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CN102946858B - 含有免疫球蛋白Fc的多肽的液体制剂 - Google Patents

含有免疫球蛋白Fc的多肽的液体制剂 Download PDF

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CN102946858B CN201180031464.3A CN201180031464A CN102946858B CN 102946858 B CN102946858 B CN 102946858B CN 201180031464 A CN201180031464 A CN 201180031464A CN 102946858 B CN102946858 B CN 102946858B
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Abstract

本发明涉及一种液体多肽制剂，该多肽含有免疫球蛋白Fc结构域，该液体制剂被稳定化以便维持含有Fc结构域的多肽的活性持续延长的时期。

Description

含有免疫球蛋白Fc的多肽的液体制剂
发明领域
本发明涉及一种包含TNFR:Fc的水性制剂、该组合物的制造方法、给药方法以及含有该组合物的试剂盒。
发明背景
肿瘤坏死因子是一种涉及炎症和急性期反应的多肽细胞因子。TNF-α大量存在于患有类风湿性关节炎或克罗恩病的人中。通过生物制剂进行TNF-α的直接抑制在类风湿性关节炎的治疗中已经取得显著进步，并且这种促炎细胞因子的细胞外抑制已经被确认为一种有效的治疗。一种这样的生物制剂是依那西普。
依那西普(TNFR:Fc)是一种二聚体融合蛋白，该二聚体融合蛋白由连接到人IgG1的Fc部分的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成。依那西普的Fc组分由CH2结构域、CH3结构域以及铰链区组成，而CH1结构域是缺乏的。它是在中国仓鼠卵巢哺乳动物细胞表达系统中通过重组DNA技术产生的。它由934个氨基酸组成，并且具有大致150千道尔顿的表观分子量。
通常，蛋白质具有非常短的半寿期，并且在暴露于各种因素(如不适宜温度、水-气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染)之后经历变性(如聚集、解离和吸附在容器表面)。因此，变性蛋白失去内在的理化性质和生理活性。蛋白质的变性通常是不可逆的，因此蛋白质一旦变性，它们的天然性质可能不会恢复到初始状态。
在生物制药行业中，使用重组DNA技术制备的蛋白质在水性制剂中的长期储存通常是一项困难的任务。为了克服水性制剂中的蛋白质的稳定性问题，通过冻干(冷冻干燥)制备了更加稳定的治疗性蛋白产品。冻干产品通常伴随有用于复原的无菌水性介质。在复原之后，这些制剂典型地具有短的有效贮存寿命，即使在低温(例如，5℃)下保存时也是如此。在市场上可得到的呈冻干形式的TNF-α抑制剂的实例包括和 并且这两种组合物应当在使用之前复原。
提高多肽稳定性的典型实践可以通过改变制剂中的要素的浓度来解决，或者通过添加赋形剂来改变该制剂。
US5580856公开了通过在干燥蛋白质再水合时添加一种复原稳定剂来稳定制剂中干的燥蛋白质以防生物活性的损失。在此还描述了一种用于通过将该干燥组合物溶解于一种包含该复原稳定剂的溶剂中来生产一种制剂的试剂盒。
US6171586公开了一种稳定的水性药物制剂，该药物制剂包括未经事先冻干的治疗有效量的一种抗体、将pH保持在大约4.5到大约6.0的范围内一种缓冲剂、一种表面活性剂以及一种多元醇，同时还公开了这种制剂的用途。
EP1314437涉及一种稳定化的制剂的发明，该稳定化的制剂含有在甘氨酸缓冲剂和/或组氨酸缓冲剂中的一种抗体，同时还提供了一种含蛋白质的稳定化的制剂的制备方法，这些方法包括用一种碱性氨基酸或一种碱性氨基酸衍生物或它们的一种盐来调节pH。
EP1478394公开了以下发明，该发明涉及含有一种免疫球蛋白的Fc结构域的多肽的适合于长期储存的一种水性药物组合物、制造方法、给药方法以及包含该组合物的试剂盒。
因此，令人希望的是提供在冷藏下具有增强的稳定性并且在正常室温下具有至少中等的稳定性的TNFR:Fc的液体制剂，从而避免来自复原程序的不便和错误的可能性。
