FI104465B - Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö - Google Patents

Description

104465

Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö

Keksintö koskee menetelmiä suolen imuuniestettä edistävien ja 5 ruoan indusoimia yliherkkyysreaktioita vähentävien proteiinihydrolysaattien tekemiseksi sekä niiden käyttöä valmistettaessa valmisteita, jotka on tarkoitettu ravinnon indusoimien yliherkkyysreaktioiden estämiseksi potilailla, jotka kärsivät ruoka-aineallergiasta. Erityisesti keksintö koskee hydrolysaattien käyttöä valmistettaessa valmisteita, jotka on tarkoitettu allergioiden, erityisesti pikku-10 lasten lehmänmaitoallergian hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi. Keksintö koskee myös menetelmällä valmistettua proteiinihydrolysaattia.

Lehmänmaitoallergia (cow's milk allergy, CMA) määritellään im-muunivälitteisenä haitallisena reaktiona lehmänmaidon proteiineille. Valittava hoito on lehmänmaidon antigeenien täydellinen välttäminen. Silloin kun ihmi-15 sen maitoa ei ole saatavissa, lehmänmaitoallergialapsilla on välttämätöntä käyttää korvikevalmistetta. Lehmänmaidosta saatuun heraan tai kaseiiniin perustuvia hydrolysoituja valmisteita käytetään turvaamaan riittävä ravitsemus vähennetyllä antigeenikuormalla. Lehmänmaidon esikuumennuskäsittely vaikuttaa pääasiassa proteiinien konformaatioon ja helpottaa niiden hydrolyysiä. 20 Myöhempi entsymaattinen hydrolyysi pepsiinillä, trypsiinillä, haimauutteilla ja suolen limakalvosta peräisin olevilla uutteilla aiheuttaa peräkkäisten epitooppi-en progressiivisen tuhoutumisen ja puhdistaa valmisteet vähiten antigeeniseen ja allergeeniseen muotoon.

Useimmissa tapauksissa täysin hydrolysoituja lehmänmaidosta joh-25 dettuja valmisteita voidaan antaa turvallisesti, ja ne ovat tehokkaita ja sekä kliinisesti että metabolisesti hyvin siedettyjä. Entsymaattinen hydrolyysi ei kuitenkaan välttämättä tee valmisteesta ei-allergeenista, koska optimaalista hyd-rolyysiastetta ei tiedetä ja hydrolysaatissa todetaan vähäisiä määriä alkuperäistä proteiinia. Sen vuoksi näitä korvikkeita on annettava varovasti lapsille, 30 joilla on lehmänmaitoallergia.

Lähestymistapa, jossa allergista tulehdusta hillitään poistamalla antigeeni, ei ole ollut tyydyttävä etenkään potilailla, joilla on monia ruoka-aineallergioita (Sampson et ai., 1992). Lehmänmaitoallergian hoitoon tarvitaan kiireellisesti uusia lähestymistapoja.

35 T-auttajasolujen (Th) immuunireaktion aikana tapahtuvalla tunnus omaisella sytokiinien tuotannolla on tärkeitä säätelyvaikutuksia immuunivas- 2 104465 teen luonteeseen. Luontaisen immuunivasteen sytokiiniprofiili määrää myöhemmän spesifisen immuunivasteen fenotyypin. IgE-synteesin säätelemisen lisäksi IL-4 on ratkaiseva tekijä allergiselle tulehdukselle luonteenomaisen Th2:n fenotyypin kehittymiselle ja kypsymiselle.

5 Suoliston antigeenikäsittely määrää myöhemmän immuunivasteen antigeeniä kohtaan. Antigeenit absorboituvat epiteelin läpi kahta funktionaalista reaktiotietä pitkin. Pääreaktiotie on hajottava vähentäen antigeenin immu-nogeenisuutta. Vähäisempi reaktiotie mahdollistaa kokonaisten proteiinien kuljetuksen, mikä on ratkaisevaa antigeenispesifisille immuunivasteille.

