PT2348890E - Probióticos para utilização em fêmeas de mamíferos gestantes para reforçar a imunidade da sua descendência - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROBIÓTICOS PARA UTILIZAÇÃO EM FÊMEAS DE MAMÍFEROS GESTANTES PARA REFORÇAR A IMUNIDADE DA SUA DESCENDÊNCIA"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se à utilização de bactérias probióticas no fabrico de uma composição nutricional para fêmeas de mamíferos gestantes para melhorar o estado imunológico da sua descendência recém-nascida.

Antecedentes da Invenção 0 estado imunológico do recém-nascido é uma questão importante. Este estado abrange desde a protecção presente no nascimento do lactente à aquisição dessa protecção imunológica durante as primeiras horas, dias ou semanas de vida do lactente. A capacidade de adquirir e manter essa protecção é um factor crucial na saúde do lactente confrontado com o seu novo ambiente. Em humanos, estas questões são da maior importância para a saúde da população.

Manter as mães gestantes em bom estado de saúde durante a gestação é um factor chave para a promoção da saúde da descendência durante a gestação e após o nascimento. Os factores de saúde geral que são conhecidos incluem os seus hábitos alimentares, a sua ingestão de micronutrientes, a sua história 1 infecciosa e também se referem ao seu estado imunológico. Por exemplo, as deficiências de alguns minerais, vitaminas ou substâncias (tal como o ácido fólico) podem afectar o desenvolvimento do feto e também afectar o desenvolvimento pós-natal do lactente. A alimentação da mãe desempenha, a esse respeito, um papel fundamental na saúde futura dos lactentes e foram feitos muitos esforços para monitorizar e melhorar o equilíbrio nutricional das gestantes. A esse respeito são essenciais os suplementos alimentares ou simplesmente directrizes gerais para alimentação.

Juntamente com a orientação nutricional geral para gestantes, é agora reconhecido que alguns alimentos específicos podem promover a proliferação de uma flora microbiana específica no tracto gastro-intestinal da gestante. A flora microbiana equilibrada pode, por sua vez, ter um efeito sobre o hospedeiro. A utilização de prebióticos, i. e., substâncias nutricionais para melhoramento da flora microbiana intestinal de um hospedeiro, foi descrita, por exemplo, no documento WO 02/07533 pelas suas vantagens para a saúde em indivíduos do sexo feminino.

Além disso, foi reivindicado no documento W02007/105945A que a alimentação das gestantes com ingredientes prebióticos, especialmente certo tipo de sacáridos não digeríveis, podia melhorar a flora microbiana e/ou o sistema imune da descendência.

Também se demonstrou que a complementação da ingestão nutricional com microrganismos, de um modo preferido, microrganismos vivos, melhora o equilíbrio da flora microbiana 2 do tracto intestinal do hospedeiro. Demonstrou-se que a modulação da flora microbiana do tracto intestinal por microrganismos específicos vivos traz efeitos fisiológicos positivos particulares. Por exemplo, a resposta imune induzida por tipos específicos de bactérias probióticas foi amplamente estudada e descrita ("Cross talk between probiotics bactéria and the host immune system", The journal of nutrition, Blaise Corthesy et al., suplemento, 2007, páginas 781S-790S) . Como descrito na literatura científica, demonstrou-se, mais particularmente, que estirpes específicas de microrganismos têm efeitos vantajosos. Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus caseii são exemplos genericamente conhecidos de famílias que se demonstrou terem efeitos probióticos.

Coloca-se a hipótese de que os probióticos, como outros comensais, vão influenciar as funções imunes do hospedeiro, quer através da modulação da composição da flora microbiana e/ou da actividade metabólica, quer por meio de uma interacção directa com o sistema imune subjacente à mucosa intestinal. Na sequência desta interacção, as funções imunes vão ser activadas como reflectido pela libertação de mediadores imunológicos (citocinas), produção de anticorpos e activação de linfócitos bem como de outras células imunitárias. Estas células activadas, citocinas e/ou compostos bacterianos, vão exercer funções moduladoras imunitárias num local diferente do corpo através da circulação sanguínea. A este respeito, é postulado que um efeito vantajoso no estado imunitário da mãe, através de suplementação probiótica, já pode influenciar o desenvolvimento imunitário fetal. Além disso, também é conhecido que as células imunitárias e outros factores bioactivos originários do intestino da mãe podem ser transportados para o leite materno através de uma via de transporte entero-mamária e transmitidos ao recém-nascido 3 durante a lactação. Portanto, vale a pena colocar a hipótese adicional de que a suplementação de gestantes pode promover um enriquecimento do leite materno com factores imunitários que vão contribuir para apoiar o desenvolvimento imunitário neonatal.

Assegurar o futuro saudável da descendência é uma necessidade bem reconhecida. Mais especificamente, garantir o melhor desenvolvimento e maturação do sistema imune da descendência é da máxima importância.

