PL211180B1 - Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków - Google Patents

Description

(21) Numer zgłoszenia: 377337 (51) Int.Cl.

(22) Data zgłoszenia: 16.12.2003 A61K 39/395 (2006.01)

A61P 35/00 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

16.12.2003, PCT/EP03/014295 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

01.07.2004, WO04/055056

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów (54) nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków
(30) Pierwszeństwo: 17.12.2002, US, 60/433,945	(73) Uprawniony z patentu:
MERCK PATENT GMBH, Darmstadt, DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 23.01.2006 BUP 02/06	(72) Twórca(y) wynalazku: STEPHEN D. GILLIES, Carlisle, US KIN-MING LO, Lexington, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Szymon Łukaszyk
30.04.2012 WUP 04/12

PL 211 180 B1

Opis wynalazku

Ogólnie wynalazek dotyczy zmodyfikowanych przeciwciał. Przedmiotem wynalazku są w szczególności białka fuzyjne zawierające zmodyfikowane przeciwciała o obniżonej immunogeniczności, które specyficznie wiążą glikosfingolipid GD2 powierzchni ludzkiej komórki, oraz ich zastosowanie, jako środków leczniczych.

W ciągu ostatnich lat wystąpił znaczący postęp w rozwoju terapii opartych na przeciwciałach. Przykładowo, badacze nie tylko zidentyfikowali różne markery specyficzne dla nowotworów, ale także różne przeciwciała, które specyficznie wiążą się z tymi markerami. Przeciwciała można zastosować w celu dostarczenia pewnych cząsteczek, na przykład toksyny lub jednostki immunostymulującej, przykładowo cytokiny, do komórki rakowej wytwarzającej taki marker, dla selektywnego zabicia takiej komórki.

Przeciwciało 14.18 jest mysim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko glikosfingolipidowi GD2 znajdującemu się na powierzchni komórki. GD2 jest disialogangliozydem, który normalnie ulega ekspresji na znaczącym poziomie jedynie na zewnętrznej powierzchni błon komórek nauronalnych, gdzie jego kontakt z układem odpornościowym jest ograniczony poprzez barierę krew-mózg.

W przeciwień stwie do powyższej sytuacji, wiele komórek nowotworowych wykazuje nienormalne poziomy ekspresji glikosfingolipidów na powierzchni komórki. Przykładowo, GD2 ulega ekspresji na powierzchniach szerokiego spektrum komórek nowotworowych w tym nerwiaków niedojrzałych, nabłoniaków rdzeniowych, gwiażdziaków, czerniaków, drobnokomórkowego raka płuc, kostniako-mięsaków oraz innych nowotworów tkanek miękkich. Zatem GD2 jest dogodnym markerem specyficznym dla nowotworów dla ukierunkowywania domeny białek odpornościowo-stymulujących na komórki nowotworowe celem zwiększenia efektywności odpowiedzi Immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym dla ich zniszczenia. Ponieważ mysie przeciwciało 14.18 (przeciwciało ml 4.18) może być pomocne w ukierunkowaniu takich domen białkowych na komórki nowotworowe, jego sekwencje aminokwasowe pochodzące od myszy mogą zakłócać pożądany efekt terapeutyczny.

Podczas podawania pacjentowi, przeciwciała mogą wykazywać skojarzoną immunogeniczność w organizmie ssaka. Najczęściej ma to miejsce w momencie, gdy przeciwciała te nie są autologiczne. w konsekwencji tego, efektywność terapii opartych na przeciwciał ach jest czę sto ograniczona przez odpowiedź odpornościową skierowaną przeciwko danemu przeciwciału terapeutycznemu. Odpowiedź odpornościowa zwykle zwiększa się, jeśli przeciwciało pochodzi całkowicie lub częściowo od ssaka innego niż gospodarz, na przykład jeśli przeciwciało pochodzi od myszy, a biorcą jest człowiek.

W zastosowaniu klinicznym u ludzi pomocne może być zmodyfikowanie przeciwciał pochodzących od myszy, aby były bardziej zbliżone do przeciwciał ludzkich, dla zredukowania lub zminimalizowania immunogeniczności przeciwciała mysiego. Immunogeniczność przeciwciała pochodzącego od myszy może zostać zredukowana poprzez wytworzenie przeciwciała chimerycznego, w którym stałe regiony ludzkiego przeciwciała połączone są z mysimi domenami zmiennymi. Jednakże, pozostałe mysie domeny zmienne są ogólnie nadal immunogeniczne dla człowieka i mogą zakłócić wydajność terapii opartej na przeciwciałach.

Pewne podejścia mające na celu zredukowanie immunogeniczności, takie jak „oklejanie” (ang. veneering) i „humanizowanie”, wymagają wprowadzenia wielu substytucji aminokwasowych i mogą zakłócić wiązanie przeciwciała z antygenem. Przeciwciało m14.18 wiąże się z GD2 ze średnim powinowactwem. Dlatego oczekuje się, że mutacje, które znacząco obniżają powinowactwo m14.18 do GD2, czynią go mniej efektywnym dla celów terapeutycznych u ludzi.

Zgodnie z powyższym, w praktyce istnieje zapotrzebowanie na lecznicze przeciwciała, które wydajnie ukierunkowują na GD2 oraz wykazują obniżoną immunogeniczność przy podawaniu człowiekowi.

Ogólnie wynalazek dotyczy białka fuzyjnego zawierającego zmodyfikowaną formę przeciwciała m14.18, która jest mniej immunogenna dla człowieka, ale dalej zapewnia powinowactwo wiązania m14.18 do ludzkiego GD2.

Istotą wynalazku jest więc białko fuzyjne typu humanizowane przeciwciało-IL2 oznaczone jako hu14.18-IL2, które specyficznie wiąże GD2 i stymuluje układ odpornościowy, zawierające lekki łańcuch o sekwencji SEQ ID NO; 5 oraz ciężki łańcuch o sekwencji SEO ID NO: 6.

Wynalazek dotyczy humanizowanych form przeciwciała m14.18 (przeciwciała hu14.18), w którym kilka aminokwasów specyficznych dla myszy w jednym lub większej liczbie regionów szkieletowych zostało podstawionych przez inne aminokwasy w celu obniżenia ich immunogeniczności dla człowieka. Wynalazek dotyczy połączeń przeciwciała hu14.18 z jedną lub większą liczbą jednostek

PL 211 180 B1 nie-immunoglobulinowych, korzystnie IL-2, dla wzmocnienia efektów ukierunkowanej terapii odpornościowej. W jednym z aspektów, wynalazek dostarcza zmiennego regionu przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEO ID NO: 1, która określa zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny (region VL). w kolejnym aspekcie, wynalazek dotyczy zmiennego regionu przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEO ID NO: 2, która określa zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (region VH). W jednej z realizacji, wynalazek dostarcza zmienny region przeciwciała, w którym sekwencja aminokwasów SEO ID NO: 1 połączona jest z sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEO ID NO: 2. Te sekwencje aminokwasów mogą być połączone na przykład wiązaniem disiarczkowym lub wiązaniem peptydowym. w kolejnym aspekcie, wynalazek dotyczy zmiennego regionu przeciwciała, który specyficznie wiąże się z GD2 i zawiera przynajmniej aminokwasy 1-23 z SEO ID NO: 1, aminokwasy 1-25 z SEO ID NO: 2, lub aminokwasy 67-98 z SEO ID NO: 2. Sekwencje te określają regiony szkieletowe w zmiennych regionach immunoglobuliny przeciwciała hu14.18. Regiony szkieletowe zostały szczegółowo opisane poniżej. Jednym z aspektów wynalazku jest sposób celowania (ang. targeting) w komórkę z GD2 na jej powierzchni obejmujący podawanie pacjentowi zmiennego regionu przeciwciała według wynalazku. W jednej z realizacji, taką komórką docelową jest komórka nowotworowa. Kolejne aspekty wynalazku obejmują kwas nukleinowy kodujący zmienny region przeciwciała lub komórkę, która zawiera taki kwas nukleinowy, z których każde może być podawane pacjentowi lub stosowane w produkcji białka w warunkach in vitro.

Wynalazek dostarcza także polipeptydu, zawierającego zmienny region przeciwciała według wynalazku oraz fragment Fc zawierający przynajmniej domenę CH2, kwasów nukleinowych kodujących taki polipeptyd, komórek zawierających takie kwasy nukleinowe, oraz sposobów celowania w komórkę z GD2 na jej powierzchni poprzez podawanie pacjentowi takiego polipeptydu, kwasu nukleinowego lub komórki w niektórych realizacjach według wynalazku, fragment Fc pochodzi z lgG1.

Zmienny region przeciwciała jest połączony, z naruszeniem lub bez naruszenia fragmentu Fc, z jednostką nie-immunoglobulinową . W szczególnym przypadku, jednostka nie-immunoglobulinowa może być jest cytokiną, taką jak interleukina, czynnikiem krwiotwórczym, limfokiną, interferonem, lub cłiemokiną. Interleukina może być, przykładowo, interleukina-2 lub interleukina-12. Czynnikiem krwiotwórczym i limfokiną może być, przykładowo, odpowiednio czynnik stymulujący wzrost koloni granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i limfotoksyna. Interferonem może być, przykładowo, interferon-α, interferon-β lub interferon-γ. W niektórych realizacjach wynalazku, białko fuzyjne zawiera drugą jednostkę nie-immunoglobulinową, taką jak druga cytokina. W szczególnej realizacji, białko fuzyjne zawiera zmienny region przeciwciała, IL-2 oraz IL-12.

Istotą wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję nukleotydową SEO ID NO: 4 zawierającą sekwencje kwasów nukleinowych, które kodują opisane powyżej białko fuzyjne według wynalazku.

Istotą wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko fuzyjne według wynalazku oraz farmaceutyczny nośnik lub zaróbkę.