10 Tämä prosessi näyttää olevan ratkaiseva ravinnoksi käytetyn prote iinin sietokyvyn kehittymiselle. Oraalinen sietokyky on antigeenispesifinen koko elimistöön vaikuttava reagoimattomuuden tila, jolle on luonteenomaista paikallinen antigeenispesifinen IgA-vaste.

Eristetyn ihmisen suolistomikrofloorakannan, Lactobacillus-kanta 15 GG:n (Lactobacillus GG, ATCC 53103), on äskettäin osoitettu edistävän paikallisia IgA-vasteita ruokavalion sellaisia antigeenejä vastaan, joita tavataan ruoansulatuskanavassa, ja sen vuoksi voivan auttaa immuunieliminoimisessa (Isolauri et ai., 1993). Vielä ei tiedetä sitä, voivatko tietyt suolistobakteerikan-nat suoraan muuntaa ruoan antigeenien immunogeenisuutta ja sen seurauk-20 sena alentaa (downregulate) yliherkkyysreaktioita.

Tämän keksinnön keksijät ovat nyt havainneet, että tiettyjä ruoansulatuskanavan bakteereita, erityisesti laktobasilleja, voidaan käyttää elimi-naatiodieettien vaikutuksen vahvistamiseen ravinnon indusoimien yliherkkyysreaktioiden hoidossa tai ehkäisyssä potilaalla.

25 Toinen keksinnön näkökanta on se, että mainittuun tarkoitukseen voidaan käyttää myös proteiinihydrolysaatteja, joita saadaan edellä mainittujen ruoansulatuskanavan bakteerien suorittamalla proteiinien hydrolyysillä. Osoitamme tässä, että tämän keksinnön mukaisesti saaduilla proteiinihydrolysaa-teilla on hypoallergeenisuutta edistävä immunologinen vaikutus. Hydrolysaatit 30 edistävät myös suolen immuuniestetoimintoa stabiloimalla siten limakalvoes-tettä.

Näin ollen kuvataan menetelmiä allergioiden hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, joissa menetelmissä annetaan proteiinihydrolysaattivalmistetta yhdessä sellaisen bakteerivalmisteen kanssa, joka sisältää valikoituja ruoan-35 sulatuskanavan bakteereita, erityisesti laktobasilleja.

104465 3

Keksintö koskee myös parannettua proteiinihydrolysaattia, joka edistää suolen immuuniestetoimintoa. Hydrolysaatti on saatavissa hydrolysoimalla proteiineja trypsiinillä ja/tai pepsiinillä ja lisäksi entsyymeillä, jotka saadaan valikoiduista ruoansulatuskanavan bakteereista, erityisesti laktobasil-5 teista. Lactobacillus GG:stä (ATCC 53103) peräisin olevat entsyymit ovat edullisia.

Vaihtoehtoisesti proteiinihydrolysaatti voidaan saada hydrolysoimalla proteiineja trypsiinillä ja/tai pepsiinillä ja lisäämällä hydrolysaattiin bak-teerivalmistetta, joka sisältää valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita, 10 erityisesti laktobasilleja. Tähän tarkoitukseen edullinen bakteeri on Lactobacillus GG -kanta (ATCC 53103). Kun tällaista hydrolysaattia annetaan potilaalle, niin odotettavissa on, että läsnäolevien bakteerien hydrolysoivat entsyymit vapautuvat in vivo, jolloin aikaansaadaan sama vaikutus kuin edellä kuvatulla hydrolysaatilla.

15 Eräs suoritustapa on menetelmä ravinnon indusoimien yliherkkyys reaktioiden hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi pikkulapsella, jossa menetelmässä pikkulapselle, joilla on riski sairastua, annetaan keksinnön mukaista parannettua proteiinihydrolysaattia tai vaihtoehtoisesti proteiinihydrolysaattivalmistetta yhdessä sellaisen bakteerivalmisteen kanssa, joka sisältää laktobasilleja tai 20 valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita.

