RO113715B1

RO113715B1 - Metoda de vaccinare a pasarilor domestice impotriva coccidiozei

Info

Publication number: RO113715B1
Application number: RO96-01179A
Authority: RO
Inventors: Nigel A Evans; Craig R Findly; Frederick H Weber
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-10-30
Also published as: EP0831896A1; CN1153509C; AU704028B2; MY121899A; PT831896E; KR970000244A; HU223708B1; TW429150B; MA23891A1; NZ286753A; WO1996040233A1; SK72796A3; IL118489A0; RU2126267C1; CO4440631A1; DE69521533D1; HU9601553D0; JPH10506919A; CZ164296A3; HUP9601553A3

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă de vaccinare a păsărilor domestice împotriva coccidiozei, în scopul imunizării puilor incubați împotriva coccidiozei.

Coccidioza este o boală enterică a păsărilor domestice, care este produsă prin infecție cu paraziți protozori intracelulari ai genului Eimeria. Coccidioza este boala parazitară cea mai devastatoare din punct de vedere economic a păsărilor domestice. Se estimează că medicamentele anticoccidiale și pierderile care sunt datorate acestei boli costă industria avicolă foarte mult.

S-au făcut Încercări diferite pentru vaccinarea păsărilor domestice împotriva acestei boli. Metodele curente de vaccinare includ administrarea de ouăciste vii din specia Eimeria la păsările domestice, prin administrarea acestora în alimente sau apă. Totuși, aceste metode sunt neconvenabile și ineficiente, întrucât nu toate păsările iau doza de ouăciste care trebuie, și multe păsări sunt neprotejate prin vaccin, fie primesc o doză patogenă.

în literatura de specialitate se cunoaște că puii care sunt vaccinați in ovo cu virusul herpes al curcanului, dezvoltă imunitate împotriva vaccinării ulterioare cu virusul bolii lui Marek. Este cunoscut, astfel, un procedeu de imunizare în care se administrează in ovo un imunogen nereplicativ. Imunogenii folosiți în acest scop sunt antigenii de Eimeria care sunt prelucrați prin inginerie genetică și un extract de ouăciste Eimeria. Se exclude, însă, în mod specific, folosirea stadiilor de parazit viu. Procedeul constă în aceea că se administreează in ovo, sporocistele sau ouăcistele vii de Eimeria sau un amestec al acestora, în cursul de dezvoltare a păsărilor domestice. Literatura de specialitate sugerează că o astfel de vaccinare ar fi ineficientă in ovo și că ar putea fi aplicabilă după incubare. S-a mai arătat că injectarea in ovo a sporoiților de E.tenella, în ziua a zecea de la incubare, nu asigură protecție imunologică semnificativă împotriva provocării ulterioare cu ouăciste de E. tenella. De fapt, s-a arătat că puii care nu au primit nici un tratament au avut o rată de supraviețuire mai mare împotriva provocării ulterioare cu ouăciste de E.tenella, decât puii care au fost tratați in ovo cu sporozoizi.

Din literatura de specialitate se mai cunoaște metoda de inoculare in ovo cu sporociste vii de E. maxima și ouăciste sporulate, deși nu se indică când s-a făcut inocularea în timpul incubării oului. S-a arătat, insă, în studiu, că nu s-a dat dovadă că expunerea.in ovo protejează împotriva provocării ulterioare cu ouăciste vii de E.maxima 10 zile după incubare. De asemenea, s-a tras concluzia că protecția imunologică semnificativă este asigurată dacă inocularea se face mai degrabă, după incubare, decât in ovo.

Metoda de vaccinare, conform invenției, constă în aceea că se administrează in ovo, prin injectare în ultimul sfert al perioadei de incubare, o doză de 1O²...1O^B de sporociști sau ouăciști vii sau amestecul lor din specia Eimeria. Metoda mai cuprinde, în plus, administrarea in ovo a unui imunostimulator în orice moment al perioadei de incubare. Pasărea domestică este un pui, iar respectivii sporociști sau ouăciști vii sau amestecurile lor provin din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care cuprinde E.tenella, E.acervulina, E. maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox și E.brunetti. Pasărea domestică este un curcan, iar respectivii sporociști sau ouăciști vii sau amestecurile lor, provin din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care cuprinde E.maleagrimitis, E.adenoeides, E.gallaopanovis, E. dispersa, E. meleagridis, E.innocua și E.subrotunda. Când doza cuprinde sporociști, aceștia au fost purificați prin îndepărtarea ouăciștilor.