Wreszcie istotą wynalazku jest zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzania leku do stabilizacji postępu choroby u GD2-pozytywnych pacjentów chorych na raka a także do wytwarzania leku do zwiększania aktywności ADCC i aktywności lizy NK u GD2-pozytywnych pacjentów chorych na raka.

Oczywistym jest, iż cechy różnych realizacji wynalazku przedstawionych w opisie nie wykluczają się wzajemnie i mogą występować w różnych kombinacjach i przemiennie.

OPIS FIGUR RYSUNKU

Rysunek fig. 1A przedstawia sekwencję aminokwasów zmiennego regionu lekkiego łańcucha immunoglobuliny według wynalazku.

Rysunek fig. 1B przedstawia sekwencję aminokwasów zmiennego regionu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny według wynalazku.

Rysunek fig. 2A-D przedstawia sekwencję nukleotydów wektora ekspresji, zawierającą konstrukty kwasów nukleinowych kodujące lekki łańcuch immunoglobuliny oraz białko fuzyjne ciężkiego łańcucha immunoglobuliny-IL-2 według wynalazku.

Rysunek fig. 3A przedstawia sekwencję aminokwasów lekkiego łańcucha immunoglobuliny według wynalazku.

PL 211 180 B1

Rysunek fig. 3B przedstawia sekwencję aminokwasów ciężkiego łańcucha immunoglobuliny według wynalazku.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wynalazek dostarcza zmodyfikowaną formę przeciwciała m14.18, które jest mniej immunogenne dla ludzi, ale ciągle posiada zdolność do specyficznego wiązania ludzkiego GD2. Obniżoną immunogeniczność osiąga się poprzez jedną lub większą liczbę zmienionych sekwencji aminokwasowych w zmiennych domenach immunoglobuliny. Przeciwciało takie jest użyteczne w leczeniu nowotworów GD2-pozytywnych, szczególnie jeśli połączone jest z cytokiną lub innym modulatorem odpornościowym.

Terminy „przeciwciało” i „immunoglobulina” według wynalazku oznaczają (i) nienaruszone przeciwciało (na przykład przeciwciało monoklonalne lub przeciwciało poliklonalne), (ii) jego fragmenty wiążące antygen, w tym, przykładowo, fragment Fab, fragment Fab', fragment (Fab')2, fragment Fv, jednołańcuchowe miejsce wiążące przeciwciało, sFv, (iii) podwójnie specyficzne przeciwciało i jego fragmenty wiążące antygen.

Terminy „wiązać specyficznie”, „specyficznie związany” oraz „wiązanie specyficzne” oznaczają według wynalazku, że przeciwciało posiada powinowactwo wiązania do szczególnego antygenu o stężeniu przynajmniej okoł o 10⁶ M^-1 bardziej korzystnie o stężeniu przynajmniej okoł o 10⁷ M^-1 bar8 -1 10 -1 dziej korzystnie przynajmniej około 10⁸ M^-1 a zwłaszcza przynajmniej około 10¹⁰ M^-1.

Terminy „regiony szkieletowe” i „FR” (ang framework region) oznaczają według wynalazku regiony zmiennego regionu immunoglobuliny przyległe do regionów określających komplementarność (ang. Complementary-Determining Regions -CDR). Regiony CDR są fragmentami zmiennego regionu immunoglobuliny, które w pierwszym rzędzie oddziałują z antygenem. Jak przedstawiono na rysunku fig. 1, oba regiony VH i VL zawierają cztery regiony FR i są zlokalizowane w obrębie zblokowanych fragmentów sekwencji aminokwasowych.

Szczególnie, w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej przedstawionej na rysunku fig. 1A (SEO ID NO: 1), regiony FR lekkiego łańcucha są określone przez sekwencje aminokwasów od Asp1 do Cys23 (huVLFR1), od His39 do His54 (huVLFR2), od Gly62 do Cys93 (huVLFR3), oraz od Phe104 do Lys113 (huVLFR4). W odniesieniu do sekwencji aminokwasów przedstawionej na rysunku fig. 1B (SEO ID NO: 2), regiony FR ciężkiego łańcucha są zdefiniowane przez sekwencje aminokwasów od Glu1 do Ser25 (huVHFR1), od Trp36 do Gly49 (huVHFR2), od Arg67 do Ser98 (huVHFR3), oraz od Trp103 do Ser113 (huVHFR4).

SEKWENCJE BIAŁEK WEDŁUG WYNALAZKU

Wynalazek obejmuje przeciwciała, które wiążą, korzystnie specyficznie, glikofosfolipid GD2 na powierzchni komórki ludzkiej oraz posiadają zmodyfikowane regiony pochodzące z przeciwciała m14.18. Sekwencje aminokwasów VH lub VL (lub obu) zostają zmodyfikowane lub humanizowane w celu obniż enia ich immunogeniczno ś ci podczas podawania ludziom. Wed ł ug wynalazku przeciwciało m14.18 może być humanizowane, na przykład, poprzez zastosowanie metod deimmunizacji, w których eliminuje się lub osł abia potencjalne epitopy limfocytów T poprzez wprowadzenie mutacji, które redukują wiązanie się epitopów peptydu z cząsteczkami MHC klasy II (patrz, na przykład, opisy patentowe W098/52976 oraz WO00/34317). Alternatywnie, epitopy limfocytów T niepochodzące od ludzi są zmutowane w taki sposób, że nie korespondują ze swoistymi ludzkimi epitopami, które występują w ludzkich przeciwciałach (patrz, na przykład, opis patentowy U.S. Patent No. 5,712,120). Wynalazek dostarcza przeciwciała GD2 posiadające regiony VL i VH, które zawierają przynajmniej jedną humanizowaną sekwencję FR, redukując w ten sposób immunogeniczność podczas podawania ludziom.

I. Zmienne regiony ciężkich i lekkich łańcuchów

Jak wspomniano powyżej, hu14.18 zawiera humanizowane zmienne regiony pochodzące z przeciwciała m14.18, które zapewniają specyficzne wiązanie ludzkiego antygenu GD2. W niektórych realizacjach według wynalazku, region VL przeciwciała hu14.18 zawiera następujący polipeptyd:

D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C-R-S-S-Q-S-L-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-H-W-Y-L-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-H-K-V-S-N-R-F-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-K-I-S-R-V-E-A-E-D-L-G-V-Y-F-C-S-Q-S-T-H-V-P-P-L-T-F-G-A-G-T-K-L-E-L-K (SEQ ID NO: 1).

PL 211 180 B1

W szczególnych realizacjach, przeciwciało hu14.18 zawiera FR1 lekkiego łańcucha, który określony jest przez reszty 1 do 23 z SEO ID NO: 1, mianowicie, D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C (huVLpR1).

W innych realizacjach wynalazku, region VH przeciwciała hu14.18 zawiera następujący polipeptyd:

E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S-G-S-S-F-T-G-Y-N-M-N-W-V-R-Q-N-I-G-K-S-L-E-W-I-G-A-I-D-P-Y-Y-G-G-T-S-Y-N-Q-K-F-K-G-R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S-G-M-E-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (SEO ID NO: 2).

W szczególnych realizacjach, przeciwciało hu14.18 zawiera FR1 ciężkiego łańcucha, który jest określony przez reszty 1 do 25 z SEO ID NO: 2, mianowicie E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S (huVHFR1).

W kolejnych realizacjach wynalazku, przeciwciało hu14.18 zawiera FR3 ciężkiego łańcucha, który przedstawiony jest przez reszty 67 do 98 z SEO ID NO: 2, mianowicie R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S (huVHFR3).

Różne kombinacje powyższych realizacji także wchodzą w zakres wynalazku. Na przykład, przeciwciało hu14.18 może zawierać sekwencję VL przedstawioną w SEO ID NO: 1 oraz sekwencję VH przedstawioną w SEO ID NO: 2. Regiony VL i VH mogą być połączone przez wiązanie disiarczkowe lub wiązanie peptydowe, w zależności od tego, jak skonstruowane są ich sekwencje kwasów nukleinowych. Ogólnie, regiony V połączone są wiązaniem disiarczkowym, jeśli ich sekwencje kodowane są na osobnych konstruktach DNA. W przeciwieństwie do tej sytuacji, regiony V typowo łączą się wiązaniem peptydowym jeśli ich sekwencje kodowane są na jednołańcuchowym konstrukcie DNA.

Wynalazek uwzględnia także przeciwciało, które specyficznie wiąże GD2 i zawiera przynajmniej fragment humanizowanych regionów V. Na przykład, przeciwciało hu14.18 może zawierać region VL zdefiniowany w sekwencji SEO ID NO: 1 oraz region VH posiadający przynajmniej jeden humanizowany FR, taki jak VHFR1 lub VHFR2. Alternatywnie, przeciwciało według wynalazku może zawierać region VH zdefiniowany przez SEO ID NO: 2 oraz region VL posiadający przynajmniej jeden humanizowany FR, taki jak huVLFR1. Przeciwciało hu14.18 może także zawierać region VH posiadający przynajmniej jeden humanizowany FR i/lub region VL posiadający przynajmniej jeden humanizowany FR.

W pewnych realizacjach według wynalazku, region zmienny lekkiego łańcucha oraz region zmienny ciężkiego łańcucha może być połączony, odpowiednio, ze stałym regionem lekkiego łańcucha oraz stałym regionem ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Lekkie łańcuchy immunoglobuliny posiadają stałe regiony, które oznaczone są albo, jako łańcuchy kappa albo łańcuchy lambda. W szczególnej realizacji wynalazku, stały region lekkiego łańcucha jest łańcuchem kappa.

Regiony stałe ciężkiego łańcucha, oraz ich różne modyfikacje i kombinacje omówiono szczegółowo poniżej.