Lisäsuoritustapa on lehmänmaitoallergian hoitomenetelmä potilaalla, jossa menetelmässä potilaalle annetaan keksinnön mukaista parannettua proteiinihydrolysaattia tai vaihtoehtoisesti proteiinihydrolysaattivalmistetta yhdessä sellaisen bakteerivalmisteen kanssa, joka sisältää laktobasilleja tai vali-25 koituja ruoansulatuskanavan bakteereita.

Edelleen kuvataan menetelmä tolerogeenisten immuunivasteiden edistämiseksi ruoan antigeenejä vastaan potilaalla, jossa menetelmässä potilaalle annetaan oraalisesti keksinnön mukaista parannettua proteiinihydrolysaattia tai vaihtoehtoisesti bakteerivalmistetta, joka sisältää laktobasilleja tai 30 valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita, tai vaihtoehtoisesti proteiinihyd-rolysaatti-valmistetta yhdessä sellaisen bakteerivalmisteen kanssa, joka sisältää laktobasilleja tai valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita.

Kun proteiinihydrolysaattivalmistetta käytetään edellä määritellyissä menetelmissä yhdessä valikoitujen ruoansulatuskanavan bakteerien kanssa, 35 sellainen valmiste voi olla mikä tahansa proteiinihydrolysaattivalmiste, joko tunnettu tai uusi. Se voi siten olla joko osittainen proteiinihydrolysaatti tai 4 104465 vaihtoehtoisesti täysin hydrolysoitu valmiste. Tähän tarkoitukseen sopivan proteiinihydrolysaatin valmistus esitetään esim. EP-patenttihakemuksessa no. 601 802.

Keksinnön mukaisissa ja edellä kuvatuissa menetelmissä käytettä-5 vä edullinen bakteeri on Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Lyhenteet

AC-GG as1-kaseiini + Lactobacillus GG

CAS-GG kaseiini + Lactobacillus GG

Cl luottamusväli 10 IFN-γ lnterferoni-γ

IgA Immunoglobuliini A

IgE Immunoglobuliini E

IL-4 lnterleukiini-4 OKT3 anti-CD3-vasta-aine 15 PBMC periferaaliset veren yksitumaiset solut PI PBDU (forboliesteri) + Ca-ionofori SD keskihajonta TNF -a tuumorinekroositekijä-a 20 Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1. Atoopikoiden PBDU-indusoitujen PBMC-solujen IL-4-tuotanto viljelmissä

Kuva 2. Atoopikoiden OKT3-indusoitujen PBMC-solujen IL-4-tuotanto viljelmissä 25 Kuva 3. Atoopikoiden PBDU-indusoitujen PBMC-solujen IFN-γ- tuotanto viljelmissä

Kuva 4. Atoopikoiden OKT3-indusoitujen PBMC-solujen IFN-γ-tuotanto viljelmissä 30 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin. Kuvataan pa rannetun hydrolysaatin valmistusmenetelmät samoin kuin kokeet, jotka osoittavat näissä tutkimuksissa havaitun hyödyllisen terapeuttisen vaikutuksen.

5 104465

Kokeellinen osa

Esimerkki 1. Lehmänmaidon proteiinien hydrolyysi

Lehmänmaitoa kuumennettiin ultrakorkeassa lämpötilassa (UHT) 135 ° C:ssa 2-4 sekunnin ajan. UHT-käsiteltyä maitoa fermentoitiin Lactoba-5 cillus GG:llä 20 - 24 tunnin ajan 37 °C:ssa. Lehmänmaidosta puhdistettiin naudan kokonaiskaseiini ja kaseiinikomponentit (as1-kaseiini) (Syväoja, 1992).

Pepsiinillä ja trypsiinillä suoritettu hydrolyysi tehtiin erikseen maidolle, fermentoidulle maidolle, kaseiinille ja <xs1-kaseiinille. Lyhyesti sanottuna näitä hydrolysoitiin ensin 0,1%:isella pepsiinillä 0,1 mol/l:ssa HCI:ää 3 tunnin 10 ajan 37 °C:ssa, pH 2,5. Sen jälkeen, kun pH oli säädetty 250 mg:lla NaH-C03:a ja 2 mol/l:lla NaOH:ia, näytteisiin lisättiin 0,1%:ista trypsiiniä ja näitä hydrolysoitiin 5 tunnin ajan 37 °C:ssa, pH 8,0.

