FI110668B - Probioottien käyttö atooppisten sairauksien primaariseen ehkäisyyn - Google Patents

Description

1 110668

Probioottien käyttö atooppisten sairauksien primaariseen ehkäisyyn

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö kuuluu allergioiden ehkäisyn alaan, ja koskee erityisesti atooppisten sairauksien primaarista ehkäisemistä antamalla probioottisia bakteereita, ter-5 veen suolistoflooran hyödyllisiä mikrobeja, ennen syntymää ja syntymän jälkeen lapsille, joilla on suuri atooppisten tautien riski.

Keksinnön tausta

Nykyisin allergia, joka ilmenee atooppisina tauteina - atooppisena ekseemana, allergisena nuhana ja astmana - edustaa merkitykseltään kasvavaa kroonista sairautta ta-10 loudellisesti kehittyneissä maissa maailmanlaajuisesti. Varhaisen iän infektioiden ja atopian välisen käänteisen yhteyden osoittaminen edustaa tärkeää kehitystä, joka on johtanut uuteen tieteelliseen mielenkiintoon vuosikymmen sitten esitettyä hygienia-hypoteesia kohtaan, jonka mukaan atopian viimeaikainen nopea yleistyminen voi itse asiassa johtua parantuneesta hygieniasta ja pienentyneestä perhekoosta. Viimeaikai-15 set epidemiologiset tulokset ovat tuottaneet sekä tätä hypoteesia puoltavia että sen vastaisia tuloksia.

Suoliston mikrofloora edistää prosesseja, joilla on mahdollisuus toimia allergiaa vas-' · · ·' tustavasti: 1) T auttaja 1 -tyypin immuniteetti, 2) transformoiva kasvutekijä β:η ' * ·; (TGF-β) tuotto, jolla on olennainen rooli Th-2-indusoidun allergisen tulehduksen 20 vaimentamisessa ja oraalisen toleranssin synnyttämisessä ja 3) IgA:n tuotto, joka on limakalvojen immuunipuolustuksen korvaamaton komponentti (Sanfilippo ym., ‘! 2000; Isolauri ym., 2000). Suoliston mikrofloora voi näin ollen edustaa raskausajan ja varhaislapsuuden yleisen Th2-painottuneen immuunijärjestelmän pääasiallista syntymän jälkeistä vastasäätelijää. Kohtaaminen mikrobiantigeenien kanssa maha-25 suolikanavassa alkaa välittömästi syntymän jälkeen, ja täysin muodostuneen suolis-. ·. : tomikroflooran elinkykyisten solujen määrä on kymmenkertaisesti suurempi kuin . · * * isännän solujen määrä. Kommensaaliset maha-suolikanavan mikrobit muodostavat • · .!. * niin muodoin varhaisimman ja tärkeimmän ärsykkeen suolistoon liittyvän imukudok- sen kehitykselle.

2 110668

Probiootit, jotka määritellään terveydelle suotuisiksi elintarvikkeiden eläviksi mikro-biainesosiksi, ovat terveen ihmisen suolistomikroflooran normaaleja kommensaalisia bakteereita. Useimmin käytettyjä sukuja ovat laktobasillit ja bifidobakteerit. Probi-oottien tiedetään kumoavan atooppisesta ekseemasta ja ruoka-allergiasta kärsivillä 5 lapsilla tyypillisen kohonneen suolistoläpäisevyyden, ja tehostavan suolistospesifisiä IgA-vasteita, jotka ovat usein puutteellisia lapsilla, joilla on ruoka-allergia (Isolauri ym., 1993; Majamaa ja Isolauri, 1996; Isolauri, 1992). Suoliston estefunktion edistäminen probioottien avulla sisältää myös suoliston mikroekologian, jonka muutoksia on osoitettu allergisilla henkilöillä, normalisoinnin. Viimeaikaiset tulokset osoittavat, 10 että tietyt probiootit lievittävät allergiseen tulehdukseen liittyviä muutoksia sekä in vitro että in vivo (Isolauri ym., 1993; Majamaa ja Isolauri, 1997). Probioottinen kanta Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (Lactobacillus GG; ATCC 53103), on osoitettu turvalliseksi varhaisessa iässä ja tehokkaaksi allergisen tulehduksen ja ruoka-allergian hoidossa. Suoliston normaalimikrofloorassa on spesifisillä kannoilla näin ollen 15 huomattavia vaikutuksia isännän fysiologiaan ja immunologiaan.

Syntymähetkellä ihmisen maha-suolikanava on steriili, mutta ensimmäisten elinkuu-kausien ja -vuosien aikana tapahtuu nopea perättäinen kolonisaatio, joka johtaa suoliston pysyvään normaalimikroflooraan. Samanaikaisesti voimistuu vastasyntyneiden yleisesti Th2-dominantti immuniteetti atooppisissa henkilöissä ja atooppinen tauti 20 ilmenee myöhemmin. Sen lisäksi, että normaali mikrofloora vaikuttaa vastasynty-' ’; * neen maha-suolijärjestelmään, kohdataan toinen massiivinen ja jatkuva antigeeniläh- "; de ruokavalion antigeenien muodossa. Viimeaikaiset eläimillä tehdyt tutkimukset ’ ‘ . osoittavat, että nämä saattavat tehostaa atooppistyyppistä immuniteettia sekä lima- ... t kalvo- että systeemisellä tasolla. Jokaisen allergiaa vastustamaan suunnitellun mene- _' '·! t 25 telmän on siis tuotettava pääasialliset vaikutuksensa varhaislapsuudessa, ja edullisesti silloin, kun ensimmäiset kohtaamiset ruokavalion antigeenien kanssa tapahtuvat.

.,.,: Probiootit ovat tässä erityisen soveltuvia tehtävään, ei yksin ajoituksen suhteen vaan . ·. myös koska ne kykenevät vähentämään ruokavalion antigeenikuormitusta hajotta- .* . maila ja muuntamalla makromolekyylejä (Pessi ym., 1998).

» · ’: * 30 Keksinnön yhteenveto ! Esillä olevassa hakemuksessa osoitamme kliinisesti, että spesifiset probiootit vähen tävät oleellisesti atooppisen ekseeman yleisyyttä, mikä osoittaa tällaisten mikrobien 3 110668 estävän atooppista tautia. Tässä hakemuksessa esitettävät bifidobakteereilla tehdyissä suoliston kolonisaatiotutkimuksissamme saadut lisätulokset osoittavat toisaalta, että suoliston mikroflooran erot edeltävät atopian kehittymistä. Näiden tietojen perusteella ehdotamme, että altistus normaalimikroflooran spesifisille kannoille edustaa avain-5 asemassa olevaa immuniteetin suojayksikköä atopiaa ja myöhempiä atooppisia tauteja vastaan ja että varhaista bifidogeenistä suolistomikroflooraa edistävillä probioo-teilla on niin muodoin mahdollista estää allergiaa.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää Lactobacillus GG -kokeen yhteenvetoa.

