JPH10506919A - コクシジウム症に対する卵内予防接種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、有効な免疫量の生きたアイメリアスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を卵内投与することを含んでなる、コクシジウム症に対して家禽を予防接種する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症に対する卵内予防接種発明の背景 本発明は、コクシジウム症に対する家禽の予防接種法に関する。特に、本発明 は、コクシジウム症に対して孵化したヒナを免疫するために、家禽の発生中（de veloping）の卵に生きたアイメリア種（Eimnelia spp）のスポロシスト又はオー シスト又はその混合物を卵内（in ovo）投与することに関する。 コクシジウム症は，アイメリア属の細胞内プロトゾア寄生虫による感染によっ て引き起こされる家禽の腸内疾患である。コクシジウム症は経済的に最も悲惨な 家禽の寄生虫疾患である。抗コクシジウム薬及びコクシジウム症による損失は、 家禽業者にとって毎年数億ドルにのぼると推定されている。 コクシジウム症に対して家禽を予防接種する様々な試みが１９５０年代初期か ら報告されている。現在の予防接種法は生きたアイメリアのオーシストを餌又は 水を通して家禽に投与することを含む。しかしながら、これらの方法は全ての家 禽が意図した量のオーシストを摂取するわけでなく、また多くの家禽がワクチン で保護されず病原体による感染を受けるので、不便なものであり効率が悪い。 J．M．Sharma and B．R．Burmester，Avian Dis．26:134-149，1981の中で、 著者は、シチメンチョウヘルペスウイルスを卵内予防接種したニワトリが、その 後のマレック病ウイルスによる攻撃に対する免疫を獲得したことを報告した。ヨ ーロッパ特許公開第２９１１７３号では、非複製的免疫源を投与する免疫法を卵 内（in ovo）投与と呼んでいる。このヨーロッパ特許公開で特に言及する免疫源 は、遺伝子操作されたアイメリア抗原及びアイメリアオーシストの抽出物である 。このヨーロッパ特許公開では、本発明の予防接種法で用いるような生きた寄生 虫段階のものを特に排除している。 本発明の予防接種法は、生きたアイメリアのスポロシスト又はオーシスト又は その混合物を家禽の発生中の卵に卵内投与することを含む。現在入手可能な文献 によると、このような予防接種法は卵内では効果がなく、孵化後に適用すべきで あると示唆する。T．K．Jeffers and G．E．Wagenbach，J．Parasit．56(4):656 -662，1970において、著者は抱卵（incubation）１０日目にE.テネラ（tenella ）のスポロゾイトを卵内注入したところ、その後のE.テネラオーシストによる攻 撃に対して有意な免疫保護を与えなかったと報告した。実際、処置を受けなかっ たニワトリは、スポロゾイトで卵内処置したニワトリよりも、その後のE.テネラ オーシストによる攻撃に対して生存率が高かったと、報告した。K．L．Watkins et al.，Proc．VI th．International Coccidiosis Conf.，Abstract E1-2，Ont ario，Canada，1993において著者は、抱卵中のどの時点で接種したかを示してい ないが、生きたE.マクシマ（maxima）のスポロシストとスポロゾイト形成した（ sporulated）オーシストを卵内接種したことを記載している。Watkinsらの研究 によると、卵内暴露によっては、孵化１０日後にE.マクシマオーシストでコクシ ジウム攻撃したことに対して保護されたと示す証拠は得られなかったと結論した 。彼らはさらに、卵内よりもむしろ孵化直後に接種すると有意な免疫保護が得ら れると結論した。この教示に反して、本発明の卵内予防接種法は、孵化したトリ をその後のコクシジウム攻撃に対して保護する予期せぬ免疫を与える。発明の概略 本発明は、”本予防接種法”と呼ぶこともあり、有効な免疫量の生きたアイメ リアスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を抱卵の最後の４分の１の期間 内に卵内投与することを含んでなる、コクシジウム症に対して家禽を予防接種す る方法に関する。 本明細書で用いる”家禽”という用語は、特記しない限り、ニワトリ、シチメ ンチョウ、アヒル、狩猟鳥（ウズラ、キジ及びガチョウを含むが、これに限定さ れない）及び走鳥類（ダチョウを含むが、これに限定されない）を含む。 本明細書で用いる”卵内（in ovo）”という用語は、特記しない限り、生きた 発生中の胚を含む家禽の卵内へ、ということを意味する。 