II. Fragment Fc

Zmienne domeny przeciwciała według wynalazku są opcjonalnie połączone z fragmentem Fc. Według wynalazku, fragment Fc obejmuje domeny pochodzące od stałego regionu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, korzystnie ludzkiej immunoglobuliny, w tym fragment, analog, odmianę, mutanta lub pochodną stałego regionu. Taki stały region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny określa się jako naturalnie występujący lub syntetycznie wytworzone homologii polipeptydowe z przynajmniej polipeptyd homologiczny co najmniej z fragmentem C-końcowego regionu ciężkiego łańcucha, w tym CH1, zawiasowy, CH2, CH3, oraz dla niektórych klas ciężkiego łańcucha, domeny CH4, Region „zawiasowy” łączy domenę CH1 z regionem CH2-CH3 fragmentu Fc. Stały region ciężkich łańcuchów dla immunoglobulin wszystkich ssaków wykazuje rozległe podobieństwo sekwencji aminokwasów. Sekwencje DNA dla tych regionów aminokwasowych są dobrze znane ze stanu techniki. (Patrz, np. Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth.125:191).

Według wynalazku fragment Fc typowo zawiera przynajmniej domenę CH2. Przykładowo, fragment Fc może zawierać cały stały region ciężkiego łańcucłia immunoglobuliny (CH1-zawias-CH2-CH3). Alternatywnie, fragment Fc może zawierać region zawiasowy, domenę CH2 oraz domenę CH3 lub ich fragmenty.

Stały region immunoglobuliny odpowiedzialny jest za wiele ważnych funkcji efektorowych przeciwciała, w tym za wiązanie z receptorem Fc (FcR) oraz dopasowanie dopełniacza. Istnieje pięć głównych klas stałego regionu ciężkiego łańcucha, sklasyfikowanych jako IgA, IgG, IgD, IgE oraz IgM, każdy z charakterystycznymi funkcjami efektorowymi przypisanymi izotypowi.

Na przykład IgG dzieli się na cztery izotypy γ: γ1, γ2, γ3 oraz γ4, znane także odpowiednio, jako lgG1, lgG2, lgG3 i lgG4. Cząsteczki IgG mogą oddziaływać z wieloma klasami receptorów komórkowych

PL 211 180 B1 w tym z trzema klasami receptorów Fcy (FcyR) specyficznymi dla przeciwciał klasy IgG, mianowicie

FcyRI, FcyRII oraz FcyRIII. Odnotowano, iż istotne sekwencje dla wiązania IgG z receptorami FcyR znajdują się w domenach CH2 i CH3.

Na okres półtrwania przeciwciała w surowicy wpływa zdolność tego przeciwciała do wiązania się z receptorem Fc (FcR). Podobnie, na okres półtrwania białek fuzyjnych immunoglobuliny w surowicy wpływ ma niezdolność do wiązania takich receptorów (Gilles et al. Cancer Research (1999) 59:2159-66). Domeny CH2 i CH3 immunoglobulin lgG2 i lgG4 wykazują niewykrywalne lub obniżone powinowactwo wiązania receptorów Fc w porównaniu do immunoglobuliny IgG1. Odpowiednio, okres półtrwania w surowicy opisanego przeciwciała może zostać zwiększony poprzez zastosowanie domeny CH2 i/lub CH3 z izotypów lgG2 lub lgG4. Alternatywnie, przeciwciało to może zawierać domenę CH2 i/lub CH3 z IgGI lub IgGS z modyfikacją w jednym lub większej liczbie aminokwasów w tych domenach w celu obniżenia powinowactwa wiązania z receptorami Fc (patrz, na przykład zgłoszenie patentowe U.S. 09/256,156, publikacja U.S. 2003-0105294-A1).

Region zawiasowy fragmentu Fc typowo przylega do końca C domeny CH1 stałego regionu ciężkiego łańcucha. Jeśli znajduje się on w białkach według wynalazku, zawias jest homologiczny do naturalnie występującego regionu w immunoglobulinie i typowo obejmuje reszty cysteiny łączące dwa ciężkie łańcuchy przez wiązania disiarczkowe tak jak w naturalnych immunoglobulinach. Reprezentatywne sekwencje regionów zawiasowych dla ludzkiej i mysiej immunoglobuliny można znaleźć w ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE, (red. Borrebaeck, W.H Freeman and Co., 1992).

Odpowiednie regiony zawiasowe dla wynalazku mogą pochodzić z IgG1, lgG2, lgG3, lgG4 oraz innych izotypów immunoglobulin. Izotyp IgGI posiada dwa wiązania disiarczkowe w regionie zawiasowym umożliwiające tworzenie efektywnego i trwałego wiązania disiarczkowego. Dlatego, korzystny region zawiasowy według wynalazku pochodzi z IgG1.

Opcjonalnie, pierwsza, najbardziej N-terminalna cysteina zawiasu IgG1 zostaje poddana mutacji w celu poprawienia ekspresji i składania przeciwciał lub białek fuzyjnych przeciwciała według wynalazku (patrz, na przykład zgłoszenie patentowe U.S. 10/093,958, publikacja U.S. 2003-0044423-A1).

Wiadomo, że w przeciwieństwie do IgG1, region zawiasowy lgG4 tworzy wewnątrzłańcuchowe wiązania disiarczkowe niewydajnie (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30:105-8). Także, region zawiasowy lgG2 posiada cztery wiązania disiarczkowe co prowadzi do zapoczątkowania oligomeryzacji i możliwego niewłaściwego wiązania disiarczkowego podczas sekrecji w układach rekombinowanych. Jeden z odpowiednich regionów zawiasowych według wynalazku może pochodzić z regionu zawiasowego lgG4, korzystnie zawierającego mutacje, które poprawiają właściwe tworzenie się wiązań disiarczkowych pomiędzy jednostkami pochodzącymi od ciężkiego łańcucha (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30(1): 105-8). Kolejny korzystny region zawiasowy pochodzi od zawiasu lgG2, w którym dwie pierwsze cysteiny są zmutowane na inne aminokwasy, takie jak, poczynając od najkorzystniejszych, seryna, alanina, treonina, prolina, kwas glutaminowy, lizyna, histydyna, arginina, asparginian, kwas asparginowy, glicyna, mationina, walina, izoleucyna, leucyna, tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan lub selenocysteina (patrz, na przykład opublikowane zgłoszenie patentowe U.S. 2003-0044423-A1).

Fragment Fc połączony z regionem zmiennym przeciwciała według wynalazku może zawierać domeny CH2 i/lub CH3 oraz region zawiasowy, który pochodzi z innych izotypów przeciwciała. Na przykład, fragment Fc może zawierać domeny CH2 i/lub CH3 z lgG2 lub lgG4 oraz region zawiasowy z IgG1. Zestawienie takiej hybrydy fragmentów Fc zostało opisane w opublikowanym zgłoszeniu patentowym U.S. 2003-0044423-A1.

Jeśli fragment Fc połączony jest ze zmiennym regionem według wynalazku, to zawiera on korzystnie jedną lub większą liczbę modyfikacji aminokwasowych, które ogólnie przedłużają okres półtrwania w surowicy białka fuzyjnego Fc. Takie modyfikacje aminokwasów obejmują mutacje zasadniczo obniżające lub eliminujące wiązanie receptora Fc lub aktywność dopasowania dopełniacza. Na przykład, jeden z typów takiej mutacji usuwa miejsce glikozylacji fragmentu Fc ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. W IgG1 miejscem glikozylacji jest Asn297 (patrz, na przykład, zgłoszenie patentowe U.S. 10/S10,719, publikacja U.S. 200S-0166163-A1).

III. Region połączenia fuzyjnego

Zmienne regiony przeciwciała według wynalazku mogą opcjonalnie być połączone lub dołączone do jednostki nie-immunoglobulinowej bezpośrednio lub pośrednio, tak jak przez łącznik peptydowy (np. (Gly4-Ser)3 (SEO ID NO: S)). Immunogeniczność ujawnionych białek fuzyjnych może zostać ograniczona poprzez zaburzenie zdolności połączenia fuzyjnego lub epitopu łączącego do oddziaływania z receptorem limfocytów T, jak opisano w opublikowanym zgłoszeniu patentowym U.S. 2003-0166877-A1.

PL 211 180 B1

Nawet w połączeniu pomiędzy dwoma ludzkimi białkami, na przykład ludzkim Fc i ludzką IL-2, region otaczający połączenie fuzyjne lub epitop łączący zawiera sekwencję peptydową, która typowo nie występuje w ludzkim organizmie oraz, co za tym idzie, może być immunogenna. Immunogeniczność epitopu łączącego może zostać ograniczona, na przykład, poprzez wprowadzenie jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji w pobliże połączenia fuzyjnego, lub poprzez określenie potencjalnych epitopów limfocytów T zachodzących na połączenie, jak opisano w opublikowanym zgłoszeniu patentowym U.S. 2003-0166877-A1 oraz zamianę aminokwasu w pobliżu połączenia w celu obniżenia zdolności potencjalnego epitopu limfocytu T do oddziaływania z receptorem limfocytu T.

Okres półtrwania białka w surowicy można także zwiększyć poprzez wprowadzenie mutacji w region połączenia fuzyjnego. Na przykład, w białku zawierającym domenę CH3 połączoną z jednostką nie-immunoglobulinową, C-końcowa lizyna domeny CH3 może zostać zmieniona na inny aminokwas, taki jak alanina, który zapewnia zasadniczy wzrost czasu półtrwania w surowicy otrzymanego białka fuzyjnego.