10 Kuvio 2 esittää kokonais-IgE-vasta-aineiden geometrisia keskiarvopitoisuuksia kahden ensimmäisen elinvuoden aikana terveissä lapsissa (avoin ympyrä) ja kaksivuotiaissa lapsissa, joilla on atooppinen ekseema (umpinainen ympyrä). Virhepylväs edustaa 95 %:n luotettavuusväliä. *p=0,009 ja ^ρ=0,02, atooppisista ekseemasta kärsivät lapset vs. terveet lapset (riippumaton t-testi).

15 Kuvio 3 esittää dendrogrammia, joka edustaa ulostenäytteiden bakteerien rasvahap-poprofiilien suhteellisia samanlaisuuksia kaasukromatografialla analysoituna asteikolla 0 - 100 atoopikoista ja ei-atoopikoista peräisin olevien näytteiden välillä, 3 viikon ja 3 kuukauden kohdalla.

; Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ' ’ ‘'. 20 Esillä oleva keksintö esittää menetelmän atooppisten tautien primaariseksi ehkäise- » · miseksi lapsessa, jolla on suuri tällaisten tautien riski, jossa menetelmässä raskaana ‘ 1! olevalle naiselle annetaan päivittäin annos eläviä probioottisia bakteereita vähintään kahden viikon ajan ennen synnytystä, ja synnytyksen jälkeen vastasyntyneelle lapsel-.,,.; le annetaan päivittäin annos eläviä probioottisia bakteereita vähintään 2 kuukauden .·*, 25 ajan.

’, ’ · · Synnytyksen jälkeen voidaan probioottiset bakteerit antaa imettävän äidin välityksel- ‘: ‘ *: lä tai suoraan vastasyntyneelle lapselle. Mitä tahansa halutun vaikutuksen antavaa : ‘ · päivittäistä bakteeriannosta voidaan käyttää, sopiva annos on noin 1 x 108 - noin 1 x • · •; · ·: 1010 probioottisten bakteerien pesäkkeitä muodostava yksikköä.

4 110668

Probioottiset bakteerit, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, ovat esimerkiksi maitohappobakteereita tai bifidobakteereita. Sopiva maitohappobakteerikanta on Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (ATCC 53103), ja sopiva bifidobakteerikanta on Bifidobacterium lactis Bb-12.

5 Myös muita bakteerikantoja, joilla on osoitettu probioottisia ominaispiirteitä, voidaan käyttää. Lisäksi voidaan antaa maitohappobakteerien ja bifidobakteerien seos.

Antamalla esillä olevan keksinnön mukaisia probioottisia bakteereita korkean riskin omaavalle pikkulapselle atooppisen taudin primaarista ehkäisemistä varten, pikkulapsen suolistoflooraan vaikutetaan suotuisasti. Aloitettaessa hoito äidin raskauden 10 aikana kohoaa rintamaidon suojaavien tekijöiden, kuten tulehdusta vastustavien sy-tokiinien määrä. Estämällä allerginen tulehdustila tällä tavalla on mahdollista estää atooppisen taudin puhkeaminen.

Esillä olevassa hakemuksessa käytettävä ilmaisu ’’primaarinen ehkäiseminen” tarkoittaa ehkäisevää hoitoa tarkoituksena estää kokonaan taudin puhkeaminen riskille 15 alttiissa henkilössä.

Esillä oleva tutkimus on ensimmäinen prospektiivinen kliininen osoitus atooppista tautia estävästä spesifisestä mikrobista, ja uusi oivallus voi saada aikaan erinomaisen tilaisuuden suunnitella strategioita allergiaa vastaan.

. . *. Esillä olevassa tutkimuksessa Lactobacillus GG:tä (ATCC 53103) annettiin ennen «· » .:. 20 syntymää äitien välityksellä ja syntymän jälkeen 6 kuukauden ajan lapsille, joilla on •; · · · korkea atooppisten tautien riski, satunnaistetussa plasebokontrolloidussa atooppisen : ’": taudin kaksoissokkoestokokeessa.

• M

Eräs tutkimukseen sisällyttämisen kriteeri oli atooppisen sairauden historia perheessä, s.o. yhdellä tai useammalla perheenjäsenellä (äiti, isä ja/tai vanhempi sisarus) on . · · ·, 25 atooppinen ekseema, allerginen nuha tai astma. Perheitä hankittiin äitiysklinikoilla , · t Turun kaupungissa (väkiluku 170 000) helmikuun 1997 ja tammikuun 1998 välillä • · · • ·» ‘ ; vuoden ajan, syntymäkuukauden vaikutuksen eliminoimiseksi atooppiseen herkisty miseen. Yhteensä 159 äitiä satunnaistettiin tietokoneen avulla saamaan kaksi kapse-‘ · " lia plaseboa (mikrokiteinen selluloosa) tai 1 x 1010 pesäkettä muodostavaa yksikköä 30 Lactobacillus GG:tä (Valio Oy, Suomi) kerran päivässä 2-4 viikon ajan ennen syn- 5 i *it66Ö nytystä. Synnytyksen jälkeen saattoivat imettävät äidit valita joko kapselien nauttimisen itse, tai muuten aineet lisättiin pikkulasten ruokavalioon. Jälkimmäisessä tapauksessa kapselin sisältö annettiin veteen sekoittamisen jälkeen lusikalla. Näistä antotavoista molempien, äidin välityksellä tai pikkulapseen, on osoitettu johtavan saman-5 laisiin Lactobacillus GG -määriin pikkulasten ulosteissa (Majamaa ja Isolauri, 1997). Lactobacillus GG-ja plasebokapselit ja niiden sisällöt näyttivät, tuoksuivat ja maistuivat identtisiltä. Kapseleita nautittiin syntymän jälkeen 6 kuukauden ajan. Toimittaja piti koodit hallussaan kunnes kaikki tiedot oli kerättyjä analysoitu. Koe oli Turun yliopistollisen keskussairaalan eettisen toimikunnan ja Turun kaupungin terveysvi-10 raston komitean hyväksymä. Lasten vanhemmilta saatiin kirjallinen, heidän kokeesta saamaansa tietoon perustuva suostumus.

