PT1645566E - Análogos da hormona paratiróide - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DA HORMONA PARATIRÓIDE"

Antecedentes da Invenção A hormona paratiróide ("PTH") é um polipéptido produzido pelas glândulas paratiróides. A forma em circulação madura da hormona é compreendida por 84 resíduos de aminoácidos. A acção biológica da PTH pode ser reproduzida por um fragmento peptídico do seu terminal N (por exemplo, os resíduos de aminoácidos 1 até 34). A proteína relacionada com a hormona paratiróide ("PTHrP") é uma proteína de 139 até 173 aminoácidos com homologia N-terminal à PTH. A PTHrP partilha muitos dos efeitos biológicos da PTH, incluindo ligação a um receptor comum da PTH/PTHrP. Tregear et al., Endocrinol. _93_: 1349 (1983). Foram caracterizados péptidos da PTH de muitas fontes diferentes, por exemplo, humana, bovina, de rato, galinha. Nissenson et al., Receptor 3: 193 (1993) .

Verificou-se que a PTH melhora a massa e qualidade ósseas. Dempster et al., Endocrine Rev. 1£: 690 (1993), e Riggs, Amer. J. Med. 91_ (Supl. 5B) : 37S (1991). O efeito anabólico da PTH administrada de forma intermitente foi observado em homens e mulheres com osteoporose, com ou sem terapia anti-reabsorção concorrente. Slovik et al., J. Bone Miner. Res. 1377 (1986); Reeve et al., Br. Med. J. 301: 314 (1990), e Hesch, R-D. et al., Calcif. Tissue Int'l. _44: 176 (1989).

Os pedidos de patente WO-A9401460 e WO-A-9702834 divulgam análogos da PTH com uma multiplicidade de substituições possíveis em várias posições.

Resumo da Invenção 2

Num aspecto, a invenção apresenta péptidos com as seguintes fórmulas: [Cha22, 23, Glu25, Lys26, 30, Leu28, Aib29] hPTHrP(1-34)NH2; [Cha22, 23, Glu25, Lys26, 30,

Aib29]hPTHrP (1-34) NH2; [Glu22, 25, Cha23, Lys26, Leu28, 31, Aib2 9, Nle3 0]hPTHrP (1-34)NH2; [Cha22, 23, Glu25,

Lys26, 30, Leu28, 31. Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, Cha23, Aib25, 29, Lys2 6, 30, Leu28, 31]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,

Cha23, Aib25. 29, Lys26, Leu28]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, 25,

Cha23, Lys26, Leu28, 31, Aib29, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, 25, Cha23, Lys26, 30, Aib29, Leu31]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, 25, Cha23, Lys26, 30, Leu28, 31, Aib29]hPTHrP(1- 34)NH2; [Glu22, 25, Cha23, Lys26, 30, Aib29]hPTHrP(1- 34)NH2; ou [Glu22, 25, Cha23, Lys26, 30, Leu28,

Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; ou um respectivo sal farmaceuticamente aceitável.

Com a excepção do aminoácido N-terminal, todas as abreviaturas (por exemplo, Ala ou Αχ) de aminoácidos nesta divulgação significam a estrutura de -NH-CH(R)-CO-, em que R é uma cadeia lateral de um aminoácido (por exemplo, CH3 para Ala). Para o aminoácido N-terminal, a abreviatura significa a estrutura de =N-CH (R) -CO-, em que R é uma cadeia lateral de um aminoácido. β-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, Ahc e Aib são as abreviaturas dos seguintes a-aminoácidos: β-(2-naftil)alanina, norleucina, ácido a,β-diaminopropiónico, ciclo-hexilalanina, norvalina; 4-aminofenilalanina, β-(3-piridinil)alanina, ácido 1-amino-1-ciclo-hexanocarboxílico e ácido a-aminoisobutirico, respectivamente. O que se pretende significar por Acc é um aminoácido seleccionado do grupo de: ácido 1-amino-l-ciclopropanocarboxílico; ácido 1-amino-l-ciclobutanocarboxílico; 3 ácido 1-amino-l-ciclopentanocarboxílico; ácido 1-amino-l-ciclo-hexanocarboxílico; ácido 1-amino-l-ciclo-heptanocarboxílico; ácido 1-amino-l-ciclo-octanocarboxílico, e ácido 1-amino-l-ciclononanocarboxilico. Na fórmula acima, hidroxialquilo, hidroxifenilalquilo e hidroxinaftilalquilo podem conter 1-4 substituintes hidroxi. Também COEi significa -C=0-Ei. Exemplos de -C=0-Ei incluem, mas não se limitam a acetilo e fenilpropionilo.

