DK171418B1 - Tumornecrosefaktorderivater, DNA som koder derfor, replikerbare udtrykkelsesvektorer indeholdende DNA'en, værtsceller transformeret dermed og en fremgangsmåde til fremstilling af tumornecrosefaktorderivaterne samt præparater omfattende tumornecrosefaktorderivaterne - Google Patents

Description

DK 171418 B1

Den her omhandlede opfindelse angår tumornecrosefaktorderivater, som er særegne ved det i krav 1 angivne, DNA, som koder for disse tumornecrosefaktorderivater, repliker-bare udtrykke1sesvektorer indeholdende DNA'en, værtscel-5 ler transformeret med vektorerne og en fremgangsmåde til fremstilling af tumornecrosefaktorderivaterne. Endvidere angår opfindelsen præparater omfattende et tumornekrose-faktorderivat ifølge opfindelsen i blanding med en fysiologisk acceptabel puffer, aminosyre eller ikke-ionisk over 10 fladeaktivt middel eller blandinger deraf og specielt præparater som er egnet til behandling af tumorer, og som omfatter et tumornecrosefaktorderivat ifølge opfindelsen og et interferon.

Immunceller, såsom B-celler, T-celler, naturlige dræber-15 celler og makrofager er kendt for at udvikle stoffer, som udøver cytotoxisk aktivitet over for tumorceller, men som er uskadelige for normale celler. Disse stoffer er blevet benævnt på forskellig måde, f.eks. lymphoto-xin, tumornecrosefaktor, cytotoxisk NK-celle-faktor, 20 hæmorrhagisk necrosefaktor, makrofag-cytotoxin eller cytotoxisk makrofagfaktor. For tiden er identiteterne af de proteiner, som forbindes med disse navne, uklare. Hovedvanskelighederne har været, at de biologiske prøvninger, som anvendes til at detektere proteinerne, ikke 25 skelner mellem dem. Proteinerne viser sig at findes i naturen som aggregater eller hydrolyseprodukter, og de hidtil opnåede mængder har været så små, at den høje grad af rensning, som behøves for fuldt ud at karakterisere proteinerne, ikke er blevet nået.

Typisk findes sådanne cytotoxiske stoffer i sera fra intakte dyr eller i kultursupernatanter af lymfeceller 30 eller cellelinier, efter at dyrene eller cellerne er blevet behandlet med et stof, som vides at stimulere formeringen af immunceller (en "induktor"). Derefter udvindes serum eller supernatant og prøves for cytotoxisk aktivitet over for en mål-tumorcellelinie. Et standardmål DK 171418 B1 2 er L-929, som en muse-tumorcellelinie. Denne cellelinie-og andre, som anvendes inden for bioprøvninger af denne type, er uspecifikke i deres lysereaktion, fordi en række forskellige, tilsyneladende adskilte lymfecelleprodukter 5 er i stand til at frembringe lyse. Lignende uspecifikke reaktioner iagttages ved in vitro tumornecrose-prøvninger. Således er cytolytiske prøvninger, som iagttager for lysen af cellelinier in vitro eller tumornecrose in vivo, util-trækkelige til at skelne mellem de forskellige cytotoxiske 10 lymfeprodukter.

Cytotoxiske faktorer er forsøgsvis blevet klassificeret på basis af de lymfeceller, hvorfra de er induceret. F.eks. er lymphotoxin et navn, som almindeligvis anvendes om de cytotoxiske sekretionsprodukter af B eller T-lymphocytter 15 eller cellelinier afledt derfra, medens tumornecrosefaktor ofte anvendes til at beskrive cytotoxiske produkter af makrofager eller deraf afledte cellelinier. Dette klassifikationssystem er imidlertid ikke blevet udviklet til det punkt, hvor der er nogen sikkerhed for, at der kun henvises til et 20 enkelt protein, eller at proteiner, som betegnes ved forskel ligt navn, faktisk er forskellige.

Der er gjort forsøg på at rense og karakterisere de cytotoxiske faktorer, som secerneres af hver celletype. I den udstrækning rapporterne varierer med hensyn til en egenskab 25 af en cytotoxisk faktor eller er fuldstændigt uoverensstem mende med hensyn til en given egenskab, kunne det konkluderes, enten at karakteriseringen var fejlagtig, eller at hver celletype secernerer flere adskilte cytotoxiske faktorer. F.eks. er de cytotoxiske produkter, som afledes fra 30 macrophager, monocytter eller monocytiske cellelinier, selv om de somme tider alment betegnes som tumornecrosefaktor blevet rapporteret at have egenskaber, som forekommer uoverensstemmende med en teori om et enkelt cytotoxisk produkt; se f.eks. den følgende litteratur: R. MacFarlan et al., 1980, 35 "AJEBAK" 58(pt 5): 489-500; D. Mannel et al., 1980 "Infec tion and Immunology" _30.(2): 523-530; H. Ohnishi et al., GB offentliggørelsesskrift nr. 2 106 117 A; og J. Hammer-strom, 1982, "Scand J. Immunol. " 1^5: 311-318.

DK 171418 B1 3 På den anden side antyder C. Zacharchuk et al., 1983 "Proc. Nat. Acad. Sci. USA", 8£: 6341 - 6345, at marsvine-lymphotoxin og en cytotoxisk faktor fra marsvine-makro-fager er immunokemisk ens, om ikke identiske. Lignen-5 de konklusioner fremsættes i Ruff et al., 1981, Lympho-kines Vol. 2, side 235 - 272, på side 241 - 242.

Forsøgene på at karakterisere cytotoxiske immunfaktorer har også fokuseret på anvendelse som udgangsmateriale af serum eller peritonealvæske fra dyr, som er blevet 10 udsat for immunogene antigener. Disse kilder indeholder hele det stressede immunsystems overflødighedshorn i modsætning til produktet eller produkterne af en enkelt celletype eller -linie. De følgende bør konsulteres som eksempler på publikationer af denne type: S. Green 15 et al., 1982, "J. Nat. Cancer Inst." 68(6): 997 - 1003 ("tumor necrosis-inducing factor"); M. Ruff et al., 1980, "J. Immunology" 125(4): 1671 - 1677 ("tumor necrosis factor"); H. Enomoto et al., EP patentansøgning nr. 86475 ("antitumor substance"); H. Oettgen et al., 20 1980, "Recent Results Cancer Res." T5_i 207 - 212 ("tumor necrosis factor"); F. Kuli et al., 1981, "J. Immunol." 126(4) : 1279 - 1283 ("Tumor Cell Cytotoxin:); D. Mannel et al., 1980, "Infection and Immunity" 28/1): 204 -211 ("cytotoxic factor"); N. Matthews et al., 1980, 25 "Br. J. Cancer: 42^ 416 - 422 ("tumor necrosis factor"); S. Green et al., 1976, "Proc. Nat. Acad. Sci. USA:, 73/2): 381 - 385 ("serum factor”); N. Satomi et al., 1981, "Jpn J. Exp. Med." 5_1 (6) : 317 - 322; N. Matthews, 1979, "Br. J. Cancer" 4J): 534 - 539 ("tumor necrosis 30 factor"); K. Haranaka et al., 1981, "Jpn. J. Exp. Med." 5_1(3): 191 - 194 ("tumor necrosis factor"); L. Old et al., EP patentansøgning nr. 90892; T. Umeda et al., 1983, "Cellular and Molecular Biology" 29/5): 349 -352; og H. Enomoto et al., 1983, EP patentansøgning 35 nr. 86 475.

DK 171418 B1 4

Yderligere litteratur, som bør konsulteres, er J. Nissen-Meyer et al., 1982, "Infection and Immunity" 38(1): 67 - 73; J. Klostergaard et al., 1981, "Mol. Immunol." ]J3(12): 1049 - 1054; N. Sloane, US patentskrift nr.

5 4 359 415; H. Hayashi et al., US patentskrift nr. 4 447 355; K. Hanamaka et al., 1983, EP patentansøgning nr. 90 892; og G. Granger et al., 1978, "Cellular Immunology" 38: 388 - 402.

EP offentliggørelsesskrift nr. 100 641 beskriver et 10 cytotoxisk polypeptid, som blev renset i det væsentlige frit for urenheder fra en human lymphoblastoidcellekultur. Dette polypeptid blev betegnet lymphotoxin, selv om dets slægtskab med andre rapporterede cytotoxiske polypeptider under navnet lymphotoxin kun er formodet.

15 Det var ikke kendt, om dette var det eneste cytotoxiske polypeptid, som udarbejdes af immunceller, som antydet af Zacharchuk et al. (ovenfor), eller om det var et af en kraftig familie af cytotoxiske faktorer.

Polypeptidet fra EP 100 641 har to aminotermini, idet 20 en større variant ender med Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr.... og en mindre variant med den afkortede aminoterminus His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala ... 1 2 3 4 5 6

Ifølge den hidtige litteratur var interferonerne, som 2 udviser nogen tumorinhiberende aktivitet, og et dårligt 3

karakteriseret protein med en AlaAla-aminoterminus (GB

4 offentliggørelsesskrift nr. 2 117 385A) kandidater til 5 cytotoxiske faktorer forskellige fra lymphotoxin. Som 6 det vil ses, er tumornecrosefaktoren ifølge opfindelsen ikke et interferon, ikke lymphotoxin og har ikke en AlaAla-aminoterminus.

DK 171418 B1 5

Denne opfindelses formål er (a) konklusivt at bestemme, om der eksisterer en anden tumornecrosefaktor end lym-photoxin eller ej, og hvis det er tilfældet, at idenfi-5 cere den på en sådan måde, at sådanne andre faktorer skelnes klart; (b) at producere en sådan faktor ved andre fremgangsmåder end induceret cellekultur, der er dyr og giver et produkt, som er forurenet med induktionsmidlet, eller induktion af perifere blodlymphocytter, 10 som er økonomisk uigennemførlig, dårligt reproducerbar og producerer et produkt, som er forurenet med homologe cellulære og plasmaproteiner; (c) at opnå DNA, som koder for en sådan tumornecrosefaktor og udtrykke DNA'en i rekombinant kultur; (d) at syntetisere en sådan faktor 15 i rekombinant kultur i moden form; (e) at modificere kodesekvensen eller strukturen af en sådan faktor; (f) at sammensætte en sådan faktor til terapeutiske doseringsformer og indgive disse til dyr til behandling af tumorer; og (g) at fremstille diagnostiske reagenser med relation 20 til en sådan faktor.

Sammenfatning af opfindelsen

En cytotoxisk faktor er blevet renset til homogenitet, karakteriseret og udtrykt i rekombinant kultur. Denne faktor betegnes af nemhedsgrunde tumornecrosefaktor 25 (TNF) og er defineret nedenfor. Den tilvejebringes i hovedsageligt homogen form fra cellekultur med en specifik aktivitet på over ca. 10 millioner enheder/mg protein, og almindeligvis omkring 100 millioner enheder/mg.

Human tumornecrosefaktor syntetiseret i rekombinant 30 kultur er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ikke- humane cellekomponenter, herunder proteiner, i mængder og af en karakter, som er fysiologisk acceptabel for indgivelse til patienter sammen med tumornecrosefaktoren. Disse komponenter vil almindeligvis være af gær-, prokaryo- DK 171418 B1 6 tisk eller ikke-human højere-eukaryotisk oprindelse og er til stede i uskadelige forureningsmængder af størrelsesordenen under ca. 1 vaegt-%. Endvidere muliggør rekombinant cellekultur produktionen af tumornecrosefaktor absolut fri for homologe proteiner. Homologe proteiner er dem, der nor-5 malt forbindes med tumornecrosefaktoren, som den findes i naturen, f.eks. i celler, celleexudater eller legemsvæsker. F.eks. er et homologt protein for human tumornecrosefaktor humant serumalbumin. Heterologe proteiner er det modsatte, dvs. de er ikke naturligt forbundet eller findes i kombina-10 tion med den pågældende necrosefaktor.

Der er tilvejebragt DNA, som koder for tumornecrosefaktor, og som, når den udtrykkes i rekombinant eller transformeret kultur, giver rigelige mængder af tumornecrosefaktor. Denne DNA er hidtil ukendt, fordi cDNA opnået ved revers 15 transcription af mRNA fra en induceret monocytisk cellelinie, ikke indeholder introns og er fri for flankerende områder, der koder for andre proteiner fra den organisme, som mRNA'en stammede fra.

20 Chromosomal DNA, som koder for TNF, er opnået ved sondering af genomiske DNA-biblioteker med cDNA. Chromosomal DNA er fri for flankerende områder, som koder for andre proteiner, men kan indeholde introns.

Den isolerede tumornecrosefaktor-DNA modificeres let ved 25 udskiftning, deletering eller indsætning af nucleotider, hvilket resulterer i hidtil ukendte DNA-sekvenser, som koder for tumornecrosefaktor eller derivater deraf. Disse modificerede sekvenser anvendes til at fremstille mutant-tumornecrosefaktor og til direkte at udtrykke moden tumor-30 necrosefaktor. De modificerede sekvenser er også nyttige til forhøjelse af effektiviteten af tumornecrosefaktor-udtrykkelse i valgte vært-vektor-systemer, f.eks. ved modifikation til at svare til en værtscelle-codon-præference.

DK 171418 B1 7

Disse hidtil ukendte DNA-sekvenser eller fragmenter deraf kan også mærkes og anvendes til hybridiseringsprøvninger for genetisk materiale, som koder for tumornecrosefaktor.

Den foreliggende opfindelse angår et tumornecrosefaktorderivat, som 5 a) er i stand til fortrinsvis at destruere eller vækstin-hibere tumorceller sammenlignet med normale celler under de samme betingelser; b) er i det væsentlige homogent bestemt ved SDS-PAGE; og c) omfatter: 10 (i) aminosyresekvensen Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-

Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro; eller (ii) aminosyresekvensen bestående af resterne 35-66 som vist i den vedføjede fig. 10; eller (iii) aminosyresekvensen bestående af resterne 110-133 15 som vist i den vedføjede fig. 10; eller (iv) aminosyresekvensen beståede af resterne 16, 7-44, 45-82, 83-90 eller 99-157 som vist i den vedføjede fig. 10.

Ved fremgangsmåder til syntese af tumornecrosefaktor lige-20 res DNA, som koder for tumornecrosefaktor, ind i en repli-kerbar (reproducerbar) vektor, vektoren anvendes til at transformere værtsceller, værtscellerne dyrkes, og tumornecrosef aktor udvindes fra kulturen. Denne almene fremgangsmåde anvendes til at konstruere tumornecrosefaktor DK 171418 Bl 8 med egenskaberne hos monocyt-tumornecrosefaktor eller at konstruere hidtil ukendte derivater af tumornecrose-faktor, afhængigt af vektorkonstruktionen og den værtscelle, der vælges til transformation. Tumornecrosefaktor-5 arterne, som kan syntetiseres ifølge opfindelsen, inkluderer moden (valyl-aminoterminal) tumornecrosefaktor, prætumornecrosefaktor ("præTNF", defineret i det følgende) og derivater af TNF inkluderende (a) fusionsproteiner, hvori TNF eller et ethvert fragment deraf (inklusive 10 moden tumornecrosefaktor) forbindes med andre proteiner eller polypeptider ved en peptidbinding ved de amino-og/eller carboxylterminale aminosyrer af TNF eller dens fragmenter, (b) TNF-fragmenter, herunder moden tumornecrosef aktor eller fragmenter af præTNF, hvori enhver 15 præprotein-aminosyre er fragmentets aminoterminale aminosyre, (c) mutanter af TNF eller dens fragmenter (herunder moden tumornecrosefaktor), hvori en eller flere aminosyrerester er udskiftet, indsat eller deleteret, og/eller (d) methionyl- eller modificeret methionyl-20 (såsom formylmethionyl eller andre blokerede methionyl-arter) aminoterminale additionsderivater af de forudgående proteiner, fragmenter eller mutanter.

Hvis en pattedyrcelle transformeres med (a) en vektor indeholdende hele tumornecrosefaktor-strukturgenet (in-25 klusive en 5'-startcodon) eller (b) genet for den modne tumornecrosefaktor eller et tumornecrosefaktor-derivat operabelt forbundet med en eukaryotisk sekretorisk leder (der også kan indeholde præsekvensen for den tumornecrose-faktor-sekretoriske leder), og cellen dyrkes, så vil 30 der almindelig vis kunne udvindes moden tumornecrosefaktor fra kulturen.

DK 171418 B1 9

Hvis på lignende måde DNA, som koder for TNF, operabelt forbundet med en vektor til en sekretorisk leder, som 5 forarbejdes passende af værtscellen, som skal transformeres (sædvanligvis den organisme, hvorfra ledersekven-sen blev opnået), og værten transformeres med vektoren og dyrkes, så vil tumornecrosefaktoren blive syntetiseret uden aminoterminalt methionyl eller blokeret methionyl.

10 Især E. coli transformeret med vektorer, hvori DNA, som koder for moden tumornecrosefaktor, er ligeret 5' til DNA, som koder for STII-enterotoxin-signalpolypep-tidet vil forarbejde en høj procentdel af det hybride præprotein på passende måde til moden tumornecrosefaktor.

15 Der kan også vælges sekretoriske ledere og værtsceller, som resulterer i passende transport af modent protein ind i celleperiplasmaet.

Opfindelsen omfatter også andre derivater af tumornecrosef aktor end variationer i aminosyresekvens eller glyco-20 sylering. Sådanne derivater er karakteriseret ved ko valent eller aggregativ forbindelse med kemiske dele. Derivaterne falder almindeligvis i tre klasser: salte, kovalente sidekæde- og terminalrest-modifikationer og adsorptionskomplekser. 1 2 3 4 5 6

Hvis DNA, som koder for moden tumornecrosefaktor, er 2 operabelt ligeret ind i en vektor, og vektoren anvendes 3 til at transformere en værtscelle, og cellen dyrkes, 4 findes moden tumornecrosefaktor i cellecytoplasmaet.

5 I overensstemmelse hermed er det unødvendigt at udforme 6 sekretionssystemer for at opnå moden tumornecrosefaktor.

Dette var overraskende, fordi direkte udtrykkelse almindeligvis giver methionyleret protein. Endvidere er proteinet stabilt og opløseligt i rekombinant cellekultur, DK 171418 B1 10 dvs. det hverken spaltes proteolytisk af intracellu-lære proteaser eller aflejres som lysbrydende legemer.

I overensstemmelse hermed tilvejebringes hidtil ukendte gæringer, som omfatter lavere-eukaryotiske eller prokaryo-5 tiske celler med umethionyleret moden tumornecrosefaktor lokaliseret i cellernes cytoplasma.

Selv om tumornecrosefaktor kan fremstilles ved dyrkning af dyrecellelinier, f.eks. en monocytisk cellelinie induceret ved vækst i nærvær af 4;-phorbol-12-myristat-10 13-acetat (PMA) eller udødelige cellelinier, såsom hybri- domer eller EBV-transformerede celler (US patentskrift nr. 4 464 465), foretrækkes det at syntetisere tumornecrosef aktor i rekombinant cellekultur som beskrevet yderligere nedenfor.