Convencionalmente, além de tratamentos médicos que respondem a situações médicas especificas, a ênfase é colocada num bom equilíbrio nutricional das gestantes. Contudo, não se conhece muito sobre como melhorar especificamente o estado imune da descendência durante o período de gestação. Há, no entanto, uma necessidade de um passo adicional para garantir o futuro saudável da descendência, utilizando as descobertas mais recentes sobre nutrição. Há, portanto, uma necessidade de provocar impacto positivo na saúde da descendência através de uma dieta nutricional direccionada das gestantes. Há, em particular, uma necessidade de ajudar a garantir o melhor sistema imune na descendência, para melhor a preparar para os desafios antigénicos no início de vida, bem como para melhorar a maturação futura do seu sistema imune, para melhor promover a protecção durante a infância posterior. Há, uma necessidade de provocar impacto na construção do sistema imune da descendência o mais cedo possível durante e ao 4 longo de toda a gestação, bem como nas fases iniciais da vida do recém-nascido quando o sistema imune está a amadurecer a passos rápidos. Há uma necessidade de aumentar a aptidão do sistema imune da descendência para reagir contra os antigénios em geral e contra doenças infecciosas em particular. Há uma necessidade de proporcionar estas vantagens por meios que sejam simultaneamente eficientes e isentos de impacto negativo sobre as gestantes e/ou a sua descendência.

Sumário da Invenção A invenção é definida pelas reivindicações.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de probióticos em fêmeas de mamíferos gestantes no fabrico de uma composição, para administração oral, para estimular a imunidade da sua descendência após o nascimento, caracterizada por os referidos probióticos serem Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona a utilização dos probióticos reivindicados durante o período de gestação e/ou durante o período de lactação da descendência.

Noutro aspecto da invenção, os probióticos são administrados na ou com a comida, bebidas, suplementos alimentares ou composições farmacêuticas, da gestante, e conjuntamente com outros ingredientes activos, tais como 5 prebióticos. A invenção estende-se, ainda, à composição utilizada pelos métodos acima referidos para o fim indicado.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1 e 3 realçam, esquematicamente, os procedimentos experimentais dos estudos 1 e 2 descritos respectivamente.

As Figuras 2 e 4 mostram os resultados dos estudos indicando um reforço imune da descendência.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições: Nesta descrição, os termos seguintes têm os seguintes significados: "Fêmeas de mamíferos gestantes" são mamíferos fêmeas que tiveram, pelo menos, um ovócito fecundado em desenvolvimento no seu útero. De um modo preferido, são considerados por esta invenção humanos do sexo feminino (i. e., mães ou futuras mães). "Probiótico" significa preparações de células microbianas ou componentes de células microbianas com um efeito vantajoso na saúde ou no bem-estar do hospedeiro. (Salminen S., Ouwehand A., Benno Y. et ai. "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sei. Technol. 1999:10 107-10). O probiótico pode compreender uma única estirpe de microrganismo, uma mistura de 6 várias estirpes e/ou uma mistura de vários microrganismos. No caso de misturas, o termo singular "probiótico" pode ainda ser utilizado para designar a mistura ou preparação probiótica. "Prebiótico", genericamente, significa um ingrediente alimentar não digerível que afecta vantajosamente o hospedeiro por estimular selectivamente o crescimento e/ou actividade de microrganismos presentes no intestino do hospedeiro e, assim, tentar melhorar a saúde do hospedeiro. "Descendência" refere-se ao recém-nascido ou bebé a nascer dos indivíduos mamíferos do sexo feminino. Em particular, inclui a descendência ainda em gestação. De um modo preferido, é considerada pela presente invenção a fase juvenil/fase de infância (i.e., até à adolescência em humanos - 12-14 anos), de um modo mais preferido, a presente invenção refere-se ao estado imune da descendência na primeira infância (até aos 2 a 4 anos de idade em humanos). A requerente constatou que a administração de probióticos a fêmeas de mamíferos gestantes pode ter impacto no sistema imune da descendência e, mais particularmente, pode reforçar o sistema imune da descendência de forma a permitir uma resposta melhor e mais forte do sistema imune após a exposição a antigénios. A modulação do sistema imune da descendência pode acontecer muito cedo na sua vida intra-uterina ou na fase inicial da vida extra-uterina, quando o seu sistema imune está a amadurecer. A requerente evidenciou o efeito de reforço na ausência de contacto directo óbvio entre o sistema intestinal da descendência e a composição de probióticos administrada às gestantes, i. e. durante a vida intra-uterina da descendência. 7

Além disso, a requerente verificou que essa composição compreendendo probióticos também pode ter um efeito vantajoso no sistema imune da descendência durante o período de lactação.

Sem ficar limitado pela teoria, especula-se que a colonização parcial do tracto intestinal das fêmeas gestantes pelo probiótico induz a criação de um sinal molecular. Crê-se que o descendente recebe e reage a este sinal molecular. Crê-se, ainda, que o sistema imune do descendente é afectado por esse sinal. Esse sinal tem um efeito positivo na maturação do sistema imune do descendente. Isto pode conduzir a uma melhor aptidão para responder a antigénios após o nascimento. Especula-se, ainda, que o sinal pode ser transmitido para ao descendente durante o período de lactação, mais especificamente, se houve um pré-condicionamento para o sinal durante o período de gestação do descendente. Fêmeas gestantes. A utilização e a composição da presente invenção é realizada e administrada a mamíferos fêmeas gestantes, i. e., fêmeas que vão dar à luz. A utilização considerada pela presente invenção vai desde a concepção da descendência (fecundação) passando pelo período de gestação completa, até ao parto, da descendência. Também pode estender-se ao período de lactação até ao desmame. 0 desmame parcial, até à terminação completa da lactação, também está incluído na presente invenção. Não está excluído que a utilização considerada pela invenção também se estenda ao período imediatamente anterior à fecundação que tem impacto no estado de saúde das fêmeas e, indirectamente, no estado de saúde da descendência.