Lapset tutkittiin kliinisesti ja immunologisesti syntymää seuraa van jakson aikana ja myöhemmillä tutkimuskäynneillä 3, 6, 12, 18 ja 24 kuukauden iässä. Fyysinen tutkimus, jonka aina suoritti sama lääkäri, käsitti silmien, korvien, nenän ja ihon tarkas-15 tuksen, sydämen ja keuhkojen kuuntelun, vatsan palpaation sekä kasvun ja hermostollisen kehityksen arvioinnin. Vanhemmilta kysyttiin heidän pienokaistensa merkeistä ja oireista, jotka mahdollisesti liittyivät atooppisiin tauteihin (iho: punoitus, kuivuus, tihkuminen, raapiminen (kutina); silmät ja nenä: punoitus, märkävuoto, ai-vastelu, hierominen (kutina); keuhkot; yskä, vinkuva ääni, hengästyneisyys). Seeru-20 min kokonais-IgE- ja spesifisten IgE-vasta-aineiden määritykset maitoa, munaa, kissaa ja huonepölypunkkia vastaan tehtiin Pharmacia CAP FEIA -immunomäärityk-‘i sellä UniCAP 100 -automaattianalysaattorilla (Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Ruot- ., *,: si) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Antigeenispesifisen IgE:n arvo, joka oli suurem- . · · ·, pi kuin 0,35 kU/1 katsottiin kohonneeksi. Ihon pistokokeen reaktiot luettiin 10 mi- .··*. 25 nuutin kohdalla, ja puolet histamiinidihydrokloridin (10 mg/ml; ALK Abello,

Horsholm, Tanska; ALK) reaktion koosta (2+) tai enemmän merkittiin positiiviseksi •:; edellyttäen, että näppylän keskimääräinen läpimitta oli vähintään 3 mm ja negatiivi- •' ’nen kontrolli (ALK) samaan aikaan oli 0 mm. Testatut antigeenit käsittivät maidon, • * : joka sisälsi 1,5 % rasvaa, vehnäjauhon, joka oli laimennettu 1:10 (paino/til.) 0,9- • · · 30 prosenttisella (paino/til.) natriumkloridilla, ruisjauhon, joka oli laimennettu 1:10 ,· . (paino/til.) 0,9-prosenttisella (paino/til.) natriumkloridilla, gliadiinin, joka oli lai- ' ; mennettu 1:1000 (paino/til.) 0,9-prosenttisella (paino/til.) natriumkloridilla, munan valkuaisen (ALK), turskan (ALK), soijapavun (ALK), lateksin (Stallergens, Ranska), 6 110668 koivun (ALK), kuusi paikallista ruohoa (kaikki ALK:lta), kissan (ALK), koiran (ALK) ja Dermatophagoidespteronyssimus -allergeenin Der pl (ALK). Lisäksi testattiin banaani, peruna ja porkkana prick-prick-tekniikalla. Ihon pistokoetulokset katsottiin positiivisiksi, jos pikkulapsella ilmeni vähintään yksi positiivinen reaktio tes-5 tattuja antigeenejä vastaan.

Krooninen uusiutuva atooppinen ekseema kahden vuoden iässä katsottiin ensisijaiseksi päätepisteeksi, koska se edustaa atooppisten tautien pääasiallista ilmentymistä ensimmäisten elinvuosien aikana. Koehenkilöt ryhmiteltiin tästä taudista kärsiviin (lapset, joilla atooppinen ekseema) tai niihin, jotka eivät kärsi taudista (terveet lapio set). Atooppinen ekseema varmistui, jos seuraavat ominaispiirteet havaittiin: kutina, esiintyminen kasvoissa ja/tai ojentajassa, ja krooninen uusiutuva kulku. Viimeksi mainittu kriteeri täyttyi, mikäli 24 kuukauden tutkimuskäynnillä ja vähintään yhdellä muulla aiemmalla käynnillä oli yhden kuukauden tai pidempään kestänyt ilmeinen ekseema. Neljäs pääkriteeri, atooppisen taudin perhehistoria, oli eräs tutkimukseen 15 sisällyttämiskriteeri. Allergisen nuhan diagnoosi vahvistettiin, mikäli kaksi tai useampi seuraavista oireista koettiin useimpina päivinä: nenävuoto, tukkeuma, aivastelu, ja kutina. Näiden oireiden ohimenevä yhteys allergeenialtistukseen, oireiden helpottuminen antihistamiinihoidolla ja osoitus atooppisesta herkistymisestä (s.o. positiivinen ihon pistokoe ja/tai positiivinen radioallergosorbent-määritys) olivat välttämät-... 20 tömiä (sine qua non). Astman diagnoosi perustui kansainvälisen pediatrisen astman ' konsensusryhmän luomaan algoritmiin. Astma diagnosoitiin, mikäli pikkulapsella oli astmaan viittaavaa kroonista tai toistuvaa yskää, aivastelua ja/tai hengästyneisyyttä, ..ja jos vaihtoehtoiset diagnoosit oli suljettu pois, ja jos astmanhoitokoe oli tehokas.

• · · ‘ · · ·' Koehenkiöiden perusominaisuudet olivat samanlaiset plasebo- ja Lactobacillus GG - ’···' 25 ryhmissä (Taulukko 1). Yhteensä 132/159(83 %) henkilöä suoritti 2-vuotisen tutki muksen loppuun. Ainakin 56 henkilöllä molemmissa ryhmissä voitiin havaita atoop- 1 < ♦ ♦ ♦ pisen taudin esiintyvyyden 25 %:n absoluuttinen riskin väheneminen (50 %:n riski *! ‘ plaseboryhmässä ja 25 %:n Lactobacillus GG -ryhmässä) 5 %:n merkitsevyystasolla * * " 80 %:n tehokkuudella. Vastaavat lopetusmäärät olivat samantasoiset (Kuvio 1).

, * ’ : 30 Atooppinen ekseema diagnosoitiin 46/132 (35 %) lapsessa kahden vuoden iässä.

* · » • · .,..: Näistä lapsista viisi myös täytti astman diagnostiset kriteerit ja yksi sekä astman että allergisen nuhan kriteerit. Rintaruokinnan kesto oli verrannollinen niiden pikkulasten 7 110668 välillä, joilla ilmeni atooppinen ekseema, 7,0 (5,8 - 8,2) kuukautta, ja niillä, joilla ei sitä ollut 6,7 (5,9 - 7,5) kuukautta; keskiarvo (95 % CI) (p=0,65 riippumattomassa t-testissä). Ikä atooppisen ekseeman oireiden puhjetessa oli 4,9 (3,9 - 6,2) kuukautta; geometrinen keskiarvo (95 % CI). Objektiivinen SCORAD 24 kuukauden iässä oli 5 10 (9 - 11) lapsilla, joilla oli atooppinen ekseema; geometrinen keskiarvo (95 % CI).

