FI95472C - Menetelmä ihmisen tuumorinekroositekijän valmistamiseksi ja sitä koodaava DNA - Google Patents

Description

. 95472

Menetelmä ihmisen tuumorinekroositekijän valmistamiseksi ja sitä koodaava DNA

Tämä hakemus liittyy lymfokiineihin. Tarkemmin il-5 maistuna se koskee menetelmää imusolujen erittämien syto-toksisten tekijöiden valmistamiseksi yhdistelmäsoluissa sekä mainittua tekijää koodaavaa DNA:ta.

Immuunisolut, kuten B-solut, T—solut, luonnolliset tappajasolut ja makrofagit, muodostavat tunnetusti ainei-10 ta, joilla on sytotoksinen vaikutus kasvainsoluihin, mutta ovat vaarattomia normaaleille soluille. Näille aineille on annettu erilaisia nimiä, esimerkiksi lymfotoksiini, tuumorinekroositekijä, NK-solujen sytotoksinen tekijä, hemorraginen nekroositekijä, makrofagisytotoksiini ja 15 makrofagin sytotoksinen tekijä. Tällä hetkellä ovat näihin nimiin liittyvien proteiinien identiteetit epäselviä. Päävaikeutena on ollut se, että biologiset kokeet, joita käytetään proteiinien detektointiin, eivät tee eroa nii-; den välillä, se, että proteiinit näyttävät luonnossa « · 4 20 esiintyvän aggregaatteina tai hydrolyysituotteina ja se, että tähän asti saadut määrät ovat olleet niin pieniä, ettei ole saavutettu korkeaa puhdistumisastetta, jota vaaditaan proteiinien täydelliseen karakterisointiin.

Tällaisia sytotoksisia aineita löytyy tyypillises-25 ti intaktien eläinten seerumeista tai imusolu- tai imu-solulinjaviljelmien supernatanteista sen jälkeen, kun eläimet tai solut on käsitelty aineella, jonka tiedetään stimuloivan immuunisolujen lisääntymistä ("indusoija"). Tämän jälkeen seerumi tai supernatantti otetaan talteen 30 ja siitä tutkitaan sytotoksinen aktiivisuus kohdekasvain-*:* solulinjaa vastaan. Tavanomainen kohde on L-929, hiiren ' kasvainsolulinja. Tämä ja muut tämäntyyppisissä biologi sissa kokeissa käytettävät solulinjat ovat epäspesifisiä lyyttiseltä vasteeltaan, koska erilaiset, näennäisesti 35 erilliset imusolutuotteet pystyvät saamaan aikaan lyysin. Samanlaisia epäspesifisiä vasteita havaitaan tuumorinek-roosikokeissa in vitro. Siten sytolyysikokeet, joissa 2 - 95472 tehdään havaintoja solulinjojen lysoitumisesta in vitro tai kasvainsolukon kuolemisesta in vivo, ovat kykenemättömiä erottamaan toisistaan erilaisia sytotoksisia imuku-dostuotteita.

5 Sytotoksiset tekijät on kokeiluluontoisesti luoki teltu imusolujen, joista ne indusoituvat, perusteella. Esimerkiksi lymfotoksiini on nimitys, jota yleensä käytetään B- tai T-lymfosyyttien tai niistä peräisin olevien solulinjojen sytotoksisista eritystuotteista, kun taas 10 nimitystä tuumorinekroositekijä käytetään usein kuvaamaan makrofagien tai niistä peräisin olevien solulinjojen sytotoksisia tuotteita. Tämä luokitusjärjestelmä ei kuitenkaan ole kehittynyt pisteeseen, jossa olisi mitään takeita siitä, että viitataan vain yhteen proteiiniin tai että 15 proteiinit, joista käytetään eri nimiä, todella ovat erilaisia.

On tehty yrityksiä kunkin solutyypin erittämien sytotoksisten tekijöiden puhdistamiseksi ja karakterisoi-: miseksi. Siitä, missä määrin raportit vaihtelevat jonkin 20 sytotoksisen tekijän jonkin tietyn ominaisuuden suhteen tai ovat täysin ristiriitaisia, voitaisiin päätellä, että karakterisointi on ollut virheellinen tai että kukin solutyyppi erittää useita erillisiä sytotoksisia tekijöitä. Esimerkiksi makrofageista, monosyyteistä tai monosyytti-25 solulinjoista peräisin olevilla sytotoksisilla tuotteil la, vaikka niistä joskus käytetään yleisnimitystä tuumorinekroositekijä, on raportoitu olevan ominaisuuksia, jotka näyttävät ristiriitaisilta yhden sytotoksisen tuotteen teorian yhteydessä. Viittaan esimerkiksi seuraaviin 30 julkaisuihin: R. MacFarlan et ai., AJEBAK 58(pt 5) (1980) ' 489-500; D. Mannel et ai., Infection and Immunology 30(2) (1980) 523-530; H. Ohnishi et ai., GB-patenttijulkaisu 2 106 117Ά; ja J. Hammerström, Scand. J. Immunol. 15 (1982) 311-318.

35 Toisaalta C. Zacharzuk et ai. [Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 80 (1983) 6341-6345] ehdottavat, että marsun lymfotoksiini ja marsun makrofagien sytotoksinen teki- - 95472 3 jä olisivat immuunikemiallisesti samanlaisia elleivät identtisiä. Samanlaisia päätelmiä esittävät Ruff et ai., [Lymfokines 2 (1981) 235-272, sivuilla 241-242].

Yritykset karakterisoida immuunisytotoksisia teki-5 jöitä ovat myös keskittyneet eläinten, jotka on altistettu immunogeenisille antigeeneille, seerumien tai vatsaon-telonesteiden käyttämiseen lähtöaineena. Nämä lähteet sisältävät rasitetun immuunijärjestelmän koko tuotannon kaikessa runsaudessaan vastakohtana yhden solutyypin 10 tai -linjan tuotteelle tai tuotteille. Viittaan seuraa-viin tämäntyyppisiin julkaisuihin: S. Green et ai., J. Natl. Cancer Inst. 68(6) (1982) 997-1003 ("tumor necrosis-inducing factor"); M. Ruff et ai., J. Immunology 125(4) (1980) 1671-1677 ("tumor necrosis factor"); 15 H. Enomoto et al., EP-hakemus 86475 ("antitumor substance"); H. Oettgen et al., "Recent Results Cancer Res. 75 (1980) 207-212 ("tumor necrosis factor"); F. Kull et al., J. Immunol. 126(4) (1981) 1279-1283 ("Tumor Cell Cyto-; toxin"); D. Mannel et al., Infection and Immunity 28(1) 20 (1980) 204-211 ("cytotoxic factor"); N. Matthews et al.,

Br. J. Cancer 42 (1980) 416-422 ("tumor necrosis factor"); S. Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73(2) (1976) 381-385 ("serum factor"); N. Satomi et al., Jpn J. Exp. Med. 51(6) 1981 317-322; N. Matthews, Br. J. Cancer 25 40 (1979) 534-539 ("tumor necrosis factor"); K. Haranaka et al., Jpn. J. Exp. Med. 51(3) (1981) 191-194 ("tumor necrosis factor"); ja L. Old et al., EP-hakemus 90892: T. Umeda et al., Cellular and Molecular Biology 29(5) (1983) 349-352; ja H. Enomoto et al., EP-hakemus 86475.

30 Muuta kirjallisuutta, johon tulisi tutustua, ovat seuraavat julkaisut: J. Nisse-Meyer et al., Infection and *' Immunity 38(1) (1982) 67-73; J. Klostergaard et al., Mol.

