receptorom (ADCP), citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i drugi Fc regioni humani IgG1 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, Fc regioni drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG1 regioni i pri čemu Fc regioni svaki sadrže supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; pri čemu su prvi i drugi Fc regioni humani IgG1 Fc regioni; i pri čemu svaki prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234, 235 i 329 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329A. U nekim otelotvorenjima, Fc region drugog i trećeg polipeptidnog lanca su humani IgG1 Fc regioni i pri čemu Fc regioni svaki sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234, 235 i 329 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329A. U nekim otelotvorenjima, mutacija sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije F234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina, i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži šarka region imunoglobulina i CH2i CH3konstantne domene teškog lanca imunoglobulina; i pri čemu i prvi i drugi Fc region sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 234 i 235 humanog IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije F234A i L235A. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži mutacije u obliku ispupčenja i udubljenja i jednu ili više mutacija za smanjenje efektorske funkcije. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG1 Fc regioni. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc region su humani IgG4 Fc regioni. Za dalji opis Fc mutacija na poziciji 329, videti npr. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem.276:6591-6604 i WO1999051642.
[0175] U nekim otelotvorenjima, tipovi mutacija opisani iznad mogu se kombinovati u bilo kom redosledu ili kombinaciji. Na primer, vezujući protein iz ovog otkrića može da sadrži dve ili više mutacija „ispupčenja“ i „udubljenja“, jednu ili više mutacija za poboljšanje poluživota seruma, jednu ili više mutacija za poboljšanje stabilnosti IgG4, ili više mutacija za poboljšanje prečišćavanja, i/ili jednu ili više mutacija za smanjenje efektorske funkcije opisane iznad.
[0176] U određenim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića sadrži: prvi polipeptidni lanac koji sadrži lambda CLdomen; CH3domen drugog polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; CH3domen trećeg polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i četvrti polipeptidni lanac koji sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354, 366, 435 i 436 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C, T366W, H435R i Y436F; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac sadrži kapa CLdomen; pri čemu CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; pri čemu CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i pri čemu četvrti polipeptidni lanac sadrži lambda CLdomen.
[0177] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića se prečišćava Protein A afinitetnom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom kapa lakog lanca (npr. korišćenjem KappaSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare), i opciono afinitetnom hromatografijom lambda lakog lanca (npr.. korišćenjem LambdaFabSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića se prečišćava Protein A afinitetnom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom lambda lakog lanca (npr. korišćenjem LambdaFabSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare), i opciono afinitetnom hromatografijom kapa lakog lanca (npr. korišćenjem KappaSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži dva Fc regiona, od kojih svaki sadrži CH3domen, a samo jedan od CH3domena sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića se prečišćava Protein A afinitetnom hromatografijom, zatim afinitetnom hromatografijom kapa lakog lanca (npr. korišćenjem KappaSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare), i zatim opciono afinitetnom hromatografijom lambda lakog lanca (npr. korišćenjem LambdaFabSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića se prečišćava Protein A afinitetnom hromatografijom, zatim afinitetnom hromatografijom lambda lakog lanca (npr. korišćenjem LambdaFabSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare), zatim opciono afinitetnom hromatografijom kapa lakog lanca (npr. korišćenjem KappaSelect smole prema uputstvima proizvođača; GE Healthcare) redom. Na primer, u nekim otelotvorenjima, vezujući protein je u kontaktu sa Proteinom A, eluiranim iz Proteina A pod uslovima pogodnim za izolovanje vezujućeg proteina dalje od vezujućih proteina koji sadrže ili 0 ili 2 CH3domena koji sadrže aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F, u kontaktu sa medijumom afiniteta kapa lakog lanca (npr. kako se koristi u smoli KappaSelect; GE Healthcare), i eluiranim iz afinitetnog medijuma kapa lakog lanca pod uslovima pogodnim za izolovanje vezujućeg proteina dalje od vezujućih proteina koji sadrže samo lambda CLdomene (npr. prema uputstvima proizvođača). Uslovi pogodni za eluiranje Proteina A su poznati u struci, uključujući bez ograničenja postepeni gradijent eluiranja od pH 4,5-2,8. U nekim otelotvorenjima, korišćen je Protein A ili varijanta Proteina A korisna za prečišćavanje proteina. U nekim otelotvorenjima, Protein A je vezan za supstrat ili smolu, npr. kao deo medijuma za hromatografiju. U nekim otelotvorenjima, nakon eluiranja iz medijuma afiniteta kapa lakog lanca, vezujući protein se dovodi u kontakt sa medijumom afiniteta lambda lakog lanca (npr. kako se koristi u LambdaFabSelect smoli; GE Healthcare), i eluira se iz medijuma afiniteta lambda lakog lanca pod uslovima pogodnim za izolovanje vezujućeg proteina dalje od vezujućih proteina koji sadrže samo kapa CLdomene (npr. prema uputstvima proizvođača). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića je detektovan korišćenjem HIC hromatografije U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži: prvi polipeptidni lanac koji sadrži lambda CLdomen; CH3domen drugog polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; CH3domen trećeg polipeptidnog lanca koji sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, 407, 435 i 436 humanog IgG1 ili IgG4 prema EU indeksu, pri čemu su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R i Y436F; i četvrti polipeptidni lanac koji sadrži kapa CLdomen. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein proizvodi ćelija domaćin. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je prečišćen iz medijuma ćelijske kulture ili ekstrakta ćelije domaćina U nekim otelotvorenjima, vezujuće proteine luči ćelija domaćin ili se proizvode i ekstrahuju iz ćelije domaćina (npr. pre nego što se stupi u kontakt sa Proteinom A). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je u medijumu ćelijske kulture ili ekstraktu ćelije domaćina kada je u kontaktu sa Proteinom A. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je prečišćen od drugih vezujućih proteina, polipeptida i/ili drugih ćelijskih komponenti.
[0178] U nekim otelotvorenjima, CH1, CH2, CH3 i CL trispecifičnih vezujućih proteina opisanih u ovom dokumentu mogu da sadrže bilo koju od CH1, CH2, CH3 i CL sekvenci vezujućih proteina 1-53.
Nukleinske kiseline
[0179] Standardne rekombinantne DNK metodologije se koriste za konstruisanje polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji formiraju vezujuće proteine, ugrađuju ove polinukleotide u rekombinantne ekspresione vektore i uvode takve vektore u ćelije domaćina.
Videti npr. Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvode u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u struci, ili kako je opisano u ovom dokumentu. Osim ako nisu date posebne definicije, nomenklatura koja se koristi u vezi sa ovim otkrićem, kao i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su opisane u ovom dokumentu su dobro poznate i obično se koriste u struci. Slično, konvencionalne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju, isporuku i lečenje pacijenata.
[0180] Drugi aspekti ovog otkrića se odnose na izolovane molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od vezujućih proteina opisanih u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina je operativno povezana sa heterolognim promoterom za direktnu transkripciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira vezujući protein. Promoter se može odnositi na kontrolne sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju transkripciju nukleinske kiseline. Prva sekvenca nukleinske kiseline je operativno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter je operativno vezan za kodirajuću sekvencu vezujućeg proteina ako promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence. Primeri promotera mogu uključivati, bez ograničenja, promotere dobijene iz genoma virusa (kao što su virus polioma, virus boginja ptica, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus, Simian Virus 40 (SV40) i slično), od heterolognih eukariotskih promotera (kao što je promotor aktina, promoter imunoglobulina, od promotera toplotnog šoka i slično), CAG-promotor (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), promotor fosfoglicerat kinaze (PGK)-promotor, tetraciklin-inducibilni promoter (Masui et al., Nucleic Acids Res.33:e43, 2005), lac sistem, trp sistem, tac sistem, trc sistem, glavni operater i regioni promotera faga lambda, promoter za 3-fosfoglicerat kinazu, promoteri kisele fosfataze kvasca i promoter faktora alfa parenja kvasca.
Polinukleotidi koji kodiraju vezujuće proteine iz ovog otkrića mogu biti pod kontrolom konstitutivnog promotera, inducibilnog promotera, ili bilo kojeg drugog prikladnog promotera opisanog u ovom dokumentu ili drugog prikladnog promotera koji će stručnjak iz ove stručne oblasti lako prepoznati.
[0181] U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina je ugrađena u vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor je ekspresioni vektor. Ekspresioni vektori mogu uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su operativno povezane sa polinukleotidom koji se eksprimira. Izraz „regulatorna sekvenca“ uključuje promotere, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr. signale poliadenilacije). Primeri pogodnih pojačivača mogu uključivati, bez ograničenja, sekvence pojačivača iz gena sisara (kao što su globin, elastaza, albumin, a-fetoprotein, insulin i slično), i sekvence pojačivača iz virusa eukariotskih ćelija (kao što je SV40 pojačivač na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani porekla replikacije, pojačivači adenovirusa i slično). Primeri pogodnih vektora mogu uključivati, na primer, plazmide, kozmide, episome, transpozone i virusne vektore (npr. adenovirusne, vakcinija virusne, Sindbis virusne, virusne malih boginja, virusne herpesa, lentivirusne, retrovirusne, povezane adenvirusne vektori, itd. ). Ekspresioni vektori se mogu koristiti za transfekciju ćelija domaćina, kao što su, na primer, ćelije bakterija, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara Biološki funkcionalni virusni i plazmidni DNK vektori sposobni za ekspresiju i replikaciju u domaćinu su poznati u struci i mogu se koristiti za transfekciju bilo koje ćelije od interesa.
[0182] Drugi aspekti ovog otkrića se odnose na vektorski sistem koji sadrži jedan ili više vektora koji kodiraju prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac bilo kog od vezujućih proteina opisanih u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, drugi vektor koji kodira drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, treći vektor koji kodira treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i četvrti vektor koji kodira četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina i drugi vektor koji kodira treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i drugi vektor koji kodira drugi i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina i drugi vektor koji kodira drugi i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, sistem vektora sadrži prvi vektor koji kodira prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. Jedan ili više vektora sistema vektora može biti bilo koji od vektora opisanih u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više vektora su ekspresioni vektori.
Izolovane ćelije domaćina
[0183] Ostali aspekti ovog otkrića se odnose na izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više izolovanih polinukleotida, vektora i/ili vektorskih sistema opisanih u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je bakterijska ćelija (npr. ćelija E. coli). U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija kvasca (npr. ćelija S. cerevisiae). U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija insekata. Primeri ćelija domaćina insekata mogu uključivati, na primer, ćelije Drosophila (npr. S2 ćelije), ćelije Trichoplusia ni (npr. High Five<™>ćelije) i ćelije Spodoptera frugiperda (npr. Sf21 ili Sf9 ćelije) U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija sisara. Primeri ćelija domaćina sisara mogu da obuhvataju, na primer, ćelije bubrega humanog embriona (npr.293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije), Expi293TM ćelije, CHO ćelije, ćelije bubrega mladunaca hrčaka (npr. BHK, ATCC CCL 10), sertoli ćelije miša (npr. TM4 ćelije), ćelije bubrega majmuna (npr. CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (npr. VERO-76, ATCC CRL-1587), ćelije humanog karcinoma grlića materice (npr. ATCCHELA CCL 2), ćelije bubrega psa (npr. MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bizamskog pacova (npr. BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane plućne ćelije (npr. W138, ATCC CCL 75), humane ćelije jetre (npr. Hep G2, HB 8065), ćelije tumora dojke miša (npr. MMT 060562, ATCC CCL51), TRI ćelije, MRC 5 ćelije, FS4 ćelije, humana linija hepatoma (npr. Hep G2) i ćelije mijeloma (npr. NS0 i Sp2/0 ćelije).
[0184] Drugi aspekti ovog otkriće se odnose na postupak proizvodnje bilo kog od vezujućih proteina opisanih u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje a) kultivisanje ćelije domaćina (npr. bilo koje od ćelija domaćina opisanih u ovom dokumentu) koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu, vektor i/ili vektorski sistem (npr. bilo koju od izolovanih nukleinskih kiselina, vektora i /ili vektorskih sistema koji su opisani u ovom dokumentu) pod takvim uslovima da ćelija domaćina eksprimira vezujući protein; i b) izolovanje vezujućeg proteina iz ćelije domaćina. Metode kultivisanja ćelija domaćina pod uslovima za ekspresiju proteina su dobro poznati stručnjaku iz ove struke. Metode izolovanja proteina iz kultivisanih ćelija domaćina su dobro poznate stručnjaku iz ove struke, uključujući, na primer, afinitetnu hromatografiju (npr. dvostepenu afinitetnu hromatografiju koja sadrži afinitetnu hromatografiju Proteina A praćenu hromatografijom isključivanja veličine).