Hydrolyysi Lactobacillus GG -kannasta saadulla entsyymiseoksella tehtiin erikseen kaseiinille ja ag1-kaseiinille. Entsyymit eristettiin käyttämällä 15 Exterkatenin ja de Veerin, 1985, modifioitua menetelmää. Lyhyesti sanottuna entsyymit vapautettiin jäätyneiden bakteerisolujen sonikoinnilla. Sentrifugoitu-jen solujen supematantti erotettiin ja käytettiin kaseiinin ja as1-kaseiinin hydro-lyysiin. Lopuksi kaseiinille ja as1-kaseiinille tehtiin pepsiini-trypsiinihydrolyysi, kuten edellä kuvattiin.

20 Esimerkki 2. Atooppista ihottumaa sairastavien pikkulasten hoito proteiinihydrolysaattivalmisteella, johon on lisätty maitohappobakteereita 2.a. Potilaat ja tutkimusjärjestely

Tutkimus käsitti 23 3-16 kuukauden (keskimääräinen ikä 8 kuu-25 kautta) ikäistä pikkulasta, jotka täyttivät Hanifinin tunnusmerkit (Hanifin, 1987) atooppisesta ekseemasta lapsilla. Heidät oli tuotu lastenklinikalle atooppisen ekseeman ja epäillyn lehmänmaitoallergian vuoksi. Oireiden puhkeamisen keski-ikä oli 2,5 kuukautta. Kokonaisrintaruokinnan kestoaika oli 4,9 kuukautta. Kahdeksantoista (78 %) potilaalla havaittiin positiivinen perhetausta atoop-.. 30 pisten sairauksien (astma, atooppinen ekseema, allerginen nuha) tai ruo- • ka-aineallergian suhteen lähisukulaisilla. Ihottumavaurioita hoidettiin pehmen- nysaineilla ja paikallisilla kortikosteroideilla. Kukaan potilaista ei saanut systeemistä kortikosteroidihoitoa. Kolmella (13 %) potilaalla havaittiin atooppisen ekseeman lisäksi ruoansulatuskanavan häiriöitä, kuten ulosteiden löysyyttä, 35 oksentelua tai ripulia.

6 104465

Potilaat satunnaistettiin kahteen ryhmään yhden kuukauden ajaksi. Toinen ryhmä (WF, n=13) sai hydrolysoitua heravalmistetta (Valio Oy, Helsinki, Suomi, EP-A-601802) ja toinen ryhmä (WF-GG, n=10) sai samaa valmistetta, johon oli lisätty Lactobacillus GG.tä 5x108 cfu/g (saatu Valio Oy.ltä, Hel-5 sinki, Suomi). Yhden kuukauden hoidon jälkeen heille määrätyillä valmisteilla molemmat ryhmät saivat täysin hydrolysoitua heravalmistetta (Valio Oy) yhden kuukauden ajan. Kaikilta potilailta määritettiin seerumin kokonais-IgE-pitoisuus, lehmänmaitospesifinen IgE (RAST, Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) ja prick-ihokokeet ennen päivittäiseen ruokavalioon puuttumista. 10 Prick-testaus tehtiin kyynärvarren kämmenpuolelle käyttämällä kaupallisesti saatavaa lehmänmaitoallergeenia ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Tanska) ja testivalmistetta, joka oli laimennettu normaaliin ravintopitoisuuteen. Käytettiin 1 mm:n yksipiikkistä lansettia, jossa oli laajenema syvemmän tunkeutumisen estämiseksi (ALK), positiivisena kontrollina oli 10 mg histamiinidi-15 hydrokloridia millilitrassa (ALK). Reaktiot luettiin 15 minuutin kuluttua ja vaste, joka oli puolet tai enemmän histamiinireaktion koosta, rekisteröitiin positiivisena sillä ehdolla, että rakkulan keskimääräinen läpimitta oli vähintään 3 mm ja negatiivinen kontrolli oli samaan aikaan 0 mm.