Immunol. 18(12) (1981) 1049-1054; N. Sloane, US-patentti-julkaisu 4 359 415; H. Hayashi et al., US-patenttijulkai-35 su 4 447 355; K. Hanamaka et al., EP-hakemus 90 892 (1983); ja G. Grabger et al., Cellular Immunology 38 (1978) 388-402.

4 - 95472 EP-hakemusjulkaisussa 100 641 kuvataan sytotoksis-ta polypeptidiä, joka puhdistettiin suurin piirtein vapaaksi epäpuhtauksista ja joka saatiin ihmisen lymfoblas-toidisolu -viljelmästä. Tämä polypeptidi nimettiin lymfo-5 toksiiniksi, vaikka sen sukulaisuus muihin lymfotoksii- niksi kutsuttuihin, kirjallisuudessa kuvattuihin polypep-tideihin on arveluttava. Ei tiedetty, oliko tämä ainoa immuunisolujen tuottama sytotoksinen polypeptidi, kuten Zacharchuk et ai. (imid.) ehdottavat vai onko se mahdol-10 lisesti jäsen sytotoksisten tekijöiden ryhmässä.

Edellä mainitun hakemuksen mukaisessa polypepti-dissä on kaksi aminopäätä, suurempi muunnos päättyy jaksoon Leu Pro Gly Vai Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr ... , 15 ja pienempi muunnos typistettyyn aminopäähän His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala ...

Aiemman kirjallisuuden mukaan interferonit, joilla on jonkin verran kasvaimia estävää aktiivisuutta ja heikosti karakterisoitu proteiini, jolla on AlaAla-aminopää 20 (GB-hakemusjulkaisu 2 117 385A) olivat ehdokkaita syto- toksisiksi tekijöiksi, jotka eivät ole lymfotoksiineja. Kuten tullaan havaitsemaan, tämän keksinnön mukaisesti valmistettava tuumorinekroositekijä ei ole interferoni eikä lymfotoksiini eikä siinä ole AlaAla-aminopäätä. Tä-25 män keksinnön päämääränä on (a) määrittää lopullisesti, onko olemassa muuta tuumorinekroositekijää kuin lymfotoksiini vai ei ja jos sellainen on olemassa, identifioida se sillä tavalla, että se selvästi erottuu muista tällaisista tekijöistä; (b) tuottaa tällaista tekijää muilla 30 menetelmillä kuin soluviljelmän indusoinnilla, joka on kallis ja tuottaa tuotetta, joka sisältää epäpuhtautena indusointiainetta tai induktoimalla ääreisverilymfosyyt-tejä, joka on taloudellisesti epäkäytännöllistä, heikosti toistettavissa ja tuottaa homologisilla soluja plasmapro-35 telineillä kontaminoituneen tuotteen; (c) saada aikaan tällaista tuumorinekroositekijää koodaava DNA ja ilmentää tämä DNA yhdistelmäviljelmelmässä; (e) muuntaa tällaisen il i KIS! I l ! a ; - 95472 5 tekijän koodausjaksoa tai rakennetta; (f) formuloida tällainen tekijä terapeuttisiin annostelumuotoihin ja antaa sitä eläimille kasvainten hoitamiseksi; ja (g) tuottaa tällaiseen tekijään liittyviä diagnostisia reagensseja.

5 Sytotoksinen tekijä on puhdistettu homogeeniseksi, karakterisoitu ja sitä on ilmennetty yhdistelmäviljelmäs-sä. Tätä tekijää kutsutaan mukavuuden vuoksi tuumorinek-roositekijäksi (TNF), ja se määritellään jäljempänä. Keksinnön mukaisesti valmistettava TNF ja sen mutantti on 10 määritelty vaatimuksen johdannossa. Se saadaan soluviljelmästä suurin piirtein homogeenisessa muodossa, jonka ominaisaktiivisuus on suurempi kuin noin 10 miljoonaa yk-sikköä/mg proteiinia ja yleisesti noin 100 miljoonaa yk-sikköä/mg. Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen tuu-15 morinekroositekijän tai sen mutantin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Yhdistelmäviljelmässä syntetisoidulle ihmisen tuu-morinekroositekij älle on luonteenomaista sellaisten solu-. komponenttien, proteiinit mukaan luettuina, läsnäolo, ·’ 20 jotka eivät ole ihmissoluista peräisin ja jotka esiinty vät sellaisina määrinä ja ovat luonteeltaan sellaisia, että ne ovat fysiologisesti soveltuvia annettaviksi potilaille yhdessä tuumorinekroositekijän kanssa. Nämä komponentit ovat yleensä peräisin hiivasta, prokaryootista tai . . 25 muusta korkeammasta eukaryootista kuin ihmisestä ja niitä esiintyy vaarattomina kontaminoivina määrinä, jotka ovat suuruusluokaltaan alle noin 1 paino-%. Yhdistelmäsoluvil-jelmä tekee lisäksi mahdolliseksi tuumorinekroositekijän tuottamisen täydellisesti vapaana homologisista proteii-30 neista. Homologiset proteiinit ovat proteiineja, joita normaalisti liittyy tuumorinekroositekijään sen esiin-tyessä luonnossa, ts. soluissa, solueritteissä ja elimistön nesteissä. Eräs ihmisen tuumorinekroositekijälle homologinen proteiini on esimerkiksi ihmisen seerumialbu-35 miini. Heterologisten proteiinien kohdalla tilanne on päinvastainen, ts. ne eivät luonnossa liity kyseessä olevaan tuumorinekroositekijään eivätkä esiinny yhdessä sen kanssa.

6 95472

Keksintö tarjoaa käytettäväksi DNA:n, joka koodaa ihmisen tuumorinekroositekijää ja joka ilmennettynä yhdistelmä- eli transformanttiviljelmässä tuottaa runsaita määriä tuumorinekroositekijää. Tämä DNA on uusi, koska 5 cDNA, joka saadaan indusoidusta monosyyttisolulinjasta saadusta mRNA:sta käänteiskopioinnilla, ei sisällä intro-neja ja on vapaa mahdollisista reuna-alueista, jotka koo-daavat organismien, joista mRNA on peräisin, muita proteiineja. Keksinnön mukaiselle DNA:lie on tunnusomaista 10 se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään.

Kromosomaalinen DNA, joka koodaa TNF:ää, saadaan tutkimalla genomi-DNA-kirjastoja käyttäen cDNA:ta koettimena. Kromosomaalinen DNA on vapaa muita proteiineja koo-daavista reuna-alueista, mutta voi sisältää introneja.

15 Eristettyä tuumorinekroositekijä-DNA:ta on helppo muuntaa nukleotidisubstituutiolla, -deleetoilla tai -in-sertioilla, jolloin saadaan uusia DNA-jaksoja, jotka koo-daavat tuumorinekroositekijää tai sen johdoksia. Näitä : muunnettuja jaksoja käytetään mutanttituumorinekroosi- • · < * 20 tekijän tuottamiseen ja valmiin tuumorinekroositekijän suoraan ilmentämiseen. Muunnetut jaksot ovat käyttökelpoisia myös tuumorinekroositekijän ilmentymistehon parantamiseen valituissa isäntä-vektorisysteemeissä, esimerkiksi muuntamalla jaksot isäntäsolun kodonipreferenssin 25 mukaisiksi.

Nämä uudet DNA-jaksot tai niiden fragmentit leimataan ja niitä käytetään hybridisaatiokokeissa, joissa tutkitaan tuumorinekroositekijää koodaavaa geneettistä materiaalia.

