ES2590912T3 - Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión heterodimérica que comprende una primera y una segunda cadena quimérica unida por un enlace disulfuro, comprendiendo cada cadena quimérica una subunidad p35 o p40 de la citoquina heterodimérica IL- 12 unida por un enlace peptídico a una porción de una cadena pesada de Ig, estando la subunidad de una de las cadenas heterodiméricas unida además por un enlace disulfuro a la subunidad diferente de la citoquina heterodimérica, en donde la subunidad de una de las cadenas heterodiméricas, unida a la cadena pesada de Ig mediante un enlace peptídico, es p35.

Description

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DESCRIPCION

Protelnas de fusion heterodimericas utiles para inmunoterapia dirigida y estimulacion general del sistema inmunitario Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a protelnas de fusion. Mas especlficamente, la presente invencion se refiere a protelnas de fusion heterodimericas utiles para la terapia inmune dirigida y estimulacion general del sistema inmunitario.

Antecedentes de la invencion

Uno de los reguladores inmunitarios clave es la celula auxiliar T que reacciona a los antlgenos presentados en moleculas HLA de clase II. Esta celula CD4+ se diferencia en respuesta a la estimulacion antigenica y se convierte en un auxiliar de tipo 1 o tipo 2 (Th1 o Th2) de acuerdo con el tipo de citoquinas que segrega. Mosmann y Coffinan, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173 (1989). Una respuesta de Th1 conduce a la secrecion de interleuquina 2 (IL-2) y el interferon y (IFN-y) que estimula reacciones inmunitarias mediadas por celulas contra patogenos intracelulares. Una respuesta de Th2 conduce a la secrecion de IL-4, IL-5 e IL- 10 que estimula respuestas de anticuerpos a patogenos extracelulares. El componente mas interesante de este sistema de regulacion es que una respuesta inhibe la otra a traves de las actividades reguladoras negativas de las citoquinas que se producen. Por lo tanto, IL-4 e IL-10 puede subregular las respuestas de Th1, mientras que IFN-y puede subregular las respuestas de Th2.

La actividad reguladora de las celulas T auxiliares y su diferenciacion despues de la exposicion al antlgeno es regulada tambien por citoquinas. IL-12, una citoquina heterodimerica unida por puentes disulfuro con una subunidad de 40 kDa y una subunidad de 35 kDa, ejerce una poderosa influencia reguladora positiva sobre el desarrollo de respuestas inmunes de celulas T auxiliares de Th1. Vease la revision de Trinchieri, Blood 84: 4008-4027 (1994). IL- 12 tambien tiene un potente efecto sinergico en la induccion de IFN-y tanto de celulas asesinas naturales (NK) como auxiliares T (solicitud de patente europea No. 90123670.3). La IFN-y secretada inhibe luego cualquier proliferation de celulas Th2 y polariza la respuesta para favorecer la inmunidad mediada por celulas.

Una forma de cambiar el resultado de una respuesta inmune serla administrar la citoquina adecuada en el momento de la estimulacion del antlgeno. Si IL-4 fuera la citoquina presente durante la estimulacion del antlgeno, la respuesta de Th2 serla mayor y se inhibirla la respuesta de Th1. Por el contrario, si IL-12 fuera la citoquina principal presente durante la estimulacion del antlgeno, la respuesta de Th1 se verla reforzada y la respuesta de Th2 se inhibirla. Sin embargo, la administration sistemica de citoquinas es diflcil debido a sus muy cortas vidas medias en circulation y sus efectos secundarios nocivos.

Un mejor enfoque consiste en dirigir el efecto de la citoquina a un antlgeno de superficie de la celula fusionandola a un anticuerpo (o fragmento derivado del mismo) que tiene especificidad y afinidad por ese antlgeno. Vease Gillies, y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432 (1992); la patente estadounidense No 5.650.150, cuya description se incorpora aqul por referencia. Alternativamente, la citoquina estimuladora puede enlazarse a un antlgeno de protelna mediante un enlace peptldico en forma de una protelna de fusion. Vease Hazama, y colaboradores, Vaccine 11: 629-636 (1993). Sin embargo, la estructura compleja de IL-12 hace que sea mas diflcil expresarla como una protelna de fusion debido a la necesidad de expresar exactamente la misma relation molar de cada subunidad en el producto final. De hecho, la IL-12 misma se expresa de forma natural y secreta como una mezcla de homodlmero p40. D' Andrea, y colaboradores, J. Exp. Med., 176: 1387-1398 (1992). El documento WO 97/20062A1 divulga un polipeptido de la subunidad p40 de IL-2 unido covalentemente a un polipeptido enzimaticamente inactivo.

Por lo tanto, hay una necesidad en la tecnica por metodos de production de protelnas de fusion con citoquinas heterodimericas y un anticuerpo o un antlgeno que mantienen la estructura heterodimerica natural de la citoquina y secreta las moleculas con relaciones equimolares de las subunidades.

Resumen de la invencion

La presente invencion proporciona protelnas de fusion heterodimericas utiles para terapia inmune dirigida y estimulacion inmunitaria general y metodos para producir estas protelnas de fusion heterodimericas.

En una realization, la protelna de fusion es una protelna de fusion trimerica que comprende una primera y una segunda cadena quimerica unidas por un enlace disulfuro. Cada cadena quimerica comprende una subunidad de la citoquina heterodimerica unida por un enlace peptido a una portion de una cadena pesada de Ig. La subunidad de una de las cadenas quimericas esta unida ademas por un enlace disulfuro a una subunidad diferente de la citoquina heterodimerica.

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En un aspecto de la invencion, las protelnas de fusion comprenden una citoquina heterodimerica unida a un anticuerpo, o una porcion del mismo. En una realizacion preferida, la protelna de fusion comprende dos cadenas quimericas unidas por un enlace disulfuro. Cada cadena quimerica comprende una subunidad diferente de la citoquina heterodimerica unida a traves de un enlace peptldico a una porcion de una cadena pesada de Ig.

Las protelnas de fusion de la invencion pueden considerarse quimericas en virtud de dos aspectos de su estructura. En primer lugar, la protelna de fusion es quimerica porque incluye una cadena de inmunoglobulina (por lo general, pero no exclusivamente, una cadena pesada) de especificidad apropiada de union al antlgeno fusionada a una citoquina heterodimerica dada. En segundo lugar, un inmunoconjugado de la invencion puede ser quimerico en el sentido de que incluye una region variable y una region constante que puede ser la region constante normalmente asociada con la region variable, o una diferente y por lo tanto una quimera V/C; por ejemplo, regiones variables y constantes de diferentes especies. Tambien abarcadas dentro del termino "protelna de fusion" estan los constructos que tienen un dominio de union que comprende regiones marco y regiones variables (es decir, regiones determinantes de complementariedad) de diferentes especies, tales como las divulgadas por Winter, y colaboradores, GB2, 188, 638.

La protelna de fusion heterodimerica citoquina-anticuerpo de la presente invencion muestra preferiblemente especificidad de union a antlgeno. En una realizacion preferida, la protelna de fusion heterodimerica citoquina- anticuerpo comprende una cadena pesada. La cadena pesada puede incluir unos dominios CH1, CH2 y/o CH3. En una realizacion alternativa preferida, la protelna de fusion heterodimerica citoquina-anticuerpo comprende una cadena ligera. La invencion proporciona por lo tanto protelnas de fusion en las que la especificidad de union al antlgeno y la actividad de un anticuerpo se combinan con la potente actividad biologica de una citoquina heterodimerica. Una protelna de fusion de la presente invencion se puede utilizar para suministrar selectivamente una citoquina heterodimerica a una celula objetivo in vivo para que la citoquina heterodimerica pueda ejercer un efecto biologico localizado.

Preferiblemente, la protelna de fusion de la presente invencion muestra actividad biologica de citoquina. La citoquina heterodimerica preferida de la protelna de fusion es IL-12. Las fusiones con anticuerpos capaces de enlazar antlgenos son utiles para la localizacion conjunta de la actividad estimuladora inmune de IL-12 ya sea con las celulas objetivo o con los antlgenos de protelna objetivo.

Ademas, la protelna de fusion de la presente invencion tiene preferiblemente una vida media en circulacion mas larga que una citoquina heterodimerica no enlazada. Las fusiones con la porcion Fc de anticuerpos e IL-12 son utiles para alterar la farmacologla y la biodistribucion de la molecula al incrementar su vida media en circulacion y su afinidad por las celulas portadoras de receptores de Fc, por ejemplo, celulas presentadoras de antlgenos. Los cambios en la biodistribucion pueden alterar tambien su toxicidad sistemica al cambiar el mecanismo por el cual se elimina de la circulacion.

En otro aspecto de la invencion, las protelnas de fusion comprenden una citoquina heterodimerica enlazada a un antlgeno. La protelna de fusion heterodimerica preferida antlgeno-citoquina de la presente invencion muestra actividad biologica de citoquina y actividad antigenica. Ademas, la protelna de fusion de la presente invencion tiene preferiblemente una vida media en circulacion mas larga que una citoquina heterodimerica no enlazada. La citoquina heterodimerica preferida de la protelna de fusion es IL-12.

En una realizacion preferida, la protelna de fusion es una protelna de fusion trimerica que comprende una primera y una segunda cadena quimerica enlazada por un enlace disulfuro. Cada cadena quimerica comprende una subunidad de la citoquina heterodimerica, enlazada por un enlace peptldico a un antlgeno. La subunidad de una cadena quimerica esta enlazada ademas por un enlace disulfuro a una subunidad diferente de la citoquina heterodimerica.

La invencion tambien cuenta con constructos de ADN que codifican las protelnas de fusion antes descritas, y llneas celulares, por ejemplo, mielomas, transfectados con estos constructos.

La invencion tambien incluye un metodo para dirigir selectivamente una citoquina heterodimerica. En una realizacion preferida, el metodo comprende el enlazamiento de al menos una subunidad de una citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico con una porcion de una cadena pesada de Ig. En una realizacion alternativa preferida, el metodo comprende el enlace de cada una de las dos subunidades de una citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico con una porcion de una cadena pesada de Ig, formando de este modo dos cadenas quimericas. Las dos cadenas quimericas estan enlazadas por un enlace disulfuro, formando de este modo una protelna de fusion heterodimerica. En aun otra realizacion preferida, el metodo comprende (1) el enlazamiento de una de las dos subunidades de una primera citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico a una cadena pesada de Ig, formando de este modo una primera cadena quimerica; (2) el enlazamiento de una de las dos subunidades de una segunda citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico a una cadena pesada de Ig, formando de este modo una segunda cadena quimerica; y (3) el enlazamiento de la primera y segunda cadenas quimericas mediante un enlace disulfuro, formando de este modo una protelna de fusion. Las protelnas de fusion resultantes pueden exhibir

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una especificidad de enlazamiento para un antlgeno predeterminado y actividad biologica de citoquina.

La invencion tambien incluye un metodo para suministrar selectivamente una citoquina heterodimerica a una celula objetivo. El metodo incluye proporcionar una protelna de fusion heterodimerica de citoquina que incluye una cadena de Ig quimerica que incluye una cadena pesada de Ig que tiene una region variable especlfica para un epltopo en la celula objetivo y una region constante unida en su terminal carboxilo mediante un enlace peptldico a una citoquina, y una cadena ligera de Ig en combination con la cadena pesada quimerica de Ig, formando un sitio funcional de union al antlgeno, y la administration de la protelna de fusion en una cantidad suficiente para alcanzar la celula objetivo para un sujeto que alberga la celula objetivo.

Ademas, la invencion presenta un metodo para aumentar la vida media en circulation de una citoquina heterodimerica. En una realization preferida, el metodo comprende el enlazamiento de cada una de las dos subunidades de una citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico con un polipeptido, formando de ese modo dos cadenas quimericas. Las dos cadenas quimericas estan enlazadas por un enlace disulfuro, formando con ello una protelna de fusion heterodimerica. En aun otra realizacion preferida, el metodo comprende (1) el enlazamiento de una de las dos subunidades de una primera citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico con un polipeptido, formando con ello una primera cadena quimerica; (2) el enlazamiento de una de las dos subunidades de una segunda citoquina heterodimerica mediante un enlace peptldico con un polipeptido, formando con ello una segunda cadena quimerica; y (3) el enlazamiento de la primera y segunda cadena quimerica mediante un enlace disulfuro, formando con ello una protelna de fusion. El polipeptido puede ser albumina de suero, un antlgeno, y una portion de una cadena pesada de Ig. Las protelnas de fusion resultantes muestran actividad biologica de citoquina.

Las protelnas de fusion IL-12 de la presente invencion son utiles para direccionamiento especlfico o estimulacion inmune cuando es importante generar una respuesta inmune mediada por celulas, tal como en la inmunoterapia de cancer o respuestas antivirales. Tambien son utiles para la subregulacion especlficamente de las respuestas de Th2 que a menudo conducen a la sobreproduccion de IL-4. Esta citoquina ha demostrado ser esencial para el desarrollo de alergia a traves de la induction de una respuesta de Th2 y la sobreproduccion resultante de anticuerpo IgE.

Breve description de los dibujos

Los anteriores y otros objetos de la presente invencion, y las diversas caracterlsticas de los mismos, pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripcion, cuando se lee junto con los dibujos adjuntos, en los que:

la FIG. 1 es una representation esquematica de la estructura de la protelna predicha de las protelnas de fusion heterodimericas;

La FIG. 2 es una representacion esquematica de un SDS-PAGE que muestra un analisis, bajo condiciones reductoras, de protelnas secretadas por celulas transfectadas con vectores que expresan la protelna de fusion Fc- p35 (carril 1), la protelna de fusion Fc-p40 (carril 2), la protelna Fc-p35 de fusion y la protelna de fusion Fc-p40 (carril 3), la protelna de fusion Fc-p35 y la subunidad p40 (carril 4), y la subunidad p35 y la protelna de fusion Fc-p40 (carril 5);

la FIG. 3 es una representacion esquematica de la estructura de la protelna predicha de las protelnas de fusion expresadas;

la FIG. 4 es un grafico de barras que representa la capacidad de diversas protelnas de fusion para estimular la production de IFN-y;

la FIG. 5A es una representacion esquematica de un SDS-PAGE que muestra un analisis de protelnas de fusion enteras de anticuerpo-IL-12 producidas por dos transfectantes independientes, bajo condiciones no reductoras (carriles 1 y 2) y condiciones reductoras (carriles 3 y 4);

las FIGS. 5B-D son graficos de llneas que representan los efectos de la IL-12 humana (X), la protelna de fusion Hu- KS-IL-12 con ambas cadenas IL-12 humanas (cuadrados rellenos), y protelna de fusion Hu-KS-1/4-p40 humana p35 de raton (cuadrados sin relleno) sobre la proliferation de PBMC humanas activadas por mitogeno (Panel B); induccion de la secretion de IFN-y a partir de PBMC activadas con PHA (Panel C) y a partir de celulas efectoras de raton, estimuladas previamente con Concanavalina A (Panel D);

las FIGS. 6A-B son graficos de llneas que representan los efectos de la IL-12 (X), protelna de fusion de una sola cadena con subunidades p35 y p40 humanas (cuadrados rellenos), y protelna de fusion de una sola cadena con una subunidad p35 de raton y una subunidad p40 humana (cuadrados sin relleno) en la induccion de la secrecion de IFN-y;

la FIG. 6C son graficos de llneas que representan la actividad de union al antlgeno de protelna de fusion entera Hu- KS-1/4-IL-12 (cuadrados sin relleno), protelna de fusion de una sola cadena con IL-12 humana (diamante sin relleno), protelna de fusion de una sola cadena con p40 humana p35 de raton (clrculos sin relleno y libres), e IL-12 humana (triangulos sin relleno);

5 la FIG. 7 es un grafico que representa la vida media en suero de Hu-KS-IL-12 (p40 humana p35 de raton), como se mide por un ELISA usando una etapa de captura con cadena H y L antihumana y una segunda deteccion ya sea con anticuerpo Fc antihumano (diamantes con relleno) o anticuerpo IL-12 p40 antihumano (cuadrados sin relleno);

la FIG. 8 (paneles superior e inferior) son graficos de llneas que representan la inmunogenicidad de las protelnas de fusion IL-12. Las diluciones en suero de animales inyectados ya sea con anticuerpo Hu-KS-1/4 o Hu-KS-1/4-IL-12 10 (p40 humana p353 de raton) se ensayaron para determinar la reactividad con anticuerpo Hu-KS-1/4.

Description detallada de la invention

La presente invencion describe protelnas de fusion entre citoquinas heterodimericas y otras protelnas. Las citoquinas heterodimericas pueden fusionarse, por ejemplo, con protelnas con propiedades antigenicas o de direccionamiento. Las protelnas de fusion entre citoquinas heterodimericas y protelnas con propiedades antigenicas 15 o de direccionamiento pueden tener una vida media en circulation mas larga que las citoquinas heterodimericas no enlazadas. Las propiedades antigenicas o de direccionamiento no son necesarias para el aumento de la vida media en circulacion ya que esta propiedad tambien se puede lograr mediante la fusion de una citoquina heterodimerica con una protelna que carece de propiedades antigenicas o de direccionamiento tales como, por ejemplo, albumina de suero.

20 Las protelnas de fusion de esta invencion pueden ser producidas por tecnicas de ingenierla genetica. Como se muestra en la FIG. 1, se pueden producir diversos constructos de protelnas de fusion por los metodos de la presente invencion. En una realization, una subunidad de la citoquina heterodimerica fusionada a un polipeptido es coexpresada con una subunidad libre del otro tipo. Una vez expresada, la cadena quimerica se enlaza mediante un enlace disulfuro a la subunidad libre (Fig. 1B). En otra realizacion, el polipeptido fusionado con la subunidad se 25 puede enlazar a otro de dichos polipeptidos. Dado que cada polipeptido se enlaza a una citoquina heterodimerica, el constructo resultante tiene dos moleculas de la citoquina heterodimerica (Fig. 1C). En aun otra realizacion, cada subunidad de la citoquina heterodimerica esta fusionada a un polipeptido y las dos cadenas quimericas estan enlazadas por un enlace disulfuro. El constructo resultante tiene solo una molecula de la citoquina heterodimerica (Fig. 1D). En aun otra realizacion, dos subunidades de la citoquina heterodimerica fusionada a un polipeptido son 30 coexpresadas con una subunidad libre. El constructo resultante tiene tres subunidades de la citoquina heterodimerica (Fig. 1E).

En la actualidad, la unica citoquina heterodimerica conocida es IL-12. Sin embargo, a medida que se identifican y se secuencian nuevas citoquinas heterodimericas, un experto en la materia sera capaz de utilizar los metodos de la presente invencion para producir protelnas de fusion con estas nuevas citoquinas heterodimericas.

35 Los metodos para sintetizar formas de realizacion utiles de la invencion se describen, as! como ensayos utiles para probar sus actividades farmacologicas, tanto in vitro como en modelos animales precllnicos in vivo. El constructo genico preferido que codifica una cadena quimerica (es decir, una subunidad de la citoquina heterodimerica fusionada a un polipeptido) incluye, en orientation 5' a 3', un segmento de ADN que codifica un polipeptido y ADN que codifica para una subunidad de la citoquina heterodimerica. Un constructo genico preferido alternativo incluye, 40 en orientacion 5' a 3', un segmento de ADN que codifica una subunidad de la citoquina heterodimerica y ADN que codifica para un polipeptido. El gen fusionado es ensamblado o insertado en un vector de expresion para la transfection de las celulas receptoras apropiadas donde se expresa.

La invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1: Clonacion de los ADNc que codifican subunidades de IL-12 humana y de raton

45 Los monocitos de sangre periferica humana (PBMC) se obtuvieron de un voluntario sano y se purificaron por centrifugation en un gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) (1700 rpm durante 20 min). La capa "leucocitaria" que contiene los PBMC se diluyo con medio de cultivo libre de suero (SF-RPMI) hasta un volumen de 50 mL y se recogio por centrifugacion a 1500 rpm durante 5 min. Se resuspendieron las celulas en medio de cultivo celular AIM-V (GIBCO) a una densidad de 5 x 106 celulas/mL y se cultivaron durante 2 dlas a 37°C en una incubadora de CO2 50 humidificada. Las celulas unidas se seleccionaron mediante agitation suave del matraz de cultivo para remover las celulas no adherentes. Se anadio medio fresco que contiene ester de forbol (100 nM) y el ionoforo de calcio, ionomicina (0,1 pg/mL). Despues de tres dlas, se recolectaron las celulas por raspado suave y centrifugacion. Se preparo Poli A + ARNm usando perlas recubiertas con oligo dT (Dynal, Inc.).

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Se clonaron ADNc de subunidades utilizando reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Se sintetizo ADNc de la primera cadena en una reaccion de 50 pl que contiene cebador de oligo dT (50 pg/mL), regulador de reaccion, ARNsin (10 U/mL) y transcriptasa inversa. La incubacion fue a 43°C durante 2 horas, seguido por extraccion con fenol, fenol:cloroformo (50:50) y precipitacion con etanol. El producto de ADNc se utilizo como molde para reacciones PCR que contienen Taq polimerasa y regulador de reaccion (regulador 10x; Perkin Elmer), cebadores sentido y antisentido (0,2 a 0,5 pM cada uno), y 10% de la reaccion de ADNc. Las secuencias de cebador fueron 5'- CCAGAAAGCAAGAGACCAGAG-3' (SEQ ID NO: 1) para el cebador sentido y 5'

GGAGGGACCTCGAGTTTTAGGAAGCATTCAG-3' (SEQ ID NO: 2) para el cebador antisentido del ADNc de la subunidad p35. El cebador sentido se deriva de una secuencia en la region 5' no traducida del mensaje de p35 justo secuencia arriba de un sitio Xmal, mientras que el cebador antisentido codifica un codon de detencion de la traduccion seguido poco despues por un sitio Xhol conveniente para la subclonacion direccional en un vector de expresion. Los cebadores para el ADNc de la subunidad p40 fueron 5'-CTCCGTCCTGTCTAGAGCAAGATGTGTC- 3' (SEQ ID NO: 3) para el cebador sentido y 5'-GCTTCTCGAGAACCTAACTGCAGGGCACAG-3' (SEQ ID NO: 4) para el cebador antisentido. El cebador sentido codifica un sitio XbaI unico secuencia arriba del sitio de inicio de la traduccion, mientras que el cebador antisentido codifica un codon de detencion y un sitio XhoI unico como anteriormente. Ambas secuencias de subunidades, clonadas con estos cebadores de PCR, se expresaran como protelnas individuales y por lo tanto requieren secuencias llder secretoras nativas (u otras) para el montaje y secrecion del heterodlmero adecuado. Las reacciones PCR consistieron en 40 ciclos incluyendo: 1 min a 92°C, 2 min a 52°C, y 3 min a 72°C, seguido de una etapa de desnaturalizacion inicial a 94°C durante 2 min. Los productos se purificaron en gel y se clonaron en el vector de clonacion SK (Strategene) para la verification de la secuencia. La secuenciacion del ADN utilizando un kit comercial (U.S. Biochemical) se llevo a cabo en cada uno de los ADNc de la subunidad. El mismo procedimiento se puede utilizar para clonar el ADNc de la subunidad p35 de raton a partir de celulas de bazo activadas con Concanavalina A (5 pg/mL en medio de cultivo durante 3 dlas). Los cebadores recomendados son 5'-CCTCTACTAACATGTGTCaAtCaCGCTACCTC-3' (SEQ ID NO: 5) para el cebador sentido y 5'-CCCTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGCC-3' (SEQ ID NO: 6) para el cebador antisentido que codifica los mismos sitios de restriction como se describio anteriormente para la subunidad p35 humana.

Ejemplo 2: Expresion de combinaciones de protefnas de fusion en celulas de mamffero transfectadas

Con el fin de elaborar las versiones fusionadas de cada subunidad, los ADN que codifican la secuencia de la protelna madura de cada una se adaptaron de la siguiente forma. El ADN de la subunidad p40 se digirio con NdeI que corta muy cerca de la union de la protelna madura y la secuencia llder, y XhoI. Se sintetizo un oligonucleotido adaptador con la secuencia 5'-CCGGGCAAGTCCA-3' (SEQ ID NO: 7) hibridada con un segundo oligonucleotido, parcialmente complementario con la secuencia 5'-TATGGACTTGC-3' (SEQ ID NO: 8). El ADN bicatenario contiene una secuencia que sobresale compatible con la ligacion a un sitio XmaI en el extremo 5' y un sitio NdeI en el extremo 3'. Este fragmento se ligo al fragmento NdeI-XhoI del ADNc de p40 y se clono como un fragmento XmaI a XhoI en el vector pdC-Fc-X, cortado con XmaI y XhoI. Este vector ya contiene un fragmento de ADN que codifica Fc de IgG1 humano en su configuration genomica (que contiene intrones y exones) y fusionado secuencia abajo de una secuencia llder derivada de una cadena ligera de raton. Vease, Gillies, y colaboradores, J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989). La adicion de un fragmento de ADN a su sitio XmaI unico permite la production de protelnas de fusion unidas directamente al terminal carboxilo de la Fc, siempre que se mantenga el marco de lectura entre las dos secuencias (Lo, y colaboradores, patente estadounidense No. 5.541.087). Otras protelnas (por ejemplo, antlgeno, albumina de suero) se pueden fusionar a los terminales amino de estas subunidades de la misma manera. Las ventajas de este metodo incluyen las grandes cantidades de producto producido y la facilidad de purification del producto mediante union a y elucion de protelna A Sefarosa.

Se uso la misma estrategia general para fusionar el ADN de la subunidad p35 a Fc humana. En este caso, se sintetizo un enlazador XmaI-BaIl usando los oligonucleotidos 5'-CCGGGAAGAAACCTCCCCGTGG-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-CCACGGGGAGGTTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 10), que se ligaron a un ADN de la subunidad p35, se cortaron con BaIl y XhoI, y se subclonaron como un fragmento XmaI-XhoI en el vector pdC-Fc-X, como se describio anteriormente. La subunidad p35 humana ha demostrado ser activa para las celulas humanas, pero no para las celulas de raton, en terminos de la actividad de IL-12, mientras que la subunidad p40 humana no muestra especificidad de especie. Por lo tanto, la subunidad p40 humana se puede utilizar para elaborar ya sea todas las protelnas de fusion IL-12 humanas o protelnas hlbridas de fusion humana/raton.

Los constructos resultantes codifican protelnas de fusion Fc-p35 o Fc-p40 que se espera que dimericen espontaneamente en protelnas de 120 kD (50 Kd de la Fc) y 130 kD, respectivamente, y que migren despues de la reduction sobre geles desnaturalizantes de SDS como protelnas de 60 kD y 65 kD. Los ADNc de las subunidades individuales se subclonaron en el vector de expresion pdC (sin la Fc) para su expresion como protelnas independientes. Este vector proporciona secuencias promotoras para la expresion de ARNm, transcritas a partir de la insertion de ADNc, despues de la transfection de celulas de mamlfero. Tambien proporciona una region 3' no traducida y un sitio de adiccion de poli A, secuencia abajo del sitio de insercion 3' XhoI. Tambien hay secuencias necesarias para la propagation del plasmido en E. coli y selection con ampicilina, as! como un gen marcador seleccionable, tal como la dihidrofolato reductasa (dhfr), para conferir resistencia al metotrexato. Estos mismos componentes se utilizan tambien en el vector pdC-Fc-X para la expresion de las protelnas de fusion.

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Para la expresion de heterodlmeros de protelna de fusion IL-12 biologicamente activos, se expresaron transitoriamente diferentes combinaciones de los vectores individuales que codifican formas de fusion y que no son de fusion de las subunidades mediante transfeccion conjunta de celulas de carcinoma epidermico 293 humano. El ADN se purifico utilizando kits preparativos (Wizard, Promega Inc.), precipitado con etanol para esterilizacion y resuspension en agua esteril. Se prepararon precipitados de fosfato de calcio por metodos estandar utilizando 10 pg de aDn por mL (5 pg de cada uno cuando dos plasmidos fueron cotransfectados) y se anadieron 0,5 mL/placa a cultivos de 293 que crecen en placas de 60 mm hasta aproximadamente 70% de confluencia. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Despues de 16 h, se removio el medio que contenla el precipitado y se reemplazo con medio fresco. Despues de 3 dlas, se removio el sobrenadante y se analizo con respecto a la produccion de la expresion genica transfectada por ELISA, determination biologica de la actividad de IL-12, o inmunoprecipitacion y analisis sobre geles de SDS de protelnas marcadas radiactivamente. Para la marcacion, se utilizo medio sin metionina para reemplazar el medio de cultivo en el segundo dla del cultivo y se anadio metionina con 35S (100 pCi/mL). Despues de una incubation adicional de 16 horas, se recogio el medio, se clarifico por centrifugation (5 min a 13.000 rpm en una microcentrlfuga de mesa) y se incubo con perlas de protelna A-Sefarosa (10 pl de volumen de perlas por mL de sobrenadante del cultivo). Despues de 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las perlas mediante centrifugacion repetida y resuspension en regulador de PBS que contenla 1% de NP-40. Se resuspendio el precipitado final en regulador de gel que contenla SDS y se calento a ebullition durante 2 min. Despues de remover las perlas por centrifugacion, se dividio el sobrenadante en dos allcuotas. Se anadio agente reductor (5% de 2-mercaptoetanol) a una muestra y se calentaron a ebullicion ambas durante 5 min antes de cargar en un gel de poliacrilamida de SDS. Despues de la electroforesis, se expuso el gel a una pellcula de rayos X (autorradiografla).

Un ejemplo de un analisis de la coexpresion de diversas protelnas de fusion y protelnas expresadas de forma individual, bajo condiciones reductoras, se muestra en la FIG. 2. Los resultados muestran que la subunidad p35 no puede ser secretada de la celula, incluso cuando se expresa como una protelna de fusion con el fragmento Fc (carril 1). La subunidad p40, por otro lado, fue facilmente secretada cuando se fusiono a Fc (carril 2). La subunidad p35 fue secretada cuando pudo aparearse con la subunidad p40, ya sea como un emparejamiento de fusion Fc-p35 con una protelna de fusion Fc-p40 (carril 3), el emparejamiento Fc-p35 con p40 libre (carril 4), o emparejamiento de p35 libre con la protelna de fusion Fc-p40 (carril 5). En todos los casos de expresion de una subunidad libre, junto con una protelna de fusion, la subunidad libre se ensambla con la otra subunidad y forma un enlace covalente, un enlace disulfuro. Un diagrama de estas diversas combinaciones se muestra en la FIG. 1. Observese que el constructo con cada subunidad fusionada a Fc y coexpresada en la misma celula tiene una molecula de IL-12 por Fc (Fig. 1D), mientras que los constructos con una unica fusion de subunidad a Fc pareada con una subunidad libre (del otro tipo) tiene dos moleculas de IL-12 por Fc (FIG. 1C). Se espera que la expresion en celulas transfectadas de forma estable sea diferente de la expresion transitoria puesto que la expresion y secretion es independiente de p35. Por lo tanto, la sobreexpresion de p40 es posible y mas ventajosa para la celula puesto que puede ser facilmente exportada. Esto podrla conducir a una sobreabundancia de subunidades Fc-p40 en relation con Fc-p35 y resultar en una mezcla de heterodlmero y la secrecion del homodlmero p40 de la celula. Esto serla ineficaz y darla lugar a problemas de purification. Es probable que la expresion de p35 tenga una desventaja de crecimiento, ya que el exceso de protelna probablemente se degrada en el retlculo endoplasmatico, a menos que se empareje en forma efectiva con la subunidad p40. Por lo tanto, es posible tomar ventaja de esta situation para asegurar la secrecion equilibrada solamente del producto de fusion heterodlmero, mediante la expresion de la subunidad p35 como una protelna de fusion junto con la subunidad p40 libre. Solo la protelna de fusion p35 emparejada con una cantidad equimolar de la subunidad p40 puede ser secretada. La purificacion de este producto en protelna A resulta en una preparation

homogenea de heterodlmero. Una representation esquematica de la estructura de la protelna predicha de las

protelnas de fusion expresadas se proporciona en la FIG. 3.

Ejemplo 3: Actividad de las protelnas de fusion en un ensayo de induccion de IFN-y

Se midio la actividad biologica en un ensayo de induccion de IFN-y utilizando PBMC humanas activadas por mitogeno, purificadas como se describe en el Ejemplo 1. Despues de la centrifugacion en gradiente, se resuspendieron las celulas en medio de cultivo celular que contenla 10% de suero bovino fetal (RPMI-10) y fitohemaglutinina (PHA; 10 pg/mL) a una densidad de 5 x 106 celulas/mL y se cultivaron durante 3 dlas a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada. Las celulas activadas con PHA fueron recogidas por centrifugacion, se lavaron tres veces con un volumen igual de SF-RPMI y se resuspendieron en RPMI-10 fresco (1 x 10° celulas/mL). Se

dispensaron las allcuotas (100 pl) en los pozos de multiples placas de 96 pozos para obtener un numero final de

celulas de 105 por pozo. Las muestras de ensayo del medio de cultivo se diluyeron en serie en medio de cultivo fresco y se anadieron a los pozos de la placa de 96 pozos. Se anadio medio de estimulacion (50 pl/pozo) que contenla 10% de suero e IL-2 (25 U/mL). Los pozos de control recibieron solo IL-2 (control negativo) o tanto iL-2 como IL-12 comercial (R & D Systems) pero no muestra (control positivo). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C en una incubadora de Co2 despues de lo cual se retiraron allcuotas de tiempo (20 pl) para el analisis de la concentration de IFN-y por ELISA.

Se uso el mismo ensayo para determinar la actividad de formas de raton de las protelnas de fusion IL-12, excepto porque se utilizaron celulas de bazo de ratones Balb/c activadas durante 3 dlas con Concanavalina A, en lugar de

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PBMC humanas activadas con PHA. Se uso un ELISA especlfico para raton para cuantificar la cantidad de IFN-y inducida por las moleculas hlbridas p40 humanas/p35 de raton a partir de celulas de raton.

Para el sistema humano, se desarrollo un ELISA cuantitativo mediante el revestimiento de placas de 96 pozos (placa Nunc-Immuno F96 Cert. Maxisorb) con un anticuerpo monoclonal de raton contra IFN-y humano (1 pg/mL) en solucion salina regulada con fosfato (PBS; Pestka Biological Laboratories) durante la noche a 4°C, lavando el anticuerpo no enlazado tres veces con PBS, y bloqueando con una solucion de 1% de albumina de suero bovino (BSA) y 1% de suero de cabra en PBS (150 pl/pozo durante 2 horas a 37°C). Despues de lavar las placas bloqueadas cuatro veces con PBS, se anadieron muestras de ensayo y diluciones del patron de IFN-y en un volumen final de 100 pl/pozo. Despues de incubacion durante la noche a 4°C, se lavaron las placas cuatro veces con PBS, y se anadio un anticuerpo policlonal de conejo contra IFN-y humano (dilucion 1/10000; Pestka Biological Laboratories). Despues de una incubacion adicional durante 1 hora a 37°C y cuatro lavados con PBS, se anadio un anticuerpo policlonal que detecta anticonejo de asno, conjugado con peroxidasa de rabano picante (dilucion 1/700; Petska Biological Laboratories) durante 1 hora a 37°C. Se lavaron luego las placas cuatro veces con PBS y se anadieron 100 pl de sustrato azul K (ELISA Technologies, Neogen Corp.) hasta que el color en los pozos que contenlan la curva estandar se desarrollo lo suficientemente, momento en el se anadieron 100 pl de solucion de detencion Roja (ELISA Technologies). Se leyo la placa a 650 nm usando un lector de placas de ELISA (Dynatech MR7000) y se calculo la cantidad de IFN-y comparando la densidad optica de la muestra de ensayo con una curva estandar derivada de las diluciones del IFN-y de control. Se indujo la cantidad de IFN-y en presencia tanto de IL-2 como de IL-12 generalmente en intervalos de 1.200 - 2.000 pg/mL, mientras que la cantidad producida en ausencia de IL-12 fue generalmente menor de 50 pg/mL.

La actividad biologica de los sobrenadantes de cultivo descritos en el Ejemplo 2 se compararon por su capacidad para estimular la produccion de IFN-y. Como se muestra en la FIG. 4, se obtuvo la actividad mas alta con la protelna de fusion Fc-p35 coexpresada con la subunidad p40 libre, aunque tambien fueron activas las otras combinaciones con ambas subunidades. A continuacion se describen mediciones mas precisas con protelnas purificadas.

Ejemplo 4: Expresion de protefnas de fusion anticuerpo-IL-12

Los experimentos descritos en el Ejemplo 2 demuestran que una forma conveniente de expresar protelnas de fusion con la citoquina heterodimerica de IL-12 es coexpresar una protelna de la subunidad p35 fusionada junto con la subunidad p40 libre en la misma celula. Esto se puede hacer mediante dos enfoques: el primero se logra mediante la cotransfeccion del vector de protelna de fusion y el vector de expresion p40 de forma simultanea (es decir, transfeccion simultanea); la segunda es transfectar primero una celula con p40 solamente y seleccionar secretores estables de alto nivel de esta protelna, y luego utilizar esta celula como un receptor mediante el constructo que expresa la protelna de fusion (es decir, transfeccion, secuencial). El ultimo metodo es particularmente util cuando la protelna de fusion es una molecula de anticuerpo tanto con una cadena pesada como ligera que necesita ser ensamblada adecuadamente para el montaje y la secrecion correctos. Teoricamente, la fusion de la subunidad p35 podrla ser a la cadena pesada o ligera, pero la modalidad preferida serla al terminal carboxilo de la cadena pesada, donde puede ser mas libre para interaccionar con el receptor de IL-12 sobre las celulas. Tambien es posible fusionar la subunidad p35 a traves de su terminal carboxilo al terminal amino de la cadena pesada o ligera. En este caso, se requerirla una secuencia llder para la expresion de p35, ya que estarla en el terminal amino de la protelna de fusion, por lo que requiere su direccionamiento al retlculo endoplasmatico para el ensamblaje y secrecion de la celula.

El constructo de acido nucleico tambien puede incluir al promotor endogeno y reforzador para el gen que codifica la region variable para regular la expresion de la cadena de inmunoglobulina quimerica. Por ejemplo, los genes que codifican la region variable se pueden obtener como fragmentos de ADN que comprenden al peptido llder, el gen VJ [regiones variables (V) reordenadas funcionalmente con el segmento de union (J)] para la cadena ligera o el gen VDJ para la cadena pesada, y el promotor endogeno y reforzador para estos genes. Alternativamente, el gen que codifica para la region variable se puede obtener separadamente de los elementos reguladores endogenos y utilizarse en un vector de expresion que proporciona estos elementos.

Los genes de la region variable se pueden obtener por procedimientos de clonacion de ADN convencionales a partir de celulas, que producen el anticuerpo deseado. El cribado de la biblioteca genomica para una region variable especlfica reordenada funcionalmente se puede lograr mediante el uso de sondas de ADN apropiadas tales como segmentos de ADN que contienen la secuencia de ADN de la region J y secuencias en direction 3'. La identification y confirmation de los clones correctos se consigue entonces mediante secuenciacion de ADN de los genes clonados y la comparacion de la secuencia con la secuencia correspondiente del ARNm de longitud completa, adecuadamente empalmado.

4.1 Transfeccion simultanea

La transfeccion simultanea se puede lograr construyendo un vector con dos unidades de transcription y un gen marcador seleccionable. Tales vectores se describen para la expresion de anticuerpos recombinantes en celulas de

mamlfero. Gillies, y colaboradores, J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989). Un metodo alternativo es utilizar dos vectores de plasmidos independientes (uno con una unidad de transcripcion para la protelna de fusion y el otro con una unidad de transcripcion para la subunidad p40) con sus propios genes marcadores seleccionables, y seleccionar las celulas que expresan, exitosamente transfectadas, mediante el cultivo en presencia de los farmacos a los que las 5 celulas se han vuelto resistentes (por ejemplo, metotrexato en celulas transfectadas con el gen dhfr). Otro enfoque serla el uso de un vector de expresion para la protelna de fusion de la subunidad p35 que contiene un gen marcador seleccionable y la cotransfeccion de un segundo vector sin un gen marcador seleccionable y una unidad de transcripcion para la subunidad p40. Cualquier clon resistente a farmacos obtenido por el ultimo metodo podrla no secretar la protelna de fusion en ausencia de la subunidad p40 y de este modo, no serla detectada por un ensayo de 10 ELISA del sobrenadante de cultivo. Solo las celulas transfectadas con ambos vectores secretarlan al heterodlmero intacto protelna de fusion-p40.

Se construyo un vector plasmido (pdHL7-14.18-p35), como se describe en Gillies, y colaboradores, J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989), que contiene un gen marcador seleccionable dhfr, una unidad de transcripcion que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-GD2 14.18 humanizado, y una unidad de transcripcion que codifica una 15 cadena pesada humanizada fusionada a la subunidad p35 de IL-12 humana. La fusion se consiguio por ligacion del fragmento XmaI a XhoI del ADNc de la subunidad p35 adaptada, tal como se describe en el Ejemplo 2, a un unico sitio XmaI en el extremo del exon CH3 del gen de la cadena H de IgG1 humana. Tanto las unidades de transcripcion de cadena H como L incluyen un promotor de citomegalovirus (CMV) (en lugar del promotor de metalotionelna en la referencia original) en el extremo 5' y un sitio de poliadenilacion en el extremo 3'. Se construyo un vector similar (pC- 20 p40) para la expresion de la subunidad p40 libre pero no inclula un gen marcador seleccionable (dhfr u otro) pero

todavla se utiliza el promotor CMV para la transcripcion.

La region de codificacion en este caso inclula la secuencia llder natural de la subunidad p40 para el trafico adecuado al retlculo endoplasmatico y ensamblaje con la protelna de fusion. Se construyo otra version de este vector (pNC- p40), que incluye el gen de resistencia a neomicina, se construyo para uso en la transfeccion secuencial.

25 Para la transfeccion simultanea, los ADN de plasmido (aproximadamente 10 pg de cada plasmido; pdHL7-14.18-p35 y pC-p40) fueron linealizados por digestion con enzima de restriccion SaII, se purificaron mediante el kit de limpieza de PCR (Wizard, Promega), y electroporacion en 5 x 106 celulas de mieloma (en 0,5 mL de PBS enfriado en hielo) utilizando un ajuste de 0,25 voltios y 500 pF. Despues de una recuperacion durante 10 minutos en hielo, se transfirieron las celulas a un medio fresco y se sembraron en placas de 96 pozos aproximadamente a razon de 105 30 celulas/mL. Despues de 48 horas, se alimentaron las celulas con medio que contiene metotrexato (0,1 pM). Se anadio medio fresco mediante el intercambio de la mitad del volumen de fluido cada 4 dlas hasta que aparecieron los clones. La expresion de la protelna de fusion deseada anticuerpo-IL-12 se analizo usando un ensayo de ELISA con base en la deteccion de Fc del anticuerpo. El anticuerpo de captura reacciono con cadenas H y L humanas y la deteccion utilizo un anticuerpo especlfico para Fc humana. Los clones positivos se expandieron en medio de 35 selection y se purifico el producto mediante la union a y elucion de protelna A Sefarosa como se describio

anteriormente. Las protelnas eluidas se analizaron por PAGE y se detectaron por tincion con azul de Coomassie.

4.2 Transfeccion secuencial

Para la transfeccion secuencial, se sometio a electroporacion el plasmido pNC-p40 en las celulas, como se describio anteriormente, y se sembraron las celulas en placa y seleccionaron en medio que contenla G418. Los 40 sobrenadantes de cultivo de los clones resistentes a los farmacos se ensayaron por ELISA para la produccion de la subunidad p40. El anticuerpo de captura fue un p40 de IL-12 anti-humano de raton y se dirigio el anticuerpo de deteccion a p40/p70 de IL-12 humano. Los kits ELISA comerciales estan disponibles a traves de varios fabricantes para este proposito (Pharminogen, San Diego; R & D Systems, MN). Los mayores productores de clones de celulas se ensayaron para la expresion estable de p40.

45 Uno de tales clones se transfecto con el ADN del plasmido pdHL7-14.18-p35, como se describio anteriormente, y los clones fueron seleccionados en medio que contenla metotrexato. La expresion de la protelna de fusion deseada anticuerpo-IL-12 se ensayo usando un ensayo de ELISA basado en la deteccion de Fc del anticuerpo. El anticuerpo de captura reacciono con cadenas H y L humanas y la deteccion utilizo un anticuerpo especlfico para Fc humana. Los clones positivos se expandieron en medio de seleccion y se purifico el producto mediante la union a, y elucion 50 de protelna A-Sefarosa como se describio anteriormente. Las protelnas eluidas se analizaron por PAGE y se detectaron por tincion con azul de Coomassie.

4.3 Actividades de las protelnas de fusion anticuerpo-IL-12

Como se resume en la Tabla 1, se obtuvieron los clones de celulas que expresan protelna de fusion ya sea por transfeccion simultanea o transfeccion secuencial, pero los clones mas altamente productivos se obtuvieron usando 55 transfeccion secuencial. Los productos secretados por dos transfectantes individuales se analizaron por la composition de la cadena. El analisis por SDS-PAGE se muestra en la FIG. 5A. Claramente, ambos clones

secretaron la misma cantidad relativa de cada una de las tres cadenas: cadena ligera, cadena H-p35, y p40 unida covalentemente, lo que indica el ensamblaje completo y adecuado de esta molecula de cadena 6. Se repitio el mismo proceso con un segundo anticuerpo, KS-1/4, reactivo con el antlgeno EpCAM expresado en practicamente todas las celulas de carcinoma epidermico (carcinoma de colon, pulmon, mama, prostata, pancreas, ovario y de 5 vejiga). Se obtuvieron exactamente los mismos resultados, incluyendo actividades de union normales de los anticuerpos a sus respectivos antlgenos.

Las actividades biologicas de las protelnas de fusion enteras de anticuerpo-IL-12 se muestran en la FIG. 5. Cuando se analizo la capacidad de estimular la proliferacion de las PBMC humanas activadas por mitogeno, la protelna de fusion Hu-KS-IL-12 con ambas cadenas IL-12 humanas era casi tan activa en una base molar como el estandar IL- 10 12 humana (FIG. 5B). El mismo constructo que contenla la subunidad p35 de raton fusionada a Hu-KS-1/4 fue

significativamente menos activo en la estimulacion de PBMC humanas. Cuando se ensayo la capacidad de inducir la secrecion de IFN-y a partir de PBMC activadas con PHA, la protelna Hu-KS-IL-12 con cadenas IL-12 humanas fue aproximadamente 6 veces menos activa que el estandar de IL-12, mientras que la forma hlbrida fue adicionalmente 4 veces menos activa (FIG. 5C). Cuando se utilizaron celulas efectoras de raton (previamente estimuladas con 15 Concanavalina A), la forma hlbrida fue aproximadamente 50 veces menos activa que el estandar de IL-12 de raton. La forma completamente humana fue inactiva (FIG. 5D), como se espera a partir de la literatura. Vease, Schoenhaut, y colaboradores, J Immunol. 148: 3433-3340 (1992).

Tabla 1: Comparacion de la cotransfeccion y transfeccion secuencial de la expresion de la protelna de fusion IL-12

Metodo Frecuencia de clones Nivel de expresion (ng/mL)

positivos

Cotransfeccion

4/22 20, 22, 244, 386

Secuencial

26/37 18, 19, 19, 45, 48, 60 , 67, 93, 97 , 128, 177, 244, 256

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Ejemplo 5: Expresion de protefnas de fusion IL-12 de una sola cadena

Los metodos que se acaban de describir para la produccion de anticuerpo dimerico y protelnas de fusion con base en Fc tambien se pueden utilizar en su forma mas simple para expresar protelnas de fusion de cadena sencilla con IL-12 (aquellas que no forman dlmeros). En este caso, se una secuencia que codifica un solo polipeptido a la 25 secuencia para la subunidad p35 y coexpresada en la misma celula que la subunidad p40 libre. Cualquiera de los dos metodos, la transfeccion simultanea o secuencial, se pueden utilizar para producir protelnas de fusion heterodimericas de una sola cadena. El proposito de tales protelnas de fusion puede ser o bien dirigir IL-12 a una celula que porta el antlgeno, a traves de la fusion de un anticuerpo Fv de una sola cadena (Fv-sc) (Huston y Oppermann, WO 88/09344) o combinar el efecto inmunoestimulador muy especlfico de IL-12 junto con un antlgeno 30 proteico como adyuvante. El enlazamiento de la protelna estimuladora y del antlgeno asegura su colocalizacion despues de la inyeccion en un animal. El antlgeno puede ser cualquier polipeptido. Estos pueden inducir anticuerpos en animales capaces de reaccionar con antlgenos tumorales, virales o de otro tipo que tienen valor terapeutico. Por ejemplo, Fv-sc se puede utilizar ya que es a menudo ventajoso para inducir respuestas inmunitarias a regiones V de anticuerpos que incluyen el idiotipo (region especlfica de union al antlgeno) con la finalidad de estimular redes de 35 idiotipos.

El tipo de antlgeno usado para dichas protelnas de fusion puede ser tambien uno que normalmente induce una respuesta alergica, tal como el Der p I y Der p II de acaros del polvo, o tropomiosina de varios tipos de mariscos, que pueden fusionarse a nivel del ADN a la subunidad p35 de IL-12 y se expresan en la misma celula con la subunidad p40. La inmunizacion con dichas protelnas de fusion inducira fuertes respuestas de celulas auxiliares de Th1 que 40 serlan utiles en la desensibilizacion de la respuesta de Th2 causante de enfermedades en pacientes atopicos con alergia.

Para demostrar la expresion de una protelna de fusion de una sola cadena, se construyo una version de Fv-sc del anticuerpo KS-1/4. El extremo 5' de la porcion que codifica la protelna del gen de fusion (un fragmento XbaI hasta Af1ll) consiste en una secuencia llder derivada de una cadena ligera k de raton, fusionada a la secuencia de la 45 protelna madura de la region V de la cadena L de KS-1/4. El extremo de la region V se fusiona, en el marco, a un

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ADN que codifica la secuencia enlazadora simple, (Gly4Ser)3, descrita por otros (Huston y Oppermann, WO 88/09344) seguida, en el marco, por la secuencia que codifica la region V de cadena H de KS-1/4. El extremo 3' de esta Fv-sc contiene un sitio Xmal, compatible con la union al extremo 5' de las versiones humana y de raton (fragmentos Xmal hasta Xhol) de la subunidad p35 de IL-12. Los fragmentos finales Xbal hasta Xhol se insertaron en los sitios correspondientes del mismo vector de expresion (pdC) utilizado para expresar las subunidades lL-12 libres para obtener los vectores pdC-SCA-hu-p35 y pdC-SCA-mu-p35.

Estos vectores se introdujeron en una llnea celular que expresa p40 humana y se cultivaron en medio que contenla metotrexato (0,1 pM). Se identificaron los clones que expresan protelna de fusion, resistentes a farmacos mediante ensayos de ELlSA especlficos para la especie de p35 utilizada en el constructo (es decir, se utilizo un anticuerpo p40 humano de lL-12 para la captura de antlgeno y se utilizaron para la detection anticuerpos especlficos anti-raton o p35 humana). Se utilizaron los medios de cultivo de cada tipo de protelna de fusion de una sola cadena para determinar sus cantidades de manera que se pudieron calcular las actividades especlficas relativas. Se analizaron las diluciones en serie de cada muestra para determinar la capacidad de inducir la secretion de IFN-y como se detallo anteriormente en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la FlG. 6, que compara la actividad de las protelnas de fusion de lL-12 de una sola cadena elaboradas ya sea con subunidades humanas o con p35 de raton y p40 humana, as! como la especificidad de especie de las protelnas de fusion. Los datos muestran que la protelna de fusion de una sola cadena de lL- 12 humana es tan activa como las fusiones completas de anticuerpos en su capacidad para inducir IFN-y, pero que no es tan potente como el estandar de lL- 12 humana cuando se utilizaron PBMC humanas (FlG. 6A). La forma hlbrida humana/de raton fue aproximadamente 50 veces menor que el control de lL-12 de raton como se observo con el constructo de anticuerpo completo (FlG. 6B). La FlG. 6C muestra un ensayo de union a antlgeno de las protelnas de lL-12 de una sola cadena. Se recubrieron las placas con el antlgeno KS reconocido por el anticuerpo KS-1/4 y se utilizo para capturar cualquier protelna de fusion de anticuerpo o anticuerpo reactivo. Despues de lavar varias veces, se detecto la protelna de fusion unida usando un anticuerpo p40 de lL-12 anti-humano. Los datos muestran que las protelnas de fusion de una sola cadena se unieron a la placa recubierta de antlgeno y se pudieron detectar con un anticuerpo contra lL-12, demostrando as! que las moleculas fusionadas retienen actividad de union al antlgeno.

La intensidad de la union fue aproximadamente 3 veces mas baja que la observada con el anticuerpo KS-1/4 completo, pero esto no es inesperado, debido a la monovalencia del constructo de una sola cadena. Los resultados de actividad tanto con el anticuerpo completo como con protelnas de fusion de lL-12 de una sola cadena sugieren que el terminal amino de la cadena de p35 puede ser importante para la union al receptor ya que las fusiones parecen reducir la actividad. No obstante, las moleculas de anticuerpo-lL-12 son todavla inductores muy potentes de IFN-y a concentraciones superiores a 1 ng/mL. Se espera que la concentration de dichas moleculas en animales tratados sea varios ordenes de magnitud mas alta que esto, tanto en la circulation, como en el sitio objetivo de accion.

Una posible forma de aumentar la actividad especlfica de protelnas de fusion anticuerpo-lL-12 serla insertar un enlazador peptldico flexible entre las secuencias del anticuerpo y de p35 dando as! mas libertad a las secuencias del terminal amino de esta subunidad. Una secuencia tal como la del enlazador (Gly4Ser)3, descrito anteriormente, se podrla utilizar de esta manera. Un posible problema con este enfoque es que tal enlazador podrla ser inmunogeno, especialmente cuando se fusiona a un potente estimulador inmune tal como IL- 12.

Ejemplo 6: Propiedades farmacocineticas de las protelnas de fusion de IL-12

Se analizaron las protelnas de fusion anticuerpo-lL-12 para determinar su comportamiento farmacocinetico despues de inyeccion intravenosa en ratones Balb/c. Se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado retro-orbital y se almaceno a 4°C en tubos Eppendorf de microcentrlfuga. Se utilizaron metodos ELISA para medir la cantidad de anticuerpo humano, as! como la cantidad de protelna de fusion intacta de IL-12, que queda en la sangre en puntos de tiempo cada vez mayores. El primer ELISA que mide anticuerpo humano utiliza un anticuerpo contra cadenas H y L humanas para captura y un anticuerpo Fc antihumano para deteccion. El ensayo especlfico de la protelna de fusion utiliza la misma primera etapa de captura, pero un anticuerpo anti-subunidad p40 para la deteccion. Como se muestra en la FIG. 7, tanto el anticuerpo como la protelna de fusion de IL-12 tenlan una vida media prolongada, pero la vida media de la protelna de fusion fue algo mas corta. Esto sugiere que la protelna de fusion en circulacion se escinde en el tiempo para liberar IL-12 mientras que el anticuerpo permanece en la circulacion. Los experimentos reportados al comienzo con otras protelnas de fusion anticuerpo-citoquina demuestran que las citoquinas pueden ser liberadas mediante escision de la proteasa. Vease, Gillies, y colaboradores, Bioconj. Chem. 4: 230-235 (1993). No obstante, las vidas medias de las protelnas de fusion son mucho mas prolongadas que el valor de 3 h reportado para IL-12 nativa. De hecho, la concentracion en suero a las 72 horas es todavla mucho mayor que el nivel requerido para inducir la secrecion de IFN-y. Trincieri, Blood 84: 4.008-4.027 (1992).

Ejemplo 7: Tratamiento de carcinoma de colon establecido con la protelna de fusion anticuerpo-IL-12.

El carcinoma de colon murino, CT26, es particularmente insensible al tratamiento con la administration sistemica de IL-12 de raton en dosis no toxicas. Martinotti, y colaboradores, Eur. J. Immunol. 25: 137-146 (1995). Se ha

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encontrado alguna eficacia cuando se ha combinado la administration sistemica de IL-12 junto con vacunacion repetida de celulas CT26 irradiadas, modificadas por ingenierla genetica para secretar IL-2. Vagliani, y colaboradores, Cancer Res. 56: 467-470 (1996). Un enfoque alternativo para una terapia exitosa implico las celulas CT26 modificadas geneticamente para segregar bajos niveles de IL-12. Esto fue ineficaz salvo que los ratones fueran tratados primero con anticuerpos para agotar las celulas CD4+, Martinotti, y colaboradores, Eur. J. Immunol. 25: 137-146 (1995), presumiblemente debido a un efecto inmunosupresor de estas celulas despues de la exposition a los tumores modificados por ingenierla genetica in vivo. Incluso otro enfoque de modificar por ingenierla genetica secretores de IL-12 mucho mayores fue mucho mas exitoso, indicando as! que la cantidad de IL-12 local era crltica en el establecimiento de una respuesta inmune a los tumores subcutaneos, Colombo, y colaboradores, Cancer Res. 56: 2531-2534 (1996). En este caso, sin embargo, no hubo demostracion del tratamiento de tumores establecidos, diseminados, similar a la que se observarla en el entorno cllnico. El proposito del presente experimento fue evaluar la eficacia de las protelnas de fusion anticuerpo-IL-12 para el tratamiento de carcinoma de colon murino, CT26.

Las celulas CT26 fueron transfectadas con un ADNc que codifica el antlgeno reconocido por el anticuerpo KS-1/4, que se denomina ya sea como antlgeno KS (KSA) o molecula de adhesion celular epitelial (EpCAM). Los clones que expresan esta protelna en su superficie fueron identificados mediante analisis de inmunocoloracion con KS-1/4 y clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Las celulas de un clon, que expresan de forma estable KSA (clon 21.6), fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones Balb/c (1 x 105 por raton). Los ratones no tratados formaron una metastasis pulmonar extensa el dla 28 y murieron dentro de los 40 dlas despues de la inoculation. Esta tasa de crecimiento fue practicamente la misma que la de las celulas parentales lo que indica que la expresion de la KSA humano no tenia efecto sobre la inmunogenicidad de CT26 o la capacidad de formar tumores.

La eficacia de la proteina de fusion anticuerpo-IL-12 para la terapia de metastasis de CT26 fue probada en este modelo de raton utilizando la forma hibrida humana/raton que tiene actividad sobre las celulas de raton. Despues de la inyeccion de celulas tumorales, los ratones recibieron inyecciones ya sea de PBS (sin control de tratamiento), la proteina de fusion KS-1/4-IL-2 (control positivo), anticuerpo KS-1/4 con IL-2 libre (control negativo) o la proteina de fusion KS-1/4-IL-12 (muestra de ensayo).

El tratamiento comenzo el dia 4, un momento en que las metastasis establecidas son facilmente detectables por tincion histologica en los pulmones de los animales, y continuo diariamente durante 5 dias. En el dia 28 despues de la inoculacion de celulas tumorales, los animales fueron sacrificados y sus pulmones examinados por la presencia del tumor. Tambien se midieron los pesos de los pulmones para determinar la cantidad de masa tumoral, con respecto a los ratones libres de tumor. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Los animales no tratados tenlan enfermedad metastasica extensa caracterizada por un cubrimiento superficial casi completo del organo con tumor a traves de la fusion de nodulos metastasicos individuales. Los pesos de los pulmones aumentaron en un promedio de tres veces, indicando que las masas tumorales en realidad formaban la mayor parte del organo. Los animales tratados tenlan poca o ninguna evidencia de metastasis, con algunos animales completamente libres de tumor. Ninguno de los animales mostro signos manifiestos de toxicidad durante el proceso de tratamiento. Por lo tanto, a diferencia del tratamiento con IL-12 sistemico, la terapia de proteina de fusion anticuerpo-IL-12 puede erradicar el carcinoma de colon CT26 metastasico establecido.

Tabla 2: Tratamiento de metastasis de pulmon del carcinoma de colon murino en ratones SCID con protelnas de

fusion anticuerpo-IL-12

Tratamiento Puntuacion metastasica Peso del organo

PBS

3, 3, 3, 3, 3, 3 0,52

Hu-KS1/4

3, 3, 3, 3, 3 0,48

Hu-KS1/4 + IL-2

3, 3, 3, 3, 3 0,40

Hu-KS-

IL-2 2, 1, 1, 1, 1 0,22

Hu-KS-

IL-12 1, 1, 1, 1, 1 0,20

Las metastasis pulmonares experimentales fueron inducidas mediante inyeccion intravenosa de 105 celulas CT26- KSA. El tratamiento comenzo tres dlas despues con inyeccion intravenosa de 10 pg del anticuerpo KS-1/4 humanizado o la proteina de fusion indicada durante cinco dias consecutivos. Los animales fueron sacrificados y se determino la puntuacion metastasica por el grado de cobertura de la superficie: 0 = sin focos metastasicos visibles; 1 = menos de 5% de la superficie cubierta; 2 = 5 a 50% de la superficie cubierta; y 3 = mas de 50% de la superficie

5

10

15

20

25

30

pulmonar esta cubierta con focos metastasicos.

Ejemplo 8: Protefnas de fusion de IL-12 como vacunas

La protelna de fusion IL-12-anticuerpo KS-1/4 humanizado en regulador de PBS, elaborada con la subunidad p35 de murino (HuKS-1/4-mIL-12), fue inyectada en ratones Balb/c por via intravenosa (5 pg/dla x 5). Los ratones de control recibieron el mismo anticuerpo, en las mismas cantidades, pero sin IL-12 adjunta. Ni la solucion de la inyeccion contenla cualquier otro tipo de adyuvante. En el dla 10, se recolectaron muestras de sangre en tubos de microcentrlfuga por sangrado retro-orbital y se preparo plasma recogiendo muestras de sangre en tubos de plastico que contenlan citrato de sodio, seguido de centrifugacion a velocidad maxima en una microcentrlfuga Eppendorf de mesa. Se recubrieron las placas de ELISA (96 pozos) con la region constante humana que contenla la protelna HuKS-1/4 y se utilizaron para capturar cualquier anticuerpo de raton elaborado en respuesta a la inmunizacion. Despues de retirar por lavado el material no enlazado, se detectaron los anticuerpos de raton enlazados con anticuerpo Fc antirraton de cabra (Jackson ImmunoResearch) acoplado a peroxidasa de rabano picante. Cualquier de los anticuerpos enlazados podrla ser dirigido a cualquiera de las regiones constantes humanas o la region variable, las cuales se reparten entre la HU-KS-1/4 y las protelnas de fusion.

Como se muestra en la FIG. 8, hubo poca o ninguna reactividad a Hu-KS-1/4 sin IL-12 fusionada. La protelna de fusion, por otro lado, induce una fuerte respuesta de anticuerpos en ausencia de adyuvantes exogenos y a pesar del hecho de que la via intravenosa de administration es altamente desfavorable para inducir tales respuestas, en comparacion ya sea con la administracion subcutanea o intraperitoneal. Los anticuerpos del isotipo IgG2a, que son tlpicos de las respuestas mejoradas de IL-12, fueron observados en el grupo inyectado con anticuerpo-IL-12, pero no en el grupo inyectado con el anticuerpo Hu-KS-1/4.

La inmunogenicidad de las protelnas de fusion de IL-12 administradas por diversas vlas se prueba mediante la inyeccion de una solucion de la protelna de fusion (tal como la descrita anteriormente) en pBs u otro regulador biocompatible, o un adyuvante conocido tal como adyuvante completo o incompleto de Freund. Por ejemplo, se pueden suministrar inyecciones subcutaneas, intradermicas o intraperitoneales unicas o multiples cada dos semanas. Alternativamente, la protelna de fusion puede administrarse primero por inyeccion subcutanea y luego seguida por inyeccion intraperitoneal. El adyuvante de Freund no puede ser utilizado para uso humano, debido a la irritation en el sitio de la inyeccion. Adyuvantes alternativos tales como precipitados de hidroxido de aluminio (Alumbre) estan aprobados para uso humano y pueden ser utilizados en la presente invention. Se pueden usar tambien nuevos adyuvantes qulmicos organicos con base en escualenos y llpidos para inyecciones en la piel.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Una protelna de fusion heterodimerica que comprende una primera y una segunda cadena quimerica unida por un enlace disulfuro, comprendiendo cada cadena quimerica una subunidad p35 o p40 de la citoquina heterodimerica IL- 12 unida por un enlace peptldico a una porcion de una cadena pesada de Ig, estando la subunidad de una de las cadenas heterodimericas unida ademas por un enlace disulfuro a la subunidad diferente de la citoquina heterodimerica, en donde la subunidad de una de las cadenas heterodimericas, unida a la cadena pesada de Ig mediante un enlace peptldico, es p35.
2. 2. Una protelna de fusion de la reivindicacion 1, en donde la subunidad de la primera cadena quimerica y la subunidad de la segunda cadena quimerica estan unidas cada una a la cadena pesada de Ig mediante un enlace peptldico es p35.
3. 3. Una protelna de fusion de la reivindicacion 1, en donde la subunidad de la primera cadena quimerica enlazada a la cadena pesada de Ig por un enlace peptldico es p35, y la subunidad de la segunda cadena quimerica enlazada a la cadena pesada de Ig por un enlace peptldico es p40.
4. 4. Una protelna de fusion de la reivindicacion 2 o 3, en donde la subunidad, que esta enlazada por un enlace disulfuro a la subunidad diferente, es p40.
5. 5. Una protelna de fusion de la reivindicacion 3, en donde la subunidad, que esta enlazada por un enlace disulfuro a la subunidad diferente, es p35.
6. 6. Una protelna de fusion de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en donde la cadena pesada comprende un dominio CH1, un CH2 y un CH3.
7. 7. Una protelna de fusion de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, que comprende regiones variables especlficas para un epltopo en una celula objetivo.
8. 8. Una protelna de fusion de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, que comprende una cadena ligera de Ig, que se combina con dicha cadena pesada quimerica de Ig, formando de esta manera un sitio funcional de enlazamiento al antlgeno.