发明概述
本发明提供了一种包含TNFR:Fc的新颖的液体制剂，它在4℃和室温下呈现出长期稳定性。
在一个方面，本发明提供了一种由含有免疫球蛋白的Fc结构域的多肽以及聚集抑制剂组成的制剂，其中该聚集抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸以及赖氨酸。
在另一个方面，该制剂包含一种含有免疫球蛋白的Fc结构域的多肽、聚集抑制剂、缓冲剂、非离子型表面活性剂、多元醇、稳定剂、渗透压调节剂(tonicity modifier)、以及螯合剂。
这种新颖的制剂的缓冲系统选自下组，该组由以下各项组成：磷酸钠、组氨酸、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、马来酸、乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷(tris)、乙酸盐以及二乙醇胺或它们的组合。
在又另一个方面，该制剂包括选自下组的非离子型表面活性剂，该组由以下各项组成：基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂以及基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂或它们的组合。
该制剂的多元醇进一步选自下组，该组由以下各项组成：蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇以及山梨醇或它们的组合。
该制剂的稳定剂选自下组，该组由以下各项组成：EDTA(乙二胺四乙酸)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)以及柠檬酸或它们的组合。
此外，该制剂提供了一种选自下组的渗透压调节剂，该组由以下各项组成：氯化钠、氯化钾、硫酸钠或者它们的组合。
在另一个方面，本发明提供了一种含有免疫球蛋白的Fc结构域的多肽，该免疫球蛋白选自下组，该组由以下各项组成：单克隆抗体、融合蛋白以及TNFR:Fc。
本发明的制剂包含TNFR:Fc，还包含天冬氨酸、磷酸钠-磷酸钾缓冲剂、赖氨酸、氯化钠、蔗糖、聚山梨酯20以及乙二胺四乙酸二钠，其中TNFR:Fc是以10mg/ml到100mg/ml的浓度存在。
附图简要说明 
图1a(非还原)以及图1b(还原)显示了在零天时在40℃下保存的具有不同的聚集抑制剂的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：参照药用产品
条带2：如在表1中给出的F-1
条带3：如在表1中给出的F-2
条带4：如在表1中给出的F-3
条带5：如在表1中给出的F-4
图2a(非还原)以及图2b(还原)显示了在40℃下保存1个月的具有不同的聚集抑制剂的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：参照药用产品
条带2：如在表1中给出的F-1
条带3：如在表1中给出的F-2
条带4：如在表1中给出的F-3
条带5：如在表1中给出的F-4
图3a(非还原)以及图3b(还原)显示了在47℃下保存16小时的具有不同的聚集抑制剂的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：参照药用产品
条带2：如在表1中给出的F-3
条带3：如在表1中给出的F-1
条带4：标记
图4显示了在55℃下保存24小时的具有不同的聚集抑制剂的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：参照药用产品
条带2：如在表1中给出的F-3
条带3：如在表1中给出的F-1
条带4：标记
图5a(非还原)以及图5b(还原)显示了在40℃下保存7天的具有作为稳定剂的赖氨酸的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：参照药用产品
条带2：如在表1中给出的F-5
条带3：如在表1中给出的F-3
条带4：标记
图6a(非还原)以及图6b(还原)显示了用于检查EDTA的影响的在零天时在40℃下保存的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：没有EDTA