Um péptido desta invenção também é aqui designado por outro formato, por exemplo, [Ahc7'11 ] hPTH (1-34) NH2 (apenas para

fins explicativos), com os aminoácidos substituídos da sequência natural colocados entre o segundo conjunto de parênteses (por exemplo, Ahc7 para Leu7 e Ahc11 para Leu11 na hPTH) . A abreviatura hPTH significa PTH humana, hPTHrP significa PTHrP humana, rPTH significa PTH de rato e bPTH significa PTH bovina. Os números entre os parênteses referem-se ao número de aminoácidos presentes no péptido (por exemplo, hPTH(1-34) consiste nos aminoácidos 1 até 34 da sequência peptídica da PTH humana) . As sequências de hPTH (1-34), hPTHrP (1-34), bPTH(l-34) e rPTH(l-34) estão listadas em Nissenson et al., Receptor 3_: 193 (1993). A designação "NH2" em PTH (1-34) NH2 indica que o terminal C do péptido está amidado. Por outro lado, PTH (1-34) tem um terminal C ácido livre.

Cada um dos péptidos da invenção é capaz de estimular o crescimento de osso num sujeito (isto é, um mamífero, tal como um paciente humano) . Assim, é útil no tratamento de osteoporose e fracturas ósseas quando administrado isoladamente ou concorrentemente com terapia anti- reabsorção, por exemplo, bifosfonatos e calcitonina. 4

Os péptidos desta invenção podem ser fornecidos na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos desses sais incluem, mas não se limitam aos formados com ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, láctico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzóico, metanossulfónico, toluenossulfónico ou pamóico), ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico) e ácidos poliméricos (por exemplo, ácido tânico, carboximetilcelulose, ácido poliláctico, ácido poliglicólico ou copolímeros de ácidos poliláctico-glicólico).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um péptido desta invenção e uma substância transportadora farmaceuticamente aceitável (por exemplo, carbonato de magnésio, lactose ou um fosfolípido com o qual o composto terapêutico pode formar uma micela) em conjunto formam uma composição terapêutica (por exemplo, um comprimido, pastilha, cápsula ou líquido) para administração (por exemplo, oralmente, intravenosamente, transdermicamente, pulmonarmente, vaginalmente, subcutaneamente, nasalmente, iontoforeticamente ou intratraquealmente) a um sujeito. 0 comprimido, pastilha ou cápsula a ser administrado oralmente pode ser revestido com uma substância para proteger a composição activa do ácido gástrico ou enzimas intestinais no estômago durante um período de tempo suficiente para permitir que passe não digerido para o intestino delgado. A composição terapêutica também estar na forma de uma formulação de libertação prolongada biodegradável ou não biodegradável, para administração subcutânea ou intramuscular. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 3 773 919 e 4 767 628 e Pedido PCT N° WO 94/15587. Também se pode obter administração contínua utilizando uma 5 bomba implantável ou externa (por exemplo, bomba INFUSAID™). A administração também pode ser conduzida de modo intermitente, por exemplo, uma única injecção diária, ou continuamente numa dose baixa, por exemplo, formulação de libertação prolongada. A dose de um péptido da presente invenção para o tratamento das doenças ou perturbações acima mencionadas varia, dependendo do modo de administração, em função da idade e do peso corporal do sujeito e do estado do sujeito a ser tratado; em última análise, será decidida pelo médico ou veterinário que atende o sujeito.

Também é contemplado no âmbito desta invenção um péptido abrangido pela fórmula genérica acima para utilização no tratamento de doenças ou perturbações associadas a deficiência no crescimento ósseo ou afins, por exemplo, osteoporose ou fracturas.

Outras caracteristicas e vantagens da presente invenção serão claras da descrição pormenorizada e das reivindicações.

