JP3135060B2 - ヘモフィルスインフルエンザｂ型菌の外皮膜タンパク質Ｐ２の部分断片を用いた接合体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ヘモフィルス
インフルエンザ（Heamophilus influenzae）ｂ型菌の外
皮膜タンパク質であるＰ２（outer membrane protein P
2）の末端断片およびその変異体を含む接合分子、およ
びそれを用いたヘモフィルス インフルエンザｂ型菌に
対するワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌が
引き起こす病気の主なものは、５才以下の児童の髄膜炎
である。この病気に対する防御抗体は上記のヘモフィル
ス インフルエンザｂ型菌の外皮膜の多糖類から誘導す
ることができ、精製したポリリボシルリビトール燐酸
（ＰＲＰ）を抗原に利用したワクチンが開発されてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このワクチンは成人と
２４月令以上の小児に対しては９０％の防御率を示す
が、２４月令以下の小児では効果がない。他の多糖類ワ
クチンと同じように、ＰＲＰはヘルパーＴ細胞の増殖を
誘導しないし、再免疫処置では追加応答も記憶細胞増加
もうまくゆかない。ＰＲＰジフテリア毒素コンジュゲー
トを使ったコンジュゲートワクチンが開発されているが
（ヨーロッパ特許第００９８５８１を参照のこと）、こ
れはＴ細胞依存性、追加免疫及びＰＲＰ特異的ＩｇＧ抗
体産生をきたす。しかしImmunisation Practices Advis
ory Committee とAmerican Academmyof Pediatrics の
どちらの勧告も、１８月令以上の小児の場合にはワクチ
ンを使用して免疫させるようにとのことだけであり、こ
れは幼若者にあってはワクチンの有効性が一定していな
かったからである。２月令から６月令ないしもっと後の
危険があるグループにおいて普遍的な防御を得るために
は、非外皮膜性抗原の採用が要求されるのであろう。

【０００４】また、病気に対して免疫を誘導する方法は
常に改良がなされており、現在ではより小さな、よりよ
く限定された材料を抗原とする動きにある。このような
材料は、或る種の天然の免疫原に基く副作用の発現の可
能性を最小にし、又除去し、かつ病気に対する防御を与
える免疫原性を維持しているものとされる。

【０００５】本発明の目的は、副作用の低減の可能性の
高く、ワクチンの成分として有効であり、より限定され
た断片からなるペプチドを担体と接合した接合体、およ
びそれを用いたヘモフィルス インフルエンザｂ型菌に
対するワクチンを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の接合分子は、合
成ペプチドと担体タンパク質とを有する接合分子であっ
て、前記合成ペプチドが、ヘモフィルス インフルエン
ザｂ型菌の１Ｈ株、２Ｌ株及び６Ｕ株の外皮膜タンパク
質Ｐ２のＮ末端部分（アミノ酸残基Ｎｏ．１〜１４）ま
たはＣ末端部分（アミノ酸残基Ｎｏ．３１４〜３４１）
に相当する以下に示すアミノ酸配列Ａ、Ｂ及びＣ： アミノ酸配列Ａ（１Ｈ株、２Ｌ株及び６Ｕ株由来、Ｎ末
端領域に相当、配列表の配列番号：４）： Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu Le
u Gly アミノ酸配列Ｂ（１Ｈ株及び２Ｌ株由来、Ｃ末端領域に
相当、配列番号：５）： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Ly
s Thr Glu Lys Glu LysSer Val Gly Val Gly Leu Arg V
al Tyr Phe アミノ酸配列Ｃ（６Ｕ株由来、Ｃ末端領域に相当、配列
番号：６）： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Val Ly
s Thr Glu Lys Glu LysSer Val Gly Val Gly Leu Arg V
al Tyr Phe 及び、これらアミノ酸配列の一部をそのエピトープとし
ての機能が損なわれない範囲内で変異させたアミノ酸配
列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有すること
を特徴とする。この接合分子と、薬学的に許容される担
体とを含有させてヘモフィルス インフルエンザｂ型菌
に対するワクチンを得ることができる。

【０００７】

【発明の実施の形態】ヘモフィルス インフルエンザｂ
型菌の外皮膜から単離され精製されたタンパク質にはＰ
２と命名されたものがあり、これはラットでヘモフィル
ス インフルエンザ菌によって引き起こされる病気に対
して防御的な抗体を誘導できるものであるが、このタン
パク質の構造は今日まで知られていない。

【０００８】発明者等はその精製タンパク質のＮ−末端
のエドマン分解を行なったところ、その配列からヘモフ
ィルス インフルエンザｂ型菌ゲノムライブラリーを選
びだすプローブのオリゴヌクレオチドを合成することが
できた。この手法で約１７００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグ
メントをクローニングすることができ、これには外皮膜
タンパク質Ｐ２遺伝子（以下、Ｐ２遺伝子と略記する）
の５’部分が含まれていた。残りのＰ２遺伝子部分を含
む重複したＰｖｕＩＩフラグメントを引続きクローニン
グした。

【０００９】その重複したフラグメントに対するＤＮＡ
のオープンリーディングフレームを翻訳することで、外
皮膜タンパク質Ｐ２（省略する場合は、Ｐ２と記載す
る）のアミノ酸配列が得られた。そして、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）において組換えタンパク質を発現させた。発
現したタンパク質は、ヘモフィルス インフルエンザｂ
型菌から分離したものと免疫学的に類似したものであ
り、その病気に対して防御的に使用できるだろうと予測
された。発明者等は、また、同じ遺伝子を他のヘモフィ
ルス インフルエンザｂ型菌からクローニングしこれら
の配列も決めた。これらの遺伝子は、塩基配列及びそれ
に基くアミノ酸配列において小規模の多形性を示す。従
って、本発明においては、本発明の接合分子に用いる断
片の元となるヘモフィルス インフルエンザｂ型菌の外
皮膜タンパク質Ｐ２をコードする遺伝子が開示されてお
り、それには、それ個有のもの、ないしは変異はあるが
それと実質的に相同の塩基配列が含まれる。この遺伝子
を用いることで、外皮膜タンパク質Ｐ２を得ることがで
きる。更に、本発明者らは、この遺伝子に幾多の突然変
異を起させて部分変更を行なったが、これよって、天然
の外皮膜タンパク質Ｐ２の免疫特性のすべて又はいくら
かを保持しているタンパク質同族体が与えられる。これ
ら突然変異のいくらかは一部削除によるもので、この一
部削除は、変異体は元のものより小さくなるが、依然と
して免疫原性を有するように行なわれる。このように、
ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌の天然外皮膜タン
パク質Ｐ２の免疫特性の少なくとも一部を持つタンパク
質又はペプチドが与えられ、これらは外皮膜タンパク質
Ｐ２に特有の塩基配列を有するか、又はそれと実質的に
相同の遺伝子変異物の断片であり、適当なベクターの中
での発現によって得ることができる。特に、その遺伝子
はヘモフィルス インフルエンザｂ型ゲノムとして染色
体に再構成されるものである。