本明細書で用いる”卵内へ投与する”又は”卵内投与”という用語は、特記し ない限り、ここに記載するワクチンを生きた発生中の胚を含む家禽の卵に、卵の 殻を貫通してワクチンを導入するあらゆる手段によって投与することを意味する 。このような投与手段にはワクチン注入を含むが、これに限定されない。 本明細書で用いる”抱卵の最後の４分の１の期間”という用語は、特記しない 限り、家禽の発生中の卵の抱卵の最後の４分の１の期間を意味する。 本明細書で用いる”アイメリア”という用語は、特記しない限り、家禽に感染 するアイメリア属の１以上の種を意味する。このようなアイメリア種には、E.テ ネラ、E.アセルブリナ（acervullna）、E.マクシマ、E.ネカトリックス（necatr ix)、E.ミティス（mitis）、E.プレコックス（praecox）及びE.ブルネッティ（b runetti）を含むニワトリに見られるもの、及びE.マレアグリミティス（maleagr imitis）、E.アデノエイデス（adenoeides）、E.ガロパボニス（gallopavonis） 、E.ディスペルサ（dispersa）、E.メレアグリディス（meleagridis）、E.イノ キュア（innocua）及びE.スブロツンダ（subrotunda）を含むシチメンチョウに 見られるもの、並びに上述したその他の家禽を感染するアイメリア種も含む。” アイメリア”という用語はまた、アイメリアの上述した種の全ての株を含み、放 射線照射されたりその他の処理を施されて完全に発達しないような株を含む早熟 株及び弱毒株を含むが、これに限定されない。アイメリアという用語は、上述し た家禽に感染するアイメリアの新しく発見された株又は種も含む。 本明細書で用いる”スポロシスト”という用語は、特記しない限り、生きたア イメリアのスポロシストを意味する。 本明細書で用いる”オーシスト”という用語は、特記しない限り、生きたアイ メリアのスポロゾイト形成したオーシスト又はスポロゾイト形成したオーシスト とスポロゾイト形成していないオーシストの混合物を意味する。 本明細書で用いる”有効免疫量”という用語は、特記しない限り、免疫されて いないトリの固有の免疫力よりも大きな免疫保護を孵化したトリに与えるのに十 分なスポロシスト又はオーシストの数、又は混合する場合にはスポロシストとオ ーシストの合計数を意味する。本明細書で用いる”免疫する”及び”予防接種す る”という用語は同義語であり、互換的に用いられる。 本発明の方法により投与する好ましい投与量は、１０²−１０⁸スポロシスト又 はオーシスト又はその混合物であり、この場合スポロシストとオーシストの合計 数が１０²−１０⁸である。 より好ましい投与量は、１０²−１０⁵スポロシスト又はオーシスト又はその混 合物であり、この場合スポロシストとオーシストの合計数が１０²−１０⁵である 。 別の好ましい投与量は、１０⁵−１０⁷スポロシスト又はオーシスト又はその混 合物であり、この場合スポロシストとオーシストの合計数が１０⁵−１０⁷である 。 別の好ましい投与量は、１０⁴−１０⁶スポロシスト又はオーシスト又はその混 合物であり、この場合スポロシストとオーシストの合計数が１０⁴−１０⁶である 。 別の好ましい投与量は、１０³−１０⁶スポロシスト又はオーシスト又はその混 合物であり、この場合スポロシストとオーシストの合計数が１０³−１０⁶である 。 本発明の方法により予防接種する好ましい家禽はニワトリである。 ニワトリ卵に卵内投与する好ましい投与量は、E.テネラ、E.アセルブリナ、E. マクシマ、E.ネカトリックス、E.ミティス、E.プレコックス及びE.ブルネッティ からなる群より選択される２以上のアイメリア種のスポロシスト又はオーシスト 又はその混合物を含む。 本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽はシチメンチョウである。 シチメンチョウ卵に卵内投与する好ましい投与量は、E.マレアグリミティス、 E.アデノエイデス、E.ガロパボニス、E.ディスペルサ、E.メレアグリディス、E. イノキュア及びE.スブロツンダからなる群より選択される２以上のアイメリア種 のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含む。 本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽は狩猟鳥、アヒル及び走鳥 類である。 本発明の方法はさらに、本発明の予防接種法と組み合わせて、抱卵中のいずれ かの時点において免疫刺激剤を卵中投与することを含む。 免疫刺激剤を投与する好ましい方法は、抱卵の最後の４分の１の期間内にスポ ロシスト又はオーシスト又はスポロシストとオーシストの混合物の一定投与量を 卵内投与するのと同時に行う。発明の詳細な説明 本発明の予防接種法は、生きたアイメリアスポロシスト又はオーシスト又はそ の混合物を抱卵の最後の４分の１の期間内に家禽の卵に卵内投与することを含む 。