Lapsilla, joilla oli atooppinen ekseema, kohoavat IgE-pitoisuudet ilmenivät kahden vuoden ikään mennessä (Kuvio 2). Reaktiivisuus ihon pistokokeessa tavallisia ympäristön antigeenejä vastaan oli tavallisempaa lapsilla, joilla oli atooppinen ekseema kuin terveillä lapsilla 12 ja 24 kuukauden iässä (p=0,03 ja p=0,01 vastaavassa järjes-10 tyksessä x2-testillä) kun taas kohonneiden antigeenispesifisten IgE-pitoisuuksien esiintymistiheys seerumissa oli samanlainen ryhmien välillä (p=0,22 ja 0,31 vastaavassa järjestyksessä x2-testillä). Tavallisimmat antigeenit, jotka aiheuttivat positiivisia reaktioita jommalla kummalla menetelmällä olivat muna ja lehmänmaito.

Atooppisen ekseeman esiintyvyys väheni puoleen pikkulapsissa, joille annettiin pro-15 bioottia, 15/64 (23 %), verrattuna esiintyvyyteen plaseboa saavissa pikkulapsissa, 31/68 (46 %) (p=0,008 x2-testillä). Luku, joka tarvitaan hoitamiseen oli 4,5 (2,6-15,6) 95 % CI:lla.

Useimmat äidit, 28/43 (65 %) probioottiryhmässä, jotka imettivät vähintään 6 kuu- • · · •... · kauden ajan, valitsivat probioottikapseleiden itse nauttimisen vaihtoehdon. Ehkäisevä :· 20 vaikutus ei ollut riippuvainen antotavasta, koska Lactobacillus GG -interventio- ..!: ryhmässä atooppinen ekseema diagnosoitiin 9/36 (25 %) tapauksessa, mikäli pikku- • * lapset nauttivat probiootin itse ja 6/28 (21 %) tapauksessa jos imettävät äidit nautti- ; il vat kantaa (p-0,74 χ -testillä). Lactobacillus GG.n ehkäisevä vaikutus oli selvin lap- ' *'' sissa, joilla oli IgE-vasta-aineita jo napanuoraveressä; 3/20 (15 %) pikkulasta, joilla . 25 oli havaittavaa IgE:tä napanuoraveressä ja jotka saivat Lactobacillus GG:tä, kehitti- • > · « · vät atooppisen ekseeman, verrattuna lukuun 9/19 (47 %) niillä, jotka saivat plaseboa; '! ’ suhteellinen riski 0,32 (0,10 - 0,99) (p=0,03 x2-testillä). Kokonais-IgE-pitoisuus ja • t • ’; kohonneiden antigeenispesifisten IgE-pitoisuuksien ja positiivisten reaktioiden ihon . pistokokeessa esiintymistiheydet olivat verrannolliset lasten välillä, jotka nauttivat :: 30 probioottia ja niillä, jotka saivat plaseboa (Taulukko 2). Niiden tapauksien esiinty- ' ‘ mistiheydellä, joissa oli korkea kokonais-IgE-pitoisuus (>93,3 kU/1), oli taipumus olla alempi probiootti-, 11/61 (18 %) kuin plaseboryhmässä, 17/63 (27 %) kahden S 110668 vuoden kohdalla; suhteellinen riski (95 % CI) 0,67 (0,34 - 1,29). Kokonais-IgE-pitoisuus arvioitiin korkeaksi, jos se oli suurempi kuin kokonais-IgE:n geometrinen keskiarvopitoisuus + yksi standardipoikkeama lapsissa, joilla ei ollut atooppista tautia.

5 Taulukko 1: Koehenkilöiden perusominaisuuksien vertailu

Plaseboryhmä Lactobacillus GG

(n=82) -ryhmä (n=77)

Perhehistoria: Äidin atooppinen tauti 63/82 (77 %) 55/77 (71 %)

Vanhempi sisarus 30/82 (37 %) 26/37 (34 %)

Vanhempi (vanhemmat) tupakoi(vat) 17/82 (21 %) 9/77 (12 %)

Karvainen lemmikkieläin kotona 9/82 (11 %) 16/77 (21 %)

Syntvmäominaisuudet:

Raskausaika viikkoina*5 39,4 (39,0 - 39,7) 39,4 (39,0 - 39,7)

Miessukupuoli 43/82 (52 %) 49/77 (64 %)

Napanuoraveren IgE (kU/l)b) 0,04 (0,02 - 0,06) 0,06 (0,03 - 0,12) ‘ *· ·' Pään ympärysmitta (cm)a) 35,0 (34,7 - 35,3) 35,2 (34,8 - 35,5) : Paino (g)a) 3610(3510-3720) 3630(3520-3740)

Arvot ovat äidin atooppisen taudin tapausten, vanhemman sisaruksen, tupakoivan ! 11 vanhemman (tupakoivien vanhempien) ja kotona olevan karvaisen lemmikkieläimen t · lukumääriä (prosenttiosuuksia) . a) Arvo edustaa keskiarvoa (95 %:n luotettavuus väli) #... t 10 b) Arvo edustaa geometrista keskiarvoa (95 %:n luotettavuusväli) • · · » » # 9 110668

Taulukko 2: Atooppinen herkistyminen interventioryhmissä

Plaseboryhmä Lactobacillus GG p-arvo (n=68) -ryhmä (n=64)

Kokonais-IeE fkU/lV°: 3 kuukautta 3,0(2,4-3,7) 3,1(2,5-4,0) 0,79d) 12 kuukautta 9,7(7,0-13,4) 11,2(8,0-15,7) 0,55d) 24 kuukautta 32,7(22,6-47,3) 31,3 (22,8-43,0) 0,85d)

Kohonneet RAST-lukematb): 3 kuukautta 2/66 (3 %) 2/58 (3 %) 0,90e) 12 kuukautta 15/66(23%) 16/62(26%) 0,68e) 24 kuukautta 16/64(25%) 17/62(27%) 0,76e)

Reaktiivisuus ihon pistokokeessa c): 6 kuukautta 7/68(10%) 11/64(17%) 0,25e) 12 kuukautta 12/68(18%) 17/63 (27%) 0,20e) 24 kuukautta 9/65(14%) 11/61(18%) 0,52e) » · ' ‘! a) Arvo edustaa geometrista keskiarvoa (95 %:n luotettavuusväli) * ' ”' . Arvo edustaa niiden pikkulasten lukumääriä (prosenttiosuuksia), joilla on vähintään ,···. b)yksi kohonnut (>0,35 kU/1) antigeenispesifisen IgE:n pitoisuus radioallergosorbent- . · ·, 5 määrityksessä (RAST) tai c)yksi positiivinen reaktio ihon pistokokeessa.