Os mamíferos podem ser mulheres grávidas. Nesse caso, o período de gestação é de cerca de 9 meses e o período de lactação pode variar consideravelmente de acordo com os hábitos, cultura e estado de saúde das mulheres. As fêmeas de mamíferos também podem ser outras fêmeas de mamíferos, incluindo cavalos e animais de estimação, tais como cães e gatos. Outras fêmeas de mamíferos gestantes não estão excluídas desta invenção.

Microrganismos probióticos

Os microrganismos probióticos considerados pela presente divulgação pode incluir qualquer probiótico seleccionado do grupo compreendendo Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus e Saccharomyces ou as suas misturas, de um modo preferido seleccionado do grupo que consiste em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Enterococcus faecium, Streptococcus sp. e Saccharomyces boulardii ou as suas misturas. Outros microrganismos probióticos não estão excluídos desta divulgação desde que sejam capazes de proporcionar o efeito de reforço imune descrito.

De um modo mais preferido, o probiótico é seleccionado do grupo que consiste em Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 (nome alternativo NCC4007 e LPR), Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 vendido inter alia pela empresa Christian Hansen da Dinamarca, sob a marca Bbl2 (nome alternativo NCC2818), Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 vendido por Morinaga Milk Industry Co. Ltd., do Japão, sob a marca BB536, Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225 9 (nome alternativo NCC533 e IAF), Lactobacillus fermentum VRI 003 vendido por Probiomics (Austrália) sob a marca PCC, Bifidobacterium longum CNCM 1-2170, Bifidobacterium longum CNCM 1-2618, Bifidobacterium breve vendido por Danisco (Dinamarca) sob a marca Bb-03, Bifidobacterium breve vendido por Morinaga (Japão) sob a marca M-16V e a estirpe de Bifidobacterium breve vendida pelo Institut Roseli (Lallemand) (Canadá) sob a marca R0070, Lactobacillus paracasei CNCM 1-1292, Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 que pode ser obtido inter alia de Valio Oy da Finlândia sob a marca LGG, Enterococcus faecium SF 68, e as suas misturas. Um probiótico preferido é Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724.

Doses de probiótico. O probiótico pode estar presente na composição numa vasta gama de %, desde que o probiótico especifico utilizado administre o efeito de reforço da imunidade descrito. No entanto, de um modo preferido, o probiótico está presente na composição numa quantidade equivalente a entre 103 e IO10 ufc/g de composição seca (ufc = unidade formadora de colónias) . Esta expressão inclui as possibilidades de as bactérias estarem vivas, inactivadas ou mortas ou, até mesmo, presentes como fragmentos, tais como materiais de ADN ou de paredes celulares. Por outras palavras, a quantidade de bactérias que contém a formulação é expressa em termos da aptidão formadora de colónias dessa quantidade de bactérias como se todas as bactérias estivessem vivas, independentemente de se estão, de facto, vivas, inactivadas ou mortas, fragmentadas ou uma mistura de quaisquer ou de todos estes estados. De um modo preferido, o probiótico está presente numa quantidade equivalente a entre 104 10 a 109 ufc/g de composição seca, de um modo ainda mais preferido, numa quantidade equivalente a entre 106 e 108 ufc/g de composição seca. Método de administraçao. A composição pode ser administrada às fêmeas gestantes por uma variedade de modos, desde que induza um contacto entre a composição e o tracto gastro-intestinal das fêmeas. De um modo preferido, a composição é administrada como parte dos alimentos, bebidas ou suplementos alimentares das fêmeas. A composição também pode ser administrada numa composição farmacêutica. De um modo preferido, a administração é oral ou entérica. A administração oral é a mais preferida uma vez que tem um impacto menos traumático nas fêmeas. No entanto, em estados patológicas ou quando a alimentação entérica é também utilizada, a administração da composição pode ser feita por adição à alimentação entérica.

Administração com outros compostos.