Descrição Detalhada da Invenção

Com base na descrição aqui apresentada, a presente invenção pode ser utilizada em toda a sua extensão. Os seguintes exemplos específicos devem ser considerados meramente ilustrativos e não limitativos do restante da divulgação de modo nenhum.

Estrutura

Foi relatado que a PTH(l-34) e PTHrP(l-34) têm dois domínios alfa helicoidais anfofílicos. Ver, por exemplo, 6

Barden et al.r Biochem. 3_2: 7126 (1992). A primeira a- hélice é formada entre os resíduos de aminoácidos 4 até 13, ao passo que a segunda α-hélice é formada entre os resíduos de aminoácidos 21 até 29. Síntese

Os péptidos da invenção podem ser preparados por síntese em fase sólida comum. Ver, por exemplo, Stewart, J.M. et al., "Solid Phase Synthesis" (Pierce Chemical Co., 2a edição, 1984) . 0 que se segue é uma descrição de como se preparou [Glu22'25, Leu23'28, Lys26'30, Aib29, Ahc31] hPTH (1-34) NH2 (apenas para fins explicativos). Outros péptidos da invenção podem ser preparados de modo análogo por um perito na especialidade.

Sintetizou-se do modo seguinte ácido 1-[N-tert-butoxi-carbonilamino]-1-ciclo-hexanocarboxílico (Boc-Ahc-OH): Dissolveram-se 19,1 g (0,133 mol) de ácido 1-amino-l-ciclo-hexanocarboxílico (Acros Organics, Fisher Scientific,

Pittsburgh, PA) em 200 ml de dioxano e 100 ml de água. A este sistema adicionaram-se 67 mg de NaOH 2 N. Arrefeceu-se a solução num banho de gelo-água. Adicionaram-se a esta solução 32,0 g (0,147 mol) de dicarbonato de di-tert-butilo. Agitou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente. Depois removeu-se o dioxano sob pressão reduzida. À solução aquosa remanescente adicionaram-se 200 ml de acetato de etilo. Arrefeceu-se a mistura num banho de gelo-água. Ajustou-se o pH da camada aquosa para cerca de 3 por adição de HC1 4 N. Separou-se a camada orgânica. Extraiu-se a camada aquosa com acetato de etilo (1 x 100 ml). Duas camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água (2 χ 150 ml) , foram secas em MgS04 anidro, filtradas e concentradas até à secura sob pressão 7 reduzida. 0 resíduo foi recristalizado em acetato de etilo/hexanos. Obtiveram-se 9,2 g de um produto puro. Rendimento 29%. Outros aminoácidos Acc protegidos podem ser preparados de um modo análogo por um perito na especialidade. 0 péptido foi sintetizado num sintetizador de péptidos da Applied Biosystems (Foster City, CA) modelo 430A, que foi modificado para realizar síntese de péptidos em fase sólida com química Boc acelerada. Ver Schnoize et al., Int. J. Peptide Protein Res. ^0: 180 (1992). Utilizou-se resina 4-metilbenzidrilamina (MBHA) (Península, Belmont, CA) com a substituição de 0,93 mmol/g. Utilizaram-se os aminoácidos Boc (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem, LaJolla, CA) com a seguinte protecção de cadeias laterais: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH, Boc-His (DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2C1Z)-OH, Boc-Ahc-OH, Boc-Thr (Hzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH e Boc-Aib-OH. A síntese foi efectuada numa escala de 0,14 mmol. Removeram-se os grupos Boc por tratamento com 100% de TFA durante 2x1 minuto. Os aminoácidos Boc (2,5 mmol) foram pré-activados com HBTU (2,0 mmol) e DIEA (1,0 ml) em 4 ml de DMF e foram acoplados, sem neutralização prévia, ao sal de TFA do péptido-resina. Os tempos de acoplamento foram 5 minutos excepto para o Boc-Aib-OH e o seu resíduo seguinte Boc-Leu-OH, e Boc-Ahc-OH e o seu resíduo seguinte Boc-Lys(2Clz)-OH, em que os tempos de acoplamento para estes quatro resíduos foram 2 horas.