【００１０】本発明の接合分子に用いられる免疫原は、
天然のヘモフィルス インフルエンザｂ型菌の外皮膜タ
ンパク質Ｐ２の免疫特性の少なくとも一部を持つペプチ
ドであり、先に挙げたアミノ酸配列またはその変異配列
からなるものである。このペプチドは、適当な発現系、
例えばＥ．ｃｏｌｉ、バチルス、ＢＣＧ、酵母、バキュ
ロビールス、アデノビールス又は哺乳動物の発現系から
の組換え外皮膜タンパク質Ｐ２フラグメントとして得る
ことができる。あるいは、これらペプチドは合成によっ
ても得ることができる。

【００１１】この外皮膜タンパク質Ｐ２のアミノ酸配列
に由来する免疫原性ペプチドはワクチンの構成の一部と
して利用できる。

【００１２】外皮膜タンパク質Ｐ２は防御性抗原能力を
持っているから、発明者等によって、まず、コンジュゲ
ートワクチンの一部として使用され、そこではコンジュ
ゲートのハプテン部分はヘモフィルス属菌のカプセル多
糖類部分であった。これによれば、コンジュゲートの担
体タンパク質にジフテリア毒素を用いる際に（ヨーロッ
パ特許第００９８５８１を参照）起る、ジフテリヤに対
する過免疫の可能性を避けることができて、病気に対し
て、特に小児において、良好な防御を保証する。更に加
えて、発明者等はワクチンにあって抗原として作用しう
る、本発明にかかる外皮膜タンパク質Ｐ２のＮ−及びＣ
−末端にそれぞれ対応するアミノ酸配列の２種類のペプ
チドを固相法で合成した。これらのペプチドはコンジュ
ゲートワクチンに使用できる。

【００１３】なお、ヘモフィルス インフルエンザｂ型
菌の培養物から天然外皮膜タンパク質Ｐ２を抽出精製す
る際には、尿素溶液中に培養物を溶解させる工程が採用
される。

【００１４】図１は、精製外皮膜タンパク質Ｐ２のＮ−
末端アミノ酸配列、逆転写による塩基配列、及びＰ２遺
伝子の単離に使ったオリゴヌクレオチドプローブを示し
ている。

【００１５】図２は、Ｐ２遺伝子の配列決定の為のシー
ケンシングストラテジーを示す。ＥｃｏＲＩ断片とＰｖ
ｕＩＩ断片はＭ１３に両方向にクローニングし、矢印で
示したようにＭ１３プライマーと２０−ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドプライマーでジデオキシ法でシーケンスし
た。Ｐ２遺伝子に対する領域はボックスで示した。オー
プンボックスは成熟タンパク質を示し、ソリッドボック
スはシグナルペプチドを示す。

【００１６】図３〜５は、Ｄｕｒｓｔ（ＯＭＰサブタイ
プ２Ｌ）、８３５８種（ＯＭＰサブタイプ６Ｕ）及びＭ
ｉｎｎＡ（ＯＭＰサブタイプ１Ｈ）よりのＰ２遺伝子の
全塩基及びそれに由来するアミノ酸の配列を示す。ＯＭ
Ｐサブタイプ３Ｌから単離したＰ２遺伝子は、Ｍｉｎｎ
Ａ Ｐ２遺伝子のものと同一であるから示していない。

【００１７】図６は、Ｐ２遺伝子の再構築を示す。１７
００ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片を含むＭ１３ファージは、翻
訳開始部位でのＮｄｅＩサイトをオリゴヌクレオチド指
定突然変異誘発に付した。このファージはｍＰ２Ａ１と
命名した。ｍＰ２Ａ１複製フォームを分離してＰ２遺伝
子のＮ−末端を含む約６００ｂｐのフラグメント（斜線
で示す）をｐＴ７−７にクローニングしてｐＲＳＭ４３
２を作った。Ｐ２遺伝子の３’−部分を含む−１Ｋｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（ソリッドバー）とおよそ
５００ｂｐの３’でその遺伝子に対するもの（オープン
バー）をｍＰ２Ｂの複製フォーム、ＰｖｕＩＩ断片を含
むＭ１３ファージから得てｐＲＳＭ４７８を作り出すた
めのｐＲＳＭ４３２にクローニングした。ベクターシー
ケンスは線で示した。Ｐ２遺伝子の位置と、Ｔ７φ１０
プロモーターからの転写の方向は矢印で示した。

【００１８】図７は、ＪＭ１０１（ｐＲＳＭ４７８）の
ウエスターンプロット解析を示す。第１列は分子量のマ
ーカーを含む。第２列はヘモフィルス インフルエンザ
ｂ型菌ＭｉｎｎＡの外皮膜タンパク質に富む界面活性剤
不溶フラクションを含む。第３から第５列は、次の菌株
の超音波破砕物を含みそれに抗−Ｐ２抗血清で発色させ
たものである。ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌Ｍ
ｉｎｎＡ（３列）、ＪＭ１０１（ｐＲＳＭ４７８）でイ
ンデュースしていないもの（４列）及びＪＭ１０１（ｐ
ＲＳＭ４７８）でｍＧＰ１−２でインデュースしたもの
（第５列）である。