Primene vezujućih proteina
[0185] Vezujući proteini se mogu koristiti u bilo kojoj poznatoj metodi ispitivanja, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i imunoprecipitacioni testovi za detekciju i kvantitaciju jednog ili više ciljnih antigena. Vezujući proteini će vezati jedan ili više ciljnih antigena sa afinitetom koji je prikladan za metod ispitivanja koji se koristi.
[0186] Za dijagnostičke primene, u određenim aspektima sadašnjeg otkrića, vezujući proteini mogu biti obeleženi ostacima koji se mogu detektovati. Detektabilni deo može biti bilo koji je sposoban da proizvede, bilo direktno ili indirektno, detektabilni signal. Na primer, deo koji se može detektovati može biti radioizotop, kao što su<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<125>I,<99>Tc,<111>In ili<67>Ga; fluorescentno ili hemiluminiscentno jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza ili peroksidaza rena.
[0187] U drugim aspektima ovog otkrića, vezujući proteini su takođe korisni za in vivo snimanje. Vezujući protein obeležen detektabilnim delom može se administrirati životinji, poželjno u krvotok, i na taj način se može ispitati prisustvo i lokacija obeleženog antitela u domaćinu. Vezujući protein može biti obeležen bilo kojim delom čije je prisustvo u telu životinje moguće otkriti, bilo nuklearnom magnetnom rezonancom, radiologijom ili drugim sredstvima za detekciju poznatim u struci.
[0188] Vezujući proteini se takođe mogu koristiti za aktivaciju ćelija, ciljanje tumora, neutralizaciju aktivnosti citokina, neutralizaciju virusne infekcije, kombinaciju više signalnih događaja, za lečenje karcinoma, artritisa i/ili inflamatornih poremećaja. Na primer, u nekim otelotvorenjima, vezujući protein specifično vezuje jedan, dva ili tri ciljna antigena izabrana između A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (takođe poznat kao VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (takođe poznat kao MCP-1), CCL3 (takođe poznat kao MIP-1a), CCL4 (takođe poznat kao MIP-1b), CCL5 (takođe poznat kao RANTES), CCL7 (takođe poznat kao MCP-3), CCL8 (takođe poznat kao mcp-2), CCL11 (takođe poznat kao eotaksin), CCL15 (takođe poznat kao MIP-1d), CCL17 (takođe poznat kao TARC), CCL19 (takođe poznat kao MIP-3b), CCL20 (takođe poznat kaoMIP-3a), CCL21 (takođe poznat kao MIP-2), CCL24 (takođe poznat kao MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (takođe poznat kao TECK), CCL26 (takođe poznat kao eotaksin-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (takođe poznat kao FCER2, receptor za IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (takođe poznat kao B7-1), CD86 (takođe poznat kao B7-2), CD122, CD137 (takođe poznat kao 41BB), CD137L, CD152 (takođe poznat kao CTLA4), CD154 (takođe poznat kao CD40L), CD160, CD272, CD273 (takođe poznat kao PDL2), CD274 (takođe poznat kao PDL1), CD275 (takođe poznat kao B7H2), CD276 (takođe poznat kao B7H3), CD278 (takođe poznat kao ICOS), CD279 (takođe poznat kao PD-1), CDH1 (takođe poznat kao E-kadherin), hitinaza, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (takođe poznat kao M-CSF), CSF-2 (takođe poznat kao GM-CSF), CSF-3 (takođe poznat kao GCSF), CX3CL1 (takođe poznat kao SCYD1), CXCL12 (takođe poznat kao SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1,ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (takođe poznat kao receptor za IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (takođe poznat kao b4 integrin), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptin, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaza-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (takođe poznat kao receptor za IL33), STEAP2, Syk kinaza, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (takođe poznat kao ko-receptor za IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCR1 (takođe poznat kao GPR5/CCXCR1). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više od gore navedenih ciljnih antigena su ciljni humani antigeni.
[0189] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ovog otkrića se administrira pacijentu kome je to potrebno za lečenje ili prevenciju karcinoma. Na primer, u nekim otelotvorenjima, vezujući protein obuhvata jedno mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za površinski protein T-ćelije i drugo mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za ciljni protein tumora (npr. dva mesta vezivanja antigena koja se specifično vezuju za površinske proteine T-ćelija i jedno mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za ciljni protein tumora, ili dva mesta vezivanja antigena koja se specifično vezuju za ciljne proteine tumora i jedno mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za površinski protein T-ćelija). U određenim otelotvorenjima, vezujući protein obuhvata mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za CD3, mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za CD28 i mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za ciljni protein tumora izabran između CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein se primenjuje istovremeno sa hemoterapijskim agensom. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek.
[0190] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein iz ovog otkrića se daje pacijentu kome je to potrebno za lečenje ili prevenciju inflamatorne bolesti ili poremećaja. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein se sastoji od tri mesta vezivanja antigena od kojih se svako specifično vezuje za citokinski ciljni protein izabran između IL-4, IL-13 i TNFa. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein se primenjuje istovremeno sa antiinflamatornim agensom. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek.
[0191] Otkriće se takođe odnosi na komplet koji se sastoji od vezujućeg proteina i drugih reagenasa korisnih za otkrivanje ciljnih nivoa antigena u biološkim uzorcima. Takvi reagensi mogu uključivati detektabilnu etiketu, serum za blokiranje, uzorke pozitivne i negativne kontrole i reagense za detekciju. U nekim otelotvorenjima, komplet se sastoji od sastava koji sadrži bilo koji vezujući protein, polinukleotid, vektor, vektorski sistem i/ili ćeliju domaćina opisanu u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, komplet se sastoji od posude i etikete ili umetka za pakovanje na posudi ili povezanog sa posudom. Odgovarajuće posude uključuju, na primer, bočice, epruvete, špriceve, kese sa rastvorom za infuziju itd. Posude mogu biti napravljene od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Posuda sadrži sastav koji je samostalan ili kombinovan sa drugim sastavom koji je efikasan za tretman, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može imati sterilni otvor za pristup (na primer, posuda može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probušiti hipodermičkom iglom). U nekim otelotvorenjima, etiketa ili uputstvo za pakovanje ukazuju na to da se sastav koristi za prevenciju, dijagnostikovanje i/ili lečenje izabranog stanja. U suprotnom, ili dodatno, proizvodni artikal ili komplet može dalje da se sastoji od druge (ili treće) posude koja se sastoji od farmaceutski prihvatljivog pufera, kao što su bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Terapijski sastavi vezujućeg proteina i njihova primena
[0192] Terapijski ili farmaceutski sastavi koji sadrže vezujuće proteine nalaze se u okviru obima otkrića. Takvi terapijski ili farmaceutski sastavi mogu sadržati terapijski efikasnu količinu vezujućeg proteina ili vezujućeg konjugata protein-lek, u mešavini sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim agensom za formulaciju odabranim tako da odgovara načinu primene.
[0193] Prihvatljivi materijali za formulaciju su poželjno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama.
[0194] Farmaceutski sastav može da sadrži formulacione materijale za modifikaciju, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, prozirnosti, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije sastava. Pogodni materijali za formulaciju uključuju, bez ograničenja, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), antimikrobna sredstva, antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum vodonik sulfit), pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline), sredstva za povećanje zapremine (kao što su manitol ili glicin), helatna sredstva (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)), kompleksirajuća sredstva (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin), punila, monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrin), proteine (kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini), sredstva za bojenje, arome i razblaživanje, emulgatore, hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon), polipeptide male molekulske mase, kontrajone koji formiraju so (kao što je natrijum), konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, tiomersal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid), rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol), šećerne alkohole (kao što su manitol fili sorbitol), sredstva za suspenziju, surfaktanti ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici; PEG; sorbitan estri; polisorbati kao što su polisorbat 20 ili polisorbat 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksalapal), agense za poboljšanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol), agense za poboljšanje toničnosti (kao što su halogenidi alkalnih metala - poželjno natrijum ili kalijum hlorid - ili manitol sorbitol), sredstva za isporuku, razblaživači, ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi (videti npr. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), i naknadna izdanja iste publikacije).
[0195] Optimalni farmaceutski sastav će odrediti stručnjak u oblasti u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta primene, formata isporuke i željene doze. Takvi sastavi mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu klirensa vezujućeg proteina in vivo.
[0196] Primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskom sastavu može biti vodene ili nevodene prirode. Na primer, pogodan vehikulum ili nosač za injekciju može biti voda, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjena drugim materijalima uobičajenim u sastavima za parenteralnu primenu. Neutralni puferirani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dodatni primerni vehikulumi. Drugi primerni farmaceutski sastavi obuhvataju Tris pufer od oko pH 7,0-8,5, ili acetatni pufer od oko pH 4,0-5,5, koji dalje može uključivati sorbitol ili odgovarajuću zamenu. U jednom otelotvorenju otkrića, sastavi vezujućih proteina mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem izabranog sastava koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim formulacionim agensima u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, vezujući protein se može formulisati kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.
[0197] Farmaceutski sastavi otkrića mogu se izabrati za parenteralnu ili supkutanu isporuku. Alternativno, sastavi se mogu izabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, npr. oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih sastava ulazi u sklop veštine u stručnjaka u ovoj oblasti.
[0198] Komponente sastava su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene. Na primer, puferi se koriste za održavanje sastava na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.
[0199] Kada se razmatra parenteralna primena, terapijski sastavi za primenu mogu biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji sadrži željeni vezujući protein u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodno sredstvo za parenteralno ubrizgavanje je sterilna destilovana voda u kojoj je vezujući protein formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno konzerviran. Još jedan preparat može uključivati formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injekcione mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koji obezbeđuju kontrolisano ili održivo oslobađanje proizvoda koji se zatim može isporučiti depo injekcijom. Može se koristiti i hijaluronska kiselina, a to može imati za posledicu promociju održivog trajanja u cirkulaciji. Druga pogodna sredstva za uvođenje željenog molekula uključuju implantabilne uređaje za isporuku leka.
[0200] U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav se može formulisati za inhalaciju. Na primer, vezujući protein se može formulisati kao suvi prah za inhalaciju. Rastvori za inhalaciju vezujućih proteina takođe se mogu formulisati sa pogonskim gasom za isporuku aerosola. U još jednom otelotvorenju, rastvori se mogu nebulizovati.
[0201] Takođe se razmatra mogućnost oralne primene određenih formulacija. U jednom otelotvorenju otkrića, vezujući proteini koji se primenjuju na ovaj način mogu se formulisati sa ili bez onih nosača koji se obično koriste u mešanju čvrstih oblika doziranja kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može biti dizajnirana da oslobodi aktivni deo formulacije u tački u gastrointestinalnom traktu kada je bioraspoloživost maksimizirana i predsistemska razgradnja minimizirana. Mogu se uključiti dodatni agensi kako bi se olakšala apsorpcija vezujućeg proteina. Takođe se mogu koristiti razblaživači, arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, maziva, sredstva za suspenziju, sredstva za dezintegraciju tableta i veziva.
[0202] Drugi farmaceutski sastav može uključivati efikasnu količinu vezujućih proteina u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem vehikulumu, rastvori se mogu pripremiti u obliku jedinične doze. Pogodni ekscipijensi uključuju, bez ograničenja, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili sredstva za vezivanje, kao što su skrob, želatin ili akacija; ili sredstva za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk.
[0203] Dodatni farmaceutski sastavi otkrića biće očigledni stručnjacima u oblasti, uključujući formulacije koje uključuju vezujuće proteine u formulacijama sa održivom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike za formulisanje različitih drugih sredstava za održivu ili kontrolisanu isporuku, kao što su nosači lipozoma, bio-erodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u oblasti. Dodatni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice sa održivim oslobađanjem mogu uključivati poliestre, hidrogelove, polilaktide, kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamata, poli(2-hidroksietil-metakrilat), etilen vinil acetat ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Sastavi sa produženim oslobađanjem takođe mogu uključivati lipozome, koji se mogu pripremiti bilo kojom od nekoliko metoda koje su poznate u struci.
[0204] Farmaceutski sastavi koji se koriste za primenu in vivo obično moraju biti sterilni. To se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Ako je sastav liofilizovan, sterilizacija ovom metodom može se sprovesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Sastav za parenteralnu primenu može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralni sastavi se obično stavljaju u posudu koja ima sterilni otvor za pristup, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probušiti hipodermičnom iglom.