No final da montagem da cadeia peptídica, a resina foi tratada com uma solução de 20% mercaptoetanol/10% DIEA em DMF durante 2 χ 30 minutos, para remover o grupo DNP na 8 cadeia lateral de His. Em seguida, removeu-se o grupo Boc N-terminal por tratamento com 100% de TFA durante 2x2 minutos. O péptido-resina parcialmente desprotegido foi lavado com DMF e DCM e foi seco sob pressão reduzida. A clivagem final foi feita agitando o péptido-resina em 10 ml de HF contendo 1 ml de anisolo e ditiotreitol (24 mg) a 0°C durante 75 minutos. Removeu-se o HF com um fluxo de azoto. O residuo foi lavado com éter (6 χ 10 ml) e foi extraído com HOAc 4 N (6 x 10 ml). A mistura peptídica no extracto aquoso foi purificada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) preparativa de fase reversa utilizando uma coluna Ci8 Vydac™ de fase reversa (Nest Group, Southborough, MA). A coluna foi eluída com um gradiente linear (10% até 45% de solução B durante 130 minutos) a uma taxa de fluxo de 10 ml/minuto (Solução A = TFA aquoso 0,1%; Solução B = acetonitrilo contendo 0,1% de TFA). As fracções foram recolhidas e verificadas por HPLC analítica. As que continham produto puro foram combinadas e liofilizadas até à secura. Obtiveram-se 85 mg de um sólido branco. A pureza foi > 99%, com base em análise de HPLC analítica. A análise por espectrómetro de massa por electro-pulverização 5 situou o peso molecular em 3972,4 (de acordo com o peso molecular calculado de 3972,7). A síntese e purificação de [Cha22, Leu23'28'31, Glu25, Lys26'30, Ahc27, Aib29]hPTHrP (1-34) NH2 (não faz parte da invenção) foi feita do mesmo modo da síntese acima de [Glu22'25, Leu23'28, Lys26'30, Aib29, Ahc31 ] hPTHrP (1-34) NH2. O aminoácido protegido Boc-Cha-OH foi adquirido à Bachem, CA. A pureza do produto final foi > 99%, e o espectrómetro de massa por 9 electro-pulverização situou o peso molecular em 3997,2 (o peso molecular calculado é 3996,8).

Os nomes completos das abreviaturas utilizadas acima são os seguintes: Boc é t-butiloxicarbonilo, HF é fluoreto de hidrogénio, Fm é formilo, Xan é xantilo, Bzl é benzilo, Tos é tosilo, DNP é 2,4-dinitrofenilo, DMF é dimetil-formamida, DCM é diclorometano, HBTU é hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazolo-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio, DIEA é diisopropiletilamina, HOAc é ácido acético, TFA é ácido trifluoroacético, 2C1Z é 2-clorobenziloxicarbonilo e OcHex é O-ciclo-hexilo.

Outros péptidos desta invenção podem ser preparados de um modo análogo pelo perito na especialidade.

Ensaios Funcionais

A. Ligação ao Receptor da PTH

Testaram-se os péptidos da invenção quanto à sua capacidade para se ligarem ao receptor da PTH presente em SaOS-2 (células de osteossarcoma humano). As células SaOS-2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC #HTB 85) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e glutamina 2 mM a 37°C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 em ar. O meio foi mudado de três em três ou de quatro em quatro dias, e as células foram subcultivadas todas as semanas por tripsinação.

Mantiveram-se as células SaOS-2 durante quatro dias até terem atingido a confluência. O meio foi substituído por 5% FBS em meio RPMI 1640 e foi incubado durante 2 horas à 10 temperatura ambiente com 10 χ 10 cpm de mono- I-[Nle ' ,

Tyr34 (3 —1251) ] bPTH(l-34) NH2 na presença de péptidos competidores da invenção, a várias concentrações entre 10-11 M e 10”4 M. As células foram lavadas quatro vezes com PBS gelado e foram submetidas a lise com NaOH 0,1 M, tendo-se contado a radioactividade associada às células num contador de cintilações. A síntese de mono-125I-[Nle8,18, Tyr34 (3-125I)] bPTH (1-34) NH2 foi feita como descrito em Goldman, M.E. et al., Endocrinol. 123: 1468 (1988). 0 ensaio de ligação foi conduzido com vários péptidos da invenção, tendo-se calculado para cada péptido o valor Kd (inibição semi-máxima da ligaçao de mono- I-[Nle ' , Tyr (3 —1251) ] bPTH (1-34) NH2) .