15 Når først tumornecrosefaktor er fremstillet ved gæring, renses den almindeligvis ved, at man udvinder dyrknings-væskesupernatanten eller den lyserede cellekultur, fjerner fast stof, adsorberer tumornecrosefaktor fra supernatant-blandingen (indeholdende tumornecrosefaktor og andre 20 proteiner) på et hydrofobt stof, eluerer tumornecrose faktor fra stoffet, adsorberer tumornecrosefaktor på en tertiær-amin-anionbytterharpiks, eluerer tumornecrosefaktor fra harpiksen, adsorberer tumornecrosefaktor på en anionbytterharpiks (fortrinsvis kvaternær-amino-25 substitueret) med i det væsentlige ensartet partikel størrelse og eluerer tumornecrosefaktor fra harpiksen. Eventuelt koncentreres og renses tumornecrosefaktor-præparaterne ved kromatofokusering ved ethvert punkt i rensningsproceduren, f.eks. ved isoelektrisk fokusering 30 eller passage igennem en si-gel, såsom "Sephadex®^G-25".

Den rensede tumornecrosefaktor fra rekombinant eller induceret cellekultur kombineres til terapeutisk brug med fysiologisk uskadelige stabilisatorer og excipienter DK 171418 B1 11 og præpareres i doseringsform, f.eks. ved lyophilise-ring i doseringsampuller eller opbevaring i stabiliserede vandige præparater. Alternativt inkorporeres tumornecrose-faktor i en polymer matrix til implantation i tumorer 5 eller kirurgiske steder, hvorfra tumorer er blevet udskå ret, således at der frembringes en tidsindstillet afgivelse af tumornecrosefaktoren i en lokal høj-gradient-kon-centration.

De her omhandlede præparater opnås frie for forurenende 10 cytotoxiske faktorer, såsom lymphotoxin, interferoner eller andre cytotoxiske proteiner, som der er henvist til i litteraturen. Imidlertid kombineres tumornecrose-faktor ved terapeutiske anvendelser fordelagtigt med forud fastsatte mængder lymphotoxin og/eller interferon.

15 Præparater indeholdende tumornecrosefaktor og et inter feron, såsom /-interferon, er særligt nyttige, da de har vist sig at udøve en synergistisk cytotoxisk aktivitet.

Tumornecrosefaktor-præparater indgives dyr, især patien-20 ter, som bærer maligne tumorer, i terapeutisk effektive doser. Egnede doseringer vil være indlysende for fagmanden inden for den terapeutiske sammenhæng som yderligere beskrevet nedenfor.

Kort beskrivelse af tegningerne 25 Fig. 1 viser elueringsprofilen af tumornecrosefaktor fra glas med kontrolleret porestørrelse.

Fig. 2 viser elueringsprofilen af tumornecrosefaktor fra diethylaminoethylcellulose.

Fig. 3 viser elueringsprofilen af tumornecrosefaktor 30 fra hurtig-protein-væskekromatografi.

DK 171418 B1 12

Fig. 4 viser elueringsprofilen af tumornecrosefaktor efter kromatofokusering.

Fig. 5 viser molekylvægten af tumornecrosefaktor ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektroforese 5 (SDS-PAGE).

Fig. 6 viser molekylvægten af tumornecrosefaktor efter HPLC-eluering.

Fig. 7 viser elueringsprofilen af tumornecrosefaktor fra en HPLC-C4-søjle.

10 Fig. 8 belyser adskillelsen af tumornecrosefaktor-trypsin-nedbrydningsfragmenter på HPLC.

Fig. 9 belyser den cytotoxiske virkning af blandinger af -interferon og tumornecrosefaktor.

Fig. 10 angiver nucleotid- og aminosyre-sekvensen for 15 præ-human-tumornecrosefaktor, herunder den fuldstændige tumornecrosefaktor-sekretoriske leder.

Fig. 11 viser konstruktionen af en tumornecrosefaktor-udtrykkelsesvektor.

DetailbeskriveIse 20 Tumornecrosefaktor defineres til formålene i denne beskri velse som et andet polypeptid end lymphotoxin, der er i stand til at udøve fortrinsvis cytotoxisk aktivitet og har et område, som viser funktionel aminosyrehomolo-gi med aminosyresekvensen af den modne tumornecrosefak-25 tor, som er anført i fig. 10, et fragment deraf eller et derivat af et sådant polypeptid eller fragment.

DK 171418 B1 13

Fortrinsvis cytotoxisk aktivitet defineres som den fortrinsvise ødelæggelse eller vækstinhibering af tumorceller i forhold til normale celler under de samme betingelser. Fortrinsvis cytotoxisk aktivitet detekteres ved poly-5 peptidets virkning på tumorceller in vivo eller in vitro sammenlignet med normale celler eller væv. Cellelyse er almindeligvis det diagnostiske indicium in vitro, medens tumornecrose bestemmes ved in vivo forsøg. Imidlertid kan cytotoxisk aktivitet udtrykkes som cytostase 10 eller antiproliferativ aktivitet. Egnede prøvningssyste mer er velkendte. F.eks. er den cellelytiske prøvning, som anvendes til at bestemme den specifikke aktivitet af tumornecrosefaktor som beskrevet nedenfor acceptabel ligesom prøvningen beskrevet af B. Aggarwal et al. i 15 "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center (den A549 cellelinie, som der henvises til i denne litteratur, kan fås fra ATCC som CCL185).

20 Den specifikke aktivitet af TNF er defineret ved målcellelyse frem for cytostase. En enhed af tumornecrosefaktor defineres som den mængde, der kræves til 50 % lyse af målcellerne udsået i hvert hul i overensstemmelse med eksempel 1. Imidlertid skal dette ikke forstås 25 at udelukke andre prøvninger til måling af specifik aktivitet, f.eks. metoder baseret på målcelle-væksthastighed.

PræTNF er en art af tumornecrosefaktor, som er inkluderet i den ovenstående definition af tumornecrosefaktor.

30 Den karakteriseres ved tilstedeværelsen i molekylet af et signal- (eller leder-) polypeptid, som tjener til efter translation at dirigere proteinet til et sted inden for eller uden for cellen. Almindeligvis spaltes signalpolypeptidet (som ikke i sig selv vil have tumor- DK 171418 B1 14 necrotisk aktivitet) proteolytisk fra et resterende protein, som har tumornecrosefaktor-aktivitet, som en del af den sekretoriske proces, hvorved proteinet transporteres til værtscelleperiplasmaet eller dyrkningsmedi-5 et. Signalpeptidet kan være mikrobielt eller fra patte dyr (herunder den native præsekvens på 76 rester), men det er fortrinsvis et signal, som er homologt for værtscellen.

Nativ tumornecrosefaktor fra normale biologiske kilder 10 har en udregnet molekylvægt på omkring 17000 ved natrium- dodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) som beskrevet nedenfor, et isoelektrisk punkt på omkring 5,3, og modtagelighed for trypsinhydrolyse ved flere steder. Nativ tumornecrosefaktor, som er blevet renset 15 ved revers-fase-HPLC, trypsinhydrolyseres til mindst ni fragmenter under de nedenfor beskrevne betingelser.

Det præcise antal fragmenter, hvori tumornecrosefaktor hydrolyseres af trypsin, vil afhænge af sådanne faktorer som trypsinaktiviteten, tumornecrosefaktor-koncentratio-20 nen og inkubationsparametrene, herunder ionstyrken, pH-værdien, temperaturen og inkubationstiden.

Tumornecrosefaktor viser sig ikke at være et glycoprotein, da det ikke tilbageholdes på lectin-affinitets-søjler, og analyse af den afledte aminosyresekvens inde-25 holder ingen sandsynlige glycosyleringssteder. Ligeledes vandrer materiale produceret i rekombinant E. coli kultur (som ikke har evne til at glycosylere) sammen med naturlig TNF ved SDS-PAGE.

Den grad af aminosyresekvens-homologi, som bringer et 30 polypeptid inden for omfanget af den her omhandlede definition af tumornecrosefaktor, vil variere afhængigt af om homologien mellem kandidatproteinet og tumornecro- DK 171418 B1 15 sefaktor falder inden for eller uden for de tumornecrose-faktor-områder, som er ansvarlige for cytotoxisk aktivitet; domæner som er kritiske for cytotoxisk aktivitet bør udvise en høj grad af homologi for at falde inden 5 for definitionen, medens sekvenser, der ikke er invol veret i opretholdelse af tumornecrosefaktor-konformatio-nen eller i frembringelse af receptorbinding, kan vise forholdsvis lav homologi. Desuden kan kritiske domæner udvise cytolytisk aktivitet og alligevel forblive homo-10 loge som defineret her, hvis der er indført rester inde holdende ens aminosyre-sidekæder. Funktionelt ens henfører til dominante egenskaber hos sidekæderne, såsom basisk, neutral eller sur eller tilstedeværelse eller fravær af sterisk omfang. Imidlertid udelukker tumornecrosefakto-15 rer som defineret heri specifikt lymphotoxin.

Almindeligvis vil et polypeptid, der defineres som tumornecrosef aktor , indeholde områder, som er i det væsentlige homologe med proteinet i fig. 10 eller fragmenter deraf over en kontinuert blok på fra omkring 20 til 20 omkring 100 aminosyrerester, især blokkene omfattende resterne 35 - 66 og 110 - 133.

En højst væsentlig faktor ved etablering af identiteten af et polypeptid som tumornecrosefaktor er evnen hos antisera, som er i stand til i det væsentlige at neutra-25 lisere den cytolytiske aktivitet hos moden tumornecrose faktor som anført i fig. 10, til også i det væsentlige at neutralisere det pågældende polypeptids cytolytiske aktivitet. Imidlertid vil det erkendes, at immunologisk identitet og cytotoxisk identitet ikke nødvendigvis 30 er sammenfaldende. Et neutraliserende antistof for tumornecrosef aktoren i fig. 10 kan eventuelt ikke binde etkandidatprotein, fordi det neutraliserende antistof tilfældigvis ikke er rettet mod specifikt at binde et DK 171418 B1 16 sted på tumornecrosefaktor, som er kritisk for dens cytotoxiske aktivitet. I stedet kan antistoffet binde et uvirksomt område og udøve dets neutraliserende virkning 5 ved sterisk hindring. Derfor kan et kanditatprotein, som er muteret i dette uvirksomme område, eventuelt ikke længere binde det neutraliserende antistof, men det ville ikke desto mindre være tumornecrosefaktor med hensyn til væsentlig homologi og biologisk aktivitet.

10 Det er vigtigt at indse, at egenskaber som molekylvægt, isoelektrisk punkt og lignende for den native eller vild-type modne humane tumornecrosefaktor i fig. 10 opnået ud fra perifer-lymphocyt- eller etableret cellelinie-kulturer kun er beskrivende for de native arter 15 af tumornecrosefaktor. Tumornecrosefaktor som omfattet af den ovenstående definition vil inkludere andre arter, som ikke vil udvise alle egenskaberne hos nativ tumornecrosef aktor . Selv om tumornecrosefaktor som defineret her inkluderer nativ tumornecrosefaktor, vil andre 20 beslægtede cytotoxiske polypeptider falde inden for definitionen. F.eks. vil TNF-derivater som de ovenfor beskrevne indsætningsmutanter, deleteringsmutanter eller fusionsproteiner bringe tumornecrosefaktor uden for den molekylvægt, som er fastslået for nativ human tumorne-25 crosefaktor (fusionsproteiner med moden tumornecrose- faktor eller præTNF selv såvel som indsætningsmutanter vil have en større molekylvægt end nativ moden tumornecrosef aktor, medens deletionsmutanter af nativ moden tumor-necrosefaktor vil have en lavere molekylvægt). På lignen-30 de måde kan tumornecrosefaktor tildannes for at reducere eller eliminere modtagelighed for hydrolyse med trypsin eller andre proteaser. Endelig kan efter-translations-forarbejdning af human præTNF i cellelinier afledt fra ikke-primat-pattedyr frembringe mikroheterogenitet i 35 det aminoterminale område, således at valin ikke længere DK 171418 B1 17 vil være den aminoterminale aminosyre.

Aminosyresekvensen for human tumornecrosefaktor afledt fra dens cDNA er beskrevet i fig. 10. Moden eller nativ tumornecrosefaktor repræsenteres ved aminosyreresterne 5 1-157. Bemærk at denne sekvens inkluderer en signal sekvens på 76 rester, som antages at blive fjernet under normal forarbejdning af det translaterede transcript til dannelse af det modne protein. Trypsinhydrolyse-steder er angivet ved pile.

10 Bemærk at sprogbrugen "i stand til at udøve" cytotoxisk aktivitet eller in vivo tumornecrose betyder, at betegnelsen tumornecrosefaktor inkluderer polypeptider, som kan omdannes, f.eks. ved enzymatisk hydrolyse, fra en inaktiv tilstand analog med et zymogen til et polypeptid-15 fragment, som udøver den ønskede biologiske aktivitet.

Typisk vil inaktive forstadier være fusionsproteiner, hvori moden tumornecrosefaktor er forbundet via en peptidbinding ved dens carboxylterminus til et humant protein eller et fragment deraf. Sekvensen ved eller nær 20 ved denne peptidbinding vælges således, at den er modta gelig for proteolytisk hydrolyse til frigørelse af tumornecrosefaktor, enten in vivo eller som del af en fremstillingsforskrift in vitro. Tumornecrosefaktoren, der er dannet således, vil derpå udøve den definitionsmæssigt 25 krævede cytotoxiske aktivitet.

Selv om tumornecrosefaktor almindeligvis skal betyde human tumornecrosefaktor, er tumornecrosefaktor fra kilder som mus, svin, heste eller okser inkluderet i definitionen af tumornecrosefaktor, så længe den i øvrigt 30 opfylder de ovenfor beskrevne standarder for homologe områder og cytotoxisk aktivitet. TNF er ikke artsspecifik, f.eks. er human TNF aktiv på musetumorer. Derfor kan TNF fra én art anvendes ved terapi af en anden.

DK 171418 B1 18

Tumornecrosefaktor inkluderer også multimere former. Tumornecrosefaktor aggregerer spontant til multimere, sædvanligvis dimere eller højere multimere. Multimere er cytotoxiske og i overensstemmelse dermed egnede til 5 anvendelse ved in vivo terapi. Selv om det er ønskeligt at udtrykke og udvinde tumornecrosefaktor som en i det væsentlige homogen multimer eller monomer, kan tumorne-crosefaktor anvendes terapeutisk som en blanding af forskellige multimere.

10 Derivater af tumornecrosefaktor er inkluderet i betegnelsen tumornecrosefaktor. Derivater inkluderer aminosyre-sekvens-mutanter, glycosyleringsvarianter og kovalente eller aggregative konjugater med andre kemiske dele.

Kovalente derivater fremstilles ved tilknytning af funk-15 tionaliteter til grupper, som findes i TNF-aminosyre-side-kæderne eller ved N- eller C-termini ved hjælp af midler, som er kendte inden for faget. Disse derivater kan f.eks. inkludere: alifatiske estere eller amider af carboxyl-terminus eller rester indeholdende carboxylsidekæder, 20 f.eks. asplO; O-acyl-derivater af hydroxylgruppeholdige rester, såsom ser52, ser3, ser4 eller ser5; N-acyl-deri-vater af den aminoterminale aminosyre eller aminogruppe-holdige rester, f.eks. lysin eller arginin; og derivater af cyslOl og cys69. Acylgruppen vælges blandt alka-25 noylgrupper (herunder sådanne indeholdende (C3-c10>-n-alkyl) og aroylgrupper indeholdende carbocycliske eller heterocycliske dele. De reaktive grupper er fortrinsvis difunktionelle forbindelser, som i sig selv er kendte til anvendelse ved tværbinding af proteiner til uopløse-30 lige matricer via reaktive sidegrupper. Foretrukne deri- vatiseringscentre er blevet cystein- og histidin-rester.

kovalente eller aggregative derivater er nyttige som reagenser ved immunoprøvning eller til affinitetsrens DK 171418 B1 19 ningsprocedurer. F.eks. insolubiliseres tumornecrosefaktor ved kovalent binding til cyanbromid-aktiveret "Sepharose" ved i sig selv kendte metoder eller adsorberes til poly-alkenoverflader (med eller uden glutaraldehyd-tværbinding) 5 til anvendelse ved prøvningen eller rensningen af anti- TNF-antistoffer eller celleoverfladereceptorer. Tumornecrosefaktor mærkes også med en detekterbar gruppe, f.eks. radioioderes ved chloramin T proceduren, bindes kovalent til sjælden-jordart-chelater eller konjugeres til en 10 anden fluorescerende del til anvendelse ved diagnostiske prøvninger, især til diagnose af TNF-niveauer i biologiske prøver ved immunoprøvninger af kompetitiv type. Sådanne derivater kan falde uden for den ovenstående TNF-defini-tion, fordi det ikke er nødvendigt, at de viser cytotoxisk 15 aktivitet, kun krydsreaktivitet med anti-TNF.

Tumornecrosefaktor-derivater inkluderer de forudbestemte, dvs. stedsspecifikke, mutationer af TNF eller dens fragmenter. Formålet med mutagenese er at konstruere DNA, som koder for tumornecrosefaktor som defineret ovenfor, dvs. tumornecrosefaktor, som udviser cytotoxisk aktivitet over for tumorceller in vitro eller forårsager tumorne-20 crose in vivo, og som bevarer resterende homologi med sekvensen i fig. 10, men som også udviser forbedrede egenskaber og aktivitet. Et tumornecrosefaktorderivat defineres som et polypeptid, som i øvrigt falder inden for homologidefinitionen for tumornecrosefaktor 25 som anført i denne beskrivelse, men som har en aminosyre- sekvens, der er forskellig fra sekvensen af tumornecrosefaktor, hvad enten det skyldes deletion, udskiftning eller indsætning. F.eks. kan lysin- eller argininrester-ne i tumornecrosefaktor (arginin 2, 6, 82, 44 og 131 30 og lysin 98, 90 og 65) udskiftet med histidin eller en anden aminosyrerest, som ikke gør proteinet proteo-lytisk labilt. På lignende måde kunne cystein 101 erstattes af andre rester eller tværbindes kemisk for at tilføre oxidativ stabilitet.

DK 171418 Bl 20

Områderne i tumornecrosefaktor-molekylet inden for resterne 35 - 66 og 110 - 133 viser væsentlig homo-logi (50 %) med lymphotoxin. De hydrophobe carboxyl-termini (tumornecrosefaktorrester 150 - 157) i de to molekyler er også i det væsentlige bevaret. Da begge proteiner udviser cytotoxisk aktivitet eller 5 in vivo tumornecrose, antages disse områder at være vigtige for den fælles aktivitet af lymphotoxin og tumornecrosefaktor. Som sådanne foretrækkes resterne i disse områder til derivatisering med det formål direkte at påvirke aktiviteten af tumornecrosefaktor på en given celle. Det relativt ubevarede område 10 ved tumornecrosefaktoresterne 67 - 109 kan have den funktion at anbringe de to omgivende relativt homologe områder korrekt i en konformation, som er nødvendig for cytotoxisk aktivitet. En sådan anbringelse, som kunne opnås ved en Cys69-Cysl01-15 disulfidbinding i tumornecrosefaktor, kunne gennemføres på lignende måde af det tilsvarende område i lymphotoxin og kunne svare for forskellene i specificitet og aktivitet mellem de to molekyler.