Ulostenäytteet α-1-antitrypsiinin ja TNF-a:n määrittämiseksi otettiin 20 ennen hoidon alkua sekä yksi (vastaa tutkimusjaksoa) ja kaksi kuukautta myöhemmin.

Atooppisen ihottuman vakavuusaste arvioitiin SCORAD-mene-telmällä, jonka European Task Force on Atopic Dermatitis (1993) on vahvistanut. Lyhyesti sanottuna ihottuman laajuus arvioitiin käyttämällä yhdeksän koh-25 dan sääntöä. Ihottuman voimakkuus oli yksilön punoituksen, turvotuksen (edema) ja/tai näppyjen, hankauman (excoriation), jäkälöitymisen ja kuivuuden yksittäisten pisteiden (=-3 ) summa. Subjektiiviset ilmenemismuodot (pisteytettiin 1 - 10), kutina ja unen puute mukaan lukien, määriteltiin vanhempien arvioiden perusteella. SCORAD saatiin laskutoimituksella: laajuus /5 + 7 30 x voimakkuus / 2 + subjektiivinen piste.

. Tampereen yliopistollisen sairaalan eettinen toimikunta hyväksyi tutkimusprotokollan. Vanhemmilta saatiin suostumus.

2.b. α-1-Antitrypsiinin määritys ulostenäytteistä

Jäädytetyt ulostenäytteet sulatettiin huoneenlämpötilassa ja homo-35 genoitiin. Noin 1 g siirrettiin lasiputkeen ja lyofilisoitiin. Tuloksena saatu kuiva aine jauhettiin ja 50 mg siirrettiin Eppendorf-putkeen. Lisättiin 1 ml 0,15 M

104465 7

NaCI-liuosta ja α-1-antitrypsiini uutettiin voimakkaalla sekoituksella Vor-tex-sekoittimessa 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tuloksena saatua suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 25 000 x g 10 minuutin ajan jäännöksen poistamiseksi, ja supematanttia käytettiin α-1-antitrypsiinin määrittämiseen 5 käyttämällä Behring BNA -nefelometriä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tulokset annetaan yksikkönä mg/g lyofilisoidun ulosteen kuivapainoa.

2.c. TNF-a:n määrittäminen ulostenäytteistä

Syväjäädytetyt ulostenäytteet sulatettiin huoneenlämpötilassa, sus-pendoitiin 1:1 (w/v) fysiologiseen suolaliuokseen ja annettiin sedimentoitua.

10 Supematantista siirrettiin 0,5 -1,0 ml Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 25 000 x g 10 minuutin ajan. Sen jälkeen supematanttia käytettiin TNF-a:n määrittämiseen. Ulosteperäisen TNF-α.η määrityksiin käytettiin kaupallista entsyymi-immunologista määritystä (Ihmisen TNF-α ELISA-pakkaus, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, USA), kuten seeruminäytteistä on neu- 15 VOttU.

2.d. Tilastokäsittelyt

Logaritmista (In) muunnosta käytettiin ulosteperäisen TNF-α-pitoisuuksien vinojen jakautumien vuoksi. Tilastollisiin vertailuihin käytettiin toistokokeiden varianssianalyysia (ANOVA), Studentin t-testiä ja X2-testiä.