Em qualquer caso, a composição pode ser administrada sozinha (pura ou diluída em água, por exemplo) ou numa mistura com outros compostos (tais como suplementos alimentares, suplementos nutricionais, medicamentos, veículos, aromatizantes, ingredientes digeríveis ou não digeríveis). Vitaminas e minerais são exemplos de suplementos alimentares típicos. Numa forma de realização preferida, a composição é administrada conjuntamente com outros compostos que aumentam o efeito descrito na imunidade da descendência. Esses compostos sinérgicos podem ser um veículo 11 ou uma matriz, que facilita a administração dos probióticos ao tracto intestinal da fêmea, de um modo preferido, numa forma activa. Esses compostos sinergéticos também podem afectar o estado de saúde ou o metabolismo da fêmea gestante, tal como para aumentar o efeito da composição sobre o sistema imune da descendência. Esses compostos sinérgicos podem ser outros compostos activos que sinergicamente ou separadamente influenciam a resposta imune do lactente e/ou potência o efeito do probiótico. Um exemplo desses compostos sinérgicos é maltodextrina. Um dos efeitos de maltodextrina consiste em proporcionar um veiculo para o probiótico, aumentando o seu efeito, e para evitar a agregação. Outros exemplos incluem compostos prebióticos conhecidos, tais como os compostos hidratos de carbono seleccionados do grupo que consiste em inulina, fruto-oligossacárido (FOS), fruto-oligosacárido de cadeia curta (FOS de cadeia curta), galacto-oligossacárido (GOS), xilooligosacárido (XOS), glangliosido, goma de guar parcialmente hidrolisada (PHGG), goma acácia, goma de soja, lacto-goji, extratos de goji ou as suas misturas. Podem estar presentes outros hidratos de carbono, tal como um segundo hidrato de carbono que actua em sinergia com o primeiro hidrato de carbono e que é seleccionado do grupo que consiste em xilo-oligossacárido (XOS), goma, goma acácia, amido, goma de guar parcialmente hidrolisada ou uma sua mistura. 0 hidrato de carbono ou os hidratos de carbono podem estar presentes a cerca de 1 g a 20 g ou 1% a 80% ou 20% a 60% das doses diárias da composição. Alternativamente, os hidratos de carbono estão presentes a 10% a 80% da composição seca. Em qualquer caso, no entanto, a dose diária de hidratos de carbono deve cumprir as directrizes de segurança e requisitos regulamentares. Para crianças, um limite típico, por exemplo, é 12 um máximo de 6 g/L/dia.

Num caso da presente divulgação, uma composição nutricional, de um modo preferido, compreende uma fonte de proteína. A proteína alimentar é a preferida como uma fonte de proteína. A proteína alimentar pode ser qualquer proteína alimentar adequada; por exemplo, proteínas animais (tal como proteína do leite, proteína da carne ou proteína do ovo) ; proteínas vegetais (tal como proteína de soja, proteína de trigo, proteína de arroz e proteína de ervilha); uma mistura de aminoácidos livres ou uma sua combinação. As proteínas do leite, tal como a caseína, as proteínas de soro de leite e proteínas de soja são particularmente preferidas. A composição pode também compreender uma fonte de hidratos de carbono e/ou uma fonte de gordura.

Se a composição da invenção é uma composição nutricional e inclui uma fonte de gordura, a fonte de gordura proporciona, de um modo preferido, cerca de 5% a cerca de 55% da energia da composição nutricional; por exemplo, cerca de 20% a cerca de 50% da energia. Os lípidos que compõem a fonte de gordura podem ser qualquer gordura ou mistura de gorduras adequadas. A gordura vegetal é particularmente adequada; por exemplo, óleo de soja, óleo de palma, óleo de coco, óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de canola, lecitina e semelhantes. As gorduras animais, tal como gordura do leite, também podem ser adicionadas se desejado.

Uma fonte adicional de hidratos de carbono pode ser adicionada à composição nutricional. De um modo preferido, proporciona cerca de 40% a cerca de 80% da energia da composição 13 nutricional. Pode ser utilizado qualquer hidrato de carbono adequado, por exemplo, sacarose, lactose, glucose, frutose, sólidos de xarope de milho, maltodextrina ou uma sua mistura.

Também podem ser adicionadas fibra alimentar adicional, se desejado. Se for adicionado, de um modo preferido, compreende até cerca de 5% da energia da composição nutricional. A fibra alimentar pode ser de qualquer origem adequada, incluindo, por exemplo, soja, ervilha, aveia, pectina, goma de guar, goma acácia, fruto-oligosacárido ou uma sua mistura.

Vitaminas e minerais adequados podem ser incluídos na composição nutricional numa quantidade para cumprir as directrizes apropriadas.

Um ou mais emulsionantes de qualidade alimentar podem ser incluídos na composição nutricional, se desejado; por exemplo, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e di-glicéridos, lecitina e mono- ou di-glicéridos ou uma sua mistura. Analogamente podem ser incluídos sais e/ou estabilizadores adequados. Pode adicionar-se aromatizantes à composição.