Eftersom disse rester postuleres at repræsentere 20 den aktive kerne af tumornecrosefaktor, kan de syntetiseres kemisk eller ved deletionsmutagenese som afkortede korte polypeptider med tumornecrose-faktor-aktivitet. 1

Selv om mutationsstedet er forudbestemt, er det unødvendigt, at mutationen i sig selv er forudbestemt. F.eks.

DK 171418 B1 21 kan der for at optimere opførslen af position-131-deri-vaterne gennemføres tilfældig mutagenese ved codonen for arginin 131, og de udtrykte tumornecrosefaktormutanter sigtes for den optimale kombination af cytotoxisk 5 aktivitet og proteaseresistens. Teknikker til frembrin gelse af udskiftningsmutationer ved forudbestemte steder i DNA med en kendt sekvens er velkendte, f.eks. Ml3-pri-mer-mutagenese.

Tumornecrosefaktor-derivatisering gennemføres ved udfø-10 relse af aminosyreindsætninger, sædvanligvis af stør relsesordenen fra omkring 1 til omkring 10 aminosyre-rester, eller deletioner på fra omkring 1 til omkring 30 rester. Udskiftninger, deletioner, indsætninger eller enhver underkombination kan kombineres for at nå til 15 en endelig konstruktion. Indsætninger inkluderer amino- eller carboxylterminale fusioner, f.eks. en hydrophob forlængelse føjet til carboxylterminus. Fortrinsvis gennemføres imidlertid kun udskiftningsderivatisering.

Det er klart, at mutationerne i den kodende DNA ikke 20 må placere sekvensen ude af læseramme og fortrinsvis ikke vil skabe komplementære områder, som kunne frembringe sekundær mRNAstruktur.

Ikke alle mutationer i DNA'en, som koder for tumornecrose-faktoren, vil udtrykkes i det endelige secernerede pro-25 dukt. F.eks. er en hovedklasse af DNA-udskiftningsmuta- tioner dem, hvori en anden sekretorisk leder eller et andet signal er blevet indført i stedet for den native humane sekretoriske leder, enten ved deletioner i ledersekvensen eller ved udskiftninger, hvorved det meste 30 af eller hele den native leder er ombyttet med en leder, som mere sandsynligt vil genkendes af den påtænkte vært.

Ved konstruktion af en prokaryotisk ekspressionsvektor deleteres f.eks. den humane sekretoriske leder til fordel DK 171418 B1 22 for den bakterielle alkalisk-phosphatase-leder eller varmestabilt-enterotoxin-II-leder, og til gær udskiftes 5 lederen med gær-invertase-lederen, -&-faktor-lederen eller -sur-phosphatase-lederen. Imidlertid kan den humane sekretoriske leder genkendes af andre værter end humane cellelinier, mest sandsynligt i cellekultur af højere eukaryotiske celler. Når den sekretoriske leder "genken-10 des” af værten, spaltes fusionsproteinet bestående af tumornecrosefaktor og lederen almindeligvis ved leder-tumornecrosefaktor-peptidbindingen ved de begivenheder, som fører til sekretion af tumornecrosefaktoren. Selv om der anvendes en mutant præTNF-DNA til at transformere 15 værten og syntetisere et præTNF-derivat som mellemprodukt, er den resulterende tumornecrosefaktor således almindeligvis nativ moden tumornecrosefaktor.

En anden hovedklasse af DNA-mutanter, der ikke udtrykkes som tumornecrosefaktor-derivater, er nucleotidudskift-20 ninger foretaget for at forhøje ekspression, først og fremmest for at undgå aminoterminale løkker i den trans-criberede mRNA (se den sideløbende US patentansøgning nr. 303 687) eller for at tilvejebringe codoner, som lettere transcriberes af den valgte vært, f.eks. de 25 velkendte E. coli præferencecodoner til E. coli ekspression.

I det væsentlige homogen tumornecrosefaktor betyder tumornecrosefaktor, som er i det væsentlige fri for andre proteiner native for den kilde, hvorfra tumornecrosef aktoren blev isoleret. Dette betyder, at homogen 30 tumornecrosefaktor er i det væsentlige fri for blodplasmaproteiner, såsom albumin, fibrinogen, serinproteaser, o(-globuliner, cytotoxiske ikke-tumornecrosefaktor-poly-peptider, såsom lymphotoxin eller interferoner, eller DK 171418 B1 23 andre proteiner fra den celle eller organisme, der tjener som synteseoprindelse for tumornecrosefaktoren, herunder hele celler og partikelformede cellerester. Imidlertid kan homogen tumornecrosefaktor inkludere sådanne stoffer 5 som de nedenfor beskrevne stabilisatorer og excipienter, forudbestemte mængder af proteiner fra cellen eller organismen, der tjener som synteseoprindelse, proteiner fra andre end celler eller organismer end dem, der er kilde til tumornecrosefaktor, og syntetiske polypepti-10 der, såsom poly-L-lysin. Rekombinant tumornecrosefaktor, som udtrykkes i en allogenisk, f.eks. bakteriel, værtscelle, vil selvfølgelig udtrykkes fuldstændig fri for genkiIde-proteiner.

Tumornecrosefaktor syntetiseres fortrinsvis i kulturer 15 af rekombinante organismer. Hverken perifere blodlympho- cytter (PBL'er) eller cellelinier er ønskelige. Det er vanskeligt i praksis at opnå PLB'er af en klasse, som er frie for forurening med celler af andre klasser, f.eks. at opnå makrofager, som er frie for B- eller 20 T-celler. En sådan forurening vil gøre adskillelses proceduren for produkterne af sådanne celler mere vanskelig på grund af andre potentielle cytotoxiske faktorer og proteiner, der frigøres af de forurenende celler.

. Endvidere er tumornecrosefaktor opnået fra ikke-rekom-25 binant kultur dyr og vil bestå alene af nativ tumor necrosef aktor , hvorved sådanne kulturer mangler fleksibiliteten ved rekombinant kultur til forbedring af tumornecrosef aktors egenskaber.

DNA, som koder for tumornecrosefaktor, opnås ved kemisk 30 syntese, ved screening af reverse transcripter af mRNA

fra PBL- eller celleliniekulturer eller ved screening af genomiske biblioteker fra enhver celle. Egnede cellelinie-kulturer omfatter monocytiske cellelinier, såsom DK 171418 B1 24 promyelocytiske cellelinier betegnet "HL-60" inden for faget (hvoraf én er tilgængelig fra ATCC som CCL 240) eller den histiocytiske lyraphoma-cellelinie U 937 (ATCC CRL 1593). Disse og andre cellelinier induceres til 5 at udtrykke og secernere tumornecrosefaktor ved udsættelse af cellerne for kemiske eller fysiske midler, der er kendte inden for faget, almindeligvis tumorigene eller mitogene midler. Tumornecrosefaktor kan i visse monocytiske cellelinier kun induceres effektivt med 10 PMA; i øvrigt konventionelle midler, såsom lipopolysac- charid, staphylococ-enterotoxin B eller thymosin 1-1, var ikke så effektive som PMA til inducering af tumornecrosefaktor i disse cellelinier. Da der kræves en variabel mængde screening for at lokalisere en cellelinie, 15 som udtrykker tumornecrosefaktor (og derfor indeholder den ønskede mRNA), kan det være mere effektivt simpelthen at syntetisere genet. Syntese er fordelagtig, fordi der kan indføres unikke restriktionssteder (hvorved man letter anvendelsen af genet i vektorer indeholdende 20 restriktionssteder, som ellers er til stede i den native sekvens), og der kan tages skridt til at forhøje translationseffektiviteten, som omtalt nedenfor.

Denne DNA mærkes kovalent med et detekterbart stof, såsom en fluorescerende gruppe, et radioaktivt atom 25 eller en kemiluminescerende gruppe, ved i sig selv kendte metoder. Den anvendes derpå ved konventionelle hybridi-seringsprøvninger. Sådanne prøvninger anvendes til identifikation af TNF-vektorer og -transformanter som beskrevet i de efterfølgende eksempler, eller til in vitro diagno-30 se, såsom detektion af TNF-mRNA i blodceller.

mRNA'en for TNF er, overraskende nok, relativt sjælden selv i inducerede HL-60-celler, måske på grund af ustabilitet i mRNA'en af ukendte årsager. Endvidere er tids- DK 171418 B1 25 forløbet af forekomsten af TNF-mRNA efter celleinduktion vigtig. TNF-mRNA viser sig kun i cellerne i et kort tidsrum ved omkring 4 timer efter induktion. I denne henseende er dens forekomst forskellig fra forekomsten 5 af lymphotoxin-mRNA, der viser sig ved omkring 12 timer efter induktion. Dette gør cDNA'en let at overse, hvis man ikke er klar over, hvad man skal se efter. Når først dens tilstedeværelse er erkendt, og fuldstændigt komplementær DNA er gjort tilgængelig, som det muliggøres 10 ved det i denne beskrivelse anførte, er det rutine at screene cDNA-biblioteker af inducerede HL-60-celler eller PBL'er for tumornecrosefaktor-cDNA under anvendelse af sonder med sekvenser af sådan DNA. De to HL-60-fag-bib-lioteker, som screenes i eksemplerne, indeholder et 15 relativt vedvarende antal positive plakker, så det er klart, at rutine-hybridiseringsprøvninger vil identificere fag indeholdende den ønskede cDNA.

Tumornecrosefaktor-syntetiserende celler af en HL-60-cel-lelinie dyrkes først på konventionel måde, indtil den 5 20 når en tæthed på omkring 8 - 12 x 10 celler/ml. Celler ne fjernes fra kulturen, vaskes, overføres til serumfrit medium og dyrkes i medium indeholdende PMA. Kulturen fortsættes derpå, indtil den ønskede koncentration af tumornecrosefaktor er akkumuleret i dyrkningsmediet, 25 almindeligvis omkring 400 tumornecrosefaktor-enheder/ml.

Derefter klares dyrkningssupernatanten fortrinsvis ved centrifugering eller et andet middel til adskillelse af cellerester fra de opløselige komponenter. Centrifugering bør udføres med lav hastighed, således at der 30 kun fjernes suspenderede partikler. Supernatanten renses derpå som beskrevet nedenfor.

Alternativt og fortrinsvis syntetiseres tumornecrosefaktor i værtsceller transformeret med vektorer indehol- DK 171418 B1 26 dende DNA, som koder for tumornecrosefaktor. En vektor er en replikerbar DNA-konstruktion. Vektorer anvendes her til at forstærke DNA, som koder for tumornecrose-faktor, og/eller til at udtrykke DNA, som koder for 5 tumornecrosefaktor. En ekspressionsvektor er en repliker bar DNA-konstruktion, hvori en DNA-sekvens, som koder for tumornecrosefaktor, er operabelt forbundet med egnede styresekvenser, som er i stand til at frembringe ekspression af tumornecrosefaktor i en egnet vært. Sådanne 10 styresekvenser inkluderer en transcriptionspromotor, en eventuel operatorsekvens til at styre transcription, en sekvens, som koder for egnede mRNA-ribosombindings-steder, og sekvenser, som styrer afslutningen af transcription og translation.

15 Vektorer omfatter plasmider, virus (herunder fager) og integrerbare DNA-fragmenter (dvs. integrerbare i værtsgenomet ved rekombination). Når først den har transformeret en egnet vært, repliceres og fungerer vektoren uafhængigt af værtsgenomet eller kan i nogle tilfælde 20 integreres i genomet selv. I denne beskrivelse er "vek tor" et overbegreb til "plasmid", men plasmider er den mest almindeligt anvendte form af vektor for tiden.

Imidlertid er alle andre former for vektorer, som tjener en ækvivalent funktion, og som er eller bliver kendte 25 inden for faget, egnede til anvendelse i forbindelse med opfindelsen. Egnede vektorer vil indeholde replicon-og styresekvenser, som er afledt fra arter, der er forenelige med den påtænkte ekspressionsvært. Transformerede værtsceller er celler, som er blevet transformeret eller 30 transficeret med tumornecrosefaktor-vektorer konstrue ret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik. Transformerede værtsceller udtrykker almindeligvis tumornecrose-faktor. Den udtrykte tumornecrosefaktor vil aflejres DK 171418 Bl 27 intracellulært eller secerneres til enten det periplas-miske rum eller kultursupernatanten, afhængigt af den valgte værtscelle.

DNA-områder er operabelt forbundet, når de har et funk-5 tionelt forhold til hinanden. F.eks. er DNA for en præ sekvens eller sekretorisk leder operabelt forbundet med DNA for et polypeptid, hvis den udtrykkes som et præprotein, som deltager i sekretionen af polypeptidet; en promotor er operabelt forbundet med en kodesekvens, 10 hvis den styrer transcriptionen af sekvensen; eller et ribosombindingssted er operabelt forbundet med en kodesekvens, hvis det er anbragt således, at det muliggør translation. Almindeligvis betyder operabelt forbundet sammenhængende ud i et og, i tilfælde af sekretoriske 15 ledere, sammenhængende og i læsefase.

Egnede værtsceller er prokaryoter, gær eller højere eukaryotiske celler. Prokaryoter inkluderer Gram-negative eller Gram-positive organismer, f.eks. E. coli eller Bacilli. Højere eukaryotiske celler inkluderer 20 etablerede cellelinier af pattedyroprindelse som beskre vet nedenfor. En foretrukken værtscelle er den fag-resistente stamme E. coli W3110 (ATCC 27 325), som er beskrevet i eksemplerne, selv om andre prokaryoter, såsom E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. coli 294 25 (ATCC 31 446), Pseudomonas-arter eller Serratia marces- cens, er egnede.

Prokaryotiske vært-vektor-systemer foretrækkes til udtrykkeisen af tumornecrosefaktor. Selv om tumornecrosefaktor-molekylet indeholder to cysteinrester, hvilket inde-30 bærer et moderat potentielt krav om efter-translations-forarbejdning til dannelse af en potentiel disulfidbin-ding, udtrykker f.eks. E. coli biologisk aktiv tumornecrosef aktor . Masser af egnede mikrobielle vektorer DK 171418 B1 28 er til rådighed. Almindeligvis vil en mikrobiel vektor indeholde et repliceringsorigin, som genkendes af den påtænkte vært, en promotor, som vil fungere i værten, og et fænotypisk selektionsgen, f.eks. et gen, som koder 5 for proteiner, der overfører antibiotisk resistens eller leverer et auxotropht krav. Lignende konstruktioner vil blive fremstillet til andre værter. E. coli transformeres typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli art (Bolivar et al., 1977, "Gene” 10 2: 95). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetra- cyclin-resistens og tilvejebringer således lette midler til identificering af transformerede celler.

Vektorer må indeholde en promotor, som genkendes af værtsorganismen. Denne er almindeligvis en promotor, 15 som er homolog for den påtænkte vært. Promotorer, som mest almindeligt anvendes ved rekombinant-DNA-konstruk-tion, inkluderer 8-lactamase-(penicillinase-) og lactose-promotorsystemerne (Chang et al., 1978, "Nature", 275; 615; og Goeddel et al., 1979, "Nature" 281; 544), et 20 tryptophan-(trp) promotorsystem (Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." (3: 4057 og EP offentliggørelsesskrift nr. 36 776) og tac-promotoren [H. De Boer et al., "Proc. Nat'1. Acad. Sci. U.S.A." 80: 21 - 25 (1983)]. Selv om disse er de mest anvendeligt anvendte, er andre 25 kendte mikrobielle promotorer egnede. Detaljer vedrøren de deres nucleotidsekvenser er blevet publiceret, hvilket gør det muligt for en fagmand operabelt at ligere dem til DNA, som koder for tumornecrosefaktor, i plasmid-vektorer (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 2J): 269) og 30 DNA'en, som koder for tumornecrosefaktor. For tiden er den foretrukne vektor et pBR322-derivat indeholdende alkalisk-phosphatase-promotoren fra E. coli med trp-Shi-ne-Dalgarno-sekvensen. Promotoren og Shine-Dalgarno-se-kvensen er operabelt forbundet med DNA'en, som koder 35 for TNF, dvs. de er anbragt således, at de promoterer DK 171418 Bl 29 transcription af TNF-mRNA fra DNA’en.

Foruden prokaryoter transformeres eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer, med tumornecrosefaktorkodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae, eller almin-5 delig bagegær, er den mest almindeligt anvendte blandt lavere eukaryotiske værtsmikroorganismer, selv om et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige. Gærvektorer vil almindeligvis indeholde et repliceringsori-gin fra 2 ^um-gær-plasmidet eller en autonomt replicerende 10 sekvens (ARS), en promotor, TNF-genet, sekvenser for polyadenylering og transcriptionsafslutning og et selektionsgen. Et egnet plasmid til tumornecrosefaktor-udtryk-kelse i gær er YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, "Nature", 282: 39; Kingsman et al., 1979, "Gene", 2: 141; Tschem-15 per et al., 1980, "Gene", 1£: 157). Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, som mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics", 85: 12). Tilstedeværel-20 sen af trpl-læsionen i gærværtscellegenomet tilvejebrin ger derpå et effektivt miljø til detektering af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

Egnede promoterende sekvenser i gærvektorer inkluderer promotorerne for metallothionein, 3-phosphoglyceratki-25 nase (Hitzeman et al., 1.980, "J. Biol. Chem.”, 255: 2073) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., 1968, "J. Adv. Enzyme Reg.", 7_: 149; og Holland et al., 1978, "Biochemistry", Γ7: 4900), såsom enolase, glycer-aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvat-30 decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphat- isomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, trio-sephosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og gluco-kinase. Egnede vektorer og promotorer til anvendelse ved gærudtrykkelse er yderligere beskrevet i EP offent- DK 171418 B1 30 liggørelsesskrift nr. 73 657.

Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transcriptionen styres af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, 5 sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitro genmetabolismen, og de førnævnte metallothionein og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, såvel som enzymer, der er ansvarlige for maltose- og galactose-udnyttel-se. Ved konstruktion af egnede ekspressionsplasmider 10 ligeres afslutningssekvenserne forbundet med disse gener også ind i ekspressionsvektoren 3' for tumornecrosefaktorkodesekvenserne for at give polyadenylering af mRNA'en og afslutning.

Foruden mikroorganismer kan kulturer af celler afledt 15 fra flercellede organismer også anvendes som værter.

Dette foretrækkes imidlertid ikke, fordi der indtil videre er opnået udmærkede resultater med TNF-udtrykkende mikroorganismer. I princippet er enhver højere eukaryo-tisk cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirvel-20 dyr eller ikke-hvirveldyr. Imidlertid har interessen været størst med hensyn til hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de seneste år [Tissue Culture,

Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)].

25 Eksempler på nyttige værtscellelinier er VERO- og HeLa- celler, kinesisk-hamster-ovarie-(CHO) cellelinier og WI38-, BHK-, COS-7- og MDCK-cellelinier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et replikationsorigin, en promotor lo-30 kaliseret oven for genet, som skal udtrykkes, sammen med et ribosombindingssted, RNA-splejsningssted (hvis der anvendes intronholdig genomisk DNA), et polyadeny-leringssted og en transcriptionsafslutningssekvens.