条带2：有EDTA
条带3：标记
图7a(非还原)以及图7b(还原)显示了在40℃下保存3天的依那西普制剂的降解模式的比较。
条带1：没有EDTA
条带2：有EDTA
条带3：标记
图8a、图8b以及图8c显示了具有不同的缓冲剂和它们的盐的依那西普制剂的DSC特征曲线。
图9显示了多种制剂的比较过渡中点(comparative transitionmidpoint)(F6到F8)。
图10显示了最终配制的体积以及RMP的比较生物活性
图11显示了在F6、F8以及RMP中经由SE＝HPLC的比较降解。
图12显示了在-20℃下保存3个月的F8和RMP的比较HIC特征曲线
图13显示了在5±3℃下保存3个月的F8和RMP的比较HIC特征曲线
图14显示了在25±2℃下保存3个月的F8和RMP的比较HIC特征曲线
图15显示了在40℃下保存3个月的F8和RMP的比较HIC特征曲线
本发明的说明 
本发明的药物制剂包括一种纯化的多肽、缓冲剂、聚集抑制剂、渗透压调节剂、稳定剂、表面活性剂、螯合剂、以及任选地防腐剂，它们呈适当的组合。
针对治疗用途，单克隆抗体以高浓度使用，并且已知高浓度的蛋白质会增加聚集。在一个方面，在制剂组合物中需要聚集抑制剂来使产品保 持在天然状态并且是具有生物活性的，具有延长的保质期和增强的储存条件。存在着几种通过增加表面张力、优先结合或水合以及优先相互作用而充当聚集抑制剂的氨基酸。
聚集抑制剂降低多肽的形成聚集体的趋向。氨基酸(如天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸以及赖氨酸)长时间地减少制剂中的含有Fc结构域的多肽的聚集并且是本发明的优先实施方案。
在另一个方面，需要缓冲剂来维持制剂的pH值。本发明的缓冲系统包括磷酸缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、丁二酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、氨基酸类、以及Tris缓冲剂，它们单独地或者以适当的组合而使用，提供所希望的从5.5到7.5范围的pH值。
在本发明中，表面活性剂用来防止TNFR:Fc吸附在小瓶、安瓿瓶、圆柱状管(carpoule)、药筒、或注射器的表面上。表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力，从而防止其吸附或聚集在一个疏水表面上。本发明的优选表面活性剂包括基于聚山梨酯的非离子型表面活性剂、聚氧乙烯共聚物、以及聚乙烯基吡咯烷酮，它们单独地或组合使用。
在一个实施方案中，在本发明中使用的稳定剂选自下组，该组由以下各项组成：氨基酸类，如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸，等等以及其他们的盐，它们单独地或组合使用；单糖，如葡萄糖和甘露糖 以及它们的类似物，它们单独地或组合使用；二糖类，如蔗糖、海藻糖、麦芽糖和它们的类似物，它们单独地或组合使用；糖醇类，如甘露糖醇、山梨糖醇以及它们的类似物，它们单独地或组合使用；以及多糖类，如葡聚糖、聚乙二醇以及它们的类似物，它们单独地或组合使用。
渗透压调节剂被理解为是一种促成溶液的克分子渗透压浓度的分子。优选地，一种药物组合物的克分子渗透压浓度被调节以便最大限度地提高活性成分的稳定性，同时也将给药时患者的不适降低至最低限度。适用于改变克分子渗透压浓度的渗透压调节剂的实施例包括，但不限于，氨基酸(精氨酸、半胱氨酸、组氨酸，等等)、盐类(氯化钠、氯化钾、氯化钙等)、和/或糖类(蔗糖、葡萄糖、甘露醇以及它们的类似物)。
依那西普在储存过程中倾向于片段化，所以需要一些片段化抑制剂来制造针对依那西普的最佳制剂组合物。已知对防止在许多产品(如干扰素、阿仑单抗，等等)中的片段化有影响的EDTA被用于本制剂中。
螯合剂稳定或防止自由金属离子与感兴趣的蛋白质反应。可以用于本发明中的螯合剂的实例包括，但不限于，EDTA(乙二胺四乙酸)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、DTPA(乙二烯三胺五乙酸)以及柠檬酸。
