TW201309793A

TW201309793A - 用於在斷奶期投予健康幼年哺乳動物以增進對新攝入食物之耐受性之益生菌

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Publication number: TW201309793A
Application number: TW101125184A
Authority: TW
Inventors: Swantje Duncker; Marie Lewis; Annick Mercenier; Anurag Singh; Michael Bailey
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2013-03-01

Abstract

本發明係基於將益生菌乳雙歧桿菌(B.Lactis)NCC2818投與關鍵斷奶期的健康幼年哺乳動物(嬰兒斷奶期通常是從約3個月至約12、18或24個月齡)，以加速幼年哺乳動物對新食物之適應性。藉由斷奶仔豬動物模型中所觀察到的形態及免疫變化證明本專利說明書中所述本發明之有效性。因此，投與根據本發明之益生菌具有預防效果，預防與斷奶期攝入新食物有關之嚴重不適及病理狀態。

Description

用於在斷奶期投予健康幼年哺乳動物以增進對新攝入食物之耐受性之益生菌

本發明係關於藉由投與益生菌或益生菌混合物，以增進斷奶期幼年哺乳動物(尤其是人類嬰兒)對新攝入食物的耐受性。

出生後腸道免疫系統之成熟作用

嬰兒及其他幼年哺乳動物與生俱來具有功能性但卻是原發(未經培育)的腸道免疫系統。完整的免疫能力會在出生後逐步的完成，且僅能憑藉不斷累積遭遇外部刺激(諸如，經消化蛋白質及/或腸道微生物相)教化免疫系統而達到完整的免疫能力。此漸進式免疫成熟作用最終會導致具有區別有害及無害刺激的能力並達到適當的免疫反應(意指當遭遇病原時會產生炎症，而當遭遇食物成分及共生細菌時會產生耐受性)。因此，嬰兒期是免疫系統不穩定的時期，具有可能會引起耐受性及保護免疫或導致病理過敏免疫反應的雙重結果(Cummins and Thompson；1997；Immunology and Cell Biology；75,419-29)。

在出生後腸道免疫系統之成熟期間，母乳可以確保免疫保護作用及補償腸道中免疫能力的不足。然而，全部餵哺母乳只能使人類嬰兒出生後一段有限的時間(即4至6個月)維持充足的營養支持。該時期之後，在飲食中要漸漸地引入其他食物以滿足嬰兒的營養需求，且因此對於可以提供所有營養之乳汁或配方的依賴性便會降低。此過程通常稱為斷奶。在人類嬰兒時，斷奶到副食品是逐步地發生在3個月齡至12個月齡。然而，引入副食品之年齡會根據地理位置及文化差異而有所變化(Aggett,P.J.,Research priorities in complementary feeding：International Paediatric Association(IPA)and European Society of Paediatric Gastroenterology,Hepatology,and Nutrition(ESPGHAN)workshop.Pediatrics 2000；106：1271)。其他哺乳動物(諸如，狗及貓)自身會逐漸地斷離母乳、在第3至4週時開始攝取副食品，並在8至10週齡時時脫離母乳。

嬰兒及幼年哺乳動物胃腸道之成熟作用包括嬰兒期所發生的一些生理機制，而這些機制均有助於未成熟胃腸系統演變成成熟的成年胃腸系統。所涉及的其中一個關鍵步驟是適應新食物，此主要發生在斷奶期間。因此，斷奶時適應新食物被視為胃腸成熟作用的一個重要部分。

斷奶前後時期免疫系統及腸道生理會經歷變化

健康幼年哺乳動物之腸道免疫系統是在斷奶期前後被激活的。此激活作用包括體液機制及細胞機制，且是因應食物來源改變(乳汁至固體)造成大量新遭遇抗原所做出的反應。咸已證明，此斷奶期哺乳動物暴露於新食物所做的反應的早期免疫激活作用是短暫的。例如，在大鼠中，斷奶係與腸繫膜淋巴結(mesenteric lymph nodes；MLN)中所增加的細胞數、增加的空腸淋巴細胞數及肥大細胞去顆粒作用(degranulation)有關。人類嬰兒則顯示出十二指腸肥大細胞之擴增及上皮內淋巴細胞之增加(Thompson,F.M., Mayrhofer G,Cummins A.G.,Dependence of epithelial growth of the small intestine on T-cell activation during weaning in the rat,Gastroenterology 1996；111：37-44)。亦在小鼠中已經證明，自發性細胞激素分泌細胞的數量在斷奶期間會暫時性地增加(Vazquez,E.,Gil,A.,Garcia-Olivares,E.,Rueda,R.,Weaning induces an increase in the number of specific cytokine-secreting intestinal lymphocytes in mice,Cytokine 2000；12：1267-70)。

咸信，斷奶前後期間的暫時性免疫激活作用對教化腸道免疫系統是有必要的，隨後可以使得生長中的嬰兒對無害刺激(例如，食物、共生細菌)具有耐受性。一般理解是，其中一種實現生理學上腸道耐受性的方式是下調節對抗新刺激之最初局部免疫反應。

斷奶不僅會影響腸道免疫系統，也會引發實質性、食物誘導的腸道代謝及形態之變化。腸道形態通常可由絨毛(絨毛長度或絨毛面積)及隱窩(隱窩長度及分裂)的形態計量得到。例如，人類嬰兒在6至12個月齡時會表現出隱窩分裂的增加，以及在12與24個月齡之間會增加隱窩長度，而斷奶前後期間絨毛面積會減少(Cummins,A.G.,Catto-Smith A.G.,Cameron,D.J.等人，Crypt fission peaks early during infancy and crypt hyperplasia broadly peaks during infancy and childhood in the small intestine of humans,J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.,2008；47：153-7)。如同免疫系統一般，大多數該等形態變化是暫時性的，且會在約4歲之兒童達到平衡，而與成年情形相似。