30 Menetelmissä tuumorinekroositekijän syntetisoimi- seksi DNA, joka koodaa tuumorinekroositekijää, ligatoi-daan replikoituvaan (lisääntyvään) vektoriin, vektorilla transformoidaan isäntäsolut, isäntäsoluja viljellään ja tuumorinekroositekijä otetaan talteen viljelmästä. Tätä 35 yleismenetelmää käytetään valmistettaessa tuumorinekroo sitekijä, jolla on monosyytin tuumorinekroositekijän ominaisuudet tai uusia tuumorinekroositekijän johdoksia, vektorin rakenteesta ja transformoitavaksi valitusta 95472 7 isäntäsolusta. Tuumorinekroositekijäspesieksiin, joita voidaan tällä tavalla syntetisoida, kuuluvat valmis (va-lyyliaminoterminaalinen) tuumorinekroositekijä, pretuumo-rinekroositekijä ("preTNF", määritelty tässä hakemukses-5 sa) ja TNF-johdokset mukaan luettuina (a) fuusioproteii-nit, joissa TNF tai jokin sen fragmentti on liittyneenä muihin proteiineihin tai polypeptideihin TNF:n tai sen fragmenttien amino- ja/tai karboksyyliterminaalisissa aminohapoissa olevien peptidisidosten kautta, (b) TNF-10 fragmentit valmis tuumorinekroositekijä ja preTNF-frag-mentit, joissa mahdollinen preproteiiniaminohappo on fragmentin aminoterminaalinen aminohappo, mukaan luettuina, (c) TNF:n tai sen fragmenttien (valmis tuumorinekroositekijä mukaan luettuna) mutantit, joissa yksi tai 15 useampi aminohapporyhmä on substituoitu, tuotu lisää tai poistettu ja/tai (d) edellä mainittujen proteiinien, fragmenttien tai mutanttien johdokset, joiden aminopäähän on lisätty metionyyli tai muunnettu metionyyli (kuten . formyylimetionyyli tai muu suojattu metionyylispesies).

·' · 20 Jos nisäkässolu transformoidaan (a) vektorilla, joka sisältää koko tuumorinekroositekijän rakennegeenin (5'-pään aloituskodoni mukaan luettuna) tai (b) valmista tuumorinekroositekijää tai tuumorinekroositekijäjohdosta koodaavalla geenillä, joka on ligatoitu eukaryootin eri-. . 25 tysesijaksoon (joka voi olla myös esijakso, joka saa ai kaan tuumorinekroositekijän erittymisen) ja solua viljellään, saadaan tavallisesti talteen valmista tuumorinekroositekijää viljelmästä.

Samalla tavalla, jos DNA, joka koodaa TNF:ää, li-30 gatoidaan vektorissa eritysesijaksoon, jota transformoi-tava isäntäsolu (tavallisesti organismi, josta mainittu esijakso on saatu) käsittelee oikealla tavalla, isäntä transformoidaan vektorilla ja sitä viljellään, syntetisoituu tuumorinekroositekijä, jossa ei ole aminoterminaa-35 lista metionyyliä tai suojattua metionyyliä. Erityisesti E. coli, joka on transformoitu vektoreilla, joissa valmista tuumorinekroositekijää koodaava DNA on ligatoitu 5'-päästään DNA:han, joka koodaa STII-enterotoksiinisig- - 95472 8 naalipolypeptidiä, käsittelee oikealla tavalla suuren osan hybridipreproteiinista valmiiksi tuumorinekroosi-tekijäksi. Voidaan myös valita sellaiset eritysesijaksot ja isäntäsolut, jotka johtavat valmiin proteiinin asian-5 mukaiseen kuljetukseen solun periplasmaan.

Kuvatulla yhdistelmämenetelmällä voidaan myös valmistaa muita tuumorinekroositekijäjohdoksia kuin aminohapposekvenssi- tai glykosylaatiomuunnokset. Tällaisille johdoksille on luonteenomaista kovalenttinen tai aggre-10 gaatin kautta tapahtuva liittyminen kemiallisiin ryhmiin. Nämä johdokset kuuluvat yleensä johonkin seuraavista kolmesta ryhmästä: suolat, kovalenttiset sivuketju- tai pää-teryhmämuunnokset ja adsorptiokompleksit.

Jos valmista tuumorinekroositekijää koodaava DNA 15 ligatoidaan vektoriin, vektorilla transformoidaan isäntä- solu ja solua viljellään, esiintyy valmista tuumorinekroositekijää solun sytoplasmassa. Siten on tarpeetonta rakentaa erityisjärjestelmiä valmiin tuumorinekroositeki-: jän saamiseksi. Tämä oli yllättävää, koska suora ilmenty kö minen tavallisesti saa aikaan metionyloituneen proteiinin. Proteiini on lisäksi pysyvä ja liukenee yhdistelmä-soluviljelmään, ts. se ei pilkkoudu solunsisäisten pro-teaasien vaikutuksesta eikä saostu. Siten on saatu aikaan uusia viljelmiä, jotka sisältävät alempien eukaryoottien 25 tai prokaryoottien soluja, joiden sytoplasmassa esiintyy metionyloitumatonta tuumorinekroositekij ää.

Vaikka tuumorinekroositekijää voidaan valmistaa viljelemällä eläinsolulinjoja, esimerkiksi monosyytti-solulinjaa, joka indusoidaan kasvattamalla 4-beta-forbo-30 li-12-myristaatti-13-asetaatin (PMA:n) läsnä ollessa tai immortaalisolulinjoja, kuten hybridoomia tai EBV-transformoituja soluja (US-patenttijulkaisu 4 464 465), on edullista syntetisoida tuumorinekroositekijää yhdistelmä-soluviljelmässä jäljempänä kuvattavalla tavalla.

35 Kun tuumorinekroositekijä on valmistettu fermen- toimalla, se yleensä puhdistetaan ottamalla talteen viljelmän supernatanttineste tai hajotetut solut, poistamalla kiinteä aines, adsorboimalla tuumorinekroositekijä 95472 g supernatanttiseoksesta (joka sisältää tuumorinekroosi-tekijän ja muita proteiineja) hydrofobiselle aineelle, eluoimalla tuumorinekroositekijä tältä aineelta, adsorboimalla tuumorinekroositekijä anioninvaihtohartsille 5 (edullisesti kvaternaarisilla aminoryhmillä substituoi-tu), jolla on suurin piirtein yhtenäinen hiukkaskoko ja eluoimalla tuumorinekroositekijä hartsilta. Tuumorinek-roositekijäkoostumuksia mahdollisesti väkevöidään ja puhdistetaan kromatografisin menetelmin missä tahansa puh-10 distusmenettelyn vaiheessa, esimerkiksi isoelektrisesti kokoamalla tai johtamalla seulontageelin, kuten Sephadex G-25:n, läpi.

yhdistelmä- tai indusoidusta soluviljelmästä saatu puhdistettu TNF yhdistetään terapeuttista käyttöä varten 15 fysiologisesti vaarattomiin stabilointiaineisiin ja apu aineisiin ja valmistetaan annostelumuotoon esimerkiksi kylmäkuivaamalla annostelupulloissa tai säilyttämällä stabiloituina vesipitoisina valmisteina. Vaihtoehtoisesti . tuumorinekroositekijä sisällytetään polymeerimatriisiin *" 20 istutettavaksi kasvaimiin tai leikkauskohtiin, joista on poistettu kasvaimia, jolloin saadaan aikaan tuumorinekroositeki jän pitkäaikainen vapautuminen paikallisesti suurena pitoisuutena.

Koostumukset saadaan tässä esitetyn mukaisesti va-., 25 paina kontaminoivista sytotoksisista tekijöistä, kuten lymfotoksiinista, interferoneista tai muista sytotoksisista proteiineista, joihin kirjallisuudessa viitataan. Terapeuttisissa sovellutuksissa on kuitenkin edullista yhdistää tuumorinekroositekijä ennalta määrättyihin mää-30 riin lymfotoksiinia ja/tai interferonia. Koostumukset, ·- jotka sisältävät tuumorinekroositekijää ja interferonia, kuten gammainterferonia, ovat erityisen käyttökelpoisia, koska niillä on havaittu olevan synergistinen sytotoksi-nen vaikutus.