【００１９】ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌Ｍｉ
ｎｎＡ株からの外皮膜タンパク質Ｐ２をコードする遺伝
子がゲノムライブラリーからクローニングされ、このヌ
クレオチド配列が決定された。Ｐ２遺伝子の全配列を含
み、重複部を有するＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩＩゲノム断
片が同定され、クローンが図１に示す配列を有する混合
オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼー
ションによりスクリーニングされた。Ｐ２遺伝子の配列
決定の際には、図２に示す切断部位を利用した。図３〜
５にＭｉｎｎＡ株からのＰ２遺伝子の完全なヌクレオチ
ド配列及び該ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸
配列を示す（配列番号：１）。この誘導されたアミノ酸
配列は化学的に同定されたタンパク質における配列と、
すなわちＮ末端配列及びトリプトシンとしての作用を有
する内圧ペプチドの配列において同一であった。このＰ
２遺伝子から誘導されたＰ２のアミノ酸組成（理論値）
は、実際の化学分析値と、測定誤差範囲内の違いはある
が、一致した。４つのクローンが更に他の単離物から、
ＰｖｕＩＩフラグメントとしてあるいはＰ２遺伝子のＰ
ＣＲ（polymerase chain reaction）増幅によって単離
された。その際、遺伝子及び誘導アミノ酸配列は高率で
保存されていることが見い出された。これらのヌクレオ
チド遺伝子及びその誘導配列は、対応するＭｉｎｎＡ株
の配列と比較された（図３〜５；配列番号：１〜３）。

【００２０】Ｐ２遺伝子の再構築は、隣接する５’側を
構成するフラグメントと３’側を構成するフラグメント
の再結合により行なわれた。その一例が後述の実施例２
に示されている。この実施例では、Ｐ２遺伝子の５’側
を構成するフラグメントの翻訳開始部位に、部位指定突
然変異（site directed mutagenisis）によりＮｄｅＩ
切断部位を形成し、形成されたＮｄｅＩ切断部位を利用
して、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを発現ベクタ
ープラスミドｐＴ７−７にクローニングし、更にＰ２遺
伝子の３’側部分及びその下流部の配列を含むＥｃｏＲ
Ｉ−ＰｓｔＩフラグメントをクローニングされた前記Ｎ
ｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントのすぐ下流にクローニ
ングすることにより全Ｐ２遺伝子の再構築が行なわれた
（図６）。この構築は、ａ）Ｐ２遺伝子の翻訳開始部位
までの５’側の配列を除去し、ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ中での
Ｐ２遺伝子の非調節発現は致命的であるので、Ｐ２遺伝
子を調節プロモーターのコントロール下に置くことによ
り行なわれた。ＭｉｎｎＡ株からのＰ２遺伝子がＥ．ｃ
ｏｌｉで発現され、対応する大きさの遺伝子産物が生産
された。この遺伝子産物は、ヘモフィルスから精製され
た外皮膜タンパク質Ｐ２に対して調製されたうさぎ抗血
清により確認された。

【００２１】Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＰ２発現の毒性を減少
させるための一方法として、リーダーペプチドをコード
する配列を除去し、融合タンパク質あるいはメチオニン
により始まる成熟タンパク質としてＰ２を発現させるこ
とが行なわれた。また、他の方法として、該遺伝子の断
片あるいは頭部（尾部）を欠失させた遺伝子（truncate
d genes）をそれぞれ単独であるいは融合タンパク質の
一部として発現させることができる。後述の実施例３
は、そのような融合タンパク質（２種）の形成を示す。
一つは、Ｎ末端アミノ酸としてのアラニンが欠失した成
熟外皮膜タンパク質Ｐ２をコードする配列を含む。２番
目のものは、単一のＥｃｏＲＩ切断部位までのＰ２遺伝
子の３’側部分をコードする配列を含む。これらの配列
の両方がベクターｐＴ７−７に挿入され、転写開始部
位、翻訳開始コドン及びｐＴ７−７中にあるバクテリオ
ファージＴ７タンパク質１０遺伝子のマルチクローニン
グ領域からのＤＮＡ配列によりコードされる種々のアミ
ノ酸を有することになる。 これら組換え融合タンパク
質の半精製品に対して調製された抗血清は、ヘモフィル
ス インフルエンザ中に生産された外皮膜タンパク質Ｐ
２と反応し、このことにより、これら融合タンパク質及
び組換えＰ２フラグメントは、天然のＰ２を認識する抗
体を誘導できることが示された。

【００２２】Ｐ２遺伝子あるいはその断片は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で他の調節プロモーターのコントロール下でも好
適に発現させることができる。また、リーダーペプチド
なしでも発現させることができる。更に、その毒性が問
題とならないところで、他のクローニング系で発現させ
ることができる。該遺伝子及びその断片は、適当なプラ
イマーを用いたＰＣＲにより（後述の実施例１参照）合
成することができ、また、その毒性を避けることができ
る場合には、Ｅ．ｃｏｌｉあるいは他の適当な宿主中
に、適当なクローニングベクターやバクテリオファージ
ベクターを用いて直接クローニングすることもできる。
好適な発現系としては、グラム陽性細菌、牛痘、ウイル
ス、アデノウイルス、バクロウイルス（baculoviru
s）、酵母、カビ、ＢＣＧあるいは哺乳類を用いた発現
系を挙げることができる。

【００２３】調節された酸加水分解で調製したヘモフィ
ルスオリゴ糖（ヘモフィルスのポリリボシルリビトール
燐酸：ＨＰＲＰ：Haemophilus oligosaccharides）が、
臭化シアン反応を利用して、精製された外皮膜タンパク
質Ｐ２と接合された。この接合に用いられたＰＲＰの平
均分子量は、約２０，０００ダルトンと同定された。ま
た、この接合にはリンカーは使用されなかった。過剰の
ハプテンを得るために、ＰＲＰとタンパク質の比（ＰＲ
Ｐ）／（タンパク質）として、約７のものが用いられ
た。反応後の生産物の分析では、（ＰＲＰ）／（タンパ
ク質）は約０．１であった。この接合体のうさぎでの免
疫原性が試験され、第１次及び第２次抗ＰＲＰ免疫応答
が観察された。結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】 *実験の詳細は上記説明部分の記載及び参考例１を参照。^** PRP-SpecificELISA法による。

【００２５】なお、poPRP-M-CRMは破傷風トキソイドとP
RPのコンジュゲートを、HPRP-P2はP2とPRPのコンジュゲ
ートを、HPRP-DはジフテリアトキソイドとPRPのコンジ
ュゲートをそれぞれ表わす。また、ポスト１は免疫後２
週間経過時における値を、ポスト２は４週経過時におけ
る値を、ポスト３は６週経過時における値をそれぞれ示
す。

【００２６】更に、イムノプロッティングによる分析に
おいて、うさぎの抗−ＰＲＰ−Ｐ２抗血清は、Ｐ２に対
して強い反応性を示した。このデータは、ジフテリアや
破傷風のトキソイドが接合タンパク質（conjugation pr
otein）の構成成分として使用される際におけるジフテ
リアや破傷風に対する過免疫の可能性の問題を避けるた
めに、コンジゲートワクチン（conjugate vaccine）の
担体タンパク質としてＰ２が利用できることを示してい
る。更に、外皮膜タンパク質Ｐ２に対する抗体によって
付与される同型防御の結果として、ワクチンとしてのＰ
ＲＰ−Ｐ２は、特に乳児や幼児におけるヘモフィルス
インフルエンザｂ型菌感染に対するより確実な防御を保
証し得る。

【００２７】Ｐ２のポリン活性（Porin activity）及び
Ｐ２に対する抗体のラットを用いた菌血症モデルでの防
御性から、本発明者らはＰ２の防御エピトープの確認、
及びＰ２をベースとしたヘモフィルス インフルエンザ
ｂ型菌に対するワクチンに組み入れるべきＰ２の機能領
域の位置及び特性の分析を行なうためのプローブの作成
を行なうことを決定した。Ｎ−及びＣ−両末端は、外皮
膜タンパク質Ｐ２のアミノ酸配列のキーテ−ドーリトル
プロット（Kyte-Doolittle plot）において親水性であ
ると予想されたので、この両末端が先ず研究の対象とさ
れた。Ｃ末端及びＮ末端のそれぞれにシステインが付加
されたポリン−Ｉ（porin−Ｉ，アミノ酸残基Ｎｏ．１
〜１４）及びＣ−ＨＩＢＰ２（アミノ酸残基Ｎｏ．３１
４〜３４１）ポリペプチドが化学的に合成された。ペプ
チドの一方の末端にユニークなシステインを有すること
は、特異的な方向での担体タンパク質とのカップリング
を可能とする。２機能性クロスリンカー（cross-linke
r）であるスルホ−ＳＩＡＢ（Sulfo-SIAB）が、担体タ
ンパク質とシステイン含有ペプチドとのカップリングの
ための試薬として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハ
イドロキシサクシンイミド エステル（ＭＢＳ：m-male
imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）よりも良
好であることが判明した。

【００２８】はつかねずみ及びモルモットにおいて天然
Ｐ２に対して生じた抗血清との両合成ペプチド、すなわ
ちポリン−Ｉ及びＣ−ＨＩＢＰ２の反応性がペプチド特
異的ＥＬＩＳＡ法により評価された。全ての抗Ｐ２抗血
清がＣ−ＨＩＢＰ２ペプチドを良く認識したが、ポリン
−Ｉとは反応しなかった。このデータは、Ｐ２の主要な
免疫優性Ｂ細胞エピトープはＣ末端領域（残基Ｎｏ．３
１４〜３４１）中にあることを示している。

【００２９】合成された上記のペプチドが、ワクチンと
して利用できるかどうかを決定するために、ペプチド−
ＫＬＨコンジュゲートの免疫原性が個々に評価された。
うさぎが免疫され、抗ペプチド抗血清がＥＬＩＳＡ、二
重免疫拡散法及びイムノプロッティング法により評価さ
れた。うさぎ抗血清は、免疫に用いたペプチドに対する
単一特異性をＥＬＩＳＡにおいて示した。ポリン−Ｉに
特異的な抗体及びＣ−ＨＩＢＰ２に特異的な抗体のいず
れも全てのアッセイにおいてＰ２を認識した。この結果
は、両者の末端領域が露出しており、かつ抗体との相互
作用がないことを示している。両者のペプタイドにおけ
るＫＬＨとのコンジュゲート体は、いずれも強い抗体応
答をうさぎにおいて誘発させたので、これらがワクチン
の調製において抗原として作用できることは明らかであ
る。

【００３０】本発明の中において明白に述べられていな
いが、分子生物学、タンパク質生物化学、ハイブリドー
マテクノロジーの方法を用いる。また、ここに示す実施
例は科学文献に十分に報告されているものであり、それ
らの技術分野の熟練した能力の範囲内で十分である。

【００３１】実施例１ 本実施例は、Ｐ２遺伝子のクローニングとその配列決定
を説明するものである。

【００３２】染色体ＤＮＡをヘモフィルス インフルエ
ンザｂ型菌から通常の方法にて分離し、ＥｃｏＲＩ、Ｐ
ｖｕＩＩまたはＰｓｔＩ、あるいはＰｓｔＩとＰｖｕＩ
Ｉの混合物とを用いて完全消化した。消化したＤＮＡ
２μｇを０．７％のアガロースのそれぞれのレーンに付
し、操作指示に従ってハイボンド−Ｎメンブラン（Hybo
nd-N membranes）に電気泳動し転写した。Ｎ−末端の配
列決定のデーターと［α−³²Ｐ］ＡＴＰでラベルした末
端（end）をもとにして合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを合成した。約１７００ｂｐの単一ＥｃｏＲＩフラグ
メント、約１６００ｂｐの単一ＰｖｕIIフラグメントお
よび約１０，０００ｂｐの単一ＰｓｔＩフラグメントが
このプローブにハイブリダイズした。

【００３３】染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１０
００〜２０００ｂｐのフラグメントを分離し、ベクター
λｇｔ１１にクローン化した。Ｅ．ｃｏｌｉは組み替え
λｇｔ１１にクローンに感染され、プラークをハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングした。約１７０
０ｂｐのＥｃｏＲＩのフラグメントをバクテリオファー
ジＭ１３ベクターに移し、部分的に配列決定した。混合
したオリゴヌクレオチドプローブをプライマーとして使
用することによって、デオキシ配列決定法を実施した。
付加されたプライマーを利用してＰ２遺伝子の５’末端
の配列が図２に説明された手法により決定された。ま
た、単一ＰｖｕＩＩ切断部位がリーダーペプチドに対し
てコードされているＤＮＡ配列が３’末端付近に同定さ
れた。

【００３４】上述のように、Ｐ２遺伝子に含まれている
遺伝子ＰｖｕＩＩのフラグメントは約１６００ｂｐのサ
イズである。ＰｖｕIIのフラグメントの部分的ライブラ
リーはＭ１３に生成され、図２に示される手法により配
列決定された。