Avantajul invenției este că toate păsările primesc doza dorită de vaccin și nu sunt expuse unei infecții cu patogeni.

Termenul “pasăre(i) domestică (e)”, așa cum s-a folosit în cadrul prezentei invenții, include pui, curcani, rațe, păsări de agrement, incluzând dar, fără să se limiteze la prepelițe, fazani, ratite

RO 113715 Bl sau struț.

Termenul “in ovo, înseamnă administrarea într-un ou de pasăre domestică care conține un embrion viu în curs de dezvoltare.

Termenul administrare in ovo' se referă la administrarea vaccinului la un ou de. pasăre domestică, care conține un embrion viu în dezvoltare, prin orice mijloace de penetrare a cojii și introducerea vaccinului. Asemenea mijloace de administrare includ, dar nu se limitează, la injectarea vaccinului.

Termenul “ultimul sfert al incubării” se referă la sfertul final al incubării unui ou în dezvoltare al unei păsări domestice

Termenul “Eimeria se referă la una sau mai multe specii de Eimeria care infectează păsările domestice. Asemenea specii de Eimeria includ acele specii care sunt găsite în pui, cum ar fi E.tenella, E.acervulina, E. maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox și E.brunetti, și, de asemenea, speciile care sunt găsite în curcan, cum ar fi E.maleagrimitis, E.adenoeides, E.gallaopanovis, E. dispersa, E.meleagridis, E.innocua și E.subrotunda și, de asemenea, specii de Eimeria care infectează și alte păsări domestice.

Termenul “Eimeria se referă la una sau mai multe specii de Eimeria care infectează păsările domestice. Asemenea specii de Eimeria includ pe cele care sunt găsite în pui, incluzând și toate tulpinile speciilor anterioare ale Eimeriei incluzând, dar fără să se limiteze la tulpini precoce și tulpini atenuate, cum ar fi tulpini care au fost iradiate sau tratate în alt mod, astfel încât acestea au eșuat în dezvoltarea lor completă. Termenul “Eimeria include, de asemenea, orice tulpină nou descoperită sau specii de Eimeria, altele decât cele arătate mai sus, și care infectează păsările domestice.

Termenul “sporociste”, se referă la sporociste vii de Eimeria.

Termenul “ouăciste”, se referă la ouăciste vii sporulente din specia Eimeria sau un amestec de ouăciste sporulente și nesporulente.

Termenul “doză de imunizare eficientă” se referă la un număr de sporociste sau ouăciste, sau, când este amestecul lor, la un număr suficient care să asigure protecția la păsările incubate, care este mai mare decât imunitatea la păsările neimunizate. Așa cum s-a folosit în prezenta invenție, termenul “imuniza” și termneul “vaccina” sunt sinonime și se folosesc interschimbabil.

doză preferată de administrare, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, cuprinde 1O² până la 1O⁸ sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora, în care numărul total al numitelor sporociste sau ouăciste este în domeniul de la 1O² până la 1O⁸. O doză mai preferată cuprinde 1O² până la 1O⁵sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora, în care numărul total al numitelor sporociste sau ouăciste este în domeniul de la 1O² până la 1O⁵. Altă doză preferată cuprinde 1O⁵ până la 10⁷sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora, în care numărul total al numitelor sporociste sau ouăciste este în domeniul de la 1O⁵ până la 1O⁷. Altă doză preferată cuprinde 10⁴ până la 1O⁶sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora, în care numărul total al numitelor sporociste sau ouăciste este în domeniul de la 10⁴ până la 10⁶. Altă doză preferată cuprinde 10³ până la 10⁶sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora, în care numărul total al numitelor sporociste sau ouăciste este în domeniul de la 10³ până la 1O⁶.