35 Tuumorinekroositekijäkoostumuksia annetaan eläi mille, erityisesti potilaille, joilla on pahanlaatuisia kasvaimia, terapeuttisesti vaikuttavina annoksina. Asian- - 95472 10 tuntijoille ovat selviä hoidon yhteydessä soveltuvat annokset, kuten jäljempänä tarkemmin kuvataan.

Kuvio 1 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis- käyrää kontrolloidusta huokoslasista.

5 Kuvio 2 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis- käyrää dietyyliaminoetyyliselluloosasta.

Kuvio 3 esittää tuumorinektroositekijän eluoitu-miskäyrää nopeassa proteiini-nestekromatografiässä.

Kuvio 4 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis-10 käyrää kromatofokusoinnissa.

Kuvio 5 esittää tuumorinekroositekijän molekyyli-painoa SDS-PAGE-geelielektroforeesilla määritettynä.

Kuvio 6 esittää tuumorinekroositekijän molekyyli-painoa HPLC-eluutiolla määritettynä.

15 Kuvio 7 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis- käyrää HPLC-C4-kolonnista.

Kuvio 8 valaisee tuumorinekroositekijän trypsiini-pilkkomisfragmenttien erottumista HPLC:llä. j Kuvio 9 valaisee gamma-interferonin ja tuumorinek- 20 roositekijän seosten sytotoksista vaikutusta.

Kuviossa 10 esitetään ihmisen pretuumorinekroositeki jän, tuumorinekroositekijän koko eritysesijakso mukaanluettuna, nukleotidi- ja aminohapposekvenssi.

Kuvio 11 esittää tuumorinekroositekijän ilmenty-25 misvektorin muodostamista.

Tuumorinekroositekijä määritellään polypeptidiksi, joka on muu kuin lymfotoksiin! ja jolla on kyky saada aikaan preferentiaalinen sytotoksinen vaikutus ja joka sisältää alueen, jossa esiintyy funktionaalisten aminohappo pojen homologiaa kuviossa 10 esitetyn valmiin tuumorinek- ” roositekijän aminohapposekvenssin, sen fragmentin tai tällaisen polypeptidin tai fragmentin johdoksen kanssa.

Preferentiaalinen sytotoksinen aktiivisuus on määritelmän mukaan kasvainsolujen tuhoamista tai niiden kas-35 vun estämistä ensisijaisesti verrattuna normaalisoluihin samoissa olosuhteissa. Preferentiaalisen sytotoksisen aktiivisuuden detektointi tapahtuu tarkastelemalla polypep- il an i mu ι i j „ - 95472 tidin vaikutusta kasvainsoluihin in vivo tai in vitro verrattuna vaikutukseen normaalisoluihin tai -kudokseen. Solujen hajoaminen on yleensä diagnostisena osoituksena in vitro, kun taas kasvainten nekroosi määritetään kokein in 5 vivo. Sytotoksisesta aktiivisuudesta voi kuitenkin olla osoituksena myös sytostaasi tai antiproliferatiivinen aktiivisuus. Soveltuvat koejärjestelyt ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi jäljempänä kuvattava solujenhajotuskoe, jota käytetään tuumorinekroositekijän ominaisaktiivisuuden mää-10 rittämiseen, on hyväksyttävä, samoin kuin koe, jota kuvaavat B. Aggarwal et ai. teoksessa "Thymic Hormones and Lymphokines", toim. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center, 1983 (tässä julkaisussa mainittu solulinja A549 on 15 saatavana ATCC:sta numerolla CCL185).

TNF:n ominaisaktiivisuutta kuvataan kohdesolujen hajoamisella sytostaasin sijasta. Yksi yksikkö tuumorinekroositeki jää määritellään siksi määräksi, joka vaaditaan kuhunkin syvennykseen esimerkin 1 mukaisesti levitettyjen ·· 20 kohdesolujen hajottamiseksi 50-%:isesti. Tällä ei kuiten kaan ole tarkoitus sulkea pois muita kokeita ominaisaktiivisuuden mittaamiseksi, esimerkiksi menetelmiä, jotka perustuvat kohdesolujen kasvunopeuteen.

PreTNF on tuumorinekroositekijäspesies, joka sisäl-25 tyv edellä esitettyyn tuumorinekroositekijän määritelmään. Sille on luonteenomaista se, että molekyylissä on signaali-(eli esi-) polypeptidi, joka luennan jälkeen ohjaa proteiinin johonkin kohtaan solussa tai sen ulkopuolella. Yleensä signaalipolypeptidi (jolla itsellään ei ole tuumorinekroo-30 siaktiivisuutta) lohkeaa proteolyyttisesti proteiinin muusta osasta, jolla on tuumorinekroositekijäaktiivisuus, osana erittymisprosessia, jossa proteiini siirtyy isäntäsolun periplasmaan tai kasvualustaan. Signaalipeptidi voi olla mikrobin tai nisäkkään peptidi (luontainen, 76-ryhmäinen 35 esijakson mukaan luettuna), mutta edullisesti se on signaali, joka on homologinen isäntäsolulle.

95472 12

Normaaleista biologisista lähteistä saatavan luontaisen tuumorinekroositekijän arvioitu molekyylipaino on noin 17 000 natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigee-lielektroforeesilla (SDS-PAGE) tässä kuvatulla tavalla mää-5 ritettynä, isoelektrinen piste on noin 5,3, ja polypeptidi on herkkä trypsiinihydrolyysille useasta kohtaa. RP-HPLC:llä puhdistettu luonnon tuumorinekroositekijä hydrolysoituu trypsiinillä vähintään yhdeksäksi fragmentiksi tässä hakemuksessa kuvatuissa olosuhteissa. Fragmenttien, joiksi tuu-10 morinekroositekijä hydrolysoituu trypsiinin vaikutuksesta, lukumäärä riippuu sellaisista tekijöistä kuin trypsiinin aktiivisuus, tuumorinekroositekijäpitoisuus ja inkubointi-parametrit, ionivahvuus, pH, lämpötila ja inkubointiaika mukaan luettuina.

15 Tuumorinekroositekijä ei näytä olevan glykoproteii- ni, se ei pidäty lektiiniaffiniteettikolonneihin ja päätellyn aminohapposekvenssin analysointi ei osoita todennäköisiä glykolysoitumiskohtia. Myös yhdistelmä- E. coli -viljelmässä tuotettu materiaali (jolla ei ole glykosyloitumis- m 20 kykyä) liikkuu yhdessä luonnon TNF:n kanssa SDS-PAGE:ssa.

Aminohapposekvenssihomologia-aste, joka tuo polypep-tidin tässä annetun tuumorinekroositekijän määritelmän piiriin,· vaihtelee riippuen siitä, osuuko ehdokasproteii-nin ja tuumorinekroositekijän välinen homologisuus sytotok-25 sisen aktiivisuuden aikaan saavien tuumorinekroositekijän • - alueiden sisä- vai ulkopuolelle; alueilla, jotka ovat ratkaisevia sytotoksiselle aktiivisuudelle, pitäisi olla korkea homologia-aste, jotta polypeptidi olisi määritelmän mukainen, kun taas jaksoissa, jotka eivät liity tuumori-30 nekroositekijän rakenteen ylläpidon tai reseptoreihin si-. toutumisen aikaansaamiseen, voi homologisuus olla suhteel- .·· lisen alhainen. Ratkaisevat alueet voivat lisäksi olla sy- tolyyttisesti aktiivisia ja tässä määritellyllä tavalla homologisia, jos ryhmiä, jotka sisältävät funktionaalisesti 35 samanlaisia aminohapposivuketjuja, korvautuu toisinaan. Funktionaalisesti samanlainen viittaa sivuketjujen .. 95472 13 vallitseviin ominaisuuksiin, kuten emäksisyys, neutraalisuus tai happamuus tai eteerisen esteen läsnä- tai poissa olo. Tässä määritelty tuumorinekroositekijä ei kuitenkaan missään tapauksessa ole lymfotoksiini.