防腐剂是指添加到制剂中作为一种抑菌剂的组合物或物质。优选地，本发明的含有保藏的TNFR:Fc的制剂符合防腐剂效果的法定或监管准则，以作为一种商业上可行的多用途产品，优选的是用于人类。本发明中使用的防腐剂选自下组，该组由以下各项组成：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、烷基对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，等等)、苄索氯铵、脱氢乙酸钠或硫柳汞，它们单独地或组合使用。然而，在本发明中，防腐剂的使用是任选的，并且在设计多剂量制剂时是优选的。
在本发明中所描述的TNFR:Fc的新颖的、耐热的水性制剂具有以下优点；
1.涉及聚集抑制剂的使用，防止融合蛋白在长期储存过程中的聚集。
2.涉及一种稳定剂的使用，防止在长期储存过程中不希望的裂解。
3.为该水性制剂提供了更好的稳定性以便长时期地维持它的活性，从而保证合理的保质期。
4.即使在高温下也为该水性制剂提供了更好的稳定性。
以下实例展示了在本发明中描述的药物组合物以及进行本发明以获得稳定的TNFR:Fc的水性药物制剂的方式。这些实例绝不应当被解释为对本发明的范围的限制。
实例1
聚集抑制剂的筛选和选择
在40℃下筛选聚集抑制剂
研究了具有不同的聚集抑制剂(如赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和脯氨酸)的依那西普制剂。这些制剂还含有其他的按照在表1中所给出的详情的赋形剂。样品和RMP在40℃下孵育一个月，然后通过SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE被用作一种分析技术，可以根据分子量从天然蛋白质中分离出游离的和高分子量的种类。由于在高浓度的单克隆抗体和融合蛋白的情况下具有高的聚集倾向，非还原SDS-PAGE被用来评定共价聚集体。由于在融合蛋白以及单克隆抗体中存在许多二硫键，在还原SDS-PAGE下检查蛋白质的片段化。
不同制剂的SDS-PAGE凝胶(图1a、1b、2a以及2b)显示了在40℃下储存一个月后依那西普的聚集和片段化。
表1：聚集抑制剂的鉴定
发现就聚集和片段化而言F2和F4具有更多的降解，但是就针对F1和F3所观察到的聚集体和片段而言没有重大差异。由于在此温度下没有观察到杂质的显著性差异，在较高的温度下进一步研究这两个制剂(F1和F3)来增加降解动力学以及降解物。
在47℃和55℃下聚集抑制剂的筛选
为了在天冬氨酸(F1)和甘氨酸(F3)之间找出最佳的聚集抑制剂，使这两个制剂均在47℃以及55℃下带电。结果表明与天冬氨酸(F1)相比，甘氨酸(F3)在两种测试温度下(即在47℃下16h(图3a和图3b)以及在55℃下24h(图4))就聚集和片段化而言显示出更高的降解。含有甘氨酸的制剂在47℃下16h的还原条件下同样显示出一个额外的片段带(图3b)。
天冬氨酸被证明在所有温度下对于防止聚集以及片段化是有效的，与参照药用产品(RMP)相比没有任何额外的带出现。在含有甘氨酸的制剂中观察到的额外的带可能是引起免疫原性的原因。
赋形剂的组合(赖氨酸+天冬氨酸)
为了维持含有天冬氨酸(在如上所看到的被证明在所有温度下都是有效的)的F3制剂的pH，添加了赖氨酸缓冲剂。赖氨酸和天冬氨酸都以10mM的浓度被使用，因为预期这些氨基酸在等摩尔浓度下具有较高的稳定性。该制剂组合物在表1a中提及：
表1aF5的制剂
如图5a和5b所示，与不含赖氨酸的制剂(F3)相比，含有赖氨酸与天冬氨酸组合的制剂显示出较少的裂解。
实例2
EDTA的作用
检查了EDTA在F3制剂中的作用(在40℃下持续3天)，并且通过SE-HPLC进行分析，用尺寸排阻色谱法分离蛋白质及其有关杂质(基于它们的尺寸)。这一技术对于检测依那西普的聚集和片段化是有用的，并且结果在下面的表2中给出。
SDS PAGE同样被用来比较聚集体和片段类型。(图5a、5b、6a和6b)
表2：显示出EDTA影响的制剂的SE-HPLC结果
尤其是就片段而言，按照SE-HPLC结果，与没有EDTA的制剂相比，发现F3具有较低的降解率。
通过SDS PAGE，发现F3在样品于40℃下暴露3天之后具有较少量的低分子量带。因此，EDTA在防止依那西普的片段化中起重要作用。
实例3
缓冲剂的作用 