ニワトリの場合、卵内投与は好ましくは抱卵の１５−２０日目に、より好まし くは抱卵の１８日目に行う。シチメンチョウの場合、卵内投与は好ましくは抱卵 の ２１−２６日目に行う。 本発明の予防接種法はいかなる適切な卵内投与方法を用いて行ってもよい。好 ましくは、本発明のワクチンは注入によって投与する。注入の１方法によると、 １８ゲージの針を用いて卵の大きい方の末端の卵殻に穴をあけて卵の気胞を露出 する。適切なサイズ（１−３ｍｌ）のシリンジをつけた１．０−１．５インチの ２２ゲージの針を穴及び気胞の膜を通して挿入する。適切な数のスポロシスト又 はオーシスト又は混合する場合には適切な数のスポロシストとオーシストを適切 な液体担体、例えばリン酸緩衝塩液１０−５００μｌに懸濁して卵に注入する。 適切な容量は処置する卵のサイズに依存し、ダチョウの卵ではニワトリの卵より も明らかに多くの容量を要するであろう。注入部位は卵又は胚のいかなる領域で あってもよい。好ましくは、注入は卵の大きい方の末端の中心から軸方向に羊膜 内に行う。 あるいは、本発明の予防接種法では自動卵注入システムを用いることもできる 。このようなシステムは米国特許第４，６８１，０６３号、４，０４０，３８８ 号、４，４６９，０４７号、及び４，５９３，６４６号に記載されており、これ らを参照としてここに援用する。その他の適切な注入法も当業者には公知である 。 本発明の予防接種法に使用するオーシストは当業者に公知のいくつかの方法に よって調製できる。このような方法には、J．F．Ry1ey et al.，Parasitology 7 3:311-326，1976及びP．L．Long et al.，Fo1ia Veterinaria Latina VI＃3，20 1-217，1976に記載されており、これらを参照としてここに援用する。１つの方 法によると、約２週齢の市販のブロイラーニワトリに、適切な投与量のスポロゾ イト形成したオーシストを経口で強制餌養させることにより興味のあるアイメリ ア種で感染する。例えば、E.テネラで用いた典型的な投与量は、トリ１羽当たり ２００，０００スポロゾイト形成したオーシストである。感染したトリからオー シストを回収及び精製する公知の方法を次に行う。ほとんどのアイメリア種では 、感染の５−７日後に感染したトリから糞を回収し、混合して濾過することによ りカスを除き、残渣の糞物質をペレットにするのに十分な速度で遠心する。E.テ ネラでは、感染６日目に盲腸コアを取り出す点を除き、同様の方法を用いる。ペ レットを飽和塩溶液に再懸濁すると、オーシストは浮遊し、ほとんどの汚染カス は 遠心により除去できる。次いでオーシスト懸濁液を希釈して低塩濃度にする。オ ーシストを繰り返し洗浄して塩を除去し、重クロム酸カリウム溶液（２．５％ｗ ／ｖ）に再懸濁する。オーシスト懸濁液を震盪（例えば１４０ｒｐｍ）しながら 約７２時間２９℃でインキュベートし、オーシストのスポロゾイト形成を誘導す る。あるいは、オーシストを次亜塩素酸ナトリウムで処理した後スポロゾイト形 成することもできる。血球計数器を用いて１ｍｌ当たりのスポロゾイト形成した オーシストの数を直接計数し、培養液を好ましくは必要時まで冷蔵で保存する。 本予防接種法では、オーシストは、好ましくは卵１個当たり１０²−１０⁸オーシ ストを含む投与量で用いることができる。より好ましくは、投与量は卵１個当た り１０²−１０⁵オーシストを含む。 スボロシストを調製するには、オーシストを繰り返し洗浄することにより上述 のオーシスト懸濁液から重クロム酸カリウムを除去し、これには遠心によるオー シストの回収と脱イオン水又は蒸留水への再懸濁を含む。黄橙色が消えることに よって判断して、重クロム酸カリウムが除去されたら、オーシスト懸濁液を等容 量の次亜塩素酸ナトリウム（ブリーチ）と混合して室温で1５分インキュベート する。次いで繰り返し洗浄してブリーチを除去し、オーシストを生理食塩水又は 脱イオン水に再懸濁する。種々の公知の方法を用いて、オーシストを壊してスポ ロシストを放出させる。例えば、１−４ｍｍ直径のガラスビーズとオーシストを 混合して手、ボルテックスミキサー又は震盪培養器で震盪するか、あるいは手で もつホモジェナイザーを用いてオーシストを壊してスポロシストを放出させる。 放出されたスポロシストから、壊れなかったオーシスト及びオーシスト壁を、Du lski et al.，AvianDiseases，32:235-239，1988に記載するように、５０％Perc o11^TM（PharmaciaBiotechから販売）又は１Ｍスクロース中で分別遠心すること により分離できる。本発明の予防接種法ではスポロシストを破壊されていないオ ーシスト及びオーシスト壁と混合するか、あるいはこれから分離して用いること ができる。好ましいスボロシスト投与量は卵１個当たり１０°−１０°スポロシ ストを含む。