[0205] Kada je farmaceutski sastav formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji zahteva rekonstituciju pre primene.
[0206] Otkriće takođe obuhvata komplete za proizvodnju jedinice za primenu jedne doze. Svaki komplet može da sadrži jednu posudu sa osušenim proteinom i drugu posudu sa vodenom formulacijom. U obim ovog otkrića uključeni su i kompleti koji sadrže jednokomorne i višekomorne prethodno napunjene špriceve (npr. špriceve za tečnost i liošpriceve).
[0207] Efikasna količina farmaceutskog sastava vezujućeg proteina koji će se terapijski primenjivati zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u oblasti će znati da odgovarajući nivoi doza za lečenje mogu varirati, delimično, u zavisnosti od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi vezujući protein, puta primene i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. Shodno tome, kliničar može titrirati dozu i modifikovati put primene kako bi se postigao optimalan terapijski efekat.
[0208] Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara vezujućeg proteina u formulaciji koja se koristi. Tipično, kliničar će primenjivati sastav dok se ne postigne doza kojom se postiže željeni efekat. Sastav se stoga može primeniti u vidu jedne doze, u vidu dve ili više doza (koje mogu ili ne moraju sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili u vidu kontinuirane infuzije putem uređaja za implantaciju ili katetera. Dalje usavršavanje odgovarajuće doze rutinski vrše stručnjaci prosečnog znanja u oblasti i ono se nalazi u okviru zadataka koje oni rutinski obavljaju. Odgovarajuće doze se mogu ustanoviti korišćenjem odgovarajućih podataka o dozi i odgovoru.
[0209] Put primene farmaceutskog sastava je u skladu sa poznatim metodama, npr. oralno; injekcijom intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimalnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijskim, intraportalnim ili intralezionim putevima; sistemima sa produženim oslobađanjem; ili implantacionim uređajima. Po želji, sastavi se mogu primeniti bolus injekcijom ili kontinuirano infuzijom ili uređajem za implantaciju.
[0210] Sastav se takođe može primeniti lokalno implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na kome je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. Kada se koristi medicinsko sredstvo za implantaciju, medicinsko sredstvo se može implantirati u bilo koje odgovarajuće tkivo ili organ, a isporuka željenog molekula može biti putem difuzije, bolusa sa vremenskim otpuštanjem ili kontinuirane primene.
[0211] U nekim otelotvorenjima, ovo otkriće se odnosi na najmanje jedan od ovde opisanih vezujućih proteina za primenu u metodi prevencije i/ili lečenja proliferativne bolesti ili poremećaja (npr. karcinoma). U nekim otelotvorenjima, metoda obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine najmanje jednog od ovde opisanih vezujućih proteina. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje u kombinaciji sa jednom ili više terapija protiv karcinoma (npr. bilo koja terapija protiv karcinoma poznata u struci). U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje pre jedne ili više terapija protiv karcinoma. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje istovremeno sa jednom ili više terapija protiv karcinoma. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje nakon jedne ili više antiretrovirusnih terapija.
[0212] U nekim otelotvorenjima, ovo otkriće se odnosi na najmanje jedan od ovde opisanih vezujućih proteina za primenu u metodi prevencije i/ili lečenja inflamatorne bolesti ili poremećaja (npr. karcinoma). U nekim otelotvorenjima, metoda obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine najmanje jednog od ovde opisanih vezujućih proteina. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek.. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje u kombinaciji sa jednom ili više antiinflamatornih terapija (npr. bilo koja antiinflamatorna terapija poznata u struci). U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje pre jedne ili više antiinflamatorne terapije. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje istovremeno sa jednom ili više antiinflamatornih terapija. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje nakon jedne ili više antiinflamatornih terapija.
PRIMERI
[0213] Primeri koji slede su ilustrativni za specifična otelotvorenja pronalaska i različite primene istih. Oni su navedeni samo u svrhu objašnjenja i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska na bilo koji način.
Primer 1: Materijali i metode
[0214] Sledeći materijali i metode su korišćeni za eksperimente opisane u Primerima 2-5.
Dizajn trispecifičnih antitela
[0215] Šematski prikaz opšteg dizajna trispecifičnog antitela je ilustrovan na SL.1A-1C. Pojedinačna trispecifična antitela su dizajnirana na osnovu 5 parametara: 1) Izbor mesta vezivanja antitela; 2) Razmatranje položaja svakog mesta vezivanja; 3) Izbor linkera za bispecifični krak vezivanja (npr. teški lanac/laki lanac B na SL.1C); 4). Integracija mutacija „ispupčenja“ i „udubljenja“ u odgovarajuće polovine antitela; 5) Izbor Fc izotipa (IgG1 ili IgG4). Nakon sastavljanja aminokiselinskih sekvenci za svaki trispecifični molekul, četiri gena za svako trispecifično At su sintetizovana korišćenjem humanih preferiranih kodona (CambrY Applied Biosciences, Cambridge, MA, USA) i klonirana u eukariotski ekspresioni vektor.
Proizvodnja i prečišćavanje trispecifičnih antitela
[0216] Trispecifična antitela su proizvedena prolaznom transfekcijom 4 ekspresiona plazmida u Expi293 ćelije korišćenjem kompleta za transfekciju ExpiFectamine<™>293 (Thermo Fisher Scientific) u skladu sa protokolom proizvođača. Ukratko, 25% (w/w) svakog plazmida je razblaženo u Opti-MEM, pomešano sa prethodno razblaženim reagensom ExpiFectamine 20-30 minuta na sobnoj temperaturi (ST) i dodato u Expi293 ćelije (2,5×10<6>ćelija/ml).
Optimizacija transfekcije za određivanje najboljeg odnosa plazmida je često korišćena da bi se proizvelo trispecifično antitelo sa dobrim prinosom i čistoćom.
[0217] Oko 4-5 dana nakon transfekcije, supernatant iz transfektovanih ćelija je sakupljen i filtriran kroz filter jedinicu od 0,45 µm (Nalgene). Trispecifično antitelo u supernatantu je prečišćeno korišćenjem postupka u 3 koraka. Najpre je korišćeno afinitetno prečišćavanje proteina A, a vezano At je eluirano korišćenjem „IgG pufera za eluiranje“ (Thermo Fisher Scientific). Zatim je izvršena dijaliza proizvoda u odnosu na PBS (pH 7,4) preko noći sa 2 promene PBS pufera. Sav precipitat je očišćen filtracijom kroz jedinicu za filtriranje od 0,45 µm (Nalgene) pre sledećeg koraka. U trećem koraku je korišćeno prečišćavanje hromatografijom sa isključivanjem veličine (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200pg ili Hiload 26/600 Superdex 200pg, GE Healthcare) za uklanjanje agregata i različitih vrsta u preparatima. Frakcije su analizirane na redukovanom i neredukovanom SDS-PAGE da bi se identifikovale frakcije koje sadrže monomerno trispecifično antitelo pre njihovog kombinovanja. Prečišćeno antitelo se može podeliti na alikvote i čuvati na -80°C dugoročno.
ELISA analize
[0218] Vezujuća svojstva prečišćenih antitela su analizirana ili korišćenjem ELISA ili korišćenjem SPR metoda. U slučaju ELISA analize, odgovarajući antigeni za svako mesto vezivanja u trispecifičnom antitelu su korišćeni za oblaganje imunoploče sa 96 bazenčića (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) preko noći na 4°C koristeći 2 µg/ml svakog antigena u PBS (pH 7,4). Obložena ploča je blokirana korišćenjem 5% obranog mleka 2% BSA u PBS tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledilo pranje sa PBS+0,25% Tween 20 tri puta (Aqua Max 400, Molecular Devices). Pripremljena su serijska razblaženja antitela (trispecifična i kontrolna At) i dodata na ELISA ploče (100 µl/bazenčiću u duplikatu), inkubirana na sobnoj temperaturi jedan sat, nakon čega je usledilo ispiranje 5 puta sa PBS+0,25% Tween 20.
[0219] Nakon ispiranja, HRP konjugovani sekundarni anti-humani Fab (1:5000, kat. br.109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) je dodat u svaki bazenčić i inkubiran na ST tokom 30 minuta. Nakon ispiranja 5 puta sa PBS+0.25% Tween 20, 100 µl supstrata peroksidaze TMB Microwell (KPL, Gaithersburg, MD, USA) dodato je u svaki bazenčić. Reakcija je završena dodavanjem 50 µl 1M H2SO4i OD450je izmeren korišćenjem SpectraMax M5 (Molecular Devices) i analiziran korišćenjem softvera SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices). Finalni podaci su preneti u softver GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, USA) i ucrtani kao što je prikazano. Vrednost EC50 je izračunata korišćenjem istog softvera.
SPR analize
[0220] Dva para teških i lakih lanaca su izabrana za kompletnu kinetičku analizu. Kinetička karakterizacija prečišćenih antitela izvršena je tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) na uređaju BIACORE 3000 (GE Healthcare). Korišćen je test hvatanja pomoću hvatanja antitela specifičnog za oznake i orijentacije ispitivanih antitela. Za hvatanje proteinskih konstrukata koji sadrže Fc korišćen je komplet za hvatanje humanih antitela (GE Healthcare), za hvatanje proteinskih konstrukata koji sadrže His oznaku korišćen je His komplet za hvatanje (GE Healthcare). Antitelo za hvatanje je imobilizovano preko primarnih aminskih grupa (11000 RU) na istraživačkom CMS čipu (GE Life Sciences) koristeći standardne procedure. Analizirano antitelo je uhvaćeno pri brzini protoka od 10 µL/min sa podešenom vrednošću RU koja bi rezultirala maksimalnim signalom vezivanja analita od tipično 30 RU.
[0221] Za primerni test, rekombinantni humani IL13 (kataloški br. IL012) i humani IL4 (kataloški br. IL004) pribavljeni su od kompanije Millipore, rekombinantni humani TNFα (kataloški br. H8916) pribavljen je od kompanije Sigma Aldrich. Kinetika vezivanja je izmerena u odnosu na rekombinantni humani IL4 i IL13 u opsegu koncentracija između 0,1 do 3 nM za IL4 i 0,8 do 25 nM za IL13. Za humani TNFα korišćen je koncentracioni opseg od 3 do 100 nM. Kao pufer za analizu korišćen je HBS EP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% površinski aktivne supstance P20) pri brzini protoka od 30 µl/min. Površine čipa su regenerisane rastvorom za regeneraciju odgovarajućeg kompleta za hvatanje. Kinetički parametri su analizirani i izračunati u programskom paketu BIAevaluation v4.1 korišćenjem protočne ćelije bez uhvaćenog antitela kao reference i 1:1 Langmuir modela vezivanja sa prenosom mase. Za proučavanje istovremenog vezivanja antigena, trispecifična antitela su uhvaćena površinom za hvatanje antihumanih antitela. Antigeni su korišćeni u pojedinačnim koncentracijama sa IL4 od 3 nM, IL13 od 25 nM i TNFα od 100 nM. Da bi se pokazalo istovremeno vezivanje sva tri antigena, ubrizgana je smeša IL4, IL13 i TNFα. U odvojenim analitičkim ciklusima, IL13 je ubrizgan samostalno, praćeno ubrizgavanjem IL4 ili TNFα, nakon čega je usledilo istovremeno ubrizgavanje IL4/TNFα ili istovremeno ubrizgavanje TNFα/IL4. Upoređen je konačni odgovor izmeren u svakom ciklusu kako bi se pokazala sličnost uzastopnog vezivanja dva ili tri antigena i istovremenog vezivanja smeše sva tri antigena.
In vitro testovi aktivacije i proliferacije T ćelija
[0222] Humane PBMC su prečišćene iz „buffy coat“-a pribavljenog od kompanije Blood Research Component (Brookline, MA, SAD) metodom Ficoll-Paque Plus. Ukratko, sveži „buffy coat“ je najpre razblažen u odnosu 1:3 u PBS (pH 7,4) i temeljno pomešan sa Ficoll-Paque Plus rastvorom (Ficoll) pre upotrebe okretanjem bočice nekoliko puta. U svaku Leucosep<®>epruvetu dodat je gradijentni medijum gustine od 15 mL i centrifugiran je 30 sekundi na 1000 x g, ST. Medijum se sada nalazi ispod porozne barijere.30-40 mL razblaženog „buffy coat“-a je zatim pažljivo sipano u svaku Leucosep epruvetu i centrifugirano na 800 x g 15 minuta na sobnoj temperaturi, sa isključenom kočnicom i maksimalnim ubrzanjem od 5. Uklonjen je sloj plazme, a ostatak supernatanta, koji je sadržao obogaćene PBMC, prebačen je u novu epruvetu (Leucosep epruveta nije držana u obrnutom položaju duže od 2 sekunde). Obogaćeni PBMC su isprani sa 45 ml PBS i centrifugirani na 250 x g, 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ispiranje je ponovljeno, a više epruveta je kombinovano u jednu epruvetu. Ćelije su resuspendovane u 20 mL PBS i prebrojane pomoću Bio-Rad TC20.