O pasăre domestică, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, este un pui.

□ doză preferată de administrare in ovo la ouăle de pui cuprinde sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care constă din E.tenella, E.acervulina, E.maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox și E.brunetti.

Altă pasăre domestică preferată, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, care poate fi vaccinată, poate fi

RO 113715 Bl un curcan.

□ doză preferată de administrare in ovo la ouăle de curcan cuprinde sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora din două sau mai multe specii de E.maleagrimitis, E.adenoeides, E.gallaopanovis, E. dispersa, E.meleagridis, E. innocua și E. subrotunda.

Alte păsări care pot fi vaccinate, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, pot fi păsări.de agrement, rațe și ratite.

Metoda de vaccinare, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, mai cuprinde, suplimentar, administrarea in ovo a unui imunostimulator, în orice moment din timpul incubării.

O metodă preferată de administrare a imunostimulentului este administrarea acestuia simultan in ovo, cu o doză de sporociste sau ouăciste sau amestecul lor, în ultimul sfert al incubării.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenției.

Se administrează in ovo, în timpul ultimului sfert al incubării, sporociste sau ouăciste vii din specia Eimeria sau un amestec al lor în ouăle păsărilor domestice. în cazul puilor, administrarea in ovo se face de preferință în zilele 15-20 ale perioadei de incubare, și cel mai preferat în ziua 18 a incubării. în cazul curcanilor, administrarea in ovo se face de preferințăîn zilele 21-26 ale perioadei de incubare,

Vaccinarea poate fi realizată prin folosirea oricărei metode de administrare in ovo care se consideră că este corespunzătoare. De preferință, prezentul vaccin se administrează prin intermediul injectării. Conform unei metode de injectare, se face un orificiu în coaja oului, la capătul mare al oului folosind un ac de calibru 18 în scopul de a expune camera cu aer a oului. Un ac de calibrul 22, atașat la o seringă adecvată (1 ...3 ml), se poate introduce prin orificiu și prin membrana camerei cu aer. Un număr corespunzător de sporociste sau ouăciste, sau când s-a amestecat un număr corespunzător de sporociste sau ouăcis te, se suspendă într-un purtător lichid adecvat, de exemplu în 10...500 pl de soluție salină tamponată fosfat și apoi se injectează în ou. Volumul necesar depinde de mărimea oului de tratat; evident ouăle de ștruț sunt capabile să primească un volum mai mare decât cele de pui. Locul injectării poate fi în orice regiune a oului. De preferință, injectarea de face axial, prin centrul capătului mare al oului, în amnios.

Alternativ, prin aplicarea metodei de vaccinare, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, poate fi folosit un sistem automat pentru injectat ouă. Astfel de sisteme sunt cunoscute și descrise în literatura de specialitate. De asemenea, pentru specialiștii din domeniu sunt cunoscute și alte metode de injectare corespunzătoare.

Ouăcistele care trebuie folosite, în conformitate cu metoda din prezenta invenție, se pot prepara prin oricare dintre metodele cunoscute specialiștilor din domeniu. Conform cu una dintre aceste metode, puii broiler comerciali în vârstă de aproape două săptămâni se infectează cu speciile Eimeria, prin gavaj oral și într-o doză adecvată de ouăciste sporulente. De exemplu, o doză tipică folosită pentru E. tenella este de 200000 ouăciste pentru fiecare pasăre. Sunt urmate apoi proceduri care sunt cunoscute în domeniu, pentru colectarea și purificarea acestor ouăciste de la păsările infectate. Pentru majoritatea speciilor de Eimeria, se colectează materii fecale de la păsări infectate, la 5-7 zile după infecție. Acestea se amestecă și se filtrează pentru îndepărtarea deșeurilor, apoi se centrifughează la o viteză suficientă pentru aglomerarea materialului fecal care a rămas. Pentru E. tenella, se folosește o procedură similară, cu excepția că mixurile fecale se iau șase zile după infecție. Paietul obținut se resuspendă într-o soluție de sare saturată în care plutesc ouăciste și majoritatea deșeurilor contaminate se pot îndepărta prin centrifugare. Suspensia de ouăciste obținută se diluează apoi la o concentrație de sare mai scăzută. Ouăcistele se spală repetat pen