d) Riippumaton t-testi jae) x2-testi (plasebo vs. Lactobacillus GG) I t 1 · » • t · * · t ·

I > I I I

· 1 10 110668

Suoliston kolonisaatiotutkimukset

Bifidobakteereilla tehdyissä tutkimuksissa seurasimme prospektiivisesti 76 korkean riskin pikkulasta syntymästä yhden vuoden ikään, jolloin atooppisen herkistymisen kehittyminen määritettiin ihon pistokokeella. Koska tärkein ja ensisijainen mikrobi-5 stimulaatio tapahtuu suoliston mikroflooran muodostumisen myötä, teimme sen hypoteesin, että altistumiset kommensaaliselle mikroflooralle ovat yleisempiä kuin satunnaiset infektiot ja että tämä saattaa olla yhteydessä muihin atopiataipumusta lisääviin muutoksiin, edustaen näin immuunijärjestelmän avainmodulaattoria vastasyntyneessä.

10 Vatsan ja suoliston mikroflooran tutkimusta tavanomaisen bakteeriviljelyn avulla on haitannut määritysmenetelmien herkkyyden puute, koska melkein puolet suolistossa olevista bakteereista eivät ole viljeltävissä, vaikka ovatkin elinkykyisiä. Käytimme siksi bakteeriviljelyn lisäksi kahta viljelystä riippumatonta menetelmää: bakteerisolujen rasvahappojen kaasukromatografiaa (GLC) ja bakteerisolujen kvantitatiivista 15 fluoresoivaa in situ -hybridisaatiota suoliston mikroflooran karakterisoimiseksi en simmäisten elinkuukausien aikana lapsissa, jotka myöhemmin kehittävät tai eivät kehitä atopiaa.

Koehenkilöt ja tutkimuksen suunnittelu : :Tutkimuskohortti sisälsi 76 vapaaehtoisperhettä, joissa oli 76 vastasyntynyttä pikku-•: · 20 lasta satunnaisesti valittuna probioottien estopotentiaalia atopiassa arvioivan aller-

MM

*: *·: gianestotutkimuksen populaatiosta. Tässä tutkimuspopulaatiossa 30:11a 76:sta (39 %) r : pikkulapsesta oli yksi ja 46:11a 76:sta (61 %) useita ensimmäisen asteen lähisukulai- * * · siä, joilla oli atooppinen ekseema, allerginen nuha tai astma.

Koe oli Turun yliopistollisen keskussairaalan eettisen toimikunnan ja Turun kaupun-25 gin terveysviraston komitean hyväksymä. Lasten vanhemmilta saatiin kirjallinen,

I i I

, * , heidän kokeesta saamaansa tietoon perustuva suostumus.

* · · • · · ’: ’ · Lapset syntyivät 36. ja 42. raskausviikon välillä (keskiarvo 40). Heidät tutkittiin klii- : ‘ : nisesti 2 päivän, 3 viikon, ja 3, 6 ja 12 kuukauden ikäisinä. Kaikki atooppisen taudin *: · ·: merkit ja oireet kirjattiin. Atooppinen herkistyminen 12 kuukauden iässä, ihon pisto- 30 kokeella testattuna, katsottiin ensisijaiseksi päätepisteeksi. Pikkulapset katsottiin π 110668 atoopikoiksi, jos he osoittivat vähintään yhden positiivisen reaktion testatuille antigeeneille, kun taas ne, jotka eivät osoittaneet positiivista reaktiota, katsottiin ei-atoopikoiksi. Plasebokontrolloitua lehmänmaidon kaksoissokkohaastetta käytettiin, kun oireet, kliiniset merkit tai ihon pistokokeet viittasivat lehmänmaitoallergiaan.

S Atooppisen ihotulehduksen diagnosointi

Atooppisen ihotulehduksen diagnosointi perustui aiemmin kuvattuihin kriteereihin (Hanifin, 1991). Lyhyesti, atooppinen ihotulehdus varmistui, jos seuraavat kolme pääpiirrettä havaittiin: kutina, tyypillinen morfologia ja jakautuminen, ja krooninen ihotulehdus (kestoltaan kuukausi tai kauemmin).

10 Atooppisen herkistymisen arviointi

Atooppinen herkistyminen arvioitiin ihon pistokokeilla kuten on aiemmin kuvattu (Majamaa ja Isolauri, 1997). Reaktiot luettiin 10 minuutin kohdalla, ja puolet hista-miinidihydrokloridin (10 mg/ml; ALK Abello, Horsholm, Tanska; ALK) reaktion koosta (2+) tai enemmän merkittiin positiiviseksi edellyttäen, että näppylän keski-15 määräinen läpimitta oli vähintään 3 mm ja negatiivinen kontrolli (ALK) samaan aikaan oli 0 mm. Testatut antigeenit käsittivät maidon, joka sisälsi 1,5 % rasvaa, vehnäjauhon, joka oli laimennettu 1:10 (paino/til.) 0,9-prosenttisella (paino/til.) natrium-kloridilla, ruisjauhon, joka oli laimennettu 1:10 (paino/til.) 0,9-prosenttisella (pai- l · » •... * no/til.) natriumkloridilla, gliadiinin, joka oli laimennettu 1:1000 (paino/til.) 0,9- 20 prosenttisella (paino/til.) natriumkloridilla, munanvalkuaisen (ALK), turskan (ALK), * ...: soijapavun (ALK), lateksin (Stallergens, Ranska), koivun (ALK), kuusi paikallista • lit· ruohoa (kaikki ALK:lta), kissan (ALK), koiran (ALK) ja Dermatophagoidespte- * * · i t ' · · ·' ronyssimus -allergeenin Der p 1 (ALK). Lisäksi testattiin banaani, peruna ja porkkana * · **··* prick-prick-tekniikalla.

25 Lehmänmaitoallergian diagnosointi * * · • ·

Lehmänmaitoallergian diagnosointi perustui lehmänmaidon nauttimisen ja kliinisten

I l I

’ Ί oireiden väliseen yksiselitteiseen yhteyteen, s.o. oireet katosivat kun lehmänmaito i i » » i , poistettiin ruokavaliosta, ja kiistaton uusiutuminen tapahtui plasebokontrolloidussa t * *, ‘ ί lehmänmaidon kaksoissokkohaastekokeessa. Tämä haastekoe suoritettiin kuten on i I 1 * ‘ > ‘ · 30 kuvattu muualla (Kalliomäki ym., 1999).