[0223] Da bi se uspostavio in vitro test aktivacije T ćelija, prečišćene humane PBMC su resuspendovane u medijumu za kultivisanje (RPMI1640 sa 10% FBS i dopunjeni glutaminom/streptomicinom)(Thermo Fisher Scientific)(10<6>ćelija/ml). Indikovane koncentracije različitih trispecifičnih i kontrolnih antitela dodate su u svaki bazenčić ili su korišćene za premazivanje ploče pre upotrebe kao što je opisano kod Stebbings, R. et al.
(2007) J. Immunol.179:3325-3331, i inkubirane 16-24 sata u inkubatoru za kultivaciju tkiva. Ćelije su centrifugirane, a supernatant je ili prikupljen za merenje oslobađanja citokina, ili odbačen. Ćelije su obojene florescentno obeleženim antitelima za T ćelijske markere (CD3, CD4, CD8, itd.) i aktivacione markere (CD69, CD62L, itd.), a analizirane su ispitivanjem uzoraka na protočnom citometru Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), nakon čega je usledila analiza pomoću softvera Flowjo (FlowJo v10) i ucrtavanje na prikazan način.
[0224] Da bi se uspostavio in vitro test proliferacije T ćelija, prečišćene humane PBMC su resuspendovane u medijumu za kultivisanje (RPMI1640 sa 10% FBS i dopunjeno glutaminom/streptomicinom) (Thermo Fisher Scientific)(10<6>ćelija/ml). Indikovane koncentracije različitih trispecifičnih i kontrolnih antitela dodate su u svaki bazenčić i inkubirane 1-7 dana u inkubatoru za kultivaciju tkiva. Ćelije su centrifugirane, a supernatant je ili prikupljen za merenje oslobađanja citokina, ili odbačen. Ćelije su obojene florescentno obeleženim antitelima za T ćelijske markere (CD3, CD4, CD8, itd.) i aktivacione markere (CD69, CD62L, itd.), a analizirane su ispitivanjem uzoraka na protočnom citometru Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), nakon čega je usledila analiza pomoću softvera Flowjo (FlowJo v10) i ucrtavanje na prikazan način.
In vitro test ubijanja ćelija
[0225] Prečišćene humane PBMC koristile su se za in vitro testove ubijanja za različite ćelije karcinoma koristeći različita trispecifična antitela. Ukratko, test ubijanja je postavljen u ploču sa V-dnom sa 96 bazenčića. Na svakoj ploči, 40 ml PBMC od svakog donatora je postavljeno pri vrednosti od 2×10^6 ćelija/ml, a pripremljeno je 30 ml PKH26 (Sigma br. MINI26) označenih ciljnih ćelija pri vrednosti od 2,5×10^5 ćelija/ml (4 µL boje za bojenje do 1×10^7 ćelija). Prvih 20 µL/bazenčiću ispitivanih proteina u različitim koncentracijama ili PMA dodato je u svaki bazenčić, nakon čega je dodato 80 µL/bazenčiću označenih ciljnih ćelija u svaki bazenčić (2×10^4 ćelije/bazenčić).100 µL PBMC je zatim dodato u svaki bazenčić, dostigavši E:T=10:1 po bazenčiću (2×10^5 ćelija/bazenčić), i inkubirano 24 sata na 37°C, 5% CO2 u inkubatoru. Ćelije su centrifugirane, a supernatant je ili prikupljen za merenje oslobađanja citokina, ili odbačen. Ćelije su obojene Vivid LIVE/DEAD<™>fiksirajućim puferom za bojenje mrtvih ćelija ljubičaste boje (Life Technology br. L34955) (pufer za bojenje je pripremljen dodavanjem 60 µL Vivid reagensa u 60 ml PBS). Ćelije su resuspendovane u puferu za bojenje od 100 µL inkubacijom 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon ispiranja ćelija sa 1×PBS, ćelije su resuspendovane u 200µL PBS sa 0,5% paraformaldehida, a PKH26+ Vivid+ ćelije karcinoma su prikupljene Fortessa protočnim citometrom (Beckton Dickinson, San Jose, CA), nakon čega je usledila analiza pomoću softvera Flowjo. Procenat ubijanja je izračunat kao specifično ubijanje-spontano ubijanje/ukupan broj ćelija i iscrtan kao što je prikazano.
Test oslobađanja citokina
[0226] Za merenje koncentracija inflamatornih citokina u testovima in vitro aktivacije, testovima in vitro ubijanja, testovima in vivo aktivacije kod CD34+ miševa sa NSG humanizovanim ćelijama pupčane vrpce i studiji toksičnosti, prikupljen je supernatant ćelijske kulture, a uzorci seruma su razblaženi u skladu sa protokolom proizvođača koristeći Miliplex Human High Sensitivity T cell 13-plex Kit (EMD Millipore). Oni su naknadno analizirani korišćenjem sistema EMD Millipore MAGPIX<®>i softvera MILLIPLEX<®>Analyst 5.1.
In vivo modeli miševa i studije efikasnosti
[0227] Kao in vivo model miševa korišćeni su miševi NSG sa presađenim humanim CD34+ hematopoetskim matičnim ćelijama (hu-CD34). Ovi miševi razvijaju višelinijske humane imunološke ćelije i predstavljaju validiranu platformu za imunoonkološke studije efikasnosti (videti npr. Shultz, L.D. et al. (2014) Cold Spring Harb. Protoc.2014:694-708). Hu-CD34<+>NSG miševi se proizvode ubrizgavanjem CD34<+>hematopoetskih matičnih ćelija, pokazujući efikasno višelinijsko presađivanje populacija humanih imunih ćelija uključujući T ćelije, B ćelije i neke druge populacije (McDermott, S.P. et al. (2010) Blood 116:193-200).
Višelinijska hematopoeza se javlja u roku od 12 nedelja. Presađivanje je stabilno duže od godinu dana bez bolesti grafta protiv domaćina.
[0228] Za studiju efikasnosti pomoću hu-CD34 NSG miševa, miševi su kupljeni od The Jackson Laboratory (Maine, USA), a populacije humanih ćelija su validirane pre upotrebe. U načelu, 5 ×10<6>tumorskih ćelija pomešanih u Matrigel-u (BD Biosciences) (50% v/v) korišćeno je za inokulaciju tumorom kod svakog miša. Kada je veličina tumora dostigla opseg od 100-150 mm<3>, miševi su izabrani i randomizovani u grupe za ispitivanje. Antitela su davana intravenski u predviđenim dozama 3 puta nedeljno. Telesna težina je praćena 1-3 puta nedeljno. Veličina tumora je merena merenjem tumora kaliperom 1-3 puta nedeljno. Svi miševi su terminisani kada je veličina tumora dostigla 1.500 mm<3>, ili 24 sata nakon poslednje doze. Terminalni uzorci krvi (0,3 ml) su sakupljeni u epruvete za separaciju seruma, pomešani nežnim okretanjem pet puta i stavljeni u stalak za epruvete. Takođe su prikupljeni i izmereni terminalni tumori pre nego što su stavljeni u fiksativ za imunohistohemijsku analizu.
[0229] Ljudski PBMC humanizovani (hu-PBMC) NSG miševi su korišćeni kao još jedan in vivo model miša. Ovi miševi se proizvode ubrizgavanjem prečišćenih humanih PBMC od zdravih donatora, koji imaju najbržu stopu usađivanja pomoću mononuklearnih ćelija periferne krvi odraslih i omogućavaju kratkoročne studije koje zahtevaju jak efektor i memorijske T ćelije i funkciju NK ćelija, i pogodni su za kratkotrajne studija efikasnosti (3-4 nedelje) zbog bolesti grafta protiv domaćina.
[0230] Za studiju efikasnosti u kojoj su korišćeni hu-PBMC NSG miševi, 8-10 nedelja stari NSG miševi (kat. br.005557, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ) pribavljeni su od he Jackson Laboratory (Maine, USA). Svaki miš je inokulisan sa 5 ×10<6>tumorskih ćelija pomešanih u Matrigel-u (BD Biosciences) (50% v/v). Kada je veličina tumora dostigla opseg od 50-100 mm<3>, 10 ×10<6>humanih PBMC od zdravog donora je rekonstituisano na svakog miša. Rekonstitucija humanih ćelija je validirana sledećeg dana. Kada je veličina tumora dostigla opseg od 100-150 mm<3>, miševi su izabrani i randomizovani u grupe za ispitivanje. Antitela su davana intravenski u predviđenim dozama 3 puta nedeljno. Telesna težina je praćena 1-3 puta nedeljno. Veličina tumora je merena merenjem tumora kaliperom 1-3 puta nedeljno. Svi miševi su terminisani kada je veličina tumora dostigla 1.500 mm<3>ili 24 sata nakon poslednje doze. Terminalni uzorci krvi (0,3 ml) su sakupljeni u epruvete za separaciju seruma, pomešani nežnim okretanjem pet puta i stavljeni u stalak za epruvete. Takođe su prikupljeni i izmereni terminalni tumori pre nego što su stavljeni u fiksativ za imunohistohemijsku analizu.
Ispitivanje podnošljivosti i farmakokinetike NHP
[0231] Sve studije NHP sprovela je kompanija Covance (Princeton, New Jersey, USA) u skladu sa protokolom Covance ICUCA. U svim studijama korišćeni su mužjaci Cynomolgus majmuna koji prethodno nisu uzimali lekove i proteine ili oni koji prethodno nisu uzimali proteine. Na osnovu dizajna studije, majmuni su izabrani i grupisani za svako trispecifično antitelo. Antitelo je dato intravenskom infuzijom u trajanju od 1 sata putem vene safene. Povećane doze su davane uzastopnim danima u slučaju malih doza (<10 µg/kg) i u intervalima od 1-2 dana u slučaju većih doza (> 10 µg/kg) za potrebe posmatranja. Uzorci krvi su prikupljeni 0 sati (samo 1. dan), 0,5 sata (sredina infuzije), 1 i 6 sati od početka infuzije od svih životinja, nakon svake doze, kao što je i navedeno. Dodatni neplanirani uzorci krvi prikupljeni su po nahođenju glavnog istraživača, patologa i/ili kliničkog veterinara. Sve životinje su vraćene u koloniju 60. dana. PBMC i serum iz uzoraka krvi pripremljeni su standardnim metodama i sačuvani za buduću analizu.
Luciferazni reporterski test
[0232] GloResponse<™>IL2-luc2P Jurkat ćelije, za odmrzavanje i upotrebu (Promega br. dela CS 187002) i GloResponse<™>NFAT-Luc2 Jurkat ćelije (Promega kat. br. CS 176401) pribavljene su od kompanije Promega (WI, sad) i pripremljene za upotrebu u skladu sa protokolom proizvođača.
[0233] Ukratko, ćelije su odmrzavane 2 minuta u vodenom kupatilu pri temperaturi od 37°C i lagano prebačene u konusnu centrifugalnu cev od 15 ml koja je sadržala 10 ml prethodno zagrejanog medija R10. Epruveta je centrifugirana na 300g 5 minuta na ST. Supernatant je uklonjen, a ćelije su resuspendovane u prethodno zagrejanom medijumu R10 od 20 mL i prebačene u tikvicu za kulturu zapremine 75 cm2, nakon čega je usledila inkubacija u inkubatoru kulture tkiva pri temperaturi od 37°C dok ćelije nisu porasle i postale stabilne (~3-4 dana). Ćelije su deljene dva puta nedeljno na 0,1e6 ćelija/ml. ćelije su održavane u medijumu R10+Higromicin B za selekciju. Ćelije su korišćene u testovima ~7 dana nakon odmrzavanja.
[0234] Za stimulaciju antitela, trispecifična ili kontrolna antitela su pripremljena u različitim koncentracijama i serijski razblažena u PBS-u.25 µL antitela je podeljeno po bazenčiću. Za At vezana za ploču, korišćena je Maxisorp ploča koja je inkubirana na 4°C preko noći. Za rastvorljive At, korišćena je ploča sa U-dnom. Reporterske ćelije su resuspendovane na 0,3-0,5 e6/ml, a 175uL ćelije su dodate u svaki bazenčić i inkubirane u inkubatoru na 37°C CO2tokom 6 sati. Ploča je zatim izvađena iz inkubatora i ostavljena da se izjednači sa temperaturom okoline (10-15min). Zatim je 50 µl Bio-Gio<™>reagensa (Promega kat. br.