Período de administração. 0 período de administração começa com a fecundação, ou logo que possível, após a fecundação (resp. depois de a futura mãe estar consciente da sua gravidez) . No entanto, o período de administração também pode começar mais cedo. Por exemplo, o período de administração pode preceder a fecundação por 1 ou 2 meses. Nesse caso, crê-se que o estado de saúde da mãe a ser fecundada tem impacto sobre o estado de saúde da futura 14 descendência. 0 período de administração também pode começar relativamente tarde na gravidez, de um modo preferido, no mês 3, 5 ou 7 da gravidez (quando se considera fêmeas humanas) ou nos períodos correspondentes para outros mamíferos. Um início muito tardio da administração da composição também pode ser considerado, i. e. aos, ou em torno, dos 8 ou 9 meses (algumas semanas antes do nascimento). Nesse, especula-se que o efeito sobre o sistema imune da descendência é um efeito a curto prazo e rápido, preparando-o melhor para a exposição a antigénios após o nascimento. 0 período de administração pode ser contínuo (por exemplo, até ao, e incluindo, o aleitamento até ao desmame) ou descontínuo. De um modo preferido, o período de administração é contínuo para um melhor efeito prolongado. No entanto, especula-se que um padrão descontínuo (por exemplo, administração diária durante 1 semana por mês) pode proporcionar "sinais de reforço imune descontínuos" que induzem efeitos positivos na descendência. A duração da administração pode variar. Se são esperados efeitos positivos com uma duração relativamente curta de administração (por exemplo, administração diária durante 1 semana ou 1 mês), crê-se que as durações longas proporcionam um efeito melhorado (por exemplo duração de 3, 5 ou 8 meses em humanos, nos períodos correspondentes noutros mamíferos). De um modo preferido, o período de administração abrange, substancialmente, toda a duração do período de gestação. Numa forma de realização, abrange mais de 50%, mais de 70% ou mais de 80% do período de gestação. A duração da administração também pode abranger a totalidade, ou uma parte, do período de lactação. De um modo mais preferido, também abrange a duração total do período de lactação. A duração pode abranger 0%, 30% ou mais, 50% ou mais ou 80% ou mais do período de lactação. Numa forma de realização específica, o período de administração da composição podem abranger o período de lactação 15 (todo ou parte dele), mas não o período de gestação; nesse caso, as vantagens da composição são transmitidas através do leite da fêmea à descendência. De um modo mais preferido, o período de administração abrange uma parte (ou a totalidade) do período de gestação e parte (ou a totalidade) do período de lactação. De um modo preferido, a administração é par ser feita na toma diária (a ser tomada uma ou duas vezes por dia) ou na toma semanal (a ser feita uma ou duas vezes por semana).

Num exemplo da presente divulgação, a composição também é administrada directamente à descendência desde que a mãe tenha recebido a composição durante a gestação. De um modo preferido, a composição é administrada, de um modo mais preferido, oralmente, directamente à descendência, durante a lactação ou após o desmame parcial ou total. A dupla exposição da mãe (durante a gestação) e da descendência (administração directa) à composição pode de facto proporcionar vantagens aumentadas de uma forma sinérgica. Especula-se que a exposição durante a gestação induz um pré-condicionamento da descendência para responder melhor à administração directa posterior.

Efeito da composição. A composição da invenção administrada a fêmeas de mamíferos gestantes induz o reforço da imunidade da descendência. Esse reforço é particularmente mensurável após o nascimento, mas pode começar durante o período de gestação.

Especificamente, o termo "reforço da imunidade" aí utilizado exclui as respostas alérgicas. 0 termo "reforço da imunidade" é definido como um reforço das funções imunes inatas 16 e uma promoção da resposta imune específica a antigénios. A resposta imune inata pode ser respostas celulares, actividade fagocitária, actividade leucocitária e/ou anticorpos polirreactivos. A resposta imune específica pode ser a activação celular e/ou respostas de anticorpos específicos. 0 termo "reforço da imunidade" pode compreender, ou pode ser definido, como o aumento das defesas imunes do corpo e/ou o aumento da capacidade do corpo para responder aos desafios antigénicos infecciosos. Os referidos desafios antigénicos podem ser agentes virais e/ou bacterianos e/ou parasitários, ou seus derivados de antigénios, subunidades, compostos da superfície celular e/ou toxinas.

Num caso, a composição da invenção reforça a transmissão de competências imunes das referidas fêmeas para a referida descendência. Ao fazê-lo, a composição é capaz de proporcionar à descendência melhores probabilidades de suportar os desafios da sua vida inicial. Em última análise, a composição ajuda a descendência a ter um melhor começo de vida e/ou a ficar melhor protegida contra infecções.

Num caso, esse efeito de reforço é um aumento da capacidade da descendência para responder a uma exposição antigénica. À nascença o sistema imune do lactente está tanto num estado que lhe permite responder apropriadamente a exposições antigénicas como num estado de maturação rápida. A exposição a antigénios também participa para melhorar a maturação do sistema imune. Após o nascimento, todos os lactentes ficam naturalmente expostos aos antígenos ambientais ou patogénicos. 0 sistema imune da descendência responde a essa exposição. Numa forma de realização da presente invenção, o sistema imune da descendência é capaz de responder de um modo mais eficiente à exposição a 17 antigénios. Num caso, a resposta à exposição antigénica pode ser medida pela dosagem de anticorpos específicos para o referido antigénio. No contexto da invenção, pode ser determinado uma elevação tanto quantitativa como qualitativa dos anticorpos específicos. Num caso, essa elevação pode ser determinada no soro e/ou na saliva e/ou nas fezes dos descendentes expostos aos antigénios. Num caso, a resposta à exposição antigénica compreende uma elevação dos anticorpos polirreactivos totais, de um modo preferido, no soro e/ou na saliva e/ou as fezes da descendência. Numa forma de realização, a resposta à exposição antigénica compreende uma elevação da resposta imune celular no sangue da descendência, de um modo preferido, um aumento do número e/ou aumento da actividade dos leucócitos da referida descendência (para ilustração, ver resultados do exemplo 2). Entende-se que o tipo de resposta está altamente dependente do tipo de exposição, embora alguns antigénios possam induzir uma resposta imune complexa mensurável por mais do que um dos efeitos acima citados (por exemplo, elevação de anticorpos específicos e elevação de anticorpos polirreactivos e/ou elevação da resposta imune celular). As determinações da resposta imune podem ser feitas por métodos convencionais de imunoensaio conhecidos, como a contagens celulares, ensaios de anticorpos, actividade fagocitária, bem como actividade celular citotóxica (actividade de neutrófilos e células assassinas naturais), doseamento de marcadores de imunidade, incluindo citocinas, factores de crescimento bem como marcadores imunes de superfícies celulares e outros semelhantes. A elevação é determinada contra os níveis das correspondentes amostras de descendentes cujas mães não foram expostas à composição da invenção (= amostras de controlo). 18