不幸地，健康幼年哺乳動物在斷奶時的激活免疫狀態(此激活免疫狀態在往後生命期間做出適當免疫反應及腸道的形態變化是必要的)讓幼年哺乳動物對其可能同時遭遇之壓力更加脆弱。此脆弱性會導致與斷奶相關的併發症，諸如極常見的慢性非特異性兒童期痢疾(Kleinman,R.E.,Chronic nonspecific diarrhea of childhood,Nestlé Nutr.Workshop Ser.Pediatr.Program,2005；56：73-9)，或對食物蛋白質產生不全的免疫系統反應(即食物過敏、過敏性及經食物蛋白質誘發的小腸結腸炎(food protein induced enterocolitis；FPIES)(Nowak-Wegrzyn,A.,Muraro,A.,Food protein-induced enterocolitis syndrome,Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.,2009；9：371-7)。當然，上述與斷奶相關的病理狀態是幼年哺乳動物不適的來源。

除此之外，隨著增加攝入的副食品，嬰兒會暴露更大量的潛在病原微生物(Sheth,M.,Dwivedi,R.,Complementary foods associated diarrhea,Indian J.Pediatr.,2006；73：61-4)，因而增加了感染風險。斷奶期間，當食物攝入增加，同時母乳的攝入便會逐漸地減少。因此，在最需要發現於母乳中的免疫保護化合物之時期，這些化合物攝取量會較少，而幼年哺乳動物的免疫系統還不能完全提供該等因子。

斷奶前後期間的併發症特別是有傷害性的，因為此時期的免疫系統之形成對於如何因應後期生命中免疫挑戰具有長遠的影響。例如，此業已在食物過敏、1型糖尿病及乳糜瀉得到證明。

胃腸微生物相及斷奶

驅動免疫系統發展及成熟的其中一個主要影響因素是微生物在腸道初期的聚居。咸已證明，無菌條件下所飼養的動物具有嚴重發育不全的腸道免疫系統，此藉由引入共生細菌及/或益生菌可以挽救。咸亦已證明，在生命第一個月期間，哺乳動物之腸道微生物相組成會經歷相當大的波動。鑒於哺乳期間雙歧桿菌佔有優勢，因此微生物相會隨著引入副食品而變得更加複雜。隨之斷奶後，會由擬桿菌(Bacteroitedes)、腸球菌(Enterococci)及厭氧球菌佔有優勢。

因為斷奶過程與腸道微生物群落種類的主要轉變有關，因此，此時期代表(例如)利用益生菌介入的窗口。除此之外，藉由以益生菌介入斷奶期間來改變形成中的微生物相時，對於其後的免疫系統功能的影響比將益生菌投與成人時更顯著。

因此，斷奶是正常發育期間的一個關鍵及生理挑戰的時期，且被視為是幼年哺乳動物的一種壓力，這並不出人意料。因此，需要儘可能在最少的不適下，幫助幼年哺乳動物度過這關鍵的斷奶期，同時確保其食用充足食物以滿足營養需求。咸有需要提供一種可預防與斷奶相關之病症的治療方法，特定言之，該等與斷奶相關之病症係以上段落中所提及者，包括慢性非特異性兒童期痢疾及食物蛋白質誘發之腸炎症候群(FPIES)。咸有需要提供一種用以預防或減少與斷奶相關之病症症狀的預防疾病治療方法。

另外，咸有需要促進及加速幼年哺乳動物之腸胃在斷奶期遭遇新食物之適應性。

咸有需要誘發或支持在斷奶期對新攝入食物之耐受性。

咸有需要預防及治療幼年哺乳動物在斷奶期所感受之腸道不適。該不適可能不嚴重，且未表現出某一特定病理狀態。或者，該不適可能是嚴重的，會引起疼痛及嬰兒長期啼哭。此嚴重不適可能與嚴重病理病症相關。

本發明係因應上述需求。本發明係以將益生菌投與關鍵斷奶期的健康幼年哺乳動物(此時期在嬰兒通常是約3個月至約12、18或24個月齡)為基礎，從而加快幼年哺乳動物對新食物之適應性。本專利說明書藉由觀察斷奶期仔豬動物模型中的形態及免疫變化證明本發明之有效性，其中係測量腸道黏膜絨毛生理機能、血清中抗原特異性IgG₁及IgG₂含量及MLN(腸繫膜淋巴結)細胞中B細胞濾泡的數量及類型。

因此，投與益生菌會導致接觸新攝入食物時之暫時性增加的體液免疫反應(特定言之是免疫球蛋白類別G之產生)會增進。相較於未接受益生菌的幼年哺乳動物所發生的暫時性增加，接受益生菌所發生者更迅速及/或範圍更大。

因此，相較於未接受益生菌之幼年哺乳動物所導致的腸道黏膜絨毛高度及/或面積，斷奶期間投與益生菌者會增加15%以上。

本發明係關於預防與斷奶有關之病理狀態，諸如，慢性非特異性兒童期痢疾、對食物蛋白質的不全免疫系統反應(即，食物過敏、過敏性及FPIES)。因此，本發明係要預防、減少斷奶及後期生命中與在斷奶期間缺乏對新攝入食物之耐受性有關之症狀。同時，該介入可以讓幼年哺乳動物有正常的免疫適應性。因此，從而縮短幼年哺乳動物因為斷奶所增加之脆弱性的期間。