110668

Ulostenäytteiden viljely

Ulostenäytteen pikkulapsesta otti joko hoitohenkilökunta ohjelman mukaisen käynnin aikana tai vanhemmat juuri ennen sitä. Jälkimmäisessä tapauksessa näytettä varastoitiin 4 °C:ssa ja toimitettiin sairaalaan 24 tunnin kuluessa viljeltäväksi heti.

5 Ulostenäyte saatiin 71 pikkulapsesta 20 päivän iässä (18-21 päivää) ja 69:stä 14 viikon iässä (13-14 viikkoa); keskiarvo (95 % CI). Loput näytteestä pakastettiin välittömästi ja varastoitiin -20 °C:ssa, kunnes ne analysoitiin GLC:lla ja FISH:lla. Mitään kvantitatiivisia viljelymenetelmiä ei käytetty. Bakteerit viljeltiin 6 erilaiselle vastavalmistetulle alustalle, s.o. Blood Agar (Pronadisa, Madrid, Espanja) gramnega-10 tiivisille sauvoille; agar (Leiras, Turku, Suomi), joka oli täydennetty Mycological Peptone’lla (Oxoid, Basingstoke, Yhdistynyt Kuningaskunta) ja glukoosilla hiivoille ja sienille; Bile Eskulin Azide Agar (Difco, Detroit, USA) enterokokeille; Blood Agar (Pronadisa) täydennettynä glukoosilla, hiivauutteella (LAB M, Bury, Yhdistynyt Kuningaskunta), L-kysteiini-HCl:lla (Merck, Darmstadt, Saksa), metadionilla 15 (Merck) ja neomysiinisulfaatilla (Sigma, St. Louis, USA) anaerobeille; Clostridium difficile Agar (Oxoid) täydennettynä hemiinillä (Sigma), neutraalipunalla (Merck), D-sykloseriinillä (Sigma), munalla ja Cefoxitin’lla (MSD, Haarlem, the Netherlands) Clostridium difficilelle’, ja Rogosa SL agar (Difco) Lactobacillus in kaltaisille bakteereille. Ensimmäistä kolmea alustaa inkuboitiin aerobisesti ja kolmea viimeistä anae-:,., ’ 20 robisesti 35 °C:ssa 48 h. Eri lajien tunnistus tehtiin sen jälkeen niiden kasvun selek- :. tiivisillä alustoilla, pesäkkeiden värin ja solumorfologian mukaan.

....: Bakteerien rasvahappojen kaasukromatografia ; ·; Menetelmä on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti (Eerola ja Lehtonen, 1988). Kun bakteerimateriaali oli erotettu ulosteiden kasviskuiduista ja vapaista rasvahapoista 25 näyte sekoitettiin uudelleen ja sen annettiin laskeutua 15 min. Sen jälkeen bakteeri-komponentti eristettiin sentrifugoimalla 1000 g:ssa 15 min huoneenlämmössä ja t · t ; poistamalla supematantti. Kerätty bakteerimassa saponifioitiin ja metyloitiin. Mety- . · · · loidut rasvahapot uutettiin sitten etyylieetterillä ja heksaanilla. GLC-analyysi suori tettiin HP5890A-kaasukromatografilla (Hewlett-Packard) ja Ultra 2004-11-09B fu- • · ;,, 30 sed silica -kapillaarikolonnilla (0,2 mm x 25 m; ristisidottu 5 % fenyylimetyylisili- koni; Hewlett-Packard). Äskettäin kehitettyä tietokoneelle sovellettua bakteerien i » » « ! ·! · tunnistusohjelmaa käytettiin analysoimaan ulostenäytteiden GLC-profiilit. Analyysi i3 110668 perustui yksittäisten näytteiden rasvahappospektrien korrelaatio-ja klusterianalyysiin. Kaikkia kromatogrammissa olevia yksittäisten rasvahappojen piikkejä käytettiin vertailussa.

Bakteerisolujen fluoresoiva in situ -hybridisaatio 5 Ulostenäytteet suspendoitiin 0,1 M fosfaattipuskuroituun suolaveteen (pH 7,0) siten, että loppupitoisuudeksi tuli 10 % (paino/til.). Lietteet homogenisoitiin ja sentrifugoi-tiin alhaisella teholla (250 g 2 min.) hiukkasmaisen aineen poistamiseksi. Bakteerisolut kiinnitettiin ja FISH suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Langendijk ym., 1995). Lyhyesti, solut kiinnitettiin yli yön 4 % (til./til.) paraformaldehydissä 4 10 °C:ssa, pestiin kahdesti PBS:ssa ja varastoitiin -20 °C:ssa PBS:etanoli (1:1) -liuoksessa. Alanäytteitä kiinnitetyistä soluista hybridisoitiin yli yön hybridisaatio-puskurissa 5 ng x μ1_1:η kanssa Cy3 indokarbosyaniinilla leimattua oligonukleotidi-koetinta. Mukaan sisällytetyt koettimet olivat bacteroidesille spesifinen Bac303 (CCAATGTGGGGGACCTT), bifidobakteereille spesifinen Bifl64 (CATCCGG-15 CATTACCACCC), klostrideille spesifinen Hisl 50 (TTATGCGGTATTAATCT- (C/T)CCTTT) ja laktobasilleille ja enterokokeille spesifinen Labl58 (GGTATTAG-CA(T/C)CTGTTTCCA); (sekvenssi 5 ’ —>3 ’). Kokonaissolumäärät laskettiin käyttämällä nukleiinihappoväri 4’,6-diamidino-2-fenyyli-indolia (DAPI). Solut pestiin hyb-ridisaatiopuskurilla, suodatettiin 0,2 pm polykarbonaattisuodattimen läpi (Millipore • ..: 20 Corporation, Bedford, USA) ja kiinnitettiin objektilasille SlowFade®:11a (Molecular ' : · ‘ Probes Inc., Eugene, USA).Ne laskettiin visuaalisesti käyttäen Leica Laborlux D - I · · • *: epifluoresenssimikroskooppia, johon oli asennettu Cy3- ja DAPI-spesifiset suotimet.

• < » · · / Viisitoista mikroskooppikenttää laskettiin määritystä kohden.