Como apresentado na Tabela I, todos os péptidos testados exibiram uma elevada afinidade de ligação para o receptor da PTH na célula SaOS-2. B. Estimulação da Actividade da Adenilato-Ciclase

Mediu-se a capacidade dos péptidos da invenção para induzir uma resposta biológica em células SaOS-2. Mais especificamente, determinou-se qualquer estimulação da adenilato-ciclase medindo o nível de síntese de cAMP (adenosina 3',5'-monofosfato) como descrito previamente em Rodan et al., J. Clin. Invest. 7_2.: 1511 (1983) e Goldman et al., Endocrinol. 123: 1468 (1988). As células SaOS-2

confluentes em placas de 24 cavidades foram incubadas com 0,5 μθί de [3H]adenina (26,9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) em meio fresco a 37°C durante 2 horas e foram lavadas duas vezes com solução salina equilibrada de Hank (Gibco, Gaithersburg, MD). Trataram-se as células com IBMX 1 mM [isobutilmetilxantina, Sigma, St. Louis, MO] em meio 11 fresco durante 15 minutos e adicionaram-se ao meio os péptidos da invenção para incubarem durante 5 minutos. A reacção foi terminada pela adição de ácido tricloroacético (TCA) 1,2 M (Sigma, St. Louis, MO), seguida de neutralização da amostra com KOH 4 N. A cAMP foi isolada pelo método cromatográfico de duas colunas (Salmon et al., 1974, Anal. Blochem. _58, 541). Contou-se a reactividade num contador de cintilações (Contador de Cintilações Liguidas 2200CA, PACKARD, Downers Grove, IL).

Calcularam-se os valores EC50 respectivos (estimulação semi-máxima da adenilato-ciclase) para os péptidos testados, e estão apresentados na Tabela I. Verificou-se que todos os péptidos testados são estimuladores potentes da actividade da adenilato-ciclase, que é uma via bioquímica indicadora como sinal próximo da proliferação de osteoblastos (por exemplo, crescimento ósseo).

TABELA I (para efeitos comparativos) •TÈtÍTlCiO1' *a%*« ,¾. - v-*V t.t>3 3.7 -Mm SJ mm p (Aio''' b 'mm Í0 Cr»'' s.P' f ” ΟΡΧλΡ b Asxb mm m pb '· UP ***** [yP ^ os δ ί^}, M&·» X 2 §3 ^ IrX X U-ftbOS APA 0.3 OkP Xe >"4 » * UX N bH 0.4

Lisboa, 24 de Agosto de 2010

Claims (1)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de fórmula: [Cha22 , 23, Glu25, Lys26 , 30 , Leu28, Aib29] hPTHrP (1-34) NH2; [Cha22 , 23 , Glu25, Lys26 , 30 , Aib29] hPTHrP (1-34) NH2; [Glu22 , 25 , Cha23, Lys26, Leu28, 31, Aib29, Nle30]hPTHrP (1-34)NH2; [Cha22 , 23, Glu25, Lys26 , 30 , Leu28, 31, Aib29] hPTHrP (1-34) NH2; [Glu22, Cha23, Aib25, 29 , Lys26, 30 , Leu28, 31] hPTHrP (1-34) NH2; [Glu22, Cha23, Aib25, 29 , Lys26, Leu28] hPTHrP (1-34) NH2; (Glu22 , 25 , Cha23, Lys26, Leu28, 31, Aib29, Nle30] hPTHrP (1- 34) NH2; [Glu22 , 25, Cha23, Lys26, 30 , Aib29, Leu31 ] hPTHrP (1- 34) NH2; [Glu22 , 25 , Cha23, Lys26 , 30 , Leu28, 31, Aib29] hPTHrP (1-34) NH2; [Glu22 , 25 , Cha23, Lys26, 30 , Aib29] hPTHrP (1-34) NH2; or [Glu22 , 25, Cha23, Lys26, 30 , Leu28, Aib29] hPTHrP (1- 34)NH2; ou um respectivo sal farmaceuticamente aceitável. Lisboa,24 de Agosto de 2010