DK 171418 B1 31

Transcriptions- og translations-styresekvenserne i ekspressionsvektorer, der skal anvendes ved transformation af hvirveldyrceller, tilvejebringes ofte fra virale kilder. F.eks. afledes almindeligt anvendte promotorer 5 fra polyoma, Adenovirus 2 og, mest fordelagtigt, abevirus 40 (SV40). De tidlige og sene promotorer er særlig anvendelige, fordi begge opnås let fra viruset som et fragment, der også indeholder det virale replikationsorigin fra SV40 (Fiers et al., 1978, "Nature", 273: 113). Mindre 10 eller større SV4O-fragmenter kan også anvendes, forudsat at den sekvens på omkring 250 bp, som strækker sig fra Hindlll-stedet hen imod Bgll-stedet lokaliseret i det virale replikationsorigin, er inkluderet. Yderligere er det også muligt, og ofte ønskeligt, at udnytte humane 15 genomiske promotor-, styre- og/eller signal-sekvenser, som normalt er forbundet med tumornecrosefaktor, forudsat at sådanne styresekvenser er forenelige med værtscel lesystemerne.

Et replikationsorigin kan tilvejebringes enten ved kon-20 struktion af vektoren, så den inkluderer et exogent origin, som det f.eks. kan afledes fra SV40 eller anden viral (f.eks. Polyoma, Adenovirus, VSV eller BPV) kilde eller kan tilvejebringes af værtscellens kromosomale replikationsmekanisme. Hvis vektoren integreres i værts-25 cellekromosomet, er det sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.

Ved udvælgelse af en foretrukken værtspattedyrcelle til transfektion med vektorer, som omfatter DNA-sekven-ser, der koder for både tumornecrosefaktor og dihydrofo-30 latreductase (DHFR), er det passende at vælge værten efter den anvendte type DHFR-protein. Hvis der anvendes vild-type-DHFR-protein, må det foretrækkes at vælge en værtscelle, som er deficient med hensyn til DHFR, hvilket muliggør anvendelsen af DHFR-kodesekvensen som DK 171418 B1 32 markør for heldig transfektion i selektivt medium, som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En passende værtscelle i dette tilfælde er den med hensyn til DHFR-aktivitet deficiente kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-cel-5 lelinie, der fremstilles og formeres som beskrevet af

Urlaub and Chasin, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci." (USA) 77: 4216.

Hvis der på den anden side anvendes DNA, som koder for DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for methotrexat 10 (MTX), som styresekvens, er det ikke nødvendigt at anvende DHFR-resistente celler. Da DHFR-mutanten er resistent over for MTX, kan MTX-holdige medier anvendes som middel til selektion, forudsat at værtscellerne i sig selv er MTX-følsomme. De fleste eukaryotiske celler, som 15 er i stand til at absorbere MTX, viser sig at være me- * thotrexat-følsomme. En sådan nyttig cellelinie er en CHO-linie, CHO-K1 (ATCC nr. CCL 61).

Tumornecrosefaktor udvindes først fra kulturer. Transformerede ikke-secernerende celler lyseres ved ultralyd 20 eller anden acceptabel metode, og rester skilles fra ved centrifugering, medens supernatanterne fra secernerende celler (såsom inducerede cellelinier) simpelthen adskilles fra cellerne ved centrifugering. Derpå kan der anvendes et eller flere af de følgende trin, 25 eller der kan anvendes helt andre metoder. Den følgende metode blev anvendt til at rense tumornecrosefaktor til en grad, som var tilstrækkelig til sekvensbestemmelse. Dette er ikke nødvendigvis af samme udstrækning som den rensning, der kræves for et terapeutisk produkt. 1

Som et første rensningstrin adsorberes tumornecrosefak tor på et hydrofobt stof fra den lyserede kultur eller kultursupernatanten. Det hydrofobe stof er fortrinsvis DK 171418 B1 33 et ikke-gelatinøst hydrofobt stof, såsom et silicat eller en polyalken, selv om alkyl-"Sepharose"® også er egnet. Den foretrukne udførelsesform er glas med kontrolleret porestørrelse. Et forhold på omkring 1 5 volumen glas med kontrolleret porestørrelse blandes med 50 volumener supernatant, og adsorptionen får lov at foregå ved omkring 4 °C uden omrøring i løbet af fra omkring 30 minutter til omkring 2 timer, fortrinsvis omkring 1 time, under svagt alkaliske betingelser.

10 Adsorbenset bør almindeligvis derefter vaskes med en egnet puffer for at fjerne indfangede forurenende proteiner.

Den adsorberede tumornecrosefaktor elueres fra det hydrofobe stof ved ændring af det omgivende mediums solva-15 tiseringsegenskaber. Elueringen kan gennemføres med en opløsning pufret ved omkring pH 7 - 8,5, fortrinsvis omkring 8, indeholdende 1 M salt og en effektiv mængde af en vandig opløsning af en med vand blandbar organisk polyol, såsom ethylenglycol eller glycerol, almindeligvis 20 ethylenglycol i området 10 - 30 volumen-%, fortrinsvis omkring 20 volumen-%. Selvfølgelig vil de optimale betingelser afhænge af den polyol, som anvendes. De tumor-necrosefaktor-holdige elueringsfraktioner detekteres ved in vitro prøvning som beskrevet nedenfor eller ved 25 anden egnet prøvning. Rensningen og udbyttet af dette trin fra monocytisk cellekultur såvel som efterfølgende trin er vist nedenfor i tabel I.

Yderligere rensning opnås ved adsorption af tumornecrose-faktor på en tertiær- eller kvaternær-amino-anionbytter-30 harpiks. De foretrukne harpikser til dette formål er hydrofil-matrix-harpikser, såsom tværbundet polystyren, dextran eller cellulose substitueret med tertiære eller kvaternære alkylaminogrupper. Kommercielle produkter af denne type kan fås som DEAE-cellulose, QAE-"Sephadex"^ DK 171418 B1 34 eller under handelsnavnet "Mono Q" (hvor alkylsubsti-tuenten er ethyl i hvert af disse produkter). De bedste resultater opnås med det hurtige protein-væskechroma-tografi-system beskrevet af J. Richey, October 1982, 5 "American Laboratory" under anvendelse af de makroporø- se i det væsentlige ensartede partikler ifølge Ugelstad et al., 1983, "Nature" 303; 95 - 96. Dette system har muliggjort rensningen af tumornecrosefaktor til et højt niveau.

10 Rensning til væsentlig homogenitet opnås kun efter yderligere adskillelse på SDS-PAG-elektroforese eller C4-re-vers-fase højtryksvæskechromatografi (HPLC) som beskrevet i de efterfølgende eksempler. Dette produkt er imidlertid ikke ønskeligt til terapi, fordi det har mistet 15 væsentlig aktivitet efter udsættelse for SDS eller orga nisk opløsningsmiddel for HPLC. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved den metode, der er beskrevet af M.

Bradford, 1976, "Anal. Biochem." 72^:248 - 254. Under de afsluttede stadier af rensningen blev proteinkoncen-20 trationen bedømt ved aminosyresammensætning og også ved aminosyresekvens.

Tumornecrosefaktor fremstilles til indgivelse ved blanding af tumornecrosefaktor med den ønskede renhedsgrad med fysiologisk acceptable bærere, dvs. bærere, som 25 er ikke-toxiske for modtagerne i de anvendte doserin ger og koncentrationer. Almindeligvis vil dette indebære, at tumornecrosefaktoren kombineres med puffere, anti-oxidanter, såsom ascorbinsyre, polypeptider med lav molekylvægt (mindre end ca. 10 rester), proteiner, amino-30 syrer, carbonhydrater, herunder glucose eller dextriner, chelateringsmidler, såsom EDTA, og andre stabilisatorer og excipienter. Bæreren bør sammensættes til at stabilisere tumornecrosefaktoren som dimer og/eller, fortrinsvis, trimer. Dette gennemføres ved undgåelse af salte eller DK 171418 B1 35 *

I LP* Γ~~ SO <—I

C - CJI I CO Cs| CD Os c ^ r-' so <j <—i Ό H 6¾ 3 "O — E « Σ1 i < r-~ o cd r-~ o 0)01 i—I <J 03 O) 2 c C —I Csl K\ (0 “ fl) -η csj ks tn

Si £

«= - 'S

c £

i? Ό * 4J

·" -*-> ''s O SO SO so so (U

Ό OC 0) oi r-i o O O O 4-1

“ > Ή 4-1 E *—C *—I i—C i—I -*-C

—· ·ΗΙ<-·Η\ X > 'T* x x x x <u cc om r r- jj u —i <u j-> c o csi oo ao o

I 0) CLOC 0) O i—I Os so I— CO

° ce cn ω— - - , 'f O O O irs so u 1 Os o - ^ 2 * - tu -X VO Q)

^ 0) 4-1 so SO so SO O CD

1-1 -HCDO O O O —t O

. ” Η Η H U

O >s*r| ^ X f 1

» ί x S

4J 4J C Csl ι-H Os Os r— u

*·- >>^ (D - - - Q

0) cj co — <r rH ao so csj e S = C-, ^

S

C _ CO CO

~ C lA <J Csl „ -h os o <i O 0)

0 * I 0) ---- CD

t cd j-ι <r co os a o .-h , 4-i o cn so oo o) O C-I E os qi · c ·— — —< 01^4 CO « o

1 ω S

J- -O CL

m S O

- ^ f_, *E O ΟιΑιΑνΟ if) CL· ® * 3^ O CO 00 I-*-

O 1 1 * 1 O OCsl > CD

? 1-1 ° ε oo -h i—i o C o) > w irs ω

c 1 Ό C

C- · *-« ti (—

m I C Oi= O

" --C 0) -H D ·Η O C2T 0) C— Ci— !*- 4 11) li- H' 1) 4J cn co "

CO Ό Cl) H CO H 4-1 CO O CD 4J

I (4 (0 ti 0) (4 CU O E C > ti | g) l cd o) cd e dj tj cn o ti o o *—1 o cd cj ti cd CJ! Ir-ι O H (4 Ol a t Σ 4-1 I Ci_ t, ti _J 0) —i C CDC0 4-1 CD ·—IS 4—1 LlJ JZ - CO O O 0) CD Q_ CJIi—1 •H Ol'H (0 CO O 41 CO C CJI CJ L< < ti i—i > x -H0) c Cti E 1—I Li CD ELU *i-C CD oco D CL 4J h 0} I ti cd c co ω o CJ14J ω o ο ω 4i jc a a i jc ¢) ti ¢) ti cn

c -1-1 CJ14J ti C ti ti CD tiCO flj CD GI ICD OO

(Dti -oco .c «co oo i·® o oftj-H ti o h <rco ^ in az -*-> 3 E cj o.J* cl c_) o.·—i Dl > u- CL· in ω cj l- * DK 171418 B1 36 detergenser i koncentrationer, som dissocierer tumorne-crosefaktor til monomere. Alternativt bør betingelser, som aggregerer tumornecrosefaktor til højere multimere, undgås. Almindeligvis anvendes et ikke-ionisk overfla-5 deaktivt middel, såsom "Tween 20" for at undgå overdreven aggregation under rensning såvel som lyofilisering eller vandig opbevaring. Tumornecrosefaktor, som skal anvendes til terapeutisk indgivelse, må være steril. Dette gennemføres let ved filtrering igennem sterilfiltrerings-10 membraner. Tumornecrosefaktor vil almindeligvis blive opbevaret i lyofiliseret form.

Tumornecrosefaktor kombineres eventuelt med andre anti-neoplastiske midler, såsom kemoterapeutiske antibiotica (actinomycin-D, adriamycin, aclacinomycin A), eller 15 med midler til at forhøje eller stimulere immunreak tionen, f.eks. immunoglobuliner, såsom ^-globulin, herunder immunoglobuliner med affinitet for neoplasmernes celleoverfladeantigener. Desuden kombineres α-, β- eller ^-interferon ønskeligt med tumornecrosefaktor-præparater 20 eller tumornecrosefaktor- og lymphotoxin-holdige præpa rater, eftersom interferoner virker synergistisk med tumornecrosefaktor ved cellelyseprøvninger. En typisk sammensætning omfatter tumornecrosefaktor og ^-interferon i et enhedsaktivitetsforhold på fra omkring 0,1:1 til 25 omkring 200:1, almindeligvis 10:1, og kan indeholde lymphotoxin i stedet for en andel af tumornecrosefaktoren. Disse mængdeforhold kan selvfølgelig underkastes modifikationer efter terapeutisk erfaring.

Tumornecrosefaktor-præparater indgives tumorbærende 25 dyr. Indgivelsesvejen er i overensstemmelse med kendte metoder, f.eks. intravenøs, intraperitoneal, intramuscu-lær, intralæsional infusion eller injektion af sterile tumornecrosefaktor-opløsninger eller ved hjælp af tidsindstillede afgivelsessystemer som anført nedenfor.

DK 171418 B1 37

Tumornecrosefaktor indgives intralæsionalt, dvs. ved direkte injektion i faste tumorer. I tilfælde af disseminerede tumorer, såsom leukæmia, sker indgivelsen fortrinsvis intravenøst eller i det lymphatiske system.

5 Tumorer i maveorganer, såsom ovariecancer, behandles med fordel ved intraperitoneal infusion under anvendelse af peritoneal-dialyse-udstyr og peritoneal-kompatible opløsninger. Almindeligvis indgives tumornecrosefaktor imidlertid kontinuert ved infusion, selv om bolusinjektion 10 er acceptabel.

Tumornecrosefaktor indgives ønskeligt fra en implanterbar tidsbestemt-afgivelses-genstand. Eksempler på egnede systemer for proteiner med molekylvægt som tumornecrose-faktor-dimere eller -trimere inkluderer copolymere af 15 L-glutaminsyre og -ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22_ (1 ): 547 - 556), poly-(2-hydroxy-ethyl-methacrylat) (R. Langer et al., 1981, "J. Biomed.

Mater. Res. "1_5: 167 - 277 og R. Langer, 1982, "Chem.

Tech." 1^2: 98 - 105) eller ethylenvinylacetat (R Langer 20 et al., Id.). Denne genstand implanteres ved kirurgiske steder, hvorfra tumorer er blevet udskåret. Alternativt indkapsles tumornecrosefaktor i semipermeable mikrokaps-ler eller liposomer til injektion i tumoren. Denne indgivelsesmåde er særlig nyttig for tumorer, som ikke 25 kan udskæres kirurgisk, f.eks. hjernetumorer.

Mængden af tumornecrosefaktor, som indgives, vil f.eks. afhænge af indgivelsesvejen, den pågældende tumor og patientens tilstand. Intralæsionale injektioner vil kræve mindre tumornecrosefaktor beregnet på legemsvægt 30 end intravenøs infusion, medens nogle tumortyper, f.eks.

faste tumorer, viser sig at være mere resistente over for tumornecrosefaktor end andre, f.eks. leukæmiske.

I overensstemmelse hermed vil det være nødvendigt for behandleren at indstille doseringen og modificere ind- DK 171418 B1 38 givelsesvejen efter, hvad der kræves til at opnå optimal cytotoxisk aktivitet over for måltumoren, som det kan bestemmes f.eks. ved biopsi af tumoren eller diagnostiske prøvninger for formodede cancermarkører, såsom carcino-5 embryonisk antigen, i betragtning af mulig rekombinant toxicitet, som mødes ved forhøjet dosering. Almindeligvis har tumornecrosefaktor-doseringer hos mus på op til ca. 120 yug/kg legemsvægt/dag ved intravenøs indgivelse vist sig at være i det væsentlige ikke-toxiske 10 og effektive in vivo.

Tumornecrosefaktor antages ikke at være artsspecifik med hensyn til dens cytotoxiske aktivitet, således at anden tumornecrosefaktor end den humane, f.eks. fra okse- eller svine-kilder, kan anvendes til terapi af 15 humane tumorer. Imidlertid ønskes det at anvende tumor necrosefaktor fra den art, som behandles, for at undgå den mulige frembringelse af autoantistoffer.

For at simplificere eksemplerne vil der blive henvist til visse hyppigt forekommende metoder ved kortbenæv- ; 20 neiser.

Plasmider betegnes ved et lille p med store bogstaver og/eller tal foran eller bagved. De heri omhandlede udgangsplasmider er kommercielt tilgængelige, er offentlig tilgængelige på uindskrænket basis eller kan konstru-25 eres ud fra sådanne tilgængelige plasmider i overensstem melse med publicerede procedurer. Desuden kendes andre ækvivalente plasmider inden for faget og vil være indlysende for den almindelige fagmand.

"Nedbrydning" af DNA henfører til katalytisk spaltning 30 af DNA'en med et enzym, som kun virker ved visse steder i DNA'en. Sådanne enzymer kaldes restriktionsenzymer, og de steder, for hvilke hvert enzym er specifikt, kaldes DK 171418 B1 39 et restriktionssted. "Delvis" nedbrydning henfører til ufuldstændig nedbrydning med et restriktionsenzym, dvs. der vælges betingelser, som resulterer i spaltning af nogle, men ikke alle stederne for en given restriktions-5 endonuclease i et DNA-substrat. De forskellige heri anvendte restriktionsenzymer er kommercielt tilgængelige, og der blev anvendt de reaktionsbetingelser, cofaktorer og andre krav, som var fastslået af enzymleverandøren. Restriktionsenzymer betegnes almindeligvis ved forkor-10 teiser sammensat af et stort bogstav efterfulgt af andre bogstaver og derpå almindeligvis et tal, som repræsenterer den mikroorganisme, hvorfra hvert restriktionsenzym oprindeligt blev opnået. I almindelighed anvendes omkring 1 yug plasmid eller DNA-fragment med omkring 1 enhed 15 enzym i omkring 20 ^ul pufferopløsning. Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret af producenten. Der anvendes almindeligvis inkubationstider på omkring 1 time ved 37 °C, men de kan variere i overensstemmelse med leverandørens in-20 struktioner. Efter inkubation fjernes protein ved eks traktion med phenol og chloroform, og den nedbrudte nucleinsyre udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol. Nedbrydning med et restriktionsenzym efterfølges i få tilfælde af hydrolyse af de terminale 25 5'-phosphater med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre de to restriktionsspaltede ender af et DNA-fragment i at "cirkularisere" eller danne en lukket løkke, som ville forhindre indsætning af et andet DNA-fragment ved restriktionsstedet. Med mindre andet er 30 anført, efterfølges nedbrydning af plasmider ikke af 5’-terminal dephosphorylering. Procedurer og reagenser til dephosphorylering er konventionelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, side 133 - 134).

"Udvinding" eller "isolering" af et givet fragment af 35 DNA fra en restriktionsnedbrydning betyder fraskillelse DK 171418 B1 40 af det nedbrudte materiale ved polyacrylamid-gel-elektro-forese, identificering af fragmentet af interesse ved sammenligning af dets mobilitet med mobiliteten af markør-DNA-fragmenter med kendt molekylvægt, udtagning af det 5 gelsnit, som indeholder det ønskede fragment, og adskil lelse af gelen fra DNA. Denne procedure er alment kendt; se f.eks. R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 6103 - 6114, og D. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057.

