PT831896E

PT831896E - Vacinacao in ovo contra cocidiose

Info

Publication number: PT831896E
Application number: PT95918719T
Authority: PT
Inventors: Nigel A Evans; R Craig Findly; Frederick H Weber
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-10-30
Also published as: EP0831896A1; CN1153509C; AU704028B2; MY121899A; KR970000244A; HU223708B1; TW429150B; RO113715B1; MA23891A1; NZ286753A; WO1996040233A1; SK72796A3; IL118489A0; RU2126267C1; CO4440631A1; DE69521533D1; HU9601553D0; JPH10506919A; CZ164296A3; HUP9601553A3

Description

- 1 - ~c (

DESCRICÂO "VACINAÇÃO IN OVO CONTRA COCÍDIOSE" O presente invento relaciona-se com um método de vacinação de aves domesticadas contra a cocídiose. Em particular, o invento relaciona-se com a administração in ovo de esporócitos ou oócitos, ou misturas daqueles, nos ovos em desenvolvimento de aves domesticadas de modo a imunizar os pintainhos recém nascidos contra a cocídiose. A cocídiose é uma doença entérica das aves domesticadas causada pela infecção com parasitas protozoários intracelulares do género Eimeria. A cocídiose é a doença parasitária de aves domesticadas mais devastante do ponto de vista económico. Estima-se que os medicamentos anti-cocídiose e as perdas devidas à cocídiose custam à indústria de avicultura centenas de milhões de dólares todos os anos. Várias tentativas de vacinar aves domesticadas contra a cocídiose têm sido referidos desde o princípio dos anos 1950. Os métodos correntes de vacinação incluem a administração de oócitos de Eimeria viva às aves através da ração ou água. Estes métodos, contudo, são inconvenientes e ineficientes porque nem todas as aves recebem a dose de oócitos pretendida e muitas ficam quer desprotegidas pela vacina ou adquirem uma infecção patogénica.

Em J. M. Sharma e B. R. Burmester, Avian. Dis. 26: 134-149, 1981, os autores referem que as frangos vacinadas in ovo com vírus herpes de peru desenvolvem imunidade contra o desafio subsequente com o vírus da doença -2-de Marek. Na publicação de patente Europeia no. 291173, um processo de imunização é referido em que um imunogénio não-replicante é administrado in ovo. Os imunogénios especificamente referidos na patente Europeia são um antigénio Eimeria produzido por engenharia genética e um extracto de oócitos de Eimería. A patente Europeia exclui especificamente estádios de parasitas vivos tais como os usados no método de vacinação revelado aqui. O presente método de vacinação envolve a administração in ovo de esporócitos ou oócitos de Emeria viva, ou uma mistura daqueles, nos ovos em desenvolvimento de aves domesticadas. A literatura disponível sugere que um tal método de vacinação seria inefectivo in ovo e deveria ser aplicado após a incubação. Em T.K. Jeffers e G. E. Wagenbach, J. Parasit. 56(4): 656-662, 1970, os autores referem que a injecção in ovo de esporozóitos de E.Tenella no dia 10 de incubação não fornecia protecção imunológica significativa contra o desafio subsequente com oócitos de E. tenella. De facto, eles referiram que os pintainhos que não receberam tratamento tinham uma taxa de sobrevivência contra desafio subsequente com oócitos de E. tenella maior que os pintainhos que tinham sido tratados in ovo com esporozóitos. Em K. L. Watkins et al., Proc. VI th International Coccidiosis Conf., Abstract El-2, Ontario, Canada, 1993, os autores descreveram inoculação in ovo com esporócitos e oócitos esporulados de E. maxima viva, embora não tenham indicado quando foi feita a inoculação durante a incubação do ovo. Watkins et al. concluíram que o seu estudo não forneceu evidência que a exposição in ovo protege contra um desafio subsequente da cocídiose com oócitos de E. maxima 10 dias após a incubação. Eles também concluíram que é proporcionada protecção imunológica significativa se a inoculação for feita logo a seguir à incubação em vez de in ovo. Contrariamente a este ensinamento, o método da vacinação in ovo do presente invento proporciona imunidade inesperada que protege os pintainhos recém-nascidos contra desafio subsequente da cocídiose.

Sumário do invento O presente invento também referido aqui como o "presente método de vacinação", relaciona-se com um método (não reivindicado) de vacinação de aves domesticadas contra a cocídiose compreendendo a administração in ovo, durante o quarto final de incubação, de uma dose imunitária efectiva de esporócitos ou oócitos de Eimeria viva, ou duma mistura daqueles.