因此，投與根據本發明之益生菌具有預防疾病效果，可以預防與在斷奶期攝入新食物有關之嚴重不適及病理狀態。

本發明另外的目標是預防與斷奶有關之不嚴重的腸道不適。

所投與之益生菌較佳為動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis；B.Lactis)、菌株B.lactis CNCM-I-3446，亦稱為B.lactis NCC2818。該益生菌可以是活的，或是經不活化以使其不能複製。日劑量可使用10²至1×10¹¹ cfu(較佳為1×10⁶至1×10⁹ cfu)(cfu=菌落形成單位)或不具複製能力微生物情況下的等量cfu。

益生菌可以其純化形式或以水稀釋形式或以適合投藥的組合物投與幼年哺乳動物。後者的組合物可包括其他益生菌，較佳地係選自龍根雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BB536(ATCC BAA-999)；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)(CGMCC 1.3724)；羅伊氏乳桿菌(Lactobacilus reuteri)(DSM 17938)或其混合物。該組合物亦可包括益生質(prebiotics)，諸如菊糖、果寡醣(FOS)、短鏈果寡醣(短鏈FOS)、半乳寡醣(GOS)、木寡醣(XOS)、阿拉伯木寡醣(AXOS)、神經節苷脂、部分水解之瓜耳膠、阿拉伯膠、大豆膠。該組合物亦可包括非益生質，諸如乳枸杞(Lacto-wolfberry)、枸杞提取物或其混合物。

該組合物可為嬰兒配方、較大嬰兒配方或成長奶粉，幼兒穀類食物或優格，幼兒餐、布丁或奶酪，乳或水果飲料，慕斯(smoothy)，點心或餅乾，或其他烘焙食品。該組合物可為儲存穩定或凍乾產品的形式，或以擠製、無菌加工處理或高溫高壓的方式製造。

在本專利說明書中，下列術語具有如下的涵義：「斷奶期」是指幼年哺乳動物從以純液體乳汁為基礎的營養物適應成以半固體或固體食物，及從類似獨一無二的食物類型(一般而言，以嬰兒情形而言，是指母乳或嬰兒配方奶粉)適應成各類食物的時期。

「耐受性」意指對食物具有低反應性的活化狀態。

「益生菌」意指對宿主的健康或安康具有利效果的微生物細胞製劑或微生物細胞組分(Salminen,S.,Ouwehand,A..Benno,Y.等人，Probiotics：how should they be defined,Trends Food Sci.Technol.(1999)：10 107-10)。益生菌的定義通常被認可且與WHO定義相符。益生菌可包括獨一無二的微生物菌株、各種菌株之混合物及/或各種細菌物種及屬之混合物。以混合物的情形而言，單數術語「益生菌」仍可用於表示益生菌混合物或製劑。以本發明目的而言，屬於雙歧桿菌屬的微生物被視為益生菌。

「益生質(Prebiotic)」通常意指不能消化的食物成分，其係藉由選擇性地刺激宿主腸胃中所存在的微生物生長及/或活性而有利地影響宿主，及進而試圖改善宿主健康。

動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌(B.lactis)菌株NCC2818(雀巢公司的收藏培養物)係以國際識別委託範圍CNCM-I-3446(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at Institute Pasteur,Paris,France)名下的B.lactis存放。全文中係使用B.lactis NCC2818。CNCM是指位於法國巴黎22陸德大道75724號的國立巴斯德研究所微生物培養中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at Institut Pasteur,22 rue du docteur Roux,75724 Paris,France.)。

本發明係關於將益生菌(明確言之是乳雙歧桿菌NCC2818(乳雙歧桿菌CNCM-I-3446))投與斷奶期的健康幼年哺乳動物，也就是當時該幼年哺乳動物開始食用無乳食品且為了其營養需求越來越降低對乳的依賴。在人類嬰兒中，該時期通常發生在當嬰兒約3個月至12個月齡的時候，儘管該時期可能持續到18、24或甚至達36個月齡。嬰兒通常直到此其後的年齡或甚至更大年齡都會持續有規律地遭遇到新食物。

以下段落列出益生菌之投予模式的細節。

如在實例1之實驗數據所證明，將乳雙歧桿菌NCC2818投與斷奶期仔豬對於與腸胃有關之黏膜免疫系統的結構及功能具有顯著的影響。投與根據本發明之益生菌可加速幼年哺乳動物對新攝入食物之適應性及改善幼年哺乳動物對新攝入食物之耐受性。因此，該介入提供一種支持嬰兒在斷奶的挑戰時期期間的免疫適應性的方法。所有嬰兒均受益於本發明，包括因為其家族史具有發展中異位性疾病之風險的嬰兒。

益生菌之劑量

投與幼年哺乳動物乳雙歧桿菌NCC2818的每日劑量為1×10⁶至1×10¹¹ cfu，較佳為1×10⁶至1×10⁹ cfu(cfu=菌落形成單位)。

倘若乳雙歧桿菌NCC2818可以實現所述的正面效果，投與幼年哺乳動物的乳雙歧桿菌NCC2818可以大範圍百分比存在於組合物中。因此，只要考慮到上述每日劑量，每公克投與的乾燥組合物中所存在之益生菌含量可以改變。然而，較佳地，存在於組合物的乳雙歧桿菌NCC2818係每公克乾燥組合物介於1 x10²與1×10¹¹ cfu之間，較佳地是每公克乾燥組合物介於1×10⁴至1×10⁹ cfu之間。此包括細菌為活的、不活化的或死的或甚至是以片段(諸如DNA或細胞壁物質)存在的可能性。可採用技藝中已知的方法使得益生菌不具有複製的能力。因此，配方奶粉中所含的細菌數量係以該數量細菌的菌落形成能力表示，不論該細菌實際上是否為活的、不活化的或死的、片段或任何或所有該類狀態的混合物，就好像所有的細菌是活的一般。