W pewnych realizacjach, pożądane jest rozczepienie proteolityczne połączenia fuzyjnego. Odpowiednio, wewnątrzgeniczny region może zawierać sekwencję nukleotydową kodującą miejsce proteolitycznego rozczepienia. Miejsce takie, znajdujące się pomiędzy immunoglobulina a cytokiną, może zostać oznaczone w celu zapewnienia proteolitycznego uwolnienia cytokiny w miejscu docelowym. Na przykład, powszechnie wiadomo, iż plazmina i trypsyna rozczepiają po resztach lizyny i argininy w miejscach, które dostę pne są dla tych proteaz. Dobrze znane są inne miejscowo specyficzne endoproteazy i sekwencje aminokwasów, które one rozpoznają.

IV. Leczenie chorób ludzkich białkami fuzyjnymi przeciwciała hu 14.18

Zmienne regiony przeciwciała według wynalazku mogą zostać przyłączone do czynnika diagnostycznego i/lub terapeutycznego. Czynnik ten może być połączony z przeciwciałem w celu wytworzenia białka fuzyjnego. Alternatywnie, czynnik taki może być chemicznie sprzężony z przeciwciałem dla wytworzenia immuno-koniugatu. Takim czynnikiem może być na przykład toksyna, znacznik promieniotwórczy, czynnik obrazujący, jednostka immunostymulująca lub podobny.

Zmienny region przeciwciała według wynalazku może być połączony z cytokiną. Korzystne cytokiny obejmują interleukiny takie jak interleukina-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-1S, IL-14, IL-15, IL-16 oraz IL-18, czynniki krwiotwórcze takie jak czynnik stymulujący wzrost koloni[granulocytów-makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (G-CSF) oraz erytropoetyna, czynniki martwicy nowotworów (TNF) takie jak TNF, limfokiny takie jak limfotoksyna, regulatory procesów metabolicznych takie jak leptyna, interferony takie jak interferon α, interferon β oraz interferon γ i chemokiny. Korzystnie, białko fuzyjne przeciwciała-cytokiny lub immunokoniugat wykazują biologiczną aktywność cytokiny. W jednej z realizacji, domena zmienna przeciwciała połączona jest z IL-2. Korzystnie, kilka aminokwasów w jednostce IL-2 jest zmutowanych w celu obniżenia toksyczności, jak opisano w opublikowanym zgłoszeniu patentowym U.S. 200S-0166163-A1.

Na przykład, rysunki fig. 3A i 3B przedstawiają sekwencje aminokwasów konkretnej realizacji białka fuzyjnego przeciwciała według wynalazku. Konkretnie, rysunek fig. 3A przedstawia sekwencję peptydu lekkiego łańcucha humanizowanej immunoglobuliny, która obejmuje zmienny i stały region. Rysunek fig. 38 przedstawia sekwencję peptydu ciężkiego łańcucha humanizowanej immunoglobuliny połączonego z IL-2. Te polipeptydy dostarczają białka fuzyjnego humanizowanego przeciwciała zdolnego do wiązania GD2 i stymulującego układ odpornościowy. Opcjonalnie, kompleksy białek mogą ponadto zawierać drugi czynnik, taki jak drugą cytokinę. W jednej z realizacji, białko fuzyjne przeciwciała hu14.18 zawiera IL-12 oraz IL-2. Taka konstrukcja kompleksów białkowych zawierająca domenę immunoglobuliny, oraz dwie różne cytokiny opisana jest szczegółowo w opisie patentowym U.S. 6,617,135.

Białka fuzyjne według wynalazku są użyteczne w leczeniu chorób ludzkich, takich jak nowotwór. Podczas leczenia ludzkich guzów, szczególnie użyteczne jest podawanie białka fuzyjnego przeciwciała-IL-2 zawierającego regiony V według wynalazku poprzez wlew lub zastrzyk śródskórny, stosując dawki 0.1 do 100 miligram/metr^A/pacjent. W korzystnej realizacji, szczególnie użyteczne jest podawanie białka fuzyjnego przeciwciała-IL-2 zawierającego regiony V według wynalazku poprzez wlew lub zastrzyk śródskórny, stosując dawki 1 do 10 miligram/metr²/pacjent, a bardziej korzystnie około 3 do 6 miligram/metr²/pacjent.

Badania kliniczne wykazały, że w następstwie podawania hu14.18-IL-2, białko fuzyjne zachowuje swoją zdolność do aktywowania komórek reagujących na IL-2 poprzez receptor IL-2 oraz zachowuje swoją zdolność do wiązania komórek GD2-pozytywnych oraz dostarczania IL-2 do ich

PL 211 180 B1 powierzchni. Ponadto, podawanie białka fuzyjnego hu14.18-IL-2 pacjentom chorym na raka skutkuje stabilizacją postępu choroby u zaskakująco dużej liczby pacjentów (patrz przykład 1).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można stosować w stałych, półpłynnych lub płynnych postaciach dawkowania, takich jak, na przykład pigułki, kapsułki, proszki, płyny, zawiesiny, oraz podobne, korzystnie w postaciach dawek jednostkowych odpowiednich do podawania w precyzyjnych dawkach. Takie kompozycje zawierają konwencjonalny nośnik farmaceutyczny lub rozcieńczalnik oraz, dodatkowo, mogą zawierać inne czynniki lecznicze, czynniki farmaceutyczne, nośniki, środki pomocnicze i podobne. Rozcieńczalniki takie mogą zawierać inne białka, takie jak, na przykład, albuminy ludzkiej surowicy lub białka osocza. Współczesne sposoby otrzymywania takich postaci dawkowania są znane lub będą oczywiste dla znawcy techniki. Taka kompozycja lub formulacja, która ma być podawana będzie, za każdym razem, zawierała ilość aktywnego składnika (aktywnych składników) efektywną dla osiągnięcia pożądanego efektu u leczonej jednostki.

Podawanie kompozycji według wynalazku może przebiegać przez dowolne akceptowane drogi podania dla czynników, które wykazują taką aktywność. Takie drogi obejmują podanie doustne, pozajelitowe lub miejscowe oraz inne formy ustrojowe. Korzystnym sposobem podawania jest wstrzyknięcie dożylne w farmaceutycznie przyswajalnym nośniku (patrz przykład 1).

Podawana ilość aktywnego składnika będzie, oczywiście, zależna od jednostki leczonej, zaawansowania choroby, sposobu podawania oraz oceny zlecającego lekarza.

KWASY NUKLEINOWE WEDŁUG WYNALAZKU I.

I. Konstrukty przeciwciała hu14.18

Wynalazek obejmuje także kwasy nukleinowe zdolne do ekspresji każdego z powyższych typów białek. Obejmują one, na przykład, kwasy nukleinowe kodujące sekwencje aminokwasów zawarte w SEO ID NO: 1; sekwencje aminokwasów zawarte w SEO ID NO: 2; region VL przeciwciała hu14.18, który zawiera sekwencję aminokwasów huVLFR1; region VH przeciwciała hu14.18, który zawiera sekwencje aminokwasów huVHFRI; region VH przeciwciała hu14.18, który zawiera sekwencję aminokwasów huVHFR3; oraz białka fuzyjne zawierające przeciwciało hu14.18 obejmujące przynajmniej jedną z powyższych sekwencji humanizowanego FR oraz jeden lub więcej czynników terapeutycznych.

Przeciwciała hu14.18 według wynalazku można wytworzyć technikami inżynierii genetycznej, na przykład poprzez utworzenie konstruktu kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało specyficzne względem GD2 zawierające pożądane FR według wynalazku. W jednej z realizacji, konstrukt genowy kodujący opisane przeciwciało zawiera, w kierunku 5' do 3', segment DNA, który koduje zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający w nim przynajmniej jeden humanizowany FR oraz segment DNA kodujący stały region ciężkiego łańcucha. W kolejnej realizacji, kolejny segment DNA kodujący cytokinę jest przyłączony do końca 3' segmentu DNA kodującego stały region łańcucha ciężkiego. W innej realizacji, konstrukt genowy zawiera, w kierunku 5' do 3', segment DNA kodujący zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający przynajmniej jeden humanizowany FR oraz segment DNA kodujący cytokinę. Alternatywnie, kwas nukleinowy według wynalazku może zawierać, w kierunku 5' do 3', segment DNA kodujący zmienny region lekkiego łańcucha zawierający w nim przynajmniej jeden humanizowany FR oraz segment DNA kodujący cytokinę. W pewnych realizacjach, kwas nukleinowy kodujący cytokinę przyłączony jest w szkielecie do 3' końca genu kodującego stały region (np. egzon CH3), albo bezpośrednio przez wewnątrzgeniczny region (np. poprzez właściwe łączniki, takie jak przez DNA kodujące (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 3)).

II. Ekspresja konstruktów przeciwciała hu 14.18

Kwas nukleinowy kodujący białka według wynalazku może zostać zestawiony lub wstawiony do jednej lub wielu wektorów ekspresji do wprowadzenia do właściwej komórki biorcy, w której ulega ekspresji. Wprowadzenie kwasów nukleinowych w wektory ekspresji można osiągnąć standardowymi technikami biologii molekularnej. Korzystne wektory ekspresji obejmują te, z których kodowane białko może ulec ekspresji albo w komórkach bakteryjnych albo w komórkach ssaków.

Według wynalazku ciężki łańcuch zmiennego regionu przeciwciała ulega koekspresji w tej samej komórce, co odpowiedni łańcuch lekki. Dla białek fuzyjnych, które zawierają wiele łańcuchów polipeptydowych, można zastosować więcej niż jeden wektor ekspresji. Sposoby kotransfekcji, na przykład, z wykorzystaniem dwóch wektorów ekspresji, często prowadzą do dostarczenia obu wektorów do docelowej komórki. Alternatywnie, czasem użyteczne jest zastosowanie pojedynczego wektora kodującego wiele polipeptydów do koekspresji w tej samej komórce.

