PT100980B

PT100980B - Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao

Info

Publication number: PT100980B
Application number: PT100980A
Authority: PT
Inventors: Lorne Franklin Erdile; Mary-Ann Brandt
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1991-10-18
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1999-07-30
Also published as: AU676140B2; FI941749A0; AU2801192A; FI941749A; NO310417B1; WO1993008299A1; CA2121121C; IL103462A0; JPH06511154A; PT100980A; NO941376L; EP0620860A4; CA2121121A1; EP0620860A1; NO941376D0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

CAMPO DO INVENTO presente invento refere-se à preparação de lipoproteínas recombinantes de Borrelia, particularmente à proteína A da superfície exterior (OspA) de Borrelia burqdorferi, a espiroqueta responsável pela doença de Lyme.

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente dos Estados Unidos copendente n^s de série 888 765, apresentado em 27 de Maio, 1992, o qual é, ele próprio, uma continuação em parte do pedido de patente dos Estados Unidos copendente n² de série 779 048, apresentado em 18 de Outubro, 1991.

ANTECEDENTES DO INVENTO

A doença de Lyme é uma zoonose causada pela espiroqueta transportada pelas carraças, Borrelia burqdorferi. A espiroqueta pode causar sérias desordens dermatológicas, artríticas, neurológicas e outras desordens patológicas num hospedeiro infectado. Recentemente a doença de Lyme tornou-se uma preocupação epidemiológica séria, particularmente na América do Norte, mas também em qualquer outro lugar no mundo.

Decorreram tentativas para desenvolver uma vacina contra a doença e reagentes de imunodiagnóstico úteis na detecção de anticorpos contra a espiroqueta. Focou-se muita atenção sobre a principal proteína da superfície exterior OspA, tendo-se verificado que anticorpos contra ela proporcionam protecção contra o desafio com a espiroqueta em ratinhos (ref. 1, 2 - a identificação das referências da literatura aparece no final da descrição).

Foram realizadas tentativas prévias para isolar lipoproteínas de Borrelia solúveis, purificadas, através do crescimento e subsequente purificação de culturas de células de Borrelia. No entanto, o crescimento e subsequente purificação //

487

MIS:jc 6102-98

das proteínas a partir de extractos brutos de células de Borreiia é muito moroso e dispendioso.

Foram sugeridas técnicas de recombinação para a produção de OspA e seus derivados, com vista no potencial para a produção de grandes quantidades de material proteico puro. Estas técnicas devem envolver expressão de genes de Borrelia num sistema hospedeiro/vector de expressão adequado, tal como E. coli.

O pedido de patente internacional publicado (PCT) n^a WO 90/04411 descreve um fragmento de ADN que codifica a proteína OspA de B. burqdorferi da estirpe de Nova Iorque B31 (ATCC 35210) e que contém o gene ospA. A sequência de nucleótidos do gene ospA, que codifica a OspA de comprimento total do tipo selvagem, está descrita no pedido de patente PCT publicado, juntamente com a sequência de aminoácidos obtida.

Dunn et al descreveram a preparação de uma forma modificada da proteína OspA que é solúvel, retendo ainda reactividade específica para anticorpos contra a OspA de B. burqdorferi do tipo selvagem (ref. 3). O artigo descreve a preparação de dois plasmídeos, pET9-OspA e pET9-preOspA, o primeiro contendo uma sequência de ADN amplificada por reacção em cadeia de polimerase (PCR) que codifica uma versão truncada recombinante da OspA, e o último contendo uma sequência de ADN amplificada por PCR que codifica a OspA de comprimento total, do tipo selvagem. Ambas as sequências são expressas a partir do promotor Φ 10 do bacteriófago T7.

produto da tradução primária do gene de comprimento total contém uma sequência de comando N-terminal hidrofóbica, a qual é um substracto para a ligação da porção lipídica à cadeia lateral sulfidrilo do resíduo de cisteína adjacente. Seguidamente a esta ligação, ocorre a clivagem por peptidase II de sinal e a ligação das porções lipídicas à nova extremidade N. Por outro lado, a proteína traduzida a partir do gene truncado não é lipidada, e é solúvel em solução aquosa. Diz-se que a expressão do derivado de OspA truncado, solúvel, ultrapassa certos problemas que se dizem

487

MIS:jc 6102-98

-4associados com a expressão de versões recombinantes de lipoproteínas de Borrelia burqdorferi de comprimento total do tipo selvagem utilizando E. coli, nomeadamente que a proteína possui pobres propriedades de solubilidade, devido à associação da proteína com a membrana celular exterior do hospedeiro durante a expressão, necessitando da utilização de detergentes para efectuar a separação da proteína e dificultando os procedimentos de purificação.

Os plasmídeos foram transferidos para uma estirpe de expressão de E. coli, nomeadamente a BL21 (DE3) (pLysS) (uma estirpe de hospedeiros contendo uma cópia cromossómica do gene para ARN polimerase de T7 sob controlo do promotor indutível lacUV5 e um plasmídeo baseado em pACYC184, pLysS, que produz baixos níveis de lisozima de T7). Com indução, verificou-se que o plasmídeo pET9-preOspA produzia quantidades relativamente- mais pequenas de proteína indutível do que o plasmídeo pET9-OspA. Verificou-se que o último produto é solúvel na ausência de detergente enquanto o primeiro requer tratamento com o detergente Triton X-100 para solubilizar. O artigo de Dunn et al não contém descrição de quaisquer isolamento e purificação subsequentes da proteína OspA solubilizada no detergente.

Embora se possa conseguir a produção de OspA recombinante de comprimento total em quantidades mais baixas do que a variação truncada solúvel de OspA e seja necessário o uso de detergentes para a recuperação da proteína de comprimento total (tratamento de lipoproteínas com detergentes danifica muitas vezes a reactividade), apesar da produção de proteína recombinante do tipo selvagem ser considerada desejável, uma vez que se pensa que a proteína do tipo selvagem lipidada produz uma resposta imunológica superior à da proteína truncada, devido à estimulação de linfócitos B (ref. 4, 5) e linfócitos T citotóxicos (ref. 6) por lípidos covalentemente ligados à extremidade N de um péptido de uma maneira idêntica àquela em que a porção lipídica se liga à OspA de B. burqdorferi (ref. 7).

Produziu-se imunidade protectora de longa duração ao

487

MIS:jc 6102-98

5— desafio com espiroquetas em ratinhos por vacinação com OspA (ref. 1, 8). 0 antigénio usado nestes estudos foi uma proteína de fusão contendo um grande domínio de glutationa-S-transferase na extremidade amino da OspA. Não é provável que esta proteína de fusão seja um substracto para uma ligação lipídica pós-tradução. A capacidade deste antigénio para induzir uma resposta protectora nestes estudos pode ser devida ao facto de que o antigénio foi distribuído em adjuvante de Freund completo, com múltiplas doses secundárias em adjuvante de Freund incompleto (ref. 1, 8), ou na forma de E. coli completa, viva ou morta, que expressa a proteína de fusão (ref. 9). Em relação a esta actividade anterior é também feita referência ao pedido de patente internacional publicado WO 92/00055.

Como aqui se verá, mostrou-se agora que a proteína recombinante codificada pelo gene ospA de comprimento total, na forma absorvida por alúmen ou sem adjuvante, exibe uma imunogenicidade que não é mostrada pela correspondente proteína OspA recombinante sem o lípido ligado. Mostrou-se que esta diferença em imunogenicidade não é devida a qualquer diferença entre a antigenicidade das duas proteínas. O presente invento representa a primeira descrição em que os inventores estão atentos ao aumento da imunogenicidade de um antigénio de proteína grande pela expressão de uma lipoproteína bacteriana.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento proporciona, num aspecto, uma maneira nova, simples e eficaz de produzir uma proteína recombinante altamente purificada e imunologicamente eficaz, codificada pelo gene ospA de comprimento total do tipo selvagem de B. burqdorferi e outras lipoproteínas de comprimento total de Borrelia codificadas pelos genes respectivos. A proteína recombinante exibe uma imunogenicidade que é igual à da proteína nativa.

O presente invento emprega separação selectiva da lipoproteína recombinante dos outros constituintes celulares utilizando detergentes particulares. 0 procedimento do presente

MIS:jc 6102-98

487 invento permite que os problemas observados na arte anterior associados com a produção da proteína OspA de comprimento total sejam ultrapassados, proporcionando ao mesmo tempo um produto com imunogenicidade melhorada.

Pela primeira vez, é proporcionada pelo presente invento uma proteína recombinante altamente purificada, imunologicamente eficaz, que é codificada por um gene da lipoproteína de comprimento total de Borrelia do tipo selvagem, particularmente o gene ospA de B, burqdorferi, e que é formada por recombinação a partir de um organismo hospedeiro transformado por um plasmídeo contendo o gene. Estas novas proteínas formam um aspecto adicional do presente invento. São também aqui proporcionados certos novos plasmídeos, úteis nesta transformação.

O novo produto proteico aqui proporcionado é útil em vacinas contra infecção por organismos Borrelia, particularmente aqueles que causam a doença de Lyme, e estas vacinas, compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz da proteína, particularmente a codificada pelo gene ospA de comprimento total de B. burqdorferi do tipo selvagem, constituem um aspecto adicional do invento.

Ainda num aspecto adicional do invento, proporciona-se um processo de imunização de um mamífero contra infecção por organismos Borrelia, particularmente aqueles que causam a doença de Lyme, por administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína, particularmente a codificada pelo gene ospA de comprimento total de B. burqdorferi do tipo selvagem, na ausência de adjuvante.

As novas proteínas podem também ser utilizadas como agentes de imunodiagnóstico para a detecção de anticorpos contra infecção de um hospedeiro por um organismo Borrelia, particularmente um que cause a doença de Lyme, e portanto a presença dessa infecção.

487

MISíjc 6102-98

Produziu-se aqui, como seguidamente se descreve, proteína recombinante purificada, imunologicamente eficaz, codificada pelo gene ospA de comprimento total a partir de várias estirpes específicas diferentes de B. burqdorferi, especificamente as estirpes B31, ACA1 e Ip90. Existem também genes ospA de comprimento total que diferem na sequência de nucleótidos das sequências destes genes específicos, no máximo, em alguns ácidos nucleícos, resultando em produtos de genes que diferem, no máximo, em alguns aminoácidos dos que são produzidos pelos verdadeiros genes ospA das estirpes B31, ACA1 e Ip90. Estes genes e os produtos dos genes são aqui combinados dentro das famílias de estirpes B31, ACA1 e Ip90.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra os oligonucleótidos PCR usados na clonagem do gene ospA de comprimento total de B-31, ACA1 e Ip90 de B. burgdorferi no vector de expressão pET9a;

A figura 2 ilustra a estratégia de clonagem para a inserção do gene ospA de comprimento total no vector de expressão pET9a de modo a colocar o gene ospA sob o controlo do promotor Φ 10 de T7, para formar pOAl a partir do gene B31, pOA9 a partir do gene ACA1 e pOAlO a partir do gene Ip90;

A figura 3 é um mapa de restrição previsto do plasmídeo pOAl;

A figura 4 mostra os resultados de vários digeridos de restrição do plasmídeo pOAl, demonstrando que todos os locais previstos estão presentes (M= marcadores (ADN ΦΧ 174 digerido com Hae III); B= Bam Hl; E= Eco RI; H= Hind III; N= Nde I);

A figura 5 mostra os nucleótidos de PCR utilizados na clonagem do gene ospA de comprimento total de B-31, ACA1 e Ip90 de B. burqdorferi no vector de expressão pCMBl;

A figura 6 ilustra a estratégia de clonagem para a inserção do gene ospA de comprimento total no vector de expressão pCMBl

ΊΑ 487

MIS:jc 6102-98 —8—

de modo a colocar o gene ospA sob o controlo do promotor Trc, para formar pOA5 a partir do gene B31, pOA7 a partir do gene ACA1 e pOA8 a partir do gene Ip90;

As figuras 7A, 7B e 7C mostram um decurso no tempo de indução com ITPG de OspA em duas estirpes de hospedeiros contendo pOAl (figura 7A), e uma estirpe de hospedeiros contendo pOA5 (figura 7B) e pOA6 (figura 7C);

As figuras 8A, 8B e 8C são diagramas de fluxos mostrando, respectivamente, os passos de crescimento e lise celulares, extracção com detergente, e de purificação envolvidos na produção e purificação de OspA recombinante de comprimento total a partir de E. coli de acordo com uma concretização do invento;

A figura 9 mostra a solubilização de proteínas em lisado celular completo com vários detergentes (Deo= desoxicolato de sódio; Emp= Empigénio; Sarc= laurilsarcosinato de sódio; SDS= dodecilsulfato de sódio; TX-114= Triton X-114), sendo as faixas (M= marcadores (Bio-Rad Low Molecular Weight Standards); W= lisado completo; S= fracção solúvel; P= pelota; A= fase aquosa; D= detergente);

A figura 10 é uma imunotransferência com o anticorpo monoclonal anti-OspA H5332, mostrando que as espécies de 31 quilodalton na fase do detergente são OspA, Wh= lisado celular completo, Aq= fase aquosa após extracção com Triton X-114, Dt= fase de detergente, Bx= fase aquosa retro-extractada com Triton X-114, Pl= pelota insolúvel;

A figura 11 ilustra a partição na fase de Triton X-114 de lipoproteína e proteína não lipidada para pOAl e pOA2, em que bactérias contendo pOAl que expressam lipoproteína OspA ou que contêm pOA2 que expressam proteína OspA não lipidada cresceram até à fase semi-logaritmica e foram induzidas com ITPG durante 2 horas para o pOAl e 4 horas para o pOA2. Após centrifugação, re-suspenderam-se as células e efectuou-se a lise por congelação e descongelação. Adicionou-se Triton X-114 e produziu-se a

MIS:jc 6102-98

partição de fases por aquecimento a 37°C.

487

electroforese de uma aliquota igual de cada fracção em gel de 4 a 20% de SDS-PAGE, e corou-se o gel com Azul Brilhante de

Coomassie. As fracções são marcadores de massas moleculares (Μ), lisado completo (W), fase aquosa (A), fase de detergente (D), e pelota insolúvel (P), para pOAl e pOA2 como indicado;

As figuras 12A, 12B e 12C ilustram a purificação de lipoproteína OspA produzida a partir de pOAl (figura 12A), a partir de pOA9 e pOAlO (figura 12B) e a partir de pOA5, pOA7 e pOA8 (figura 12C), onde uma aliquota de cada fracção foi submetida a electroforese num gel de 4 a 20% de SDS-PAGE e o gel foi tingido com Azul Brilhante de Coomassie. Figura 12A : faixa 1, marcadores de baixa massa molecular; faixa 2, lisado completo; faixa 3, fase de detergente; faixa 4, DEAE-Sepharose; e faixa 5, eluição'de S-Sepharose; Figura 12B : P= marcadores de baixa massa molecular pré-corados (106 kDa, 80 kDa, 49,5 kDa,

32,5 kDa, 27,5 kDa, 18,5 kDa), CL= lisado celular completo, D= fase do detergente Triton X-114, De= de fracção do fluido de passagem de DEAE Sepharose. S= eluição de Sepharose, pH 5,7 (OspA-2 purificada); Figura 12C : P= marcadores de baixa massa molecular pré-corados (106 kDa, 80 kDa, 49,5 kDa, 32,5 kDa, 27,5 kDa, 18,5 kDa), 0= OspA-L B31 purificada por S-Sepharose, derivada de pOAl (figura 12A), CL= lisado celular completo, D= fase do detergente Triton x-114, De= fracção do fluido de passagem de DEAE Sepharose.

A figura 13 é um gel corado com prata de três vacinas de teste usadas num estudo de comparação de imunogenicidade da OspA de comprimento total purificada com a de proteínas de Borrelia burgdorferi (M= marcadores; OA= OspA recombinante purificada; E= fracção E de B. burgdorferi; SA= albumina de soro bovino);

A figura 14 mostra os títulos de IgG no soro de ratinhos a que se deu um reforço quatro semanas após a injecção primária com 10 μφ da OspA de comprimento total purificada e fracção B. burgdorferi da figura 13, sendo realizado um ensaio ELISA com 100 ng de OspA purificada na fase sólida, soro de ratinho como

487

MIS:jc 6102-98 íflK.

primeiro anticorpo e IgG anti-ratinho de cabra conjugado com fosfatase alcalina como segundo anticorpo;

As figuras 15A a 15E contêm uma representação gráfica da resposta à dose de ratinhos à lipoproteína. A figura 15A mostra a resposta à dose de ratinhos C3H/He a lipoproteína não adsorvida; A figura 15B mostra a resposta à dose de ratinhos BALB/c a lipoproteína não adsorvida; A figura 15C mostra a resposta à dose de ratinhos C3H/He a lipoproteína adsorvida em alúmen; A figura 15D mostra a resposta à dose de ratinhos CH3/He a lipoproteína não adsorvida; A figura 15E mostra a resposta à dose de ratinhos CH3/He a proteína não lipidada. Vacinaram—se os ratinhos na semana 0 com a quantidade indicada de proteína, em PBS excepto onde indicado, e deu-se um reforço com a mesma vacina na semana 3. Determinou-se o título de IgG no soro na semana 4 por ELISA utilizando lipoproteína OspA como antigénio;

A figura 16 contém uma representação gráfica da antigenicidade da lipoproteína e da proteína não lipidada; e

A figura 17 ilustra a produção de plasmídeos pCMBl e pCMB2.

IDENTIFICAÇÃO DE PLASMÍDEOS CONTENDO O GENE ospA

Plasmídeo Estirpe de Vector de

I.D. B. burqdorferi Expressão

pOAl	B31	pET9a
pOA2*	B31	pET9a
pOA5	B31	pCMBl
pOA6	B31	pCMB2
pOA7	ACA1	pCMBl
pOA8	Ip90	pCMBl
pOA9	ACA1	pET9a
pOAlO	Ip90	pET9a

* Este plasmídeo contém ospA truncado da estirpe B31. Todos os outros plasmídeos contêm ospA de comprimento total de várias estirpes.

MISzjc 6102-98

487

DESCRIÇÃO GERAL DO INVENTO

O gene ospA clonado de B. burqdorferi da estirpe B31 (como descrito em WO 90/04411, acima mencionado) (região N-terminal : SEQ ID NO: 1, região c-terminal : SEQ ID NO: 2. O restante da sequência está mostrado em WO 90/04411) foi utilizado como molde (pTRH44) e utilizaram-se oligonucleótidos iniciadores especifi-camente projectados (PET-IN [CO1] (SEQ ID NO: 3) e PET-273 C [C03] (SEQ ID NO: 4)) numa reacção de polimerase em cadeia (PCR) para amplificar a totalidade do gene ospA do tipo selvagem, como mostrado na figura 1.

Similarmente, o gene ospA clonado de B. burqdorferi das estirpes ACA1 e Ip90 (como descrito na referência 10 - a região N-terminal de ACA1 e Ip90 é: SEQ ID NO: 1; região C-terminal de ACA1: SEQ ID NO: 5; região C-terminal de Ip90: SEQ ID NO: 6) foi utilizado numa reacção PCR com pares de oligonucleótidos iniciadores (a) OspN2 (SEQ ID NO: 7) e BZ1 (SEQ ID NO: 8) e (b) OspN2 (SEQ ID NO: 7) e pK4 (SEQ ID NO: 9), respectivamente nas extremidades N-terminal e C-terminal, para formar os fragmentos amplificados apropriados, como mostrado na figura 1.

Os processos básicos para a amplificação de uma sequência alvo de ácidos nucleícos desejada utilizando oligonucleótidos iniciadores são geralmente conhecidos na arte e estão descritos nas patentes dos E.U.A. N² 4 683 202 e 4 800 159. Pode-se referir estas patentes para a descrição das técnicas a empregar.

Clonaram-se os fragmentos resultantes nos locais Ndel e Bam Hl do vector plasmídico pET9 para colocar o gene ospA sob o controlo de um promotor de T7 e sinais de iniciação de tradução eficazes do bacteriófago T7, como se mostra na figura 2. Os plasmideos pET9 e pLysS, os hospedeiros bacterianos para clonagem, os meios de crescimento e os processos usados para dirigir a expressão dos genes clonados pela ARN polimerase de T7 foram anteriormente descritos na patente dos E.U.A. N² 4 952 496 e pode-se referi-la para esta descrição. Embora um sistema promotor de T7 seja um sistema de expressão preferido no presente invento, a expressão do gene ospA de comprimento total pode ser

487

MIS:jc 6102-98

-12—

conseguida utilizando outros sistemas de expressão compatíveis com o organismo hospedeiro, como se descreve em seguida.

Utilizou-se o vector de expressão pET9 uma vez que este possui um gene kan como seu marcador selectivo em vez do gene bla. Consequentemente, não se usa ampicilina durante o crescimento celular e portanto não há possibilidade de se formar um conjugado imunogénico de proteína alvo OspA/ampiciloilo. Crê-se que estes conjugados são determinantes antigénicos principais na alergia à penicilina e podem complicar os estudos imunológicos.

Os plasmídeos resultantes foram designados por pOAl, pOA9 e pOAlO, contendo os genes ospA das estirpes B31, ACA1 e Ip90 de B. burqdorferi, respectivamente. 0 plasmídeo pOAl é praticamente idêntico ao plasmídeo pET9-preOspA descrito por Dunn et al. (supra), excepto que os oligonucleótidos usados para a reacção PCR foram diferentes nos dois casos. Está mostrado na figura 3 um mapa de restrição previsto para o plasmídeo pOAl, enquanto a figura 4 contém os resultados de várias digestões de restrição do plasmídeo pOAl, demonstrando que todos os locais previstos estão presentes.

Para a produção de proteína, os plasmídeos pOAl, pOA9 e pOAlO foram transformados na estirpe de expressão de E. coli ou em outro organismo hospedeiro adequado. Preferivelmente, a estirpe de E. coli é a estirpe de expressão T7 de E. coli, como descrito na patente dos E.U.A. N^B 4 952 496 anteriormente mencionada. Especificamente, a estirpe pode ser a estirpe de expressão BL21(DE3) (pLysS) de E. coli, como acima descrito, ou a estirpe HMS174(DE3) (pLysS) de E. coli. 0 hospedeiro transformado cresceu e induziu-se a proteína com isopropil-0-D-tiogalactósido (IPTG). Mostra-se na figura 7A um decorrer no tempo da indução de OspA a partir do plasmídeo pOAl, após adição de IPTG. Obtiveram-se resultados idênticos aos do pOAl utilizando pOA9 e pOAlO. A síntese de proteína OspA a partir do plasmídeo pOAl terminou aproximadamente uma hora após a indução, implicando alguma toxicidade da proteína para a E. coli. Apesar

487

MIS:jc 6102-98

disto, a produção de proteína foi até um nível aceitável de aproximadamente 10 mg/1 de cultura de células.

Em adição à provisão dos plasmídeos pOAl, pOA9 e pOAlO e expressão de lipoproteína OspA em E. coli usando o promotor de T7, construíram-se plasmídeos adicionais contendo o gene ospA de comprimento total de B31, ACA1 e Ip90 sob um promotor diferente e conseguiu-se expressão da lipoproteína. Com este fim, prepararam-se os plasmídeos pOA5 e pOA6 por clonagem de um fragmento amplificado por PCR de ospA da estirpe B31 nos locais Ncol e Bam Hl dos vectores de expressão plasmídicos pCMBl e pCMB2 enquanto os plasmídeos pOA7 e pOA8 foram preparados por clonagem de um fragmento amplificado por PCR de ospA da estirpe ACA1 (pOA7) e da estirpe Ip90 (pOA8) nos locais Ncol e Bam Hl da vector de expressão pCMBl (ver figura 6 para pOA5, pOA7 e pOA8).

Como se vê na figura 5, os genes ospA clonados das estirpes de B. burgdorferi, B31, ACA1 e Ip90 foram amplificados por reacção PCR utilizando pares de oligonucleótidos iniciadores (a) PK3 (SEQ ID NO: 10) e CO3 (SEQ ID NO: 3), (b) PK3 e (SEQ ID NO: 10) e BZ1 (SEQ ID NO: 8), e (c) PK3 (SEQ ID NO: 10) e PK4 (SEQ ID NO: 9), respectivamente nas extremidades N- e C-terminal dos genes respectivos para formar os fragmentos amplificados apropriados.

Construíram-se os plasmídeos pCMBl e pCMB2 por digestão do plasmídeo pTrc99a (Pharmacia N^a de Catálogo 27-5007-01) e um gene de resistência à canamicina (Pharmacia N^a de Catálogo 27-4897-01), isolamento dos fragmentos resultantes pelo procedimento Geneclean, e por ligação dos fragmentos uns aos outros (figura 17). O plasmídeo pTrc99a, 4197 pb, contém um promotor forte adjacente a um local de clonagem múltiplo, seguido por um sinal de terminação de transcrição forte (rrnB). A expressão do gene alvo utiliza ARN polimerase da célula hospedeira, permitindo o seu uso numa vasta variedade de estirpes de E. coli. A expressão é fortemente controlada pelo gene supressor de lactose (laclq) incluído no vector. A proteína repressora de lactose impede a transcrição do gene alvo na

487

MIS:jc 6102-98

ausência do indutor IPTG. 0 gene de resistência à canamicina é um fragmento de ADN linear de cadeia dupla de 1282 pb contendo o gene desde o transposão Tn903 flanqueado por locais de restrição de enzimas e codifica a enzima aminoglicosido-3'-fosfotransferase, a qual confere resistência à canamicina e à neomicina.

pCMBl, de 5,5 kb, contém o gene de resistência à canamicina orientado de tal modo que a sua transcrição é feita na mesma direcção que a orientação a partir do promotor Trc, enquanto o pCMB2 contém o gene de resistência à canamicina orientado na direcção oposta, de modo que a transcrição do gene de resistência e do gene de interesse sob o controlo do promotor Trc resultam na convergência de transcritos. A digestão com enzimas de restrição do pCMBl e do pCMB2 usando Smal, HindIII e BamHI+Ncol mostrou os fragmentos com o tamanho exacto previsto.

Os plasmídeos pOA5 e pOA6 foram transformados na estirpe de expressão de E. coli ou noutro organismo adequado, preferivelmente as células competentes DH5a. Desenvolveram-se os hospedeiros transformados e induziu-se a proteína com IPTG. 0 decorrer no tempo de indução com pOA5 (figura 7B) foi similar ao obtido com pOAl (figura 7A) enquanto os níveis de OspA produzida pelo pOA6 (figura 7C) foram várias vezes inferiores. Obtiveram-se resultados idênticos a estes utilizando pOA7 e pOA8.

Os passos envolvidos na produção e na purificação da OspA recombinante de comprimento total estão mostrados esquematicamente nas figuras 8A a 8C. As condições específicas do processo estão aí enumeradas como se descreve nos exemplos seguintes.

Após o passo do crescimento celular e da indução da proteína (figura 8A), as células são submetidas a lise por congelação-descongelação. Trata-se o lisado com um detergente que seja selectivo para a solubilização da proteína OspA, preferencialmente em relação a outras proteínas bacterianas

487

MIS:jc 6102-98

presentes no lisado. Conduziu-se uma série de experiências empregando detergentes diferentes para determinar que detergente foi selectivo para a proteína OspA. Dos testados verificou-se que o Triton X-114 solubiliza selectivamente uma proteína de 31 quilodalton (figura 9), a qual mostrou ser a OspA por imunotransferência (figura 10).

invento não está limitado ao emprego de Triton X-114, mas também inclui claramente outros materiais que exibam uma solubilidade selectiva similar para a OspA bem como a propriedade de separação de fases sob condições moderadas como referido abaixo.

Após a adição do detergente selectivo, aquece-se a mistura até uma elevação de temperatura moderada de cerca de 35° a 40°C altura em que a solução se torna nebulosa à medida que ocorre a separação de fases. É essencial para o procedimento de purificação do presente invento que esta separação de fases ocorra sob condições moderadas para evitar qualquer desnaturação ou outros danos nas propriedades imunológicas da proteína. (Por exemplo, se o Triton X-100, mencionado por Dunn et al. (ref. 3), for utilizado como detergente, enquanto é efectuada a separação selectiva da proteína OspA, são necessárias temperaturas muito mais elevadas, cerca de 60 a 65°C, para se efectuar a separação de fases, o que é altamente desvantajoso em relação à utilidade do produto).

A centrifugação da mistura nebulosa resulta na separação da mistura em três fases, nomeadamente uma fase de detergente contendo 50% ou mais da proteína OspA e uma pequena quantidade (aproximadamente 5% em peso) das proteínas bacterianas, uma fase aquosa contendo o resto das proteínas bacterianas e uma pelota sólida de resíduos celulares. A fase de detergente é separada da fase aquosa e da pelota sólida.

Pelos passos de tratamento com um detergente selectivo para a OspA e a subsequente separação de fases da fase de detergente, consegue-se a separação substancialmente completa de OspA das

487

MISíjc 6102-98

proteínas bacterianas (figura 12). Resta a purificação final da OspA da proteína bacteriana residual presente na fase de detergente.

A purificação final da proteína é realizada numa coluna cromatografica selectiva para a ligação de proteínas bacterianas mas não da OspA, especificamente DEAE-Sephacel, DEAE-Sepharose, ou outro material cromatográfico equivalente. A fase de detergente é carregada na coluna e o fluido de passagem, o qual contém toda a proteína OspA purificada, é recolhido. A fracção ligada contém todas as proteínas bacterianas na fase de detergente. Após purificação adicional utilizando S-Sepharose ou uma coluna cromatográfica equivalente (figura 12), para além de ficar isenta de proteínas contaminantes, a fracção de fluido de passagem está substancialmente isenta de lipossacárido (LPS), como indicado pela falta de pirogenicidade, como determinado por lisado de amebócito límulo (LAL). A solução altamente purificada de OspA pode ser criodissecada ou processada de outro modo.

Embora o procedimento acima descrito tenha sido especificamente dirigido para a produção de proteína OspA recombinante altamente purificada, os procedimento e técnicas descritos são prontamente adaptáveis à produção de outras lipoproteínas de Borrelia recombinantes altamente purificadas, por clonagem adequada do gene apropriado, construção de um vector plasmídico adequado contendo o gene, transformação de um hospedeiro adequado pelo vector plasmídico, e produção e purificação da lipoproteína, por escolha adequada do surfactante selectivo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparou-se o plasmídeo pOAl como se descreveu acima e usou-se para transformar as estirpes de E. coli BL21(DE3) (pLysS) (pOAl) e HMS174(DE3) (pLysS) (pOAl). Inoculou-se a E. coli transformada em meios LB com 25 /xg/ml de sulfato de

487

MIS:jc 6102-98

-17canamicina e 25 gg/ml de clorafenicol a uma taxa de 12 ml de cultura por cada litro preparado. Deixou-se a cultura crescer durante a noite num balão misturador a cerca de 37°C.

Na manhã seguinte, transferiu-se 10 ml do meio de cultura da noite anterior para 11 de meio LB contendo 25 /xg/ml de sulfato de canamicina e deixou-se a cultura crescer num balão misturador a cerca de 37°C até um nível de D0=0,6 (embora se possa realizar um crescimento até D0=l,5), em aproximadamente 3 horas.

Adicionou-se ao meio de cultura isopropiltiogalactósido (IPTG) até uma concentração final de 0,5 mM e deixou-se crescer o meio de cultura durante mais duas horas a cerca de 37°C. No final deste período, arrefeceu-se o meio de cultura a cerca de 4°C e centrifugou-se a 10000 x g durante 10 minutos. Desprezou-se o sobrenadante enquanto se ressuspendeu a pelota de células em 1/10 do volume de PBS. Congelou-se a suspensão celular em azoto líquido e pode-se armazenar indefinidamente a -7 0 ° C, se desej ado.

Após a congelação da suspensão celular, descongelaram-se as células até à temperatura ambiente (cerca de 20° a 25°C) o que provoca a lise celular. Adicionou-se ADNase I ao material descongelado até uma concentração de 1 Mg/ml e incubou-se a mistura durante 30 minutos à temperatura ambiente, o que resultou numa diminuição da viscosidade do material.

Arrefeceu-se o material incubado em gelo até uma temperatura inferior a 10°C e adicionou-se Triton X-114 na forma de uma solução de armazém a 10% em peso, até uma concentração final de 0,3 a 1 % em peso. Manteve-se a mistura em gelo durante 20 minutos. Aqueceu-se em seguida a mistura arrefecida até cerca de 37°C e deixou-se a essa temperatura durante 10 minutos.

A solução tornou-se muito nebulosa à medida que ocorria a separação de fases. Centrifugou-se então a mistura nebulosa a cerca de 20 °C durante 10 minutos a 12 000 x g, o que causou a

487

MIS:jc 6102-98

separação da mistura numa fase inferior de detergente, uma fase aquosa superior e uma pelota sólida. Separou-se a fase de detergente das outras duas fases e arrefeceu-se a 4°C, sem perturbar a pelota. Adicionou-se tampão A, nomeadamente Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM e NaCl 10 mM, à fase de detergente arrefecida para voltar a reconstituir 1/3 do volume original. A solução resultante pode ser congelada e armazenada para processamento posterior como se descreve abaixo ou pode ser imediatamente submetida a esse processamento.

Preparou-se uma coluna de DEAE-Sepharose CL-6B num volume de 1 ml/10 ml de fase de detergente e lavou-se com 2 volumes de tampão C, nomeadamente Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, NaCl 1M, 0,3% em peso de Triton X-100, e depois com 4 volumes de tampão B, nomeadamente Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, 0,3% em peso de Triton X-100.

Carregou-se então a fase de detergente na coluna e recolheu-se o fluido de passagem contendo a OspA. Lavou-se a coluna com 1 volume de tampão B e recolheu-se novamente o fluido de passagem. O fluido de passagem combinado era uma solução aquosa de OspA purificada, a qual pode ser congelada para armazenagem.

A coluna pode ser limpa de proteínas bacterianas para reutilização, por eluição com 2 volumes de tampão C.

A purificação adicional e final do fluido de passagem da coluna de DEAE-Sepharose pode ser realizada por cromatografia em S-Sepharose Fast Flow. Acidificou-se primeiro o fluido de passagem da coluna de DEAE-Sepharose até pH 4,2 pela adição de ácido cítrico 0,1 M. Lavou-se a coluna de S-Sepharose Fast Flow extensivamente com tampão C, e ajustou-se a pH 4,2 com ácido cítrico.

Eluíu-se a OspA altamente purificada da coluna utilizando tampão C, e ajustou-se a pH 5,7 com ácido cítrico. Reajustou-se imediatamente o eluído a pH 7,5 pela adição de base Tris 2M.

487

MIS:jc 6102-98

A solução aquosa de OspA altamente purificada obtida por ambos os procedimentos cromatográficos foi analizada através de geles corados com Coomassie (figura 12A) e confirmou-se que continha OspA na forma altamente purificada. A pureza do produto produzido pelo último procedimento cromatográfico foi superior à do formado pelo primeiro procedimento cromatográfico, exibindo níveis muito baixos de endotoxina.

Exemplo 2

Repetiu-se o procedimento do exemplo 1, com a exepção de se terem utilizado outros surfactantes, bem como o Triton X-114, para formar a fase de detergente. Os resultados que se obtiveram estão mostrados na figura 9. Como se pode ver na figura 9, dos detergentes testados apenas o Triton X-114 foi capaz de proporcionar uma solubilização suficientemente selectiva da OspA para permitir a purificação rápida por coluna cromatográfica.

Exemplo 3

Prepararam-se os plasmídeos pOA5 e pOA6 como se descreveu acima e utilizaram-se para transformar a estirpe DH5a de E. coli. Repetiu-se o procedimento de expressão da proteína que se empregou no exemplo 1 e o decorrer no tempo de expressão da lipoproteína OspA pelo pOA5 foi idêntico ao observado para o pOAl enquanto a expressão a partir do pOA6 se verificou ser várias vezes inferior do que a do pOA5 (figuras 7B e 7C). Apenas se continuou a purificação da proteína OspA nas células que expressavam o pOA5.

A lipoproteína OspA de B31 produzida pelo sistema de expressão Trc desta maneira foi purififcada seguindo um procedimento idêntico ao descrito no exemplo 1, com a excepção de que se adicionaram 0,1 mg/ml de lisozima à pelota de células após a sua recolha e se suspenderam as células durante 30 minutos à temperatura ambiente antes da congelação.

fluido de passagem da coluna de DEAE-Sepharose continha

487

MIS:jc 6102-98

lipoproteína OspA numa forma altamente purificada (figura 9C).

Exemplo 4

Repetiram-se os procedimentos para a produção do plasmídeo pOAl (promotor pET) e pOA5 (promotor TRC), como se descreveu anteriormente, com o gene ospA clonado da estirpe asiática (Ip90) de B. burqdorferi (ATCC ________), para formar os plasmídeos pOA8 (promotor Trc) e pOAlo (promotor pET) contendo o gene. Realizou-se uma digestão de restrição com estes plasmídeos, a qual mostrou que todos os locais previstos estavam presentes.

Repetiram-se também os procedimentos com o gene ospA clonado da estirpe europeia (ACA1) de B. burqdorferi (ATCC _____), para formar os plasmídeos pOA7 (promotor Trc) e pOA9 (promotor pET) contendo o gene. Realizou-se uma digestão de restrição que mostrou que todos os locais previstos estavam presentes.

O crescimento e indução das estirpes de expressão pOA7 e pOA8 prosseguiu identicamente à estirpe de pOA5 (exemplo 3) enquanto o crescimento e a indução das estirpes de expressão pOA9 e pOAlO foi realizada identicamente à da estirpe de pOAl (exemplo 1).

As lipoproteínas OspA de ACA1 e lp90 obtidas por estas operações foram purificadas de modo idêntico à lipoproteína OspA de B31 (pOAl) como se descreveu no exemplo 1. 0 fluido de passagem da coluna de DEAE-Sepharose continha lipoproteína OspA numa forma altamente purificada (figuras 12B, 12C).

Exemplo 5

A OspA recombinante de comprimento total de E. coli, purificada, de acordo com o procedimento descrito no exemplo 1, foi comparada com a fracção E de B. burqdorferi, a qual é enriquecida em OspA (preparada como descrito no PCT N² WO

487

MISzjc 6102-98

90/04411 anteriormente mencionada), e com albumina de soro de bovino (BSA) quanto à imunogenicidade em ratinhos. Injectaram-se ratinhos C3H/He com 10 pg de cada vacina (figura 13) numa forma sem adjuvante. Quatro semanas depois da primeira injecção, administrou-se um reforço aos ratinhos com o mesmo antigénio que se utilizou na primeira injecção. Testaram-se os títulos no soro por um ELISA contra lipoproteína OspA, recombinante, purificada, (figura 14).

Como se pode ver, ambos os imunogénios provocaram uma resposta muito similar, ou seja, uma resposta IgG no soro primária fraca, mas detectável, com um aumento de 100 vezes nos títulos do soro após o reforço. Para ambos os imunogénios, os títulos de IgG no soro mantiveram-se estáveis durante pelo menos 6 semanas. Em nenhum caso se observou qualquer resposta significativa de IgG no soro.

Estas experiências indicam que a OspA recombinante é igualmente imunogénica à proteína purificada de B. burqdorferi.

A integridade imunológica da lipoproteína OspA recombinante foi ainda demostrada pelo facto de que os soros de ratinhos imunizados com a lipoproteína recombinante foram completamente capazes de inibir o crescimento da estirpe de espiroquetas B31 B. burqdorferi in vitro, como se vê a partir da tabela 1 seguinte:

487

MIS:jc 6102-98

TABELA 1. Títulos de actividades mibidoras de crescimento de B. burgdorferi em soros de ratinhos vacinados com lipoproteína e proteína não lipidada OspA

Estirpe \| de ratinho\| 1	Antigênio \| 1 I
1 C3H/He \| 1 I	1 lipoproteína OspA \| 1 1
1 1 1	1 1 proteína não lipi-\|
1 I	dada OspA \| I
1 BALB/C \| 1 I	1 lipoproteína OspA \| 1 I
1 1 1	1 1 proteína não lipi-\|
1	dada OspA 1

Dose I Titulo de inibição do cres (Mg) | cimento de B.burgdorferi

---------------------------1 0 1	<8
0,1 I	32
0,5 \|	256
2,5 \|	1024
0,1 \|	<8
0,5 \|	<8
2,5 \|	<8
θ 1	<8
0,1 [	4
0,5 \|	16
2,5 \|	512
0,1 \|	<8
0,5 \|	<8
2,5 I	<8

Como se pode ver nesta tabela, verificou-se que a actividade inibitória do soro era proporcional à dose de lipoproteína administrada aos ratinhos e que se correlacionava muito bem com os resultados obtidos pelo ensaio ELISA para a IgG anti-OspA. 0 soro de ratinhos vacinados com proteína não lipidada OspA, o qual não continha anticorpos anti-OspA detectáveis, não teve efeito sobre o crescimento das espiroquetas.

Os títulos inibidores do crescimento atingidos em ratinhos imunizados com 2,5 ^g de lipoproteína OspA em PBS foram iguais ou superiores aos obtidos em ratinhos vacinados com 20 /zg de proteína total de B. burgdorferi em adjuvante de Freund completo e com um reforço de proteína total em PBS. A capacidade da lipoproteína OspA recombinante para provocar uma resposta no

ΊΑ 487

MIS:jc 6102-98

soro capaz de inibir o crescimento das espiroquetas demonstrou que os epitopos protectores críticos na proteína são conservados durante a expressão em E. coli e na subsequente purificação.

Exemplo 6

Preparou-se o plasmideo pOA2 de maneira similar à descrita acima para o plasmideo pOAl, excepto que se usou o iniciador PET-18N, possuindo a sequência (SEQ ID NO: 11):

5' CAG CAT ATG GCT AAG CAA AAT GTT AGC 3' juntamente com o iniciador C-terminal PET-273C, na reacção PCR para amplificar a forma truncada do gene ospA desprovido do péptido de sinal da lipoproteína. A região sublinhada no PET-18N é idêntica aos nucleótidos 51 a 67 da cadeia de codificação do gene da OspA.

Utilizou-se o plasmideo pOA2 para transformar as estirpes BL21 (DE3) (pLysS) (pOA2) e HMS174 (DE3) (pLysS) (pOA2) de E. coli e expressou-se a proteína OspA truncada a partir das E. coli transformadas, como descrito no exemplo 1. Com a realização dos passos de lise celular e extracção com detergente do exemplo 1, verificou-se que a proteína não lipidada estava presente na fase aquosa, como seria de esperar.

Exemplo 7

Investigou-se o efeito da ligação dos lípidos à proteína OspA sobre a imunogenicidade.

Vacinaram-se ratinhos C3H/He e BALB/C com ambas as formas de lipoproteína da OspA formada e isolada como descrito no exemplo 1 ou com a forma de proteína não lipidada da OspA preparada por Dunn et al. (ref 3) e deu-se um reforço três semanas mais tarde. Recolheram-se os soros 1 a 2 semanas após o reforço, e ensaiaram-se por ELISA utilizando lipoproteína OspA purificada como antigénio.

487

MIS:jc 6102-98

As figuras 15A e 15B mostram que a lipoproteína OspA em PBS induziu uma resposta IgG secundária forte, dependente da dose, em ambos os ratinhos C3H/He (figura 15A) e BALB/C (figura 15B). Observou-se um pequeno, se algum, aumento na imunogenicidade da lipoproteína quando a proteína foi absorvida em hidróxido de alumínio numa razão de proteína;alumínio de 1:5 em peso antes da injecção, como se vê pela figura 15C.

Em contraste com a resposta observada para a lipoproteína OspA, a proteína não lipidada foi incapaz de induzir qualquer anticorpo anti-OspA detectável, mesmo com a dose mais elevada de 25 Mg/ratinho, como se vê na figura 15E. Mesmo a proteína não lipidada absorvida em alúmen parece incapaz de produzir uma resposta imunológica.

Deve-se observar que as versões de lipoproteína e proteína não lipidada de OspA são idênticas na sequência de aminoácidos deduzida excepto para o resíduo de aminoácido amino terminal que é cisteína modificada para a lipoproteína e metionina-alanina para a proteína não lipidada, o que sugere fortemente que a diferença observada na imunogenicidade seja devida à presença da porção lipídica.

Exemplo 8

Foi também investigada a antigenicidade inerente da OspA lipidada e não lipidada, para determinar se a diferença na imunogenicidade observada no exemplo 7 era devida a diferenças na sua antigenicidade inerente ou a diferenças em como o sistema imunológico reconhece e responde às duas proteínas.

Os soros de ratinhos imunizados com a lipoproteína deram um sinal positivo num ELISA utilizando ambas as versões da OspA como antigénio de teste, como se vê na figura 16. Similarmente, os soros de ratinhos imunizados com a proteína não lipidada falharam na reacção com ambos os antigénios. Consequentemente, enquanto ambas as versões da OspA são igualmente antigénicas, a lipoproteína é bem reconhecida pelo sistema imunológico enquanto

487

MIS:jc 6102-98

-25que a proteína não lipidada não o é.

Em adição, estes resultados sugerem fortemente que, embora o grupo lipídico seja essencial para a imunogenicidade, os anticorpos formados contra a lipoproteína são dirigidos principalmente contra a porção peptídica da molécula, e não contra a porção lipídica.

Exemplo 9

Observou-se o efeito da origem da estirpe para a proteína OspA sobre a imunogenicidade.

Vacinaram-se ratinhos com lipoproteínas OspA purificadas de B31, ACA1 e Ip90 derivadas de pOAl, pOA9 e pOAlO, respectivamente. Os ratinhos foram vacinados com 2,5 p,g de proteína na semana 0, deu-se um reforço com a mesma dose na semana 3, e sangraram-se na semana 4. Determinaram-se os títulos IgG no soro na semana 4 por um ensaio ELISA utilizando lipoproteína OspA purificada de B31, ACA1 ou Ip90 como antigénio. O título foi determinado utilizando o anticorpo secundário IgG anti-ratinho de cabra.

Os resultados obtidos nestas experiências estão mostrados na figura 15D. Como se pode ver nestes dados, a OspA recombinante para todas as estirpes testadas é imunogénica em ratinhos e os soros policlonais mostram uma reactividade cruzada parcial.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

Como sumário desta descrição, o presente invento proporciona um procedimento novo e simples para produzir uma proteína recombinante, altamente purificada e imunologicamente eficaz, codificada por um gene de lipoproteína de comprimento total de Borrelia do tipo selvagem , particularmente o gene ospA de B. burgdorferi, utilizando um detergente para extrair selectivamente a proteína da estirpe hospedeira e subsequentemente purificando a solução do detergente por

487

MISzjc 6102-98

-26São possíveis modificações dentro do cromatografia em coluna, âmbito deste invento.

REFERÊNCIAS DE LITERATURA

1. Fikrig, E., S.W. Barthold, F.S. Kantor e R.A. Flavell (1990). Protection of Mice Against the Lyme Disease Agent by Immunizing with Recombinant OspA. Science, 250: 553-556.

2. Simon, M.M., U.E. Schaible, M.D. Kramer, C. Eckerskorn, C. Museteanu, H.K. Muller-Hermelink, e R. Wallich (1991). Recombinant Outer Surface Protein A from Borreiia burqdorferi Induces Antibodies Protective Against Spirochetal Infection in Mice. J. Infect. Pis., 164: 123-132.

3. Dunn, J.J., B.N. Lade, e A.G. Barbour (1990). Outer Surface Protein A (OspA) from the Lyme Disease Spirochete, Borrelia burqdorferi: High Levei Expression and Purification of Soluble Recombinant Form of OspA. Protein Expression and Purification 1: 156-168.

4. Bessler, W.G., B. Suhr, H.-J. Buhring, C.P. Muller, K.-H. Wiesmuller, G. Becker, e C. Jung (1985). Specific Antibodies Elicited by Antigen Covalently Linked to a Synthetic Adjuvant. Immunobioloqy 170: 239-244.

5. Biesert, L. , W. Scheuer, e Bessler, W.G. (1987 ). Interaction of Mitogenic Bacterial Lipoprotein and a Synthetic Analogue with Mouse Lymphocytes. Eur. J. Biochem.. 162: 651-657.

6. Deres, K. , H. Schild, K.H. Wiesmuller, G. Jung, e H.G. Rammensee (1989). In vivo Priming of Virus-Specific Cytotoxic T Lymphocytes with Synthetic Lipopeptide Vaccine. Nature 342: 561-564.

7. Brandt, M.E., B.S. Riley, J.D. Radolf, e M.V. Norgard (1990). Immunogenic Integral Membrane Proteins of Borrelia burqdorferi Are Lipoproteins. Infection and Immunitv 58:

ΊΑ 487

MIS:jc 6102-98

983-991.

8. Fikrig, E., S.W. Barthold, F.S. Kantor, e R.A. Flavell (1992). Long-term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA”. Infect. and Immun. 60: 773-777.

9. Fikrig, E., S.W. Barthold, F.S. Kantor, e R.A. Flavell (1991). Protection of mice from Lyme borreliosis by oral vaccination with Escherichia coli expressing OspA. J. Infect. Pis. 164: 1224-1227.

10. Johnsson, Μ., L. Noppa, A.G. Barbour, e S. Bergstram (1992). Heteroantigenicidade of Outer Membrane Proteins in Borrelia burgdorferi: Comparison of osp operons of three isolates of different geographic origins. Infect. Immun. 60: 1845-1853.