20 2.e. TULOKSET

2.e.1. Kliininen aineisto

Keskimääräinen (95 %:n luottamusväli) seerumin kokonais-lgE oli 23 (11-47) kU/l potilailla, jotka saivat hydrolysaattivalmistetta. RAST lehmän-maitoa kohtaan oli positiivinen (>0,4 kU/l) 7/23 (30 %) atooppista ekseemaa 25 sairastavalla potilaalla. Ihon prick-testi lehmänmaidolle oli positiivinen 6/21 (29 %) potilaalla. Keskimääräinen (SD) SCORAD-piste ennen käsittelyä oli 23 (12) ryhmässä WF ja 30 (13) ryhmässä WF-GG; p=0,19. Ihon tilan etenevä paraneminen heijastui SCORAD-pisteiden merkittävässä vähenemisessä molemmissa ryhmissä kahden kuukauden tutkimusjakson aikana (p=0,007). Toisto-v 30 kokeiden ANOVA osoitti ryhmien ja jaksojen välisen vuorovaikutuksen (p=0,07), mikä osoittaa nopeamman paranemisen ryhmässä WF-GG; SCORAD-piste oli tutkimusjakson jälkeen 22 (13) ryhmässä WF ja 20 (14) ryhmässä WF-GG.

2.e.2. α-1-Antitrypsiinipitoisuus ulosteissa 35 Ennen lehmänmaidon eliminaatioruokavalion aloitusta 30 %:lla pik kulapsista todettiin kohonnut α-1-antitrypsiinipitoisuus (> 2 mg/g) ulosteissa.

8 104465

Yhden kuukauden käsittelyn jälkeen 38 %:lla pikkulapsista, joita hoidettiin hydrolysoidulla valmisteella, oli kohonnut α-1-antitrypsiinipitoisuus ulosteissa, kun taas näin oli 0 %:lla niistä, joita oli hoidettu Lactobacillus GG:tä sisältävällä valmisteella, p=0,03. Lisäparannusta ei tapahtunut kuukautta myöhemmin.

5 2.e.3. TNF-cc-pitoisuus ulosteissa

Keskimääräinen (95 %:n luottamusväli) TNF-a:n pitoisuus ulosteissa oli ennen ruokavalioon puuttumista 327 (154-690) pg/g. Yhden kuukauden hoidon jälkeen konsentraatio laski molemmissa ryhmissä. Erityisesti TNF-a:n konsentraatio ulosteissa laski ryhmässä WF-GG verrattuna ryhmään WF 10 (taulukko 1).

Taulukko 1. Keskimääräinen (95 %:n luottamusväli) TNF-a:n pitoisuus ulosteissa pikkulapsilla, joita ruokittiin täysin hydrolysoidulla heravalmis-teella (WF) tai maitohappobakteereita sisältävällä samalla valmisteella 15 (WF-GG) yhden kuukauden ajan, mitä seurasi yhden kuukauden käsittely täysin hydrolysoidulla heravalmisteella molemmissa ryhmissä.

WF WF-GG

20 Ennen käsittelyä 196(60-639) 677(235-1510) Käsittelyn jälkeen 157(72-344) 77(30-196)

Sama valmiste 104 (36-304) 183 (72-196)

Esimerkki 3. Periferaalisten veren yksitumaisten solujen ai-25 kaansaaman sytokiinituotannon aleneminen atooppisilla lapsilla 3.a. Potilaat ja menetelmät

Tutkittiin 10 6-12 kuukauden ikäistä atooppista lasta ja 6 ikäsovi-tettua tervettä verrokkia. Heidän ruokavaliostaan eliminoitiin lehmänmaidon antigeenit. Kyynärtaivelaskimosta otettiin verta (5 ml) ja se heparinisoitiin. 30 Valmistettiin soluviljelmät. Periferaaliset veren yksitumaiset solut (PBMC), jot-v ka sisältävät pääasiassa lymfosyyttejä (> 90 % imusoluja), eristettiin Fi- coll-Hypaque-gradienttisentrifugaatiolla kiihtyvyydellä 400 x g 30 minuutin ajan 20 °C:ssa. Noin 1x10® eristettyä solua yhdessä millilitrassa RPMI 1640:ää, joka sisälsi antibiootteja, glutamiinia ja 20 % inaktivoitua FCS:ää, viljeltiin kos-35 tutetussa 5%:isessa C02-ilmakehässä 37 °C:ssa 48 tunnin ajan. Viisi koeviljelmää sisälsivät joko i. anti-CD33-vasta-ainetta (OKT3, Sigma) tai ii. forbo- 9 104465 liesteriä kalsium-ionoforin kanssa (PBDU, Sigma) 1. ilman tai varustettuna 2. kaseiiniliuoksella, joka oli hydrolysoitu Lactobacillus GG -kannasta saaduilla entsyymeillä (Valio Oy) tai 3. as1-kaseiinilla, joka oli hydrolysoitu Lactobacillus GG -kannasta saaduilla entsyymeillä 4. hydrolysoimattomalla kaseiinilla tai 5.