投與方法

乳雙歧桿菌NCC2818可經口投與幼年哺乳動物；其可以純化的或為稀釋於水或母乳中(例如)作為副食品或作為嬰兒奶粉配方中之成分。如果在嬰兒6個月齡之前開始投與益生菌，則此配方奶粉稱為「初生嬰兒配方奶粉」，或如果在嬰兒大於6個月開始投與，則該配方奶粉稱為「較大嬰兒配方奶粉」。此出生嬰兒配方奶粉的實例說明於實例2中。該配方奶粉也可以是其中牛乳蛋白質經水解的低敏(HA)配方奶粉。

若幼年哺乳動物介於12與24個月齡之間，該益生菌可以成長奶粉、穀類食物或優格，幼兒餐、布丁或奶酪，乳及水果飲品，慕斯，點心或餅乾，或其他烘焙食品的方式投與。此成長奶粉的實例說明於實例3中。該組合物可為儲存穩定或凍乾產品的形式，或可藉由擠製、無菌加工處理或高溫高壓方式製造。

與其他化合物之投與

乳雙歧桿菌NCC2818可與一或多種其他益生菌投與。該等益生菌較佳選自龍根雙歧桿菌BB536(ATCC BAA-999)；鼠李糖乳桿菌(CGMCC 1.3724)；羅伊氏乳桿菌(DSM 17938)或其混合物。

乳雙歧桿菌NCC2818可單獨投與(純的，或稀釋於水或乳中，包括例如母乳)，或與其他化合物(諸如膳食補充品、營養補充品、藥物、載體、香料、可消化或不可消化成分)之混合物投與。維生素及礦物質為典型膳食補充品的實例。在一個較佳實例中，該組合物係與其他可提高上述子代免疫作用的化合物一起投與。此等協同化合物可為能促進乳雙歧桿菌NCC2818遞送至幼年哺乳動物腸道的載體或基質。該等化合物可為其他協同地或各別地影響嬰兒免疫反應及/或強化益生菌效果之活性化合物。該等協同化合物的一個實例為麥芽糊精。麥芽糊精的一個效果在於提供益生菌載體以提高益生菌效果，並預防聚集。

其他實例包括已知的益生質化合物(諸如選自如下組成之群之碳水化合物：菊糖、果寡醣(FOS)、短鏈果寡醣(短鏈FOS)、半乳寡醣(GOS)、木寡醣(XOS)、阿拉伯木寡醣(AXOS)、神經節苷脂、部分水解之瓜耳膠(PHGG)、阿拉伯膠、大豆膠、蘋果提取物)及非益生質化合物(諸如乳枸杞、枸杞提取物或其混合物)。其他碳水化合物可以存在，諸如可與第一碳水化合物協同作用的第二碳水化合物。該(等)碳水化合物係以約1g至20g、或1%至80%、或20%至60%存在於組合物之每日劑量中。或者，該等碳水化合物係以乾燥組合物之10%至80%存在。

與乳雙歧桿菌NCC2818投與之碳水化合物及所有其他化合物之每日劑量應當總是遵循公開之安全指導及法規要求。這對投與1歲以下的嬰幼兒尤其重要。

在一個實施例中，營養組合物較佳地係包括蛋白質來源。膳食蛋白質較佳地係蛋白質來源。膳食蛋白質可為任何適宜的膳食蛋白質，例如動物性蛋白質(諸如，乳蛋白或肉蛋白)、植物性蛋白質(諸如，大豆蛋白質、小麥蛋白質、米蛋白質或豌豆蛋白質)、游離胺基酸的混合物或其組合。尤佳者為乳蛋白，諸如酪蛋白及乳清蛋白。

該組合物亦可包括碳水化合物來源及/或脂肪來源。

若本發明組合物為營養組合物且包括脂肪來源，該脂肪來源較佳地係提供約5%至約55%營養組合物之能量；例如約20%至約50%的能量。

組成脂肪來源的脂類可為任何適宜的脂肪或脂肪混合物。植物性脂肪尤其適宜，例如，大豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、向日葵油、玉米油、芥花籽油、卵磷脂及類似物。亦可視需要添加動物性脂肪，諸如乳脂。

另一來源之碳水化合物可添加至該營養組合物。其較佳地係提供約40%至約80%營養組合物之能量。可使用任何適宜的碳水化合物，例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體、麥芽糊精或其混合物。亦可視需要添加其他膳食纖維。若添加，其較佳地包括至多達約5%營養組合物之能量。膳食纖維可來自任何適宜來源，包括例如大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜耳膠、阿拉伯膠、果寡醣或其混合物。適宜維生素及礦物質可以符合適宜指導之含量併入營養組合物中。

一或多種必須長鏈脂肪酸(LC-PUFA)可以併入該組合物中。可添加之LC-PUFA的實例為二十二碳六烯酸(DHA)及花生油酸(AA)。LC-PUFA係以可使其存在於組合物構成高於0.01%脂肪酸的濃度添加。