G7941) (temperatura okoline) dodato u svaki bazenčić na ploči za analizu. Posle inkubacije od 5 minuta, merena je aktivnost luminiscencije pomoću MicroBeta2 LumiJET brojača mikroploča (Perkin Elmer; vreme čitanja od 1 s). Podaci su iscrtani pomoću softvera GraphPad Prism.
Konformaciona stabilnost
[0235] Merenja termostabilnosti (npr. tačke topljenja, Tm) određena su pomoću diferencijalne skenirajuće fluorimetrije (DSF). Uzorci su razblaženi u D-PBS puferu (Invitrogen) do konačne koncentracije od 0,2 µg/µl uključujući 4x koncentrovani rastvor SYPRO-Orange boje (Invitrogen, 5000x zaliha u DMSO) u D-PBS-u u beloj poluobloženoj ploči sa 96 bazenčića (BIORAD). Sva merenja su izvršena u duplikatu pomoću MyiQ2 PCR instrumenta za merenje u realnom vremenu (BIORAD). Negativne krive prvog izvoda (-d(RFU)/dT) krive topljenja su generisane u softveru iQ5 v2.1 (BIORAD). Podaci su zatim izvezeni u Microsoft Excel za određivanje Tm i grafički prikaz podataka.
Merenja IC50 vrednosti
Detekcija aktivnosti antitela protiv IL-4 i IL-13 sa reporterskom ćelijskom linijom
[0236] Aktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv citokina IL4 i IL13 su određene u komercijalno dostupnim HEK-Blue IL-4/IL-13 reporter ćelijama (InvivoGen). HEK-Blue IL-4/IL-13 ćelije su dizajnirane da prate aktivaciju STAT6 putanje od strane IL-4 ili IL13.
Stimulacija ćelija sa bilo kojim citokinom dovodi do proizvodnje embrionalne alkalne fosfataze (SEAP) izlučene reporterskim genom koja se može meriti u supernatantu kulture pomoću QUANTI-Blue testa. Za testiranje aktivnosti antitela protiv IL4 ili IL13, citokini su predinkubirani 1 sat sa različitim koncentracijama antitela i dodati u 50.000 HEK-Blue IL-4/IL-13 ćelija. Indukcija SEAP posredovana citokinom je merena nakon 24 sata inkubacije u supernantu ćelijske kulture pomoću QUANTI-Blue testa (InvivoGen). Svaki eksperiment je izveden sa n = 3 tačke podataka za svaku koncentraciju antitela. Polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) za svako antitelo izračunata je putem interne aplikacije Biostat-Speed V2.0 (Sanofi).
Detekcija aktivnosti antitela protiv TNFα sa reporterskom ćelijskom linijom
[0237] Aktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv TNFa su određene korišćenjem komercijalno dostupnih HEK-Blue TNF-a reporter ćelija (InvivoGen). HEK-Blue TNF-a ćelije su dizajnirane da detektuju bioaktivni TNFa praćenjem aktivacije NFkB puta preko ekspresije embrionalne alkalne fosfataze (SEAP) izlučene reporterskim genom koja se može meriti u supernatantu kulture pomoću QUANTI Blue testa (InvivoGen). Da bi se odredile aktivnosti antitela protiv TNFa, citokini su prethodno inkubirani 1 sat sa različitim koncentracijama antitela i dodati u 50.000 HEK Blue TNF-a ćelija. Indukcija SEAP posredovana citokinom merena je posle 24 sata u supernatantu kulture pomoću QUANTI-Blue testa (InvivoGen). Svaki eksperiment je izveden sa n = 3 tačke podataka za svaku koncentraciju antitela. Izračunata je polovina maksimalne inhibitorne koncentracije za svako antitelo.
Primer 2: Pregled trispecifičnih vezujućih proteina
[0238] Razvijena je nova strategija za generisanje trispecifičnih vezujućih proteina.
Trispecifični proteini su se sastojali od četiri polipeptida koji su formirali tri ciljna mesta vezivanja (SL. 1A-C).. Svako mesto vezivanja za cilj sadržalo je VHi VLdomen iz antitela koje je ciljalo različitu metu humanog antigena (vidi npr. Tabelu 1). Trispecifični vezujući proteini sadržali su prvi par polipeptida koji su posedovali dvostruke varijabilne domene sa unakrsnom orijentacijom formirajući dva različita mesta vezivanja antigena (nazvana CODV Ig format), i drugi par polipeptida, svaki sa jednim varijabilnim domenom koji je formirao treće mesto vezivanja antigena (SL. 1A i 1B).
Tabela 1: SEQ ID NO teških i lakih lanaca za vezujuće proteine 1-21 i ciljni antigeni na koje su usmereni vezujući proteini.
[0239] Prvi par polipeptida (koji je imao dvostruke varijabilne domene) se sastojao od prvog polipeptida koji ima strukturu VL2-Linker-VL1-Linker-Imunoglobulinski konstantni domen lakog lanca, i drugog polipeptida koji ima strukturu VH1-Linker-VH2-Linker-Immunoglobulin CH1konstantni domen teškog lanca, što je rezultiralo parom polipeptida koji su imali unakrsnu orijentaciju koja je formirala dva različita mesta vezivanja antigena: VH1-VL1i VH2-VL2(SL.1C, videti lake i teške lance B). Tabela A daje rezime dizajna bispecifičnog kraka (npr. kraka koji sadrži teške i lake lance B) IgG1 i IgG4 varijanti reprezentativnih trispecifičnih vezujućih proteina, uključujući navođenje različitih kombinacija linkera koji se koriste u bispecifičnom kraku trispecifično vezujućih proteina. Drugi par polipeptida (od kojih je svaki imao jedan varijabilni domen) se sastojao od prvog polipeptida koji ima strukturu konstantnog domena teškog lanca VH3-imunoglobulina CH1, i drugog polipeptida koji ima strukturu konstantnog domena VL3-imunoglobulina lakog lanca, što je rezultovalo parom polipeptida koji su formirali treće mesto vezivanja antigena: VH3-VL3(SL.1C, vidi laki i teški lanci A). Štaviše, trispecifični vezujući proteini su konstruisani tako da bilo koji od CH3domena može uključivati modifikaciju ispupčenja ili udubljenja kako bi se olakšala heterodimerizacija antitela (SL.1).
Tabela A: Rezime dizajna bispecifičnog kraka trispecifičnih vezujućih proteina kao IgG1 (udubljenje) ili IgG4 (udubljenje)
NO:106)]; [ ,] /[GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104)];
Primer 3: Aktivnost vezivanja in vitro i specifično ubijanje aktivatora T ćelija posredovano antitelima
[0240] Ovaj primer opisuje in vitro testove za karakterizaciju aktivnosti aktivatora T ćelija.
[0241] Koristeći pristup opisan u gornjem Primeru 2 za dizajn trispecifičnog vezujućeg proteina, generisana su četiri trispecifična vezujuća proteina (vezujući proteini 1, 3, 5 i 6). Ovi trispecifični vezujući proteini su stvoreni presađivanjem na okvir trispecifičnog vezujućeg proteina VHi VLdomena izolovanih iz antitela koja ciljaju različite humane proteine: CD3, CD19, CD28, CD38 ili Her2. Vezujući protein 1 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji je formirao dva mesta vezivanja antigena) ciljao CD28 i CD3, a drugi par polipeptida (koji je formirao jedno mesto vezivanja antigena) ciljao Her2 (vezujući protein 1 = Her2 × ( CD28 × CD3)). Vezujući protein 3 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji je formirao dva mesta vezivanja antigena) ciljao CD28 i CD3, a drugi par polipeptida (koji je formirao jedno mesto vezivanja antigena) ciljao CD19 (vezujući protein 3 = CD19 × ( CD28 × CD3)). Vezujući protein 5 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji je formirao dva mesta vezivanja antigena) ciljao CD28 i CD3, a drugi par polipeptida (koji je formirao jedno mesto vezivanja antigena) ciljao CD38 (vezujući protein 5 = CD38 × ( CD28 × CD3)). Vezujući protein 6 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji je formirao dva mesta vezivanja antigena) ciljao CD28 i CD3, a drugi par polipeptida (koji je formirao jedno mesto vezivanja antigena) ciljao CD38 (vezujući protein 6 = CD38 × ( CD28 × CD3)).
In Vitro testovi koji koriste trispecifične vezujuće proteine koji sadrže Anti-Her2
[0242] Da bi se testirala sposobnost trispecifičnih vezujućih proteina da ciljaju i vezuju tri različita humana antigena, specifičnost vezujućeg proteina 1 za njegove ciljeve je najpre ispitana ELISA testom. Vezujući protein 1 je bio sposoban da veže sva tri svoja ciljna proteina-CD3, CD28 i Her2 (SL. 2) - što ukazuje na to da je svaki domen vezivanja u trispecifičnom formatu zadržao svoju funkciju.
[0243] ZR-75-1, AU565 (Her2<+>), ARH-77 (CD19<+>), MOLP-8, RPMI-8226, KMS-12_BM, NCI-H929, MM.1.S, MM.1., R OPM-2, KMS-26 i U266 ćelije (CD38<+>) su označene membranskom bojom PKH-26 (Sigma) i korišćene kao ciljne ćelije u testu citotoksičnosti. Ove označene ćelijske linije su ko-kultivisane u odnosu E:T od 10:1 sa obogaćenim humanim Pan T ćelijama u prisustvu rastućih koncentracija trispecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili kontrolnih proteina tokom 24 sata. Obim lize ćelija u ciljnim ćelijama određen je bojenjem markerom živih/mrtvih ćelija (Life Technologies) i merenjem broja mrtvih ćelija u označenoj ciljnoj populaciji ćelija pokretanjem uzoraka na protočnom citometru Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), nakon čega je usledila analiza pomoću softvera Flowjo (FlowJo v10).
[0244] Ćelijske linije tumora Her2+, CD19 , CD38+ obojene su fluorescentno konjugovanim antitelima protiv humanih CD3, CD28, CD19, CD38, LAMP1 i/ili Her2 (Biolegend). Takođe je uključeno bojenje odgovarajućim kontrolnim antitelima koja se podudaraju sa izotipom. Ćelije su zatim postavljene na instrument Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA). Analiza protoka je izvršena sa FlowJo v10. Rezultati posredovanog ubijanja različitih vezujućih proteina prikazani su na SL. 3A-5, 9A, 9B i 11A-16.
[0245] Ispitana je sposobnost vezujućeg proteina 1 da indukuje ubijanje ćelija tumora koje eksprimiraju HER2 proteine na svojoj površini posredstvom antitela. Ne samo da je vezujući protein 1 bio sposoban da se veže za sva tri svoja ciljna proteina, već je takođe bio u stanju da izazove ubijanje ćelija Her2<+>ćelijskih linija posredovano antitelima (SL.3A-4). Vezujući protein 1 pokazao je snažnu aktivnost ubijanja ćelija posredovanu antitelima, dok su anti-CD3/CD28 bispecifična At i anti-Her2 antitela pokazala minimalnu aktivnost ubijanja.(SL.
3A, 3B, 4 i 5), pokazujući efikasnost korišćenja trispecifičnog At za angažovanje tumorskih ćelija sa T ćelijama putem tumorskih antigena (HER2) i T ćelijskih markera (CD3 i CD28).
Anti-CD3/CD28 nije važan samo za regrutovanje T ćelija, već takođe obezbeđuje efikasniju aktivaciju T ćelija i signalizaciju preživljavanja, potencijalno poboljšavajući efikasnost.
[0246] Pored toga, sprovedene su studije o in vitro aktivaciji i proliferaciji T ćelija, kao i proizvodnji citokina, koristeći trispecifično antitelo anti-Her2 × CD28 × CD3 (vezujući protein 1). Vezujući protein 1 i kontrolne varijante koje imaju jedan ili dva domena vezivanja inaktivirana mutagenezom usmerenom na lokaciju (ΔCD28: inaktiviran anti-CD28; ΔCD3: inaktiviran anti-CD3; Δ(CD3×CD28): i anti-CD3 i anti-CD28 inaktivirani) korišćeni su u humanom PBMC testu in vitro aktivacije kao što je opisano u Primeru 1. Rezultati su pokazali da je vezujući protein 1 efikasno aktivirao i humane primarne CD4 T ćelije i CD8 T ćelije in vitro. Inaktivacija anti-CD28 smanjila je potenciju aktivacije, ukazujući na značaj kosignalne putanje anti-CD28. Inaktivacija mesta vezivanja anti-CD3 dovela je vezujući protein 1 do minimalne aktivnosti, što sugeriše da anti-CD3 obezbeđuje primarnu signalizaciju aktivacije T ćelija (SL.6A i 6B). Slični rezultati su dobijeni korišćenjem IL2 i NFAT reporter humanih T ćelijskih linija (Jurkat-IL2 i Jurkat-NFAT) (SL.7A-7C).