PL 211 180 B1

Na przykład rysunki fig. 2A-D przedstawiają sekwencję kwasu nukleinowego pojedynczego wektora kodującego zarówno ciężki jak i lekki łańcuch immunoglobuliny według wynalazku. Taki wektor zawiera także kwas nukleinowy kodujący IL-2 połączony z końcem 3' ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Stąd, podczas wprowadzania do komórki, wektor taki sam może dostarczyć białko fuzyjne humanizowanego przeciwciała-IL-2, które specyficznie wiąże GD2 oraz pobudza funkcje odpornościowe.

Ponadto, dogodnym może być ekspresja białek według wynalazku, jako cząsteczek o pojedynczym łańcuchu. Na przykład, zmienny region przeciwciała może ulegać ekspresji, jako jednołańcuchowe przeciwciało lub sFv opcjonalnie połączony z białkiem niebędącym immunoglobulina. W kolejnej realizacji ciężki łańcuch (z lub bez przyłączonej cytokiny) połączony jest z częścią lekkiego (lub ciężkiego) łańcucha (z lub bez przyłączonej cytokiny) w celu wytworzenia monowalentnych i biwalentnych immunokoniugatów.

Linie komórek biorczych są korzystnie komórkami limfoidalnymi, takimi jak szpiczak (lub hybrydoma). Szpiczaki mogą syntetyzować, składać i wydzielać immunoglobuliny kodowane przez transfekowane geny oraz mogą glikozylować białka. Szczególnie korzystną komórką biorczą jest szpiczak Sp2/0, który normalnie nie wytwarza endogennej immunoglobuliny. Podczas transfekowania, komórka ta będzie wytwarzała tylko immunoglobuliny kodowane przez transfekowane konstrukty genowe. Transfekowane szpiczaki mogą wzrastać w hodowli lub w otrzewnych myszy, gdzie wydzielone immunokoniugaty można odzyskać z płynu puchliny brzusznej. Inne komórki limfoidalne jak limfocyty B można również wykorzystać, jako komórki biorcze.

Istnieje kilka sposobów transfekowania komórek limfoidalnych wektorami zawierającymi konstrukty kwasu nukleinowego kodującego łańcuch chimerycznej Ig. Korzystnym sposobem wprowadzenia wektora do komórek limfoidalnych jest fuzja sferoblastyczna. (patrz, na przykład Gillies et al. (1989) Biotechnol. 7:798-804). Alternatywne sposoby obejmują elektroporację lub strącanie fosforanem wapnia. Inne użyteczne sposoby wytwarzania immunokoniugatów obejmują otrzymywanie sekwencji RNA kodującej taki kontrukt oraz jego translacje we właściwych układach in vivo lub in vitro. Po ekspresji, białka według wynalazku można zebrać standardowymi procedurami oczyszczania białek (patrz na przykład opis patentowy U.S. 5,650,150).

III. Leczenie raka terapią genową

Kwasy nukleinowe według wynalazku można stosować, jako czynniki terapii genowej w leczeniu raka i innych chorób, w których pożądane jest ukierunkowanie układu odpornościowego na specyficzny typ komórek. Na przykład, komórki można pobrać od człowieka lub zwierzęcia, i jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych kodujących przeciwciało według wynalazku można transfekować do tych komórek. Komórki takie są następnie ponownie wprowadzane do organizmu człowieka lub zwierzęcia. Transfekowane komórki mogą być normalne lub rakowe. Alternatywnie, kwas nukleinowy można wprowadzić do komórek in situ. Człowiek lub zwierzę ustawia układ odpornościowy na komórki rakowe, co może doprowadzić do wyleczenia lub osłabienia zaawansowania raka. Zmienny region przeciwciała według wynalazku, połączony z właściwymi elementami regulatorowymi w celu promowania ekspresji w komórkach ssaka, można transfekować do komórek dowolną z wielu technik, w tym poprzez fosforan wapnia, „pistolet genowy”, wektory adenowirusowe, liposomy kationowe, wektory retrowirusowe, lub każdym innym wydajnym sposobem transfekcji.

W szczególnej realizacji wynalazku, przeciwciało hu14.18 można stosować w celu selektywnego dostarczenia cytokiny do docelowej komórki in vivo, w taki sposób, że cytokina może wywrzeć lokalny efekt biologiczny taki jak miejscowa reakcja zapalana, pobudzenie wzrostu oraz aktywacja limfocytów T lub aktywacja ADCC. Terapeutycznie wydajna ilość takiego przeciwciała podawana jest do układu krążenia jednostki posiadającej docelowe komórki.

Wynalazek został dalej zilustrowany nieograniczającymi go przykładami.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Oczyszczanie i formulacja hu14.18-IL2

W jednym z badań, hu14.18-IL2 poddano ekspresji z komórek NS/0, zbierano supernatant z hodowli tkankowej, i oczyszczano białko hu14.18-IL2 stosując kolejno kolumnę chromatograficzną Abx Mixed Resin, chromatografię z rekombinowanym Białkiem A oraz kolumnę chromatograficzną Q Sepharose, a następnie styczną przepływową diafiltrację Pellicon 2 z buforu wymiany do buforu formulacji. Szczegóły tych etapów oczyszczania opisano poniżej. Inaktywacja wirusa oraz etapy usuwania zostały przeprowadzone w etapach opisanych poniżej. Inaktywacja wirusa i etapy usuwania nie

PL 211 180 B1 były konieczne dla samego oczyszczania, ale były stosowane w celu spełnienia względów regulaminowych.

Dwa litry supernatantu hodowli komórkowej NS/0 zawierającego hu14.18-IL2 doprowadzano do pH 5.9 1M kwasem octowym i podawano na kolumnę Abx (J. T. Baker); przemywano 10 mM MES, 100 mM octanem sodu o pH 6.2; i poddawano elucji 500 mM octanem sodu o pH 7. Materiał ten ładowano na kolumnę z rekombinowanym Białkiem A (Pharmacia); przemywano 100 mM fosforanem sodu, 150 mM NaCI o pH 7; przemywano 100 mM fosforanem sodu, 150 mM NaCI o pH 6; przemywano 10 mM fosforanem sodu o pH 7; i poddawano elucji 100 mM fosforanem sodu, 150 mM NaCI o pH 3.5. pH eluatu wynosił o 4.2. W celu wywoł ania inaktywacji wirusa, obniż ono to pH do 3.8 i preparat inkubowano przez 30 minut, po których pH zobojętniano do 7 stosując 1M NaOH. W celu usunięcia kwasu nukleinowego materiał ten ładowano na kolumnę Q Sepharose (Pharmacia) i przemywano 100 mM fosforanem sodu, 150 mM NaCI o pH 7. Kwas nukleinowy wiązał się z kolumną, podczas gdy białko znajdowało się w przepływie i w płukankach, które powtarzano aż A280 powróciła do linii podstawowej. Diafiltrację Pellicon 2 (Milipore) przeprowadzano według instrukcji wytwórcy, w taki sposób, że końcowy materiał hu14.18-1L2 znajdował się w następującej formulacji:

1. Mannitol 4%

2. Chlorowodorek argininy USP/NF 100 mM

3. Kwas cytrynowy USP-FCC 5 mM

4. Polisorbat 80 0.01% (w/v) pH buforu formulacji doprowadzano do 7 z użyciem 1 M NaOH.

W koń cowym etapie preparat przesą czano przez membranę Viresolve 180 (Milipore), która wykazuje granicę masy cząsteczkowej 180000. Dało to efekt „wypolerowania” materiału co spowodowało usunięcie podwójnych agregatów i oligomerów wyższego rzędu.

P r z y k ł a d 2

Aktywność przeciwnowotworowa białka fuzyjnego hu14.18-IL-2

Obserwowana w I fazie prób klinicznych

W celu oceny bezpieczeństwa i wydajności hu14.18-IL-2, przeprowadzono próbę kliniczną I fazy. Wyselekcjonowani pacjenci mieli histologicznie potwierdzonego czerniaka, który nie kwalifikował się do leczenia chirurgicznego i medycznego. Pacjenci ci mogli posiadać albo mierzalne albo możliwe do oceny przerzuty, albo też nie wykazywali żadnych objawów przerzutów po chirurgicznej resekcji albo przerzutów odległych albo miejscowych nawrotowych. Pacjenci z wieloma (dwoma lub większą liczbą) miejscowych lub regionalnych nawrotów zostali włączeni tylko w przypadku, jeśli stwierdzono dowody na zajęcie węzłów chłonnych oraz jeśli każdy nawrót był oddzielony o przynajmniej przez 2 miesiące. Wymagano, aby wszyscy pacjenci wykazywali właściwe funkcje szpiku kostnego (okreś lone przez całkowitą liczbę białych krwinek (WBC) > 3,500/ml, lub całkowitą liczbę granulocytów > 2000/ml, p ł ytek krwi > 100,000/ml oraz hemoglobinę > 10.0 g/dl), wł a ś ciwą funkcję wą troby (określoną przez aminotransferazę aspartamową (AST) < 3 x norma i całkowitą bilirubinę < 2.0 mg/dl), oraz właściwą funkcję nerek (określoną przez poziom kreatyniny w surowicy < 2.0 mg/dl lub klirens kreatyniny > 60 ml/min). Wszyscy pacjenci wykazywali wynik elektrokortykografii (EGOG) wynoszący 0 lub 1 i spodziewany okres przeż ycia powyż ej 12 tygodni. Wykluczono pacjentów, którzy uprzednio otrzymywali chemoterapię, trapię napromieniowania, lub inną terapię immunosupresywną w ciągu 4 tygodni przed badaniem. Pacjenci mogli posiadać wcześniejsze przerzuty do centralnego układu nerwowego, jeśli byli leczeni i stabilni przez przynajmniej 4 tygodnie przed rozpoczęciem badania. Świadomą zgodę otrzymano od wszystkich pacjentów.