10 "Southern-analyse" er en metode, hvorved tilstedeværelsen af DNA-sekvenser i en nedbrudt eller DNA-holdig blanding bekræftes ved hybridisering til et kendt mærket oligo-nucleotid eller DNA-fragment. Til de heri omhandlede formål skal Southern-analyse, med mindre andet er anført, 15 betyde adskillelse af nedbrydninger på 1 % agarose, denaturering og overførsel til nitrocellulose ved den metode, der er beskrevet af E. Southern, 1975, "J. Mol.

Biol." 98^: 503 - 517, og hybridisering som beskrevet af T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15: 687 - 701.

20 "Transformation" betyder indførelse af DNA i en organis me, således at DNA'en er replikerbar, enten som et eks-trakromosomalt element eller som en kromosomal integrant. Med mindre andet er angivet, er den fremgangsmåde, som anvendes i denne beskrivelse til transformation 25 af E. coli CaC^-metoden som beskrevet af Mandel et al., 1970, "J. Mol. Biol." 53: 154.

"Ligering" henfører til en fremgangsmåde til dannelse af phosphodiesterbindinger mellem to dobbeltstr.engede nucleinsyrefragmenter (T. Maniatis et al., Id., side 30 146). Med mindre andet er angivet kan ligering gennemfø res under anvendelse af kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 ^ug af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de DNA-fragmen- DK 171418 B1 41 ter, som skal ligeres.

5 "Præparation" af DNA fra transformanter betyder isole ring af plasmid-DNA fra mikrobiel kultur. Med mindre andet er angivet, kan alkali/SDS-metoden beskrevet af Maniatis et al., Id. side 90, anvendes.

"Oligonucleotider" er korte enkelt- eller dobbeltstrengede polydeoxynucleotider som er syntetiseret kemisk ved 10 kendte metoder og derpå renset på polyacrylamidgeler.

EKSEMPEL 1

Prøvninger

Den specifikke aktivitet af tumornecrosefaktor blev bestemt ved en tidligere beskrevet modificeret celle-15 lyseprøvning (B. Spofford, 1974, "J. Immun." 112: 2111).

L-929 musefibroblastceller (ATCC CCL-929) blev dyrket i 96 hullers fladbundede bakker (3040; Falcon Plastics, Oxnard, CA, U.S.A.) ved 30000 celler (volumen 0,1 ml) pr. hul i nærvær af 1 ^ug/ml actinomycin D og en rækkefor-20 tyndet prøve (0,125 ml). Cellerne blev inkuberet i en befugtet atmosfære ved 37 °C med 5 % C02. Prøven blev udtaget efter 18 timer, pladerne blev vasket, og cellelyse blev detekteret ved farvning af pladerne med 0,5 % opløsning af krystalviolet i methanol/vand (volumenforhold 25 1:4). Endepunktet på mikrotiterpladerne blev bestemt med en "MicroELISA autoreader (Dynatech)" indstillet til absorption ved 450 nm og transmission ved 570 nm. Cellerne, som var udsat for dyrkningsmedium alene, blev sat til 0 % lyse, og de, der var udsat for 3 M guanidin-30 hydrochlorid-opløsning gav et slutpunkt for 100 % lyse.

DK 171418 B1 42 *

En enhed af tumornecrosefaktor defineres som den mængde tumornecrosefaktor (prøvet i volumenet på 0,125 ml), som krævedes til 50 % cellelyse.

Tumornecrosefaktor blev også prøvet ved en in vivo tumor-5 necrose-prøvning. Kort fortalt blev denne prøvning udført ved dyrkning af Meth A Sarcoma celler (5 x 10^ celle) i CB6F hunmus (BALB/c x C57BL/6)F1 i 7 - 10 dage og efterfølgende intratumoral injektion med en prøve af tumornecrosefaktor. Efter 24 timer blev musene aflivet 10 ved brud på nakken, tumorerne blev udtaget, og necrosen blev bedømt histologisk som tidligere beskrevet i E.

Carswell et al., 1975, "Proc. Nat. Acad. Sci." 72/.3666 -3670.

EKSEMPEL 2 15 Anvendelse af PBL'er eller en monocytisk cellelinie til at syntetisere tumornecrosefaktor_

En human promyelocytisk HL-60-cellelinie-podekultur med en celletæthed på 1 x 10D celler/ml blev dyrket 2 i 2 liters rulleflasker (890 cm ) under anvendelse af 20 500 ml RPMI 1640 medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, U.S.A.) indeholdende 10 mM HEPES, 0,05 mM β-mercep-toethanol, 100 enh./ml penicillin, 100 ^ug/ml streptomycin og 10 % fetalt kalveserum. Efter 3 dage ved 37 °C, efter at kulturen havde nået en celletæthed på 8 -25 12 x 10^ celler/ml, blev cellerne høstet ved centri fugering ved 1000 G i 10 minutter, vasket to gange med serumfrit RPMI 1640 medium og overført til det samme medium som beskrevet ovenfor uden serum ved en celle-tæthed på 15 - 20 x 10 celler/ml. Cellerne blev dyrket 30 i 2 liters rulleflasker i nærvær af 10 ng/ml PMA. Efter 16-24 timer blev cellerne fjernet ved filtrering igennem et 3 um "Sealkleen"-filter (Pall Trinity Micro Corp.

DK 171418 B1 43

Cortland, NY, U.S.A.). Det klare filtrat blev prøvet for tumornecrosefaktor-aktivitet og anvendt til efterfølgende rensning og karakterisering. Denne procedure producerede omkring 400 enheder tumornecrosefaktor-en-5 heder/ml dyrkningsmediumsupernatant.

Humane perifere blodmonocyter blev også anvendt til produktion af tumornecrosefaktor. Blodpladepherese-rester blev skaffet fra Amerikansk Røde Kors, Boston, MA, U.S.A. og anvendt inden for 24 timer fra opsamlingen. Den indle-10 dende adskillelse af monocyter fra erythrocyter blev opnået ved centrifugering på Ficoll-Hypaque gradienter ved 1000 G i 30 minutter. Celler opsamlet ved grænsefladen blev vasket tre gange med phosphatpufret saltopløsning. Monocyter afledt fra hver donor blev dyrket sepa-15 rat i 2 liters rulleflasker i serumfrit RPMI 1640 medium

C

ved en celletæthed på 2,5 x 10 celler/ml. Der tilsattes 1 yUg/ml hver af staphylococ-enterotoxin B (SEB) og rekombinant thymosin α-l til kulturen, og cellerne blev inkuberet i en befugtet atmosfære ved 37 °C med 10 % 20 C02’ ®fter 24 - 72 timer, afhængigt af donoren, blev cellesupernatanterne indhøstet og forarbejdet på lignende måde som dem, der blev afledt fra HL-60-cellelinien. Tumornecrosefaktor-udbytter fra PBL-kulturer varierede vidt, afhængigt af de anvendte inducerende midler. Tilsæt-25 ning af PMA til det ovenfor beskrevne induktionssystem forøgede cellesupernatanternes cytolytiske aktivitet. Imidlertid indeholdt cellesupernatanterne både tumorne-crosefaktor og lymphotoxin (bestemmelse af lymphotoxin eller tumornecrosefaktor i blandinger af disse blev 30 foretaget ved gennemførelse af cellelyseprøvningen med prøver, som i forvejen var inkuberet med neutraliserende kanin-antistof over for tumornecrosefaktor eller lymphotoxin, og bestemmelse af resterende aktivitet ved L-929 cellelyseprøvningen).

DK 171418 B1 44 EKSEMPEL 3

Chromatografi på qlaskugler med kontrolleret porestorrelse

Tumornecrosefaktor-aktivitet fra cellekultur blev chargeabsorberet på glaskugler med kontrolleret porestørrelse 5 (Catalogue No. CPG 00350, Electro-Nucleonics, Fairfield, NJ, U.S.A.) ækvilibreret med 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 8,0, ved konstant omrøring ved 4 °C. Der anvendtes 100 ml glaskugler pr. 5 liter medium. Efter omrøring i 1 time fik kuglerne lov at synke til bunds, og super-10 natanten blev afdekanteret. Kuglerne blev derpå hældt i en 5 x 50 cm kolonne ved stuetemperatur og vasket med 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 8,0, indeholdende 1 M NaCl. Tumornecrosefaktor-aktiviteten blev elueret fra glaskuglerne med 20 % ethylenglycol i 10 mM natrium-15 phosphatpuffer, pH 8,0, indeholdende 1 M NaCl. Eluerings- profilen af HL-60-supernatanten fra kolonnen er vist i fig. 1.

EKSEMPEL 4

Chromatografi på DEAE-cellulose 20 Eluatet fra eksempel 3 blev direkte påført en DEAE-cel lulose 53 (Whatman) kolonne (2,5 x 20 cm) ækvilibreret med 10 mM natriumphosphatpuffer ved pH 8,0 og 0,01 % "Tween 20" med en strømningshastighed på omkring 500 ml/h. Efter at kolonnens strømningshastighed var indstil-25 let til 100 ml/h, blev 4,2 x 10b enheder tumornecrose- faktor i 1080 ml prøve påført ved 4 °C, kolonnen blev vasket med ækvilibreringspuffer og elueret med stigende gradienter på 75 mM, 150 mM og 500 mM natriumchlorid i 10 mM phosphatpuffer (pH 8,0). Eluatet blev kontrolle-30 ret for absorbans ved 280 nm og tumornecrosefaktor-akti vitet som funktion af elueringsfraktioner. Resultaterne i DK 171418 B1 45 er vist i fig. 2.

EKSEMPEL 5

Hurtig protein-væskekromatografi

Den tumornecrosefaktor-aktive fraktion fra eksempel 5 4 blev koncentreret og dialyseret over for 20 mM "Tris"- HCl, pH 8,0, indeholdende 0,01 % "Tween 20" og 1 mM natriumazid (puffer A) i en Amicon-omrøringscelle under anvendelse af ca. YM-10 membran eller anden dialyse-membran med en molekylvægtafskæring under molekylvægten 10 af TNF. Membranen blev vasket to gange med puffer A.

En kolonne med kugler af "Sepharose'"^' substitueret med kvaternære ammoniumgrupper (9,8 ^uM kugler i en 5 x 0,5 cm kolonne? forhandlet som "Mono Q resin", Pharmacia) i en hurtig-protein-væskechromatografi-(FPLC) enhed 15 (Pharmacia) udstyret med en gradientprogrammør (GP-250) og to pumper (P-500)) blev præækvilibreret med dialysepuffere via et "superloop" med en strømningshastighed på 1 ml/min som yderligere beskrevet i J. Richey, "American Laboratory" October 1982, side 1. De sammen-20 hældte vaskeopløsninger og dialysekoncentrat blev sat på kolonnen, og kolonnen blev vasket med puffer A og derpå elueret med en lineær gradient på 40 - 75 mM na-triumchlorid i puffer A. Lineære gradienter blev programmeret som følger: 0-5 min, ækvilibreringspuffer? 25 5,1 - 15 min, 25 mM NaCl; 15,1 - 25 min, 40 mM NaCl? 25 - 60 min, 40 - 75 mM NaCl lineær gradient; 60 - 65 min, 75 mM NaCl; 65,1 - 70 min, 100 mM NaCl; 70 - 80 min, 100 - 1000 mM NaCl lineær gradient; 80 - 90 min, 100 mM NaCl; 90,1 - 110 min, ækvilibreringspuffer. Gen-30 nemløbet blev optaget som 2 ml fraktioner og kontrolleret for absorbans ved 280 n, for konduktivitet og for tumornecrosef aktor-aktivitet . Resultaterne er vist i fig. 3.

DK 171418 B1 46 EKSEMPEL 6 Kromatofokusering

Kromatofokusering blev gennemført under anvendelse af en "Pharmacia Mono P" kolonne (20 x 0,5 cm) i et FPLC-5 system som i eksempel 5. Den biologisk aktive (tumor- necrosefaktor) fraktion, som var elueret i fraktionerne nr. 37 - 45 fra eksempel 5, blev koncentreret og dialyseret på en Amicon-omrøringscelle med en YM-10 membran over for kolonneækvilibreringspufferen, dvs.

10 0,025 M bis-"Tris"-HCl, pH 6,7. Prøven blev sat på Mono P-søjlen ved stuetemperatur via et "superloop" med en strømningshastighed på 1 ml/min. Kolonnen blev vasket med ækvilibreringspuffer, indtil absorbansen ved 280 nm vendte tilbage til basislinien, og blev derpå elueret 15 med en lineær pH-gradient etableret ved vaskning af kolonnen med 7,5 % polypuffer 74 ved pH 4,7 (Pharmacia).

Der blev opsamlet en ml fraktioner, og afløbets absor-bans ved 280 nm og pH-værdi blev optegnet. Resultaterne er vist i fig. 4. Som det kan ses af fig. 4 var tumorne-20 crosefaktors isoelektriske punkt omkring 5,3.

EKSEMPEL 7

Præparativ SDS-PAG-elektroforese 15 % Polyacrylamidgeler (11 x 16 cm) med en tykkelse på 1,5 - 3,0 mm blev fremstillet ifølge en modifikation 25 af den procedure, der er beskrevet U. Laemmli, 1970, "Nature" 227:680 - 685. Både adskillelses- og stabelgeler indeholdt 0,1 % SDS og 0,05 % "Tween 20". Andre puffere samt koncentrationen af tværbindingsreagens var de samme som for analytiske SDS-PAGE-geler. Tumornecrosefaktor-30 aktive fraktioner fra trinnet i eksempel 5 eller 6 blev

hældt sammen, koncentreret og dialyseret over for 6,25 mM

♦ DK 171418 B1 47 "Tris"-HCl, pH 7,0, indeholdende 0,005 % SDS på en Amicon omrøringscelle under anvendelse af en YM-10 membran.

Efter fjernelse af det dialyserede koncentrat, blev membranen vasket tre gange med et lille volumen prøve-5 puffer (0,2 % SDS, 0,02 % "Tween 20", 30 % glycerol, 0,03 M "Tris"-HCl, pH 6,8, 0,005 % sporingsfarvestof).

Det dialyserede koncentrat og vaskeopløsningerne blev hældt sammen (totalvolumen 1 - 4 ml), der tilsattes eventuelt mercaptoethanol for at etablere reducerende 10 SDS-PAGE-betingelser, og prøven blev påført i et stort hul støbt i stabelgelen. Små huller nær ved prøvehullet blev anvendt til i forvejen farvede molekylvægtmarkører: phosphorylase-a (94K), okseserumalbumin (67K), ovalbumin (43K), kulsyreanhydrase (30K), sojabønnetrypsin-15 inhibitor (20K) og lysozym (14,4K). Gelerne blev kørt i et Biorad lodret elektroforesesystem afkølet til 12 °C ved en konstant strøm på 20 mA pr. mm geltykkelse, indtil sporingsfarvestoffet nåede gelens bund.

Efter elektroforesen blev en af glaspladerne fjernet 20 fra gelen, og positionerne af molekylvægtmarkørerne blev noteret. Banen indeholdende den påførte tumornerose-faktor-prøve blev derpå udskåret i 0,25 cm sektioner i overensstemmelse med molekylvægtene af markørproteinerne. Disse gelskiver blev derpå anbragt i polypro-25 pylenglas indeholdende 1 - 2 ml 10 mM ammoniumhydrogen- carbonat og 0,01 % "Tween 20", pH 8, og fik lov at elueres i 16 timer ved 4 °C. Eluaterne blev derpå prøvet for tumornecrosefaktor-aktivitet, og resultaterne er vist i fig. 5. Tumornecrosefaktormolekylvægtene på SDS-gel 30 var omkring 17000, hvad enten det var under reducerende eller ikke-reducerende betingelser, hvilket tyder på et enkeltkæde-molekyle.

Proteinet blev udvundet fra eluatet af gelskiverne frit for salte og stoffer med lav molekylvægt ved den følgen- DK 171418 B1 48 de behandling: der fremstilledes små kolonner indeholdende 0,2 ml Sep-pak C18 resin, som var blevet forvasket med acetonitril, 1-propanol, 1 % trifluoreddikesyre (TFA) og destilleret vand og derpå ækvilibreret med 5 10 mM amminohydrogencarbonat indeholdende 0,01 % "Tween 20", pH 8,0. Geleluatet blev sat på kolonnen og afløbet opsamlet. Harpiksen blev derpå vasket med omkring 5 ml hver af destilleret vand og 0,1 % TFA for at fjerne frie aminosyrer og puffersalte. Tumornecrosefaktor blev 10 elueret fra harpiksen med 1 ml 50 % 1-propanol i 0,1 % TFA. Yderligere elueringer med 1 ml hver af 50 % 1-propanol i 1 % TFA og 99 % 1-propanol i 1 % TFA blev også gennemført, men proteinet blev også elueret med den første puffer. Omkring 80 % af tumornecrosefaktor-bio-15 aktiviteten blev inaktiveret i dette trin. Selv om den således opnåede tumornecrosefaktor kan anvendes til sekvensanalyse, foretrækkes det at HPLC-afløbet beskrevet nedenfor i eksempel 8 anvendes til dette formål.

EKSEMPEL 8 20 Højtryks-væske-kromatografi

Molekylvægten af nativ intakt tumornecrosefaktor blev bestemt ved højtryks-gelpermeations-kromatografi. Denne blev udført ved stuetemperatur under anvendelse af en TSK G2000 SW gel HPLC kolonne (Alltech Associates, Deer-25 field, IL, U.S.A.) (7,5 x 60 mm). En 1 ml prøve af renset tumornecrosefaktor fra eksempel 5 indeholdende omkring 1 yug protein og 15600 enheder af aktivitet blev iso-kratisk elueret fra gelkolonnen med 0,2 M natriumphosphat-puffer, pH 7,0 ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min.

30 Kolonnen blev kalibreret med okseserumalbumin (molekyl vægt 66000), ovalbumin (molekylvægt 45000), oksekulsyre-anhydrase B (molekylvægt 29000) og lysozym (molekylvægt 14300). Der blev optaget 1 ml fraktioner, som blev prøvet DK 171418 B1 49 for tumornecrosefaktor-aktivitet. Fraktionerne, som viste tumornecrosefaktor-aktivitet, elueredes overensstemmende med en molekylvægt på 45000 - 6000 (fig. 6).