如在表3(F6和F7)中给出的具有磷酸盐缓冲剂和组氨酸缓冲剂的依那西普制剂在50℃下带电2天，然后通过SE-HPLC和差示扫描量热法(DSC)进行分析。DSC是用于测定蛋白质的热力学稳定性的一种技术。依那西普有三个过渡，Tm 1相应于TNFR，Tm 2相应于Fc部分的 CH2结构域并且Tm 3相应于Fc部分的CH3结构域(较高的Tm表示较高的稳定性)。
表3：缓冲剂成分的鉴定
表4：缓冲剂成分鉴定的SE-HPLC结果
制剂号 聚集体％ 片段％ 纯度％
F6-0天 1.4 0 98.6
F7-0天 1.6 0.1 98.3
F6-2天 12.5 0 87.5
F7-2天 21.6 0 78.4
按照SE-HPLC结果，与含有组氨酸缓冲剂的制剂相比，具有作为缓冲剂的磷酸盐缓冲剂的组合物具有高纯度以及较少的聚集体。
按照DSC分析，磷酸盐缓冲剂的第一和第二过渡峰的过渡中点分别比组氨酸缓冲剂制剂分别高大约1℃和2℃。在两种缓冲剂中的第三个过渡峰的中点几乎是相似的。
由于与组氨酸缓冲剂相比，观察到磷酸盐缓冲剂具有较低的降解率(如SE-HPLC结果所证明的)以及高的热力学稳定性(通过DSC分析证明的)，磷酸盐缓冲剂被优选地作为适合的缓冲系统。
实例4
缓冲盐的鉴定 
从缓冲盐(钠和钾)中筛选出在稳定性方面最适合的候选物。
针对所希望的蛋白质的稳定性，使用了与其盐(即钠、钾)组合的磷酸盐缓冲剂。表5总结了用于选择最好的制剂候选物的组合集。
表5：组合缓冲盐及其浓度的鉴定
序号 成分： F6 F8
1 蔗糖 20mg 20mg
2 赖氨酸一水合物 10mM 10mM
3 天冬氨酸 10mM 10mM
4 氯化钠 100mM 100mM
5 聚山梨酯20 0.2mg 0.2mg
6 EDTA二钠 1mM 1mM
7 磷酸二氢钠 11mM 11mM
8 磷酸氢二钠 13mM  -  
9 磷酸氢二钾  -   19mM
用DSC方法鉴定来组合物的热力学稳定性。通过SE-HPLC方法评定了在储存过程中的聚集和片段化。结果报告于表6和表7中。
表6：选择的组合的实验性DSC结果
序号 制剂 Tm1 Tm2 Tm3
1 RMP 57.5 70.4 82.3
2 F6 57.7 70.1 82.7
3 F8 58.3 70.1 82.3
表7：缓冲盐优化的SE-HPLC结果
按照SE-HPLC结果，与含有钠盐的制剂相比，具有钾盐的组合物具有高纯度。
按照DSC分析，钾盐的第一过渡峰的过渡中点只比钠盐组合物的第一过渡峰的过渡中点高大约1℃。在这两种盐中，第二和第三过渡峰的中点几乎是相似的。
由于与单独的钠盐相比，观察到钠-钾盐组合具有较低的降解率(如SE-HPLC结果所证明的)以及高热力学稳定性(通过DSC分析所证明的)，钠-钾盐组合被优选地作为适合的缓冲系统。
实例5
具有聚集抑制剂L-天冬氨酸和赖氨酸的TNFR:Fc融合蛋白的制备
除了聚山梨酯20外，在表8中给出的所有组分均溶解在80％的水中，并且通过连续搅拌将它们充分地混合。在该溶液中加入聚山梨酯20，使最终浓度为0.2mg/ml。用水将制剂缓冲剂的体积调到90％。用任何适合的酸/碱将pH值调节到6.3，并且用水将体积补足到100％。将该制剂缓冲剂过滤，并用这个过滤过的制剂缓冲剂将依那西普体积稀释成所需的浓度。在-20℃、5±3℃和25±2℃下储存1、2以及3个月之后，在零时间通过SE-HPLC、SDS-PAGE以及HIC分析依那西普制剂。HIC基于疏水性来分离蛋白质。HIC中的峰1确定片段，峰2相应于依那西普的活性二聚体，并且峰3相应于聚集体。在一些情况下观察到的前峰1相应于截短杂质(truncated impurities)。
还检查了样品的生物活性。该方法是基于细胞毒性效应的中和原理。TNF-α对L929(小鼠结缔组织)细胞系产生细胞毒性效应。TNFR:Fc以一种剂量依赖的方式特异性地中和TNF-α的细胞毒活性。RMP的生物活性为每毫克170万单位。这些结果报告于表9中。
如上所述，通过向纯化的多肽添加聚集抑制剂来制备本发明的药物制剂。此外，必要时可以添加一种缓冲剂、渗透压调节剂、表面活性剂、片段化抑制剂以及一种另外的赋形剂。任何本领域的普通技术人员将会理解的是，将被包括在组合物中的各种组分的组合可以以任何适当的顺序来完成，即，可以首先添加、在中间添加或在最后添加缓冲剂，并且也以可首先添加、在中间添加或在最后添加渗透压调节剂。同样，本领域的普通 技术人员将会理解的是，在某些组合中这些化学物质中的一些是不相容的，并且因此，它们可以容易地被具有相似性质但在有关混合物中是相容的不同的化学物质取代。