Uma exposição antigénica que é de particular relevância no contexto da invenção inclui, mas não está limitada, à exposição a vírus, de um modo preferido, rotavírus e adenovírus, ou exposição a bactérias infecciosas, de um modo preferido, Escherichia coli, Vibrio cholerae, salmonelas, clostrídios, shigellas, ou exposição a infecção por parasitas infecciosos, de um modo preferido, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Cryptosporidium spp ou as suas misturas. É de interesse particular para o estado de saúde dos lactentes apresentar uma melhor aptidão para responder a essa exposição patogénica. Isto pode contribuir para uma melhor protecção da descendência contra estes agentes patogénicos e, por último, para melhor os proteger contra as infecções correspondentes induzidas por estes agentes patogénicos. Mais genericamente, pode contribuir para uma melhor protecção da descendência contra muitos tipos de agentes patogénicos (= sistema imunológico reforçado em geral). 0 efeito positivo sobre as alergias também ser contemplado dentro do âmbito desta invenção, uma vez que o efeito no sistema imune pode ser uma resposta mais equilibrada e mais controlada a alergénios. 0 efeito de reforço do sistema imune da descendência pode atingir um máximo durante o período de lactação ou durante a fase juvenil/infância. Para os humanos o máximo do reforço é, de um modo preferido, conseguido entre o nascimento (dia 0) e 24 meses de vida, de um modo mais preferido, entre o nascimento (dia 0) e o dia 180 de vida. Não está excluído que o efeito de reforço durar até à fase adulta jovem da vida da descendência. Para os mamíferos não humanos têm de ser considerados períodos correspondentes. 19

Exemplo 1, Estudo em murganhos 1

Material e métodos: Em todas as experiências foram utilizados murganhos BALB/c fêmeas com seis semanas de idade convencionais (18-20 g), adquiridos a Charles River (Domaine des Oncins, BP 010969592, L'Arbresle Cedex, França). Os murganhos foram alojados em condições isentas de agentes patogénicos específicos no biotério da Clinique Medicai Universitaire de Genebra (CMU-Genebra) , e 6 a 8 crias de cada ninhada foram distribuídos por cada grupo de estudo.

Os animais tiveram livre acesso à dieta convencional regular. Os murganhos grávidos receberam pós de probiótico ou de placebo suspensos na água de beber. A água potável foi mudada diariamente. Foram comparados três grupos: - Grupo A de controlo (Maltodextrina) - Grupo B Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 (STL11) - Grupo C Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 (LPR)

Todos os produtos foram obtidos da fonte pública habitual. Os nomes "STll" e "LPR" são abreviaturas ou designações alternativas para os microrganismos citados. A vacina contra o sarampo viva atenuada (MV-S) foi adquirida a Aventis-Pasteur (Lyon, França).

Determinações - a determinação de anticorpos contra o vírus do sarampo (isotipos IgGl e IgG2a) e de IgG total no soro foi realizada por ELISA no Center for Vaccinology and Neonatal Immunology (CVNI) 20 do University Medicai Center de Genebra (Suíça), de acordo com normas.

Procedimento experimental: (A Figura 1 apresenta uma vista esquemática do procedimento): 1. Quatro murganhos fêmeas grávidas por grupo receberam água potável contendo A, B ou C durante a gravidez e durante o desmame. 2. Do desmame (3 semanas) em diante, todas as crias receberam água normal sem quaisquer aditivos. As mães foram sacrificadas. 3. Às 3 semanas (imunização infantil), as crias (5-8 crias por ninhada; 28 crias por grupo) foram imunizadas com vírus do sarampo atenuados vivos (5 x 105 CCID50). 4. As crias foram monitorizadas semanalmente (das 3 às 8 semanas de idade) quanto ao ganho de peso e as fezes foram recolhidas uma vez por semana (das 3 às 8 semanas de idade). 5. As crias foram sangrados 3 e 5 semanas após a imunização para a determinação da IgG total e de anticorpos IgGl e IgG2a específicos do sarampo. 6. Cinco semanas depois da imunização todos os murganhos foram sacrificados.