より好ましくは、投与量は卵１個当たり１０°−１０°スポロシス トを含む。 スポロシスト又はオーシスト又はその混合物はいかなる生理学的に適当な溶媒 中で卵内注入してもよい。好ましくは、リン酸緩衝塩溶液のような生理学的にバ ランスのとれた塩溶液中に懸濁する。選択した溶媒は、場合により生理学的に適 当なゲル、ゼラチン、ヒドロゾル、セルロース又は多糖ガムを含む１以上の懸濁 剤を含んでいてもよい。 好ましくは、本発明の予防接種法では、２以上のアイメリア種のスポロシスト 又はオーシスト又はその混合物を同時に卵中注入する。本発明の予防接種法では 、ニワトリのような特定の家禽を感染する全ての同定されたアイメリア種のスポ ロシスト又はオーシスト又はその混合物を、全ての種に対する免疫学的保護を与 えるための適当な投与量で同時に又は連続して卵中注入することができる。 本発明の予防接種法と組み合わせて免疫刺激剤を用いることができる。適当な 免疫刺激剤には、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養物 の上清、単球、又はリンパ球器官由来の細胞、細胞調製物又は細胞抽出物（例え ば、固定化Staphy1ococcusaureus又はリポ多糖調製物）、マイトジェン、又は低 分子量医薬を含むアジュバントを含むが、これに限定されない。免疫刺激剤は抱 卵中のいかなる時点で卵内投与してもよい。好ましくは、免疫刺激剤は投与量の アイメリアスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含む溶媒中で卵内投与 する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェーバー，フレデリック・エイチ アメリカ合衆国インディアナ州47803，テ レ・ホート，フェニックス・コート 159

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有効な免疫量の生きたアイメリアスポロシスト又はオーシスト又はその混 合物を抱卵の最後の４分の１の期間内に卵内投与することを含んでなる、コクシ ジウム症に対して家禽を予防接種する方法。 ２．投与量が１０²−１０⁸のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含 み、ここでスポロシスト及びオーシストの合計数が１０²−１０⁸の範囲である請 求項１記載の方法。 ３．投与量が１０²−１０⁵のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含 み、ここでスポロシスト及びオーシストの合計数が１０²−１０⁵の範囲である請 求項１記載の方法。 ４．投与量が１０⁵−１０⁷のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含 み、ここでスポロシスト及びオーシストの合計数が１０⁵−１０⁷の範囲である請 求項１記載の方法。 ５．投与量が１０⁴−１０⁶のスボロシスト又はオーシスト又はその混合物を含 み、ここでスポロシスト及びオーシストの合計数が１０⁴−１０⁶の範囲である請 求項１記載の方法。 ６．投与量が１０³−１０⁶のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含 み、ここでスポロシスト及びオーシストの合計数が１０³−１０⁶の範囲である請 求項１記載の方法。 ７．家禽がニワトリである請求項２記載の方法。 ８．投与量がE.テネラ、E.アセルブリナ、E.マクシマ、E.ネカトリックス、E. ミティス、E.プレコックス及びE.ブルネッティからなる群より選択される２以上 のアイメリア種のスポロシスト又はオーシスト又はその混合物を含む請求項７記 載の方法。 ９．投与量を卵内注入によって投与する請求項８記載の方法。 １０．抱卵のいずれかの時点において免疫刺激剤を卵内投与することをさらに含 んでなる請求項２記載の方法。 １１．免疫刺激剤を投与量のスポロシスト又はオーシスト又はスポロシスト及び オーシストの混合物と同時に卵内投与する請求項１０記載の方法。 １２．投与量がオーシストを含んでなる請求項２記載の方法。 １３．投与量がスポロシストを含んでなる請求項２記載の方法。 １４．スポロシストがオーシストを除去するように予め精製されている精製１３ 記載の方法。 １５．家禽がシチメンチョウである請求項２記載の方法。 １６．投与量がE.マレアグリミティス、E.アデノエイデス、E.ガロパボニス、E. ディスペルサ、E.メレアグリディス、E.イノキュア及びE.スブロツンダからなる 群より選択される２以上のアイメリア種のスポロシスト又はオーシスト又はその 混合物を含む請求項１５記載の方法。 １７．投与量を卵内注入により投与する請求項１６記載の方法。 １８．家禽が狩猟鳥、アヒル又は走鳥類である請求項２記載の方法。