Faza I określona była, jako otwarte, nie-randomizowane badanie eskalacji dawki w grupach 3 do 6 osobowych, które otrzymywały hu14.18-IL-2 w jednym z następujących poziomów dawkowania:

0.8, 1.6, 3.2, 4.8, 6.0 lub 7.5 mg/m^A/dzień. hu14.18-IL-2 podawano hospitalizowanym chorym jako 4-godzinny wlew dożylny (IV) przez 3 kolejne dni podczas pierwszego tygodnia terapii. Białko fuzyjne hu14.18-IL-2 podawano pacjentom w formulacji zawierającej 4% Mannitolu; HCI Argininy, 100 mM; Cytrynian, 5 mM; oraz 0.01% Tween 80, przy pH 7. Pacjenci byli wypisywani ze szpitala jeśli ich stan był stabilny, w przybliżeniu 24 godziny po podaniu trzeciego wlewu. Działania uboczne i toksyczność była stopniowana według NCI Common Toxicity Criteria (wersja 2.0) oraz University of Winconsin Comprehensive Cancer Center Toxicity Grading Scalę dla IL-2 (stan funkcjonowania, wzrost masy oraz temperatura). Graniczna dawka toksyczna (DLT) została określona jako występowanie 3 lub 4 stopnia toksyczności innego niż 3 stopień limfopenii, hiperbilirubinemii, hipofospfatemii lub hiperglikemii. Maksymalna tolerowana dawka (MTD) została określona jako poziom dawki, przy którym dwóch

PL 211 180 B1 z sześciu pacjentów wykazywało DLT podczas kuracji 1. Pacjenci z 3 stopniem toksyczności zależnej od leczenia byli doprowadzani do przynajmniej pierwszego stopnia zanim mogli kontynuować leczenie w 2 kuracji z obniżeniem dawki o 50%. Pacjenci z > 25% postępem choroby byli wykluczani z badań.

Pacjenci ze stabilnym obrazem choroby byli poddawani kuracji 2.

Właściwości farmakokinetyczne hu 14.18-1L-2 oceniano na pacjentach. Kiedy wyznaczono poziomy hu14.18-IL-2 w seryjnych próbkach od wszystkich 33 pacjentów niezwłocznie po pierwszym czterogodzinnym wlewie (dzień 1, kuracja 1), okres półtrwania wynosił 3.7 godzin (+/- odchylenie standardowe 0.9 godz.). Jest to poziom pomiędzy okresem półtrwania 2 składników (około 45 minut dla IL-2 i 3 dni dla chimerycznego przeciwciała m14.18), oraz porównywalny do tego, jaki był obserwowany w przypadku okresu półtrwania chimerycznego m14.18-1 L-2 u myszy. Śledząc klirens hu14.18-IL-2 z surowicy tych pacjentów, nie wykryto ani IL-2 ani przeciwciała hu 14.18. Pik w surowicy oraz obszar pod krzywą (AUC) podczas kuracji 1 wykazywały znaczący wzrost zależny od dawki (p < 0.001).

W badaniu tym leczono trzydziestu trzech pacjentów. Tabela 1 zawiera kliniczne wyniki. Dwóch pacjentów (6%) ukończyło jedynie pierwsze 2 lub 3 dni kuracji 1. Jeden z nich (poziom dawkowania 3) wykazywał stopień 3 hiperbilirubinemii drugiego dnia leczenia, a drugi pacjent (poziom dawkowania 6) wykazywał 3 stopień nadciśnienia wymagającego leczenia. Obaj ci pacjenci wykazywali rozwój choroby i nie otrzymali drugiej kuracji z całej terapii. Dziewiętnastu pacjentów (58%) wykazało stabilizację choroby po pierwszej kuracji z całej terapii. Pięciu pacjentów (15% wszystkich pacjentów) wymagało redukcji dawki o 50% w kuracji 2 ze względu na uboczne efekty podczas kuracji 1. Siedemnastu pacjentów (52% wszystkich pacjentów) ukończyło kurację 2. Jeden pacjent (poziom dawkowania 4) odrzucił otrzymywanie końcowego wlewu podczas kuracji 2, i jeden pacjent (poziom dawkowania 6) miał wstrzymany wlew podczas kuracji 2 ze względu na nadciśnienie. Ośmiu pacjentów (24% wszystkich pacjentów) wykazywało stabilizację choroby po drugiej kuracji całego leczenia. Wyniki te wskazują, że hu14.18-IL-2 powoduje stabilizację postępowania choroby u zaskakująco dużej liczby pacjentów.

Ośmiu z 33 pacjentów utrzymywało stan stabilny choroby po 2 kuracjach całej terapii, a 4 z tych 8 pacjentów kontynuowało bez widocznych dowodów postępu choroby (1 ze stabilną chorobą i 3 w brakiem dowodów postępu choroby). Przez okres 20-52 miesięcy od zakończenia protokołu terapii.

Pięciu z tych 33 pacjentów włączono do badań bez mierzalnej choroby po chirurgicznym usunięciu nawracających przerzutów. Dwóch z tych pięciu pacjentów wykazało postęp choroby, podczas gdy pozostałych 3 pacjentów nadal nie wykazywało symptomów choroby (20-52 miesięcy). Odkrycia te są zgodne z hipotezą, że kliniczna korzyść z interwencji immunoterapeutycznej jest najbardziej obiecująca u pacjentów z małymi zniszczeniami nowotworowymi. Dodatkowo jeden pacjent wykazał obiektywne zmniejszenie guzka płucnego po dwóch kuracjach całej terapii, ale pozostałe symptomy choroby były punktowane jako postęp choroby spowodowany wzrostem w odległym węźle. Węzeł ten został usunięty po terapii hu14.18-IL-2 i u pacjenta nie stwierdzono postępu choroby w ciągu ponad 3 lat.

T a b e l a 1 Wyniki Kliniczne

	Liczba pacjentów
Pacjenci, którzy ukończyli kurację 1	31
Stabilna choroba po kuracji 1	19
50% redukcja dawki na kurację 2	5
Pacjenci, którzy ukończyli kurację 2	17
Stabilna choroba po kuracji 2	8

Immunostymulacja in vivo przez hu14.18-IL-2 w Fazie I badań klinicznych.

Pacjenci leczeni hu14.18-IL-2 byli także badani ze względu na wskazania immunostymulacji.

Limfopenia krwi obwodowej wystąpiła 2-4 dnia, a następnie wyrzutowa limfocytopenia 5-22 dnia. Obie te zmiany były zależne od dawki (odpowiednio p < 0.01 i p < 0.05). Liczba limfocytów 5, 8, 15 i 22 dnia była znacząco większa niż poziom podstawowy w przypadku kuracji 1. Poziom podstawowy liczby limfocytów dla kuracji 2 (dzień 29 kuracji 1) zwiększył się ponad poziom podstawowy liczby limfocytów dla kuracji 1, wskazując, że efekty pierwszej kuracji stale występują w 29 dniu. Ponadto, liczba limfocytów podczas kuracji 2 w dniu 5, 8 i 15 jest większa niż odpowiednie wartości dla dni 5, 8 i 15 podczas kuracji 1 w przypadku tych 12 pacjentów.

PL 211 180 B1

Fenotyp powierzchni komórkowej limfocytów wskazuje na ekspansję limfocytów CD16+ i CD56+ (markery naturalnych zabójców, ang. natural killer - NK) po pierwszym tygodniu terapii hu14.18-IL-2. Efekt ten stale występował 29 dnia kuracji 1 (dzień 1, kuracja 2). W przypadku pacjentów 19-33 (otrzymujących 4.8-7.5 mg/m²/dzień), fenotyp powierzchni komórkowej limfocytów został określony w dniu 15 i 22 oprócz dni 1 i 8. Analiza ta wskazała, że namnożenie komórek, w których zachodzi koekspresja CD56 i CD56/CD16 pozostaje znacząco zwiększone (p < 0.01) w dniach 8, 15 oraz 22.

Jako miarę immunoaktywacji, przyjęto poziomy białek C-reaktywnych (ang. C-reactive protein - CRP) dla pacjentów 13-33 oraz poziomy rozpuszczalnego receptora IL-2 (slL-2R) dla 31 pacjentów, którzy ukończyli kurację 1. Znaczący wzrost średniej wartości CRP występował w 3-5 dniu leczenia w obu kuracjach 1 i 2 w porównaniu do wartości podstawowej dla każdej kuracji. Ten wzrost w CRP powracał do poziomów podstawowych do 8 dnia każdej kuracji. Poziom slL-2R był znacząco zwiększony ponad poziom podstawowy po 24 godzinach od wlewu hu14.18-IL-2 podczas obu kuracji 1 i 2, który utrzymywał się do 8 dnia. Odkryto, że wzrost SIL-2R jest zależny od dawki (p = 0.014). Wartości slL-2R dla kuracji 2 były zwiększone w porównaniu do odpowiednich wartości w kuracji 1 dla 1-5 dni w przypadku pacjentów otrzymujących tę samą dawkę w obu kuracjach (p < 0.05).

Linia komórkowa nerwiaka niedojrzałego LA-N-5, która wytwarzała GD2 i wiązała hu14.18-IL-2 została użyta w celu oceny działania IL-2 aktywującego NK oraz komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) na jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) otrzymanej od 31 pacjentów, którzy ukończyli kurację 1. Występował znaczący wzrost niszczenia komórek za pośrednictwem limfocytów od dnia 8 w porównaniu z dniem 1 dla tych obu badań. 12 pacjentów, którzy otrzymali kurację 2 na poziomie tej samej dawki, co w kuracji 1, wykazało wyniki ADCC, które były bardzo zbliżone do tych zaobserwowanych podczas kuracji 1. Jednym parametrem, który był inny dla kuracji 2 niż kuracji 1 był wzrost niszczenia komórek w obecności IL-2 dnia 1, co wskazuje na wzmocnione niszczenie komórek w tych badaniach pozostało podwyższone dnia 29 (dzień 1, kuracja 2).