Para avaliar diferenças das vacinas contra o sarampo, foram aplicados os testes de Krsukal-Wallis seguidos por testes de Mann-Withney (Wilcoxon). 21

Resultados: A Figura 2 apresenta uma ilustração gráfica dos resultados obtidos. Não foi identificado efeito sobre o crescimento do recém-nascido. Não foram observadas diferenças nas respostas à vacina relacionadas com ninhadas, género ou peso corporal especifico. Um aumento significativo da resposta de anticorpos após a vacinação contra o sarampo foi observada em todos os grupos, reflectindo um processo de maturação de anticorpos normal. A resposta imune foi caracterizada por respostas Thl:Th2 mistas, como ilustrado pelos níveis de IgGl e IgG2a bem eguilibrados observados em todos os grupos. A suplementação de mães com ST11 não tem nenhum efeito estatisticamente significativo na capacidade de resposta da cria à vacina contra o sarampo (nas condições de ensaio). No entanto, a suplementação de LPR a mulheres grávidas promoveu títulos de IgG mais elevados em comparação com controlos sem alterar o perfil imune geral da resposta à vacina contra o sarampo.

Conclusão: Estes resultados parecem indicar gue os efeitos são específicos da estirpe probiótica. Na verdade, ST11 parece ter pouco efeito na maturação imune intestinal da cria e capacidade de resposta à vacina contra o sarampo. Em contraste, a suplementação LPR a mães grávidas promoveu respostas de IgG periféricas aumentadas à vacina contra o sarampo em murganhos adultos jovens.

Exemplo comparativo 2, Estudo em murganhos 2

Material e métodos: Utilizou-se, em todas as experiências, murganhos BALB/c fêmeas grávidas com seis semanas de idade convencionais (18-20 g) , adquiridos a Janvier, França. Os murganhos foram alojados em condições isentas de agentes 22 patogénicos específicos no biotério do Centro da Investigação da Nestlé e 10 a 12 crias de cada ninhada foram atribuídos a cada grupo de estudo.

Os animais tiveram livre acesso à dieta convencional regular. Os murganhos grávidos receberam pós de probiótico ou de placebo suspensos na água de beber. A água potável foi mudada diariamente. Foram comparados dois grupos: - Grupo A de controlo (Maltodextrina) - Grupo B Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 (BL)

Todos os produtos foram obtidos de fonte pública habitual. 0 nome "BL" é uma abreviatura do microrganismo citado. A vacina de Toxóide do Tétano, Tetanol Pur (40 UI) foi adquirida a Novartis (Suíça).

Determinações • A determinação da proliferação de células T do baço na presença de anticorpo anti-CD3 foi realizada de acordo com procedimentos correntes. Resumidamente, esplenocitos foram incubados com CD3 anti-murganho ligado a placas (2,5 pg/mL incubado 2 h, a 37 °C, BD Pharmigen, n° de cat 553056) em placas com 96 poços, a 37 °C, durante 72 h. A proliferação celular foi determinada pela incorporação de [metil-3H] timidina (Amersham Pharmacia Biosciences) como descrito (DeCicco, K. L., Youngdahl, J. D. e Ross, A. C. 2001 Immunology 104, 341-348). Os dados estão representados como contagens por minuto, normalizadas pela percentagem de células positivas a CD3 efectivamente presentes 23 no baço de murganhos testados.

As dosagens dos anticorpos IgG séricos específicos para toxóide do tétano foram realizadas por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação com 96 poços foram revestidas com 0,1 pg de antigénio TT total (Calbiochem, Toxóide do Tétano de Clostridium tetani, n° de cat 582231) em PBS. Após 3 lavagens com PBS-Tween 20 a 0,05%, as placas foram bloqueadas com um tampão de PBS-20%, FCS-0,05% Tween 20 durante 1 h, a 37 °C, e depois lavadas de novo 3 vezes. Diluições em série de soros de murganhos em tampão de bloqueamento foram incubadas durante 2 h a 37 °C. Após 3 lavagens, IgG específica de TT ligada foi detectada pela incubação com um anticorpo de anti-IgG de murganho de cabra conjugado com biotina (SouthernBiotech, n° de cat 1034-08) durante 1 h a 37 °C. Após 3 lavagens, as placas de ELISA foram incubadas com estreptavidina marcada com peroxidase (KPL, n° de cat 14-30-00) durante 30 minutos a 37 °C. Após 3 passos de lavagem final, adicionou-se substrato peroxidase (KPL, n° de cat 50-76-00). A reacção colorimétrica foi bloqueada com ácido sulfúrico e a densidade óptica a 450 nm foi então determinada num espectrofotómetro. Os títulos de anticorpos foram então calculados como descrito (Ma, Y. e Ross, R. C., 2005, Proc. Natl. Acad. Sei. 20 Set. 2005; 102(38):13556-61).

Procedimento experimental: (A Figura 3 apresenta uma vista esquemática do procedimento): 1. Dois a três murganhos fêmeas grávidas por grupo receberam água potável contendo placebo ou BL durante a gravidez e durante as duas primeiras semanas de lactação. 24 2. Do desmame (3 semanas) em diante, todas as crias receberam água normal sem quaisquer aditivos. As mães foram sacrificadas. 3. Às 3 semanas, um subgrupo de crias em cada grupo (5-6 crias por grupo) foi sacrificado para avaliar a proliferação de células do baço 4. Às 3 semanas (imunização dos lactentes), as restantes crias (5-6 crias por grupo) foram imunizadas subcutaneamente com a vacina TT (1/4 da dose humana). 5. Quatro semanas após a primeira imunização foi administrado às crias um reforço da vacina. 6. As crias foram sangradas 4 semanas após a primeira imunização e 2 semanas após o reforço para determinação de anticorpos IgG anti-TT, depois, os murganhos foram sacrificados.