表8
序号 成分 浓度
1. TNFR:Fc 50.0mg/ml
2. 磷酸二氢钠 1.5mg/ml
3. 磷酸氢二钾 3.3mg/ml
4. 赖氨酸 1.5mg/ml
5. 氯化钠 5.8mg/ml
6. 聚山梨酯20 0.1mg/ml
7. 蔗糖 20mg/ml
8. 天冬氨酸 1.3mg/ml
9. EDTA二钠 0.37mg/ml
a)TNFR:Fc水性制剂的稳定性试验
这些生物学检验按照欧洲药典的规范进行。
·SDS PAGE【聚集(非还原)和片段化(还原)】
由于在高浓度的单克隆抗体和融合蛋白的情况下具有高的聚集倾向，非还原SDS-PAGE被用来评定共价聚集体。由于TNFR通过二硫键结合到Fc的铰链区并且因为在Fc和TNFR中存在许多二硫键，在还原SDS PAGE下检查蛋白质的片段化。
·SE-HPLC(聚集和片段化)
用尺寸排阻色谱法分离蛋白质及其有关杂质(基于它们的尺寸)，上述技术对于检测依那西普的聚集和片段化是有用的。
·HIC(聚集、片段化、截短和错折叠)
HIC基于疏水性来分离蛋白质。HIC中的峰1确定片段，峰2相应于依那西普的活性二聚体，并且峰3相应于聚集体。在一些情况下观察到的前峰1相应于截短杂质。在图12(在-20℃下3个月之后)、图13(在5±3℃下3个月之后)、图14(在25±2℃下3个月之后)中给出了定义峰1、峰2以及峰3的HIC的参考特征曲线。
·差示扫描量热法(DSC)
DSC是一种用来测定蛋白质的热力学稳定性的技术。依那西普具有三个过渡，并且图9表示Tm 1相应于TNFR，Tm 2相应于Fc部分的CH2结构域并且Tm 3相应于Fc部分的CH3结构域(较高的Tm决定了较高的稳定性)。
·体外生物测定(生物活性)
该方法是基于细胞毒性效应的中和原理。TNF-α对L929(小鼠结缔组织)细胞系产生细胞毒性效应。TNFR:Fc以一种剂量依赖的方式特异性地中和TNF-α的细胞毒活性(图10)。RMP的生物活性为每毫克170万单位。
关于水性制剂的稳定性的方面收集在表9中。
实例6
在40°C下TNFR:Fc液体制剂的稳定性试验
制备了包含具有在表8中给出的组成的依那西普的液体制剂。配制的溶液在空气层流下用0.2μm过滤器灭菌并在40℃下储存1个月。在40℃下储存零时间、7天、15天、21天和1个月之后通过SE-HPLC、SDS-PAGE和HIC（图15）分析该制剂并且检查其生物活性。结果报告于表10中。
表10：依那西普制剂的稳定性试验结果
实例7
在50°C下TNFR:Fc液体制剂的稳定性试验
制备了包含具有在表8中给出的组成的依那西普的液体制剂。配制的溶液在空气层流下用0.2μm过滤器灭菌并且在50℃下储存3天。在零时间以及在50℃下储存2天和3天之后通过SE-HPLC、SDS-PAGE和HIC分析该制剂。结果报告于表11中。
表11：依那西普制剂的稳定性试验的结果(50℃)
使用适合的缓冲剂、聚集抑制剂、渗透压调节剂、稳定剂、表面活性剂、螯合剂的组合(并且任选地在它们的适当的组合中具有防腐剂)来备制这些新颖的融合蛋白制剂。
通过所述发明制备的制剂包含有效量的生物活性TNFR:FC，其被用于治疗人的炎性疾病。它们优选地作为注射用水性溶液而被使用。

Claims (3)

1.一种依那西普的水性、耐热的药物制剂，包括天冬氨酸、钠-钾磷酸盐缓冲剂、赖氨酸、氯化钠、蔗糖、聚山梨酯20以及乙二胺四乙酸二钠，其中依那西普以10mg/ml到100mg/ml的浓度存在。
2.如权利要求1所述的水性、耐热的药物制剂，包含25mg/ml到50mg/ml的依那西普、1mM到50mM的天冬氨酸、1mM到50mM的赖氨酸、10mM到50mM的磷酸钠-磷酸钾、0.75％到3％的蔗糖、50mM到150mM的NaCl、0.1mM到2mM的EDTA、0.05mg/ml到1.0mg/ml的聚山梨酯20，pH为6.0到7.0。
3.如权利要求1所述的水性、耐热的药物制剂，包含50mg/ml的依那西普、1.3mg/ml的天冬氨酸、1.5mg/ml的赖氨酸、1.5mg/ml的磷酸二氢钠、3.3mg/ml的磷酸氢二钾、20mg/ml的蔗糖、5.8mg/ml的NaCl、0.37mg/ml的EDTA二钠、0.1mg/ml的聚山梨酯20，pH为6.3。
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