EKSEMPEL 9

5 Revers-fase-HPLC

Tumornecrosefaktor blev også renset ved revers-fase-HPLC under anvendelse af C4 Synchropak kolonner på Water's Associates, Inc. kromatograf-system som beskrevet tidligere (W. Kohr et al, 1982, Anal. Biochem, 122: 348 10 - 359). Proteinmaksima blev detekteret ved 210 nm og ved 280 nm efter eluering med en lineær gradient af 1-23 volumen-% 1-propanol i 0,1 % vandig TFA i de første 15 minutter og 23 - 30 volumen-% 1-propanol i 0,1 % TFA i de næste 15 minutter ved en strømningshas-15 tighed på 1 ml/min. Maksimaene blev prøvet for cyto-lytisk aktivitet. De organiske opløsningsmidler, som blev anvendt til eluering af tumornecrosefaktor fra C4-kolonnen, reducerede tumornecrosefaktor-aktiviteten omkring 80 %. Tumornecrosefaktor renset ved denne metode 20 blev tørret under vakuum og derpå forarbejdet til amino-syreanalyse og sekvensbestemmelse. Resultaterne er anført i fig. 7. Fig. 7 viser, at den tumornecrosefaktor, som blev opnået i afløbet fra eksempel 5, indeholdt biologisk inaktive proteinforureninger, som elueredes ved omkring 25 16 og 19 minutters retentionstid. Det bioaktive afløb fra C4-RP-HPLC var i det væsentlige homogent efter kriteriet aminoterminal sekvens.

EKSEMPEL 10

Bestemmelse af delvis aminosyresekvens for tumornecrose-30 faktor_

Tumornecrosefaktor blev trypsinnedbrudt som følger: DK 171418 B1 50 homogen tumornecrosefaktor fra eksempel 9 blev opløst, nedtørret og genopløst i 100 mM ammoniumhydrogencarbonat-puffer pH 8,0 indeholdende 5 vægt-% TPCK-trypsin (Worthington Biochemicals), 1 mM CaCl2 og 0,01 % "Tween 5 20" ved et enzym/substrat-forhold på 1:20, inkuberet i 6 timer ved 37 °C, tilsat yderligere 5 vægt-% trypsin, og hydrolyseblandingen yderligere inkuberet i 12 timer ved 37 °C. Reaktionsblandingen blev påført C4-HPLC som beskrevet ovenfor for at adskille peptidfragmenterne.

10 Resultaterne er vist i fig. 8. Der blev iagttaget ialt 9 fragmenter (fragmenterne 2 og 21 elueredes sammen ved toppen betegnet T2 i fig. 8). Et yderligere tiende fragment antages ikke at blive tilbageholdt af kolonnen. Aminosyresekvenser for intakt tumornecrosefaktor fra 15 eksemplerne 8 og 9 og trypsinhydrolyse-fragmenterne opnået i dette eksempel blev bestemt ved automatiseret sekventiel Edman-nedbrydning under anvendelse af en modificeret Beckman sequencer model 890B udstyret med kolde fælder. "Polybrene" (1,25 mg) blev anvendt som 20 bærer i koppen. Baseret på det intakte molekyles aminosy- resammensætning er molekylvægten af intakt tumornecrosefaktor 17100. Dette tal stemte overens med SDS-PAGE-dataene og udgør bekræftelse på fraværet af glycosylering.

EKSEMPEL 11 25 Synergistisk virkning af tumornecrosefaktor og ^-inter- feron_

Celler af musemelanoma B16, (Mason Research, Worcester, MA, U.S.A.) en cellelinie af C57bl/6 oprindelse, blev podet i en mikrotiterplade i en koncentration på 5000 30 celler/hul og inkuberet i 4 timer ved 37 °C i en befug-tet inkubator med 5 % C02 før tilsætningen af lympho-kinerne. Tumornecrosefaktor opnået fra eksempel 1 blev renset til væsentlig homogenitet ved HPLC og kvantise- DK 171418 B1 51 ret efter dens aktivitet ved den ovenfor beskrevne bioprøvning for cytolyse af L929-celler. På lignende måde blev renset rekombinant muse-2^-interf eron (P. Gray et al., 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 811: 5842 -5 5846) prøvet efter dets antivirale aktivitet over for EMC-inficerede L-celler (D. Goeddel et al., 1980, "Nature" (London) 287: 411 - 416). Muse-i^-interferon og human tumornecrosefaktor blev separat fortyndet til de i fig.

9 viste fortyndinger. ^-Interferon blev først tilsat til 10 det udpegede hul, og fortyndet tumornecrosefaktor tilsat tes umiddelbart derefter til et slutvolumen på 0,2 ml/hul. Efter 72 timers inkubering blev cellerne farvet med 0,5 % krystalviolet i 20 % methanol. Resultaterne er vist i fig. 9. B16 er relativt resistent over for såvel 15 tumornecrosefaktor som IFN-V alene; ved 1000 enh./ml tumornecrosefaktor blev der ikke iagttaget nogen synligt detekterbar cytolyse. Imidlertid resulterede tilsætning af meget små mængder ^-interferon (så lidt som 5 enh./ml) i cytolyse.

20 EKSEMPEL 12

Isolering af mRNA

Total RNA fra HL-60-cellekulturer (4 timer efter PMA-induktion) eller perifere blodmonocyter dyrket som beskrevet i eksempel 2 blev ekstraheret i hovedsagen som 25 rapporteret af Ward et al., 1972, "J. Virol." 9_: 61.

Celler blev pelletteret ved centrifugering og derpå resuspenderet i 10 mM NaCl, 10 mM "Tris"-HCl pH 7,5, 1,5 mM MgC^. Celler blev lyseret ved tilsætning af NP-40 (1 % slutkoncentration), og kerner blev pellette-30 ret ved centrifugering. Supernatanten indeholdt den totale RNA, som blev yderligere renset ved flere ganges phenol- og chloroform-ekstraktioner. Den vandige fase blev gjort 0,2 M med hensyn NaCl, og derpå udfældedes DK 171418 B1 52 den totale RNA ved tilsætning af 2 volumener ethanol.

Et typisk udbytte fra 1 g dyrkede celler var omkring 6 mg total RNA. Polyadenyleret mRNA (omkring 100 ^ug) blev opnået på oligo-(dT) cellulose ved metoden beskre-5 vet af H. Aviv et al., 1972, "Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. "69: 1408 - 1412.

EKSEMPEL 13 cDNA-bibliotek 7,5 ^,ug poly(A)+-mRNA fra eksempel 12 blev omdannet 10 til dobbeltstrenget cDNA ved successiv indvirkning af revers-transcriptase, DNA polymerase Klenow-fragment og Sl-nuclease (P. Gray et al., 1982, "Nature" 295: 503 - 508; M. Wickers et al., 1978, "J. Biol. Chem." 253: 2483 - 2495). Omkring 80 ng cDNA med en længde 15 på over 600 bp blev isoleret fra en polyacrylamid-gel.

Den syntetiske DNA-adaptorsekvens 5'AATTCATGCGTTCTTACAG 3' 3'GTACGCAAGAATGTC 5' blev ligeret til cDNA'en for at skabe EcoRI-kohæsive 20 termini. Som det er konventionelt inden for faget, blev adaptoren syntetiseret kemisk som to separate strenge, 5’-enden af en af strengene blev phosphoryleret med polynucleotidkinase, og de to strenge smeltet sammen·. cDNA'en (20 ng) blev derpå igen isoleret fra en poly-25 acrylamid-gel, indsat ved ligering i EcoRI-nedbrudt ^gt-10, emballeret i fagpartikler og formeret i E. coli stamme C600 hfl (Huynh et al., 1984, Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press Ltd., Oxford England) eller en anden kendt stamme, som er egnet til formering af 30 X~fag. Der blev opnået et cDNA-bibliotek på omkring 200000 uafhængige kloner.

DK 171418 B1 53 EKSEMPEL 14

Fremstilling af en deoxyoligonucleotid-sonde for tumor-necrosefaktor-cDNA_

En DNA-hybridiseringssonde på 42 nucleotider, baseret 5 på den præliminære aminosyresekvens af tumornecrosefaktor- tryptisk-peptid TD-6 (E-T-P-E-G-A-E-A-K-P-W-Y-E-K-) blev udformet på basis af publicerede codonudnyttelses-frekvenser (R. Grantham et al., 1981 "Nucleic Acids Res." jJ: 43 - 74) og codontilbøjeligheden hos humant 10 IFN-# (P. Gray et al., 1982, "Nature" 295: 503 - 508) og humant lymphotoxin. Den præliminære sekvens var forkert (det sidste K skulle have været P). Ikke desto mindre førte denne sekvens til en heldig sonde. Den syntetiske sonde havde sekvensen 15 5' dGAAACCCCTGAAGGGGCTGAAGCCAAGCCCTGGTATGAAAAG 3' og blev syntetiseret ved den metode, som er beskrevet af R. Crea et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8_: 2331 - / ^9 2348. Sonden blev phosphoryleret med (J- P) ATP og T4-polynucleotidkinase som beskrevet tidligere (Goeddel 20 et al., 1979, "Nature" 28^: 544).

EKSEMPEL 15

Identificering af en cDNA-klon indeholdende tumornecrose-faktor-kodesekvenser_

Omkring 200000 rekombinante fager fra Xgt-10/cDNA-biblio- 25 teket blev screenet ved DNA-hybridisering under anvendelse 32 af den P-mærkede 42-mer fra eksempel 14 under lav-stnn-gens-betingelser i overensstemmelse med A. Ullrich et al., 1984, "EMBO J." 2: 361 - 364 (eller alternativt P. Gray et al., 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 30 8J) 5842 - 5846, S. Anderson et al., 1983, "Proc. Natl.

Acad. Sci U.S.A." 6836 - 6842 og M. Jaye et al., DK 171418 B1 54 1983, "Nucleic Acids Res." 1Λ: 2325 - 2335). Ni adskilte kloner hybridiserede med sonden og blev plak-renset.

3 2

Derpå fremstilledes P-mærket cDNA under anvendelse af mRNA fra uinducerede HL-60-celler. DNA fra syv af 5 disse ni fagkloner hybridiserede ikke med denne "uinducerede" sonde og blev derfor bedømt til at være kandidater til tumornecrosefaktor-cDNA-sekvenser. cDNA-klo-nen indeholdende den største indsætning blev betegnet ).42-4. Denne indsætning blev sekvensbestemt ved dideoxy-10 kædeafslutnings-metoden (A. Smith, 1980, "Methods in

Enzymology" 6_5: 560 - 580 og F. Sanger et al., 1977, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 2i.: 5463 - 5467) efter subkloning i vektoren Ml3mp8 (J. Messing et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9^: 309 - 321).

15 Den for 2*42-4 opnåede cDNA-sekvens indeholdt hele kode- området for moden tumornecrosefaktor plus en portion af dens signalpeptid. Den korrekte orientering og læseramme af DNA'en blev udledt ved sammenligning med ami-nosyresekvensen af tryptisk peptid T4 af tumornecrose-20 faktor. Den aminoterminale valinrest i tumornecrosefak tor, bestemt ved proteinsekvensbestemmelse, er angivet som aminosyre 1 og efterfølges af 156 yderligere aminosyrer, før der mødes en stopcodon i læsefase. Den udregnede molekylvægt er 17356 dalton.

25 EKSEMPEL 16

Identificering af en cDNA-klon indeholdende komplette præTNF-kodesekvenser_ cDNA-klonen λ.42-4 indeholder hele kodeområdet for moden TNF, men mangler en fuldstændig signalpeptid-kodesekvens, 30 hvilket ses ved dens mangel på en startcodon. For at opnå den manglende sekvensinformation syntetiseredes hexadecanucleotid-primeren dTGGATGTTCGTCCTCC (komple DK 171418 B1 55 mentær til nucleotiderne 855 - 870, fig. 10) kemisk.

Denne primer blev sammensmeltet med mRNA fra eksempel 12, og derpå syntetiseredes cDNA under anvendelse af metoden fra eksempel 13. Der blev fremstillet et nyt 5 bibliotek på omkring 200000 cDNA-kloner i XgtlO ifølge metoden beskrevet i eksempel 13. Dette bibliotek blev screenet ved hybridiseringsanalyse under anvendelse Λ 32 af A42-4-cDNA-indsætningen, som var blevet P-mærket, som sonde. Der blev opnået 16 positive kloner, hvoraf 10 den længste (λΐ6-4) indeholdt en cDNA-indsætning, der strakte sig 337 bp yderligere i 5'-retning end X42-4- indsætningen. Den sammensatte sekvens af TNF-cDNA-ind- sætningerne fra Xl6-4 (nucleotiderne 1 - 870) og X42-4 (nucleotiderne 337 - 1643) er vist i fig. 10.

15 EKSEMPEL 17

Konstruktion af en ekspressionsvektor til direkte ekspression af tumornecrosefaktor_

Proceduren, som blev anvendt til at udtrykke cDNA-sekven-sen for den i eksempel 15 opnåede tumornecrosefaktor 20 er anført i fig. 11. Fag X42-4 fra eksempel 15, indeholdende hele kodesekvensen for moden tumornecrosefaktor og en del af den formodede tumornecrosefaktor-sekre-toriske leder, blev nedbrudt med EcoRI, og der blev udvundet et fragment på omkring 800 bp indeholdende 25 tumornecrosefaktor-kodeområdet. Dette fragment blev nedbrudt med Aval og Hindlll, og der blev udvundet et fragment på 578 bp (betegnet "C" i fig. 11). Dette fragment koder for tumornecrosefaktor-aminosyrerne 8 - 157.

Der fremstilledes to syntetiske deoxyoligonucleotider 30 (betegnet fragment "B" i fig. 11) (se konstruktionen af adaptorsekvensen i eksempel 13), som indeholdt en Xbal-kohæsiv terminus ved 5'-ende og en Aval-kohæsiv DK 171418 B1 56 terminus ved 3'-enden, en met-startcodon og codoner for de første syv aminoterminale aminosyrer i tumornecro-sefaktor. Codonerne for disse aminosyrer blev valgt på basis af E. coli præference. AATT-sekvensen oven 5 for startcodonen blev valgt til at holde startcodonen i rigtig afstand fra trp-ribosombindingssekvensen og, i kombination med aminosyrecodonerne, at eliminere en mulig mRNA-løkke.

Segmenterne B og C sammenføjes derpå ved en tredobbelt 10 ligering med et pBR322-derivat indeholdende trp-promotor- sekvensen med Shine-Dalgarno-sekvensen af trp-lederpepti-det (EP offentliggørelsesskrift nr. 36 776). Derivatet opnås eller udformes til at indeholde unikke Xbal- og

D

HindiII-steder mellem trp-promotoren og Tet -genet.

15 Enten pLTtrpl (Gray et al., 1984, "Nature" 312: 721 -724) eller ptrpETA (Gray et al., 1984, "Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A." 8^: 2645 - 2649) er egnede udgangsvektorer af denne type, selv om andre kan konstrueres ud fra pBR322, trp-promotoren og eventuelle krævede synte-20 tiske linkere. Både pBR322 og plasmider indeholdende trp-promotoren er offentligt tilgængelige. pBR322-por-tionen af den valgte vektor kan have Aval-PvulI-segmentet fra bp 1424 til 2065 deleteret (betegnet "XAP" i plasmidnavnet). Ethvert af de ovenstående plasmider 25 nedbrydes samtidigt med Xbal og Hindlll, og det store vektorfragment udvindes. Dette fragment og fragmenterne B og C ligeres med T4-DNA-ligase, og ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli 294 (ATCC 31446). Ampicillinresistente kolonier blev selekteret, og plasmid-30 DNA blev udvundet og karakteriseret ved restriktions- endonuclease-kortlægning og DNA-sekvensbestemmeIse.

Der blev opnået pTrpXAPTNF, som indeholdt indsætningerne B og C.

DK 171418 B1 57 EKSEMPEL 18

Tumornecrosefaktor-ekspression i E. coli E. coli ATCC 31446, som var blevet transformeret med pTNPtrp, blev dyrket i M9-medium indeholdende 20 ^ug/ml 5 ampicillin, og kulturen blev dyrket til Α,-,-q = 0,3.

Der tilsattes indoleddikesyre til opnåelse af en slut-koncentration på 20 ^ug/ml, og kulturen blev dyrket til A550 =1. 10 ml celler blev koncentreret og gensuspenderet i phosphatpufret saltopløsning. Cellerne blev 10 ultralydbehandlet og fortyndet til tumornecrosefaktor- bestemmelse ved prøvningen ifølge eksempel 1. Der blev opnået omkring 10 enheder af aktivitet pr. ml kultur.

Denne aktivitet blev neutraliseret ved præinkubering med kanin-antisera fra kaniner immuniseret over for 15 human tumornecrosefaktor.

EKSEMPEL 19

Tumornecrosefaktor-ekspression i E. coli

Denne fremgangsmåde foretrækkes frem for den ifølge eksempel 18. 1 2 3 4 5 6

Fortrinsvis er værten til anvendelse med de ovenstående 2 vektorer en ikke-revertibel tonA E. coli stamme. Sådanne 3 stammer er bakteriofag-resistente og derfor langt mere 4 egnede til dyrkning i stor målestok end vild-type-stammer.

5

Det følgende er en beskrivelse af en egnet fremgangs- 6 måde til frembringelse af en sådan stamme. E. coli W3110 transduceres med X: :Tnl0, en X.-bakteriofag indeholdende det overflyttelige element TnlO, til frembringelse af en TnlO-hop-pulje af E. coli W3110 (N. Klecker et al., 1977 "J. Mol. Biol." 116.: 125).

DK 171418 B1 58 E. coli W3110::Tnl0 hop-puljen dyrkes i L-væske ved 37 °C til en celletæthed på omkring 1 x 10^/ml. 0,5 ml af kulturen centrifugeres, og pillen gensuspenderes i 0,2 ml af et Xphi80-(eller TI) lysat indeholdende 9 5 7,0 x 10 pfu. Fagen får lov at adsorbere i 30 minutter ved 37 °C. Suspensionen spredes derefter på EMB-plader suppleret med tetracyclin (15 ^ug/ml). Efter inkubation natten over ved 37 °C sammenhældes de blegt lyserøde kolonier i 3 ml L-væske, dyrkes natten over ved 37 °C, 10 vaskes to gange og suspenderes igen i L-væske. Denne kultur inficeres med bakteriofag PI kc, og faglysatet udvindes (J. Miller, 1972, Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, side 304).

E. coli AT982 (no. 4546, E. coli Genetic Stock Center, 15 New Haven, Conn., U.S.A.) transduceres til tetracyclin- resistens af dette PI kc lysat. Transductanter selekteres på L-væske-plader suppleret med tetracyclin (15 yug/ml) og diaminopimelinsyre (dap; 40 yug/ml). De resulterende transductanter screenes for tetracyclinresistens, og

+ R + R

20 regenereringen af dap-genet (dap , tet ). dap tet transductanter prøves derpå for Xphi80-(eller Ti) resistens.

+ R

Pl kc lysater fremstilles derefter på flere dap , tet ,

Xph i80-(eller TI) resistente stammer. Lysaterne anvendes til at transducere E. coli W3110 til tetracyclinresistens.

25 Transductanterne screenes og selekteres for Xphi80-(eller

Ti) resistens.

Tetracyclin-følsomme isolater selekteres fra W3110 fhuA::Tnl0- phi80R transductanterne (S. Naloy et al., 1981 "J. Bact." 145: 1110). Disse isolater undersøges 30 for ^.phi80-resistens og tetracyclin-følsomhed efter enkeltkolonirensning.