Ponieważ docelowa LA-N-5 jest względnie oporna na świeże komórki NK, jest ona użyteczna do pomiaru niszczenia komórek zwiększonego przez IL-2, oraz ADCC. Jednakże, słaby efekt niszczenia LA-N-5 za pośrednictwem świeżych PBMC w pożywce (bez suplementacji IL-2 in vitro) nie był znacząco większy dnia 8 niż dnia 1.

W przypadku pacjentów 19-33, standardowe badanie NK przeprowadzono 1, 8, 15 i 22 dnia, stosując linię komórkową K562 podatną na NK. Znaczący wzrost lizy NK komórek docelowych K562, podczas badania albo w pożywce albo w obecności IL-2, zaobserwowano dnia 8 i 22 w porównaniu do dnia 1. Próbki surowicy wybranych pacjentów badano także w celu określenia funkcjonalnej aktywności IL-2 oraz funkcjonalnego przeciwciała przeciwko-GD2.

Linia komórkowa Tf-1b podatna na IL-2 wykazała proliferację wywołaną IL-2 w surowicy pacjenta otrzymanej po wlewie hu14.18-IL-2. Postępujący wzrost w proliferacji obserwowano podczas pierwszych czterech godzin po 4-godzinnym wlewie. Wartości powróciły do stanu podstawowego do 16 godzin po tym wlewie, zgodnie z okresem półtrwania dla hu14.18-IL-2 wynoszącego około 4 godziny. Próbki surowicy z tych punktów czasowych badano także na pomocą cytometrii przepływowej na obecność całych immunocytokin hu14.18-IL-2 (IC), które zachowały swój komponent IL-2 oraz swoją aktywność przeciwciała przeciwko-GD2. hu14.18-IL-2 zdolne do wiązania linii komórkowej M21 (GD2 pozytywnej) wykrywano w próbkach surowicy pacjentów po wlewie IC. Ilość IC zdolna do wiązania M21 progresywnie wzrosła podczas 4 godzin po 4-godzinnym wlewie, i zmalała po tym czasie, podobnie zgodnie z okresem półtrwania po około 4 godzinach. W końcu, na wycinkach od pacjentów przeprowadzono badania in vitro w celu określenia czy podawanie hu14.18-IL-2 skutkuje warunkami in vivo takimi, jakie wymagane są, aby osiągnąć ADCC. Komórki PBMC z 8 dnia wskazują na wzmocnienie ADCC na GD2+ docelowych komórkach jeśli hu14.18-IL-2 dodano do badania cytotoksyczności. To samo badanie ADCC przeprowadzono z komórkami PBMC z 8 dnia, jednakże zamiast dodawać hu14.18-IL-2 do badania, dodano surowicę pacjenta, otrzymaną przed lub po podaniu hu14.18-IL-2. PBMC otrzymane od pacjentów dnia 8 kuracji 2 były zdolne do pośrednictwa w wzmożonej aktywności niszczenia linii komórkowej LA-N-5 w obecności surowicy otrzymanej po podaniu hu14.18-IL-2, w porównaniu do tej obserwowanej przed wlewem. Stąd, hu14.18-IL-2 krążące u pacjentów po podaniu IV jest zdolne do ułatwienia ADCC z aktywowanymi PBMC in vivo przez hu14.18-IL-2 od tego samego pacjenta.

Podsumowując, wyniki te wskazują, że zachodzą immunologiczne zmiany związane z terapią tym hu14.18-IL-2 obejmujące wzrost liczby limfocytów, wzrost zawartości procentowej CD16+ i CD56+ PBMC, wzrost lizy NK, oraz wzrost ADCC. Dodatkowe dowody na immunoaktywację obejmują wzrost

PL 211 180 B1 poziomu w surowicy CRP i slL-2R. Analiza laboratoryjna surowicy i PBMC wskazuje, że cząsteczka hu14.18-IL-2 krążąc w surowicy pacjenta po podaniu IV zachowuje swoją zdolność do aktywowania komórek wrażliwych na IL-2 poprzez receptor IL-2 oraz zachowuje swoją zdolność do wiązania komórek nowotworowych GD2 pozytywnych, oraz dostarczenia IL-2 do ich powierzchni, co stwierdzono poprzez przepływową cytometrię. Komórki NK były aktywowane in vivo na podstawie ich zdolności do pośredniczenia w działaniu NK i ADCC in vitro. Ponadto, komórki NK aktywowane in vivo przez hu14.18-IL-2 podawane tym pacjentom były zdolne do pośredniczenia w ADCC wspartym przez hu14.18-IL-2 krążące w surowicy tych samych pacjentów. Zatem, w badaniu tym u wszystkich pacjentów zostały spełnione warunki do osiągnięcia immunoaktywacji.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białko fuzyjne typu hiumanizowane przeciwciało-IL2 oznaczone jako hu14.18-IL2, które specyficznie wiąże GD2 i stymuluje układ odpornościowy, znamienny tym, że zawiera lekki łańcuch o sekwencji SEO ID NO: 5 oraz ciężki łańcuch o sekwencji SEO ID NO: 6.
2. 2. Wektor zawierający sekwencję nukleotydową SEO ID NO: 4 zawierającą sekwencje kwasów nukleinowych, które kodują białko fuzyjne zdefiniowane w zastrz. 1.
3. 3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko fuzyjne zdefiniowane w zastrz. 1 oraz farmaceutyczny nośnik lub zaróbkę.
4. 4. Zastosowanie białka fuzyjnego zdefiniowanego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do stabilizacji postępu choroby u GD2-pozytywnych pacjentów chorych na raka.
5. 5. Zastosowanie białka fuzyjnego zdefiniowanego w zastrz. 1 do wytwarzania leku 1 do zwiększania aktywności ADCC i aktywności lizy NK u GD2-pozytywnych pacjentów chorych na raka.

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.li3t.txt WYKAZ SEKWENCJI <110> Gillies , Stephen D.

   Lo, Kin-Ming <120> Sekwencje immunocytokiny i ich zastosowanie <130> LEX-023 <150> US 60/433,945 <151> 2002-12-17 <160> 6 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

   <223> Humanizowany zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny <400> 1

   Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro 1 ” 5

   Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15

   Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20

   Ser Ser Gin Ser Leu Val His Arg 25 30

   Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp 35 40

   Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45

   Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val 50 55

   Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

   Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70

   Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80

   Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85

   Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 90 95

   Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe 100

   Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 105 110

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.list.txt

   Lys <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Humanizowany zmienny immunoglobuliny <400> 2 Glu Val Gin Leu Val Gin Ser

   Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

   Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

   Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

   Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

   Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

   Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110

   Ser <210> 3 <211> 15 · <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.list.txt <220>

   <223> Sekwencja lacznika <400> 3

   Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 ' <211> 10531 <212 > DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

   <223> wektor zawierający humanizowany lekki i ciężki łańcuch immunoglobuliny i IL-2 <400> 4 gtcgacattg 60 attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 120 ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgsccc 180 ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 240 ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 300 tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 360 tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 420 cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 480 ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 540 aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 600 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta cagaacccac tgcttaactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagaccctc

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.list.txt

   660 tagaatgaag 720 ttgcctgtta ggctgttggt gctgatgttc tggattcctg gtgaggagag agggaagtga 780 gggaggagaa tggacaggga gcaggagcac tgaatcccat tgctcattcc atgtatctgg 840 catgggtgag aagatgggtc ttatcctcca gcatggggcc tctggggtga atacttgtta 900 gagggaggtt ccagatggga acatgtgcta taatgaagat tatgaaatgg atgcctggga 960 tggtctaagt aatgccttag aagtgactag acacttgcaa ttcacttttt ttggtaagaa 1020 gagattttta ggctataaaa aaatgttatg taaaaataaa cgatcacagt tgaaataaaa 1080 aaaaaatata aggatgttca tgaattttgt gtataactat gtatttctct ctcattgttt 114 0 cagcttcctt aagcgacgtg gtgatgaccc agacccccct gtccctgccc gtgacccccg 1200 gcgagcccgc ctccatctcc tgcagatcta gtcagagtct tgtacaccgt aatggaaaca 1260 cctatttaca ttggtacctg cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg attcacaaag 1320 tttccaaccg attttctggg gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt 1380 tcacactcaa gatcagcaga gtggaggctg aggatctggg agtttatttc tgttctcaaa 1440 gtacacatgt tcctccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgtatta 1500 gtgtgtcagg gtttcacaag agggactaaa gacatgtcag ctatgtgtga ctaatqqtaa 1560 tgtcactaag ctgcgggatc ccgcaattct aaactctgag ggggtcggat gacgtggcca 1620 ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa gccctcagaa 1680 tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag

   PL 211 180 B1 P02256 BZ seq.list.txt ggggaaccta 1740 ggaagaaact Ca3S,3CSCC3. agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg ctataattat 1800 ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta tccgcaaaca 1860 acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc tttcctcagg 1920 aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt taaaatctgg 1980 aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg 2040 gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 2100 caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 2160 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag 2220 cttcaacagg ggagagtgtt sgagggagaa gtgcccccac ctgctcctca gttccagcct 2280 gaccccctcc catcctttgg cctctgaccc tttttccaca ggggacctac ccctattqcg 2340 gtcctccagc tcatctttca cctcaccccc ctcctcctcc ttggct ćtaa ttatgctaat 2400 gttggaggag aatgaataaa taaagtgaat ctttgcacct gtggtttctc tctttcctca 2460 atttaataat tattatctgt tgtttaccaa ctactcaatt tctcttataa gggactaaat 2520 atgtagtcat cctaaggcgc ataaccattt ataaaaatca tccttcattc tattttaccc 2580 tatcatcctc tgcaagacag tcctccctca aacccacaag ccttctgtcc tcacagtccc 2640 ctgggccatg gtaggagaga cttgcttcct tgttttcccc tcctcagcaa gccctcatag tcctttttaa gggtgacagg tcttacggtc atatatcctt tgattcaatt