5 hydrolysoimattomalla asl-kaseiinilla. Valmistettiin myös kontrollisolupopulaatio, joka sisälsi pelkästään RPMI 1640:ää. Supematantit otettiin talteen ja varastoitiin -70 °C:ssa sytokiinimäärityksiä varten.

IL-4 ja IFN^y määritettiin jäädytetyistä viljelysupematanteista kaupallisesti saatavilla ELISA-testeillä valmistajan ohjeiden mukaisesti (IL-4: CLB, 10 Compact Human lnterleukin-4 ELISA kit, Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Alankomaat; IFN-γ: E-IFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, USA ja TNF-α: EH-TNFA, Endogen Inc., Cambridge, MA, USA). Eri ajojen tulokset tasattiin käyttämällä standardi-käyrien vertailua ja ne ilmaistaan yksikkönä pg/ml.

15 Friedmanin testiä käytettiin arvioimaan tilastollinen ero läheisesti yhteen kuuluvien parien (in related pairs) toistokokeiden välillä. Tilastollisen merkitsevyyden (p < 0,05) tapauksessa aineisto esitettiin mediaanimittauksina kvartiiiivälit sulkeissa.

3.b. Tulokset 20 Kaseiinien vaikutus IL-4-tuotantoon PBDU:lla stimuloiduissa atooppisten potilaiden viljelmissä oli merkitsevä ero IL-4-tuotannossa. Tämä johtui matalasta IL-4-pitoisuudesta viljelmissä, jotka sisälsivät Lactobacillus GG -kannasta peräisin olevilla entsyymeillä hydrolysoitua kaseiinia, ja kontrolliviljelmissä, jotka sisälsivät vain 25 PBDU:ta (kuva 1).

Anti-CD3-vasta-aineella, s.o. OKT3:lla stimuloiduissa atooppisten potilaiden viljelmissä oli merkitsevä ero IL-4-tuotannossa. Lactobacillus GG -kannasta peräisin olevilla entsyymeillä hydrolysoitua kaseiinia sisältävissä viljelmissä IL-4 oli merkitsevästi vähentynyt (kuva 2).

30 Kaseiinien vaikutus IFN-y-tuotantoon PBDU:lla stimuloiduissa atooppisten potilaiden viljelmissä oli merkitsevä ero I FN-y-tuotannossa. Tämä johtui matalasta IFN-y-pitoisuudesta viljelmissä, jotka sisälsivät Lactobacillus GG -kannasta peräisin olevilla entsyymeillä hydrolysoitua kaseiinia, ja kontrolliviljelmissä, jotka sisälsivät vain 35 PBDU:ta (kuva 3).

104465 10

Anti-CD3-vasta-aineella, s.o. OKT3:lla stimuloiduissa atooppisten potilaiden viljelmissä oli merkitsevä ero IFN^y-tuotannossa, koska vain niissä viljelmissä, jotka sisälsivät Lactobacillus GG -kannasta peräisin olevilla entsyymeillä hydrolysoitua kaseiinia, IFN-γ oli merkitsevästi vähentynyt (kuva 4).

« n 104465

Viitteet

European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCRAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31.

Exterkate, F. ja de Veer, G. Partial isolation and degradation of ca-5 seins by cell wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris. Appi. Environ. Microbiol. 1985; 49: 328-32.

Hanifin, J.M. Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr. Allergy 1987; 21: 116-131.