【００３５】他のヘモフィルス インフルエンザｂ型菌
からのＰ２遺伝子は、ＰｖｕＩＩ断片としてクローン化
されるか、またはポリメラーゼによるチェーンリアクシ
ョン（ＰＣＲ）による遺伝子ＤＮＡの増幅のあとにクロ
ーン化される。

【００３６】増幅に使用されたオリゴヌクレオチドは以
下のとおりである。

【００３７】5'CTTGGATCCTTAATCGTTGGTGCATTCGCAGC および 5'GCAAAGCTTGCGAATCTTTCGATTCGCCT これらのオリゴヌクレオチドは5'末端に独自の切断部位
を含んでおり、遺伝子のＰＣＲによる増幅の後でのクロ
ーニングを容易にする。クローン化されたＰｖｕＩＩ遺
伝子フラグメント、または増幅後のクローン化された遺
伝子の配列決定が十分行なわれた。 実施例２ 本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰ２遺伝子の再構築と発現
について説明するものである。構築するＰ２遺伝子に対
してその５’末端を除去してから、ベクターｐＴ７−７
中において調節バクテリオファージＴ７プロモーターか
ら下流にこれを再構築した。Ｐ２遺伝子の翻訳開始部位
でＮｄｅＩ部位を形成するために、約１７００ｂｐ Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを含むクローンに部位指定の突然
変異をおこなった。ＥｃｏＲＩフラグメントに対するＮ
ｄｅＩは、ｐＴ７−７に再結合したＭ１３の複写型から
サブクローン化された。その遺伝子のリマインダーとし
てＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントが加えられた。そ
れを図６に示した。その構築物をＥ．ｃｏｌｉのＪＭ１
０１株にトランスフォームした。類似のサイズの複製
（recombinant）Ｐ２（ｒＰ２）が、抗−天然Ｐ２抗血
清を用いてウエスタンプロット法によって測定したと
き、本株の抽出物のなかから検出された（図７）。バク
テリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をｌａｃ
プロモーター／オペレーターのコントロール条件のもと
に、イソプロピルチオガラクトシドの存在下において発
現するバクテリオファージによる本菌株の感染がｒＰ２
合成のレベルを増加させた。 実施例３ 本実施例は、Ｐ２エピトープを示す融合タンパク質を生
じる遺伝子の構築を示したものである。

【００３８】成熟した外皮膜タンパク質Ｐ２をコードす
るＤＮＡ配列のほとんどを含むＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩフ
ラグメントと、Ｐ２遺伝子の３’部位のコード領域を含
むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントが、ｐＴ７−７ベ
クターの中でクローン化され、それはＳｍａＩとＰｓｔ
Ｉ又はＥｃｏＲＩとＰｓｔＩでそれぞれ切断された。バ
クテリオファージＴ７遺伝子１０を用いたフレームフュ
ージョンにおいて、タンパク質がそれらのクローンの中
に生成された。ファージＤＥ３に対して溶菌的である
Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＬ２１株の誘導株にその構成物を挿入
した。ＤＥ３はラクトースプロモーター／オペレーター
のコントロール下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を
含んでいる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはイソプロピルチ
オガラクトシドの添加によって誘発された。その融合タ
ンパク質遺伝子の転写と翻訳が行われた。融合タンパク
質は不溶性の包括体に蓄積され、ソニケーションによる
溶菌の後で２Ｍのシュークロース上でペレット化させる
ことによって部分的に精製された。精製した融合タンパ
ク質でネズミが部分的な免疫状態になった。これらの抗
血清はヘモフィルス インフルエンザによって生産され
たＰ２と認められた。 実施例４ 本実施例は、ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌の培
養液から外皮膜タンパク質Ｐ２を精製する方法について
示している。

【００３９】純粋の外皮膜タンパク質Ｐ２がＥａｇｅｎ
株の培養液のセタブロン（Cetavlon）沈澱物から精製さ
れた。培養ペーストを４Ｍ尿素を含むＰＢＳバッファー
を用いてポリトロン中で９０秒間ホモゲナイズし、その
サスペンションを室温で９０分間攪拌した。８，０００
ｇで３０分間遠心分離することによって透明な上清が得
られ、それをＰＢＳで透析することによって尿素を除去
した。透析の間に沈澱が形成され、それを８，０００
ｇ、３０分間の遠心分離により収集した。収集した沈澱
物を２％のオクチルグルコシド ０．２％のソディウム
デオキシコレートを含む１００ｍＭのトリスバッファ
ー、ｐＨ８に懸濁した。この段階で、ＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動分析（ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析）によれ
ば、Ｐ２の調製は９５％の精製が達成されていた。 参考例１ 本実施例は、オリゴサッカライドとＰ２接合体の調製に
ついて示す。

【００４０】ヘモフィルス インフルエンザ ｂ型菌か
らの精製ポリサッカライド（ＰＲＰ）はｐＨ３．２の
０．１Ｍクエン酸ナトリウム中でセファクリルＳ−２０
０カラムにおけるゲル濾過によって測定される分子量サ
イズ１５〜４０，０００ダルトンの範囲になるように十
分な時間をかけて８０〜９０℃まで加熱された。ＰＲＰ
の反応液を０．８５％塩化ナトリウムｐＨ８．５と６．
７％トリエチルアミンハイドロクライド中に２５ｍｇ／
ｍｌになるように希釈した。アイスバス中で攪拌しなが
ら、シアノーゲンブロミド（ＢｒＣＮ）の濃縮液（１ｇ
ＢｒＣＮ／１ｍｌアセトン）全量の１／１０の量を１分
毎に間隔をあけて５回加えた。添加の間、ｐＨは１．０
Ｎ ＮａＯＨで８．０〜９．０に保った。最終添加の後
２分間、その反応混合物のｐＨを１．０Ｎの塩酸で６．
０まで下げた。活性化されたポリサッカライドは低分子
量の反応物を除去するため、４℃で０．８５％塩化ナト
リウムに対して完全濾過することによって精製した。Ｐ
ＲＰ濃度は２５ｍｇ／ｍｌで維持した。