Assim, de acordo com o presente invento, é fornecido aqui a utilização de oócitos ou esporócitos de Eimeria viva, ou uma mistura daqueles, na manufactura de uma vacina para protecção de uma ave domesticada contra a cocídiose, em que uma dose de vacina efectiva na imunização é administrada in ovo durante o quarto final de incubação. O termo "ave(s) domesticada(s)", como usado aqui, salvo indicação em contrário, inclui frangos, perus, patos, aves de caça (incluindo, mas não estando limitado a, codomizes, faisões, e gansos) e aves corredoras (incluindo, mas não estando limitada a, avestruzes). O termo "m ovo" , como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa num ovo de ave domesticada contendo um embrião vivo em desenvolvimento. O termo "administrando in ovo" ou "administração in ovo", como usado aqui, e salvo indicação em contrário, significa administrando a vacina descrita aqui a um ovo de ave domesticada contendo um embrião vivo em desenvolvimento por qualquer meio de penetração da casca do ovo e introdução da vacina. Tais meios de administração incluem, mas não estão limitados a, injecção da vacina. O termo "quarto final de incubação", como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa o quarto final de incubação de um ovo em desenvolvimento de uma ave domesticada. O termo "Eimeria”, como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa uma ou mais espécies do género Eimeria que infectam as aves domesticadas. Tais espécies Eimeria incluem aquelas que são encontradas nos frangos, incluindo E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, e E. brunetti, e também aquelas que são encontradas nos perus, incluindo E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda, e também espécies Eimeria que infectam outras aves domesticadas como definido acima. O termo "Eimeria" também inclui todas as estirpes das espécies precedentes de Eimeria, incluindo, mas não estando limitadas a, estirpes precoces, e estirpes atenuadas, as quais incluem estirpes que foram irradiadas, ou tratadas de outro modo, de modo a falharem o desenvolvimento completo. O termo Eimeria também inclui quaisquer estirpes ou espécies recém-descobertas de Eimeria que infectem aves domesticadas como definido acima. O termo "esporócitos", como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa esporócitos de Eimeria vivos. O termo "oócitos", como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa oócitos esporulados de Eimeria viva ou uma mistura de oócitos esporulados e não esporulados. O termo "dose de imunização efectiva", como usado aqui, salvo indicação em contrário, significa um número de esporócitos ou oócitos, ou, -5- Αί b*· — (^χ quando misturados, um número de esporócitos e oócitos, suficientes para fornecer protecção imunológica nas aves recém-nascidas que é maior que a imunidade inerente das aves não imunizadas. Como usado aqui, os termos "imunizar" e "vacinar" são sinónimos e são usados indiferentemente.

Uma dose preferida a ser administrada de acordo com o invento Λ Λ compreende 10 a 10 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles em que o

Λ O número total dos ditos esporócitos e oócitos varia de 10 a 10 .

Uma dose mais preferida compreende 10 a 10 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles em que o número total dos ditos esporócitos e oócitos varia de 102 a 105.

Uma outra dose preferida compreende 105 a 107 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles em que o número total dos ditos esporócitos e c n oócitos varia de 10 a 10 .

Uma outra dose preferida compreende 104 a 106 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles em que o número total dos ditos esporócitos e oócitos varia de 104 a 106.

Uma outra dose preferida compreende 10 a 10 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles em que o número total dos ditos esporócitos e Λ / oócitos varia de 10 a 10 .

Uma ave domesticada preferida para ser vacinada de acordo com o invento é o frango.

Uma dose preferida a ser administrada in ovo nos ovos de frango -6-

compreende esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de duas ou mais espécies de Eimeria seleccionada a partir do grupo consistindo de E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, e E. brunetti.

Uma outra ave domesticada preferida a ser vacinada de acordo com o invento é o peru.

Uma dose preferida a ser administrada in ovo nos ovos de perú compreende esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de duas ou mais espécies de Eimeria seleccionadas a partir do grupo consistindo de E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda.

Outras aves domesticadas preferidas a ser vacinadas de acordo com o invento são aves de caça, patos e aves corredoras. O invento compreende ainda a utilização como definida acima, mas no qual um imuno estimulador é administrado in ovo em qualquer altura durante a incubação.

De preferência o imunoestimulador é administrado simultaneamente com a administração in ovo de uma dose de esporócitos ou oócitos, ou mistura dos sitos esporócitos e oócitos, durante o quarto final de incubação.