In Vitro testovi koji koriste trispecifične vezujuće proteine koji sadrže Anti-CD19
[0247] Anti-CD19 × CD28 × CD3 trispecifični vezujući protein je bio sposoban da veže svoje ciljne antigene (SL.8), što ukazuje na to da je svaki domen vezivanja u trispecifičnom formatu zadržao svoju funkciju.
[0248] Anti-CD19 × CD28 × CD3 trispecifični vezujući protein je takođe bio sposoban da indukuje ubijanje CD19+ ćelija posredovano antitelima (SL.9A-9N). Slično tome, anti-CD19 × CD28 × CD3 trispecifični vezujući protein pokazao je snažnu aktivnost ubijanja protiv humanih limfomskih ćelija, dok su i anti-CD3/CD28, anti-CD19 i izotip kontrolna antitela pokazala minimalnu aktivnost ubijanja, pokazujući efikasnost korišćenja trispecifičnog At za angažovanje tumorskih ćelija sa T ćelijama putem tumorskih antigena (CD19) i T ćelijskih markera (CD3 i CD28).
In Vitro testovi koji koriste trispecifične vezujuće proteine koji sadrže Anti-CD38
[0249] Kao što je uočeno kod vezujućih proteina 1 i 3, vezujući protein 5 je bio u stanju da veže sva tri svoja ciljna proteina (CD3, CD28 i CD38), što je procenjeno ELISA testom (SL.
10) , što ukazuje na to da je svaki domen vezivanja u trispecifičnom formatu zadržao svoju funkciju.
[0250] Utvrđeno je i da vezujući protein 5 izaziva ubijanje ćelija posredovano antitelima (SL.
11A-15D) protiv 9 humanih ćelija multiplog mijeloma sa različitim nivoima ekspresije CD38 i CD28 (videti SL.11D, 12D i 13D). Slično tome, trispecifični vezujući protein 5 pokazao je snažnu aktivnost ubijanja protiv humanih ćelija multiplog mijeloma, dok su i anti-CD38 i izotipska kontrolna antitela pokazala minimalnu aktivnost ubijanja, pokazujući efikasnost korišćenja trispecifičnog At za angažovanje tumorskih ćelija sa T ćelijama putem tumorskih antigena (CD38 i CD28) i T ćelijskih markera (CD3 i CD28). Bispecifično anti-CD3/CD28 kontrolno antitelo je takođe pokazalo marginalnu aktivnost ubijanja protiv CD28+ MM ćelija (videti SL.11B, 12A-C i 13A-C).
[0251] Ovi rezultati pokazuju da ovde opisana platforma trispecifičnih antitela pruža mogućnost integrisanja mesta vezivanja za dva tumorska markera, ili dva mesta vezivanja za markere T ćelija, omogućavajući fleksibilnost za naučne dizajne i različite primene. Vezujući protein 5 je takođe bio efikasan protiv 5 CD38+ ćelijskih linija humanog limfoma (SL.14C i 15D), pokazujući snažnu aktivnost ubijanja (SL.14A-B i 15A-C).
[0252] Testirano je ubijanje ćelija posredovano antitelima protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226 korišćenjem vezujućih proteina 5 i 6, a njihove EC50vrednosti su izračunate i upoređene sa onima bispecifičnih antitela CODV formata koja ciljaju CD28 i CD3 (SL. 16 i Tabela B). Vezujući proteini 5 i 6 se razlikuju samo u domenu vezivanja anti-CD28; vezujući protein 5 sadrži superagonist anti-CD28, dok vezujući protein 6 sadrži konvencionalni anti-CD28. Vezujući protein 5 pokazao je snažniju aktivnost ubijanja.
Tabela B: Vrednosti EC50 izračunate za bispecifične i trispecifične vezujuće proteine
[0253] Aktivnost anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog vezujućeg proteina 5 i kontrolnih varijanti koje imaju jedan ili dva vezujuća domena inaktivirana mutagenezom usmerenom ka mestu (ΔCD28: anti-CD28 inaktiviran; ΔCD3: anti-CD3 inaktiviran; Δ(CD3×CD28): i anti-CD3 i anti-CD28 inaktiviran) testirana je korišćenjem IL2 i NFAT reporterskih humanih T ćelijskih linija (Jurkat-IL2 i Jurkat-NFAT) u testu in vitro aktivacije kao što je opisano u Primeru 1. Rezultati su pokazali da je vezujući protein 5 efikasno aktivirao i humane IL2 i NFAT promotore in vitro (SL.17A i 17B). Inaktivacija anti-CD28 smanjila je potenciju aktivacije, koja je bila izraženija za reportera IL2, ukazujući na značaj kosignalnog puta anti-CD28. Inaktivacija mesta vezivanja anti-CD3 dovela je vezujući protein 5 do minimalne aktivnosti, što sugeriše da anti-CD3 obezbeđuje primarnu signalizaciju aktivacije T ćelija.
Primer 4: In Vivo aktivnost aktivatora T ćelija
[0254] Ovaj primer opisuje eksperimente koji karakterišu svojstva i aktivnosti anti-Her2 ili anti-CD38 koji sadrže aktivatore T ćelija in vivo.
In Vivo testovi koji koriste trispecifične vezujuće proteine koji sadrže anti-Her2
[0255] Studija povećanja doze korišćenjem Her2 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela sprovedena je na primatima koji nisu ljudi (SL.18A-18E), kao što je opisano u Primeru 1. Sva tri domena vezivanja u vezujućem proteinu 1 su unakrsno reaktivna sa majmunskim CD3/CD28/HER2. Osmišljena je studija toksičnosti povećanja doze kako bi se procenio potencijalni profil toksičnosti molekula. Prikupljeni su uzorci krvi za izolaciju seruma i PBMC. Populacije cirkulišućih T ćelija su istražene nakon svakog doziranja (SL. 18A i 18B), zajedno sa aktivacijom subpopulacije T ćelija (CD69+) (SL. 18C i 18D). Procenat CD4 i CD8 T-ćelija u cirkulaciji povećan je pri niskoj eskalaciji doze, ali se na kraju smanjio pri visokoj eskalaciji doze. Značajna aktivacija CD4 i CD8 T ćelija bila je izražena samo pri dozi od 100 µg/kg, što ukazuje na relativno visoku podnošljivu dozu. Izmeren je i nivo nekoliko citokina u serumu. Značajno oslobađanje citokina je uočeno samo pri najvišoj dozi (100 µg/kg; SL. 18E).
[0256] Zatim je ispitan efekat trispecifičnog anti-Her2 × CD28 × CD3 vezujućeg proteina 1 na rast tumora u modelima humanizovanih miševa kao što je opisano u Primeru 1 (SL.19A20H). SL. 19A i 19B rezimiraju rezultate dobijene korišćenjem humanog CD34+ modela NSG miševa sa ugrađenim hematopoetskim matičnim ćelijama (hu-CD34) inokulisanih humanom HER2+ linijom karcinoma dojke BT474. Značajne antitumorske aktivnosti bile su evidentne u svim doznim grupama. Antitumorska aktivnost je bila zavisna od doze, što se statistički razlikovalo u poređenju sa kontrolnom grupom pri 25 µg/kg. Nije uočen značajan gubitak telesne težine ni u jednoj tretiranoj grupi.
[0257] Takođe je urađena druga in vivo studija korišćenjem humanog PBMC rekonstituisanog NSG modela miševa inokulisanih humanim HER2+ karcinomom dojke linije BT474 (SL.20A-20H). Značajne antitumorske aktivnosti uočene su u grupama sa visokim dozama (100 i 500 µg/kg). Smanjivanje tumora uočeno je kod 40% miševa u grupi od 500 µg/kg. Antitumorska aktivnost je bila zavisna od doze. Antitumorska aktivnost u grupama tretiranim dozama od 100 i 500 µg/kg bila je značajno bolja od grupa tretiranih anti-HER2 (0,1 do 10 mg/kg), što ukazuje na superiornu antitumorsku aktivnost vezujućeg proteina 1. Nije uočen značajan gubitak telesne težine ni u jednoj tretiranoj grupi.
In Vivo testovi koji koriste trispecifične vezujuće proteine koji sadrže anti-CD38
[0258] Studija povećanja doze sprovedena je na primatima koji nisu ljudi koristeći trispecifično anti-CD38 × CD28 × CD3 antitelo (vezujući protein 5) kao što je opisano u Primeru 1 (SL. 21A-21F). Dva od tri domena vezivanja u vezujućem proteinu 5 su unakrsno reaktivna sa majmunskim CD3 i CD28. Osmišljena je studija toksičnosti povećanja doze kako bi se procenio potencijalni profil toksičnosti molekula. Prikupljeni su uzorci krvi za izolaciju seruma i PBMC. Populacije cirkulišućih T ćelija su istražene nakon svakog doziranja (SL.21A i 21B, stubasti grafikoni), zajedno sa aktivacijom subpopulacije T ćelija (CD69+) (SL.21A i 21B, linijski grafikoni). Procenat CD4 i CD8 T-ćelija u cirkulaciji povećan je pri niskoj eskalaciji doze, ali se na kraju smanjio pri visokoj eskalaciji doze. Značajna aktivacija CD4 i CD8 T ćelija bila je izražena samo pri dozi od 100 µg/kg, što ukazuje na relativno visoku podnošljivu dozu. Takođe je izmeren nivo nekoliko citokina u serumu. Značajno oslobađanje citokina je uočeno samo pri najvišoj dozi (100 µg/kg; SL. 21C-21F).
[0259] In vivo aktivnost anti-CD38 × CD28 × CD3 trispecifičnog antitela je zatim testirana na humanizovanim miševima (SL.22A-23D) kao što je opisano u Primeru 1. SL.22A-22C sumiraju rezultat pilot studije u kojoj je određena doza korišćenjem humanog CD34+ modela NSG miševa sa ugrađenim hematopoetskim matičnim ćelijama (hu-CD34) implantiranih sa humanom MM ćelijskom linijom RPMI-8226 transdukovanom sa CD38 i PD-L1, tretiranih vezujućim proteinom 5 u dozama 5, 50 i 100 µg/kg. Značajna antitumorska aktivnost bila je očigledna samo u grupi tretiranoj sa 5 µg/kg (SL.22A). Infiltracija CD8 T ćelija je uočena kod miševa tretiranih vezujućim proteinom 5 (5 µg/kg) (SL.22B i 22C).
[0260] Studija praćenja na istom modelu je izvedena korišćenjem vezujućeg proteina 5 pri doziranju od 0,04-5 ug/kg (SL.23A-23D). Značajna antitumorska aktivnost je pokazana u svim grupama tretiranim vezujućim proteinom 5 (SL. 23B), koje su se statistički razlikovale od kontrole na kraju ispitivanja (SL.23C). Nije uočen značajan gubitak telesne težine ni u jednoj tretiranoj grupi (SL. 23A). Indukcija zavisna od doze serumskih inflamatornih citokina IFN-γ, TNF-α i IL-2 četiri sata nakon prve doze primećena je kod miševa tretiranih naznačenim koncentracijama vezujućeg proteina 5 ili PBS kontrole (SL.23D), što ukazuje na efektivnu aktivaciju T ćelija trispecifičnim vezujućim proteinom 5 in vivo.
[0261] Humanizovanim CD34+ NSG miševima (n=3) ubrizgano je i.v.100mcg/kg trispecifičnog At (trougao), bi-specifičnog At (kvadrat) ili jednostruko specifičnog At (krug). Aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija merena je 0 (pre ubrizgavanja), 1, 24 i 72 sata nakon injekcije At određivanjem srednjeg povećanja u % CD69, smanjenja % CD62L i/ili koncentracije inflamatornih citokina u plazmi u svakoj vremenskoj tački tehnologijom multipleksiranja Luminex's xMAP. Rezultati aktivacije T ćelija različitih trispecifičnih antitela prikazani su na SL.24-26C.