Para avaliar as diferenças na proliferação de células T e vacina TT foram aplicados testes de Mann-Whitney (Wilcoxon).

Resultados: A Figura 4 mostra que um aumento significativo da resposta de anticorpos após a vacinação TT foi observado em todos os grupos, o que reflecte um processo de maturação de anticorpos normal. A suplementação de mães com BL durante a gravidez e lactação promoveu uma maior reactividade das células T sistémica e aumentou, significativamente, os títulos de IgG em comparação com placebo.

Conclusões: Os dois estudos do exemplo 1 e do exemplo comparativo 2 destacam o facto de que é possível promover o 25 desenvolvimento imune da descendência através de intervenção perinatal, em particular, através de suplementação das mães durante a gravidez e lactação com probióticos. Estes efeitos são específicos da estirpe como indicado pelo Estudo 1, no entanto, não parecem ser específicos da espécie. De facto, a suplementação com LPR ou BL a mães grávidas parece promover uma maior maturação imune na descendência.

Lisboa, 19 de Setembro de 2013 26

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de probióticos no fabrico de uma composição para administração oral a fêmeas de mamíferos gestantes para reforçar a imunidade da sua descendência após o nascimento, caracterizada por os referidos probióticos serem Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724.
2. 2. Utilização da reivindicação 1 para reforçar as funções imunes inatas e/ou promover a resposta imune específica a antigénios infecciosos da referida descendência.
3. 3. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida composição reforça a transmissão de competências imunes das referidas fêmeas para a referida descendência.
4. 4. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que as referidas fêmeas de mamífero são humanos.
5. 5. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida composição é administrada oralmente às referidas fêmeas, em alimentos, bebidas, suplementos nutricionais ou composições farmacêuticas.
6. 6. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida composição é administrada durante um período de administração, compreendendo o referido período de administração uma parte do período de gestação das referidas fêmeas, em que a referida parte abrange mais de 50% do período de gestação. 1
7. 7. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido periodo de administração compreende parte do período de lactação da referida descendência, em que a referida parte abrange 30% ou mais do período de lactação.
8. 8. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido período de administração compreende mais de 50% do período de gestação e 30% ou mais do período de lactação.
9. 9. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida composição compreende, ainda, ingredientes ou prebióticos, de um modo preferido, seleccionados de inulina, fruto-oligossacárido (FOS), fruto-oligossacárido de cadeia curta (FOS de cadeia curta), galacto- oligossacárido (GOS), xilo-oligossacárido (XOS), glangliosido, goma de guar parcialmente hidrolisada, goma acácia, goma de soja, Lacto-goji, extractos de goji ou uma sua mistura.
10. 10. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido reforço da imunidade compreende um aumento da aptidão da descendência para responder a uma exposição antigénica.
11. 11. Utilização da reivindicação 10, em que a resposta à referida exposição antigénica compreende: - uma elevação dos anticorpos específicos para os referidos antigénios, de um modo preferido, no soro da referida descendência e/ou na saliva e/ou nas fezes, e/ou 2 - uma elevação dos anticorpos polirreactivos totais, de um modo preferido, no soro da referida descendência e/ou na saliva e/ou nas fezes, e/ou uma elevação da resposta imune celular no sangue da referida descendência, de um modo preferido, um aumento do número e/ou aumento da actividade dos leucócitos da referida descendência.
12. 12. Utilização da reivindicação 10 ou 11, em que a referida exposição antigénica compreende a exposição a virus, de um modo preferido, rotavirus e adenovírus, ou a exposição a bactérias infecciosas, de um modo preferido, Escherichia coli, Vibrio cholerae, salmonelas, clostrídios, shigellas, ou exposição a infecção por parasitas infecciosos, de um modo preferido, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Cryptosporidium spp. ou as suas misturas.
13. 13. Utilização de qualquer das reivindicações 10 a 12, em que a referida aptidão de resposta aumentada à referida exposição antigénica contribui para melhor proteger a referida descendência contra infecções no inicio de vida, compreendendo as referidas infecções, de um modo preferido, infecções virais, tais como infecções por rotavirus e infecções por adenovírus, ou infecções bacterianas, tais como infecção por Escherichia coli, infecção por Vibrio cholerae, infecção de salmonelas, infecção por clostrídios, infecção por shigella, ou infecções por parasitas, tais como Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Cryptosporidium spp. 3
14. 14. Utilização de qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido reforço de imunidade atinge o seu máximo durante o referido período de lactação, ou durante a fase juvenil da referida descendência, de um modo preferido, entre o nascimento (dia 0) e os 24 meses de vida, de um modo mais preferido, entre o nascimento (dia 0) e o dia 180 de vida. Lisboa, 19 de Setembro de 2013 4