Descrição detalhada do invento O presente método de vacinação envolve a administração in ovo, durante o quarto final de incubação, de esporócitos ou oócitos de Eimeria viva, ou uma mistura daqueles, em ovos de aves domesticadas. No caso de frangos, a administração in ovo é feita de preferência nos dias 15-20 de incubação, e mais preferencialmente no dia 18 de incubação. No caso de perus, a administração in ovo é de preferência feita nos dias 21-26 de incubação. O presente método de vacinação pode ser levado a cabo usando qualquer método de administração in ovo apropriado. De preferência, a presente vacina é administrada via injecção. De acordo com um método de injecção, é feito um orifício na casca do ovo na ponta mais larga do ovo usando uma agulha de calibre 18 para expor a célula de ar do ovo. Uma agulha de calibre 22 (2,54-3,81 cm) ligada a uma seringa de capacidade apropriada (1-3 ml) pode ser inserida através do orifício e através da membrana da célula de ar. Um número apropriado de esporócitos ou oócitos, ou quando misturados um número apropriado de esporócitos e oócitos são suspensos num líquido transportador apropriado, por exemplo 10-500 μΐ de solução salina tamponizada com fosfato, e depois injectada no ovo. O volume apropriado dependerá do tamanho do ovo a ser tratado, com os ovos de avestruz a ser obviamente capazes de tomar mais volume que os ovos de frango. O local de injecção pode estar dentro de qualquer zona do ovo. De preferência, a injecção é dada axialmente através do centro do extremo mais largo do ovo no âmnios.

Altemativamente, pode ser usado um sistema de injecção automática no ovo no presente método de vacinação. Tais sistemas como descritos nas patentes U.S. nos. 4 681 063, 4 040 388, 4 469 047, e 4 593 646. Outros métodos apropriados de injecção são conhecidos dos especialistas na arte.

Os oócitos a ser usados de acordo com o presente método de vacinação podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos dos especialistas na arte. Tais métodos incluem aqueles descritos em J. F. Ryley et al., Parasitology 73:311-326, 1976 e P. L. long et al., Folia Veterinária Latina -8- VI#3, 201-217, 1976. De acordo com um método, frangos para grelhar comerciais, com aproximadamente 2 semanas de idade, são infectados com as espécies Eimeria de interesse por injecção oral forçada de uma dose apropriada de oócitos esporulados. Por exemplo, uma dose típica usada para E. tenella é 200 000 oócitos esporulados / ave. Processos bem conhecidos para recolha e purificação dos oócitos de aves infectadas são então seguidos. Para a maior parte das espécies de Eimeria, são recolhidas fezes de aves infectadas 5-7 dias após a infecção, misturadas e filtradas para remover detritos, depois centrifugadas a uma velocidade suficiente para formar uma pastilha com o material fecal restante. Para E. tenella, é usado um processo semelhante excepto que os núcleos fecais são tomados a 6 dias pós infecção. A pastilha é resuspendida numa solução salina saturada, na qual os oócitos flutuam e em que a maior parte dos detritos contaminantes podem ser removidos por centrifugação. A suspensão de oócitos é então diluída para baixar a concentração salina. Os oócitos são lavados repetidamente para remover o sal e resuspendidos numa solução de dicromato de potássio (2,5 % (w/v). A suspensão de oócitos é incubada a 29 °C com agitação (e.g., 140 rpm) durante aproximadamente 72 horas para induzir a esporulação dos oócitos. Altemativamente, os oócitos podem ser tratados com hipoclorito de sódio e depois esporulados. O número de oócitos esporulados/ml é determinado por contagem directa usando um hemocitómetro, e a cultura é armazenada, de preferência refrigerada até ser necessária. Os oócitos podem ser usados de acordo com o presente método de vacinação, de preferência numa dose compreendendo Λ β Λ 10 a 10 oócitos por ovo. Ainda com maior preferência, a dose compreende 10 a 105 oócitos por ovo.

Para preparar esporócitos, o dicromato de potássio é removido da suspensão de oócitos descrita acima por lavagens repetidas dos oócitos, a qual envolve a recolha de oócitos por centrifugação e resuspensão em água destilada ou desionizada. Quando o dicromato for removido o que é determinado pela -9-

At-b^rfr

δ*» ausência de coloração amarelo alaranjada, a suspensão de oócitos é misturada com um volume igual de hipoclorito de sódio (lixívia) e incubado á temperatura ambiente durante 15 minutos. A lixívia é então removida por lavagens repetidas, e os oócitos são resuspendidos água desionizada ou fisiologicamente salina. Os oócitos podem ser partidos para libertarem os esporócitos usando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, os oócitos podem ser partidos para libertar esporócitos misturando os oócitos com pérolas de vidro de diâmetro 1-4 mm e agitando manualmente, com vortex, ou incubador com agitação, ou usando um homogeneizador sustentado manualmente. Os oócitos intactos e as paredes dos oócitos podem ser separados dos esporócitos libertados por centrifugação diferencial em Percoll® 50% (vendido por Pharmacia Biotech) ou sucrose 1M como descrito em Dulski et al., Avian Diseases, 32: 235-239, 1988. Os esporócitos podem ser usados no presente método de vacinação quer misturados com ou separados dos oócitos intactos e paredes de oócitos. De preferência, a dose de esporócitos é separada dos oócitos e paredes de oócitos. Uma dose preferida de esporócitos compreende 102 a 108 esporócitos por ovo. Ainda de maior preferência, a dose compreende 10 a 10 esporócitos por ovo.