[0262] Sistemska in vivo aktivacija T ćelija je proučavana u humanom CD34+ modelu NSG miševa sa ugrađenim hematopoetskim matičnim ćelijama (hu-CD34) nakon primene vezujućeg proteina 5, anti-CD3/CD28_IgG4 bispecifičnog antitela i anti-CD28 IgG4 kontrolnog antitela (SL.24). 100 µg/kg vezujućeg proteina 5 i kontrolnih antitela primenjeno je kod 3 miša/grupi. Uzorci krvi su prikupljeni pre, 1 sat, 24 sata i 72 sata nakon primene. Serumi miša i humane T ćelije izolovani su iz krvi i sačuvani za analizu aktivacije T ćelija i za merenje nivoa serumskih citokina. SL.24 i 25 pokazuju da su humane CD4 i CD8 T ćelije aktivirane 1 sat nakon infuzije antitela, da bi se vratile na početnu vrednost nakon 72 sata. SL. 26A-26C pokazuje povišenje oslobađanja IFN-γ, TNF-α i IL-2 u serumu kod istih miševa, koje je uočeno 1 sat nakon infuzije i vraćeno na početnu vrednost 24 sata kasnije.
Ovi rezultati su pokazali da su i vezujući protein 5 i anti-CD3/CD28 IgG4 bispecifično antitelo efikasni u aktivaciji T ćelija u datom životinjskom modelu, što ga čini pogodnim za in vivo studiju efikasnosti.
Primer 5: Karakterizacija trispecifičnih i bispecifično-trovalentnih vezujućih proteina usmerenih na citokine
[0263] Sledeći primer opisuje eksperimente koji karakterišu stabilnost, svojstva vezivanja i aktivnosti novih trispecifičnih i bispecifično-trovalentnih vezujućih proteina koji ciljaju humane citokine.
[0264] Dizajnirani su trispecifični vezujući proteini (npr. koji se vezuju za tri različita ciljna proteina; vezujući proteini 9-15), kao i bispecifični-trovalentni vezujući proteini (npr. koji se monovalentno vezuju za jedan antigen; vezujući proteini 16-19) (Tabela C). Sa izuzetkom vezujućeg proteina 11, gde je korišćen kapa konstantni domen i na CODV-LC i na Fab-arm-LC, svi ostali vezujući proteini (9-10 i 12-19) su proizvedeni sa kapa konstantnim domenom na CODV-LC i lambda konstantnim domenom na Fab-arm-LC. Kao Fc-okosnica korišćena je sekvenca IgG1. Dok CODV-HC sadrži mutacije ispupčenja-RF (S354C, T366W; H435R i Y436F), Fab-arm-HC sadrži mutacije udubljenja (Y349C, T366S, L368A, Y407V).
Tabela C: Rezime trispecifičnih/trovalentnih vezujućih proteina usmerenih na anti-IL-4/IL-13/TNFα
[0265] Trispecifični i bispecifično-trovalentni vezujući proteini su proizvedeni i prečišćeni kao što je gore opisano (SL.27).
Tabela D: SEC prečišćavanje vezujućih proteina 16-19
[0266] Da bi se procenila stabilnost trispecifičnih vezujućih proteina, pomoću DSF je procenjena njihova tačka topljenja, koja je zatim upoređena sa termostabilnošću roditeljskih antitela (Tabela E).
Tabela E: Rezime termostabilnosti prema DSF i procentima monomera iz preparativne hromatografije isključivanja veličine za različite trispecifične vezujuće proteine
n.o.=nije određeno
[0267] Da bi se procenio afinitet vezivanja svakog pojedinačnog domena vezivanja antitela u okviru trispecifičnog formata, SPR analiza za svaki pojedinačni antigen je izvedena kao što je prethodno opisano. Rezultati su upoređeni sa afinitetima roditeljskih antitela (Tabele F, G i H).
Tabela F: Rezime rezultata površinske plazmonske rezonancije za IL-4 za različite trispecifične vezujuće proteine
Vezujući protein 15 7.35E+07 1.23E-04 1.67E-12 31 0.547 Tabela G: Rezime rezultata površinske plazmonske rezonancije za IL-13 za različite trispecifične vezujuće proteine
Vezujući protein 15 2.50E+05 5.61E-05 2.24E-10 30 0.631 Tabela H: Rezime rezultata površinske plazmonske rezonancije za TNFa za različite trispecifične vezujuće proteine
[0268] Da bi se procenila aktivnost neutralizacije trispecifičnih vezujućih proteina, izvršen je ćelijski test korišćenjem različitih HEK Blue kompleta (Invivogen). Citokini su prethodno inkubirani sa različitim koncentracijama anti-citokinskih antitela tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u ploči sa 96 bazenčića. Kontrole su uključivale upotrebu samo citokina ili samo antitela. 50.000 HEK Blue ćelija (HEK Blue TNFa/IL1β ćelije (InvivoGen, kat. br. hkbtnfil1; HEK Blue STAT-6 ćelije (InvivoGen, kat. br. Hkb.stat6) dodato je u smešu citokina/antitela i inkubirano 23 sata na 37°C, 5% CO2 u inkubatoru. Reagens QuantiBlue je dodat u svaki bazenčić za kulturu i inkubiran 2 sata na 37°C. OD je izmeren na 620 nm i IC50 je izračunat korišćenjem BioStat Speed 2.0. Rezultati testa ćelija HEK Blue Reporter za različita trispecifična antitela prikazani su u Tabelama I i M.
[0269] Nakon toga su izračunate IC50vrednosti za vezujuće proteine 9-15 i upoređene u odnosu na pojedinačna roditeljska antitela (Tabela I).
Tabela I: Rezime analiza HEK Blue Reporter (IC50 podaci) za različite trispecifične vezujuće proteine
Konstrukt IL4 ICso (ng/mL) IL13 IC50 (ng/mL) TNFα IC50 (ng/mL)
Vezujući protein 15 1.30E+01 1.07E+02 2.38E+01
[0270] Termostabilnost bispecifično-trovalentnih vezujućih proteina merena je diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF; Tabela J).
Tabela J: Rezime termostabilnosti prema DSF, za različite trovalentne vezujuće proteine
[0271] Afinitet vezivanja i broj ciljnih proteina vezanih za svaki od bispecifično-trovalentnih vezujućih proteina je meren za humani IL-4 (Tabela K) i IL-13 (Tabele K i L).
Tabela K: Rezime rezultata površinske plazmonske rezonancije za IL-4 za različite trovalentne vezujuće proteine
Konstrukt RU Analit Ka Kd Rmax KD Chi2 kDa Br.
Tabela L: Rezime rezultata površinske plazmonske rezonancije za IL-13 za različite trovalentne vezujuće proteine
Konstrukt RU Analit Ka Kd Rmax KD Chi2 kDa Br.
[0272] Konačno, IC50vrednosti su izračunate za vezujuće proteine 16-19 (Tabela M).
Tabela M: Rezime analiza HEK Blue Reporter (IC50 podaci) za različite trovalentne vezujuće proteine
Primer 6: Optimizacija formata trispecifičnog vezujućeg proteina
[0273] Problem sa mnogim postojećim formatima heterodimernih vezujućih proteina (npr. bispecifična antitela i njihove varijante) je u tome što može biti teško prečistiti samo željene heterodimerne vrste bez uključivanja bilo koje homodimerne vrste. Dakle, proces za efikasno prečišćavanje željenog, heterodimernog vezujućeg proteina je od velikog interesa, npr. za industrijsku proizvodnju.
[0274] Kao što je ovde opisano, vezujući proteini ovog otkrića mogu uključivati nekoliko opcionih karakteristika, uključujući bez ograničenja mutacije ispupčenja i udubljenja (npr. za promovisanje pravilnog formiranja heterodimera) i mutacije za poboljšanje prečišćavanja. Pored toga, ovi vezujući proteini uključuju dva laka lanca, što dovodi do četiri potencijalne konfiguracije: dva kapa laka lanca, dva lambda laka lanca, kapa laki lanac na kraku sa dvostrukim varijabilnim domenima („CODV krak“) i lambda laki lanac na tradicionalnom kraku antitela („Fab krak“), i lambda laki lanac na CODV kraku i kapa laki lanac na Fab kraku.
[0275] Stoga su sprovedeni eksperimenti kako bi se identifikovao proces koji omogućava efikasno prečišćavanje željenog vezujućeg proteina od interesa. Varijante vezivnog proteina su takođe testirane na efikasnost prečišćavanja.
[0276] SL.28A prikazuje dijagram primernog vezujućeg proteina ovog otkrića, ukazujući na varijacije koje dovode do jedinstvenih konfiguracija. Ovi eksperimenti su testirali efekat postavljanja: kapa i lambda lakih lanaca (npr. dva kapa, dva lambda, kapa na CODV kraku i lambda na Fab kraku i lambda na CODV kraku i kapa na Fab kraku), mutacija ispupčenja i udubljenja (npr. mutacije ispupčenja na CODV kraku i mutacije udubljenja na Fab kraku, ili mutacije udubljenja na CODV kraku i mutacije ispupčenja na Fab kraku) i H435R/Y436F mutacija („RF mutacije“, npr. RF mutacije na CODV ili Fab kraku, ili bez RF mutacija). Ispitano je ukupno 18 različitih varijanti, kao što je prikazano na SL. 28B. Za ove eksperimente, CODV krak je imao mesta vezivanja antigena specifična za TNFa (npr. VH i VL sekvence SEQ ID NO: 168 i 169, respektivno) i IL4 (npr. VH i VL sekvence SEQ ID NO: 170 i 171, respektivno), dok je Fab grupa imala mesto vezivanja antigena specifično za IL13 (npr. VH i VL sekvence SEQ ID NO: 172 i 173, respektivno). Za mutacije ispupčenja korišćeni su S354C i T366W, a za mutacije udubljenja Y349C, T366S, L368A i Y407V.
[0277] Različiti koraci obrade testirani su na sposobnost praćenja ispravnog uparivanja krakova CODV i Fab (npr. za razliku od homodimera CODV ili Fab), kao i ispravnog uparivanja teškog lanca i lakog lanca (npr. za razliku od uparivanja između lakog lanca Fab kraka i teškog lanca CODV kraka, ili između teškog lanca Fab kraka i lakog lanca CODV kraka). Utvrđeno je da je analitička hromatografija isključivanja veličine (SEC) neefikasna u razlikovanju ispravnog uparivanja teškog lanca i lakog lanca; utvrđeno je da vezujući proteini sa lakim lancem Fab kraka pogrešno upareni sa teškim lancem CODV i homodimerni vezujući proteini sa dva Fab kraka koeluiraju sa željenim trispecifičnim vezujućim proteinima. Međutim, nađeno je da analitička hidrofobna interakcijska hromatografija (HIC) razrešava željene trispecifične vezujuće proteine iz vezujućih proteina sa lakim lancem Fab kraka koji je pogrešno uparen sa teškim lancem CODV i homodimernim vezujućim proteinima sa dva Fab kraka (SL.29).
[0278] 18 konfiguracija vezujućih proteina prikazanih na SL. 28B prečišćeno je afinitetnom hromatografijom Protein A, a zatim prečišćavanjem sa KappaSelect (GE Healthcare). Vrste su praćene HIC hromatografijom. Jedna konfiguracija vezujućeg proteina je efikasno prečišćena bez uključivanja pogrešno uparenih vrsta: lambda laki lanac za CODV krak, kapa lak lanac za Fab krak, mutacije ispupčenja na CODV kraku, mutacije udubljenja na Fab kraku i RF mutacije na Fab kraku. HIC hromatografija (SL. 30A), SDS-PAGE (SL.30B) i analiza intaktne mase su pokazali da je jedna vrsta koja odgovara željenom trispecifičnom vezujućem proteinu prečišćena.
[0279] Ovi rezultati identifikuju konfiguraciju vezujućeg proteina koja omogućava efikasnije prečišćavanje vezujućih proteina od interesa podalje od pogrešno uparenih vrsta. Štaviše, pokazalo se da proces prečišćavanja Protein A praćen korakom prečišćavanja pomoću KappaSelect, obezbeđuje efikasno odvajanje vezujućih proteina od interesa od pogrešno uparenih vrsta.
SEKVENCE
[0280]
Tabela 1: SEQ ID NO teškog i lakog lanca za vezujuće proteine 1-21 i ciljni antigeni na koje su vezujući proteini usmereni.
Tabela 2: Sekvence teških i lakih lanaca vezujućih proteina posebno usmerene na Her2, CD3, CD28, CD19 i/ili CD20. CDR sekvence su podebljane i ispisane kurzivom.