若有需要，一或多種食品級乳化劑可以包含於營養組合物中；例如，單及二甘油酯之二乙醯基酒石酸酯、卵磷脂及單或二甘油酯或其混合物。任何適宜的鹽類及/或穩定劑可包含其中。香料可添加至組合物中。

投與時期

投與時期的開始與斷奶期的開始典型地是同一時期，斷奶期的開始也就是最早非乳食品被攝入的當時。另一種方式是，乳雙歧桿菌NCC2818的投與係在該時期前不久開始，例如，在攝入最早非乳食品的前1或2週。投與乳雙歧桿菌NCC2818也可在攝入最早非乳食品後不久發生。然而，如果益生菌的介入係與最早攝入新食物同時發生或在攝入新食物時間點之前，正面效果被認為最大。

以人類嬰兒而言，斷奶開始的年齡係取決於嬰兒出生的文化環境，因為斷奶會根據不同的文化發生在不同的年齡。斷奶通常發生在嬰兒約3至7個月齡時。因此，在該情形下，投與益生菌可在斷奶開始時就開始，也就是當嬰兒約3至7個月齡時，或在該時間點前1至4週。

甚至可以更早開始投與，例如，斷奶開始前3、4、5、6、7、8、9或10週。

投與益生菌的期間可為持續性的，例如每日直到嬰兒至少12個月齡。持續性投與對於維持性效果更佳。然而，咸經推測，間斷性投與方式(例如，每月一周期間每日投與或隔周期間每日投與)可產生對嬰兒有利的效果。

投與益生菌之持續時間會根據嬰兒及其出生的文化環境的不同而有所變化。如果在斷奶同時間或略早就開始投與益生菌，預料即使短期間持續投與(例如1、2或3個月)也會有正面效果。較長期間持續投與可以提供幼年哺乳動物更長時間的正面效果。典型地，投與益生菌係持續到嬰兒至少12個月齡。該投與可持續直到嬰兒18個月齡、或24個月齡或甚至長達3歲。嬰兒通常會持續有規律地遭遇到新食物直到4歲。

較佳地，對嬰兒之投與為每日攝取或每隔一日攝取，每日1次或2次攝取益生菌。

益生菌投與之效果

乳雙歧桿菌NCC2818投與斷奶期嬰兒可改善對新攝入食物的耐受性。此經利用實例1所述之斷奶仔豬動物模型在一組實驗中得到證明。因為相較齧齒動物，仔豬在剛出生及出生後的發展更可與人類相比，所以本發明者選擇仔豬模型以研究乳雙歧桿菌NCC2818在斷奶期的影響。除此之外，最近對於小鼠、豬及人類之147基因型、表現型及功能參數的比較業已顯示，這些參數中80%在豬與人之間比在小鼠與人之間更為相似(Wernersson R,Schierup MH,Jorgensen FG等人，2005,Pigs in sequence space：A 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing.BMC Genomics,6：70)。

本專利說明書所呈現的結果清楚地證明，投與斷奶期仔豬乳雙歧桿菌NCC2818對於與腸胃有關之黏膜免疫系統之結構及功能具有明顯的影響。

在本發明一個實施例中，可以促進對新攝入蛋白質具有特異性之系統性IgG的暫時性增加，該系統性IgG的暫時性增加通常發生於斷奶期。當斷奶同時伴隨投與乳雙歧桿菌NCC2818時，則會更快速增加且增加程度更大。

因此，在實例1中，根據圖1A之餵養方案餵哺的仔豬在第3週斷離母乳改食大豆食物(以4.2×10⁶ cfu/ml(約2×10⁹ cfu/kg代謝wt/天)濃度混入配方之經補充乳雙歧桿菌NCC2818大豆食物)，或改食蛋類食物。在斷奶後0、7及14天測量每一組別動物血清中大豆特異性IgG1及IgG2之含量(見圖2)。這對應於圖1A中出生後21、28及35天。據觀察，以免疫系統先前陌生的蛋白質餵食斷奶期仔豬斷奶後1及2週，會導致血清中特異性IgG的暫時性增加。亦觀察到，仔豬當餵食補充有乳雙歧桿菌NCC2818之大豆時，在血清中大豆-特異性IgG₂會出現顯著更大幅增加(p=0.03；圖2B)及大豆-特異性IgG₁出現更大幅增加的傾向(圖2A)。

因應食物蛋白質所提高的血清IgG抗體反應係與人類對經IgE調節的過敏性疾病及豬隻對斷奶後痢疾感受性降低有關(Li,D.F.等人，Interrelationship between Hypersensitivity to Soybean Proteins and Growth-Performance in Early-Weaned Pigs,Journal of Animal Science,1991；69：4062-4069及Strait,R.T.等人，Ingested allergens must be absorbed systemically to induce systemic anaphylaxis,Journal of Allergy and Clinical Immunology；127：982-989.e1.)。

因此，實例1中經餵食補充有乳雙歧桿菌NCC2818的仔豬中所觀察到大豆特異性IgG之更高暫時性增加顯示斷奶期間投與乳雙歧桿菌NCC2818可加速及增加仔豬免疫系統對新攝入蛋白質的適應性程度。