5 Tuumorinekroositekijäksi määritelty polypeptidi si sältää yleensä kuvion 10 mukaisen proteiinin tai sen fragmentin kanssa suurin piirtein homologisia alueita, jotka ovat jatkuvan 20-100 aminohappoa käsittävän jakson mittaisia, erityisesti ryhmien 35 ja 66 sekä 110-133 välisten 10 jaksojen kanssa homologisia alueita.

Merkittävin tekijä polypeptidin määrittelemisessä tuumorinekroositekijäksi on antiseerumien, joilla on kyky oleellisilta osiltaan kumota kuvion 10 mukaisen valmiin tuumorinekroositekijän sytolyyttinen aktiivisuus, kyky ku-15 mota oleellisilta osiltaan myös kyseessä olevan polypeptidin sytolyyttinen aktiivisuus. On kuitenkin otettava huomioon, etteivät immunologinen ja sytotoksinen luonne ole välttämättä toisensa kattavia. Kuvion 10 mukaisen tuumorinekroositeki jän aktiivisuuden kumoava vasta-aine ei ehkä 4 20 sitoudu ehdokkaana olevaan proteiiniin, koska aktiivisuuden kumoava vasta-aine sitoutuu spesifisesti tuumorinekroositeki jän sellaiseen kohtaan, joka ei ole ratkaiseva syto-toksisen aktiivisuuden kannalta. Vasta-aine saattaa sitoutua proteiinin vaikutuksen kannalta merkityksettömään koh-25 taan ja saada aikaan kumoavan vaikutuksensa steerisen esteen kautta. Siksi ehdokkaana oleva proteiini, jossa on mutaatio tällä merkityksettömällä alueella, ei enää sido vaikutuksen kumoavaa vasta-ainetta, mutta on siitä huolimatta tuumorinekroositekijä huomattavan homologian ja bio-30 logisen aktiivisuuden kannalta katsottuna.

.>t . On tärkeää ottaa huomioon, että kuvion 10 mukaisel le luonnon eli villin tyypin valmiille ihmisen tuumorinekroositeki jälle, joka on saatu ääreislymfosyytti- tai solu-linjaviljelmistä, annetut ominaisuudet, kuten molekyylipai-35 no, isoelektrinen piste ja vastaavat, ovat kuvaavia vain tuumorinekroositekijän luonnossa esiintyville spesieksille.

14 - 95472

Edellä esitetyn määritelmän mukaisiin tuumorinekroosite-kijoihin kuuluu spesieksiä, joilla ei ole luonnon tuumori-nekroositekijän kaikkia luontaisia ominaisuuksia. Vaikka tässä määritelty käsite tuumorinekroositekijä sisältää 5 luonnon tuumorinekroositekijän, sisältyy määritelmän piiriin muitakin sille sukua olevia sytotoksisia polypeptide-jä. Esimerkiksi sellaiset TNF-johdokset kuin insertiomu-tantit, deleetiomutantit ja fuusioproteiinit, joita edellä kuvattiin, eroavat molekyylipainoltaan luonnossa esiinty-10 västä ihmisen tuumorinekroositekijästä (fuusioproteiineil-la valmiin tuumorinekroositekijän kanssa tai itse preTNF:llä samoin kuin insertiomutanteilla on suurempi molekyylipaino kuin valmiilla luonnon tuumorinekroositekijällä, kun taas luonnossa esiintyvän valmiin tuumorinekroositekijän delee-15 tiomutanttien molekyylipaino on pienempi). Tuumorinekroo-sitekijää voidaan myös käsitellä alttiuden hydrolysoitua trypsiinin tai muiden proteaasien vaikutuksesta vähentämiseksi tai poistamiseksi. Lopuksi mainittakoon, että ihmisen preTNF:n luennan jälkeinen prosessointi solulinjois-20 sa, jotka ovat peräisin muista nisäkkäistä kuin kädellisistä, voi johtaa mikroheterogeenisuuteen aminoterminaa-lisella alueella, niin että aminoterminaalisena aminohappona ei enää ole väliini.

Ihmisen tuumorinekroositekijän aminohapposekvenssi, 25 joka on päätelty sen cDNA:sta, esitetään kuviossa 10. Valmista eli luonnossa'esiintyvää tuumorinekroositekijää vastaavat aminohapot 1-157. Tämä jakso sisältää 76 ryhmästä koostuvan signaalijakson, jonka uskotaan poistuvan luetun transkriptin normaalissa prosessoinnissa valmiiksi pro-30 teiiniksi. Trypsiinihydrolyysikohdat osoitetaan nuolin.

V Huomaa, että ilmaus "kykenevä" sytotoksiseen aktii- • · visuuteen tai tuumorinektroosiin in vivo tarkoittaa sitä, että termin "tuumorinektroositekijä" piiriin kuuluvat poly-peptidit, joita voidaan muuttaa esimerkiksi entsymaattisel-35 la hydrolyysillä, epäaktiivisesta, tsymogeenin kanssa - 95472 15 analogisesta tilasta polypeptidifragmentiksi, jolla on haluttu biologinen vaikutus. Tyypillisiä epäaktiivisia esiasteita ovat fuusioproteiinit, joissa valmis tuumorinekroo-sitekijä on liittyneenä karboksyylipäästään peptidisidok-5 sen kautta johonkin ihmisproteiiniin tai sen fragmenttiin. Tämän peptidisidoksen kohdalla tai sen lähellä oleva sekvenssi on siten valittu, että se on herkkä proteolyyttisel-le hydrolyysille, jolloin tuumorinekroositekijä vapautuu joko in vivo tai, osana valmistusohjelmaa, in vitro. Siten 10 muodostuneella tuumorinekroositekijällä on tällöin määritelmän edellyttämä sytotoksinen aktiivisuus.

Vaikka tuumorinekroositekijällä yleensä tarkoitetaan ihmisen tuumorinekroositekijää, kuuluvat sellaisista lähteistä kuin hiiri, seka, hevonen tai nauta peräisin olevat 15 tuumorinekroositekijät tuumorinekroositekijän määritelmän piiriin, kunhan ne muutoin täyttävät edellä kuvatut homologisia alueita ja sytotoksista aktiivisuutta koskevat vaatimukset. TNF ei ole lajispesifinen, ihmisen TNF vaikuttaa esimerkiksi hiiren kasvaimiin. Jonkin lajin TNF:ää voidaan 20 siten käyttää toisen lajin hoidossa.

Tuumorinekroositekijä-nimikkeen alle kuuluvat myös multimeeriset muodot. Tuumorinekroositekijä aggregoituu spontaanisti multimeereiksi, tavallisesti dimeereiksi tai korkeammiksi multimeereiksi. Multimeerit ovat sytotoksisia 25 ja siten soveltuvia käytettäviksi terapiaan in vivo. Vaik-• ka on toivottavaa ilmentää ja ottaa talteen tuumorinekroo sitekijä suurin piirtein homogeenisena multimeerinä tai monomeerinä, voidaan tuumorinekroositekijä käyttää terapeuttisesti erilaisten multimeerien seoksena.