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 2
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 3
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 4
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 4
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 4 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 4
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 4 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 5
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 6
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 6
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 6
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 6 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 7:
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 7:
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 8
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 21
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 21
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 21
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 21
Tabela 3: Sekvence teškog i lakog lanca vezujućih proteina specifično usmerenih na IL-4, IL-13 i/ili TNFa.
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 9
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 9
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 9
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 9 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 9
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 10
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 10
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 10 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 10
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 11
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 11
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 11 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 11 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 11
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 12
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 12
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 12 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 12
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 13
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 13 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 13
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 14 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 14 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 14
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 15
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 15 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 15 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 15
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 16
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 16 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 16 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 16
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 17
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 17
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 17 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 18
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 18
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 19
Nukleotidne sekvence vezujućeg proteina 19
Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 19 Aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina 19
N go

Claims (26)

Patentni zahtevi
1. Vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta vezivanja antigena koja specifično vezuju jedan ili više ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-šarka-CH2-CH3[II]
treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VH3-CH1-šarka-CH2-CH3[III]
i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina sadrži strukturu predstavljenu formulom:
VL3-CL[IV]
pri čemu:
VL1prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL2drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VL3treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;
VH1prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH2drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
VH3treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;
CLkonstantni domen lakog lanca imunoglobulina;
CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;
CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;
CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;
šarka imunoglobulinski šarka region koji povezuje CH1i CH2domene; i
L1, L2, L3i L4su linkeri aminokiselina;
i pri čemu polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
2. Vezujući protein iz patentnog zahteva 1, pri čemu (a) L1, L2, L3i L4svako nezavisno ima nula aminokiselina u dužini ili sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148); ili (b) L1, L2, L3i L4svako nezavisno sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) i GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148).
3. Vezujući protein iz patentnog zahteva 1, pri čemu
(a) L1sadrži sekvencu GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L2sadrži sekvencu TKGPS (SEQ ID NO:106), L3sadrži sekvencu S, a L4sadrži sekvencu RT;
(b) L1sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L2sadrži sekvencu GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L3je 0 amino kiselina u dužini i L4je 0 amino kiselina u dužini;
(c) L1sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L2sadrži sekvencu GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L3je 0 amino kiselina u dužini i L4je 0 amino kiselina u dužini.
4. Vezujući protein iz patentnog zahteva 1, pri čemu je vezujući protein trispecifičan i sposoban da specifično veže tri različita ciljna antigena.
5. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu vezujući protein specifično vezuje tri ciljna proteina koji korespondiraju dvama ciljnih proteina na T ćelijama i jednom ciljnom proteinu tumora; pri čemu je opciono jedan od navedenih ciljnih proteina na T ćelijama CD3, jedan od navedenih ciljnih proteina na T ćelijama je CD28 i/ili navedeni ciljni protein tumora je CD38.
6. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu vezujući protein specifično vezuje tri ciljna proteina koji korespondiraju dvama ciljnih proteina na T ćelijama i jednom ciljnom izabranom iz grupe izabrane iz grupe koja se sadrži od A2AR, APRIL, ATPDaze, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, hitinaze, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaze 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaze-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptora trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk kinaze, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM i XCRl.
7. Vezujući protein iz patentnog zahteva 5 ili patentnog zahteva 6, pri čemu L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).
8. Vezujući protein iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 5, pri čemu
VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; i
VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35 i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54.
9. Vezujući protein iz patentnog zahteva 1, pri čemu VH1i VL1formiraju prvo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD28, pri čemu VH2i VL2formiraju drugo vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani CD3 i pri čemu VH3i VL3formiraju treće vezujuće mesto za antigen koje specifično vezuje humani ciljni protein tumora.
10. Vezujući protein iz patentnog zahteva 9, pri čemu treće mesto vezivanja antigena specifično vezuje humani ciljni protein tumora izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1.
11. Vezujući protein iz patentnog zahteva 9 ili 10, pri čemu mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3 sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; ili
(b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155.
12. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 9-11, pri čemu mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161; ili
(b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163.
13. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 9-12, pri čemu mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157;
(b) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159;
(c) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165;
(d) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151; ili
(e) varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166; i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 167.
14. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13.
15. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 14.
16. Izolovana ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 14, ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je opciono ćelija domaćin ćelija sisara ili ćelija insekata.
17. Farmaceutski sastav koji sadrži vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 1-13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
18. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 5-13 ili sastav iz patentnog zahteva 17 za primenu u prevenciji i/ili lečenju karcinoma kod pacijenta.
19. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz patentnog zahteva 18, pri čemu vezujući protein sadrži jedno mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje površinski protein T ćelije i drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora.
20. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz patentnog zahteva 19, pri čemu vezujući protein sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD3, drugo mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje CD28 i treće mesto vezivanja antigena koje specifično vezuje ciljni protein tumora izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD38, Her2 i LAMP1.
21. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 18-20, pri čemu se vezujući protein primenjuje zajedno sa hemoterapijskim agensom.
22. Vezujući protein iz bilo kog od patentnih zahteva 6-8 ili farmaceutski sastav iz patentnog zahteva 17 za primenu u prevenciji i/ili tretman inflamatorne bolesti ili poremećaja kod pacijenta.
23. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz patentnog zahteva 22, pri čemu vezujući protein sadrži tri mesta vezivanja antigena od kojih svako specifično vezuje ciljni protein citokina izabran iz grupe koju čine IL-4, IL-13 i TNFa.
24. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz patentnog zahteva 22 ili patentnog zahteva 23, pri čemu se vezujući protein primenjuje zajedno sa antiinflamatornim agensom.
25. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 18-24, pri čemu je pacijent čovek.
26. Vezujući protein za primenu ili sastav za primenu iz patentnog zahteva 18 ili patentnog zahteva 22, pri čemu je vezujući protein sposoban da inhibira funkciju jednog ili više ciljnih proteina izabranih iz grupe koju čine A2AR, APRIL, ATPDaza, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, hitinaza, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ektonukleozid trifosfat difosfohidrolaza 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptin, LPFS2, MHC klase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDaaza-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor trombocita, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk kinaza, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, i XCRl.
RS20230996A 2016-04-13 2017-04-13 Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini RS64771B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662322036P 2016-04-13 2016-04-13
US201662331191P 2016-05-03 2016-05-03
US201662412187P 2016-10-24 2016-10-24
EP17305298 2017-03-17
EP17732263.3A EP3443006B1 (en) 2016-04-13 2017-04-13 Trispecific and/or trivalent binding proteins
PCT/US2017/027488 WO2017180913A2 (en) 2016-04-13 2017-04-13 Trispecific and/or trivalent binding proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64771B1 true RS64771B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=80631088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230996A RS64771B1 (sr) 2016-04-13 2017-04-13 Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11932704B2 (sr)
EP (1) EP4257193B1 (sr)
KR (1) KR20240036142A (sr)
DK (1) DK3443006T5 (sr)
ES (1) ES2960329T3 (sr)
FI (1) FI3443006T3 (sr)
HR (1) HRP20231188T1 (sr)
HU (1) HUE063824T2 (sr)
LT (1) LT3443006T (sr)
MX (1) MX2023004804A (sr)
MY (1) MY192090A (sr)
PL (1) PL3443006T3 (sr)
RS (1) RS64771B1 (sr)
SI (1) SI3443006T1 (sr)
TN (1) TN2020000058A1 (sr)
ZA (1) ZA202006103B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017074878A1 (en) 2015-10-25 2017-05-04 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of hiv infection
RS64771B1 (sr) 2016-04-13 2023-11-30 Sanofi Sa Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
WO2025238419A1 (en) * 2024-05-17 2025-11-20 Sanofi Methods of treating cancer using trispecific binding proteins targeting her2-expressing tumors

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE108068T1 (de) 1987-09-23 1994-07-15 Bristol Myers Squibb Co Antikörper-heterokonjugate zur töting von hiv- infizierten zellen.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
WO2002056910A1 (en) 2001-01-17 2002-07-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN1294148C (zh) * 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
WO2005000898A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
US9200061B2 (en) 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
CN100376599C (zh) * 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP3002299A1 (en) * 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010298025B2 (en) 2009-09-25 2016-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 and their use
PL2580243T3 (pl) * 2010-06-09 2020-05-18 Genmab A/S Przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD38
CN103282385A (zh) 2010-11-12 2013-09-04 美国洛克菲勒大学 用于hiv治疗的融合蛋白
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
TWI622597B (zh) 2011-03-28 2018-05-01 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012154312A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
CN107903325B (zh) 2011-05-16 2021-10-29 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
DK2710033T3 (da) 2011-05-17 2021-03-08 Univ Rockefeller Human immundefektvirus-neutraliserende antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2013070776A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing gp41 antibodies and their use
EP2788376B1 (en) 2011-12-08 2018-10-03 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US20150239991A1 (en) 2012-09-25 2015-08-27 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
US9951106B2 (en) 2012-12-04 2018-04-24 University Of Maryland, Baltimore Recombinant fusion protein comprising HIV gp120 linked to an enhancing CD4 binding site mAb
MX2015007575A (es) 2012-12-13 2016-03-15 Univ Pennsylvania Construcciones de anticuerpos de adn y metodo para utilizarlas.
US20140213772A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
NZ708182A (en) 2013-02-26 2019-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
MX2015013170A (es) * 2013-03-15 2016-07-26 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra tnf alpha.
WO2015017755A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 The Regents Of The University Of California Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
MY176522A (en) 2013-11-04 2020-08-13 Ichnos Sciences SA Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
JP6775422B2 (ja) * 2014-03-28 2020-10-28 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３８及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体
WO2016033690A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 Stemcell Technologies Inc. Soluble antibody complexes for t cell or nk cell activation and expansion
EP3812398A3 (en) * 2015-01-23 2021-07-21 Sanofi Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
WO2016187580A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Quantum-Si Incorporated Method of determining the sequence of a nuclear acid using time resolved luminescence
WO2016196740A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 The Rockefeller University Tri-specific antibodies for hiv therapy
KR20180050413A (ko) 2015-09-22 2018-05-14 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Hiv 감염을 치료하기 위해 t 세포를 리디렉션시키는 방법
WO2017074878A1 (en) 2015-10-25 2017-05-04 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of hiv infection
CN105837688B (zh) 2015-11-20 2019-02-26 北京大学深圳研究生院 单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞
MY186414A (en) 2015-12-15 2021-07-22 Gilead Sciences Inc Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies
RS64771B1 (sr) 2016-04-13 2023-11-30 Sanofi Sa Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini
CN109476732B (zh) 2016-04-13 2024-03-22 赛诺菲 三特异性和/或三价结合蛋白
WO2018120842A1 (zh) 2016-12-30 2018-07-05 上海欣百诺生物科技有限公司 一种双功能分子及其应用
US10626169B2 (en) 2017-02-17 2020-04-21 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
KR20240049621A (ko) 2017-02-17 2024-04-16 사노피 디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자
EP3601334A4 (en) 2017-03-27 2021-03-31 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Dna antibody constructs for use against hiv
EP3694882B1 (en) 2017-10-10 2024-06-19 Sanofi Anti-cd38 antibodies and combinations with anti-cd3 and anti-cd28 antibodies
CN113166254A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 赛诺菲 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20231188T1 (hr) 2024-02-02
NZ748144A (en) 2024-09-27
MY192090A (en) 2022-07-26
ES2960329T3 (es) 2024-03-04
LT3443006T (lt) 2023-10-25
DK3443006T5 (da) 2024-09-16
EP4257193B1 (en) 2025-12-31
DK3443006T3 (da) 2023-10-23
HUE063824T2 (hu) 2024-02-28
EP4257193A2 (en) 2023-10-11
FI3443006T3 (fi) 2023-10-23
TN2020000058A1 (en) 2022-01-06
US20240279362A1 (en) 2024-08-22
SI3443006T1 (sl) 2024-01-31
MX2023004804A (es) 2023-05-10
ZA202006103B (en) 2022-01-26
US20220119553A1 (en) 2022-04-21
KR20240036142A (ko) 2024-03-19
PL3443006T3 (pl) 2024-01-29
US11932704B2 (en) 2024-03-19
EP4257193A3 (en) 2024-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11192960B2 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
JP7387780B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体および使用方法
JP7664175B2 (ja) 三重特異性結合性タンパク質、方法、およびその使用
US11932704B2 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
HK40101445A (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
HK1260494A1 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
HK1260494B (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
HK40100622A (en) Anti-cd38 antibodies and combinations with anti-cd3 and anti-cd28 antibodies
BR122024005246A2 (pt) Método de purificação de uma proteína de ligação produzida por uma célula hospedeira