487

MIS:jc 6102-98

28IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

1 1 1 \|SEQ ID NO.\| DESCRICÃO DA SEQUÊNCIA \| 1 1 L	I FIGURA \| 1
1 1 1 1 1	1 Γ \|Cadeia de codificação para a região N- \| \|terminal de osdA da estirpe B31, ACA1 e\| \|Ip90 \| 1 1	1/	5 \| 1 1
1 1 2 1 I	1 1 [Cadeia de codificação para a região C- \| [terminal de osdA da estiroe B31 \| I 1	1,	1 5 1 1 I
1 1 3	1 1 \|Oligonucleótido iniciador PET-IN [CO1]\| 1 1	1	1 1 \|
1 1 ⁴ 1 1	1 1 \|Oligonucleótido iniciador PET-273C \| \|[C03], \| I I	1/	1 5 1 1 I
1 1 ⁵ 1 I	1 1 [Cadeia de codificação para a região C- \| [terminal de osdA da estiroe ACA1 \| 1 1	1,	1 ⁵ 1 1 I
1 1 θ 1 I	1 1 [Cadeia de codificação para a região C- \| \|terminal de osdA da estiroe Io90 \| I 1	1/	1 5 \| 1 I
1 1 7 \|	1 1 [Oligonucleótido iniciador OspN2 \| 1 I	1	1 1 I
1 1 θ \|	1 1 [Oligonucleótido iniciador BZ1 \| I I	I,	1 5 1
1 1 9	1 1 \|Oligonucleótido iniciador PK4 \| I I	1/	1 5 1
1 \| ίο I	1 1 [Oligonucleótido iniciador PK3 \| I I	5	1 1 I
1 1 11	1 1 [Oligonucleótido iniciador pET-18N \|	——	1 1

487

MIS:jc 6102-98

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 1:

ATATATTATG AAAAAATATT TATTGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 2:

GAGGAATAAA ATTTCGCAAA AATTAAA (3) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

ΊΑ 487

MIS:jc 6102-98 (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 3:

-30GCACATATGA AAAAATATTT ATTGGG (4) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 4:

CGGGGATCCC TCCTTATTTT AAAGCG (5) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 5:

GAGGAATAAA TAAAGTTTCG ÇAAAAATTCA A (6) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla

487

MIS:jc 6102-98 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 6:

GAGGGATAAA ATTTCGTAGA AATTCAA (7) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 7:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 7:

GGCCGCACAT ATGAAAAAAT ATTTATTGGG (8) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 8:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 8:.

CGGGGATCCC CTTATTTATT TCAAAGCG (9) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 9:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

487

MIS:jc 6102-98 s>

(B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 9:

CGGGGATCCC TATTTTAAAG CATC (10) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 10:

CGGCCATGGA AAAATATTTA TTGGG (11) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO. 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 11:

CAGCATATGG CTAAGÇAAAA TGTTAGC

487

MIS:jc 6102-98

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Proteína pura imunologicamente eficaz, caracterizada por ser codificada por um gene de lipoproteína de Borreiia do tipo selvagem, de comprimento total, e por ser formado recombinantemente a partir de um organismo hospedeiro transformado por um plasmídeo contendo o gene.
2 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser codificada pelo gene ospA de B. burqdorferi do tipo selvagem, de comprimento total.
3 - Proteína de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o referido plasmídeo ser o plasmídeo pOAl, pOA5, pOA6, pOA7, pOA8, pOA9 ou pOAlO.
4 - Proteína de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada por o referido gene ospA ser o isolado da família de estirpes B31, família de estirpes Ip90 ou família de estirpes ACA1 de B. burqdorferi.
5 - Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o referido organismo hospedeiro ser E. coli.
6 - Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o referido plasmídeo compreender o vector plasmídico pET9 no qual o gene é colocado sob o controlo de um promotor de T7 e sinais de iniciação da tradução eficazes do bacteriófago T7.
7 - Proteína de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido organismo hospedeiro ser uma estirpe de expressão de T7 de E. coli.
8 - Proteína de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido organismo hospedeiro ser a estirpe BL21 (DE3) (pLysS) ou HMS174 (DE3) (pLysS) de E. coli.

74 487

MIS:jc 6102-98
9 - Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o referido plasmídeo compreender o vector plasmídico pCMBl ou pCMB2 no qual o gene é colocado sob o controlo de um promotor TRC.
10 - Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por estar substancialmente isenta de proteína bacteriana e de lipopolissacárido.
11 - Processo de produção de uma proteína codificada por um gene de lipoproteína de Borrelia do tipo selvagem, de comprimento total, caracterizado por compreender os passos de:

(a) efectuar a indução de lipoproteína de Borrelia a partir de um organismo hospedeiro transformado por um plasmídeo contendo o referido gene, (b) lisar as células do referido organismo hospedeiro, (c) tratar as células lisadas com um surfactante que solubiliza selectivamente lipoproteína de Borrelia. preferencialmente a proteínas bacterianas e de outros tipos e que é capaz de efectuar a separação de fases de uma fase detergente sob condições suaves, (d) efectuar a separação de fases numa fase detergente contendo lipoproteína de Borrelia solubilizada, numa fase aquosa contendo proteínas bacterianas e outros tipos e numa fase sólida contendo resíduos celulares, (e) recuperar a referida fase detergente da referida fase sólida e da referida fase aquosa, e (f) purificar a referida fase detergente de modo que fique isenta de proteínas diferentes de lipoproteína de Borrelia.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a proteína ser proteína OspA codificada pelo gene ospA de B. burqdorferi.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o plasmídeo ser o plasmídeo pOAl, pOA5, pOA6, pOA7, pOA8, pOA9 OU pOAlO.

74 487

MIS:jc 6102-98
14 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por o referido surfactante ser Triton X-114.
15 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por o referido tratamento das referidas células lisadas ser efectuado a uma temperatura de cerca de 0° a cerca de 10°C, a mistura resultante ser aquecida a uma temperatura moderadamente elevada de cerca de 35° a cerca de 40°C para efectuar a separação da referida fase detergente, e a referida fase detergente ser separada da referida fase aquosa e da referida fase sólida, por centrifugação.
16 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado por a referida purificação da referida fase detergente ser efectuada por contacto da referida fase detergente com uma coluna cromatografica, sob condições que resultam na ligação de proteínas diferentes da lipoproteína de Borrelia à referida coluna e a recuperação do fluido de passagem da referida coluna contendo lipoproteína de Borrelia.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida coluna ser ainda feita contactar com um meio tampão que desloca líquido contendo lipoproteína de Borrelia da referida coluna, ao passo que as outars proteínas são retidas pela referida coluna, e ser recolhido o fluido de passagem do referido contacto adicional.
18 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado por a referida lise do organismo hospedeiro ser efectuada por congelação e descongelação do organismo hospedeiro.
19 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado por o referido organismo hospedeiro ser uma estirpe de E. coli que produz ARN de bacteriófago T7 capaz de dirigir a transcrição em alto nível a partir de um promotor de T7 e o referido vector plasmídico conter um gene Kan, como

74 487

MIS:jc 6102-98 seu marcador selectivo, e um promotor de T7.
20 - Vacina contra infecção por organismo Borrelia, caracterizada por compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
21 - Agente de imunodiagnóstico para a detecção de anticorpos contra infecção de um hospedeiro por um organismo Borrelia, caracterizado por compreender uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.