在另一實施例中，當斷奶同時伴隨投與乳雙歧桿菌NCC2818時，可增加幼年哺乳動物之絨毛高度。

絨毛高度可視為嬰兒健康良好的一個指標。在胃腸道所伴隨的疾病(諸如，乳糜瀉或病毒感染)中，經常可見絨毛萎縮(Cummins,A.等人，American Journal of Gastroenterology,2011,106,145-50；及Boshuizen等人；Journal of Virology,2003,77(24),13005-16)。在仔豬中亦已證明，在諸多現象中絨毛長度的減少是顯示斷奶期腸道完整性的急性損壞。相反地，此時期之後適應性的特徵為空腸絨毛長度增加(Montagne,L.等人，British Journal of Nutrition,2007,97,45-57)。因此，較高的絨毛高度與腸道適應新食物之轉變有關。

圖3顯示動物經依循圖1餵養方案II後的腸道黏膜(遠端小腸)之組織形態學。由於斷奶在黏膜形態上的急性變化發生在斷奶後的2至5天。因為實驗的目的在於證明乳雙歧桿菌NCC2818對腸道黏膜形態的有利影響，因此餵養方案II的實驗步驟可以調整。因為咸信益生菌需要一定的餵食持續時間以達到效果，因此餵食該等動物開始於24小時大。因此，從出生、24小時後即測量經以或未以乳雙歧桿菌NCC2818餵食之仔豬的絨毛高度(A)。仔豬在第21天斷奶改食固體食物(蛋類食物、蛋類食物+NCC2818)，或者依舊餵食仔豬配方(組合配方)。

在第25天測量絨毛高度。板A證明，相較於未補充乳雙歧桿菌NCC2818的組別，經補充乳雙歧桿菌NCC2818的蛋類食物小組顯示在絨毛高度有增加。充分的絨毛高度通常被視為生理學上具有功能性及良好發展之腸道黏膜的指標之一。確保絨毛高度通常被視為具有保護性的。因為乳雙歧桿菌NCC2818所增加的絨毛高度因而可視為黏膜保護的象徵。

在另一實施例中，斷奶時補充乳雙歧桿菌NCC2818似乎可以促進腸繫膜淋巴結(MLN)中某些免疫過程的轉變，從較不成熟的IgM佔優勢的抗體反應變成更成熟的IgA佔優勢的反應。

圖4顯示動物經實例1飼養方案I餵食的MLN中B-細胞濾泡之螢光免疫組織形態。經(乳雙歧桿菌NCC2818)補充的組別與未經補充的組別兩相比較，觀察到淋巴結中之濾泡的總數沒有改變(圖4A)。然而，在經補充組別中，IgM特異性濾泡及濾泡外IgM產生之細胞的數量顯著降低(p<0.0001；圖4B、圖4C)。與未經補充組別比較，IgA特異性濾泡之數量亦顯著地增加(分別為p=0.04及p<0.0001；圖4B、圖4C)。

該等結果顯示斷奶期間補充乳雙歧桿菌NCC2818之動物會朝向對新攝入食物更加「成熟的」免疫反應的趨勢。此更加成熟的反應可視為對新攝入食物之耐受性的改善。幼年哺乳動物之腸道系統對新食物適應更快。因此，本發明者假設，此更快的適應性用另外的語言解釋就是與斷奶有關之脆弱期的縮短。因此，與斷奶有關的病理病症可以預防或其嚴重性降低。另外，該等病症對生命後期的長期影響可以預防及/或減少。

因此，投與根據本發明益生菌具有對幼年哺乳動物之預防疾病效果，可以預防與導因於斷奶期因攝入新食物所產生之病理狀態有關的輕度不適或嚴重不適。

實例 實例1：用以研究乳雙歧桿菌NCC2818在斷奶時的影響之仔豬模型

進行兩個實驗。

根據飼養方案I(圖1A)的第一個實驗，生命最初三周，仔豬吸吮母豬。在第3週，仔豬斷奶改食以大豆為基礎經補充乳雙歧桿菌(NCC2818)之含蛋白質成分固體食物或未經補充乳雙歧桿菌(NCC2818)之含蛋白質成分固體食物，或改食未經補充之卵清蛋白(OVA)食物。在第7週，所有動物改餵食魚粉，其中一組維持經補充乳雙歧桿菌NCC2818。動物在第11週時被犧牲。

斷奶後0、7及14天測量系統性大豆特異性IgG之含量(圖2)，且動物被犧牲時檢測腸繫膜淋巴結(MLN)細胞中之IgA、IgM及CD21的含量(圖4)。

根據飼養方案II(圖1B)的第二個實驗，從24小時後，以經補充乳雙歧桿菌NCC2818或未經補充乳雙歧桿菌 NCC2818的配方餵食仔豬。在第21天，仔豬斷奶改食固體食物(蛋類食物，蛋類食物+NCC2818)或依舊餵食仔豬配方(組合配方)。在第25天動物被犧牲的當天，測量腸道黏膜樣本的絨毛高度。結果示於圖3中。

實驗細節如下述。

動物模型：

根據當地倫理指引進行動物圈養及實驗程序：所有試驗係在英國國內特許總部監督下進行，並經過當地倫理審查團體許可。利用取自單一頭公豬(由Hermitage-Seaborough Ltd,North Tawton,Devon,UK提供)之精液人工受精7頭遠系交配的母豬。在分娩六週前，將母豬運到臨床獸醫科學部(department of Clinical Veterinary Science)及餵食以小麥為基礎的食物(BOCM Pauls Ltd,Wherstead,UK)。

飼養方案I(圖1A)