Isolauri, E., Majamaa, H., Arvola, T., Rantala, I., Virtanen , E ., Ar-10 vilommi, H . Lactobacillus casei Strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105: 1643-1650.

Sampson, H.A., James, M.J. ja Bemhisel-Broadbent, J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 15 1992;90:463-465.

Syväoja, E.-L. Quantitative determination of the main casein components and purification of a0- and κ-casein from bovine milk. Milchwissen-schaft 1992; 47: 563-566.

Claims (12)

104465 12

1. Menetelmä suolen immuuniestettä edistävän ja ruuan indusoimia yliherkkyysreaktioita vähentävän proteiinihydrolysaatin tekemiseksi, t u n - 5. e 11 u siitä, että proteiinit hydrolysoidaan pepsiinillä ja/tai trypsiinillä sekä lisäksi entsyymeillä, jotka on saatu valikoiduista ruoansulatuskanavan bakteereista, joilla on samanlainen vaikutus immunologiseen tasapainoon kuin Lactobacillus GG: Mä (ATCC 53103).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että entsyymit saadaan Lactobacillus GG: stä (ATCC 53103).

3. Menetelmä suolen immuuniestettä edistävän ja ruuan indusoimia yliherkkyysreaktioita vähentävän proteiinihydrolysaatin tekemiseksi, tunnettu siitä, että hydrolysoidaan proteiinit pepsiinillä ja/tai trypsiinillä ja lisätään hydrolysaattiin bakteerivalmistetta, joka sisältää valikoituja ruoansulatus- 15 kanavan bakteereita, joilla on samanlainen vaikutus immunologiseen tasapainoon kuin Lactobacillus GG: llä (ATCC 53103).

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerivalmiste sisältää Lactobacillus GG:tä (ATCC 53103 ).

5. Proteiinihydrolysaatti suolen immuuniesteen edistämiseksi ja yli-20 herkkyysreaktioiden vähentämiseksi, tunnettu siitä, että hydrolysaatti on saatavissa jonkin patenttivaatimuksista 1 - 4 mukaisella menetelmällä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukaisen proteiinihydrolysaatin käyttö valmistettaessa valmistetta, joka on tarkoitettu ruoan indusoimien yliherkkyysreaktioiden hoitoon tai ehkäisyyn pikkulapsella.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukaisen proteiinihydrolysaatin käyttö valmistettaessa lehmänmaitoallergian hoitoon tarkoitettua valmistetta.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukaisen proteiinihydrolysaatin käyttö valmistettaessa valmistetta, joka on tarkoitettu oraalisesti annettavaksi tolero-geenisten immuunivasteiden edistämiseen ruoan antigeenejä vastaan. .. 30 9. Valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita, joilla on samanlai nen vaikutus immunologiseen tasapainoon kuin Lactobacillus GG:llä (ATCC 53103), sisältävän bakteerivalmisteen käyttö yhdessä proteiinihydrolysaatti-valmisteen kanssa valmistettaessa valmistetta, joka on tarkoitettu ruoan indusoimien yliherkkyysreaktioiden hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi pikkulapsel-35 la. 104465 13

10. Valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita, joilla on samanlainen vaikutus immunologiseen tasapainoon kuin Lactobacillus GG:llä (ATCC 53103), sisältävän bakteerivalmisteen käyttö yhdessä proteiinihydrolysaatti-valmisteen kanssa valmistettaessa valmistetta, joka on tarkoitettu lehmän- 5 maitoallergian hoitamiseksi.

11. Valikoituja ruoansulatuskanavan bakteereita, joilla on samanlainen vaikutus immunologiseen tasapainoon kuin Lactobacillus GG:llä (ATCC 53103), sisältävän bakteerivalmisteen käyttö yksinään tai yhdessä proteiini-hydrolysaattivalmisteen kanssa valmistettaessa valmistetta, joka on tarkoitettu 10 tolerogeenisten immuunivasteiden edistämiseksi ruoan antigeenejä vastaan.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 9-11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että bakteerivalmiste sisältää Lactobacillus GG:tä (ATCC 53103). 104465 14