【００４１】精製した外皮膜タンパク質Ｐ２は４℃で限
外濾過によって約３．５ｍｇまで濃縮した。その後、
１．０％オクチルグルコシドを含む０．８５％塩化ナト
リウムに対して４℃で完全濾過し、トリスとデオキシコ
レートを除去した。完全濾過し、精製した外皮膜タンパ
ク質Ｐ２と完全濾過し、活性化したＰＲＰを等量容器中
で混合しシールした。ｐＨを８．５に調整し、その反応
混合液を４℃で１５〜１８時間振盪した。この時点で
は、未反応のタンパク質またはＰＲＰからその接合体を
精製するための試みは行われていない。混合物中のポリ
サッカライドとタンパク質の接合体は常法によって測定
された。 実施例５ 本実施例は、ペプチドの合成とペプチド担体の調製を示
している。

【００４２】Ｐ２のＮ−とＣ−末端ＤＮＡ配列に対応す
るペプチドは個々にコマーシャルペプチド合成機中で合
成され、続いて酢酸を用いて樹脂から分離した。そして
ＶｙｄａｃＣ４カラムにおいて０．１％トリフルオロ酢
酸中のアセトニトリルの濃度勾配（０〜４０％）を用い
て分離層ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドタンパク
質１はＮ末端配列（アミノ酸残基１〜１４）と添加した
システインを含んでいる。その配列は、Ala-Val-Val-Ty
r-Asn-Asn-Glu-Gly-Thr-Asn-Val-Glu-Gly-Cysである。
ペプチドＣ−ＨＩＢ Ｐ２はＣ末端配列（アミノ酸基３
１４〜３４１）と添加したシステインを含んでいる。そ
のシーケンスは、Cys-Ala-Arg-Thr-Arg-Thr-Thr-Glu-Th
r-Gly-Lys-Gly-Val-Thr-Glu-Lys-Ser-Val-Gly-Val-Gly-
Leu-Arg-Tyr-Pheである。免疫学的研究に対して用いら
れているすべての合成ペプチドはＨＰＬＣ分析による判
定で９５％以上の精製度であった。ペプチドの加水分解
によるアミノ酸分析は理論的組成と良く一致した。

【００４３】個々のペプチドとＫＬＨ（Keyhole limpet
haemocyanin）またはＢＳＡ（bovin serum albumin）
との複合は、担体タンパク質に対してペプチドの分子量
比が１０：１の条件で以下の装飾法を用いて常法（Liu
et al., Biochemistry, 18,690, (1979)）に従って行っ
た。担体タンパク質はまずスルフォスクシニル（４−ヨ
ウドアセチル）−アミノベンゾエート（Sulfo-SIAB）で
修飾された。その修飾されたタンパク質はさらにゲル濾
過ＨＰＬＣによって精製された。ペプチドは引き続いて
４〜６時間かけて担体タンパク質と修飾され、ペプチド
−担体タンパク質複合体がゲル濾過によって分離され
た。 実施例６ 本例は、プロトコルを動物に免疫性を与えるために使用
し、抗血清を調整することについて示している。まず、
外皮膜タンパク質Ｐ２に特異的な抗血清と、ペプチドに
特異的な抗血清を以下のように調製した。すなわち、ウ
サギ、モルモット、マウスのそれぞれに、フロインド完
全アジュバンドにエマルジョンさせたＰ２、ＰＲＰ−Ｐ
２及びこれらのＫＬＨ接合体のそれぞれを個々に筋肉注
射し免疫した。ＰＢＳバッファー５００μｌ中に２０〜
５００μｇ含まれる物質が注射された。最初の注射から
２週間毎にそれぞれの動物から採血した。血清を遠心分
離によって凝固血から分離し、３０分間５６℃の加熱に
よって不活性化し、その後−２０℃で保存した。 実施例７ 本例ではＥＬＩＳＡにおけるＰ２に対して特異的な調製
物を調製した。まず、Ｐ２またはペプチド（各５μｇ／
ウエル）を、１６時間、４℃でインキュベーションする
ことによってマイクロタイタープレートの各ウエルに直
接コートした。各ウエルは３％のウシ血清アルブミンを
含むＰＢＳで３０分間の処理によりブロックされた。次
に、先に調製したＰ２に特異的な抗血清及び各ペプチド
に特異的な抗血清のそれぞれの所定の希釈濃度シリーズ
をウエルに加えた。室温において２時間プレートがイン
キュベートされた。過剰の抗体は洗浄用のバッファー
（０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し除
去した。市販のタンパク質Ａ−ペルオキシダーゼ複合体
が各ウエルに添加され、プレートはさらに１時間室温に
てインキュベートされた。過剰のタンパク質 Ａ−ペル
オキシダーゼを除去した後、プレートを洗浄用バッファ
ーで洗い、０．２ｍｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）を各ウエルに添加した。プレートを色が変化し終わ
るまで暗所にてインキュベートした。反応を１Ｎ硫酸５
０μｌ添加によって停止し、各ウエルをエリザ（ELIS
A）リーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。 実施例８ 本例は、抗−Ｐ２抗血清を特徴化するイムノプロティン
グ法の実施について示す。まず、天然のタンパク質Ｐ
２、レコンビナントＰ２、合成ＫＬＨ−ペプチド接合体
及びＰＲＰ−Ｐ２接合体に対するウサギから調製した抗
体は、イムノプロッティング法を用いてその特性を試験
した。文献に記載されている方法によって（Towbin et
al. Proc. Nat. Acid. Sci., 76,4350 (1979)）、精製
したネガティブなＰ２とリコンビナントＰ２を電気泳動
にかけ、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロ
ース膜に電気移動した。ニトロセルロース膜はネイティ
ブなＰ２、レコンビナントＰ２、合成ＫＬＨ−ペプチド
接合体、またはＰＲＰ−Ｐ２接合体に対して作用のある
様々なウサギ抗体の適正な希釈物で２〜４時間インキュ
ベートした。抗血清は、洗浄バッファー（０．１％トリ
トンＸ−１００を含むリン酸バッファー塩）にて５００
倍に希釈した。過剰の抗体が洗浄バッファーで３〜５回
洗浄することによって除去された。ゴート抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体が市販のアルカリ−フォスファターゼに接合さ
れ、第２の抗体として使用される。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、ヘモフィルス インフ
ルエンザｂ型菌に対するワクチンの有効成分として有用
な接合分子が提供できる。