   2700

   PL 211 180 B1 ccctgggaat 2760 caaccaaggc P02256 BZ seq.list.txt acicttLtttca aaagaagaaa cctgctataa agagaaLcat tcattgcaac 2820 atgatataaa ataacaacac aataaaagca attaaataaa caaacaatag ggaaatgttt 2880 aagttcatca tggtacttag acttaatgga atgtcatgcc ttatttacat ttttaaacag 2940 gtactgaggg actcctgtct gccaagggcc gtattgagta ctttccacaa cctaatttaa 3000 tccacactat actgtgagat taaaaacatt cattaaaatg ttgcaaaggt tctataaagc 3060 tgagagacaa atatattcta taactcagca atcccacttc tagggtcgat cgacgttgac 3120 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 3180 atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gccfcggctga ccgcccaacg 3240 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 3300 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 3360 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 3420 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 3480 tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 3540 ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 3600 accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgc 3660 gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta actacagaac 3 72 0 ccactgctta act.ggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctcct cgaggctaga atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.Iist.txt

   3780 ttcctggtga 3840 ggagagaggg aagtgaggga ggagaatgga cagggagcag gagcactgaa tcccattgct 3900 cattccatgt atctggcatg ggtgagaaga tgggtcttat cctccagcat ggggcctctg 3960 gggtgaatac ttgttagagg gaggttccag atgggaacat gtgctataat gaagattatg 4020 aaatggatgc ctgggatggt ctaagtaatg ccttagaagt gactagacac ttgcaattca 4080 ctttttttgg taagaagaga tttttaggct ataaaaaaat gttatgtaaa aataaacgat 4140 cacagttgaa ataaaaaaaa aatataagga tgttcatgaa ttttgtgtat aactatgtat 4200 ttctctctca ttgtttcagc ttccttaagc gaggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag 4260 gtggagaagc ccggcgcctc cgtgaagatc tcctgcaagg cctccggctc ctccttcacc 4320 ggctacaaca tgaactgggt gcgccagaac atcggcaagt ccctggagtg gatcggcgcc 4380 atcgacccct actacggcgg cacctcctac aaccagaagt tcaagggccg cgccaccctg 4440 accgtggaca agtccacctc caccgcctac atgcacctga agtccctgcg ctccgaggac 4500 accgccgtgt actactgcgt gtccggcatg gagtactggg gccagggcac ctccgtgacc 4560 gtgtcctccg gtaagctttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt ggggcaggga 462 0 gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc atgagcccag 4680 acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg ccctgggccc 4740 agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc accaaaggcc 4800 catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 BZ seq.iist.txt gcggccctgg 4860 gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 4920 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca 4980 gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 5040 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag 5100 ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc cggctatgca 5160 gtcccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccagag gcctctgccc 5220 gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct gggcaggcac 5280 aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg gctcagacct 5340 gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca aaggccaaac 5400 tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac tcccaatctt 5460 ctctctgcag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccaggtaag 5520 ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc 5580 cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct cagcacctga 5640 actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat 5700 ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 5760 caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga 5820 ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc

   PL 211 180 B1 accaggactg 5880 gctgaatggc P02256 BZ aaggagtaca seq.list.txt agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga 5940 gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac atggacagag 6000 gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct gtccctacag 6060 ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc acgggaggag atgaccaaga 6120 accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 6180 gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 6240 acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 6300 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 6360 tctccctgtc cccgggtaaa gccccaactt caagttctac aaagaaaaca cagctgcaac 6420 tggagcatct cctgctggat ctccagatga ttctgaatgg aattaacaac tacaagaatc 6480 ccaaactcac caggatgctc acattcaagt tctacatgcc caagaaggcc acagagctca 6540 aacatctcca gtgtctagag gaggaactca aacctctgga ggaagtgcta aacctcgctc 6600 agagcaaaaa cttccactta agacctaggg acttaatcag caatatcaac gtaataąttc 6660 tggaactaaa gggatccgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca 6720 ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactaactt 6780 gataattaag tgctcgaggg atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 6840 cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca

   PL 211 180 B1 6900 P02256 BZ seq.list.txt ttcattttat 6960 gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt ttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 7020 tggtatggct gattatgatc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 7080 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 7140 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 7200 cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 7260 gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 7320 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 7380 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 7440 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 7500 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 7560 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 7620 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 7680 cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ~ 7740 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tącgccttat 7800 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 7860 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 7920 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 BZ seq.list.txt ctgctgaagc 7980 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 8040 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 8100 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 8160 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 8220 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 8280 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 8340 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 8400 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 8460 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 8520 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 8580 ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 8640 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 8700 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 8760 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 8820 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgc.ccggcgt 8880 ' caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attqqaaaac 8940 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt

   PL 211 180 B1 tcgatgtaac 9000 ccactcgtgc P02256 BZ acccaactga seq.list.txt tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 9060 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 9120 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 9180 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 9240 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 9300 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattccg atccagaca;

   gataagatac 9360 attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 9420 atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac 9480 aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 9540 aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc taaagccagc aaaagtccca 9600 tggtcttata aaaatgcata gctttcggag gggagcagag aacttgaaag catcttcctg 9660 ttagtctttc ttctcgtaga ccttaaattc atacttgatt cctttttcct cctggacctc 9720 agagaggacg cctgggtatt ctgggagaag tttatatttc cccaaatcaa tttctgggaa 9780 aaacgtgtca ctttcaaatt cctgcatgat ccttgtcaca aagagtctga ggtggcctgg 9840 ttgattcatg gcttcctggt aaacagaact gcctccgact afcccaaacca tgtctacttt 9900 acttgccaat tccggttgtt caataagtct taaggcatca tccaaacttt tgccaaaaaa 9960 atgagctcct cgtggtggtt ctttgagttc tctactgaga actatattaa ttctgtcctt taaaggtcga ttcttctcag gaatggagaa ccaggttttc ctacccataa

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 BZ seq.list.txt

   10020 tcaccagatt 10 0 S 0 ctgtttacct tccactgaag aggttgtggt cattctttgg aagtacttga actcgttcct 10140 gagcggaggc cagggtcggt ctccgttctt gccaatcccc atattttggg acacggcgac 10200 gatgcagttc aatggtcgaa ccatgagggc accaagctag ctttttgcaa aagcctaggc 10260 ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg gcctcggcct 10320 ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa ctgggcggag 103S0 ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa ttgagatgca 10440 tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg gttgctgact 10500 tttccacacc aattgagatg ctaactgaca catgctttgc cacattccac atacttctgc a ctgctgggga gcctggggac

   10531 <210> 5 <211> 220 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

   <223 > Humanizowany lekki łańcuch immunoglobuliny <400> 5

   Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

   1 5 10 ' 15

   Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Arg 20 25 30

   Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 . 40 45

   PL 211 180 B1

   Ρ02256 ΒΖ seq.list.txt

   Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

   50 55 60

   Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

   Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95

   Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 10C 105 110

   Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125

   Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140

   Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160

   Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175

   Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190

   Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205

   Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 6 ' <211> 575 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

   <223> Humanizowany ciężki łańcuch immunoglobuliny i IL-2

   PL 211 180 B1

   PL 211 180 B1

   Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

   210 215 220

   Ρ02256 BZ seq.list.txt

   Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240

   Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255

   Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270

   Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285

   Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300

   Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320

   Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335

   Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350

   Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365

   Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 370 375 380

   Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400

   Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415

   PL 211 180 B1

   Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

   420 425 430

   Ρ02256 BZ seq.list.txt

   Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser 435 440 445

   Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 450 455 460

   Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg 465 470 475 480

   Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 485 490 495

   His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 500 505 510

   Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile 515 520 525

   Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 530 535 540

   Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu 545 550 555 560

   Asn Arg Trp' Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 565 570 575

   PL 211 180 B1

   Humanizowany zmienny region lekkiego łańcucha immunoglobuliny

   Rysunki

   PL 211 180 B1

   Humanizowany zmienny region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny

   PL 211 180 B1

   Sekwencja nukleotydowa wektora ekspresji

   GTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT

   ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC

   GCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTC

   AATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTA

   CGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTAT

   GGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTnTG

   GCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGA

   CGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGC

   CCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGC

   TAACTACAGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTC

   TAGAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGGTGAGGAGAGAGGGAA

   GTGAGGGAGGAGAATGGACAGGGAGCAGGAGCACTGAATCCCATTGCTCATTCCATGTATCTGGC

   ATGGGTGAGAAGATGGGTCTTATCCTCCAGCATGGGGCCTCTGGGGTGAATACTTGTTAGAGGGA

   GGTTCCAGATGGGAACATGTGCTATAATGAAGATTATGAAATGGATGCCTGGGATGGTCTAAGTA

   ATGCCITAGAAGTGACTAGACACTTGCAATTCACTTTTTTTGGTAAGAAGAGATTTTTAGGCTATA

   AAAAAATGTTATGTAAAAAIAAACGATCACAGTTGAAATAAAAAAAAAATATAAGGATGTTCATG

   AATTTTGTGTATAACTATGTATTTCTCTCTCATTGTTTCAGCTTCCTTAAGCGACGTGGTGATGACC

   CAGACCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACCCCCGGCGAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAG

   AGTCTTGTACACCGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCA

   AAGCTCCTGATTCACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGA

   TCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGT

   TCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTATT

   AGTGTGTCAGGGTTTCACAAGAGGGACTAAAGACATGTCAGCTATGTGTGACTAATGGTAATGTC

   ACTAAGCTGCGGGATCCCGCAATTCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCT

   AAAGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCT

   CCAACAAAACAATTTAGAACTTTATTAAGGAATAGGGGGAAGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCA

   AGATTTTAAATACGCITCITGGTCIGCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCT

   GTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAAC

   ACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG

   ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG

   CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG

   CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG

   AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC

   TTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCC