PL155778B1 - Method of isolating the neoplastic necrosis factor - Google Patents

Abstract

1. Sposób wydzielania czynnika martwicy nowotworu z jego mieszaniny z innymi bialkami, znamienny tym, ze czynnik martwicy nowotworu adsorbuje sie z tej mieszaniny na substancji wybranej z grupy obejmujacej krzemian, szklo o kontrolowanej wielkosci porów, alkilowana sepharoze oraz czastki anionowej zywicy jonowymiennej o zasadniczo jednakowym rozmiarze czastek, a nastepnie czynnik martwicy nowotworu eluuje sie. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania czynnika martwicy nowotworu.

Wiadomo, że komórki o czynności immunologicznej, takie jak komórki B, komórki T, naturalne komórki zabijające (komórki cytotoksyczne zależne od przeciwciała) i makrofagi wytwarzają substancje wykazujące aktywność cytotoksyczną wobec komórek nowotworu, ale są nieaktywne wobec komórek prawidłowych. Substancje te są nazywane różnie np. limfotoksyna, czynnik martwicy nowotworu, czynnik cytotoksyczny komórek NK, czynnik martwicy krwotocznej, cytotoksyna makrofaga lub cytotoksyczny czynnik makrofaga. Nie jest obecnie w pełni jednoznaczne, jakie białka określone są tymi terminami. Główna trudność polega na tym, że próby biologiczne używane do wykrywania białek nie różnicują białek występujących jako agregaty lub produkty hydrolizy, a ilości otrzymywanych białek są niewielkie, tak że nie wystarczają na otrzymanie preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia, umożliwiającym ich pełną charakterystykę.

Na ogół takie substancje cytotoksyczne występują w surowicy zdrowych zwierząt albo w supernatantach hodowli komórek limfatycznych lub linii komórkowych, po traktowaniu zwierzęcia lub komórki substancją stymulującą proliferację komórek o czynności immunologicznej (,,induktor“). Takie surowice lub supernatanty są oddzielone, a następnie sprawdzane na aktywność cytotoksyczną przeciwko linii docelowych komórek nowotworowych. Jako linię standardową stosuje się mysie komórki nowotworowe L-929. Linia ta, a także inne linie stosowane w próbach biologicznych są niespecyficzne pod względem ich odpowiedzi litycznej, ponieważ liczne produkty komórek limfatycznych są zdolne powodować lizę. Podobnie niespecyficzne odpowiedzi obserwuje się przy wywoływaniu martwicy nowotworu in vitro. Tak więc próby cytolityczne, w których ocenia się lizę komórek in vitro lub próby wywoływania martwicy nowotworu in vivo, nie pozwalają na zróżnicowanie różnych produktów cytotoksycznych limfy.

Czynniki cytotoksyczne klasyfikuje się na podstawie komórek limfatycznych, w których są indukowane. Na przykład limfotoksyna jest nazwą powszechnie stosowaną do cytotoksycznych produktów wydzielanych przez komórki limfocytów B lub T albo linie komórkowe od nich pochodzące, podczas gdy termin „czynnik martwicy nowotworu jest często stosowany dla określenia produktów cytotoksycznych makrofagów lub linii z nich pochodzących. Ten system klasyfikacji nie jest jednak rozwinięty w tym stopniu, aby mieć jakąkolwiek pewność, że mówi się o pojedynczym białku, lub że białka o różnych nazwach są w rzeczywistości różne.

Czyniono próby oczyszczania i scharakteryzowania czynników cytotoksycznych wydzielanych przez każdy typ komórek. Ponieważ wyniki różniły się pod względem właściwości danego czynnika cytotoksycznego lub były całkowicie niezgodne jeśli chodzi o daną właściwość, można wnioskować, że albo charakterystyka była błędna, albo przez każdy typ komórek były wytwarzane liczne czynniki cytotoksyczne. Na przykład produkty cytotoksyczne pochodzące z makrofagów,

155 778 monocytów lub linii monocytarnych, nazwane ogólnie czynnikiem martwicy nowotworu, wykazywały właściwości, które teoretycznie nie mogły być właściwościami pojedynczego produktu cytotoksycznego. (patrz np.: R. MacFarlan et.al., 1980, „AJEBAK 58, (5): 489-500; D. Mannel et al., 1980, „Infection and Immunology 30 (2), 523-530; H. Ohnishi et al. zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 106 117A; J. Hammerstorm, 1982, „Scand J. Immunol.“ 15, 311-318).

Z drugiej strony C. Zacharchuket al., 1983 „Proc. Nat. Acad. Sci. USA“ 80, 6341-6345 sugerują, że limfotoksyna świnki morskiej i czynnik cytotoksyczny z makrofagów świnki morskiej są immunochemicznie podobne, jeśli nie identyczne. Podobne wnioski przedstawia Ruff et al., 1981, Lymfokines, tom 2, str. 235-272 i 241-242.

Próby charakterystyki immunologicznych czynników cytotoksycznych były również oparte na zastosowaniu jako materiału wyjściowego surowicy lub płynu otrzewnowego zwierząt traktowanych immunogennym antygenem. Materiał ten zawierał szereg produktów układu immunologicznego, w przeciwieństwie do produktu lub produktów pojedynczej komórki albo linii komórkowej. Przykłady podają następujące publikacje: S. Green et al., 1982, „J. Nat. Cancer Inst.“ 68 (6), 997-1003 (czynnik indukujący martwicę nowotworu); M. Ruff et al., 1980, „J. Immunol. 125 (4), 1671-1677 (czynnik martwicy nowotworu); H. Enoto et al., europejskie zgłoszenie patentowe 86475 (substancja przeciwnowotworowa); H. Oettgen at al., 1980, „Recent Results Cancer Res.“ 75, 207-212 (czynnik martwicy nowotworu); F. Kuli et al., 1981, „J. Immunol.“ 126 (4), 1279-1283 („Tumor Celi Cytotoxin“; D. Mannel et al., 1980, „Infection and Immunity 28 (1), 204-211 (czynnik cytotoksyczny); N. Matthews et al., 1980 „Br. J. Cancer, 42, 416-422 (czynnik martwicy nowotworu); S. Green et al.,1976,„Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73 (2), 381-385 (czynnik surowicy); N. Satomi et al., 1981, „Jpn. J. Exp. Med 51 (6), 317-322; N. Matthews, 1979, „Br. J. Cancer 40, 534-539 (czynnik martwicy nowotworu); K. Haranaka et al., 1981, (Jpn. J. Exp. Med. 51 (3), 191-194 (czynnik martwicy nowotworu); i L. Oldet al. europejskie zgłoszenie patentowe 90 892; T. Umeda et al., 1983, „Cellular and Molecular Biology 29 (5), 349-352; i H.Enomoto et al., 1983, europejskie zgłoszenie patentowe 86475.

Inne związane z tematem pozycje literaturowe to J. Nissen-Meyer et al., 1982, „Infection and immunity 38 (1), 67-73; J. Klostergaard et al., 1981, „Mol. Immunol. 18 (12), 1049-1054; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 359 415; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 447 355; K.Hanamaka et al., 1983, europejskie zgłoszenie patentowe nr 90 892; i G.Granger et al., 1978, „Cellular Immunology, 38, 388-402.

Europejskie zgłoszenie patentowe 100641 opisuje polipeptyd o właściwościach cytotoksycznych, oczyszczony od zanieczyszczeń, pochodzący z hodowli ludzkich komórek hmfoblastoidalnych. Polipeptyd ten nazwano limfotoksyną, chociaż jej podobieństwo do innych opisywanych pod nazwą limfotoksyna polipeptydów cytotoksycznych jest wątpliwe. Nie wiadomo, czy jest to pojedynczy polipeptyd cytotoksyczny wytwarzany przez komórkę immunologiczną, jak to sugeruje Zacharchuket al. (jak wyżej), czy też jest to polipeptyd z grupy czynników cytotoksycznych.

Opisywany polipeptyd zawiera dwa końce aminowe: większy wariant o sekwencji końcowej Leu Pro Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr, i mniejszy wariant o sekwencji His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala.

Według danych literaturowych interferony wykazujące pewną aktywność hamującą nowotworów, a także słabo scharakteryzowane białko posiadające sekwencję Ala Ala na końcu aminowym (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 117 385A) były uważane za nielimfotoksynowe czynniki cytotoksyczne. Jak będzie to wykazane, czynnik martwicy nowotworu, którego sposób wydzielania z mieszaniny z innymi białkami jest przedmiotem wynalazku, nie jest interferonem, nie jest limfotoksyną i nie posiada sekwencji Ala Ala na końcu aminowym.

Twórcy niniejszego wynalazku prowadzili badania, których celem było a) jednoznaczne określenie czy istnieje inny niż limfotoksyna czynnik martwicy nowotworu, a jeśli istnieje, to zidentyfikowanie go w taki sposób, aby odróżnić go od innych czynników tego rodzaju; b) wytworzenie takiego czynnika sposobami innymi niż indukcja hodowli komórkowej, która jest kosztowna i prowadzi do powstania produktu zanieczyszczonego innymi czynikami, względnie indukcja limfocytów krwi, która jest nieekonomiczna, nie daje powtarzalnych wyników i prowadzi

155 778 do wytwarzania produktu zanieczyszczonego homologicznymi białkami komórkowymi plazmy; c) otrzymanie DNA kodującego taki cznnik martwicy nowotworu i poddanie tego DNA ekspresji w hodowli rekombinantowej; d) zsyntetyzowanie takiego czynnika w hodowli rekombinantowej w dojrzałej formie; e) zmodyfikowanie sekwencji kodującej lub struktury takiego czynnika; f) nadanie temu czynnikowi postaci dawek terapeutycznych do podawania istotom żywym w celu leczenia nowotworu i g) wytworzenie odczynnika diagnostycznego pochodzącego od takiego czynnika. W wyniku tych badań opracowano między innymi sposób wydzielania czynnika martwicy nowotworu z jego mieszaniny z innymi białkami.

Według wynalazku, sposób wydzielania czynnika martwicy nowotworu z jego mieszaniny z innymi białkami polega na tym, ze czynnik martwicy nowotworu adsorbuje się z tej mieszaniny na substancji wybranej z grupy obejmującej krzemian, szkło o kontrolowanej wielkości porów, alkilowaną sepharozę oraz cząstki anionowej żywicy jonowymiennej o zasadniczo jednakowym rozmiarze cząstek, a następnie czynnik martwicy nowotworu eluuje się. Jako anionową żywicę jonowymienną stosuje się usieciowany polistyren podstawiony ugrupowaniami aminy czwartorzędowej. Czynnik martwicy nowotworu eluuje się ze szkła o kontrolowanej wielkości porów za pomocą glikolu etylenowego.

Poniżej przedstawiono informacje, które pozwolą fachowcom na zrozumienie istoty wynalazku.

Czynnik cytotoksyczny oczyszczono do stanu homogenności, scharakteryzowano i poddano ekspresji w hodowli rekombinantowej. Czynnik ten określono jako czynnik martwicy nowotworu, w skrócie TNF (tumor necrosic factor). Całkowicie homogenna forma preparatu otrzymanego z hodowli komórkowej wykazywała aktywność specyficzną wyzszą niz 10 milionów jednostek/mg białka.

Ludzki czynnik martwicy nowotworu syntetyzowany w hodowli rekombinantowej zawiera komponenty, które nie występują w komórkach ludzkich, włącznie z białkami, w ilościach które są fizjologicznie dopuszczalne do podania pacjentom, razem z czynnikiem martwicy nowotworu. Komponenty te pochodzą zwykle z drożdży, prokariontów, lub wyższych eukariontów, z wykluczeniem człowieka, i występują w ilościach zwykle mniejszych niż około 1% wagowy. Co więcej, hodowla komórek rekombinantowych zdolna jest do wytwarzania czynika martwicy nowotworu całkowicie wolnego od białek homologicznych. Białka homologiczne są to białka zwykle powiązane z czynnikiem martwicy nowotworu występującym w przyrodzie to jest w komórkach , wyciągach komórkowych lub płynach ustrojowych. Na przykład białkiem homologicznym dla ludzkiego czynnika martwicy nowotworu jest albumina surowicy. Białka heterologiczne to takie białka, które w przyrodzie nie występują w połączeniu z danym czynnikiem martwicy nowotworu.

Otrzymano DNA, który koduje czynnik martwicy nowotworu i który poddany ekspresji w hodowli rekombinantowej lub transformowanej wytwarza liczne kopie czynnika martwicy nowotworu. Ten rodzaj DNA jest nowy, ponieważ cDNA otrzymywany przez odwrotną transkrypcję mRNA z linii indukowanych komórek monocytowych nie zawiera intronów i jest wolny od jakichkolwiek odcinków sąsiadujących, kodujących inne białka organizmu, z którego pochodzi mRNA.

Chromosomalny DNA kodujący TNF otrzymano przez porównanie banku genowego DNA z cDNA. Chromosomalny DNA jest wolny od sąsiadujących odcinków kodujących inne białka, lecz może zawierać introny.

Izolowany DNA czynnika martwicy nowotworu można łatwo zmodyfikować przez podstawienie, wycięcie lub włączenie nukleotydów, z wytworzeniem nowej sekwencji DNA kodującej czynnik martwicy nowotworu, lub jego pochodnych. Te zmodyfikowane sekwencje stosuje się do wytwarzania mutanta czynnika martwicy nowotworu i do bezpośredniej ekspresji dojrzałego czynnika martwicy nowotworu. Zmodyfikowane sekwencje są również przydatne przy zwiększaniu efektywności ekspresji czynnika martwicy nowotworu w wybranym układzie gospodarz-wektor, na przykład przez modyfikację kodonu korzystną dla komórki gospodarza. Te nowe sekwencje DNA lub ich fragmenty poddaje się znakowaniu i stosuje w próbach hybrydyzacji z genetycznym materiałem kodującym czynnik martwicy nowotworu.

W procesie syntezy martwicy czynnika martwicy nowotworu, DNA, który koduje czynnik martwicy nowotworu liguje się z dającym się replikować wektorem, wektor używa do transformacji komórki gospodarza, komórki gospodarza hoduje się i czynnik martwicy nowotworu izoluje się z

155 778 hodowli. Ten ogólny proces stosuje się do konstrukcji czynnika martwicy nowotworu o charakterystyce czynnika martwicy nowotworu, lub do konstrukcji nowej pochodnej czynnika martwicy nowotworu, w zależności od wektora i komórki gospodarza wybranych do transformacji. Gatunki czynnika martwicy nowotworu, które mogą być syntetyzowane obejmują: dojrzały czynnik martwicy nowotworu (z resztą waliny na końcu aminowym), czynnik martwicy pre-nowotworu („preTNF zdefiniowany poniżej) i następujące pochodne TNF: a) białka fuzyjne, w których TNF, lub jakikolwiek jego fragment (włącznie z dojrzałym czynnikiem martwicy nowotworu) jest powiązany z innym białkiem lub pohpeptydem wiązaniem peptydowym z aminokwasem końca aminowego i/lub karboksylowego TNF lub jego fragmentu, b) fragmenty TNF, włącznie z dojrzałym czynnikiem martwicy nowotworu lub fragmenty preTNF, w których każdy aminokwas pre-białka jest amino-terminalnym aminokwasem fragmentu, c) mutanty TNF lub jego fragmentów (włącznie z dojrzałym czynnikiem martwicy nowotworu), w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest podstwiona, włączona lub wycięta i/lub d) pochodne wymienionych białek, fragmentów lub mutantów, zawierające na końcu aminowym resztę metioniny lub zmodyfikowanej metioniny (takiej jak formylometionina lub inne gatunki zablokowanej metioniny).

Zwykle z hodowli można wyizolować dojrzały czynnik martwicy nowotworu, jeśli komórka ssaka jest transformowana a) wektorem zawierającym gen strukturalny całego czynnika martwicy nowotworu (łącznie z 5' kodonem startowym) lub b) wektorem zawierającym gen dojrzałego czynnika martwicy nowotworu lub pochodnej czynnika martwicy nowotworu powiązany funkcyjnie z eukariotycznym liderem wydzielającym (który może również zawierać presekwencję lidera czynnika martwicy nowotworu), po czym taką komórkę hoduje się.

Podobnie, jeśli DNA kodujący TNF jest funkcyjnie związany w wektorze z liderem wydzielającym, prawidłowo działającym w transformowanej komórce gospodarza (zwykle organizmu, z którego otrzymano sekwencję lidera wydzielającego), gospodarz jest transformowany tym wektorem i hodowany, to czynnik martwicy nowotworu jest syntetyzowany bez metioniny lub blokowanej metioniny na końcu aminowym. Szczególnie E.coli transformowana wektorami, w których DNA kodujący dojrzały czynnik martwicy nowotworu jest zligowany końcem 5' z DNA kodującym polipeptyd sygnałowy STU enterotoksynę, będzie produkować dużą ilość hybrydowego pre-białka do dojrzałego czynnika martwicy nowotworu. Dobór lidera wydzielających i komórek gospodarza wpływa również na prawidłowy transport dojrzałego białka do periplazmy komórki.

Wynalazek obejmuje również wydzielanie pochodnych czynnika martwicy nowotworu innych niz warianty sekwencji aminokwasowej i glikozylacji. Takie pochodne są powiązane kowalencyjnie lub w postaci agregatów z cząsteczkami chemicznymi. Pochodne można ogólnie podzielić na trzy klasy: sole, cząsteczki o zmodyfikowanych kowalencyjnie łańcuchach bocznych i resztach końcowych i kompleksy adsorbcyjne.

Jeśli DNA kodujący dojrzały czynnik martwicy nowotworu jest funkcyjnie związany z wektorem, wektor używa się do transformacji komórki gospodarza, a komórki hoduje, dojrzały czynnik martwicy nowotworu znajduje się w cytoplazmie komórki. Dlatego nie jest konieczne wprowadzanie układu wydzielającego, w celu otrzymania dojrzałego czynnika martwicy nowotworu. Jest to nieoczekiwane, ponieważ zwykle bezpośrednio ekspresja prowadzi do powstania białka metionylowanego. Co więcej białko jest stabilne i rozpuszczalne w hodowli komórek rekombinantowych, to jest me podlega ono rozszczepieniu ani nie odkłada się w postaci załamujących światło ciałek. Tak więc nowa fermentacja prowadzi do uzyskania komórek niższych eukariotów lub prokanotów zawierających niemetylowany, dojrzały czynnik martwicy nowotworu w cytoplazmie.

Czynnik martwicy nowotworu można otrzymać w hodowlach linii komórek zwierzęcych to jest linii komórek monocytów indukowanych 4-beta-forbol-12-mirystyniano-13-octanem (PMA) lub liniami komórek, takimi jak hybrydomy lub komórki transformowane EBV (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4464465), korzystne jest jednak syntetyzowanie czynnika martwicy nowotworu w hodowli komórek rekombinantowych sposobem opisanym później.

Jeśli wytwarza się czynnik martwicy nowotworu drogą fermentacji to ogólnie rzecz biorąc, oczyszcza się go poprzez oddzielenie supernatantu hodowli lub zlizowanie komórek, odrzucenie części stałych, zaadsorbowanie czynnika martwicy nowotworu (TNF) z supernatantu (zawierającego TNF i inne białka) na substancji hydrofobowej, elucję TNF z tej substancji, adsorbcji TNF na anionowej żywicy jonowymiennej (amina trzeciorzędowa), elucję TNF z żywicy, ponowną adsorb6

155 778 cję TNF na anionowej żywicy jonowymiennej (korzystnie amina czwartorzędowa) o jednakowej wielkości cząsteczek i elucję TNF z żywicy. Mieszaniny zawierające TNF ewentualnie mogą być zatężane i oczyszczane przez chromatoogniskowanie w każdym etapie oczyszczania, na przykład przez elektroogniskowanie lub przepuszczanie przez żel odsiewający taki jak Sephadex G-25.

Dla zastosowania terapeutycznego oczyszczony czynnik martwicy nowotworu z hodowli komórek rekombinantowych lub indukowanych łączy się z obojętnymi fizjologicznie stabilizatorami i wypełniaczami i przygotowuje się preparat w formie liofilizatu w ampułkach lub stabilizowanego roztworu wodnego. Alternatywnie, czynnik martwicy nowotworu można włączać do matrycy polimerowej do implantancji w miejsce nowotworu lub jego chirurgicznego usunięcia, w celu osiągnięcia uwalniania TNF w czasie, przy umiejscowionej wysokiej koncentracji gradiento wej.

Kompozycje zawierające nowy TNF są wolne od zakażeń czynnikami cytotoksycznymi takimi jak limfotoksyna, interferony, lub inne białka cytotoksyczne opisywane w literaturze. Jednakże przy stosowaniu terapeutycznym korzystne jest łączenie czynnika martwicy nowotworu z odpowiednimi ilościami limfotoksyny i/lub interferonu. Szczególnie użyteczne są kompozycje zawierające czynnik martwicy nowotworu interferon taki jak /--interferon, ponieważ wykazują one synergistyczne działanie cytotoksyczne.

Kompozycje zawierające czynnik martwicy nowotworu podaje się istotom żywym, szczególnie pacjentom cierpiącym na nowotwór złośliwy, w dawkach terapeutycznie skutecznych. Odpowiednie dawki muszą być ustalone przez lekarza jak to opisano poniżej.

Figura 1 rys. przedstawia profil elucji czynnika martwicy nowotworu ze szkła o określonej wielkości por, fig. 2 - profil elucji czynnika martwicy nowotworu z DEAE-celulozy, fig. 3 - profil elucji czynnika martwicy nowotworu w metodzie szybkiej chromatografii cieczowej białek, fig. 4 -profil elucji czynnika martwicy nowotworu w chromatoogniskowaniu, fig. 5 - oznaczenia ciężaru cząsteczkowego czynnika martwicy nowotworu metodą elektroforezy żelowej SDS PAGE, fig. 6 -oznaczenie ciężaru cząsteczkowego czynnika martwicy nowotworu metodą HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa), fig. 7 - profil elucji czynnika martwicy nowotworu w HPLC z kolumny C4, fig. 8 - rozdział fragmentów czynnika martwicy nowotworu po trawieniu trypsyną, metodą HPLC, fig. 9 - przedstwia działanie cytotoksyczne mieszaniny y-interferonu i czynnika martwicy nowotworu, fig. 10 - sekwencję nukleotydową i aminokwasową pre-czynnika ludzkiej martwicy nowotworu, zawierającej kompletny lider wydzielający czynnika martwicy nowotworu, fig. 11 - konstrukcję wektora ekspresyjnego czynnika martwicy nowotworu.

Dla celów tego opisu, czynnik martwicy nowotworu definiuje się jako polipeptyd różny od limfotoksyny, wykazujący preferencyjną aktywność cytotoksyczną i zawierający odcinek wykazujący funkcjonalną homologię aminokwasów z sekwencją aminokwasową dojrzałego czynnika martwicy nowotworu przedstawioną na fig. 10, jego fragment, względnie pochodną takiego polipeptydu lub fragmentu.

Preferencyjną aktywność cytotoksyczną definiuje się jako preferencyjne niszczenie lub hamowanie wzrostu komórek nowotworu, w porównaniu z komórkami prawidłowymi w tych samych warunkach. Preferencyjną aktywność cytotoksyczną oznacza się porównując działanie polipeptydu na komórki nowotworu i normalne komórki lub tkanki in vivo i in vitro. Cechą diagnostyczną w doświadczeniach in vitro jest liza komórek, natomiast w doświadczeniach in vivo martwica nowotworu. Aktywność cytotoksyczną można jednak oznaczać jako aktywność cytostatyczną lub aktywność antyproliferacyjną. Odpowiednie układy testowe są znane. Na przykład akceptowany jest opisany poniżej test na lizę komórek do określenia specyficznej aktywności czynnika martwicy nowotworu, a także test opisany w B. Aggarwal et.al. w „Thymic Hormones and Limphokines, 1983, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center (linia komórek A549 opisana w tej literaturze jest dostępna w kolekcji ATCC jako CCL185).

Specyficzną aktywność TNF oblicza się raczej w stosunku do lizy komórki docelowej, a nie na podstawie działania cytotoksycznego. Jedną jednostkę czynnika martwicy nowotworu definiuje się jako ilość potrzebną do 50% lizy komórek docelowych umieszczonych w każdej studzience, według przykładu I. Jednak nie wyklucza to stosowania innych metod mierzenia aktywności specyficznej, np. opartych na współczynniku wzrostu komórek docelowych.

155 778

PreTNF jest to gatunek czynnika martwicy nowotworu objęty definicją czynnika martwicy nowotworu. Gatunek ten zawiera w cząsteczce polipeptyd sygnałowy (czyli lider), który służy do post-translacyjnego skierowania białek do wewnątrz lub na zewnątrz komórki. Zwykle polipeptyd sygnałowy (który sam nie wykazuje aktywności czynnika martwicy nowotworu) zostaje proteolitycznie odszczepiony od pozostałego białka wykazującego aktywność czynnika martwicy nowotworu, w procesie transportu białek do periplazmy komórki gospodarza lub do płynu hodowlanego. Peptyd sygnałowy może pochodzić z drobnoustroju lub ssaka (włącznie z natywną presekwencją liczącą 76 reszt aminokwasów), ale korzystne jest jeśli peptyd ten jest homologiczny do komórki gospodarza.

Natywny czynnik martwicy nowotworu ze źródeł biologicznych wykazuje wyliczony na podstawie elektroforezy w żelu poliakiydoamidowym w obecności siarczanu dodecylu (SDS-PAGE) ciężar cząsteczkowy 17000, punkt izoelektryczny około 5,3 i wrażliwość na hydrolizę trypsyną w wielu miejscach cząsteczki. Natywny czynnik martwicy nowotworu oczyszczony metodą HPLC z odwróconymi fazami hydrolizuje się pod wpływem trypsyny na przynajmniej 9 fragmentów w niżej opisanych warunkach. Dokładna liczba fragmentów, na jakie czynnik martwicy nowotworu hydrolizuje pod wpływem trypsyny zależy od takich czynników jak aktywność trypsyny, stężenie czynnika martwicy nowotworu oraz parametry inkubacji, jak siła jonowa, pH, temperatura i czas inkubacji.

Czynnik martwicy nowotworu nie wydaje się być glikoproteidem, ponieważ nie wykazuje powinowactwa do kolumny lektynowej i analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasów nie wykazuje miejsca glikozylacji. Również produkt wytworzony w hodowli rekombinantowej E.coli (która me ma zdolności glikozylacji) w analizie SDS-PAGE migruje razem z naturalnym TNF.

Stopień homologii sekwencji aminokwasów wymagany, aby polipeptyd był uznany za czynnik martwicy nowotworu zalezy od tego czy homologia tego pohpeptydu i czynnika martwicy nowotworu występuje w odcinku odpowiedzialnym za aktywność cytotoksyczną, czy poza nim. Odcinki krytyczne dla cytotoksycznej aktywności winny wykazywać wysoki stopień homologii, podczas gdy sekwencje nie związane z aktywnością czynnika martwicy nowotworu lub z wiązaniem receptora mogą wykazywać stosunkowo niską homologię. Poza tym krytyczne odcinki mogą wykazywać aktywność cytolityczną i pozostawać homologiczne według podanej tu definicji, jeśli reszty aminokwasowe funkcjonalnie podobnego łańcucha bocznego są podstawione. Termin funkcjonalnie podobny odnosi się do podstawowej charakterystyki łańcucha bocznego takiej jak charakter zasadowy, obojętny lub kwaśny oraz wielkość grup (małe lub duże przestrzennie). Podana tutaj definicja czynnika martwicy nowotworu wyklucza jednak limfotoksyny.

Ogólnie, polipeptyd zdefiniowany jako czynnik martwicy nowotworu zawiera odcinki wykazujące podstwową homologię z białkiem przedstawionym na fig. 10 lub jego fragmentem, w ciągłym bloku 20-100 reszt aminokwasowych, szczególnie w bloku obejmującym reszty 35-66 i 110-133.

Najważniejszym czynnikiem dla określenia identyczności polipeptydu jako czynnika martwicy nowotworu jest występowanie zdolności neutralizowania aktywności cytolitycznej danego polipeptydu przez te same przeciwciała, które neutralizują aktywność czynnika martwicy nowotworu przedstwionego na fig. 10. Jednak należy pamiętać, że identyczność immunologiczna i identyczność cytotoksyczną nie zawsze idą w parze. Przeciwciało neutralizujące czynnik martwicy nowotworu przedstawiony na fig. 10 może nie wiązać białka będącego kandydatem do grupy czynników martwicy nowotworu, ponieważ miejsce wiązania przeciwciała przypada na region nie związany z aktywnością cytotoksyczną. Przeciwciało może być wiązane przez region obojętny i wykazywać swoje działanie neutralizujące dzięki hamowaniu sterycznemu. Tak więc białko zmutowane w tym obojętnym regionie może nie wiązać przeciwciała neutralizującego, ale mimo to jest czynnikiem martwicy nowotworu pod względem podstawowej homologii i aktywności biologicznej.

Ważną jest obserwacja, ze takie cechy jak ciężar cząsteczkowy, punkt izoelektryczny itp. dla natywnego lub dzikiego typu dojrzałego czynnika martwicy nowotworu przedstawionego na fig. 10, otrzymanego z limfocytów lub ustabilizowanych linii komórkowych, charakteryzują jedynie natywne gatunki czynnika martwicy nowotworu. Czynnik martwicy nowotworu według przedstawionej powyżej definicji obejmuje inne gatunki, które nie wykazują wszystkich cech natywnego

155 778 czynnika martwicy nowotworu. Termin czynnik martwicy nowotworu według przedstawionej definicji obejmuje natywny czynnik martwicy nowotworu i inne pochodne polipeptydy cytotoksyczne. Przykładowo, takie pochodne TNF jak mutanty ze wstawką, mutanty z delecją lub białka fuzyjne opisane powyżej, zmieniają ciężar cząsteczkowy określony dla natywnego czynnika martwicy nowotworu (białka fuzyjne z dojrzałym czynnikiem martwicy nowotworu lub preTNF, a także mutanty ze wstawką będą wykazywały ciężar cząsteczkowy wyższy od ciężaru cząsteczkowego natywnego czynnika martwicy nowotworu, natomiast mutanty z delecją będą wykazywały ciężar cząsteczkowy niższy od ciężaru natywnego czynnika martwicy nowotworu). Poza tym, czynnik martwicy nowotworu może być konstruowany w taki sposób, aby ograniczyć lub wyeliminować wrażliwość na hydrolizę trypsyną lub innymi proteazami. Wreszcie, post-translacyjne procesy ludzkiego preTNF w liniach komórkowych pochodzących od ssaków, z wyłączeniem ssaków naczelnych, mogą powodować powstanie mikroheterogeniczności w terminalnym regionie cząsteczki tak, że walina może nie być końcowym aminokwasem.

Sekwencja aminokwasów ludzkiego czynnika martwicy nowotworu wydedukowana z cDNA, przedstawiona jest na fig. 10. Dojrzały lub natywny czynnik martwicy nowotworu obejmuje reszty 1-157. Należy zauważyć, że sekwencja ta zawiera sekwencję sygnałową obejmującą 76 reszt aminokwasów, która jak się przypuszcza jest usuwana podczas procesu translacji transkryptu do wytworzenia dojrzałego białka. Miejsca hydrolizy trypsyną są zaznaczone strzałkami.

Należy podkreślić, że termin „zdolny¹¹ do aktywności cytotoksycznej, lub do wywoływnia martwicy nowotworu m vivo, oznacza że definicja czynnika martwicy nowotworu obejmuje również polipeptydy, które mogą być przekształcone, na przykład przez hydrolizę enzymatyczną z formy nieaktywnej, analogicznej do zymogenu, do fragmentu polipeptydu wykazującego żądaną aktywność biologiczną. Typowym nieaktywnym prekursorem są białka fuzyjne, w których dojrzały czynnik martwicy nowotworu jest powiązany wiązaniem peptydowym na swym karboksylowym końcu z białkiem ludzkim lub jego fragmentem. Sekwencja przy tym wiązaniu peptydowym lub w jego pobliżu jest tak dobrana, aby była wrażliwa na hydrolizę proteolityczną uwalniającą czynnik martwicy nowotworu, albo in vivo, albo m vitro, jako część preparatyki. Tak otrzymany czynnik martwicy nowotworu wykazuje definiowaną aktywność cytotoksyczną.

Pomimo, że zwykle termin czynnik martwicy nowotworu oznacza ludzki czynnik martwicy nowotworu wykazuje zdefiniowaną aktywność cytotoksyczną.

Pomimo, że zwykle termin czynnik martwicy nowotworu oznacza ludzki czynnik martwicy nowotworu, to czynnik martwicy nowotworu otrzymany z innych źródeł, jak mysi, wieprzowy, koński lub wołowy, jest również objęty definicją czynnika martwicy nowotworu jeśli odpowiada standardowi pod względem homologii odcinków i aktywności cytotoksycznej. TNF nie wykazuje specyficzności gatunkowej, to jest ludzki TNF działa na nowotwór mysi. Tak wiąc TNF z jednego gatunku może być stosowany w terapii drugiego gatunku.

Termin czynnik martwicy nowotworu obejmuje również formy multimeryczne. Czynnik martwicy nowotworu spontanicznie agreguje z wytworzeniem multimerów, przeważnie dimerów lub wyższych multimerów. Multimery są cytotoksyczne i w związku z tym są odpowiednie do stosowania w terapii in vivo. Pomimo, że pożądane jest określanie i otrzymywanie czynnika martwicy nowotworu jako całkowicie homogennego multimeru lub monomeru, może on być stosowany w terapii jako mieszanina różnych multimerów.

Termin czynnik martwicy nowotworu obejmuje również pochodne czynnika martwicy nowotworu. Pochodne obejmują mutanty sekwencji aminokwasowej, warianty glikozylacji i kowalencyjne lub zagregowane koniugaty z innymi cząsteczkami chemicznymi. Pochodne kowalencyjne otrzymuje się przez przyłączenie cząsteczki funkcyjnej do odpowiednich grup w łańcuchach bocznych lub na końcach C- i N-terminalnych TNF, metodami znanymi. Pochodne te mogą na przykład obejmować alifatyczne estry lub amidy końcowej grupy karboksylowej lub grup karboksylowych w łańcuchach bocznych, np. asp 10 O-acylo pochodne reszt zawierających grupę hydroksylową takich jak ser52, ser3, ser4 lub ser5 N-acylo-pochodne aminokwasu terminalnego lub aminokwasów zawierających grupę aminową, np. lizyny lub argininy i pochodne cyslOl i cys69. Grupa acylowa należy do grup alkilowych (włącznie z alkilowymi grupami o 3-10 atomów węgla) i tworzy gatunki alkanoilowe pochodnych lub pochodzi ze związków karboksylowych lub heterocyklicznych i tworzy gatunki aroilowe pochodnych. Korzystne jest, gdy grupa reaktywna pochodzi z

155 778 dwufunkcyjnego związku znanego z zastosowania do wiązania krzyżowego białek do nierozpuszczalnych matryc, poprzez reaktywne grupy boczne. Korzystnymi miejscami do tworzenia pochodnych są reszty cysteiny i histydyny.

Kowalencyjne lub agregacyjne pochodne są przydatne jako odczynniki w testach immunologicznych lub w technikach oczyszczania przez chromatografię przez powinowactwo. Na przykład, wytwarza się nierozpuszczalną formę czynnika martwicy nowotworu przez kowalencyjne powiązanie z Sepharozą aktywowaną bromocyjanem, metodą znaną lub przez zaadsorbowanie na powierzchni poliolefinowej (z zastosowaniem sieciowania aldehydem glutarowym lub bez niego) do stosowania w testach lub oczyszczaniu przeciwciał anty-TNF lub receptorów komórkowych. Czynnik martwicy nowotworu można znakować łatwo wykrywalnymi grupami np. izotopem jodu, metodą z użyciem chloroaminy T, poprzez wiązanie kowalencyjne do metali ziem rzadkich lub koniugację do innej cząsteczki fluoryzującej, do stosowania w testach diagnostycznych, szczególnie w diagnozie poziomu TNF w próbkach biologicznych testami immunologicznymi typu kompetytywnego. Takie pochodne są objęte podaną wyżej definicją TNF, ponieważ nie jest konieczne, aby wykazywały aktywność cytotoksyczną, a jedynie reakcję krzyżową z anty-TNF.

Mutanty czynnika martwicy nowotworu obejmują preterminowane, to jest specyficzne co do miejsca, mutacje TNF lub jego fragmentów. Celem mutagenezy jest skonstruowanie DNA, który koduje czynnik martwicy nowotworu odpowiadający podanej powyżej definicji, to jest czynnik martwicy nowotworu, który wykazuje aktywność cytotoksyczną wobec komórek nowotworu in vitro lub powoduje martwicę nowotworu in vivo, i który zachowuje resztkową homologię do struktury przedstawionej na fig. 10, lecz który również wykazuje polepszone właściwości i aktywność. Mutant czynnika martwicy nowotworu definiuje się jako polipeptyd, który odpowiada definicji czynnika martwicy nowotworu, jeśli chodzi o występowanie homologii, lecz który ma sekwencję aminokwasów różną od sekwencji czynnika martwicy nowotworu z powodu delecji, podstwiema lub wstawienia. Na przykład reszty lizyny lub argininy czynnika martwicy nowotworu (arginina 2, 6, 82,44 i 131 i lizyna 98, 90 i 65) mogą być zmutowane do histydyny lub innej reszty aminokwasowej, która nie zmienia wrażliwości białka na proteazę. Podobnie, cysteina 101 może być zastąpiona innymi resztami i usieciowana chemicznie, w celu uzyskania stabilności oksydatywnej. Nie jest konieczne, aby mutant spełniał wymagania dotyczące aktywności czynnika martwicy nowotworu, ponieważ nawet biologicznie nieaktywne mutanty są po wyznakowaniu lub immobilizacji, użyteczne jako odczynniki w testach immunologicznych. Jednak, w tym przypadku mutanty muszą zawierać przynajmniej jedno miejsce, które reaguje krzyżowo z przeciwciałem na czynnik martwicy nowotworu.

Regiony cząsteczki czynnika martwicy nowotworu obejmujące reszty 35-66 i 110-133 wykazują homologię (50%) z limfotoksyną. Hydrofobowy koniec karboksylowy (w cząsteczce czynnika martwicy nowotworu reszty od 150 do 157) obu cząsteczek jest również podobny. Ponieważ oba białka wykazują aktywność cytotoksyczną lub in vivo wywołują martwicę nowotworu, regiony te wydają się być ważne dla aktywności obu tych czynników. Jako takie, reszty aminokwasowe tych regionów mogą być szczególnie korzystnie mutowane z osiągnięciem pośredniego lub bezpośredniego wpływu na aktywność czynnika martwicy nowotworu, obejmujący reszty od 67 do 109, może wpływać na odpowiednią pozycję dwu sąsiadujących odcinków, stosunkowo homologicznych, ważnych dla cytotoksycznej aktywności. Taka pozycja, która pozwala na wytworzenie wiązania siarkowego pomiędzy cys 69 - cys 101 w cząsteczce czynnika martwicy nowotworu, może być podobnie osiągnięta dla podobnego regionu limfotoksyny i może powodować różnice w specyficzności i aktywności dwu cząsteczek. W tym przypadku, ponieważ te reszty aminokwasowe stanowią centrum aktywne czynnika martwicy nowotworu, mogą one być syntetyzowane chemicznie lub drogą mutagenezy z delecją, co prowadzi do wytworzenia krótkich polipeptydów wykazujących aktywność czynnika martwicy nowotworu.

Ponieważ miejsce mutacji jest preterminowane, konieczne jest aby sama mutacja była predeterminowana. Na przykład w celu otrzymania mutantów w pozycji reszty 131, prowadzi się zwykłą mutację kodonu dla argininy 131 i powstały czynnik martwicy nowotworu testuje się na optymalną kombinację aktywności cytotoksycznej i oporności na proteazę. Techniki wykonywania mutacji z podstawieniem w predeterminowanym miejscu DNA, są dobrze znane, na przykład M 13 primer mutageneza.

155 778

Mutagenezę czynnika martwicy nowotworu prowadzi się przez włączenie aminokwasów, zwykle w ilości 1-10 reszt aminokwasowych albo przez delecję aminokwasów w ilości 1-30 reszt aminokwasowych. Dla uzyskania ostatecznej konstrukcji można używać podstawienia, delecji, wstawek lub każdej innej kombinacji. Wstawki obejmują fuzje na końcu aminowym lub karboksylowym, np. przyłączenie cząsteczki hydrofobowej do końca karboksylowego. Korzystne jest jednak prowadzenie jedynie mutagenezy jedynie z podstawieniem. Oczywiście, mutacje kodującego DNA nie mogą występować w sekwencji poza obszarem odczytu i korzystne jest jeśli nie występują w regionach komplementarnych wytwarzających drugorzędową strukturę mRNA.

Nie wszystkie mutacje w DNA kodującym czynnik marwicy nowotworu podlegają ekspresji w końcowym wydzielanym produkcie. Na przykład duża ilość mutacji z podstawieniem, są to mutacje, w których różne lidery wydzielające czyli białka sygnałowe są podstawiane zamiast natywnego lidera wydzielającego czynnika martwicy nowotworu, albo przez delecję wewnątrz sekwencji lidera, albo przez podstawienie, w którym cały lub duża część natywnego lidera jest zmieniona na lider lepiej rozpoznawany przez komórkę gospodarza. Na przykład, przy konstruowaniu prokariotycznego wektora ekspresyjnego ludzki lider wydzielający podlega delecji na korzyść liderów alkalicznej fosfatazy lub odpornej na ogrzewnie enterotoksyny II, a w przypadku drożdży lider ten jest zastąpiony liderami inwertazy drożdży, czynnika a lub fosfatazy kwaśnej. Jednak ludzki lider wydzielający może być rozpoznany przez komórki różne od ludzkich, bardziej prawdopodobnie przez komórki wyższych eukariotów. Jeśli lider wydzielający jest „rozpoznawany przez gospodarza, białko fuzyjne zlozone z czynnika martwicy nowotworu i lidera zwykle jest rozszczepiane na wiązaniu peptydowym lider-czynnik martwicy nowotworu i czynnik martwicy nowotworu jest wydzielany. Tak więc, nawet jeśli mutant pre-TNF DNA jest stosowany do transformacji gospodarza i mutant pre-TNF jest syntetyzowany jako związek pośredni, to powstały czynnik martwicy nowotworu jest natywnym czynnikiem martwicy nowotworu.

Inną dużą grupą mutacji DNA, które nie podlegają ekspresji jako pochodne czynnika martwicy nowotworu są podstawienia nukleotydów wykonywane w celu zwiększenia ekspresji, głównie dla uniknięcia powstawania pętli w transkrybowanym mRNA (patrz zgłoszenie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 303 687) lub wprowadzenie kodonu łatwiej transkrybowanego przez wybranego gospodarza, np. dobrze znanych kodonów preferencyjnych dla E.coli, do szczepów E.coli.

Termin „zasadniczo homogenny czynnik martwicy nowotworu oznacza, że czynnik martwicy nowotworu jest zasadniczo wolny od innych natywnych białek pochodzących ze źródła, z którego czynnik ten izolowano. Znaczy to, że homogenny czynnik martwicy nowotworu jest zasadniczo wolny od białek plazmy krwi, takich jak albumina, fibrynogen, proteazy serynowe, ff-globuliny, polipeptydy nie wykazujące aktywności czynnika martwicy nowotworu takie jak limfotoksyna lub interferony lub inne białka komórkowe organizmu, który służy jako syntetyczne źródło czynnika martwicy nowotworu, włącznie z całymi komórkami, a szczególnie resztkami komórek. Jednak homogenny czynnik martwicy nowotworu może zawierać takie substancje jak stabilizatory i zarobki opisane poniżej, określoną ilość białek z komórki lub organizmu, który służy jako syntetyczne źródło białka inne niż białka komórek lub organizmu, z których pochodzi czynnik martwicy nowotworu oraz syntetyczne polipeptydy takie jak poli-L-lizyna. Rekombinantowy czynnik martwicy nowotworu, który ulega ekspresji w allogenicznych, to jest bakteryjnych, komórkach gospodarza jest oczywiście całkowicie wolny od białek organizmu, z którego pochodzi gen.

Czynnik martwicy nowotworu korzystnie jest syntetyzować w hodowlach organizmów rekombinantowych. Limfocyty krwi obwodowej (P BLs) i linie komórkowe nie są pożądane. W praktyce trudne jest otrzymanie P BLs jednego rodzaju, wolnych od zanieczyszczeń komórkami innego rodzaju, np. otrzymać makrofagi wolne od komórek B lub T. Takie zanieczyszczenia utrudniają procdurę oczyszczania produktów ze względu na wytwarzanie własnych potencjalnych czynników cytotoksycznych i białek, uwalnianych do środowiska. Co więcej, czynnik martwicy nowotworu uzyskany z nierekombinantowej hodowli jest kosztowny i składa się głównie z natywnego czynnika martwicy nowotworu, a więc takie hodowle są pozbawione „elastyczności hodowli rekombinowanych pod względem polepszenia charakterystyki czynnika martwicy nowotworu.

DNA kodujący czynnik martwicy nowotworu otrzymuje się drogą syntezy chemicznej, poddając skriningowi odwrotne tranaskrypty mRNA z hodowli pBL lub linii komórkowych, albo poddając skriningowi bank genów jakiejkolwiek komórki. Hodowle odpowiednich komórek

155 778 zawierające komórki monocytarne, takie jak linie komórek premielocytowych oznaczone „HL-60 (jedna z nich jest osiągalna w ATCC jako CCL 240) lub linia komórek histocytarnych U 937 (ATCC CRL 1593). Te i inne linie komórkowe są indukowane w celu wytwarzania i wydzielania czynnika martwicy nowotworu znanymi czynnikami chemicznymi lub fizycznymi, głównie czynnikami rakotwórczymi lub mitogenicznymi. Czynnik martwicy nowotworu może być efektywnie indukowany u pewnych linii komórek monocytarnych jedynie PMA, natomiast inne znane czynniki takie jak lipopolisacharydy, stafilokokowa entertoksyna B lub tymozyna alfa-1, nie są tak efektywne. Ze względu na niezliczoną ilość skriningów, które należy wykonać dla zlokalizowania komórek wytwarzających czynnik martwicy nowotworu (i co za tym idzie zawierających żądany mRNA) bardziej efektywną drogą może być prosta synteza genu. Synteza taka jest korzystna, ponieważ można wprowadzić unikalne miejsca restrykcyjne (co ułatwia zastosowanie genu jako wektora zawierającego miejsca restrykcyjne inne niż w sekwencji natywnej), a także polepszyć wydajność translacji, jak to opisano poniżej.

DNA znakuje się przez kowalencyjne połączenie z wykrywalną substancją, taką jak grupa wykazująca fluorescencję, atom radioaktywny lub grupa wykazująca chemoluminescencję, znanymi metodami. DNA jest następnie używany w próbach hybrydyzacji. Próby takie są podejmowane dla identyfikacji wektorów TNF i transformantów, jak opisano w przykładach poniżej lub dla diagnoz m vitro, takich jak wykrywanie mRNA TNF w komórkach krwi.

mRNA dla TNF, nieoczekiwanie, występuje stosunkowo rzadko, nawet w indukowanych komórkach HL-60, być może ze względu na niestabilność messengera powodowaną nieznanymi przyczynami. Ważny jest również czas pojawiania się nRNA TNF po indukcji komórki. mRNA TNF pojawia się w komórce jedynie krótki czas w około 4 godziny po indukcji. Pod tym względem jego pojawianie się różni się od pojawienia się limfotoksyny, która występuje w około 12 godzin po indukcji. Dlatego łatwo jest przeoczyć pojawienie się mRNA TNF. Jednakże jeśli dysponuje się kompletnie komplementarnym DNA, skrining banku cDNA staje się czynnością rutynową. Dwa banki faga HL-60 poddawane sknningowi, jak to opisano w przykładach, zawierają stosunkowo dużą ilość pozytywnych łysinek i rutynowa próba hybrydyzacji pozwala na zidentyfikowanie faga zawierającego żądany cDNA.

Komórki linii HL-60 syntetyzujące czynnik martwicy nowotworu są początkowo hodowane metodą znaną, do osiągnięcia gęstości około 8-12 X 10⁵ komórek/ml. Komórki oddziela się od hodowli, przemywa i przenosi na podłoże nie zawierające surowicy, zawierające natomiast PMA. Hodowlę prowadzi się aż do osiągnięcia żądanego stężenia czynnika martwicy nowotworu w płynie hodowlanym, zwykle około 400 jednostek czynnika martwicy nowotworu/ml. Następnie supernatant hodowli klaruje się, korzystnie przez wirowanie lub inną metodą oddzielającą nierozpuszczalne części komórek, od składników rozpuszczalnych. Wirowanie należy prowadzić przy niskich szybkościach, aby usunąć tylko cząsteczki zawieszone. Supernatant oczyszcza się następnie metodą poniżej opisaną.

Alternatywnie i korzystnie, czynnik martwicy nowotworu syntetyzuje się w komórkach transformowanych wektorami zawierającymi DNA kodujący czynnik martwicy nowotworu. Wektor jest to skonstruowana, dająca się replikować cząsteczka DNA. Wektory są używane albo dla wzmocnienia DNA kodującego czynnik martwicy nowotworu i/lub w celu ekspresji DNA kodującego czynnik martwicy nowotworu. Wektor ekspresyjny jest dającą się replikować, skonstruowaną cząsteczką DNA, w której sekwencja DNA kodująca czynnik martwicy nowotworu jest funkcyjnie związana z odpowiednią sekwencją kontrolną, zdolną do wywołania ekspresji czynnika martwicy nowotworu u odpowiedniego gospodarza. Taka sekwencja kontrolna obejmuje promotor transkrypcji, ewentualnie sekwencję operatorową do kontroli transkrypcji, sekwencję kodującą rybozomalne miejsca wiązania odpowiedniego mRNA i sekwencje kontrolne zakończenia transkrypcji i translacji.

Wektory obejmują plazmidy, wirusy (włącznie z fagami) i integralne fragmenty DNA (to jest włączane do genomu gospodarza przez rekombinację). Po transformacji odpowiedniego gospodarza, wektor replikuje się i funkcjonuje od genomu gospodarza lub może, w pewnych przypadkach, być włączany do samego genomu. W niniejszym opisie termin (wektor jest jednoznaczny z terminem „plazmid, lecz plazmidy są obecnie najpowszechniej używaną formą wektorów. Jednak wszystkie inne formy wektorów posiadające równoznaczne funkcje i które są lub stają się znane, są

155 778 odpowiednie do zastosowania zgodnie z wynalazkiem. Odpowiednie wektory zawierają replikon i sekwencję kontrolną, która pochodzi z gatunków dających się pogodzić z gatunkiem wybranego gospodarza. Transformowane komórki gospodarza, są to komórki, które były poddane transformacji, lub transfekcji wektorami czynnika martwicy nowotworu skonstruowanymi przy użyciu techniki rekombinancji DNA. Transformowane komórki gospodarza zwykle wytwarzają czynnik martwicy nowotworu. Wytworzony czynnik martwicy nowotworu jest odkładany w komórce, lub wydzielany albo do przestrzeni periplazmicznej, albo do supernatantu hodowli, w zależności od wybranej komórki gospodarza.

Odcinki DNA są powiązane funkcjonalnie, jeśli ich funkcje są zależne od siebie. Na przykład DNA dla presekwencji lub lidera wydzielającego jest związany funkcyjnie z DNA dla polipeptydu, jeśli jest on wytwarzany w postaci pre-ciała, które bierze udział w wydzielaniu polipeptydu, promotor jest funkcyjnie związany z sekwencją kodującą jeśli kontroluje on transkrypcję tej sekwencji lub miejsce wiązania rybozomu jest funkcyjnie związane z sekwencją kodującą, jeśli jest tak umieszczone, że pozwala na translację. Ogólnie, termin „powiązane funkcyjnie znaczy sąsiadujące, a w przypadku liderów wydzielających sąsiadujące w fazie odczytu.

Odpowiednimi komórkami gospodarza są komórki prokariotów, drożdży lub wyższych eukariotów. Prokarioty obejmują Gram-ujemne i Gram-dodatnie organizmy, na przykład E.coli lub Bacilli. Wyższe komórki eukariotyczne, włącznie z ustabilizowanymi liniami komórkowymi pochodzącymi od ssaków, opisane są poniżej. Korzystną komórką gospodarza jest odporny na faga szczep. E.coli W3110 (ATCC 27,325) opisany w przykładach, chociaż inne prokarioty, takie jak E.coli,B, E.coli Χ1776 (ATCC 31, 537), E.coli 294 (ATCC 31, 446), gatunki Pseudomonas lub Serratia marcesans są również odpowiednie.

Układy gospodarz - wektor pochodzenia prokariotycznego są korzystne dla ekspresji czynnika martwicy nowotworu. Ponieważ cząsteczka czynnika martwicy nowotworu zawiera dwie reszty cysteiny, wprowadzenie średniego potencjału potrzebnego w procesach post-translacyjnych do wytworzenia wiązania dwusiarczkowego powoduje, ze np. E.coli wytwarza biologicznie aktywny czynnik martwicy nowotworu. Dostępnych jest wiele odpowiednich wektorów bakteryjnych. Ogólnie, wektor bakteryjny zawiera region replikacji rozpoznawany przez wybranego gospodarza, promotor, który będzie funkcjonował u gospodarza i gen fenotypowej selekcji, na przykład gen kodujący odpowiedzialność za oporność na antybiotyk lub gen auksotrofa. Podobnie akonstruowane wektory są wytwarzane dla różnych gospodarzy. E.coli transformuje się na ogół przy użyciu pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunku E.coli (Bolivaretal., 1977, „Gene 2,95). Plazmid pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę i dlatego ułatwia identyfikację komórek transformowanych.

Wektory muszą zawierać promotory, które są rozpoznawane przez organizm gospodarza. Jest to promotor homologiczny do wybranego gospodarza. Promotory najpowszechniej używane w konstrukcji rekombinantowego DNA obejmują /3-laktamazę (penicylinazę) i lektozowy system promotora (Chang et. al., 1978 „Naturę, 275, 615; i Goeddel et al., 1979 „Naturę 281, 544), tryptofanowy system promotora (trp) (Goeddel et al., 1980 „Nucleic Acid Res.“, 8, 4057 i opublikowane europejskie zgłoszenie patentowe nr 36 776) i tac promotor (H. De Boer et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983). Chociaż wymienione promotory są używane najpowszechniej, inne znane promotory bakteryjne są również odpowiednie. Szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowej są publikowane, podobnie jak sposób ich funkcyjnego związania do DNA kodującego czynnik martwicy nowotworu w wektorach plazmidowych (Siebenlist et al., 1980, „Celi 20, 269) i DNA kodującego czynnik martwicy nowotworu. Obecnie korzystnym wektorem jest pochodna pBR322 zawierająca promotor alkalicznej fosfatazy z E.coli i sekwencję trp ShineDalgarno. Promotor i sekwencja Shine-Dalgarno są funkcyjnie związane do DNA kodującego TNF, to jest tak umieszczone, aby wspomagać transkrypcję mRNA TNF z DNA.

Oprócz prokariotów, drobnoustroje eukariotyczne, takie jak hodowle drożdży są transformowane wektorami kodującymi czynnika martwicy nowotworu. Wśród niższych drobnoustrojów eukariotycznych najpowszechniej stosowane są Saccharomycs cerevisiae, czyli zwykłe drożdże piekarnicze, chociaż dostępnych jest wiele innych szczepów. Wektory drożdzowe zawierają region replikacji z plazmidu drożdżowego o długości 2 mikrony, lub automatycznie replikującą się sekwencję (ARS), promotor, TN F, sekwencje zakończenia poliadenylacji i transkrypcji i gen selekcyjny. Odpowiednim plazmidem do ekspresji czynnika martwicy nowotworu u drożdży jest

155 778

YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, 282, 39; Kimgsman et al., 1979, „Gene“, 7, 141; Tschemper et al., 1980, „Gene“, 10, 157). Plazmid ten zawiera juz gen trpl, który służy jako marker selekcji dla zmutowanego szczepu drożdży, który nie ma zdolności wzrostu na tryptofanie., na przykład ATCC nr 44076 lub PRP4-1 (Jones, 1977, „Genetics“, 85, 12). Obecność trpl w genomie komórki gospodarza drożdzowego stwarza odpowiednie warunki do wykrycia transformacji przez hodowanie w nieobecności tryptofanu.

Odpowiednie sekwencje promotora w wektorach drożdżowych obejmują: takie promotory jak metalotioneinę, kinazę 3-fosfoglicerynianu (Hitzemanet al., 1980, „J. Biol. Chem.“,255,2073)lub inne enzymy glikolityczne (Hess et al., 1968, „Biochemistry“, 17,4900), takie jak enolaza, dehydrogenaza 3-fosfogliceraldehydu, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianu, fosfofruktokinaza, izomeraza glukoz-6-fosforanu, mutaza 3-fosfoglicerynianu, kinaza pirogronianu, izomeraza trójfosforanu, izomeraza fosfoglukozy i glukokinaza. Odpowiednie wektory i promotory do wywołania ekspresji u drożdży są opisane w R. Hitzeman et al. EPO Publ. Nr 73 657.

Inne promotory, które mają tę dodatkową korzyść, że transkrypcja jest kontrolowana przez warunki hodowli, są to odcinki promotora dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradujących związanych z metabolizmem azotu i metalotioneina i dehydrogenaza 3-fosfo-gllceraldehydu, a także enzymy odpowiedzialne za zużywanie maltozy i galaktozy. Przy konstruowaniu odpowiedniego plazmidu ekspresyjnego końcowe sekwencje związane z takim genem są również ligowane w wektorze ekspresyjnym z 3'-końcem sekwencji kodującej TNF, aby umożliwić poliadenylację mRNA i zakończenie.

Oprócz drobnoustrojów jako gospodarze mogą być również używane hodowle komórek pochodzące z organizmów wielokomórkowych. Nie jest to jednak korzystne, ze względu na doskonałe rezultaty otrzymywane jak dotąd przy użyciu drobnoustrojów wytwarzających TNF. W zasadzie może być stosowana hodowla każdych komórek wyższych eukariontów, zarówno spośród kręgowców jak i bezkręgowców. Jednak większe zainteresowanie budzą komórki kręgowców i rozmnażanie komórek kręgowców w hodowlach (hodowle tkankowe) stało się postępowaniem rutynowym w ostatnich latach (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson et al., 1973). Przykładami przydatnych linii komórek gospodarza są takie linie jak komórki VERO i Hela, CHO, WI38, BHK, COS-71 MDCK. Wektory ekspresyjne dla takich komórek zwykle zawierają (jeśli jest to potrzebne) region replikacji, promotor umieszczony powyżej genu, który ma ulegać ekspresji, razem z rybozomalnym miejscem wiązania, miejsce odłączenia mRNA (jeśli stosuje się DNA genomu zawierające mtron), miejsce poliadenylacji i sekwencję zakończenia transkrypcji.

Sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację w wektorach ekspresyjnych stosowanych do transformacji komórek kręgowców często są otrzymywane ze źródeł wirusowych. Na przykład powszechnie stosowane promotory pochodzą z Polyoma, Adenovirus 2 i najkorzystniej Siman Virus 40 (SV 40). Pierwszy i ostatni z wymienionych promotorów są szczególnie przydatne, ponieważ oba jest łatwo otrzymać z wirusa jako fragment, który zawiera również odcinek replikacji z wirusa SV40 (Fiers et al., 1978, „Nature“, 273, 113). Można również stosować mniejsze lub większe fragmenty SV40, jeśli do wirusowego odcinka replikacji włączony jest odcinek liczący około 250 par zasad obejmujący miejsce Hindlll i Bgl I. Co więcej, istnieje również możliwość, a często jest to korzystne, używanie ludzkiego promotora, sekwencji kontrolnej i/lub sygnałowej związanej z czynnikiem martwicy nowotworu, jeśli sekwencja taka daje się pogodzić z systemem komórek gospodarza.

Odcinek replikacji może być wytworzony albo drogą konstrukcji wektora z włączeniem odcinka egzogennego, pochodzącego z SV40 lub innego wirusa (np. Polyoma, Adenovirus, VSV lub BPV), albo może być wytworzony przez chromozomalny mechanizm replikacyjny komórki gospodarza. Jeśli wektor jest włączony do chromozomu komórki gospodarza, ten ostatni sposób jest wystarczający.

Przy wyborze korzystnej komórki ssaka jako gospodarza do transfekcji wektorami zawierającymi sekwencje DNA kodujące zarówno czynnik martwicy nowotworu jak i dehydrogenazę dwuhydrofolanu (DHFR) należy wybierać gospodarza według typu białek DHFR. Jeśli stosuje się białka DHFR typu dzikiego korzystne jest wybranie komórki gospodarza, która zawiera definicję DHFR, co pozwala na zastosowanie sekwencji kodującej DHFR jako markera dokonanej transfekcji w selektywnym podłożu, które nie zawiera hypoksantyny, glicyny i tymidyny. Odpowiednią

155 778 komórką gospodarza jest w takim przypadku hodowla komórek jajnika chińskiego chomika (CHO), pozbawionych aktywności DHFR, przygotowanych i hodowanych według przepisu Urlaub i Chasin, 1980, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216.

Z drugiej strony, jeśli jako kontrolnej sekwencji używa się DNA o słabym powinowactwie do ΜΤΧ, nie jest konieczne stosowanie komórek opornych na DHFR. Ponieważ mutant DHFR jest oporny na ΜΤΧ, stosuje się podłoża zawierające ΜΤΧ w celu rozróżnienia mutantów i niezmutowanych komórek gospodarza, które są wrażliwe na ΜΤΧ. Większość komórek eukariotycznych absorbujących ΜΤΧ jest na ten związek wrażliwa. Jedną z przydatnych linii komórkowych jest linia CHO, CHO-K1 (ATCC No CCL 61).

Czynnik martwicy nowotworu izoluje się z hodowli. Transformowane komórki niewydzielające lizuje się przez sonikację lub inną dopuszczalną metodą i nierozpuszczalne części komórek usuwa się przez wirowanie, natomiast supernatant z hodowli komórek wydzielających (takich jak indukowane linie komórkowe) po prostu odwirowuje się. Następnie stosuje się jeden lub kilka etapów oczyszczania lub stosuje się inną metodę. Do oczyszczania czynnika martwicy nowotworu do stopnia pozwalającego na jego sekwencjonowanie, stosowano następującą metodę, która nie zawsze daje oczyszczanie wymagane w przypadku środka terapeutycznego.

Jako pierwszy etap oczyszczania czynnik martwicy nowotworu adsorbuje się na substancji hydrofobowej, używając zlizowanych komórek lub supernatantu z hodowli. Korzystne jest stosowanie jako substancji hydrofobowej nieżelatynowej powierzchni hydrofobowej, takiej jak krzemian lub poliolefina, chociaż alkilowana Sepharoza jest również odpowiednia. Korzystną substancją jest porowate szkło. Jedną objętość szkła o określonych porach miesza się z 50 objętościami supernatantu i pozostawia się do adsorbcji, w temperaturze około 4°C, bez mieszania,w ciągu od około 30 minut do 2 godzin, korzystnie około 1 godziny, zachowując lekko alkaliczne środowisko. Adsorbent przemywa się odpowiednim buforem, w celu usunięcia zaadsorbowanych białek zanieczyszczających.

Zaadsorbowany czynnik martwicy nowotworu eluuje się z substancji hydrofobowej poprzez zmianę właściwości rozpuszczających otaczającego środowiska. Elucji można dokonać poprzez przepuszczenie roztworu zbuforowanego od pH 7 do 8,5, korzystnie około 8, zawierającego 1 m roztwór soli i efektywną ilość wodnego roztworu organicznego poliolu mieszającego się z wodą, takiego jak np. glikol etylenowy lub gliceryna, zwykle glikol etylenowy w ilości 10-30, korzystnie około 20% objętościowych. Oczywiście optymalne warunki zalezą od rodzaju stosowanego poliolu. Frakcje eluatu zawierające czynnik martwicy nowotworu wykrywa się testem m vitro, jak opisano poniżej, lub innym odpowiednim testem. Oczyszczanie i wydajność tego etapu, jak również dalszych etapów oczyszczania preparatu z hodowli komórek monocytarnych przedstawia tabela 1.

Tabela I

Oczyszczanie ludzkiego czynnika martwicy nowotworu z płynu hodowlanego komórek HL-60

Etap oczyszczania	Końcowa objętość (ml)	Całkowite białko (mg)	Aktywność cytolityczna jednostki	Względna aktywność specyficzna (jednostka (mg))	Oczyszczanie	Odzysk (%)
Materiał wyjściowy	58 000	1,964	14,2X10’	0,007 X 10’	—	—
Chromatografia na szkle o określonej wielkości porów	1 080	88,9	11,1 X 10’	0,12X10’	17	78,5
Chromatografia na DEAE-celulozie	285	9,05	8,9 X 10’	0,98 X 10’	140	62,7
Szybka chromatografia cieczowa białekMono-Q	75	0,44	6,9 X 10’	15,68 X 10’	2 240	48,6
Preparatywna elektroforeza SDS PAG lub HPLC C-4 z odwróconymi fazami	6	0,028	2,71 X 10'x	96,79 X 10’ x	13 387x	19,lx

Z poprawką ze względu na częściowy spadek aktywności czynnika martwicy nowotworu spowodowany przez SDS lub przez TFA i propanol

Dalsze oczyszczanie uzyskuje się przez adsorbcję czynnika martwicy nowotworu na trzeciorzędowych lub czwartorzędowych aminowych jonowymiennych żywicach anionowych. Korzystnymi do tych celów żywicami są żywice hydrofitowe, takie jak usieciowany polistyren, dekstran lub

155 778 celuloza podstawiona grupą trzecio- lub czwartorzędową alkiloaminową. Handlowymi produktami tego typu są DEAE-celuloza, QAE Sephadex i Mono Q (we wszystkich przypadkach podstawnikiem jest grupa etylowa). Najlepsze wyniki osiąga się przy zastosowaniu szybkiej chromatografii cieczowej białek, metodą opisaną przez J. Richey, 1982, „American Laboratory“, przy użyciu zasadniczo jednorodnych makroporowatych cząsteczek (Ugekstad et al., 1983, „Nature“ 303, 95-96). System ten zapewnia oczyszczanie czynnika martwicy nowotworu w wysokim stopniu.

Oczyszczenie do zupełnej homogenności osiąga się jedynie poprzez dalszy rozdział metodą elektroforezy SDS-PAG lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej C-4 z odwróconymi fazami, jak to opisano w przykładach poniżej. Produktu takiego nie można jednak wytwarzać do celów terapeutycznych ze względu na duże straty aktywności w organicznych rozpuszczalnikach stosowanych do SDA i HPLC. Stężenie białek oznaczano metodą M. Bradford, 1976, „Anal. Biochem.“, 72, 248-254. Podczas ostatnich etapów oczyszczania stężenie białka oznaczano na podstawie składu aminokwasów i sekwencji aminokwasów.

Do podawania w terapii czynnik martwicy nowotworu, mający odpowiedni stopień czystości, miesza się z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem, to jest nośnikiem, który nie jest toksyczny w stosowanej dawce i stężeniu. Przeważnie czynnik martwicy nowotworu miesza się z buforami, antyutleniaczami, takimi jak kwas askorbinowy, niskocząsteczkowymi polipeptydami (mniej niż 10 reszt aminokwasowych), białkami, aminokwasami, węglowodanami włącznie z glukozą lub dekstrynami, środkami chelatującymi, takimi jak EDTA i innymi stabilizatorami i wypełniaczami. Nośnik powinien stabilizować czynnik martwicy nowotworu w postaci dimeru i/lub korzystnie trimeru, co uzyskuje się poprzez unikanie stosowania soli lub detergentów w stężeniach, które powodują dysocjację czynnika martwicy nowotworu na monomery. Należy również unikać warunków, w których czynnik martwicy nowotworu agreguje do wyższych multimerów. Dla uniknięcia nadmiernej agregacji stosuje się niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak Tween 20 lub liofilizację oraz powierzchniowe w roztworze wodnym. Do celów terapeutycznych czynnik martwicy nowotworu musi być jałowy. Jałowość roztworu osiąga się poprzez sączenie przez jałowe filtry membranowe. Czynnik martwicy nowotworu przechowuje się zwykle w formie zliofilizowanej.

Czynnik martwicy nowotworu można łączyć z innymi czynnikami antyneoplastycznymi, takimi jak chemioterapeutyczne antybiotyki (aktynomycyna D, adriamycyna, aklacinomycyna A) lub czynnikami zwiększającymi lub stymulującymi odpowiedź immunologiczną, takimi jak gamma-globuliny, włącznie z immunoglobulinami wykazującymi powinowactwo do powierzchniowych antygenów neoplazmy. Oprócz tego, ze względu na synergistyczne działanie interferonów i czynnika martwicy nowotworów w próbach lizy komórek, pożądane jest łączenie alfa-, beta- lub gamma-interferonu w kompozycjach z czynnikiem martwicy nowotworu lub w kompozycjach zawierających czynnik martwicy nowotworu i limfotoksynę. Typowy preparat zawiera czynnik martwicy nowotworu i gamma-interferon w proporcji jednostek aktywności od około 0,1:1 do 200:1, zwykle 10:1 i może zawierać limfotoksynę w miejsce i w proporcji czynnika martwicy nowotworu. Proporcje te są oczywwiście modyfikowane, według wskazań doświadczeń terapeutycznych.

Kompozycje zawierające czynnik martwicy nowotworu podaje się zwierzętom cierpiącym na nowotwór. Droga podania jest zgodna ze znanymi metodami, np. dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, drogą infuzji domiejscowej lub iniekcji jałowego roztworu czynnika martwicy nowotworu, albo w układzie leku uwalnianego w czasie, jak to będzie opisane poniżej.

Czynnik martwicy nowotworu podaje się domiejscowo, to jest przez bezpośrednie wstrzyknięcie do guza nowotworu. W przypadku nowotworów rozproszonych, takich jak leukemia, korzystne jest podawanie dożylne lub poprzez układ limfatyczny. Nowotwory organów wewnętrznych, takie jak nowotwór jajnika, są korzystnie leczone przez dootrzewnową infuzję drogą dializy dootrzewnowej, z użyciem odpowiednich roztworów do podawania dootrzewnowego. Zwykle czynnik martwicy nowotworu podawany jest ciągle, drogą infuzji, chociaż wstrzykiwanie pigułek jest również dopuszczalne.

Korzystne jest podawanie czynnika martwicy nowotworu w postaci uwalniającej się w czasie z wszczepionego zbiorniczka. Przykłady odpowiednich systemów dla białek o ciężarze cząsteczko ·

155 778 wym podobnym do ciężaru cząsteczkowego czynnika martwicy nowotworu w formie dimerów lub trimerów, obejmują kopolimery kwasu L-glutaminowego i y-etylo-L-glutaminianu (U. Sidman et al., 1983, „Biopolimers 22, (1), 547-556), poli/2-hydroksyetylo-metakrylanu/ (R. Langer et al., 1981, „J. Biomed. Mater Res.“, 15,167-277 i R. Langer, 1982, „Chem. Tech. 12,98-105) lub octanu etylenowinylowego (R. Langer et al., Id). Zbiorniczek ten wszczepia się w miejsca, z których nowotwór został usunięty chirurgicznie. Alternatywnie, czynnik martwicy nowotworu kapsułkuje się w półprzepuszczalnych mikrokapsułkach lub lipozomach, do iniekcji w miejsce nowotworu. Ten sposób podania jest szczególnie dogodny w przypadku nowotworów, których nie można operować np. nowotworów mózgu.

Podawana ilość czynnika martwicy nowotworu zależy np. od drogi podawania, rodzaju nowotworu i stanu pacjenta. Domiejscowe iniekcje wymagają zastosowania mniejszej ilości czynnika martwicy nowotworu, obliczonej na podstawie wagi ciała, niż dożylne infuzje, natomiast niektóre typy nowotworu, np. guzy nowotworowe, wydają się być bardziej oporne na czynnik martwicy nowotworu niż inne, np. Leukemia. Tak więc, terapeuta musi dobrać dawkę i drogę podania tak, aby uzyskać optymalną aktywność cytotoksyczną przeciwko nowotworowi, co można określić np. drogą biopsji nowotworu lub z zastosowaniem markerów raka, takich jak antygen carcinoembrionalny biorąc pod uwagę toksyczność złożoną wystąpującą przy podwyższonej dawce. Zwykle czynnik martwicy nowotworu podawany myszom w ilości do 120 mikrogramów/kg wagi ciala/dzień, drogą dożylną, jest całkowicie nietoksyczny i efektywny in vivo.

Czynnik martwicy nowotworu nie jest specyficzny gatunkowo w swojej aktywności cytotoksycznej, tak ze czynnik martwicy nowotworu inny niż ludzki czynnik martwicy nowotworu np. wołowy lub wieprzowy, może być zastosowany w terapii nowotworów ludzkich. Jednak pożądane jest używanie czynnika martwicy nowotworu z tego samego gatunku co osobnik leczony, dla uniknięcia powstawania potencjalnej generacji przeciwciał.

W celu uproszczenia opisu przykładów, pewne często występujące metody będą opisane skrótowo.

Plazmidy są oznaczone małą literą p oraz poprzedzającą i/lub następującą literą dużą i/lub liczbą. Plazmidy stosowane zgodnie z wynalazkiem są osiągalne w handlu i ogólnie dostępne bez ograniczeń lub mogą być skonstruowane z dostępnych plazmidów według publikowanych metod. Również inne równorzędne znane plazmidy mogą być stosowane.

Termin „trawienie DNA odnosi się do katalitycznego rozszczepienia DNA enzymem, który działa tylko w określonym miejscu DNA. Enzymy takie są nazywane enzymami restrykcyjnymi, a miejsca wobec których są specyficzne są nazywane miejscami restrykcyjnymi. „Częściowe trawienie oznacza niekompletne trawienie enzymem restrykcyjnym to znaczy dobrane są takie warunki, w których następuje rozszczepienie niektórych, lecz nie wszystkich miejsc dla danej endonukleazy restrykcyjnej w substracie DNA. Różne enzymy restrykcyjne stosowane zgodnie z wynalazkiem są dostępne w handlu a stosuje się je w warunkach reakcji, z kofaktorami i dodatkami określonymi przez producenta. Enzymy restrykcyjne zwykle są oznaczone skrótami złożonymi z dużych liter, po których następują inne litery, a następnie liczby reprezentujące drobnoustrój, z którego enzym restrykcyjny został otrzymany. Zwykle stosuje się około 1 pg plazmidu, lub fragmentu DNA z około 1 jednostką enzymu w około 20μ1 roztworu buforowego. Odpowiednie bufory i ilości substratu dla poszczególnych enzymów restrykcyjnych są podawane przez producenta. Stosuje się czas inkubacji około 1 godziny w temperaturze 37°C, ale może być stosowany inny czas inkubacji według instrukcji producenta. Po inkubacji białka usuwa się je przez ekstrakcję fenolem lub chloroformem, a strawiony kwas nukleinowy odzyskuje się z frakcji wodnej przez wytrącenie etanolem. Czasami po trawieniu enzymem restrykcyjnym stosuje się hydrolizę alkaliczną fosfatazą bakteryjną terminalnych 5' fosforanów, aby zabezpieczyć dwa rozszczepione końce fragmentu DNA przed „cyrkularyzacją czyli utworzeniem zamkniętej pętli uniemożliwiającej włączenie innego fragmentu DNA w miejscu restrykcyjnym. Jeśli nie jest to specjalnie zaznaczone, trawienie plazmidów nie było wspomagane przez działanie alkalicznej fosfatazy. Stosowane metody i odczynniki do przeprowadzenia defosforylacji były znane (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning str. 133-134).

„Wydzielenie lub „izolacja danego fragmentu DNA z mieszaniny trawionej enzymem restrykcyjnym oznacza rozdział mieszaniny po trawieniu drogą elektroforezy na żelu poliakryaloami155 778 dowym, identyfikację pożądanego fragmentu przez porównanie jego ruchliwości z ruchliwością markerowych fragmentów DNA o znanym ciężarze cząsteczkowym, wycięcie sekcji żelu, zawierającej żądany fragment DNA i oddzielenie żelu od DNA. Metoda ta jest ogólnie znana, na przykład patrz R. Lown et al., 1981, „Nucleic Acid Res.“ 9,6103-6114 i D. Goeddel et al., 1980, „Nucleic Acid Res. 8, 4057.

„Analiza Southerna jest metodą potwierdzania obecności sekwencji DNA w mieszaninie po trawieniu lub w mieszaninie zawierającej DNA, poprzez hybrydyzację do znanego, znakowanego oligonukleotydu lub fragmentu DNA. Dla celów niniejszego zgłoszenia, w przypadku braku innych wskazówek, analiza Southerna oznacza rozdział mieszaniny po trawieniu na 1% agarozie, denaturację i przeniesienie na nitrocelulozę metodą E. Southerna, 1975, „J. Mol. Biol.“ 98,504-517 i hybrydyzację metodą T. Maniatis et al., 1978, „Cell“, 15, 687-701.

„Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu w taki sposób, że DNA jest replikowany, albo jako pozachromozomalny element, albo jako składnik chromozomu. Jeśli nie podano innych informacji, oznacza to, że stosowano metodę transformacji E.coli z chlorkiem wapnia opisaną przez Mandel et al., 1970, „J. Mol. Biol.“ 53, 154.

„Ligacja oznacza proces tworzenia wiązań dwuestrowych pomiędzy dwoma fragmentami dwuniciowego kwasu nukleinowego (T. Maniatis et al., Id, str. 146). Jeśli nie podano innych informacji, oznacza to, że ligację prowadzono przy użyciu znanych buforów stosując 10 jednostek ligazy T4 DNA („ligaza) na 0,5 μξ w przybliżeniu równomolarnych ilości fragmentów DNA, które miały być zligowane.

„Preparatyka DNA z transformantów oznacza izolowanie plazmidowego DNA z hodowli drobnoustroju. Jeśli nie podano innych informacji, oznacza to, że stosowano metodę alkalia/SDS opisaną przez Maniatis et al., Id. str. 90.

„Oligonukleotydy są krótkimi pojedynczo- lub podwójnoniciowymi polidezoksynukleotydami, syntetyzowanymi chemicznie znanymi metodami a następnie oczyszczanymi na żelu poliakryloamidowym.

Przykład I. Testy.

Specyficzną aktywność czynnika martwicy nowotworu oznaczano uprzednio opisanym, zmodyfikowanym testem lizy komórek (B. Spofford, 1974, „J. Immun. 112,2111). Komórki fibroblastu myszy L-929 (ATCC CCL-929) hodowano w 96 studzienkach tacek o płaskim dnie (3040; Falcon Plastics, Oxnard, CA), w ilości około 30 000 komórek (objętość 0,1 ml) w jednej studzience, w obecności l/Ug/ml aktynomycyny D u seryjnie rozcieńczonej próbki testowej (0,125 ml). Komórki inkubowano w nawilżonej atmosferze w temperaturze 37°C przy 5% CO2. Po 18 godzinach próbki testowe usuwano, płytki przemywano i wykrywano lizę komórek barwiąc płytki 0,5% roztworem krystalicznego fioletu w mieszaninie metanol : woda (1:4) objętościowo. Punkt końcowy mikromiareczkowania płytek określano przyrządem Microelisa autoreader (Dynatech) nastawionym na absorbcję 450 nm i tansmisję 570 nm. Komórki hodowane w samym podłożu określano jako 0% lizy, a komórki poddane działaniu 3 m roztworu chlorowodorku guanidyny, określano jako „punkt końcowy, czyli 100% lizy. Jedną jednostkę czynnika martwicy nowotworu zdefiniowano jako tę ilość czynnika martwicy nowotworu (przy objętości próbki testowej 0,125 ml), która jest potrzebna do wywołania 50% lizy komórek.

Czynnik martwicy nowotworu testowano również w testach in vivo. W skrócie, próbę tę prowadzono hodując komórki Meth A Sarcoma (5X 10⁵ komórek) w samicach myszy CB6F1 (BALB)c x C57BL/6/Fi, w ciągu 7-10 dni, a następnie wstrzykując próbkę czynnika martwicy nowotworu do nowotworu. Po 24 godzinach myszy zabijano przez rozerwanie kręgosłupa, nowotwory wycinano i histologicznie oceniano stopień martwicy, metodą opisaną przez E. Carswell et al., 1975, „Proc. Nat. Acad. Sci, 72, 3666-3670.

Przykład II. Zastosowanie linii komórek PBLs lub komórek monocytarnych do syntezy czynnika martwicy nowotworu.

Prowadzono hodowlę ludzkich komórek promyelocytarnych HL-60, o gęstości komórek 1X 10⁵ komórek/ml w 2-litrowych okręgłodennych kolbach (890 cm²), przy użyciu 500 ml podłoża RPMI 1640 (Irvine Scientific, Snata Ana, CA) zawierającego 10 mM HEPES, 0,05 mM β markaptoetanolu, 100 jednostek/ml penicyliny, 100pg/ml streptomycyny i 10% surowicy płodo18

155 778 wej cielęcia. Po trzech dniach hodowli w temperaturze 37°C, kiedy hodowla osiągnęła gęstość komórek 8-12 X 10⁵ komórek/ml, komórki odwirowano przy 1000 xg w ciągu 10 minut, komórki zbierano, przemywano dwukrotnie wolnym od surowicy podłożem RPMI 1640 i przenoszono do tego samego podłoża nie zawierającego surowicy, sporządzając zawiesinę o gęstości komórek 15-20 X 10⁵ komórek/ml. Komórki hodowano w okręgłodennych 2-litrowych kolbach w obecności 10/rg/ml PMA. Po 16-24 godzinach komórki odsączono przez 3μιη filtr Sealkleen'a (Pall Trinity Micro Corp. Cortland, NY). Klarowny przesącz testowano na aktywność czynnika martwicy nowotworu i używano do następnego oczyszczania i charakterystyki. Według opisanego sposobu otrzymywano około 400 jednostek czynnika martwicy nowotworu/ml supernatantu z hodowli.

Monocyty ludzkiej krwi obwodowej również stosowano do produkcji czynnika martwicy nowotworu. Płytki krwi otrzymywano z American Red Cross, Boston, MA i stosowano w ciągu 24 godzin od zebrania. Monocyty oddzielono od erytrocytów przez wirowanie w gradiencie Ficoll -Hypague przy 1000 g w ciągu 30 minut. Komórki zbierano, w interfazie i przemywano trzykrotnie buforem fosforanowym z dodatkiem soli. Monocyty pochodzące od każdego donora hodowano oddzielnie w 2-litrowych kolbach okrągłodennych w wolnym od surowicy podłożu RPMI 1640 do gęstości komórek 2,5 X 10⁶ komórek/ml. Do hodowli dodawano po 1 ^g/ml enterotoksyny B ze Staphyloccocus (SEB) i rekombinantowej tymozyny a-l i komórki hodowano w wilgotnej atmosferze zawierającej 10% CO2 w temperaturze 37°C. Po 24 godzinach, w zależności od donora, supernatant komórkowy zbierano 1 postępowano w ten sam sposób jak w przypdku komórek HL-60. Wydajność czynnika martwicy nowotworu z hodowli PBL wahała się znacznie, w zależności od zastosowanego czynnika indukującego. Dodanie PMA do układu indukcyjnego opisanego powyżej, zwiększa aktywność cytolityczną supernatantów. Jednak supernatanty komórkowe zawierają zarówno czynnik martwicy nowotworu, jak i limfotoksynę ((oznaczanie czynnika martwicy nowotworu i hmfotoksyny w mieszaninach obu tych składników przeprowadzano wykonując test na lizę komórek z próbkami testowymi preinkubowanymi z przeciwciałami królika, neutralizującymi czynnik martwicy nowotworu, lub limfotoksynę 1 oznaczają aktywność resztkową wobec komórek L-929).

Przykład III. Chromatografia na perełkach szklanych o kontrolowanej wielkości porów.

Czynnik marwicy nowotworu z hodowli komórkowej adsorbowano na perełkach szklanych o kontrolowanej wielkości porów (Cat. No CPG 00350, Electro-Nucleonics, Fairfield NJ) zrównoważonych 10 mM buforem z fosforanu sodu o pH 8,0, przy stałym mieszaniu, w temperaturze 4°C. Stosowano 100 ml perełek szklanych na 5 litrów podłoża. Po 1 godzinie mieszania, wlewano do kolumny o rozmiarach 5X50 cm i przemywano w temperaturze pokojowej 10 mM buforem fosforanowym pH 8,0 zawierającym 1 M chlorku sodu. Czynnik martwicy nowotworu eluowano z perełek szklanych 20% roztworem glikolu etylenowego w 10 mM buforze z fosforanu sodu, pH 8,0, zawierającym 1 M chlorku sodu. Profil elucji supernatantu HL-60 z kolumny przedstawiono na fig. 1.

Przykład IV. Chromatografia na DEAE Celulozie.

Eluat otrzymany sposobem według przykładu III, podawano bezpośrednio na kolumnę (2,5X20 cm) z DEAE celulozy (Whatman), zrównoważonej 10 mM buforem z fosforanu sodu o pH 8,0, zawierającym 0,01% Tween 20, przy szybkości przepływu około 500 ml/godzinę. Następnie przepływ przez kolumnę wyregulowano na 100 ml/godzinę, a na kolumnę podano 4,2 Χ106 jednostek czynnika martwicy nowotworu w 1,080 ml próbce, w temperaturze 4°C, kolumnę przemywano zrównoważonym buforem i eluowano wstępującym gradientem 75 mM, 150 mM chlorku sodu w 10 mM buforze fosforanowym pH 8,0. Sprawdzano absorbcję eluatu przy 280 nm i aktywność czynnika martwicy nowotworu w eluowanych frakcjach. Wyniki przedstawiono na fig. 2.

Przykład V. Szybka chromatografia cieczowa białek.

Aktywne frakcje zawierające czynnik martwicy nowotworu, otrzymane sposobem według przykłdu IV, zatężano, dializowano wobec 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, zawierającego 0,01% Tween 20 i 1 mM azydku sodu (bufor A) w komorze Amicon, przy użyciu membrany YM-10, lub innej membrany dializacyjnej „odcinającej ciężar cząsteczkowy niższy od ciężaru cząsteczkowego TNF. Membranę przemywano dwukrotnie buforem A. Kolumnę wypełnioną ziarnami Sepharozy podstawionej czwartorzędową grupą amoniową (9,8 μΜ ziaren w kolumnie o rozmiarach 5 X 0,5 cm; sprzedawana pod nazwą Mono Q, Pharmacia) w aparacie do szybkiej chromatogrfii cieczowej

155 778 białek (FPLC) (Pharmacia), zaopatrzonej w programator gradientu (GP-250) i dwie pompy (P-500) równoważono wstępnie buforami dializacyjnymi, przy szybkości przepływu 1 ml/min. metodą opisaną przez J. Richey, „American Laboratory“, 1982 str. 1. Połączone koncentraty dializatu i przemywek wprowadzano na kolumnę, kolumnę przemywano buforem A, a następnie eluowano liniowym gradientem 40-75 mM chlorku sodu w buforze A. Gradient liniowy programowano następująco: 0-5 min. bufor równoważący; 5,1-15 min. 25 mM chlorek sodu; 15,1-25 min. 40 mM chlorek sodu; 25-60 min., liniowy gradient 40-75 mM chlorku sodu; 60-65 min., 75 mM chlorek sodu; 65,1-70min., 100mM chlorek sodu; 70-80min., liniowy gradient 100-1000mM chlorku sodu; 80-90 min., 100 mM chlorek sodu; 90,1-100 min., bufor równoważący. Pobierano po 2 ml każdej frakcji i oznaczano absorbcję przy 280 nm, przewodnictwo i aktywność czynnika martwicy nowotworu. Wyniki przedstawiono na fig. 3.

Przykład VI. Chromatoogniskowanie.

Chromatoogniskowanie prowadzono przy użyciu kolumny Mono P firmy Pharmacia (20 X 0,5 cm) w układzie FPLC opisanym w przykładzie V. Frakcje biologicznie aktywne (zawierające czynnik martwicy nowotworu) eluowano jako frakcje 37 do 45 w przykładzie C, zatężano i dializowano w komorze Amicon na YM-10 membranie, wobec buforu używanego do równoważenia kolumny, to jest 0,025 M bis-Tris HC1, pH 6,7. Próbkę nanoszono na kolumnę Mono P, w temperaturze pokojowej, przez superpętlę, przy szybkości przepływu 1 ml/min. Kolumnę przemywano buforem równoważącym, póki absorbcja przy 280nm nie osiągnęła linii podstawowej, a następnie eluowano liniowym gradientem pH, poprzez przemywanie kolumny 7,5% polibuforem 74 o pH 4,7 (Pharmacia). Zbierano frakcje o objętości 1 ml i notowano absorbcję przy 280 nm i pH eluentu. Wyniki przedstawiono na fig. 4. Jak wykazują dane na tym rysunku, punkt izoelektryczny czynnika martwicy nowotworu wynosi około 5,3.

Przykład VII. Preparatywna elektroforeza na żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS.

Przygotowano 15% żele poliakryloamidowe (llX16cm) o grubości l,5-3,0mm, według zmodyfikowanej metody U. Laemmli, 1970, „Nature“ 227,680-685. Zarówno żel rozdzielającyjak i żel zagęszczający zawierały 0,1% SDS i 0,05% Tween 20. Inne bufory i stężenia środka sieciującego były takie same jak w przypadku analitycznych żeli stosowanych w metodzie SDS-PAGE. Aktywne frakcje czynnika martwicy nowotworu, otrzymane według przykładu V lub VI, zlewano, zatężano i dializowano wobec 6,25 mM Tris-HCl pH 7,0, zawierającego 0,005% SDS, w komorze Amicona przy użyciu membrany YM-10. Po usunięciu dializowanego koncentratu membrany przemywano trzykrotnie małymi objętościami buforu, w którym rozpuszczano próbkę (0,2% SDS, 0,02% Tween 20,30% glicerolu, 0,03 M Tris-HCl pH 6,8,0,005% barwnika). Dializowany koncentrat i przemywki łączono (całkowita objętość 1-4 ml), ewentualnie dodawano merkaptoetanol, w celu stabilizacji warunków redukujących w SDS PAGE i podawano próbkę do studzienki żelu zagęszczającego. Niewielka studzienka przylegająca do studzienki z próbką była używana do podania uprzednio barwionej markerowej substancji o znanym ciężarze cząsteczkowym jak fosforylaza a (94K), albumina surowicy wołowej (67K), owoalbumina (43K), anhydrazy węglowej (30K), sojowego inhibitora trypsyna (20K) i lizozymu (14,4K). Żele rozwijano w pionowym układzie do elektroforezy Bioradu w temperaturze 12°C, przy stałym prądzie o natężeniu 20 mA na mm grubości żelu, póki barwnik wskaźnikowy nie osiągnął dolnej krawędzi żelu.

Po elektroforezie, jedną z płytek szklanych usuwano z żelu i zaznaczano pozycję markerów o znanym ciężarze cząsteczkowym. Następnie wstążkę żelu zawierającą czynnik martwicy nowotworu przecinano na 0,25 mm odcinki według ciężaru cząsteczkowego białek markerowych. Te kawałki żelu umieszczano w polipropylenowych probówkach zawierających 1-2 ml 10 mM dwuwęglanu amonu i 0,01% Tween 20, pH 8 i pozostawiano do elucji w ciągu 16 godzin w temperaturze 4°C. Eluaty testowano na aktywność czynnika martwicy nowotworu i wyniki przedstawiono na fig.

5. Ciężar cząsteczkowy czynnika martwicy nowotworu zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących wynosił 17 000, co wskazuje na występowanie cząsteczki o pojedynczym łańcuchu.

Białko izolowano z eluatów odcinków żeli, w postaci wolnej od soli i substancji niskocząsteczkowych w następujący sposób: przygotowano małe kolumny zawierające 0,2 ml żywicy Sep-pak C18, przemywano je wstępnie acetonitrylem, 1-propanolem, 1% kwasem trójfluorooctowym (TFA) i wodą destylowaną, a następnie równoważono 10 mM dwuwęglanem amonu zawierającym

155 778

0,01% Tween 20 pH 8,0. Eluat z żelu wprowadzano na kolumnę i zbierano wyciek.. Następnie żywicę przemywano po 5 ml wody destylowanej i0,l%TFA, aby usunąć wolne aminokwasy i sole z buforu. Czynnik martwicy nowotworu eluowano z żywicy przy użyciu 1 ml 50% 1-propanolu w 0,1% TFA. Prowadzono również następną elucję 99% 1-propanolu w 1% TFA, lecz białka były zwykle wyeluowane pierwszym buforem. Około 80% aktywności biologicznej traciło się na tym etapie. Czynnik martwicy nowotworu otrzymany opisanym sposobem może być używany do analizy sekwencji aminokwasów, korzystne jest jednak używanie do tego celu preparatu otrzymanego przez HPLC, sposobem opisanym w przykładzie VIII.

Przykład VIII. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).

Ciężar cząsteczkowy natywnego, nietkniętego czynnika martwicy nowotworu oznaczano drogą wysokosprawnej żelowej chromatografii cieczowej. Prowadzono ją w pokojowej temperaturze przy użyciu kolumny do HPLC z żelu TSK G2000 SW (Alltech Associates, Deerfield, IL) (7,5 X 60 cm). Próbkę o objętości 1 ml oczyszczonego czynnika martwicy nowotworu z przykładu V zawierającego około 1 g białek i 15 600 jednostek aktywności, eluowano izokratycznie z kolumny żelowej, przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. 0,2 M buforem fosforanu sodu pH 7,0. Kolumnę kalibrowano albuminą surowicy wołowej (ciężar cząsteczkowy 66 000), owoalbuminą (ciężar cząsteczkowy 45 000), wołową anhydrazą węglową B (ciężar cząsteczkowy 29 000) i lizozymem (ciężar cząsteczkowy 14 300). Otrzymywano frakcje o objętości 1 ml i testowano je na aktywność czynnika martwicy nowotworu. Frakcje wykazujące aktywność czynnika martwicy nowotworu eluowano jednocześnie z substancjami o ciężarze cząsteczkowym 45 000 ±6 000 (fig. 6).

Przykład IX. HPLC z odwróconymi fazami.

Czynnik martwicy nowotworu oczyszczano również przez HPLC z odwróconymi fazami, przy użyciu kolumn C4 Synchropak na układzie chromatograficznym Waters Associates, Inc. metodą opisaną uprzednio (W. Kohr et al., 1982, Anal. Biochem. 122,348-359). Piki białkowe wykrywano przy 210 nm i 280 nm po elucji liniowym gradientem od 1 do 23% objętościowo 1-propanolu w 0,1% wodnym roztworze TFA w ciągu pierwszych 15 minut i 23-30% objętościowo 1-propanolem w 0,1% TFA w ciągu następnych 15 minut, przy szybkości przepływu 1 ml na min. Białka testowano na aktywność cytolityczną. Rozpuszczalniki organiczne stosowane do elucji czynnika martwicy nowotworu z kolumny C4 obniżają jego aktywność o około 80%. Czynnik martwicy nowotworu otrzymany opisaną metodą suszy się w próżni i używa do analizy sekwencji aminokwasów. Wyniki przedstawiono na fig. 7. Jak wykazują dane przedstawione na fig. 7, czynnik martwicy nowotworu otrzymany w przykładzie V zawierał biologicznie nieaktywne białka eluujące się w czasie retencji około 16 i 19 minut. Eluent z kolumny C4,RP-HPLC był całkowicie homogenny, według kryteriów sekwencji aminokwasów terminalnych.

Przykład X. Oznaczanie częściowej sekwencji aminokwasów czynnika martwicy nowotworu.

Czynnik martwicy nowotworu trawiono trypsyną w następujący sposób: Homogenny czynnik martwicy nowotworu otrzymany sposobem według przykładu IX rozpuszczono, suszono i rozpuszczono ponownie w 100 mM buforze z dwuwęglanu amonu o pH 8,0, zawierającym 5% objętościowo TPCK trypsyny (Worthington Biochemicals) 1 mM chlorku wapnia i 0,01% Tween 20 i enzym w proporcji 1:20 do substratu, inkubowano w ciągu 6 godzin w temperaturze 37°C, dodawano dodatkowo 5% objętościowo trypsyny i mieszaninę inkubowano wciągu następnych 12 godzin w temperaturze 37°C. Mieszaninę reakcyjną nanoszono na C4 HPLC, w sposób opisany poprzednio, w celu oddzielenia fragmentów peptydów. Wyniki przedstawiono na fig. 8. Obserwowano występowanie 9 fragmentów (fragmenty 2 i 2' eluowano razem jako pik oznaczony T2 na fig. 8). Dodatkowy, dziesiąty fragment prawdopodobnie nie był zatrzymywany przez kolumnę. Sekwencję aminokwasów nietkniętego czynnika martwicy nowotworu otrzymanego według sposobu opisanego w przykładach VIII i IX i fragmentów otrzymanych po trawieniu trypsyną, jak opisano w niniejszym przykładzie, oznaczano automatycznie metodą sekwencyjnej degradacji Edmana na zmodyfikowanym przyrządzie Beckmana model 890 B wyposażonym w zimną pułapkę.

Jako nośnik stosowano polybren (1,25 mg). Obliczony na podstawie składu aminokwasowego nietkniętej cząsteczki, ciężar cząsteczkowy czynnika martwicy nowotworu wynosi 17 000. Wartość

155 778 21 ta jest zgodna z wartością otrzymaną metodą SDS-PAGE i stanowi potwierdzenie braku glikozylacji.

Przykład XI. Działanie synergistyczne czynnika martwicy nowotworu i gammainterferonu.

Komórki mysie czerniaka B 16 (Mason Research, Worcester, MA), pochodzące z linii C57B1/6, wysiewano na płytkach do mikromiareczkowania w ilości 5000 komórek) studzienkę i inkubowano, w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze nawilżanym i zawierającym w atmosferze 5% dwutlenku węgla, przed dodaniem limfokin. Czynnik martwicy nowotworu otrzymany sposobem według przykładu I oczyszczano do całkowitej homogenności na HPLC i określano jego aktywność na podstawie cytolizy w teście biologicznym na komórkach L929, opisanym powyżej. Podobnie oznaczano aktywność antywirusową oczyszczonego mysiego gammainterferonu (P. Gray et al., 1983, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA“ 80, 5842-5846) wobec komórek L zainfekowanych EMC (D. Goeddel et al., 1980, ,,Nature“) (London 287, 411-416). Mysi gammainterferon i czynnik martwicy nowotworu rozcieńczano oddzielnie do stężeń określonych na fig. 10. Najpierw, do oznakowanych studzienek dodawano gamma-interferon, a bezpośrednio potem czynnik martwicy nowotworu do końcowej objętości 0,1 ml/studzienkę. Po 72 godzinnej inkubacji komórki barwiono 0,5% roztworem fioletu krystalicznego w 20% metanolu. Wyniki przedstawiono na fig. 10. Komórki B16 wykazywały oporność na czynnik martwicy nowotworu, lub gamma-interferon, zastosowane jako jedyny czynnik przy stężeniu 1000 jednostek/ml czynnika martwicy nowotworu nie obserwowano wykrywalnej wizualnie cytolizy. Jednak dodanie bardzo małej ilości gamma-interferonu (5 jednostek/ml) powodowało cytolizę.

Przykład XII. Izolacja mesenger-RNA (RNA-informacyjnego).

Prowadzono całkowitą ekstrakcję, według metody Ward et al., 1972 „J. Virol.“ 9, 61., całkowitego RNA z hodowli komórek HL-60 (w 4 godziny po indukcji PMA), lub hodowli monocytów krwi obwodowej. Komórki odwirowywano i zawieszano ponownie w roztworze zawierającym 10 mM chlorku sodu, 10mMTris-HClopH7,5,1,5 mM chlorku magnezu. Komórki hzowano przez dodanie NP-40 (do końcowego stężenia 1%) i jądra komórkowe odwirowywano. Supernatant zawierał całkowity RNA, który następnie oczyszczano drogą wielokrotnych ekstrakcji fenolem i chloroformem. Następnie RNA przeprowadzono do fazy wodnej (0,2 m roztwór chlorku sodu) i wytrącono przez dodanie dwu objętości etanolu. Zwykle z 1 grama komórek otrzymywano około 6 miligramów całkowitego RNA. Poliadenylowany mRNA (około 100 mikrogramów) otrzymywano na oligo/dT/celulozie metodą Η. Aviv. et al., 1972, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412.

Przykład XIII. Bank cDNA.

7,5/yg poll/A/⁺ mRNA otrzymanego sposobem według przykładu XII przekształcano do podwójnoniciowego cDNA działając kolejno odwrotną transkryptazą, fragmentem Klenowa polimerazy DNA i nukleazą S1 (P. Gray et al., 1982, „Naturę 295,503-508; M. Wickers et al., 1978, („J. Biol. Chem. 253, 2483-2495). Z żelu poliakryloamidowego izolowano około 80pg cDNA o długości większej niż 600 par zasad.

Sekwencję adaptorową syntetycznego

DNA 5' AATTCATGCGTTCTTACAG 3'

3' GTACGCAAGAATGTC 5' ligowano do cDNA aby wytworzyć EcoRI lepkie końce. Adaptor syntetyzowano, metodą konwencjonalną, z dwóch pojedynczych łańcuchów, przy użyciu kinazy polinukleotydowej, z wytworzeniem dwu oddzielnych nici, z których jedna miała fosforylowany koniec 5'. cDNA (20/yg) izolowano ponownie z żelu poliakryloamidowego, włączano przez ligację do faga żgt-10, uprzednio trawionego EcoRI, formowano cząsteczki faga i propagowano do szczepu E.coli C600 hfl (Huynh et al., 1984, Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press Ltd, Oxford England), lub innego odpowiedniego szczepu. Otrzymano bank liczący około 200 000 niezależnych klonów zawierających cDNA.

Przykład XIV. Preparatyka wzorcowa dezoksyrybonukleotydu dla cDNA czynnika martwicy nowotworu.

Sporządzono 42 nukleotydowy wzorzec DNA do prób hybrydyzacji, w oparciu o wstępną sekwencję aminokwasów trójpeptydu TD6 (E-T-P-E-G-A-E-A-K-P-W-Y-E-K-) czynnika mart22

155 778 wicy nowotworu, wyznaczoną na podstawie częstości występowania kodonów (R. Granhan et al.,

1981, „Nucleid Acid Res.“ 9, 43-74) i kodonu bias ludzkiego gamma-interferonu (P. Gray et al.,

1982, „Naturę 295, 503-508) i ludzkiej limfotoksyny. Wstępna sekwencja okazała się błędna (zamiast końcowego K, powinno być P), lecz doprowadziła do otrzymania prawidłowego wzorca. Syntetyczny wzorzec posiada sekwencję 5' dGAACCCCTGAAGGGGCTGAAGCCAAGCCCTGGTATGAAAAG 3 i został zsyntetyzowany metodą R. Greaet al., 1980, „Nucleic Acids Res.“ 8, 2331-2348. Wzorzec fosforylowano przy użyciu (χ-P/ATP i kinazy polinukleotydowej T4, metodą opisaną poprzednio Goeddel et al., 1979, „Naturę 281, 544).

Przykład XV. Identyfikacja klonów cDNA zawierających sekwencje kodujące czynnik martwicy nowotworu.

Testowano około 200000 rekombinantów fagowych z banku cDNA żgtlO metodą hybrydyzacji DNA przy użyciu znakowanego ³²P 42-nukleotydowego DNA otrzymanego sposobem według przykładu XIV, w łagodnych warunkach, według metody A. Ullrich et al., 1984, „EMBO J.“ 3, 361-364 (lub alternatywnie P. Gray et al., 1983 „Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842, 5846, S. Anderson et al., 1983 „Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6836-6842 i M. Jaye et al., 1983, „Nucleic Acids Res. 11, 2325-2335). Dziewięć różnych klonów, które hybrydyzowały ze wzorcem oczyszczano poprzez tworzenie łysinek. Następnie przygotowywano znakowany P cDNA z mRNA z nieindukowanych komórek HL-60. Siedem z dziewięciu uprzednio wybranych klonów nie wykazywało hybrydyzacji z „nieindukowanym wzorcem, co wskazywało, że mogą zawierać sekwencje cDNA czynnika martwicy nowotworu. Klon cDNA zawierający największą wstawkę oznaczono λ 42-4. Oznaczono sekwencję wstawki metodą dwudezoksy łańcuchów końcowych (A, Smith, 1980, „Methods in Enzymology 65, 560-580 i F. Sanger et al., 1977, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) po subklonowaniu do wektora Ml3mp8 (J. Messinget al. 1981, „Nucleic Acids Ress. 9, 309-321).

Sekwencja cDNA otrzymanego z λ 42-4 zawiera region kodujący dojrzały czynnik martwicy nowotworu plus część jego peptydu sygnałowego. Prawidłowa orientacja i zakres odczytu DNA wydedukowano przez porównanie z sekwencją aminokwasową peptydu T4 czynnika martwicy nowotworu. Amino-terminalna reszta waliny czynnika martwicy nowotworu jest oznaczona w sekwencji białka jako aminokwas 1, a po niej następują 156 aminokwasów w fazie odczytu, przed kodonem stop. Wyliczony ciężar cząsteczkowy wynosi 17 356 daltonów.

Przykład XVI. Identyfikacja klonów cDNA zawierających sekwencje kodujące całkowity pre-TNF.

Klon cDNA Λ-42-4 zawiera cały region kodujący dojrzały TNF, ale nie zawiera sekwencji kodującej kompletny peptyd sygnałowy, jak na to wskazuje brak kodonu inicjującego. W celu uzyskania tej brakującej sekwencji zsyntetyzowano chemicznie pnmer - heksadekanukleotyd dTGGATGTTCGTCCTCC (komplementarny do odcinka nukleotydów 855-870, na fig. 10). Primer ten przyłączono do mRNA otrzymanego sposobem według przykładu XII, a następnie zsyntetyzowano cDNA według sposobu opisanego w przykładzie XIII. Nowy bank klonów cDNA, liczący około 200 000 klonów przygotowano z -gtlO, metodą opisaną w przykładzie XIII. Bank ten testowano analizą hybrydyzacyjną przy użyciu jako wzorca wstawki cDNA Λ42-4 znakowanej P. Otrzymano 16 pozytywnych klonów, z których najdłuższy (Λ16-4), zawierał wstawkę cDNA o 337 par zasad z końca 5' dłuższą od wstawki Λ42-4. Całkowita sekwencja wstawek cDNA TNF λ 16-4 (nukleotydy 1-870) i Λ42-2 (nukleotydy 337-1643) jest przedstawiona na fig. 10.

Przykład XVII. Konstrukcja wektora ekspresyjnego do bezpośredniej ekspresji czynnika martwicy nowotworu.

Sposób używany do wywołania ekspresji sekwencji cDNA dla czynnika martwicy nowotworu otrzymanej sposobem opisanym w przykładzie XV, przedstawiono na fig. 11. Fag Λ42-4, otrzymany sposobem według przykładu XV, zawierający sekwencję kodującą cały, dojrzały czynnik martwicy nowotworu i część lidera wydzielającego czynnik martwicy nowotworu, trawiono EcoRI i wydzielano fragment, liczący około 800 par zasad, zawierający region kodujący czynnik martwicy nowotworu. Fragment ten trawiono Ava I i Hind III i wydzielano fragment liczący 578 par zasad (oznaczony „C“ na fig. 11). Fragment ten kodował aminokwasy 8-157 czynnika martwicy nowotworu.

155 778

Przygotowano dwa syntetyczne dezoksyoligonukleotydy (oznaczone jako fragment „B“ na fig. 11) (patrz konstrukcja sekwencji adaptorowej w przykładzie XIII), które włączano pomiędzy lepkie końce Xba I na końcu 5' i lepkie końce Ava I na końcu 3', kodon met inicjujący i kodony dla pierwszych siedmiu aminoterminalnych aminokwasów czynnika martwicy nowotworu. Były to kodony preferencyjne dla E.coli. Sekwencja AATT, powyżej kodonu startowego, była tak dobrana, aby odpowiednio odsunąć kodon startowy od sekwencji trp wiążącej do rybosomu, w kombinacji z kodonami aminokwasów eliminującej powstanie potencjalnej pętli mRNA.

Segmenty B i C połączono następnie, w trzystopniowej ligacji z pochodną pBR322 zawierającą sekwencję promotora trp z sekwencją Shine-Dalgarno peptydu liderowego trp (europejskie złgoszenie patentowe nr 36776). Pochodną otrzymano lub wyznakowano tak, aby zawierała specyficzne miejsca Xba I i Hind III, pomiędzy promotorem trp i genem TetR Odpowiednimi wektorami startowymi są pLTtrpl (Gray et al., 1984, „Nture 312, 721-724) lub ptrpETA (Gray et al., 1984, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA“ 81,2645-2649), chociaż inne wektory można zsyntetyzowaćzpBR322 i promotora trp, oraz niezbędnych syntetycznych substancji wiążących. Zarówno pBR322, jak i plazmidy zawierające promotor trp są ogólnie dostępne. Część wybranego wektora pBR322 może zawierać segment Ava I-Pvu II z delecją par zasad od 1424 do 2065. (oznaczony „XAP“ w nazwie plazmidu). Którykolwiek z wymienionych wyżej plazmidów trawi się jednocześnie Xba I i Hind III, i izoluje duży fragment wektora. Fragment ten, oraz fragmenty B i C liguje się przy użyciu ligazy DNA T4 i mieszaninę hgacyjną używa się do transformacji E.coli 294 (ATCC 31446). Selekcjonuje się kolonie oporne na ampicylinę, izoluje plazmidowe DNA i charakteryzuje się go przez mapowanie endonukleazą restrykcyjną i oznaczenie sekwencji DNA. Otrzymano pTrpXAPTNF, zawierający wstawki B i C.

Przykład XVIII. Ekspresja czynnika martwicy nowotworu u E.coli.

Szczep E.coli ATCC 31 446 transformowany pTNFtrp hodowano w podłożu M9 zawierającym 20pg/ml ampicyliny do osiągnięcia absorbcji przy 550 nm równej 0,3. Następnie dodawano kwas indolooctowy do osiągnięcia końcowego stężenia 20pg/ml i hodowlę prowadzono do osiągnięcia A550 = 1· 10 ml komórek zatężano i zawieszano ponownie w buforze fosforanowym z dodatkiem soli. Komórki sonikowano i rozcieńczano do oznaczenia czynnika martwicy nowotworu sposobem opisanym w przykłdzie I. Otrzymywano około 10⁵ jednostek aktywności w ml hodowli. Aktywność neutralzowano przez preinkubację z surowicą królika, z królików immunizowanych czynnikiem martwicy nowotworu.

Przykład XIX. Ekspresja czynnika martwicy nowotworu u E.coli. Ten sposób jest korzystniejszy niż sposób według przykładu XVIII.

Korzystnym gospodarzem do zastosowania z opisanymi powyżej wektorami jest nierewertujący szczep ton A E.coli. Takie szczepy są oporne na bakteriofagi i dlatego znacznie bardziej odpowiednie do hodowli na dużą skalę niz szczepy typu dzikiego. Sposób przygotowania takiego szczepu jest następujący. Szczep E.coli W3110 jest transdukowany Λ::Τη10, bakteriofagiem lambda zawierającym przenoszony element TnlO do wytworzenia „skaczącej puli E.coli W3110 (N. Klecker et al., 1977 „J. Mol. Biol. 116, 125.

Szczep E.coli W3110::Tnl0 ze „skaczącą pulą“ hodowano w podłożu L w temperaturze 37°C do gęstości komórek około 1 X 10⁹/ml. 0,5 ml hodowli odwirowywano i zawieszano ponownie w 0,2 ml lizatu ΛρΗ i 80 (lub Tl) zawierającego 7,0 X 10⁹pfu. Fag pozostawiono do adsorbcji w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Zawiesinę następnie rozprowadzano na płytkach EMB zawierających tetracyklinę (15 pg/ml). Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C kolonie o barwie lekko różowej zbierano w 3 ml podłoża L. Hodowlę infekowano bakteriofagiem Pl kc i wyodrębniono lizat fagowy (J. Miller, 1972, Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 304).

Szczep E.coli At982 (Nr 4546 E.coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) transdukowano lizatem PI kc, osiągając oporność na tetracyklinę. Transduktanty selekcjonowano na płytkach z podłożem L wzbogaconym w tetracyklinę (15pg/ml) i kwas dwuaminopimelinowy (dap) (40/yg/ml). Uzyskane transduktanty selekcjonowano na oporność tetracyklinową i regenerację genu dap (dap+, tet^R). Transduktanty dap+, tet^R testowano następnie na oporność wobec Λρ1ι80 (lub Tl). Następnie przygotowano lizaty szeregu szczepów dap+, tetR oporne na Λρ1ΐ80 (lub Ti). Lizaty używano do transdukcji E.coli W3110 do oporności na tetracyklinę. Transduktanty poddawano sknningowi i selekcjonowano szczepy oporne na Λρ1π80 (lub Tl).

155 778

Szczepy wrażliwe na tetracyklinę selekcjonowano z transduktantów W3110 fhu::TnlO/3phi8OR(S. Naloy etal., 1981 „J. Bact“ 145,1110). Szczepy te sprawdzano na oporność na ^phi80 i wrażliwość na tetracyklinę po oczyszczeniu pojedynczych kolonii.

Z kilku mutantów wrażliwych na tetracyklinę i opornych na faga ^phi80 izolowano DNA i trawiono go Sstll. Mieszaninę po trawieniu poddawano analizie metodą Southerna, przy użyciu znakowanego pierwiastkiem radioaktywnym, trawionego Sstll DNA Λ::Τη10, jako wzorca do określenia czy TnlO został wycięty (R. Davis et al., 1980, Advanced Bacterial Genetics, Colg Spring Harbor Laboratory). Stwierdzono, że jeden z izolatów wrażliwych na tetracyklinę stracił dwa prążki hybrydyzacyjne TnlO. W porównaniu z hybrydyzacją pomiędzy DNA z λ ::TnlO i macierzystym W3110 fhuA:TnlO-Aphi8OR. Trzeci prążek hybrydyzacyjny wykazywał zmienioną ruchliwość, co wskazuje na delecję spowodowaną przez nieprecyzyjne wycięcie TnlO.

Elektroforeza na żelu z dodatkiem SDS, preparatów ze szczepu z nieprecyzyjnym wycięciem TnlO wskazuje, że prążek, który jest białkiem fhuA wykazuje zmienioną ruchliwość elektroforetyczną w porównaniu z białkiem fhuA typu dzikiego. Powstałe białko jest niefunkcjonalne jako białko receptorowe faga ^phi80. Drugi, niezależny szczep, u którego również nastąpiło nieprecyzyjne wycięcie TnlO nie wykazuje występowania białka fhuA na żelu SDS.

Żaden ze szczepów me wykazuje rewersji do oporności na tetracyklinę lub wrażliwości na ziphi80 co wskazuje, że wystąpiło nieprecyzyjne wycięcie wszystkich części transpozonu TnlO, razem z częściową lub całkowitą delecją genu fhuA. Korzystne jest stosowanie jednego z takich szczepów W3110 (NL106) jako gospodarza dla opisanych w niniejszym zgłoszeniu, wektorów kodujących TNF.

Szczep NL106 transformowano ptrpXAPTNF i zaszczepiano nim 10 litrów podłoża o pH 7,4 i następującym składzie: siarczan amonu 5,0g/1, fosforan dwupotasowy 6,0 g/1, fosforan jednosodowy 3,0 g/1, cytrynian sodu 1,0 g/1, L-tryptofan 0,2 g/1, NZ amina AS 4,0 g/1, ekstrakt drozdzowy 4,0 g/1, siarczan magnezu 1,2 g/1, glukoza 25,0 g/1; roztwór mikroelementów (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B, Mn) 0,5ml/l, tetracyklina l,0mg/l. Gdy hodowla osiągnęła wartość absorbcji przy 550nm równą około 20, dodawano do niej glukozę w ilości 1 g/min. Fermentację prowadzono w 37°C do momentu osiągnięcia Asso⁼ 136 (około 20 godzin). Hodowlę odwirowywano uzyskując pastę komórkową, którą następnie ekstrahowano w ciągu 30 minut w pH 8,0 i w temperaturze pokojowej buforem zawierającym 50 mM tris, 10 mM EDTA, 1000 mM chlorku sodu, 2000 mM mocznika i 0,1% beta-merkaptoetanolu. Ekstrakt rozcieńczano i testowano według metody opisanej w przykładzie I. W próbie tej ustalono, że 1 X 10®jednostek czynnika martwicy nowotworu odpowiada 1mg czynnika martwicy nowotworu. Z jednego litra hodowli uzyskiwano około 2g czynnika martwicy nowotworu. Analiza aminokwasów terminalnych wykazała, że od 75 do 86% wagowych przypada na dojrzały czynnik martwicy nowotworu z resztą waliny na końcu aminowym, a pozostała część jest to met-TNF. Pomimo wysokiego poziomu ekspresji, białko nie występowało w postaci ciałek załamujących światło, ani nie wykazywało innych właściwości wskazujących na jego toksyczność dla komórki, pomimo że osiągano wyjątkowo wysoką wartość gęstości komórek.