RO 113715 Bl tru a fi îndepărtată sarea și apoi se resuspendă în soluție de bicromat de potasiu (2,5 % g/v). Suspensia de ouăciste se incubează la temperatura de 29°C, cu agitare (de exemplu la rotația de 140 rpm], pe o perioadă de aproximativ 72 ore, pentru inducerea sporulării ouăcistelor. Alternativ, ouăcistele se pot trata cu hipoclorit de sodiu și apoi pot sporula. Numărul de ouăciste sporulente/ml se determină prin numărare directă, folosind un hemocitometru care este cunoscut în domeniu, și cultura se menține de preferință în condiții de refrigerare până când, este necesar de a fi folosită. Ouăcistele pot fi folosite în conformitate cu metoda de vaccinare din prezenta invenție, de preferință într-o doza care cuprinde cuprinde de la 10²până la 10^s ouăciste/ou, dar mai preferat doza cuprinde de la 1D² până la 10⁵ouăciste/ou.

Pentru prepararea ouăcistelor, se îndepărtează bicromatul de potasiu din suspensia de ouăciste care s-a descris mai sus, prin spălarea repetată a ouăcistelor, prin centrifugare se îndepărtează ouăcistele și apoi se resuspendă în apa deionizată sau în apă distilată. Când se consideră că s-a îndepărtat bicromatul de potasiu, prin lipsa colorației galbenportocaliu, suspensia de ouăciste se amestecă cu un volum egal de hipoclorit de sodiu (albire) și apoi se incubează la temperatura camerei pe o perioadă de 15 minute. Decolorantul se îndepărtează apoi prin spălări repetate și ouăcistele se resuspendă în soluție salină fiziologică sau în apa deionizată. Ouăcistele pot fi sparte pentru eliminarea sporocistelor folosind o diversitate de tehnici cunoscute în domeniu. De exemplu, ouăcistele pot fi rupte pentru eliberarea sporocistelor, prin amestecarea ouăcistelor cu bile de sticlă de diametru de 1 ...4 mm și agitare manuală, mixer sau incubator cu sistem de agitare sau folosind un omogenizator manual. Ouăcistele care nu au fost rupte și pereții ouăcistelor se pot separa de sporocistele eliberate prin centrifugare diferențială în Percoll^R de 50% sau în sucroză 1M, așa cum este descris în literatura de specialitate. Sporocistele se pot folosi în metoda care este redată în prezenta invenție, fie amestecate, fie separate de ouăcistele nerupte și pereții ouăcistelor. De preferință doza de Sporociste este separată de ouăciste și pereții de ouăciste. O doză preferată de sporociste cuprinde de' la 10^Ξ până la 10⁸ sporociste/ou. Mai preferat, doza cuprinde de la 10² până la 10⁵ sporociste/ou.

Sporocistele sau ouăcistele sau amestecul acestora se pot injecta in ovo folosind orice mediu corespunzător din punct de vedere fiziologic. De preferință, acestea se suspendă în soluție salină fiziologică echilibrată, cum ar fi soluția salină tamponată de fosfat. Mediul care a fost ales poate include, opțional, unul sau mai mulți agenți de suspendare, incluzând geluri fiziologice corespunzătoare, gelatine, hidrosoli, celuloză sau gume polizaharidice.

De preferință, în metoda de vaccinare în conformitate cu prezenta invenție, sporocistele sau ouăcistele sau un amestec al acestora, din două sau mai multe specii Eimeria, se injectează in ovo în același moment. în conformitate cu prezenta metodă, sporociste sau ouăciste sau un amestec al acestora conținând toate speciile de Eimeria identificate care infectează o pasăre domestică, și anume cum ar fi puii, se pot injecta in ovo în același moment sau în serii la doze corespunzătoare, pentru a asigura o protecție imunologică împotriva tuturor speciilor de Eimeria.