30 Tuumorinekroositekijän johdokset sisältyvät tuumo rinekroositeki jä-termin piiriin. Johdoksiin kuuluvat ami-nohapposekvenssimutantit, glykosyloitumismuunnokset ja ko-valenttisesti tai aggregoitumalla muodostuneet yhteenliittymät muiden kemiallisten ryhmien kanssa. Kovalenttisia 35 johdoksia valmistetaan liittämällä funktionaalisia ryhmiä TNF-aminohapposivuketjuissa tai N- tai C-päässä esiintyviin 16 - 95472 ryhmiin alalla tunnetuin keinoin. Näihin johdoksiin kuuluvat esimerkiksi: karboksyylipään tai karboksyylisivuketjuja sisältävien ryhmien, esimerkiksi asp10:n alifaattiset esterit tai amidit; hydroksyyliryhmän sisältävien aminohap-5 poryhmien, kuten ser52:n, ser3:n, ser4:n tai ser5:n, O-asyy-lijohdokset; aminoterminaalisen aminohapon tai aminoryhmän sisältävien aminohapporyhmien, esimerkiksi lysiinin tai ar-giniinin, N-asyylijohdokset; ja cys101:n ja cys69:n johdokset. Asyyliryhmä on alkyyliryhmä (C3_1Q-n-alkyylit mukaan 10 luettuina), jolloin muodostuu alkanoyylijohdos tai karbosyk-linen tai heterosyklinen yhdiste, jolloin muodostuu aroyy-lijohdos. Reaktiiviset ryhmät ovat edullisesti difunktio-naalisia yhdisteitä, joita sinänsä tiedetään käytettävän proteiinien silloittamiseen liukenemattomiksi matriiseiksi 15 reaktiivisten siuryhmien kautta. Edullisia johdosten muo-dostuskohtia ovat kysteiini- ja histidiiniryhmät.

Kovalenttiset tai aggregaattijohdokset ovat hyödyllisiä reagensseja immuunitutkimukseen ja affiniteettipuh-distuksiin. Tuumorinekroositekijä voidaan esimerkiksi tehdä 20 liukenemattomaksi sitomalla se kovalenttisesti syanogeeni-bromidilla aktivoituun Sepharose-geeliin sinänsä tunnetuin menetelmin tai adsorboida polyolefiinipinnoille (mahdollisesti glutaarialdehydisilloituksen avulla) käytettäväksi anti-TNF-vasta-aineiden tai solujen pintareseptorien tut-25 kimiseen tai puhdistukseen. Tuumorinekroositekijä voidaan myös leimata detektoitavissa olevalla ryhmällä, esimerkiksi radiojodata kloramiini T -menettelyllä, sitoa kovalenttisesti harvinaisia maametalleja sisältäviin kelaatteihin tai liittää johonkin muuhun fluoresoivaan ryhmään, käytet-30 täväksi diagnostisissa tutkimuksissa, erityisesti biologisten näytteiden TNF-pitoisuuksien mittaamiseen kompeti-. tiivistä tyyppiä oleville immuunitutkimuksilla. Tällaiset johdokset voivat olla edellä annetun TNF:n määritelmän ulkopuolella, koska ei ole välttämätöntä, että niillä on sy-35 totoksinen vaikutus, vaan ristireaktiivisuus anti-TNF:n kanssa riittää.

17 - 95472

Tuumorinekroositekijän mutanttijohdoksiin kuuluvat ennalta määrätyt/ ts. paikkaspesifiset, TNF:n tai sen fragmenttien mutantit. Mutanttien muodostuksen tarkoituksena on saada aikaan DNA/ joka koodaa edellä määritellyn kal-5 täistä tuumorinekroositekijää/ ts. tuumorinekroositekijää, jolla on sytotoksinen vaikutus kasvainsoluihin in vitro tai joka aiheuttaa kasvainsolujen kuoleman in vivo ja jolla on jäljellä homologiaa kuvion 10 mukaisen sekvenssin kanssa, mutta jolla on myös parantuneet ominaisuudet ja paran-10 tunut aktiivisuus. Mutanttituumorinekroositekijä määritellään polypeptidiksi, joka muuten täyttää tässä hakemuksessa aiemmin annetun tuumorinekroositekijän homologiamääritel-män ehdot, mutta jonka aminohapposekvenssi eroaa tuumorinekroositeki jän sekvenssistä deleetion, substituution tai 15 insertion kautta. Tuumorinekroositekijän lysiini- tai argi-niiniryhmät (arginiini 2, 6, 82, 44 ja 131 ja lysiini 98, 90 ja 85) voidaan esimerkiksi vaihtaa histidiiniin tai muuhun aminohapporyhmään, joka ei tee proteiinista proteolyyt-tisesti labiilia. Samoin voitaisiin kysteiini 101 korvata 20 muilla ryhmillä ja silloittaa kemiallisesti stabiilisuuden antamiseksi hapettumista vastaan. Ei ole välttämätöntä, että mutantit täyttävät tuumorinekroositekijälle asetetut aktiivisuusvaatimukset, koska jopa biologisesti inaktiiviset mutantit ovat käyttökelpoisia reagensseina immuunitut-25 kimuksissa. Tässä tapauksessa tulee mutantissa kuitenkin * säilyä ainakin yksi epitooppinen kohta, joka reagoi tuumo rinekroositeki jän vasta-aineen kanssa.

Tuumorinekroositekijän alueet, jotka ovat ryhmien 35-66 ja 110-133 välillä mainitut ryhmät mukaan luettuina, 30 ovat merkittävässä määrin homologisia (50-%:isesti) lymfo-toksiinin kanssa. Näiden kahden molekyylin hydrofobiset *: karboksyylipäät (tuumorinekroositekijän ryhmät 150-157) ovat myös merkittävästi samanlaiset. Koska molemmilla proteiineilla on sytotoksinen vaikutus tai kasvainsolujen tap-35 pamiskyky in vivo, uskotaan näiden alueiden olevan tärkeitä lymfotoksiinin ja tuumorinekroositekijän yhteisen 18 - 95472 aktiivisuuden kannalta. Siten näillä alueilla olevat ryhmät ovat edullisia muutettaviksi silloin, kun mutageneesin tarkoituksena on vaikuttaa suoraan tuumorinekroositekijän vaikutukseen tiettyyn soluun. Tuumorinekroositekijän ryh-5 mien 67—109 välisen suhteellisen paljon muuttuneen alueen tehtävänä saattaa olla sitä ympäröivien kahden suhteellisen homologisen alueen sijoittaminen sytotoksisen vaikutuksen kannalta välttämättömään oikeaan konformaatioon. Tällaisen sijoittamisen, jonka voisi saada aikaan tuumorinek-10 roositekijässä oleva Cys69-Cys101-disulfidisilta, voisi samalla tavalla saada aikaan lymfotoksiinin vastaava alue ja se voi olla syynä eroihin näiden kahden molekyylin spesifisyydessä ja aktiivisuudessa. Tässä yhteydessä mainittakoon, että koska näiden ryhmien otaksutaan muodostavan tuu-15 morinekroositekijän aktiivisen ytimen, voidaan ne syntetisoida kemiallisesti tai deleetiomutageneesin kautta typistettyinä, lyhyinä polypeptideinä, joilla on tuumorinekroo-sitekijävaikutus.

Vaikka mutaatiokohta on ennalta määrätty, ei itse 20 mutaation tarvitse olla määrätty ennalta. Esimerkiksi (asema 131) -mutanttien tehon optimoimiseksi voidaan tehdä sattumanvarainen mutageneesi arginiinia 131 vastaavan kodonin kohdalla ja tutkia ilmentyneet tuumorinekroositekijämutan-tit sytotoksisen aktiivisuuden ja proteaasinkeston optimaa-25 lisen yhdistelmän löytämiseksi. Menetelmät substituutio-mutaatioiden aiheuttamiseksi sekvenssiltään tunnetun DNA:n ennalta määrättyihin kohtiin ovat tunnettuja, esimerkiksi M13-alukemutageneesi.