Przykład XX. Konstrukcja i ekspresja genu mutanta czynnika martwicy nowotworu.

W niniejszym przykładzie, powtórzono procedury opisane w przykładach XVII-XVIII z tą różnicą, że oligonukleotydowy fragment B syntetyzowano z kodonem histydyny CAT, w miejsce kodonu argininy CGT. Otrzymano mutant czynnika martwicy nowotworu.

Przykład XXI. Konstrukcja i ekspresja innego genu mutanta czynnika martwicy nowotworu.

W niniejszym przykładzie powtórzono procedury opisane w przykładach XVII-XVIII z tą różnicą, że oligonukleotydowy fragment B kodował leucynę (CTT) w miejsce kodonu reszty 2 argininy. W litrze hodowli otrzymano około 1200 mg dojrzałego TNF. Niezmieniony TNF nie był wykrywany w hodowli.

Przykład XXII. Konstrukcja wektora kodującego białko fuzyjne czynnika martwicy nowotworu, i sekwencji sygnałowej wydzielania.

Sekwencja genu STU odpornej na ogrzewanie enterotoksyny E.coli przedstawiona jest w pracy Picken i inni, 1983, „Infection and Immunity“, 42 (1), 269-275. W niniejszym przykładzie ligowano fragment zawierający sygnał wydzielania STII i sekwencję Shine-Dalgarno z leżącym w genie poniżej, promotorem alkalicznej fosfatazy E.coli. W kierunku 3', od sygnału 3', od sygnału

155 778 25

STU, występuje syntetyczny oligonukleotyd, zawierający kodony dla pierwszych siedmiu aminokwasów (końca aminowego) czynnika martwicy nowotworu i pozostała sekwencja kodująca czynnik martwicy nowotworu. Sekwencje te zebrano w wektorze pBR322.

Plazmid pWM501 (Picken i inni, 1983, „Infection and Immunity 42 (1), 269-275) zawiera gen STU. pWM501 trawiono Xbal i Nsil i wyizolowano fragment liczący około 90 par zasad. Fragment ten można również zsyntetyzować drogą preparatyki organicznej, metodami znanymi w sztuce (fragment A).

Plazmid pBR322-Trp, opisany w przykładzie XVII (p20kLT) trawiono Xbal i Hindlll, a następnie izolowano duży fragment wektora (fragment B). Fragment ten zawiera gen fenotypowo rozpoznawalny - oporność na ampicylinę.

Syntetyzowano syntetyczny oligonukleotyd, w postaci dwu nici, które łączono dla uzyskania następującej struktury (podano również miejsca restsrykcyjne, lepkie końce i aminokwasy kodowane przez oligonukleotyd):

VAL ARG SER SER SER ARG THR 5' GTA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3'

ACGT CATACGAGAAGAAGAGCATGAGGCT

Nsil Aval

Fragment ten nazwano fragmentem C.

pTNFtrp przygotowany sposobem opisanym w przykładzie XVIII trawiono Aval i Hindlll. Izolowano Aval - Hindlll fragment, liczący 578 par zasad (fragment D). Zawierał on całą sekwencję kodującą TNF z wyjątkiem kodonu dla pierwszych siedmiu aminokwasów.

Sekwencję DNA zawierającego promotor alkalicznej fosfatazy z E.coli (AP) przyłączony do heterologicznej sekwencji Shine-Dalgarno (S.D.) (trp), oraz posiadającego lepkie końce EcoRI i Xbal, konstruowano w następujący sposób. Fragment DNA zawierający promotor AP izolowano z plazmidu pHI-1 (H. Inouye et al., 1981,/J. „Bacteriol. 146, 688-675), chociaż można również stosować każde DNA zawierające promotor AP. pHI-1 trawiono Hpal, aby otworzyć plazmid, ligowano do plazmidu syntetyczny związek

GAATTCGAATTC

CTTAAGCTTAAG i połączony plazmid trawiono nadmiarem EcoRI, aby rozszczepić wszystkie miejsca EcoRI i niedoborem Rsal, aby tylko częściowo rozszczepić miejsca Rsal (trawienie EcoRI i Rsal powinno być prowadzone raczej kolejno, niż jednocześnie). Po częściowym trawieniu wyizolowano fragment liczący 420 par zasad, zawierający promotor AP.

Sekwencję trp S.D. otrzymano w sposób następujący: Plazmid lub organizm zawierający promotor trp (-IFN-beta 2, D. Leung et al., 1984, „Biotechnology 2, 458-464) trawiono Xbal i Rsal, a następnie izolowano fragment liczący 30 par zasad, który zawiera sekwencję trp S.D. Fragment ten ligowano do liczącego 420 par zasad promotora AP, aby uzyskać liczący 450 par zasad EcoRI-XbaI fragment E. Fragment E posiada następującą sekwencję nukleotydów:

EcoRI 'G.UHuAACTTCH;C,UACTTTGGATAAGGAAAiACAGACATGAA,AAATCTC.VnGC[G,\óTTG

TTATTTAAGCTTGCCCAAAAAGAAGAAGAGTCGAAAGAACTGTGTGCGCAGGTAGAAGCTTTGG

AAGATTATCGTCCTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAGCGGTTGATTGATCA

GGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCGCCATCCCTGACGAGGATAGGGACCTCGTG

CGCGATAGCGTGAGGAAGTTAAAGGGGCATCCACGACAGTGGAGAGTTGGACAAATCAGCGGCA

GACGAGGGGAAGTAGCGCAAGGGGCTA trpS.D. Xbal

GAGGTCGCTTAGTTAAAGTATTATAATGTATTTAGCCCAAAGTAGACGTAAAGGGGGAGAATAGG

Fragmenty A, B, C i D ligowano w czteroczęściowym procesie ligacji i mieszaninę ligacyjną używano do transformacji E.coli 294. Transformanty identyfikowano hodując je na płytkach LB, zawierających ampicylinę. Plazmid trpSTIITNF izolowano z kolonii transformanta. Plazmid ten trawiono Xbal i EcoRI, aby usunąć trp promotor, a następnie ligowano do liczącgo 450 par zasad EcoRI-XbaI fragmentu E zawierającego promotor alkalicznej fosfatazy z E.coli. Otrzymany plazmid oznaczono pAPSTIITNF.

Przykład XXIII. Ekspresja i prowadzenie procesu dla otrzymania białka fuzyjnego - czynnika martwicy nowotworu z sygnałową sekwencją wydzielającą.

155 778

Szczep E.coli NL106 transfekowano pAPSTIITNF i zaszczepiano 10 litrów pożywki o pH 7,0 o następującym składzie: siarczan amonu 5,0 g/1, fosforan dwupotasowy 2,6 g/1, fosforan jednosodowy 1,3 g/1, cytrynian sodu 1,0 g/1, chlorek potasu 1,5 g/1, NZ amina AS 5,0g/1, ekstrakt drożdżowy 2,0 g/1, siarczan magnezu 1,2 g/1, glukoza 25 g/1, roztwór mikroelementów (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B i Mn) 0,5 ml/1, ampicylina 20,0 mg/1.

Hodowlę prowadzono w sposób opisany w przykładzie XIX, z tym wyjątkiem, że osiągano wartość absorbcji w 550 nm równą 140. Hodowla doprowadzona do tego momentu zawierała około 400 mg czynnika martwicy nowotworu (litr, którego 70-80% wagowych wykazywało w elektroforezie na żelu cechy dojrzałego białka. Tę samą, w przybliżeniu aktywność uzyskiwano przy ekstrakcji całych komórek sposobem opisanym w przykładzie XIX, przy zastosowaniu szoku osmotycznego komórek.

Przykład XXIV. Konstrukcja i ekspresja pochodnych czynnika martwicy nowotworu.

Mutanty sekwencji aminokwasowej TNF przedstawionej na fig. 10 sporządzano w celu uzyskania następujących korzyści: zwiększenie czasu półtrwania in vivo, zwiększenie aktywności cytolitycznej wobec komórek nowotworowych, w porównaniu z aktywnością wobec komórek prawidłowych, przygotowanie immunogenów TNF przez wytworzenie przeciwciał anty-TNF do celów diagnostycznych, wprowadzenie specyficznych miejsc do modyfikacji kowalencyjnej (na przykład znakowanie enzymem kowalencyjnie związanym preparatów diagnostycznych EMIT, lub ELISIA i zmiana fizycznych właściwości TNF np. jego rozpuszczalności, pi ltp). Oznaczenie żądanej aktywności pochodnych prowadzi się metodami rutynowymi znanymi w sztuce.

Korzystne jest jeśli TNF i jego pochodne nie zawierają TNF o sekwencji odpowiadającej sekwencji TNF nienaczelnych, a także sekwencji aminoterminalnych aminokwasów charakterystycznej dla nienaczelnych np. desValArg, występującej w TNF królika, ani genu kodującego sekwencję amino-terminalną Val-Arg-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Ser-ValAla-Asn-Pro-Aln-Ala-Glu-Gly- (Wang et al., „Science 228, 149-154, 1985).

Następująca metoda, oparta na J. Adelman et al., „DNA 2 (3), 189-193, jest ogólnie stosowana do konstrukcji i ekspresji każdej zmutowanej sekwencji DNA TNF, zawierającej mutacje ukryte lub mutacje TNF. W celu uniknięcia rozwlekłych opisów, podano przykłady wytwarzania pochodnych, w których Arg 32 jest przekształcona do reszty histydylowej (podstawienie), His 73 jest wycięta (delecja) i reszta leucylowa jest przyłączona do Leu 157 (wstawienie). Należy jednak pamiętać, że inne gatunki mutantów są wytwarzane w ten sam sposób.

Inne metody odpowiednie do wywoływania mutacji ukrytych lub ulegających ekspresji w DNA kodującym czynnik martwicy nowotworu są znane w sztuce. Na przykład, mutant DNA wytwarza się przez prostą syntezę chemiczną całej sekwencji lub jej części, którą następnie liguje się do pozostałej żądanej sekwencji DNA. Chemiczna synteza jest korzystna w przypadku, gdy pożądane jest przygotowanie mutantu bezpośrednio, bez uprzedniej izolacji DNA kodującego czynnik martwicy nowotworu ze źródeł naturalnych. Zwykle jednak wyjściowy DNA koduje naturalną sekwencję aminokwasów lub jej warianty i pożądane jest przygotowanie pewnych pochodnych mutantów.

Przy preparatyce DNA kodującego mutanta TNF pożądane jest, aby zmiany kodo nu nie powodowały powstania warunków do wytwarzania struktury pętlowej mRNA. Unikanie występowania takich struktur zwykle prowadzi do wyższych wydajności. Poza tym, z tych samych powodów, należy stosować kodony preferowane przez gospodarza.

Odpowiednim wyjściowym DNA jest fragment EcoRI-Hindlll plazmidu pTrpXAPTNF (przykład XVII) uzyskany przez kolejne trawienie EcoRI i Hindlll, po którym następuje izolacja fragmentu zawierającego gen kodujący TNF. Fragment ten zawiera promotor trp i gen strukturalny kodujący metionylowany czynnik martwicy nowotworu. Aby otrzymać pojedynczo-niciową formę tego genu, odpowiednią do mutagenezy, fragment EcoRI-Hindlll klonowano do faga M13 mp8 RF-DNA (J. Messing et al., 1982, „Gene 19 ,269-276; „RF“ oznacza replikującą się formę faga; fag ten jest dostępny w handlu). Mieszanina po trawieniu EcoRI-Hindlll jest stosowana do reakcji ligacji w mieszaninie zawierającej lOjug M13 mp8 RF-DNA, który uprzednio był trawiony EcoRI i Hindlll. Po inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin, mieszaninę ligacyjną używa się do transformacji E.coli JM 103 (szczep dostępny w handlu; można również stosować szczep JM101). Transformowane komórki umieszcza się na płytkach z agarem zawierającym

155 778

X-GAL (dwubromo-dwuchloro-indolilo-galaktozyd) i IPTG (izopropylotio-galaktozyd). Hodowle bakteryjne (1 ml) zakażone fagiem pobranym z bezbarwnych łysinek stosuje się do izolacji DNA M13mp8) TNF RF, metodą miniskriningu (Birnboim i Doły, 1980, „Nuc. Acids Res“ 7, 1513-1523). Otrzymany fag rekombinantowy M13 mp8/TNF zawiera nić kodującą genu TNF.

W celu dokonania mutagenezy w określonym miejscu, syntetyzowano dezoksyrybonukleotydy (mutageneza oligomerów) z sekwencją komplementarną do 15 zasad leżących po każdej stronie miejsca mutacji, jak to przedstawiono na następujących diagramach, w którym N oznacza zasady komplementarne i M oznacza kwas nukleinowy, który jest wstawiony, wycięty lub podstawiony. Wstawki lub wycięcia zwykle występują w grupach po 3, ze względu na zachowanie części genu leżącej „w dół strumienia w fazie odczytu.

Dla wycięcia (delecji): Dla podstawienia:

Dla wstawki:

oligomer DNA wektor DNA oligomer DNA wektor DNA oligomer DNA wektor DNA (N)₁s(N)15 (N)₁s(M) (N)15 (N)l5(Ml) (N)i5 (N)is(M2) (N)15 (N)i5(M) (N)is (N)1₅(N)₁₅

Mi oznacza zasadę oligomer, który nie jest komplementarny do zasady lub oligomeru M2. W tym przypadku Mi oznacza żądaną sekwencję mutanta. Zwykle wytwarza się oligomery o większej ilości mutacji.

Oligomerem nonsensownym dla mutanta Arg-his 32 jest p CAG GAG GGC ATT GGC ATG GCG GTT CAG CCA CTG-OH.

Oligomerem nonsensownym dla delecji His 73 jest p GTG GGT GAG GAG CAC GGT GGA GGG GCA GCC-OH.

Oligomerem nonsensownym dla wstawki Leu 158 jest p TGT TCG TCC TCA AAG CAG GGC AAT GAT CCC-OH.

2250Y

Primery syntetyzuje się metodami konwencjonalnymi. Do zastosowania w procesie mutagenezy, prowadzi się następującą reakcję: lOpmoli oligomerów lub lac-primera 5'-GTTTTCCC AGTCACGAC-3' fosforyluje się w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C w mieszaninie zawierającej 1(^150mMTris-HCl (pH 7,5), 0,1 mMEDTA, 10 mM chlorku magnezu, lOmMdwutiotritolu, 0,1 mM ATP i 1 jednostki kinazy polinukleotydowej T4. Do zastosowania jako wzorca do hybrydyzacji (patrz powyżej) prowadzi się następującą reakcję: 2 pmole syntetycznych oligonukleotydów fosforyluje się metodą podaną powyżej, z tą różnicą, że zamiast 0,1 mM ATP stosuje się 1 μΜχ³²Ρ ATP (Amersham). Osiąga się aktywność specyficzną wyższą niż 5 X 10⁸cpm/pmol łańcucha oligonukleotydu.

Hybrydyzacja każdego oligomeru i lac primera do pojedynczo-niciowego DNA z faga M13mp8/TNF, a następnie wydłużenie primera prowadzi do tworzenia częściowej struktury podwójnoniciowej DNA, przy czym jedna z nici zawiera zmutowany DNA.

W celu wytworzenia częściowej struktury podwójno-niciowej, pojedynczo-niciowy M13 mp8/TNF DNA (30^^g) ogrzewa się do temperatury 80°C, w ciągu 2 minut, pozostawia w temperaturze 50°C, w ciągu 5 minut i w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut w mieszaninie zawierającej 20 μϊ 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 50 mM chlorku sodu i po 1 pmolu fosforylowanego oligomeru i primera (dodanych w ilościach współmiernych podanych dla reakcji z kinazą). Wydłużenie primera jest rozpoczynane przez dodanie 30μϊ 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) zawierającego 0,1 EDTA, 12 mM chlorku magnezu, 10 mM dwutiotritolu, 0,7 mM ATP, 0,07 mM dATP, po 0,2 mM dGTP, dTTP i dCTP, oraz 2 jednostki polimerazy I DNA z E.coli (duży fragment), oraz 20 jednostek ligazy DNA T4. DNA wyekstrahowane fenolem wytrąca się etanolem i rozpuszcza w 15μϊ wody. Tak otrzymane DNA stosuje się do transforamcji E.coli JM103.

Lac primer hybrydyzuje do faga w miejscu 5' oligomeru. Wydłużenie primera stabilizuje strukturę podwójnoniciową. Oligomer i primer są enzymatycznie fosforylowane, aby umożliwić ligazie DNA T4 przyłączyć następny łańcuch DNA. Ekstrakt fenolowy DNA (10μ1) dodaje się do mieszaniny zawierającej 10μ1 0,06 M buforu z octanu sodu pH 4,5, 0,6 M chlorku sodu 0,6 mM chlorku cyny i 200 jednostek nukleazy Si. Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 5 minut,

155 778 dodaje się 5 pg drożdżowego tRNA i kwasy nukleinowe ekstrahuje się fenolem i wytrąca etanolem. Przy zachowaniu opisanych warunków, z 30pg pojedynczo-niciowego DNA M13 mp8 (około 10000 jednostek tworzących łysinki) uzyskuje się, w próbie transformacji DNA, mniej niż 100 łysinek, podczas gdy ta sama ilość RF-DNA zachowuje ponad 80% swych właściwości transformujących. DNA traktowany nukleazą Si, stosuje się do transformacji E.coli JM103 i wytworzony fag analizuje się metodą tworzenia łysinek.

Bakteriologiczne płytki o średnicy 15 cm, zawierające kilkaset łysinek rekombinantów faga M13 są stosowane do skriningu metodą hybrydyzacji in situ (Benton et al., 1977, „Science, 196, 180-182) na genotypy macierzyste i zmutowane przy użyciu odpowiednich znakowanych oligomerów na oddzielnych układach filtrów (około 10⁶cpm na filtr). Hybrydyzacja prowadzona jest w ciągu nocy w temperaturze 50°C, w 40% formamidzie, 5 X SSC. Filtry przemywa się w temperaturze 45°C, 2XSSC, 0,02% siarczanem dodecylu sodu, suszy na powietrzu i eksponuje na błonę filmową w temperaturze -70°C.

Konieczna jest zmiana warunków hybrydyzacji (przez zmianę stężenia SSC), w celu oddzielenia hybrydyzacji oligomeru do mutanta DNA (całkowita), od hybrydyzacji oligomeru do wyjściowego DNA; każdy mutant będzie wykazywał inną zdolność hybrydyzacji zależącą od rodzaju i ilości zasad podstawionych, wyciętych lub wstawionych. Na przykład, wykrycie mutacji pojedynczej zasady wymaga bardziej surowych warunków różnicowania pomiędzy mutantem i niezmutowanym, macierzystym DNA, ponieważ mutacja jest niewielka, obejmująca delecję lub podstawienie 1-3 zasad w kodonie; wtedy wzorzec do hybrydyzacji musi być mniejszy niz zmutowany oligomer. Zwykle jest to wzorzec o 14 do 20 zasadach. Wykonanie skriningu wykrywającego delecję mutanta ułatwia zastosowanie wzorca zawierającego lub stanowiącego sekwencję z delecją, do próby na utratę sekwencji. Jeśli wzorzec nie hybrydyzuje z DNA z wybranych łysinek, należy przypuszczać, że nastąpiła żądana utrata sekwencji docelowej.