【００４５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１１４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌 株名：１Ｈ 配列の特徴：外皮膜タンパク質Ｐ２をコードするＤＮＡ 配列： ATG AAA AAA ACA CTT GCA GCA TTA ATC GTT GGT GCA TTC GCA GCT TCA 48 Met Lys Lys Thr Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala Phe Ala Ala Ser -20 -15 -10 -5 GCA GCA AAC GCA GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA GAA 96 Ala Ala Asn Ala Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu 1 5 10 TTA GGT GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT AGC ACT GTA 144 Leu Gly Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gln Ser Asn Ser Thr Val 15 20 25 GAT AAT CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CGT 192 Asp Asn Gln Lys Gln Gln His Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Ser Arg 30 35 40 TTC CAC ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA CAA 240 Phe His Ile Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gln 45 50 55 60 GGT TAT TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA 288 Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser 65 70 75 GAT AAC TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA 336 Asp Asn Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly 80 85 90 AAT AAA GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT 384 Asn Lys Ala Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala 95 100 105 GAT GGC ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC AAT 432 Asp Gly Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn 110 115 120 AGT GAC TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACC GTT GGC TAT ACT TTT AAA 480 Ser Asp Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val Gly Tyr Thr Phe Lys 125 130 135 140 GGT ATT GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA AAG 528 Gly Ile Asp Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gln Lys 145 150 155 CGT GAG GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAT AAG GCT GGT 576 Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro Asn Asp Lys Ala Gly 160 165 170 GAA GTA CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA AAA 624 Glu Val Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gln Val Gly Ala Lys 175 180 185 TAT GAT GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT AAC 672 Tyr Asp Ala Asn Asp Ile Val Ala Lys Ile Ala Tyr Gly Arg Thr Asn 190 195 200 TAC AAA TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT GTA 720 Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gln Gln Leu Asn Gly Val 205 210 215 220 TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT 768 Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser 225 230 235 CTA GAT AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC GAA 816 Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His Glu 240 245 250 AAA CGC TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA GAT 864 Lys Arg Tyr Phe Val Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Met Glu Asp 255 260 265 ACT AAT GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT CAA 912 Thr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp Gln 270 275 280 GGT GAA AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT AAA 960 Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gln Ala Val Leu Phe Gly Val Asp His Lys 285 290 295 300 CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA ACT 1008 Leu His Lys Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr Ala Arg Thr 305 310 315 AGA ACA ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA TCA 1056 Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser 320 325 330 GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAA TCA TTT GTT AGA AAT ACA 1104 Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 335 340 TTA TTA AAA GCA AGG CGA ATC GAA AGA TTC GCT TTT 1140 配列番号：２ 配列の長さ：１１４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌 株名：２Ｌ 配列の特徴：外皮膜タンパク質Ｐ２をコードするＤＮＡ 配列： ATG AAA AAA ACA CTT GCA GCA TTA ATC GTT GGT GCA TTC GCA GCT TCA 48 Met Lys Lys Thr Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala Phe Ala Ala Ser -20 -15 -10 -5 GCA GCA AAC GCA GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA GAA 96 Ala Ala Asn Ala Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu 1 5 10 TTA GGT GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT AGC ACT GTA 144 Leu Gly Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gln Ser Asn Ser Thr Val 15 20 25 GAT AAT CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CGT 192 Asp Asn Gln Lys Gln Gln His Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Ser Arg 30 35 40 TTC CAC ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA CAA 240 Phe His Ile Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gln 45 50 55 60 GGT TAT TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA 288 Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser 65 70 75 GAT AAC TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA 336 Asp Asn Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly 80 85 90 AAT AAA GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT 384 Asn Lys Ala Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala 95 100 105 GAT GGC ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC AAT 432 Asp Gly Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn 110 115 120 AGT GAC TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACC GTT GGC TAT ACT TTT AAA 480 Ser Asp Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val Gly Tyr Thr Phe Lys 125 130 135 140 GGT ATT GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA AAG 528 Gly Ile Asp Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gln Lys 145 150 155 CGT GAG GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CAG CCT AAT GAT AAG GCT GGT 576 Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu Asn Lys Gln Pro Asn Asp Lys Ala Gly 160 165 170 GAA GTA CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA AAA 624 Glu Val Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gln Val Gly Ala Lys 175 180 185 TAT GAT GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT AAC 672 Tyr Asp Ala Asn Asp Ile Val Ala Lys Ile Ala Tyr Gly Arg Thr Asn 190 195 200 TAC AAA TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT GTA 720 Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gln Gln Leu Asn Gly Val 205 210 215 220 TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT 768 Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser 225 230 235 CTA GAT AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC GAA 816 Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His Glu 240 245 250 AAA CGC TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA GAT 864 Lys Arg Tyr Phe Val Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Met Glu Asp 255 260 265 ACT AAT GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT CAA 912 Thr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp Gln 270 275 280 GGT GAA AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT AAA 960 Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gln Ala Val Leu Phe Gly Val Asp His Lys 285 290 295 300 CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA ACT 1008 Leu His Lys Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr Ala Arg Thr 305 310 315 AGA ACA ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA TCA 1056 Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser 320 325 330 GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAA TCA TTT GTT AGA AAT ACA 1104 Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 335 340 TTA TTA AAA GCA AGG CGA ATC GAA AGA TTC GCT TTT 1140 配列番号：３ 配列の長さ：１１４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヘモフィルス インフルエンザｂ型菌 株名：６Ｕ 配列の特徴：外皮膜タンパク質Ｐ２をコードするＤＮＡ 配列： ATG AAA AAA ACA CTT GCA GCA TTA ATC GTT GGT GCA TTC GCA GCT TCA 48 Met Lys Lys Thr Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala Phe Ala Ala Ser -20 -15 -10 -5 GCA GCA AAC GCA GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA GAA 96 Ala Ala Asn Ala Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu 1 5 10 TTA GGT GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT AGC ACT GTA 144 Leu Gly Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gln Ser Asn Ser Thr Val 15 20 25 GAT AAT CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CGT 192 Asp Asn Gln Lys Gln Gln His Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Ser Arg 30 35 40 TTC CAC ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA CAA 240 Phe His Ile Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gln 45 50 55 60 GGT TAT TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA 288 Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser 65 70 75 GAT AAC TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA 336 Asp Asn Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly 80 85 90 AAT AAA GCA TTG GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT 384 Asn Lys Ala Leu Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala 95 100 105 GAT GGC ATA ACA AGC GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC AAT 432 Asp Gly Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn 110 115 120 AGT GAC TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACC GTT GGC TAT ACT TTT AAA 480 Ser Asp Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val Gly Tyr Thr Phe Lys 125 130 135 140 GGT ATT GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA AAG 528 Gly Ile Asp Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gln Lys 145 150 155 CGT GAG GGT GCA AAA ATG GCA AAT AAG CTG CCT AAT AAT AAG GCT GGT 576 Arg Glu Gly Ala Lys Met Ala Asn Lys Leu Pro Asn Asn Lys Ala Gly 160 165 170 GAA GTA CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA AAA 624 Glu Val Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gln Val Gly Ala Lys 175 180 185 TAT GAT GCA AAC AAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT AAC 672 Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Val Ala Lys Ile Ala Tyr Gly Arg Thr Asn 190 195 200 TAC AAA TAT AAC GAA GCT GAC GAG CAT ACA CAG CAA TTA AAT GGT GTA 720 Tyr Lys Tyr Asn Glu Ala Asp Glu His Thr Gln Gln Leu Asn Gly Val 205 210 215 220 TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT 768 Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser 225 230 235 CTA GAT AGT GGC TAT GCA AAA GCT AAA AAC TAT AAA GTT AAA CAC GAA 816 Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Val Lys Asn Tyr Lys Val Lys His Glu 240 245 250 AAA CGC TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA GAT 864 Lys Arg Tyr Phe Val Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Met Glu Asp 255 260 265 ACT AAT GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT CAA 912 Thr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp Gln 270 275 280 GGT GAA AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT AAA 960 Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gln Ala Val Leu Phe Gly Val Asp His Lys 285 290 295 300 CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA ACT 1008 Leu His Lys Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr Ala Arg Thr 305 310 315 AGA ACA ACT GGG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA TCA 1056 Arg Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser 320 325 330 GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAA TCA TTT GTT AGA AAT ACA 1104 Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 335 340 TTA TTA AAA GCA AGG CGA ATC GAA AGA TTC GCT TTT 1140 配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列の特徴：インフルエンザ ヘモフィルス ｂ型菌 １Ｈ、２Ｌ及び６Ｕ株の 外皮膜タンパク質Ｐ２のＮ末端配列 配列： Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu Leu Gly 1 5 10 配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列の特徴：インフルエンザ ヘモフィルス ｂ型菌 １Ｈ及び２Ｌ株の外皮膜 タンパク質Ｐ２のＣ末端配列 配列： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Ser Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 20 25 配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列の特徴：インフルエンザ ヘモフィルス ｂ型菌 ６Ｕ株の外皮膜Ｐ２タン パク質のＣ末端配列 配列： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Ser Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】精製外皮膜タンパク質Ｐ２のＮ−末端アミノ酸
配列、その逆転写による塩基配列及びＰ２遺伝子単離用
オリゴヌクレオチドプローブを示す図である。