DNA isoleres fra flere tetracyclin-følsomme ^.phi80-re-sistente mutanter og nedbrydes med Sstll. Den Sstll- DK 171418 B1 59 nedbrudte DNA karakteriseres ved Southern-afdupningspro-cedure under anvendelse af radioaktivt mærket og SstIIl-nedbrudt X: :TnlO-DNA som sonde for at bestemme, om TnlO'en er udskåret (R. Davis et al., 1980, Advanced Bacterial 5 Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory). Et af de tetra- cyclin-følsomme isolater vises at have mistet to af TnlO-hybridiseringsbåndene sammenlignet med hybridi-seringen mellem DNA fraX::TnlO og den oprindelige W3110 fhuA::TnloXphi80R. Et tredje hybridiseringsbånd har 10 en ændret mobilitet, som viser, at der er sket en dele tion forårsaget ved upræcis udskæring af TnlO.

SDS-gel-elektroforese af ydermembranpræparater fra stammen med en upræcis TnlO-udskæring afslører, at båndet, som antages at være fhuA-proteinet, har en ændret elektro-15 foretisk mobilitet sammenlignet med vild-type-fhuA-pro- teinet. Det resulterende protein er ikke-funktionelt som ^lphi80-receptor-protein. En anden uafhængig stamme, som også har undergået upræcis udskæring af TnlO, viser intet fhuA-protein på SDS-gelen.

20 Ingen af disse stammer viser reversion til tetracyclin- resistens eller til X.phi80-følsomhed, hvilket viser, at der er en upræcis udskæring af hele eller en‘del af TnlO-transposonet sammen med enten en delvis eller fuldstændig deletion af fhuA-genet. Fortrinsvis anvendes 25 en af disse W3110-stammer (NL106) som vært for de TNF- kodende medier, som er beskrevet andetsteds i denne beskrivelse.

NL106 blev transformeret med ptrpXAPTNF og indpodet i 10 liter af et medium med pH 7,4 og med følgende sammen-30 sætning: DK 171418 B1 60

Komponent_q/1 (NH4)2S04 5,0 K2HP04 6,0

NaH2P04 3,0 5 Na-citrat 1,0 L-Tryptophan 0,2 "NZ Amine AS" 4,0 Gærekstrakt 4,0

MgS04 1,2 10 Glucose 25,0

Sporelementopløsning (Fe-, Zn-, Co-, Mo-, Cu-, B- og Mn-ioner) 0,5 ml

Tetracyclin 1,0 mg 15 Glucose tilførtes kulturen med en hastighed på 1 g/min, når kulturen A550 nåede omkring 20. Gæringen gennemførtes ved 37 °C, indtil der var nået en A^g på 136 (omkring 20 timer). Kulturen blev centrifugeret til dannelse af en cellepasta, og pastaen derpå ekstraheret i 30 minutter 20 ved pH 8,0 og stuetemperatur med en puffer indeholdende 50 mM "Tris”, 10 mM EDTA, 1000 mM NaCl, 2000 mM urinstof og 0,1 % 6-mercaptoethanol. Ekstrakten blev fortyndet p og prøvet som beskrevet i eksempel 1. 1 x 10 enheder af tumornecrosefaktor-aktivitet ved denne prøvning blev 25 fastslået som ækvivalent med 1 mg tumornecrosefaktor.

Op til omkring 2 g tumornecrosefaktor blev opnået pr. liter kultur. Aminoterminal sekvensbestemmelse viste, at fra omkring 75 til omkring 86 vægt-% var valyl-amino-terminal (moden) tumornecrosefaktor, og resten met-TNF.

30 Ud over de høje udtrykkelsesniveauer var proteinet ikke til stede i lysbrydende legemer og viste sig heller ikke på anden måde at være toxisk for cellerne, hvilket fremgår af de yderst høje celletætheder, som blev opnået.

DK 171418 B1 61 EKSEMPEL 20

Konstruktion og ekspression af et mutant tumornecrose-faktor-qen_

Eksempel 17 - 18 blev gentaget, undtagen at oligonucleo-5 tidfragmentet B blev syntetiseret med en histidincodon CAT i stedet for 6-arginincodonen CGT. Der blev udtrykt tumornecrosefaktorderivat.

EKSEMPEL 21

Konstruktion og ekspression af et andet mutant tumorne-10 crosefaktor-gen_

Proceduren fra eksempel 17-18 blev gentaget med et oligonucleotidfragment B, som koder for leucin (CTT) i stedet for 2-arginincodonen. Der blev opnået omkring 1200 mg moden TNF-aktivitet pr. liter kultur ved indleden-15 de forsøg. Uforarbejdet TNF kunne ikke detekteres i kulturen.

EKSEMPEL 22

Konstruktion af en vektor, som koder for en tumornecrose-faktor-fusion med en sekretorisk siqnalsekvens_ 1 2 3 4 5 6

Sekvensen af E. coli genet for varmestabilt enterotoxin 2 STII er afbildet i Picken et al., 1983, "Infection and 3

Immunity" 4^(1): 269 - 275. I dette eksempel blev et 4 fragment indeholdende STII-sekretionssignalet og Shine- 5

Dalgarno-sekvensen ligeret neden for alkalisk-phosphata- 6 se-promotoren fra E. coli. STII-signalet efterfølges i 3'-retningen af et syntetisk oligonucleotid, som leverer codoner for de første syv aminoterminale tumornecrosef aktor-aminosyrer og resten af kodesekvensen for tumor- DK 171418 B1 62 necrosefaktor. Alle de ovenstående blev samlet i en pBR322-vektor.

pWM501 (Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" £2(1): 269 - 275) indeholder STII-genet. pWM501 blev 5 nedbrudt med Xbal og Nsil, og fragmentet på omkring 90 bp isoleres. Dette fragment kunne også syntetiseres organisk ved i sig selv kendte metoder (fragment A).

Et pBR322-Trp-plasmid som beskrevet i eksempel 17 (p20kLT) blev nedbrudt med Xbal og Hindlll, og det store vektor-10 fragment udvundet (fragment B). Dette fragment indehol der et E. coli replikationsorigin og et gen, som overfører fænotypen ampicillinresistens.

Et syntetisk oligonucleotid blev syntetiseret som to strenge og sammensmeltet til følgende struktur (de ud-15 ragende restriktionssteds-ender og de aminosyrer, som oligonucleotidet koder for, er også angivet):

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr 51 GTA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3 * ACGT CAT ACG AGA AGA AGA GCA TGA GGCT Nsil Aval

Dette oligonucleotid betegnes fragment C.

pTNFtrp fra eksempel 18 blev nedbrudt med Aval og Hindlll. AvaI-HindIII-fragmentet på 578 bp (fragment D) blev 20 udvundet. Det indeholder hele TNF-kodesekvensen undta gen de første 7 aminosyrer.

En DNA-sekvens omfattende en alkalisk-phosphatase-(AP) promotor fra E. coli forbundet med en heterolog Shine-Dalgarno-(S.D.) sekvens (trp) og med EcoRI- og Xbal-termi-25 ni blev konstrueret som følger. Et DNA-fragment indehol- DK 171418 B1 63 dende en portion af AP-promotoren blev isoleret fra plasmidet pHI-1 (H. Inouye et al., 1981, "J. Bacteriol." 146: 668 - 675), selv om alle passende kilder indeholdende AP-promotor-DNA også kunne anvendes. pHI-1 blev nedbrudt 5 med Hpal for at åbne plasmidet, en syntetisk EcoRIlinker

GAATTCGAATTC blev ligeret til plasmidet, og det CTTAAGCTTAAG

med linker forsynede plasmid blev nedbrudt med et overskud af EcoRI for at spalte alle EcoRI-steder og med mangel på Rsal-aktivitet for kun delvis at spalte alle 10 Rsal-stederne (EcoRI- og Rsal-trinnene kunne også gennemføres efter hinanden i stedet for samtidigt). Et 420 bp fragment indeholdende AP-promotoren blev udvundet fra EcoRI-delvis-Rsal-nedbrydningsblandingen.

En trp S.D. sekvens blev opnået som følger: et plasmid 15 eller en organisme indeholdende trp-promotoren (pIFN-82, D. Leung et al., 1984, "Biotechnology" 2: 458 -464) blev nedbrudt med Xbal og Rsal, og 30 bp fragmentet, som indeholder trp S.D. sekvensen, blev udvundet. Dette fragment blev ligeret til 420 bp AP-promotor-fragmentet 20 til dannelse af et 450 bp EcoRI-Xbal-fragment, betegnet fragment E. Dette har nucleotidsekvensen

EcoRI

GAATTCAACTTCTCCATACTTTGGATAAGGAAATACAGACATGAAAAATCTCATTGCTGAGTTGTTATTT | AAGCTTGCCCAAAAAGAAGAAGAGTCGAAAGAACTGTGTGCGCAGGTAGAAGCTTTGGAGATTATCGTCA CTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTA CGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTA TTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTT

trpS.D. Xbal

ATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCTAGA

Fragmenterne A, B, C og D blev ligeret ved en fire-parts-ligering, og ligeringsblandingen blev anvendt til at DK 171418 Bl 64 transformere E. coli 294. Transformanter blev identificeret ved vækst på LB-plader indeholdende ampicillin.

Plasmid trpSTIITNF blev isoleret fra en transformant-koloni. Dette plasmid blev nedbrudt med Xbal og EcoRI 5 for at fjerne trp-promotoren og derpå ligeret til det 450 bp lange fragment E indeholdende alkalisk-phosphatase-promotoren fra E.coli. Det resulterende plasmid kaldes pAPSTIITNF.

EKSEMPEL 23 10 Ekspression og forarbejdning af en tumornecrosefaktor-fu- sion med en sekretorisk signalsekvens_ E. coli NL106 blev transficeret med pAPSTIITNF og indpodet i 10 liter af et medium med pH 7,0 og med følgende sammensætning: 15 Komponent_q/1 (NH4)2S04 5,0 K2HP04 2,6

NaH2P04 1,3

Na-citrat 1,0 20 KC1 1,5 "NZ Amine AS" 5,0 Gærekstrakt 2,0

MgS04 1,2

Glucose 25,0 25 Sporelementopløsning (Fe-, Zn-, Co-, Mo-, Cu-, B- og Mn-ioner) 0,5 ml

Ampicillin 20,0 mg

Dyrkningen blev gennemført på samme måde som beskrevet 30 ovenfor i eksempel 19, undtagen at der blev nået en A,-[-q på 140. Kulturen indeholdt ved dette punkt omkring DK 171418 B1 65 400 mg tumornecrosefaktor/liter, hvoraf omkring 70 -80 vægt-% var rigtigt forarbejdet til det modne protein, bedømt fra elektroforese-geler. Der blev udvundet tilnær-5 melsesvis den samme aktivitet af tumornecrosefaktor efter helcelleekstraktion ved den fremgangsmåde, som blev anvendt i eksempel 19, som der blev udvundet ved osmotisk chok af cellerne.

EKSEMPEL 24 10 Konstruktion og udtrykkelse af yderligere tumornecrose-f aktor-derivater______

Derivater af TNF-aminosyresekvensen i fig. 10 fremstilles til at opfylde et eller flere af de følgende formål: at forøge in vivo halveringstiden, forøge den cytolytiske 15 aktivitet, forøge nettoforskellen i cytolytisk aktivitet på tumorceller i forhold til normale celler, at fremstille TNF-immunogener til fremstilling af anti-TNF-antistoffer til diagnostiske anvendelser, at frembringe unikke steder til kovalent modificering (f.eks. hvor enzymmærker bindes 20 kovalent ved fremstillingen af EMIT- eller ELISA-diagnos- tiske reagenser) og at ændre TNF's fysiske egenskaber, f.eks. dens opløselighed, pi og lignende. Bestemmelsen af den ønskede aktivitet hos selekterede derivater udføres ved rutinescreening ved hjælp af egnede i sig selv kendte 25 prøvninger.

Fortrinsvis vil TNF og dets derivater ikke inkludere TNF med en sekvens svarende til den hos ikke-primater, og den vil fortrinsvis heller ikke have aminotermini som hos ikke-primater, f.eks. den desValArg-aminoterminus, 30 som er karakteristisk for, hvad der er blevet betegnet som kanin-tumornecrosefaktor, eller aminoterminus fra det TNF-gen, som er identificeret at give sekvensen DK 171418 B1 66

Val-Arg-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Ser-Val-Ala-Asn-Pro-Aln-Ala-Glu-Gly- (Wang et al., "Science" 228: 149 - 154, 1985).

Den følgende fremgangsmåde, baseret på J. Adelman et 5 al., "DNA" 2^(3): 183 - 193 er alment anvendelig til konstruktion og udtrykkelse af alle mutant-TNF-DNA-sekven-ser, som indeholder stille mutationer eller koder for TNF-derivater. For at undgå redundans belyses repræsentative derivater, hvori Arg 32 er omdannet til histidyl 10 (en udskiftning), His 73 er deleteret (en deletions mutation), og leucyl er knyttet til Leu 157 (en indsætning). Det bør imidlertid forstås, at alle andre derivater frembringes på samme måde.

Andre fremgangsmåder, som er egnede til skabelse af 15 stille eller udtrykte mutationer i den tumornecrose- faktor-kodende DNA, er kendte for fagfolk. F.eks. konstrueres mutant-DNA ved simpelthen kemisk at syntetisere hele sekvensen eller ved at syntetisere en portion af sekvensen og ligere fragmentet til resten af den krævede 20 DNA. Kemisk DNA-syntese er fordelagtig, når fagmanden ønsker at fremstille mutanten direkte uden først at opnå DNA'en, som koder for tumornecrosefaktor, fra naturlige kilder. Almindeligvis vil imidlertid udgangs-DNA'en kode for den naturlige aminosyresekvens, herunder dens 25 alleliske varianter, og man vil derudfra ønske at frem stille visse afledte mutanter.

Det er ønskeligt ved fremstilling af DNA, som koder for TNF-derivater, at der ikke foretages codon-ændringer, som skaber mulighed for, at mRNA, som trans-30 criberes derfra, danner stærke stamme-og-løkke-struk- turer. Undgåelse af sådanne strukturer vil almindeligvis resultere i højere udbytter. Af samme grund bør der anvendes codoner, som foretrækkes af transformantværten.

DK 171418 B1 67

Egnet udgangs-DNA er EcoRI-Hindlll-fragmentet af pTrpXAPTNF (eksempel 17) opnået ved sekventiel nedbrydning med EcoRI og Hindlll, efterfulgt af isolering af fragmentet indeholdende TNF-genet. Dette fragment inklu-5 derer trp-promotoren og strukturgenet for methionyl-tumor- necrosefaktor. For at opnå en enkeltstrenget kopi af dette gen, som er egnet til mutagenese, klones EcoRI-HindIII-fragmentet ind i polylinker-stedet i fag Ml3 mp8 RF-DNA (J. Messing et al., 1982, "Gene" 19: 269 10 - 276; "RF" betyder den replikative form af fagen; denne fag er kommercielt tilgængelig). En aliquot af EcoRI-Hindlll-nedbrydningsblandingen sættes til en ligeringsreaktion indeholdende 10 ng Ml3 mp8 RF-DNA, som i forvejen er blevet nedbrudt med EcoRI-Hindlll. Efter inkubation 15 ved stuetemperatur i 2 timer anvendes ligeringsblandingen til at transformere E. coli JM103 (en kommercielt tilgængelig stamme; JM101 kan også anvendes). Transformerede celler udplades med top-agar indeholdende X-GAL (di-brom-dichlor-indol-galactosid) og IPTG (isopropylthio-20 galactoside). Bakteriekulturer (1 ml) inficeret med fag opsamlet fra farveløse plakker anvendes til at isolere Ml3 mp8/TNF RF-DNA ved en miniscreeningsprocedure (Birn-boim and Doly, 1980, "Nuc. Acids Res." J.'· 1513 - 1523).

Den resulterende rekombinante fag Ml 3 mp8/TNF bærer 25 kodestrengen for TNF-genet.

Til stedsdirigeret mutagenese syntetiseres oligodeoxy-ribonucleotider (mutagenese-oligomere) med en sekvens komplementær til strækninger på 15 baser på hver side af mutationsstedet som vist i de følgende diagrammer, 30 hvori N angiver komplementære baser, og M angiver den nucleinsyre, som indsættes, deleteres eller udskiftes. Indsætninger eller deletioner foretages almindeligvis i grupper på 3 for at bevare den nedenfor liggende portion af genet i fase.

DK 171418 B1 68

Til deletioner: oligomer DNA (N).^ ^N^15 vektor DNA (N)15 {M) (N)15

Til udskiftninger: oligomer DNA (N)^ (N)^,- vektor DNA (N)15 (M2* (N)15 5 Til indsætninger: oligomer DNA (N)^ ^N^15 vektor DNA (N)15 (N)15 M^ angiver en base eller en oligomer, som ikke er komplementær til basen eller oligomeren M2· Her er den ønskede mutantsekvens. Almindeligvis fremstilles også 10 oligomere som har den virkning af frembringe mere end én type mutation ad gangen.

Antisense-oligomeren for Arg-His 32 mutanten er p CAG GAG GGC ATT GGC ATG GCG GTT CAG CCA CTG-OH.

Antisense-oligomeren for His 73 deletionen er 15 p GTG GGT GAG GAG CAC GGT GGA GGG GCA GCC-OH.

Antisense-oligomeren for Leu 158 indsætningen er p TGT TCG TCC TCC TCA AAG CAG GGC AAT GAT CCC-OH.

Disse primere syntetiseres ved konventionelle metoder. Til anvendelse ved mutageneseproceduren phosphoryleres 10 pmol 20 af oligomererne eller lac-primeren 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' hver i 30 minutter ved 37 °C i 10 yul 50 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothrei- tol, 0,1 mM ATP, indeholdende 2 enh. T4-polynucleotid- kinase. Til anvendelse som sonder (se nedenfor) phos- 25 phoryleres 2 pmol af de syntetiske oligonucleotider som ovenfor, undtagen at 0,1 mM ATP blev erstattet med 1 /U -^P ATP (Amersham). Specifikke aktiviteter er 6 rutinemæssigt højere end 5 x 10 tællinger/min pr. pmol oligonucleotidkæde.

DK 171418 B1 69

Hybridisering af hver oligomer og lac-primeren til den enkeltstrengede DNA fra fag M13 mp8/TNF, efterfulgt af primerforlængelse, resulterer i dannelsen af delvis heteroduplexe DNA'er, hvoraf en streng indeholder 5 mutant-DNA'en.

Til delvis heteroduplexdannelse opvarmes enkeltstren-get Ml3 mp8/TNF-DNA (300 ng) til 80 °C (2 min), 50 °C (5 min) og stuetemperatur (5 min) i 20 ^,ul 10 mM "Tris"-HC1 (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 50 mM NaCl, indeholdende 10 1 pmol hver af phosphoryleret oligomer og primer (tilsat

som aliquoter fra kinasereaktionen). Primerforlængelse startes ved tilsætning af 30 yul 50 mM "Tris"HCl (pH

8,0), 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 mM dATP, 0,2 mM hver af dGTP, dTTP, 15 dCTP og indeholdende 2 enh. E. coli DNA-polymerase I, stort fragment og 20 enh. T4-DNA-ligase. Efter 30 minutter ved stuetemperatur inkuberes reaktionsblandingerne i 4 timer ved 37 °C efterfulgt af inkubation natten over ved 4 °C. Aliquoter phenolekstraheres, og DNA fældes 20 med ethanol og opløses i 15 ^ul vand. DNA i disse aliquoter anvendes til at transformere E. coli JM103.

lac-primeren hybridiserer til fagen ved en lokalitet 5' for oligomeren. Primerforlængelse stabiliserer den heteroduplexe struktur. Oligomeren og primeren phos-25 phoryleres enzymatisk for at gøre det muligt for T4-DNA- ligasen at sammenføje forbindende DNA-kæder.