3週齡時，仔豬斷奶並按窩分成三組。此刻，一組接受動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌(CNCM I-3446)，或者稱為乳雙歧桿菌NCC2818之益生菌膳食補充品以4.2×10⁶ CFU/ml之濃度(約2×10⁹ cfu/kg代謝wt/天)以噴霧乾燥培養物之形式混入配方中。將所需量之補充有新鮮益生菌的飼料每日2次餵食該組，直到豬11週齡時實驗結束。剩餘兩組不接受益生菌補充品。益生菌餵食及對照組的動物係於經生物安全柵欄分開之不同隔間中。接受益生菌之仔豬斷奶改食以大豆為基礎的食物，而未接受益生菌的仔豬斷奶改食大豆或卵白蛋白(蛋)食物。所有飲食均補充適量的維生素及礦物質，且係由Parnutt Foods Ltd.(Sleaford,Lincolnshire,UK)按訂單製造。

從7週齡，所有三組動物均餵食不含蛋及大豆、視需要含或不含益生菌之以魚類為基礎的食物。

所有的仔豬在3、4及5週齡時，以静脈穿刺取血以收集血清。在11週齡時，仔豬用阿紮哌隆(Azaperone)鎮定，並以超量巴比妥鹽(barbiturate)安樂死。在仔豬死後，回收心臟血液及組織。

飼養方案II(圖1B)

在1天大時，仔豬與母豬分離及按窩分成兩組。然後，一組仔豬係餵食補充有動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌(CNCM I-3446)，或者稱為乳雙歧桿菌NCC2818的配方，以4.2×10⁶ cfu/ml之濃度(約2×10⁹ cfu/kg代謝wt/天)以噴霧乾燥培養物之形式混入配方，直至第21天。第二組仔豬係餵食不含乳雙歧桿菌NCC2818補充品之配方，直至第21天。將所需量之補充有新鮮益生菌的飼料每日2次餵食經補充的組，直到豬25天大時實驗結束。

當仔豬3週齡時，將經補充乳雙歧桿菌NCC2818的組別分成2組，並將其中一組斷奶改食經補充乳雙歧桿菌NCC2818的蛋類食物，或另一組根本不斷奶。類似的作法，將未經補充的組別分成2組，並將其中一組斷奶改食蛋類食物或另一組根本不斷奶。所有飲食均補充適量的維生素及礦物質，並由Parnutt Foods Ltd.(Sleaford,Lincolnshire,UK)按訂單製造。該飲食係經設計以使其包含21%的蛋類蛋白質。

25天大時，用阿紮呱隆使仔豬鎮定並以過量巴比妥鹽使其安樂死。仔豬死後，回收組織。

抗原特異性免疫球蛋白之測量(圖2)

在第0、7及14天時，從飼養方案I之動物取得血清樣本。藉由Bailey M.等人詳述於Effects of infection with transmissible gastroenteritis virus on concomitant immune responses to dietary and injected antigens,Clin.Diagn.Lab.Immunol.2004；11：337-43中的ELISA方法分析樣本之抗卵清蛋白IgG₁及IgG₂抗體。簡言之，用源自雞蛋白的卵清蛋白(Sigma)塗覆96孔微量板，然後用含於PBS-tween 20之2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)(Sigma)阻斷非專一性鍵結位點。洗滌後，將系列稀釋之血清樣本及參考標準品添加至微量板中。參考標準品是經以卵清蛋白進行高免疫接種反應後所得的豬血清。利用同型-特異性單株抗體，接著藉由如上之經HRP共軛之羊抗鼠檢測結合之抗大豆IgG₁及IgG₂抗體，及藉由將樣本內插於參考標準品的方法測定抗體之相對濃度。

為比較遠系繁殖動物在斷奶時所產生之血清抗體的變化(其中遠系繁殖動物的抗體初始含量不同)，結果係以操作後之抗體與操作前之抗體的比例表示(抗體的倍數變化)

免疫組織學 樣本收集

在各實驗仔豬死後不久摘除MLN組織。將該等組織包埋在OCT(Tissue TEK,BDH,Lutterworth,Leicestershire,UK)中，並在液態氮氣相中預冷至約-70℃後，置於異戊烷中速凍。樣本儲存在-80℃下直到切片。利用型號OTF低溫切片機(Brights Instrument Company Ltd.,Huntingdon.UK)連續切割該等組織一系列5 μm之切片。該等切片空氣乾燥24小時，然後浸在丙酮中固定15分鐘。切片載片儲存在-80℃之前先使其乾燥。

螢光免疫組織學及分析

以2色螢光免疫組織學而言，係使用鼠抗豬單株抗體(針對ELISA係IgA及IgM)識別游離及細胞結合之IgA及IgM陽性細胞(圖4)。經共軛第二試劑是使用：共軛至FITC之山羊抗鼠IgG₁(Southern Biotechnology,AMS Biotechnology,Oxon,UK)及共軛至TRITC之山羊抗鼠IgG_2b(Southern Biotechnology)。按照Inman等人，2010,Inman,C.F.,Rees,L.E.N.,Barker E.,Haverson,K.,Stokes,C.R.,Bailey,M.,Validation of computer-assisted,pixel-based analysis of multiple-colour immunofluorescence histology,Journal of Immunological Methods,2005；302：156-167所述之方式(除了利用含於PBS之10%山羊血清完成Fc受體阻斷外)，進行組織著色、圖像採集及自動圖像分析。