Tuumorinekroositekijän mutageneesi toteutetaan teke-30 mällä aminohappoinsertioita, tavallisesti noin 1-10 aminohapon mittaisia tai noin 1-30 ryhmän deleetioita. Substi-: tuutioita, deleetioita, insertioita tai näiden mitä tahan sa kombinaatioita voidaan yhdistää toisiinsa lopullisen rakenteen aikaansaamiseksi. Insertioihin sisältyvät amino-35 tai karboksyyliterminaaliset fuusiot, esimerkiksi karbok-syylipäähän lisätty hydrofobinen jatke. Edullisesti tehdään - 95472 19 kuitenkin vain substituutiomutaatioita. On ilmeistä, etteivät koodaavan DNA:n mutaatiot saa saattaa jaksoa lukukehyksen ulkopuolelle ja on edullista, etteivät ne synnytä komplementaarisia alueita, joista voisi syntyä sekundaa-5 rinen mRNA-rakenne.

Kaikki tuumorinekroositekijää koodaavan DNA:n mutaatiot eivät ilmenny lopullisessa erittyneessä tuotteessa. Tärkeä ryhmä DNA-substituutiomutaatioita ovat esimerkiksi mutaatiot, joissa erilainen eritysesijakso tai signaali on 10 korvannut ihmisen luontaisen eritysesijakson joko esijaksossa tehtyjen deleetioiden tai substituutioiden kautta, joissa luontainen esijakso tai suurin osa siitä vaihdetaan esijaksoon, jonka isäntä, jota aiotaan käyttää, todennäköisemmin tunnistaa. Muodostettaessa esimerkiksi prokaryootti-15 ilmentymisvektoria ihmisen eritysesijakso poistetaan bakteerin alkalisen fosfataasin tai lämpöstabiilin enterotok-siini II:n esijaksojen eduksi ja hiivaa varten tämä esijakso korvataan hiivan invertaasin, alfa-tekijän tai happaman fosfataasin esijaksojen eduksi. Ihmisen eritysesijakson 20 voivat kuitenkin tunnistaa muutkin isännät kuin ihmissolu-linjat, todennäköisimmin korkeampien eukaryoottien viljelmässä olevat solut. Kun isäntä "tunnistaa" eritysesijakson, fuusioproteiini, joka koostuu tuumorinekroositekijäs-tä ja esijaksosta, katkeaa esijakson ja tuumorinekroosi-25 tekijän välisen peptidisidoksen kohdalta niiden tapahtumien yhteydessä, jotka johtavat tuumorinekroositekijän erittymiseen. Siten, vaikka isännän transformointiin käytettäisiin mutantti-preTNF-DNA:ta ja välituotteena syntetisoituu mutantti-preTNF:ää, on tuotteena oleva tuumorinek-30 roositekijä tavallisesti luontainen valmis tuumorinekroo-sitekijä.

Toinen tärkeä ryhmä DNA-mutantteja, jotka eivät ilmenny tuumorinekroositekijäjohdoksina, ovat nukleotidi-substituutiot, joita tehdään ilmentymisen edistämiseksi, 35 pääasiallisesti aminoterminaalisten silmukoiden välttämi- - 95472 20 seksi tai kodonien, joita valitun isännän on helpompi kopioida, esimerkiksi tunnettujen E. coli -preferenssi-kodonien E. coli -ilmentymistä varten, aikaansaamiseksi.

Oleellisilta osiltaan homogeenisella tuumorinekroo-5 sitekijällä tarkoitetaan tuumorinekroositekijää, joka on suurin piirtein vapaa muista proteiineista, jotka ovat luontaisia lähteelle, josta tuumorinekroositekijä eristet-tiin. Tämä tarkoittaa sitä, että homogeeninen tuumorinek— roositekijä on suurin piirtein vapaa veren plasmaproteii-10 neista, kuten albumiinista, fibrinogeenista, seriinipro- teaaseista, OC—globuliineista, sytotoksisista polypeptideis— tä, jotka eivät ole tuumorinekroositekijöitä, kuten lymfo-toksiinista ja interferoneista ja tuumorinekroositekijäsyn— teesipaikkana toimivan solun tai organismin muista prote-15 iineista, kokonaiset solut ja hiukkasmaiset solujätteet mukaan luettuina. Homogeeninen tuumorinekroositekijä voi kuitenkin sisältää sellaisia aineita kuin jäljempänä kuvattavia stabilointi- ja täyteaineita, ennalta määrättyjä määriä synteesipäikkana toimivan solun tai organismin pro— 20 teiineja, proteiineja, jotka ovat lähtöisin muista kuin tuumorinekroositekijän lähdesoluista tai -organismeista ja synteettisiä polypeptidejä, kuten poly-L-lysiiniä. Yhdistelmä tuumorinekroositekijä, joka ilmentyy allogeeni-sessä isäntäsolussa, esimerkiksi bakteerissa, ilmentyy 25 luonnollisesti täysin vapaana geenilähteen proteiineista.

Tuumorinekroositekijä syntetisoidaan edullisesti yhdistelmäorganismiviljelmissä. Ääreisverilymfosyytit (PBL:ät) ja solulinjat eivät ole toivottavia. Käytännössä on vaikeaa saada jonkin ryhmän PBL:iä, jotka ovat vapaita 30 muiden ryhmien solujen aiheuttamasta kontaminaatiosta, esi-; merkiksi B- tai T-soluista vapaita makrofageja. Tällainen kontaminaatio tekee mainittujen solujen tuotteiden erottamisen vaikeammaksi kontaminoivien solujen mahdollisesti vapauttamien sytotoksisten tekijöiden ja proteiinien vuok-35 si. Muista kuin yhdistelmäviljelmistä saatava tuumorinek- ίΒ ittc Bitti I t I ** 95472 21 roositekijästä, joten näiltä viljelmiltä puuttuu yhdistel-mäviljelmän joustavuus tuumorinekroositekijän ominaisuuksien parantamiseksi.

DNA, joka koodaa tuumorinekroositekijää, saadaan ke-5 miallisella synteesillä, PBL- tai solulinjaviljelmistä saatavan mRNA:n käänteiskopiointituotteita tutkimalla tai tutkimalla mistä tahansa solusta peräisin olevien genomikir-jastoja. Soveltuvia solulinjaviljelmiä ovat monosyyttiso-lulinjat, kuten promyelosyyttisolulinjat, joista käytetään 10 merkintää "HL-60" (ja joista eräs on saatavana ATCCrstä numerolla CCL 240) tai histiosyyttinen lymfoomasolulinja U 937 (ATCC CRL 1593). Nämä ja muut solulinjat indusoidaan ilmentämään ja erittämään tuumorinekroositekijää altistamalla solut alalla tunnetuille kemiallisille tai fysikaa-15 lisille tekijöille, yleensä kasvaimia aiheuttaville tai mitogeenisille tekijöille. Tuumorinekroositekijä voidaan indusoida tietyissä monosyyttisolulinjoissa tehokkaasti vain PMA:lla; muuten tavanomaiset aineet, kuten lipopoly-sakkaridi, stafylokokkaalinen enterotoksiini B tai tymosii-. 20 ni ¢¢-1 , eivät olleet yhtä tehokkaita kuin PMA tuumorinek roositekijän indusoimiseksi näissä solulinjoissa. Koska täytyy tehdä vaihtelevia määriä tutkimuksia tuumorinekroo-sitekijää ilmentävän (ja siten haluttua mRNArta sisältävän) solulinjan paikallistamiseksi, saattaa olla tehokkaam-25 paa yksinkertaisesti syntetisoida geeni. Synteesi on edullinen, koska sen avulla voidaan muodostaa ainutkertaisia restriktiokohtia (jolloin on mahdollista käyttää geeniä vektoreissa, jotka sisältävät restriktiokohtia, joita muutoin esiintyisi luontaisessa sekvenssissä) ja suorittaa 30 luentatehoa parantavia toimenpiteitä, joita käsitellään • jäljempänä.