Phenolekstraheret heteroduplex DNA fra aliquot C (10 ^,ul) sættes til 10 ^,ul 0,06 M Na-acetat pH 4,5, 0,6 M NaCl, 0,6 mM ZnCl2, og indeholdende 200 enh. S^-nuc-30 lease. Efter inkubation ved 37 °C i 5 minutter tilsættes gær-tRNA (5 yug), og nucleinsyrerne udvindes ved phenol-ekstraktion og ethanolfældning. Under anvendelse af de samme S^-betingelser giver 30 ng enkeltstrenget M13 DK 171418 B1 70 mp8 DNA (omkring 10000 plak-dannende enheder) mindre end 100 plakker ved en DNA-transformationsprøvning, medens den samme mængde RF-DNA bevarer mere end 80 % af dens transformerende egenskaber. S^-behandlet DNA 5 anvendes til at transformere E. coli JM103, og den resul terende fag analyseres ved in situ plak-screening.

Bakterieplader (15 cm i diameter) indeholdende flere hundrede rekombinante Ml3-fag-plakker screenes ved in situ plakhybridisering (Benton et al., 1977, "Science" 10 196; 180 - 182) for både den oprindelige og den muterede genotype under anvendelse af de passende mærkede oli- g gomere på separate sæt af filtre (omkring 10 tællinger/ min pr. filter). Hybridisering sker natten over ved 50 °C, 40 % formamid, 5 X SSC. Filtrene vaskes ved 45 15 °C, 2 X SSC, 0,02 % natriumdodecylsulfat, lufttørres og eksponeres på røntgenfilm ved -70 °C under anvendelse af en intesiveringsskærm.

Det vil være nødvendigt at variere stringensen af hybridi-seringsproceduren (ved ændring af koncentrationen af 20 SSC) for at adskille hybridiseringen af oligomer til mutant-DNA-strengen (et perfekt komplement) fra hybridisering til udgangs-DNA'en; hver mutant vil variere med hensyn til dens evne til at hybridisere afhængigt af arten og antallet af udskiftede, deleterede eller indsatte 25 baser. F.eks. vil detektering af en mutation i en enkelt base kræve høj-stringens-betingelser for at skelne mellem mutant-DNA og umuteret udgangs-DNA. Hvor mutationen er mindre betydende, f.eks. deletion af en codon eller udskiftning af 1 - 3 baser, bør hybridiseringssonden 30 være mindre end den muterende oligomer. Typisk vil dette være en sonde på fra omkring 14 til omkring 20 baser.

Opgaven med at screene mutantdeletioner lettes ved anvendelse af en sonde indeholdende eller udgørende den deleterede sekvens til at prøve for tab af sekvensen. Hvis DK 171418 B1 71 denne sonde ikke hybridiserer til DNA fra en selekteret plak, kan man konkludere, at det ønskede tab af målsekvensen har fundet sted.

5 En plak, som hybridiserer med den mærkede oligomer, opsamles og indpodes i E. coli JM103. Der præpareres enkeltstrenget (ss) DNA fra supernatanten og dobbeltstrenget (ds) DNA fra cellepillen. ssDNA'en anvendes som skabelon for dideoxysekvensbestemmelsen af klonen 10 under anvendelse af M13-universalprimeren eller en syn tetisk oligomer komplementær sekvens lokaliseret 3' for det muterede område i tumornecrosefaktor-DNA. Di-deoxysekvensbestemmelse bekræfter, at den udvundne plak indeholder mutant-DNA'en. En sådan fag betegnes Ml3 mp8/TNFmtnt.

15

Ml3 mp8/TNFmtnt nedbrydes med EcoRI og Hindlll, og det TNF-kodende fragment udvindes. pTrpXAPTNF nedbrydes med EcoRI og Hindlll, og vektorfragmentet udvindes. Mutantfragmentet ligeres derpå til vektorfragmentet, 20 og ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli W3110, NL106, eller 294 (ATCC 31446). Tumor-necrosefaktorderivatet udvindes ved fremgangsmåden ifølge eksempel 18 eller 19. Yderligere information med hensyn til M13 mutagenese leveres af GB offentliggørelsesskrift nr. 2 130 219 A.

25 TNF-derivaterne fremstillet i overensstemmelse med denne fremgangsmåde opdeles i tre klasser: Udskiftninger, deletioner og indsætninger, og underdeles yderligere som vist i den følgende tabel. Med mindre andet er anført, 30 er derivaterne af den modne tumornecrosefaktor i fig. 10.

DK 171418 B1 72

Repræsentativ modifikation

Derivattype_TNF-sted_ved angivne sted

A. UDSKIFTNINGER

5 I. Modifikationer i ladningsarten eller -graden 1. arg 6 his 2. lys 65 arg 3. pro 20 arg 10 4. asp 10 his 5. glu 53 thr 6. gin 47 asp 7. asp 45 gin eller asn 8. asn 39 asp 15 9. asn 34 gin 10. leu 29 asp 11. tyr 115 ile 12. glu 116 lys 13. pro 117 thr 20 14. glu 127 tyr 15. lys 128 his 16. ala 134 tyr 17. glu 135 lys 18. tyr 141 pro 25 19. asp 143 ser 20. alal45 thr 21. glu 146 asn 22. gin 149 lys 23. leu 120 lys 1 2 3 4 5 6 II. Modifikationer i hydrofil 2 eller hydrofob karakter 3 1. leu 57 tyr 4 2. ser 52 leu 5 3. val 41 tyr 6 4. gly 108 phe DK 171418 B1 73

Repræsentativ modifikation

Derivattype_TNF-sted_ ved angivne sted 5. leu 120 thr 5 6. ser 133 g!y 7. ala 134 thr 8. gly 148 ser 9. val 16 thr III. Sterisk modifikation 10 (ændringer i sidekædeomfanget) 1. leu 63 Phe 2. ser 52 tyr 3. ile 58 leu 4. gly 40 ile 15 5. val 13 phe 6. leu 120 Phe 7. ile 146 giy 8. asn 137 glu 9. ile 154 phe 20 10. ile 155 gly 11. phe 144 ile

B. INDSÆTNINGER

1. efter leu 157 gly gly-COOH

2. mellem asp 10 og lys 11 his 25 3. mellem ile 58 og tyr 59 leu 4. mellem ser 60 og gin 61 lys 5. mellem arg 31 og arg 32 ala 6. mellem gly 121 og gly 122 gly 7. før val 1 immunogenisk polypeptid 30 8. efter leu 157 immunogenisk polypeptid 9. mellem gin 149 og val 150 gly gly 10. mellem ala-1 og val 1 i præTNF lys arg DK 171418 B1 74

Repræsentativ modifikation

Derivattype_TNF-sted__ved angivne sted

C. DELETIONER

5 1. gin 149 2. lys 112 3. val 1 - arg 2 4. val 1 til og med pro 8 5. ala 22 10 6. arg 32 7. glu 53 8. ala 111 - lys 112 9. ala 123 10. ile 154 15 11. glu 127

D. KOMBINATIONER

1. ile 58 leu leu 57 phe 2. gin 149 deleteres 20 tyr 151 phe 3. lys 112 deleteres glu 115 lys 4. val 1 thr ala 22 lys 25 gly 24 asn ala 33 asp 5. tyr 115 phe glu 116 lys 6. gly indsættes mellem gly 121 og gly 122

30 efter leu 157 tilføjes gly gly-COOH

7. val· 1 til og med gly 66 deleteres og erstattes med NH2-Leu Ala Ile Ile Gly Phe lyr Val Gin Gly Ser Glu Ala-

Phe Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asn Ile Glu Ala Ser Leu Arg-

Asp Gly Lys Glu Leu Gin Phe Val Gly Gly Leu Tyr Ile Pro- 35 Glu Tyr Trp Pro Lys Ala Glu Ala Gly Glu Pro Thr- DK 171418 B1 75

Repræsentativ modifikation

Derivattype_TNF-sted_ved angivne sted 8. ala 111 deleteres 5 ala 109 gin leu 120 his 9. asn 19 gin asn 92 gin asn 137 gin 10 Bemærkelsesværdige er derivatiseringer, hvori trypsin- hydrolysesteder ved arg 2, arg 6 (se eksempel 20 og 21), arg 32 og arg 131 er deleteret eller modificeret, således at de ikke længere er følsomme for trypsin.

Dette kan forlænge halveringstiden i forhold til tumor-15 necrosefaktor in vivo, medens det reducerer muligheden for fermentativ klipning, arg 2 og arg 6 stederne er ikke kritiske, fordi biologisk aktivitet bevares, selv efter at de pågældende områder er fjernet. Imidlertid fører spaltning ved arg 32 og arg 131 stederne til akti-20 vitetstab. I overensstemmelse hermed udskiftes arg 32 og/eller arg 131 mest ønskeligt med his eller, mindre foretrukket, gin. Dette fjerner eller reducerer stedets enzymmodtagelighed, men bevarer sidekædens basicitet. Ligeledes udskiftes arg 31 med his eller, mindre fore-25 trukket, gin af samme grunde. Enzymhydrolysesteder ind sættes også mellem fusionspolypeptider og TNF-sekvenser for at skabe steder for forudbestemt frigørelse af moden TNF eller TNF-derovat, eller sådanne steder indføres i stedet for rester i ledersekvensen af præTNF. 1

Indførelsen af asn ved asp 45 og udtrykkelse i en værts celle (f.eks. gær- eller pattedyrcelle), som er i stand til glycosylering, forventes at frembringe en glyco-syleret tumornecrosefaktor.

DK 171418 B1 76 EKSEMPEL 25

Ekspression af tumornecrosefaktor i gær under styring af ADH-promotoren_

Plasmid TrpXAPTNF konstrueres som beskrevet i eksempel 5 17, undtagen at p20KLT eller ptrpETA (eller pBR322) spaltes med EcoRI og Hindlll frem for Xbal og Hindlll, og det syntetiske fragment B fremstilles med en EcoRI-ko-hæsiv terminus frem for den Xbal-kohæsive terminus. Ligeringsblandingen anvendes derpå til at transformere 10 E. coli ATCC 31446, og ved restriktionsanalyse identi ficeres et plasmid pTNFRI, som indeholder den tumorne-crosefaktor-kodende DMA bundet af EcoRI-steder. Plasmid pTNFRI isoleres, nedbrydes med EcoRI, og det tumornecrose-faktor-DNA-holdige fragment T-l udvindes.

15 Plasmid pFRPn (EP offentliggørelsesskrift nr. 60 057A) nedbrydes med EcoRI, behandles med alkalisk phosphatase for at forhindre recirkularisering, ligeres til T-l tumornecrosefaktor-fragmentet under anvendelse af T4-DNA-ligase, og ligeringsblandingen anvendes derpå til at 20 transformere E. coli ATCC 31446. Ampicillinresistente kolonier giver to rækker af plasmider med T-l indsætningen i modsatte orienteringer som bestemt ved restriktionsanalyse på agarose-elektroforese-geler. Plasmider renses fra E. coli transformanter og anvendes til at transformere 25 gær med trpl-mutationen (f.eks. gærstamme RH218, ube grænset ATCC deponering nr. 44076) til trp+-fænotypen. Plasmider orienteret sådan, at startcodonen i segment T-l er lokaliseret op til alkoholdehydrogenase-promotor-fragmentet, findes at transformere gæren til tumornecrose-30 faktor-udtrykkelse. Tumornecrosefaktor udvindes fra ekstrakter af gærtransformanterne. Plasmidstabiliteten ved gæringer i stor målestok forbedres ved anvendelse af et ekspressionsplasmid indeholdende 2 ^um-replika- DK 171418 Bl 77 tionsoriginet i stedet for det pFRPn-kromosomale repli-kationsorigin (ars 1) og en kompatibel værtsstamme (J.

Beggs, 1978, "Nature" 275: 104 - 109).

EKSEMPEL 26 5 Ekspression af tumornecrosefaktor i pattedyrceller

Plasmid pEHER (EP offentliggørelsesskrift nr. 117 060A) nedbrydes med EcoRI, behandles med kalveintestinal alkalisk phosphatase, ligeres til fragment T-l fra eksempel 25, og ligeringsblandingen anvendes til at transformere 10 E. coli ATCC 31446. Der isoleres to plasmider (betegnet pEHERTNF I og pEHERTNF II) indeholdende TNF-DNA'en i modsatte orienteringer som bestemt ved restriktionsanalyse på polyacrylamid-geler. Disse plasmider anvendes til at transficere og selektere CHO-DHFR-DUX-B11-, CHO 1-15 og Ltk -celler.

Vævskulturceller transficeres ved blanding af 1 ^ug pEHERTNF I eller pEHERTNF II som fremstillet ovenfor med 10 ^ug rotte-bærer-DNA i et volumen på 250 ^ul,

0,25 M CaC^r efterfulgt af dråbevis tilsætning af 250 20 ^ul HEPES-pufret-saltopløsning (280 mM NaCl, 1,5 mM

Na2PO^, 50 mM HEPES, pH 7,1). Efter 30 minutter ved stuetemperatur sættes opløsningen til vævskulturceller voksende i 60 mm plastic-vævskultur-skåle. Der anvendes CHO 1-, CH0-DHFR-DUX-B11-, og Ltk -celler. Skålene inde-25 holder 3 ml dyrkningsmedium passende for værtscellen.

Til CHO 1- og CHO-DHFR-DUX-Bll-celler er mediet Ham F-12 medium (Gibco) suppleret med 10 % kalveserum, 100 yug/ml penicillin, 100 yug/ml streptomycin og 2 yUM L-glutamin. Til Lth -cellelinien er mediet "Dulbecco 30 modified Eagle's medium" (DMEM) suppleret som ovenfor.

DK 171418 B1 78

Efter 3-16 timer fjernes mediet, og cellerne vaskes med 20 % glycerol i phosphatpufret saltopløsning. Der sættes frisk medium til hver skål, og cellerne inkuberes i 2 dage til.

5 Selektion af transficerede værtsceller udføres ved tryp- sinering af cellerne efter 2 dages vækst (hvilket omfatter behandling af cellerne med sterilt trypsin 0,5 mg/ml indeholdende 0,2 mg/ml EDTA) og tilsætning af omkring 5 3 x 10 celler til 10 mm vævskulturskåle med selektive 10 medier. Til dhfr celler er mediet en sammensætning

af F-12 (Gibco) medium, som mangler glycin, hypoxanthin og thymidin (GHR medium). Til DHFR+ værtsceller sættes methotrexat (100 - 1000 nM) til det normale vækstmedium. Kontroller køres under anvendelse af transfektionsbetin-15 gelser uden noget plasmid og med plasmid pFD-11 (EP

offentliggørelsesskrift nr. 117 060A) indeholdende normalt DHFR. Kolonier stammende fra celler, som optager og udtrykker DHFR-plasmidet, er synlige inden for 1-2 uger. Der identificeres transformanter, som udtrykker 20 tumornecrosefaktor.

Claims (18)

1. Tumornecrosefaktorderivat, som 5 a) er i stand til fortrinsvis at destruere eller væk-stinhibere tumorceller sammenlignet med normale celler under de samme betingelser; 10 b) er i det væsentlige homogent bestemt ved SDS-PAGE; og c) omfatter: (i) aminosyresekvensen Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-

15 Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro; eller (ii) aminosyresekvensen bestående af resterne 35-66 som vist i den vedføjede fig. 10; eller 20 (ii±) aminosyresekvensen bestående af resterne 110- 133 som vist i den vedføjede fig. 10; eller (iv) aminosyresekvensen bestående af resterne 16, 7-44, 45-82, 83-90 eller 99-157 som vist i den 25 vedføjede fig. 10.

2. Tumornecrosefaktorderivat ifølge krav 1 bestående i det væsentlige af aminosyresekvensen 1-157 som vist i den vedføjede fig. 10, eventuelt med en N-terminal methionyl- 30 rest, og hvori resten Val og/eller resten Arg er bevaret .

3. Tumornecrosefaktorderivat ifølge krav 2 omfattende en aminosyreudskiftning, -deletion eller -indsætning ved et DK 171418 B1 sted lokaliseret inden for aminosyreresterne 35-66, 110-133 eller 150-157 som vist i den vedføjede fig. 10.

4. Tumornecrosefaktorderivat ifølge krav 2 omfattende en 5 aminosyreudskiftning, -deletion eller -indsætning ved et sted lokaliseret inden for aminosyreresterne 67-109 som vist i fig. 10.

5. Tumornecrosefaktorderivat ifølge et hvilket som helst 10 af kravene 2-4, hvori udskiftningen er en indførelse af en rest fra klasserne af neutrale, sure eller basiske aminosyrerester i stedet for en rest i tumornecrosefak-tor-aminosyresekvensen, som ikke tilhører den samme klasse som den indførte aminosyre. 15

6. Tumornecrosefaktorderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 2-4, hvori udskiftningen er en, hvorved en rest med en sterisk omfangsrig sidekæde erstatter en rest, som ikke har en sådan sidekæde. 20

7. Tumornecrosefaktorderivat ifølge krav 6, hvori resten, som ikke har en sterisk omfangsrig sidekæde, er glycin eller serin.

8. Tumornecrosefaktorderivat ifølge krav 6 eller 7, hvori resten, som har en sådan sidekæde, er phenylalanin eller tryptophan.

9. Tumornecrosefaktorderivat ifølge et hvilket som helst 30 af kravene 2-4, hvori en lysin- eller argininrest er de- leteret eller erstattet af en anden aminosyrerest end lysin og arginin.

10. Præparat omfattende et tumornecrosefaktorderivat 35 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 i blanding med DK 171418 B1 en fysiologisk acceptabel puffer, aminosyre eller ikke-ionisk overfladeaktivt middel eller blandinger deraf.

11. Præparat ifølge krav 12, som er lyofiliseret. 5

12. DNA, som koder for et tumornecrosefaktorderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 2-9.

13. Replikerbar udtrykkelsesvektor indeholdende DNA'en 10 ifølge krav 12.

14. Vektor ifølge krav 13, som er et plasmid eller et virus . 15 15. Værtscelle transformeret med en vektor ifølge krav 13 eller 14.

16. Fremgangsmåde, som omfatter, at man dyrker en værtscelle transformeret med DNA ifølge krav 12, så der frem- 20 bringes udtrykkelse af DNA'en, at man lader tumornecrose-faktorderivatet akkumuleres i kulturen, og at man udvinder det fra kulturen.

17. Præparat, som er egnet til behandling af tumorer, 25 hvilket præparat omfatter et tumornecrosefaktorderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 og et interferon.

18. Præparat ifølge krav 17, hvori interferonet er γ-30 interferon. 1 35 Præparat ifølge krav 17 eller 18, som er lyof iliseret .