組織形態學及分析

按照如上在樣本收集中所示的方式製備樣本，及利用蘇木清素及伊紅染劑進行著色，並接著利用檢測絨毛長度之圖像軟體、經圖像採集及自動圖像分析進行分析。

實例2

初生嬰兒奶粉配方

實例3：

成長乳粉組合物

其他支持本發明之證據可見於論文「Weaning diet induces sustained metabolic phenotype shift in the pig and influences host response to Bifidobacterium lactis NCC2818C」(Merrifield及M.Lewis等人，2012,Gut doi：10.1136/gutjnl-2011-301656)，藉此以引用的方式併入本文參考。特別參考Merrifield及M.Lewis等人所執行之圖3板A。Merrifield及M.Lewis等人所示數據，可以提供當在斷奶期投與健康幼年哺乳動物益生菌(特別是動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌)時具有免疫適應性效果的證據。

圖1：飼養方案

A：飼養方案I：仔豬斷離母乳改食固體食物(分別以大豆或OVA(蛋)為基礎的蛋白質)，且一組補充有NCC2818。所有的組別從第49天改食魚粉直到第77天實驗結束。n=6。

B：飼養方案II：仔豬從24小時大時餵食含或不含NCC2818之配方。其後，各組中有半數仔豬斷奶改食以蛋類蛋白質為基礎的食物，或根本不斷奶。實驗係在25天大時結束。n=6。

圖2：對餵食大豆之血清IgG反應

以經補充NCC2818(大豆+NCC2818)或未經補充NCC2818(大豆食物)大豆餵食的仔豬或以未經補充NCC2818蛋類食物餵食之仔豬(蛋類食物)的血清中大豆特異性IgG₁(A)及IgG₂(B)的變化。誤差線=SEM(n=14)。結果係與介入前對大豆蛋白質抗體含量比較，以介入後對大豆蛋白質之抗體含量的變化表示(抗體的倍數變化)。

圖3：腸道黏膜(遠端小腸)之組織形態計量

從24小時後，經以含或不含NCC2818飼料餵食仔豬的絨毛高度。仔豬在第21天時斷奶改食固體食物(蛋類食物，蛋類食物+NCC2818)，或依舊餵食仔豬配方(組合配方)。第25天結束實驗後進行組織形態計量分析。結果係以平均log₁₀ mm±標準差(SE)表示。

圖4：腸繫膜淋巴結(MLN)細胞中B-細胞濾泡的螢光免疫組織形態

第21天開始斷奶時，以經補充乳雙歧桿菌NCC2818或未經補充乳雙歧桿菌NCC2818之大豆餵食的仔豬之濾泡總數(A)、濾泡外細胞中表現IgA及IgM(B)及IgA或IgM陽性濾泡之數目(C)。誤差線=SEM(n=6)。

Claims

一種益生菌，其係在斷奶期投與健康幼年哺乳動物以增進對新攝入食物的耐受性。
如請求項1之益生菌，其中當暴露新攝入食物時體液免疫反應(特別是免疫球蛋白類別G之產生)之暫時性增加比未接受益生菌之幼年哺乳動物中所發生者更迅速及/或增加程度更大。
如請求項1或2之益生菌，其中在斷奶期間該腸道黏膜絨毛之高度及/或面積比未接受益生菌之幼年哺乳動物增加15%以上。
如請求項1或2之益生菌，其中該益生菌為動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)。
如請求項4之益生菌，其中該益生菌為動物雙歧桿菌亞種乳雙歧桿菌(B.lactis)。
如請求項5之益生菌，其中該益生菌為菌株乳雙歧桿菌(B.lactis)NCC2818。
如請求項1或2之益生菌，其中其係以1×10²至1×10¹¹，較佳1×10⁶至1×10⁹ cfu(cfu=菌落形成單位)之每日劑量投與。
如請求項1或2之益生菌，其中其係投與介於約3個月齡至約24個月齡之間的人類健康幼兒。
如請求項1或2之益生菌，其中其係以純形式、或稀釋於水中或以適合投與幼年哺乳動物之組合物投與。
如請求項1或2之益生菌，其中該益生菌係與一或多種其他益生菌組合投與。
如請求項10之益生菌，其中該一或多種其他益生菌較佳選自龍根雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BB536(ATCC BAA-999)；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamno-sus)(CGMCC 1.3724)；羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)(DSM 17938)或其混合物。
如請求項1或2之益生菌，其中該益生菌係以組合物投與，其中該組合物包括其他成分或益生質(prebiotics)，較佳選自菊糖、果寡醣(FOS)、短鏈果寡醣(短鏈FOS)、半乳寡醣(GOS)、木寡醣(XOS)、阿拉伯木寡醣(AXOS)、神經節苷脂、經部分水解之瓜耳膠(guar gum)、阿拉伯膠、大豆膠、乳枸杞(Lactowolfberry)、枸杞提取物或其混合物。
如請求項1或2之益生菌，其中該益生菌已經不活化，以致使其不可複製。
如請求項1或2之益生菌，其中該益生菌係以嬰兒配方、較大嬰兒配方(follow-on formula)、成長奶粉、穀類食物或優格，幼兒餐、布丁或奶酪，乳或水果飲品，慕斯(smoothy)，點心或餅乾，或其他烘焙品投與。
一種益生菌之用途，其係用於投與斷奶期健康幼年哺乳動物以加速對新攝入食物之適應性。
如請求項15之用途，其中該益生菌或益生菌混合物：a.在斷奶開始或斷奶前不久，以每日劑量之益生菌投與幼年哺乳動物，及 b.在斷奶期開始後，持續每日投與至少4週的時期。
如請求項16之用途，其中該益生菌為乳雙歧桿菌(B.lactis)NCC2818。
如請求項16或17之用途，其中該每日劑量為約1×10⁶至約1×10⁹菌落形成單位(cfu)之乳雙歧桿菌(B.lactis)NCC2818。