în legătură cu prezenta metodă de vaccinare, se pot folosi și imunostimulatori. Imunostimulatorii care se pot folosi includ, dar nu limitează, citockine, factori de creștere, chemochine, supernatante de la culturi de celule de limfocite, monocite sau celule din organe limfoide, preparate celulare sau extracte celulare (de exemplu Staphylococcus aureus sau preparate lipopolizaharidice], mitogeni sau adjuvanți, inclusiv medicamente cu greutate moleculară scăzută. Imunostimulatorii se pot administra in ovo în orice moment din timpul incubării. De

RO 113715 Bl preferință, aceștia se administrează in ovo în mediul care conține doza de sporociste sau ouăciste din specia de

Eimeria, sau amestecul acestora.

Claims

Revendicări

1. Metodă de vaccinare a păsărilor domestice împotriva coccidiozei, prin administrarea in ovo de componenți de io imunizare din specia Eimeria ce conține sporociști sau ouăciști vii sau amestecul lor, caracterizată prin aceea că, se administrează in ovo prin injectare, în ultimul sfert al perioadei de incubare, o 15 doză de 10/..10⁶ din respectivii sporociști sau ouăciști sau amestecul lor.
2. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, în plus, mai cuprinde administra- 20 rea in ovo a unui imunostimulator în orice moment al perioadei de incubare.
3. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva pasăre domestică este un pui.
4. Metodă de vaccinare, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, respectivii sporiciști sau ouăciști vii sau amestecurile lor, provin din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care cuprinde E.tenella,

E.acervulina, E. maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox și E.brunetti.
5. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva pasăre domestică este un curcan.
6. Metodă de vaccinare, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că, respectivii sporiciști sau ouăciști vii sau amestecurile acestora provin din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care cuprinde E.maleagrimitis, E. adenoeides, E. gallaopanovis, E. dispersa, E.meleagridis, E.innocua și E.subrotunda.
7. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva doză cuprinde ouăciști.
8. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva doză cuprinde sporociști.
9. Metodă de vaccinare, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că, respectivii sporociști au fost purificați prin îndepărtarea ouăciștilor.

Președintele comisiei de examinare: chim. Hăulică Mariela Examinator: farm. Pentelescu Elena

Editare și tehnoredactare computerizată - OSIM

Tipărit la: Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci

RO 113715 Bl

VERSIUNE CORECTATĂ - CORRECTED VERSION Semnalat în: / Reffered to in: BOPÎ 7/1999 preferință, aceștia se administrează in ovo în mediul care conține doza de sporociste sau ouăciste din specia de

Eimeria, sau amestecul acestora.

Revendicări

1. Metodă de vaccinare a păsărilor domestice împotriva coccidiozei, prin administrarea in ovo de componenți de io imunizare din specia Eimeria ce conține sporociști sau ouăciști vii sau amestecul lor, caracterizată prin aceea că, se administrează in ovo prin injectare, în ultimul sfert al perioadei de incubare, o 15 doză de 1Q²...1O⁶ din respectivii sporociști sau ouăciști sau amestecul lor.

2. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, în plus, mai cuprinde administra- 20 rea in ovo a unui imunostimulator în orice moment al perioadei de incubare.

3. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva pasăre domestică este 25 un pui.

4. Metodă de vaccinare, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, respectivii sporiciști sau ouăciști vii sau amestecurile lor, provin din două sau mai multe specii de Eimeria, alese dintr-un grup care cuprinde E.tenella,

E.acervulina, E. maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox și E.brunetti.

5. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva pasăre domestică este un curcan.

6. Metodă de vaccinare, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că, respectivii sporiciști sau ouăciști vii sau amestecurile acestora provin din două sau mai multe specii de E.imeria, alese dintr-un grup care cuprinde E. meleagrimitis, E.adenoeides, E.gallopavonis, E. dispersa, E.meleagridis, E.innocua și E.subrotunda.

7. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva doză cuprinde ouăciști.

8. Metodă de vaccinare, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiva doză cuprinde sporociști.

9. Metodă de vaccinare, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că, respectivii sporociști au fost purificați prin îndepărtarea ouăciștilor.