Os esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, pode ser injectada in ovo em qualquer meio fisiológico apropriado. De preferência, eles são suspensos numa solução salina fisiologicamente equilibrada tal como solução salina tamponizada com fosfato. O meio seleccionado pode opcionalmente incluir um ou mais agentes de suspensão incluindo géis, gelatinas, hidrosóis, celulose, ou gomas de polisacarídeos fisiologicamente apropriados.

De preferência, no presente método de vacinação, esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de duas ou mais espécies Eimeria são injectados in ovo ao mesmo tempo. De acordo com o presente método de vacinação, esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de todas as espécies - 10-identificadas de Eimeria que infectam um ave domesticada específica, tal como frango, pode ser injectados in ovo ao mesmo tempo, ou em série, em doses apropriadas para fornecer protecção imunológica contra todas as espécies.

Os imunoestimuladores podem ser usados em conjunção com o presente método de vacinação. Os imunoestimuladores que podem ser usados no presente método de vacinação incluem, mas não estão limitados a, citoquinas, factores de crescimento, quemoquinas, sobrenadantes de culturas de células de linfócitos, monócitos, ou células de orgãos linfóides, preparações de células ou extractos de células (e.g., Staphylococcus aureus fixados ou preparações de liposacarídeos), mitógenios, ou adjuvantes, incluindo produtos farmacêuticos de baixo peso molecular. Os imunoestimuladores são administrados in ovo em qualquer altura durante a incubação. De preferência, os imunoestimuladores são administrados in ovo no meio contendo a dose de esporócitos ou oócitos Eimeria, ou misturas daqueles.

Lisboa, 29 de Junho de 2001

ALBERTO CANELAS

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON» 14 1200 LISBOA

I

Claims

-1 - /<v. íCM-r η * REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de esporócitos ou oócitos de Eimeria viva, ou uma mistura daqueles, na manufactura de uma vacina para protecção de uma ave domesticada contra cocídiose, em que uma dose de imunização efectiva da vacina é administrada in ovo durante o quarto final da incubação.
2. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 2 o 10 alO esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, em que o número total dos ditos esporócitos ou oócitos varia de 10 a 10 .
3. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 9 c 10 a 10 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, em que o número total 9 S dos ditos esporócitos ou oócitos varia de 10 a 10 .
4. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 105 a 101 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, em que o número total C *7 dos ditos esporócitos ou oócitos varia de 10 a 10 .
5. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 104 a 106 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, em que o número total dos ditos esporócitos ou oócitos varia de 104 a 106.
6. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 103 a 106 esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, em que o número total 3 6 dos ditos esporócitos ou oócitos varia de 10 a 10 . 1 A utilização da reivindicação 2, em que a ave domesticada é um frango. -2-
8. A utilização da reivindicação 7, em que a dose compreende esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de duas ou mais espécies de Eimeria seleccionadas de um grupo consisitindo de E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitiis, E. praecox, e E. brunetti.
9. A utilização da reivindicação 8, em que a dose é administrada por injecção in ovo.
10. A utilização da reivindicação 2, em que um imunoesti-mulador é administrado in ovo em qualquer altura durante a incubação.
11. A utilização da reivindicação 10, em que o imunoesti-mulador é administrado in ovo simultaneamente com a dose de esporócitos ou oócitos, ou mistura dos ditos esporócitos e oócitos.
12. A utilização da reivindicação 2, em que a dose compreende oócitos.
13. A utilização da reivindicação 2, em que a dose compreende esporócitos.
14. A utilização da reivindicação 13, em que os esporócitos foram purificados para remover oócitos.
15. A utilização da reivindicação 2, em que a ave domesticada é um peru.
16. A utilização da reivindicação 15, em que a dose compreende -3- esporócitos ou oócitos, ou uma mistura daqueles, de duas ou mais espécies de Eimeria seleccionadas de um grupo consistindo de E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda.
17. A utilização da reivindicação 16, em que a dose é administrada por injecção in ovo.
18. A utilização da reivindicação 2, em que a ave domesticada é uma ave de caça, pato ou ave corredora. Lisboa, 29 de Junho de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTÒR CORDON, 14 1200 LISBOA