: : Tilastolliset menetelmät » · · ..,.: 25 Normaalisti jakautuneet tiedot ilmaistaan keskiarvoina 95 % luotettavuusvälin (CI) I · . · ·. kanssa ja vinon jakauman tiedot geometrisena keskiarvoina 95 % CI:n kanssa loga- .' . ritmisen (log) muunnoksen jälkeen. Riippumatonta t-testiä käytettiin vertailemaan i * · » * . arvoja ryhmien välillä, χ -testiä käytettiin vertailemaan osuuksia ryhmien välillä.

t · : '.: GLC-tulosten koko analyysi perustui vertailuihin yksittäisten näytteiden välillä ja 30 samanlaisuusindeksien laskentaan niiden välillä. Samanlaisuusindeksit esitettiin kor- 14 110663 relaatiomatriiseina ja analysoitiin edelleen aritmeettisten keskiarvojen painotetulla pariryhmäklusterianalyysillä. Ulostenäytteet jaettiin neljään eri ryhmään bakteerien solurasvahappojen GLC-tulosten analyysiä varten pikkulapsen atooppisen tilan (atooppinen vs. ei-atooppinen) ja näytteenottoajan (ikä 3 viikkoa vs. 3 kuukautta) 5 mukaisesti. Tilastollinen merkitsevyys atoopikkojen ja ei-atoopikkojen välillä eri ajankohtina laskettiin vertaamalla ryhmien sisäistä rasvahappoprofiilien vaihtelua ryhmien väliseen vaihteluun. Ryhmän sisäinen vaihtelu määritettiin laskemalla kaikkien parittaisten vertailujen samanlaisuusindeksien keskiarvo (SD) ryhmän sisällä. Kahden eri ryhmän välinen vaihtelu saatiin laskemalla kaikkien parittaisten saman-10 laisuusindeksien keskiarvo (SD) näytteiden välillä molemmissa ryhmissä. Sen jälkeen ryhmien välistä vaihtelua verrattiin ryhmien sisäiseen vaihteluun laskemalla Z-arvo aiemmin kuvatulla tavalla. Z-arvoa käytettiin määrittämään p-arvo Z-taulukon avulla. P<0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.

TULOKSET

IS Atooppinen herkistyminen ja kliiniset ominaispiirteet 12 kuukauden iässä atooppinen herkistyminen havaittiin 22/76 (29 %) lapsessa. Ihon pistokoereaktiivisuus munalle, lehmänmaidolle, vehnälle, kissalle ja lateksille havaittiin vastaavassa järjestyksessä 19/22 (86 %), 5/22 (23 %), 3/22 (14 %), 2/22 (9 %) ja 1/22 (5 %) atoopikossa. Mitään ihon pistokoereaktiivisuutta millekään muulle anti-[! 20 geenille ei havaittu. Viisi atoopikkoa oli moniherkistyneitä, s.o. heillä oli positiivinen " · e ihon pistokoereaktiivisuus vähintään kahta eri antigeeniä kohtaan. Puolella atoopi- .,,.: koista, 11/22 (50 %), ilmeni atooppinen ihotulehdus ja 9/22 (41 %) oli allergisia . · \ lehmänmaidolle plasebokontrolloidussa lehmänmaidon kaksoissokkohaastekokeessa.

* » * • | ’· ··' Äidin atooppinen historia havaittiin 19/22 (86 %) atoopikossa ja 45/54 (83 %) ei- 25 atoopikossa (p=0,74). Atoopikot ja ei-atoopikot olivat syntymäominaisuuksien suh teen samanlaisia. Syntymähetken pituuden, painon ja pään ympärysmitan keskiarvot olivat vastaavassa järjestyksessä 51,2 (50,3 - 52,8) cm, 3600 (3410 - 3790) gja 35,1 • · ·: (34,5 - 35,7) cm atoopikoilla ja, vastaavassa järjestyksessä 50,6 (50,1 - 51,1) cm, ’ * 3610 (3480 - 3740) g ja 35,1 (34,7 - 35,5) cm ei-atoopikoilla (vastaavasti p=0,24, : 30 p=0,94, p=0,98); keskiarvo (95 % CI).

is 110668

Ruokavalion ominaispiirteet 3 viikon ja 3 kuukauden iässä olivat samanlaiset atoopi-koilla ja ei-atoopikoilla (Taulukko 3). 3 kuukauden kohdalla 9/54 (17 %) ei-atoopikoista, mutta ei yksikään atoopikoista, oli saanut antibiootteja, p=0,04.

Vastasyntyneen maha-suolikanavan mikrofloora 5 Bakteeriviljelyjen mukaan ei vastasyntyneiden suoliston mikrofloorassa ollut mitään eroja atopian kehittävien ja sitä kehittämättömien pikkulasten välillä (Taulukko 4). Ulostenäytteiden bakteerien solurasvahappoprofiileissa ryhmien välillä oli kuitenkin samaan aikaan tilastollisesti merkitsevä ero (Kuvio 3)(p=0,005). Poikkeavuudesta mahdollisesti vastuussa olevien bakteerien havaitsemiseksi tehtiin ulostebakteerien 10 FISH 29 näytteelle; tulokset osoittivat, että bifidobakteerien suhde klostrideihin oli alentunut atoopikoilla, 19 (3 - 122) verrattuna suhteeseen ei-atoopikoilla, 185 (57 -604); geometrinen keskiarvo (95 % CI) (p=0,03). Eron aiheutti tendenssi bifidobakteerien pienempiin lukumääriin ja klostridien korkeampiin lukumääriin atoopikoissa (Taulukko 5).

15 Mahan ja suoliston mikrofloora 3 kuukauden iässä

Atoopikkojen ja ei-atoopikkojen suoliston mikroflooran välillä ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja 3 kuukauden iässä. Vastaavat bakteerien solurasvahappospektrit olivat samanlaisia (Kuvio 3). Myöskään bakteeriviljelyn tulokset eivät eronneet ryh- • · · mien välillä, vaikka ei-atoopikoiden ulosteilla oli taipumus sisältää hiivoja useammin :: 20 kuin atoopikoiden (taulukko 4)(p=0,07).

• i * · * 16 110668

Taulukko 3: Ruokavalion ominaispiirteet ja antibioottien käyttö pikkulapsilla 3 viikon ja 3 kuukauden iässä

Atoopikota) Ei-atoopikota) x2-testi (n=22) (n=54) 3 viikkoa: yksinomaan rintaruokittu 16/22 (73 %) 37/54(68%) 0,31 osittain rintaruokittu 6/22 (27 %) 15/54 (28 %) 0,96 kokonaan pulloruokittu 0/22 2/54 (4 %) 0,36 antibiootitb) 0/22 3/54 (6 %) 0,26 3 kuukautta: yksinomaan rintaruokittu 11/22 (50 %) 29/54 (54 %) 0,77 osittain rintaruokittu 6/22 (27 %) 14/54 (26 %) 0,90 kokonaan pulloruokittu 5/22 (23 %) 11/54 (20 %) 0,82 antibiootitc) 0/22 9/54(17%) 0,04 a) Pikkulapset, joilla oli vähintään yksi positiivinen reaktio ihon pistokokeessa, katsottiin atooppisiksi, ne, joilla ei ollut yhtään, ei-atooppisiksi.