Łysinka, która hybrydyzuje ze znakowanym obligomerem jest stosowana do inokulacji E.coli JM103. Izoluje się pojedynczo-niciowe DNA (ss) z supernatantu, a podwójno-niciowe DNA (ss) z osadu komórkowego. ssDNA stosuje się jako matrycy do dwudezoksy-sekwencjonowama klonów przy zastosowaniu uniwersalnego primera M13, lub syntetycznego oligomeru o sekwencji komplementarnej, umieszczonej na końcu 3' odcinka zmutowanego DNA czynnika martwicy nowotworu.. Dwudezoksy-sekwencjonowanie potwierdziło, ze wyizolowana łysinka zawierała zmutowany DNA. Fag ten oznaczono M13 mp8/TNFmtnt.

M13 mp8/TNFmtnt poddawano trawieniu EcoRI i Hindlll i wyodrębniano fragment kodujący TNF. Plazmid pTrpXAPTNF trawiono EcoRI i Hindlll i wyodrębniono fragment wektora. Następnie ligowano fragment mutanta i fragment wektora i mieszaninę ligacyjną stosowano do transformacji E.coli W3110, NL106 lub 294 (ATCC 31446). Mutanty TNF izolowano sposobem opisanym w przykładzie XVIII lub XIX. Dodatkowe informacje dotyczące mutagenezy M13 podane są w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 130219A.

Mutanty otrzymane sposobem według niniejszego przykładu dzielą się na trzy klasy: podstawienie, wycięcia (delecja) i wstawki i można zastosować dalszy ich podział jak to podano w tabeli 2. Jeśli nie podano innych informacji, mutanty oznaczają mutanty dojrzałego czynnika martwicy nowotworu o strukturze przedstawionej na fig. 10.

155 778

Tabela 2

Typ mutanta	Miejsce TNF	Reprezentatywne modyfikacje w określonym miejscu
A. Podstawienia
I. Modyfikacje stopnia lub rodzaje ładunku
1	2	3
1	arg 6	his
2	lys 65	arg
3	pro 20	arg
4	asp 10	his
5	glu 53	thr
6	gin 47	asp
7	asp 45	gin lub asn
8	asn 39	asp
9	asn 34	gin
10	leu 29	asp
11	tyr 115	ile
12	glu 116	lys
13	pro 117	thr
14	glu 127	tyr
15	lys 128	his
16	ala 134	tyr
17	glu 135	lys
18	tyr 141	pro
19	asp 143	ser
20	ala 145	thr
21	glu 146	asn
22	gin 149	lys
23	leu 120	lys

II Modyfikacje dotyczące hydrofilnych lub hydrofobowych właściwości

1	leu 57	tyr
2	ser 52	leu
3	val 41	tyr
4	gly 108	phe
5	leu 120	thr
6	ser 133	gly
7	ala 134	thr
8	gly 148	ser
9	val 16	thr
III. Modyfikacje przestrzenne (zmiany w rozmiarach łańcucha bocznego)
1	Leu 63	phe
2	Ser 52	tyr
3	ile 58	leu
4	gly 40	ile
5	val 13	phe

155 778

1	2	3
6	leu 120	phe
7	ile 146	giy
8	asn 137	glu
9	ile 154	phe
10	ile 155	giy
11	phe 144	tle

B. Wstawki

1	po Leu 157	giy gly-COOH
2	pomiędzy Asp 101 Lys 11	his
3	pomiędzy ile 58 i tyr 59	leu
4	pomiędzy Ser 60 i gin 61	lysde
5	pomiędzy arg 31 i arg 32	ala
6	pomiędzy giy 121 i giy 122	giy
7	przed val 1	polipeptyd immunologiczny
8	po leu 157	polipeptyd immunologiczny
9	pomiędzy gin 149 i val 150	giy giy
10	pomiędzy ala-1 i val 1 lub pre TNF	lys arg

C Wycięcia (delecja)

Gin 149

2	lys 112
3	val l-arg 2
4	val 1 poprzez pro 8
5	ala 22
6	arg 32
7	glu 53
8	ala 111-lys 112
9	ala 123
10	ile 154
11	glu 127
D Kombinacje
1	ile 58	leu
	leu 57	phe
2	gin 149	wycięcia
	tyr 151	phe
3	lys 112	wycięcie
	glu 115	lys
4	val 1	thr
	ala 22	lys
	giy 24	asn
	ala 33	asp
5	tyr 115	phe
	glu 116	lys
6	wstawka giy pomiędzy giy 121	i giy 122
	po leu 157 dodano giy gly-COOH
7	wycięcie val 1 przez giy 66 i podstawienie NH2-Leu
	Ala Ile Ile Giy Phe Tyr Val Gin Giy Ser Glu Ala-Phe Asp
	Leu Tyr Asp Pro Arg Asn Ile Glu Ala Ser Leu Arg-Asp Giy Lys
	Glu Leu Gin Phe Val Giy Giy Leu Tyr Ile Pro-Glu Tyr Trp Pro
	Lys Ala Glu Ala Giy Glu Pro Thr -

155 778

1	2	3
8	wycięcie ala 111 ala 109	gin
	leu 120	his
9	asn 19	gin
	asn 92	gin
	asn 137	gin

Na uwagę zasługują mutacje, w miejscach wrażliwych na hydrolizę trypsyną, w arg 2, arg 6 (patrz przykłady XX i XXI), arg 32 i arg 131, które ulegają delecji lub modyfikacji tak, że tracą wrażliwość na trypsynę. Może to prowadzić do przedłużenia okresu półtrwania czynnika martwicy nowotworu in vivo, ze względu na ograniczenie możliwości rozkładu fermentacyjnego. Miejsca arg 2 i arg 6 nie mają krytycznego znaczenia dla biologicznej aktywności i jest ona zachowana nawet jeśli miejsca te są usunięte. Jednak rozszczepienie w miejscach arg 32 i arg 131 prowadzi do utraty aktywności. Korzystne jest natomiast podstawienie arg32i/lub arg 131 resztą histydylową lub mniej korzystnie resztą gin. Powoduje to usunięcie lub ograniczenie wrażliwości tego miejsca na działanie enzymu, zachowując zasadowy charakter łańcucha bocznego. Korzystne jest również zastąpienie arg 31 resztą histydylową lub mniej korzystnie glutaminą, z tych samych przyczyn. Stosuje się również wstawianie miejsc hydrolizy enzymatycznej pomiędzy polipeptyd fuzyjny i sekwencję TNF, w celu utworzenia miejsc predeterminowanego uwolnienia dojrzałego lub zmutowanego TNF lub miejsca takie podstawia się w sekwencji liderowem preTNF.

Podstawienie asn zamiast asp 45 i poddanie ekspresji w komórce gospodarza (np. komórce drożdży lub ssaka), zdolnej do glikozylacji prowadzi do wytwarzania glikolizowanego czynnika martwicy nowotworu.

Przykład XXV. Ekspresja czynnika martwicy nowotworu u drożdży pod kontrolą promotora ADH.

Plazmid TrpXAPTNF skonstruowano sposobem opisanym w przykładzie XVII z tą różnicą, że p20KLT lub ptrpETA (lub pBR322) trawiono -EcoRI i Hindlll, zamiast Xbal i Hindlll i syntetyczny fragment B zawierał EcoRI lepkie końce, zamiast lepkich końców Xbal. Mieszaninę ligacyjną używano do transformacji E.coli ATCC 31446 i drogą analizy restrykcyjnej identyfikowano plazmid pTNFRI, który zawierał DNA kodujące czynnik martwicy nowotworu związany z miejscami EcoRI. Izolowano plazmid pTNFRI, trawiono go EcoRI i wyodrębniano DNA czynnika martwicy nowotworu, zawierający fragment T-l.

Plazmid pFRPn (EP 60,057A) trawiono EcoRI, traktowano fosfatazą alkaliczną, dla ochrony przed recyrkularyzacją , ligowano do fragmentu T-l czynnika martwicy nowotworu, przy użyciu ligazy DNAT4 i mieszaninę ligcyjną używano do transformacji E.coli ATCC 31446. Jak wykazała analiza restrykcyjna w elektroforezie na żelach agarozowych, kolonie oporne na ampicylinę utworzyły dwie serie plazmidów zawierających wstawkę T-l w odwrotnych orientacjach. Plazmidy oczyszczono i stosowano do transformacji drożdży posiadających mutację trpl (np. szczep drożdży RH218, ATCC 44076, do dyspozycji bez ograniczeń) do fenotypu trp+. Plazmidy, w których kodon startowy segmentu T-l jest umieszczony w sąsiedztwie fragmentu promotora dehydrogenazy alkoholowej, transformują drożdże z wytworzeniem czynnika martwicy nowotworu. Czynnik martwicy nowotworu uzyskuje się z ekstraktów transformantów drożdżowych. Stabilność plazmidu w fermentacjach na wielką skalę, osiąga się przez użycie plazmidu ekspresyjnego, zawierającego 2 mikronowy odcinek replikacji w miejsce plazmidu pFRPn o chromozomalnym odcinku replikacji (ars 1) i odpowiedniego gospodarza (J. Beggs, 1978, „Naturę, 257, 104-109).

Przykład XXVI. Ekspresja czynnika martwicy nowotworu w komórkach ssaka.

Plazmid pEHER (EP 117, 060A) trawiono EcoRI, traktowano alkaliczną fosfatazą z przewodu pokarmowego cielęcia, ligowano do fragmentu T-l, otrzymanego sposobem opisanym w przykładzie XXV i mieszaniną ligacyjną używano do transformacji, E.coli ATCC 31446. Izolowano dwa plazmidy (oznaczone pEEHERTNF I i pEGERTNF II) zawierające DNA TNF w odwrotnej orientacji, jak to wykazała analiza restrykcyjna na żelu poliakrylamidowym. Plazmidy te używano do transfekcji wybranych komórek CHO DHFR-DUX-B11, CHO 1 i Ltk~.

155 778

Hodowle tkankowe transfekowano mieszaniną lpg pEHERTNF I i pEHERTNF II z lOpg nośnika DNA szczura w objętości 250/./1 0,25 M chlorku wapnia, następnie dodawano kroplami 250 μΐ buforu HEPES z dodatkiem soli (280 mM chlorku sodu, 1,5 mM fosforanu dwusodowego, 50 mM HEPES, pH 7,1). Po 30 minutach w temperaturze pokojowej roztwór dodawano do hodowli tkankowej rosnącej w 60 mm plastikowych płytkach do hodowli. Stosowano hodowle komórek CHO 1, CHO DHFR-DUX-B11 i Ltk”. Płytki zawierały 3 ml podłoża hodowlanego odpowiedniego dla danych komórek gospodarza.

Dla komórek CHO 1 i CHO DHFR-DUX-B11 stosowano podłoże Ham F-12 (Gibco) wzbogacone 10% surowicy cielęcej, 10(^g/ml penicyliny, 100pg/ml streptomycyny i 2pmM L-glutaminy. Dla komórek Ltk” stosowano podłoże Dulbecco w modyfikacji Eagle (DMEM) wzbogacone składnikami podanymi dla poprzedniego podłoża.

Po 3-16 godzinach podłoże usuwano i komórki przemywano 20% glicerolem w buforze fosforanowym z dodatkiem soli. Dodawano świeże podłoże do każdej płytki i komórki inkubowano w ciągu dalszych 2 dni.

W celu selekcji transfekowanych komórek poddawano je działaniu trypsyny (czyli traktowano je sterylnym roztworem trypsyny o stężeniu 0,5 mg/ml zawierającym 0,2 mg/ml EDTA), i umieszczano w ilości około 3X 10⁵ komórek na 10 mm płytkach do hodowli tkankowej z podłożem selekcjonującym. Dla komórek dhfr” jest to podłoże F-12 Gibco bez dodatku glicyny, hipoksantyny i tymidyny (podłoże GHT”). Dla komórek gospodarza DHFR+ do normalnego podłoża hodowlanego dodawano ΜΤΧ (100-1000 nM). Kontrolę prowadzono w warunkach transfekcji bez użycia plazmidu, lub z użyciem plazmidu pFD-11 (EP 117,060A), zawierającego normalny DHFR. Kolonie powstałe z komórek, do których wniknął i uległ ekspresji plazmid DHFR pojawiały się po 1-2 tygodniach. Transformanty identyfikowano na podstawie cechy wytwarzania czynnika martwicy nowotworu.

co

155 778

CTATCTCCTACCTr.ACAC

CGCAGAC/AiG<CAACTACACACCCCCCCTGAAAĄCAACCCTCAGACCCCAACTCCCCICACAACCTCCCAMCA<XrrCTCTrCCTCTCACATACSACCCACGCCTCCACCCrCTCTC 50 100

-76

-70

-60

met

ser

thr

glu

ser

aet

He

•rg

• sp

val

glu

leu

ala

glu

glu

ala

leu

pro

i/·

ly·

thr

gly

gly

pro

gin

CCCCCGAAACCCCACC

ACC

ACC

ACC

CAA

ACC

ATC

ACC

COC

GAC

Cfo

CAC

CTG

CCC

CAC

CAG

CCC

CCC

CCC

AAG

AAC

ATA

ccc

ccc

CAC

150

200

-50

-40

-30

giy

•er

•rg

• rg

cyt

leu

phe

leu

•er

leu

phe

er

phe

leu

ile

val

al·

gly

ala

thr

thr

leu

phe

cy·

leu

leu

hi·

phe

giy

val

ccc

CCC

ACC

CCC

CCC

TCC

TTC

CCC

ACC

CTC

TTC

TCC

TTC

CTG

ACC

CTG

CCA

CCC

CCC

ACC

ACC

CCC

TTC

TGC

CTC

ACG

CAC

TTC

CCA

GCC

250

200

-20

-10

1

1

He

giy

pro

gin

• rg

glu

glu

phe

pro

arg

asp

leu

ser

leu

ile

ser

pro

leu

ala

gin

ala

Va1

Arg

^r

Zer

Ser

Thr

Pro

^r

ACC

GGC

CCC

CAG

ACC

CAA

GAC

CCC

CCC

AGG

GAC

CCC

TCC

CCA

ATC

AGC

CCC

CCG

GCC

CAG

GCA

GCC

AGA

TCA

'CC

TCC

CGA

ACC

CCG

AGC

10

20

30

I

Asp

Lys

Pro

Va1

Ala

HIS

Val

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

frp

Leu

Asn

Arg

Arg

^Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn

GAC

AAG

CCC

GCA

GCC

CAC

GTC

GCA

GCA

AAC

CCC

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CCC

CAG

CGG

CCG

AAC

CGC

CGG

GCC

AAC

GCC

CCC

CTG

GCC

AAC

40

1

50

60

i

1

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

Leu

Val

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyi-

Leu

Ile

Cyr

Ser

Gin

Val

Leu

***

Lys

Gly

Gin

Giy

Cys

GGC

GTG

GAG

CCG

AGA

GAC

AAC

CAG

CTG

GCG

GCG

CCA

CCA

GAG

GGC

CCG

ΤΜ

CCC

ACC

CAC

CCC

CAG

GCC

CCC

'CC

AAG

GGC

CM

GGC

TGC

70

80

90|

i

Pro

Ser

Chr

His

Val

Leu

Leu

Chr

His

Chr

He

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Cyr

Gin

Chr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

S?r

Ala

Ile

lys

^r

CCC

TCC

ACC

CAC

GCG

CCC

CCC

ACC

ACC

ATC

AGC

CGC

ACC

GCC

GCC

CCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GCC

AAC

CTC

c~c

CCT

GCC

ATC

AAG

AGC

100

110

120

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Chr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Lys

Pro

Crp

Cyr

Glu

Pro

He

Cyr

Leu

Gly

G1y

Val

>>e

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCC

GAG

GCC

AAG

Ctt

CGG

CAC

GAG

CCC

ACC

TAC

CTG

GGA

GGG

GCC

ccc

CAG

CTG

GAG

AAG

GGT

130

140

150

157

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

He

Asn

Arg

Pro

Asp

Cyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

fy

Phe

Gly

' *e

He

Ala

Leu

OP

GAC

CGA

CCC

AGC

GCC

GAG

ACC

AAC

CGG

CCC

GAC

CAT

CCC

GAC

ctt

GCC

GAG

CCC

GGG

CAG

GCC

TAC

m

GGG

ATT

ATT

GCC

CTG

TGA

GGA

Fig.10

GGAC<GAGIACTCCMCCπCTCWCGCCTCCCCT«XTTTAGCTTπTATCCTTTTCCTTCCTCGATCTTTCTCCTTrTCTTCGGTCTCAAACGC6CATTG<^Tπc^6TCGGACTT

TAAGC'ΓrCGGGCπTCAGCCCTCAG^CCACCACπC(ACWTTTGGGCrCTCGGACCGCGCGGTTCGTCTCGT&ACTTGCTGGCWGCCACTGCGA^^^ACATTGGGαCTCίA^ATTTA

TTGGGGCTCCTAGTCHGACTTTTGCTCTCTGGCArTTGGCGCTTAαGIGCGCTTTT&STTTCGGTTCGAATGCTGCAGGACTT(GG(GW6AGTTCCCA'CAAGCrπCAα^ίCA½TGGCTTT rAGGCCπCCCCTCTCCC&ATGrπCCAGACCTCCΠ&AGACGC(&GAGCCCTACCCGCCCCATGrG^(ACCCGTCrGCCTATCCCTCπTCCACACc-GAπArTrAπACTTATTTCTTC

TπATGCTCCTCCATAGCAArCCTTGTATTTGCGGACCC&GTGTATCCTGGGGCTTTGCTGTGAGCGTCTTCCCTGGCTCA(ATCATGTTrTTCTT·^CCTCGAGATG&ACACrTtóGTrG

ΠCCCACGCA6ACCCCTG6CCrCrGTGCCπCrTTr&ArTAr&πΠrTWAA^TAπGCGTTATπCAGTTTCTCAMCCArTGCτ(ArTπGGT(^GCJGACTGT(AG;TCΛrTKTy£CCT

TTGCCTTTTAGαGGAGπGTGTCTGTAArTGCCCTCCTCrCTA6CGGTGAίGAACTGAGGTTCGCCC

Fig. 9.

MU/FPl~-~ (jednostki /mi) /— IOO-\ λ-50-λ <-20-λ

-ιο-

············

Bl6(5QOOOomórek/s/ydzimkę)inkutx2cjai 72ocxteiny

155 778

Fig. 8.

Czas retencji (minuty)

I

I

I

fibsorbancja (210 mm)

Fig. 7

(...) OrouOgjosgj

155 778

Boaktyrmość (jednostki κΐ0~2/™ί)

Fig. 6.

OO, C_ O_ b-~ rO O φφ Ϊ fC -r-ι-1-ιΟ o'

Cd st ~T“ czoto barwnika <\i ¹ 18

X

AZ

-U) $

£:

<u ^-c c

Sj

AZ a

o '««» co

3 « ¹ « T^-1 ł J 1 ¹ | I I ; ) I

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Numer pictki rejowej

155 778

Ftg k.

Fig. 3.

RicuktyginośC (jednostki x ΙΟ'³/™.

155 778

Fig. 2.

I go

Ί» ξ

C\

-u s-s

Cg S •^J ~v

Hj

V)

O

C ftumer frakcji

□ o>

Ό |

Sj

Ch $

-uj ζ) ~£ £ -Ό Οι

Numer frakcji

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 3000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania czynnika martwicy nowotworu z jego mieszaniny z innymi białkami, znamienny tym, że czynnik martwicy nowotworu adsorbuje się z tej mieszaniny na substancji wybranej z grupy obejmującej krzemian, szkło o kontrolowanej wielkości porów, alkilowaną sepharozę oraz cząstki anionowej żywicy jonowymiennej o zasadniczo jednakowym rozmiarze cząstek, a następnie czynnik martwicy nowotworu eluuje się.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik martwicy nowotworu eluuje się ze szkła o kontrolowanej wielkości porów za pomocą glikolu etylenowego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako anionową żywicę jonowymienną stosuje się usieciowany polistyren podstawiony ugrupowaniami aminy czwartorzędowej.