【図２】Ｐ２遺伝子シーケンシングストラテジーを示す
図である。

【図３】Ｐ２遺伝子とそれに由来するアミノ酸の全配列
のうちの４２０番目のヌクレオチドまでの配列を示す図
である。

【図４】Ｐ２遺伝子とそれに由来するアミノ酸の全配列
のうちの４２１番目〜８４０番目のヌクレオチドまでの
配列を示す図である。

【図５】Ｐ２遺伝子とそれに由来するアミノ酸の全配列
のうちの８４１番目〜最後のヌクレオチドまでの配列を
示す図である。

【図６】Ｐ２遺伝子の再構築工程を示す図である。

【図７】ＪＭ１０１（ｐＲＳＭ４７８）のウエスターン
プロット解析の結果を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (72)発明者 ロバート エス． ムンソン、ジュニア ー アメリカ合衆国 63011 ミゾリー州 ボールイン ナントツケツト ドライブ 340 (72)発明者 ロバート ダブリュ． トルアン アメリカ合衆国 46222 インデアナ州 インデアナポリス ユージーン 2844 (72)発明者 ペレ チョング カナダ国 エル４ジエイ ２エス４ オ ンタリオ州 ソンヒル ボローズ スト リート 20 (72)発明者 ラファツト ファーヒム カナダ国 エル５アール ２テイ２ オ ンタリオ州 ミシソーガ セレモニアル ドライブ 524 (72)発明者 パトリック マクヴェリイ アメリカ合衆国 18360 ペンシルヴア ニア州 ストロードスヴェーク ノルト ン ロード （番地なし) (72)発明者 ミシエル クレイン カナダ国 エム５エイ ３エム２ オン タリオ州 ウイローダール マンロー ブールヴァード 16 (56)参考文献 特開 昭63−190896（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．10, （Ｏｃｔ．1988）ｐ．2709−2716 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/31 A61K 39/102 A61P 31/04 171 C07K 14/285 C07K 19/00 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｐ ＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 合成ペプチドと担体タンパク質とを有す
   る接合分子であって、前記合成ペプチドが、ヘモフィル
   ス インフルエンザｂ型菌の１Ｈ株、２Ｌ株及び６Ｕ株
   の外皮膜タンパク質Ｐ２のＮ末端部分（アミノ酸残基Ｎ
   ｏ．１〜１４）またはＣ末端部分（アミノ酸残基Ｎｏ．
   ３１４〜３４１）に相当する以下に示すアミノ酸配列
   Ａ、Ｂ及びＣ： アミノ酸配列Ａ（１Ｈ株、２Ｌ株及び６Ｕ株由来：Ｎ末
   端領域に相当）： Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu Le
   u Gly アミノ酸配列Ｂ（１Ｈ株及び２Ｌ株由来：Ｃ末端領域に
   相当）： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Ly
   s Thr Glu Lys Glu LysSer Val Gly Val Gly Leu Arg V
   al Tyr Phe アミノ酸配列Ｃ（６Ｕ株由来：Ｃ末端領域に相当）： Ala Arg Thr Arg Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Val Ly
   s Thr Glu Lys Glu LysSer Val Gly Val Gly Leu Arg V
   al Tyr Phe 及び、これらアミノ酸配列の一部をそのエピトープとし
   ての機能が損なわれない範囲内で変異させたアミノ酸配
   列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする接合分子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の接合分子と、薬学的に
   許容される担体とを含むことを特徴とするヘモフィルス
   インフルエンザｂ型菌に対するワクチン。