‘ · · ‘ 5 b) jac) edustavat niiden lasten määrää, jotka olivat saaneet systeemisiä antibiootteja • ’ (oraalisesti tai suonensisäisesti) 3 viikon ja 3 kuukauden ikään mennessä, vastaavassa järjestyksessä.

• · · • · · ‘7 110668

Taulukko 4: Viljelty ulostemikrofloora pikkulapsilla 3 viikon ja 3 kuukauden iässä

Hiivat ja Gramneg An- Clostri- Lakto- Entero- sieneta) sauvata) aerobita) dium dif- basillit*-* kokita) ficilea) 3 viikkoa:

Atoopikotb) 0/20 15/20 18/20 0/20 16/20 18/20

Ei-atoopikotb) 45/51 2/51 39/51 45/51 2/51 41/51 χ2-testi 0,37 0,90 0,83 0,37 0,97 0,83 3 kuukautta:

Atoopikotb) 0/20 20/20 18/20 1/20 18/20 20/20

Ei-atoopikotb) 47/49 7/49 45/49 40/49 6/49 44/49 X2-testi 0,07 0,19 0,39 0,37 0,98 0,36 a) Sarakkeissa olevat luvut edustavat niiden pikkulasten lukua, joilla on baktee-ri/bakteerit ulostenäytteessä bakteeriviljelyllä analysoituna b) Pikkulapset, joilla oli vähintään yksi positiivinen reaktio ihon pistokokeessa, kat-5 soitiin atooppisiksi, ne joilla ei ollut, katsottiin ei-atooppisiksi.

a 18

Taulukko 5: Bakteerimäärät ulostenäytteissä fluoresoivalla in situ -hybridisaatiolla analysoituna 3 viikon iässä

Atoopikota) Ei-atoopikota) Riippu maton t-testic)

Klostriditb) 9,3 (3,8 - 22,9) x 107 3,3 (1,8 - 6,1) x 107 0,04

Bifidobakteeritb) 1,8 (0,4 - 7,6) x 109 6,1 (2,5 - 14,6) x 109 0,11

Laktobasillit/enterokokitb) 2,4 (1,1 - 5,2) x 108 3,4 (1,5 - 7,6) x 108 0,53

Bacteroidesb) 1,1 (0,3 - 4,4) x 108 0,5 (0,2 - 1,4) x 108 0,30

Kokonaissolumääräb) 8,9 (4,0 - 19,4) x 109 9,6 (5,3 - 17,3) x 109 0,87 a)Pikkulapset, joilla oli vähintään yksi positiivinen reaktio ihon pistokokeessa, katsottiin atooppisiksi, ne joilla ei ollut, katsottiin ei-atooppisiksi.

5 b) edustaa ulosteen bakteerien lukumäärän geometrista keskiarvoa (95 % CI) grammaa kohden.

c) Riippumatonta t-testiä sovellettiin bakteerilukumäärien logaritmisen muunnoksen jälkeen.

; » i · • i > · «

Viitteet 110668 19

Eerola E, Lehtonen OP. Optimal data processing procedure for automatic bacterial identification by gas-liquid chromatography of cellular fatty acids. J. Clin Microbiol. 1988;26:1745-1753.

5 Hanifin JM. Atopic dermatitis in infants and children. Pediatr. Clin. North Am. 1991; 38:763-789.

Isolauri E, Suomalainen H, Kaila M, ym. Local immune response in patients with cow milk allergy: follow-up with patients retaining allergy or becoming tolerant. J. Pediatr. 1992; 120:9-15.

10 Isolauri E, Arvola T, Siitäs Y, Salminen S, Clin. Exp. Allergy, 2000; 30: 1605-1610.

Isolauri E, Majamaa H, Arvola T. ym. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105:1643-1650.

Kalliomäki M, Ouwehand A, Arvilommi H, Kero P, Isolauri E. Transforming growth 15 factor-beta in breast milk: a potential regulator of atopic disease at an early age. J. Allergy Clin. Immuno. 1999; 104:1251-1257.

Langendijk PS, Schut F, Jansen GJ, Raangs GC, Kamphuis GR, Wilkinson MH, ym. Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium spp. with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in fecal samples.

20 Appi.Environ. Microbiol. 1995;61:3069-75.

Majamaa H, Isolauri E. Evaluation of the gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic excema. J. Allergy Clin. Immunol. 1996; 97:985-990.

: ;' Majamaa H, Isolauri E. Probiotics: a novel approach in the management of food al- "! 25 lergy. J. Allergy Clin. Immunol. 1997; 99:179-185.

•; · · · Pessi T, Siitäs Y, Marttinen A, Isolauri E. Down-regulation of anti-CD3 antibody- induced IL-4 production by bovine caseins hydrolysed with Lactobacillus GG-' · derived enzymes. J. Nutr. 1998; 128:2313-2318.

Sanfilippo L, Li CK, Seth R, Balwin TJ, Menozzi MG, Mahida YR. Bacteroides 30 fragilis enterotoxin induces the expression of IL-8 and transforming growth factor-beta (TGF-beta) by human colonic epithelial cells. Clin. Exp. Immunol. 2000; 119:4565-463.

» »

• I

Claims (6)

110668

1. Elävien probioottisten maitohappo- tai bifidobakteerien, joilla on samankaltaiset probi-oottiset ominaisuudet kuin kannalla Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (ATCC 53103) tai kannalla Bifidobacterium lactis Bb-12, ja joiden ominaispiirteenä on edistää varhaista bi-5 fidogeenistä suolistomikroflooraa, käyttö koostumuksen valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen atooppisten tautien primaariseksi ehkäisemiseksi pikkulapsessa, jolla on suuri atooppisten tautien riski, annettavaksi raskaana olevalle naiselle ennen synnytystä ainakin kahden viikon ajan, ja synnytyksen jälkeen vastasyntyneelle pikkulapselle ainakin kahden kuukauden ajan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa koostumusta annetaan synnytyksen jäl keen imettävän äidin välityksellä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, jossa koostumus sisältää probioottisia bakteereita noin 1 x 108 - noin 1 x 1010 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen käyttö Jossa maitohappobakteerit ovatkan- 15 taa Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (ATCC 53103).

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen käyttö, jossa bifidobakteerit ovat kantaa Bifidobacterium lactis Bb-12. « i · • :1:

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen käyttö, jossa probioottiset bakteerit sisältä- ·;· vät maitohappobakteerien ja bifidobakteerien seoksen. • · * · • · · • · · * · * · • · * · · • · · · • · * · * · * 1 · t · · • 1 Pa,entkrav 110660