Tämä DNA leimataan kovalenttisesti detektoitavissa olevalla aineella, kuten fluoresoivalla ryhmällä, radioaktiivisella atomilla tai kemiluminesoivalla ryhmällä, sinän-35 sä tunnetuin menetelmin. Sitten sitä käytetään tavanomaisiin hybridisaatiotutkimuksiin. Tällaisia tutkimuksia 95472 22 käytetään TNF-vektoreiden ja transformanttien identifioimiseen tämän hakemuksen esimerkeissä kuvattavalla tavalla tai in vitro -diagnooseihin, kuten TNF-mRNA:n havaitsemiseen punasoluista.

5 TNF:ää vastaavaa mRNAita on yllättävästi suhteelli sen vähän jopa indusoiduissa HL-60-soluissa, mikä ehkä johtuu tuntemattomien tekijöiden aiheuttamasta lähetti-RNA:n epästabiilisuudesta. Lisäksi aika, joka kuluu TNF-mRNA:n ilmaantumiseen solun indusoinnista lukien, on tärkeä. TNF-10 mRNAita ilmaantuu soluihin vain lyhyeksi ajaksi noin neljän tunnin kuluttua indusoinnista. Tässä suhteessa sen ilmaantuminen on erilainen kuin lymfotoksiinin, joka ilmaantuu noin 12 tunnin kuluttua indusoinnista. Tästä syystä jää cDNA helposti huomaamatta, ellei tiedetä mitä etsitään.

15 Kuitenkin, kun tiedetään sen läsnäolo ja käytettävissä on täydellisesti komplementaarista DNA:ta, minkä tämä keksintö tekee mahdolliseksi, on tuumorinekroositekijä-cDNAin etsiminen indusoidusta HL-60- tai PBL-soluista saaduista cDNA-kirjastoista tällaisia DNA-sekvenssejä sisältävien 20 koettimien avulla rutiinityötä. Esimerkeissä tutkitut kaksi HL-60-fagikirjastoa sisältävät suhteellisen samanlaisen määrän positiivisia plakkeja, joten on selvää, että rutiininomaisilla hybridisaatiotutkimuksilla voidaan identifioida halutun DNA:n sisältävä faagi.

25 HL-60-solulinjan tuumorinekroositekijää syntetisoi via soluja viljellään aluksi tavanomaisella tavalla, kunnes saavutetaan tiheys noin 8-12 x 10^ solua/ml. Solut poistetaan viljelmästä, pestään, siirrostetaan seerumista vapaaseen alustaan ja kasvatetaan PMA:ta sisältävässä alus-30 tässä. Kasvatusta jatketaan, kunnes haluttu tuumorinekroo-sitekijäpitoisuus, tavallisesti noin 400 yksikköä/ml, on : akkumuloitunut kasvualustaan. Sen jälkeen viljelmäsuperna- tantti edullisesti kirkastetaan sentrifugoimalla tai muulla keinolla, jolla voidaan erottaa solujätteet liukoisista 35 komponenteista. Sentrifugointi tulisi tehdä niin pienellä kierrosnopeudella, että vain suspendoituneet hiukkaset • I iu i mii i i i äi 95472 23 poistuvat. Sitten supernatantti puhdistetaan tässä hakemuksessa kuvattavalla tavalla.

Vaihtoehtoisesti ja edullisesti, tuumorinekroosite-kijä syntetisoidaan isäntäsoluissa, jotka on transformoitu 5 tuumorinekroositekijää koodaavaa DNA:ta sisältävillä vektoreilla. Vektori on replikoituva DNA-rakennelma. Vektoreita käytetään tässä yhteydessä tuumorinekroositekijää koodaa-van DNA:n amplifiointiin ja/tai ilmentämiseen. Ilmentymis-vektori on replikoituva DNA-rakennelma, jossa tuumorinek-10 roositekijää koodaava DNA-sekvenssi on sopivin toimenpitein kytketty soveltuviin säätelyjaksoihin, joilla on kyky saada aikaan tuumorinekroositekijän ilmentyminen sopivassa isännässä. Tällaisia säätelyjaksoja ovat mm. transkriptio-promoottori, lisäoperaattorijakso, joka ohjaa kopiointia, 15 soveltuvia mRNA:n ribosomisitoutumiskohtia koodaava jakso ja kopioinnin ja luennan lopetusta ohjaavat jaksot.

Vektoreihin kuuluvat plasmidit, virukset (faagit mukaan luettuina) ja integroitavissa olevat DNA-fragmentit (ts. fragmentit, jotka voidaan integroida isännän genomiin 20 rekombinaation kautta). Kun vektorilla on transformoitu soveltuva isäntä, se replikoituu ja toimii isännän genomista riippumattomasti tai saattaa, joissakin tapauksissa, integroitua itse genomiin. Tässä selostuksessa "vektori on yleisnimitys, joka sisältää "plasmidin", mutta plasmidit 25 ovat tällä hetkellä yleisimmin käytettyjä vektorityyppejä. Kaikki muutkin vektorityypit, jotka palvelevat samaa tarkoitusta ja ovat alalla tunnettuja tai tulevat sellaisiksi, ovat kuitenkin soveltuvia tämän keksinnön mukaiseen käyttöön. Soveltuvien vektorien tulee sisältää replikoni ja 30 säätelyjaksot, jotka ovat peräisin isännän, jota aiotaan käyttää ilmentämiseen, kanssa yhteensopivasta lajista.

* Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on transfor moitu tai transfektoitu yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistetuilla tuumorinekroositekijävektoreilla. Transformoi-35 dut isännät yleensä ilmentävät tuumorinekroositekijää. Ilmentynyt tuumorinekroositekijä jää solun sisään tai - 95472 24 erittyy joko periplasmatilaan tai viljelmäsupernatanttiin valitusta isäntäsolusta riippuen.

DNA-alueet ovat toiminnallisesti kytkettyjä, jos ne liittyvät toisiinsa funktionaalisesti. Esimerkiksi esijak-5 soa tai eritysesijaksoa koodaava DNA on kytketty toiminnallisesti polypeptidiä koodaavaan DNA:hän, jos se ilmentyy preproteiinina, joka osallistuu polypeptidin erittymiseen; promoottori on kytketty toiminnallisesti koodausjaksoon, jos se ohjaa tämän sekvenssin kopiointia; tai ribosomin si-10 toutumiskohta on kytketty toiminnallisesti koodausjaksoon, jos se sijaitsee siten, että luenta on mahdollinen. Toiminnallisesti kytketty merkitsee yleensä jatkuvaa ja, erittymisesijaksojen ollessa kyseessä, jatkuvaa ja samassa lukukehyksessä olevaa.

15 Soveltuvia isäntäsoluja ovat prokaryootti-, hiiva- tai korkeammat eukaryoottisolut. Prokaryootteihin kuuluvat gram-negatiiviset ja -positiiviset organismit, esimerkiksi E. coli ja basillit. Korkeampiin eukaryoottisoluihin kuuluvat nisäkäsperäiset vakiinnutetut solulinjat, joita ku-20 vataan jäljempänä. Edullinen isäntäsolu on faagiresistent-ti E. coli W3110 (ATCC 27325) -kanta, jota kuvataan esimerkeissä, vaikka myös muut prokaryootit, kuten E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli 294 (ATCC 31446), Pseudomonas-lajit ja Serratia marcesans, ovat soveltuvia.

.. . 25 Prokaryoottiset isäntä-vektorijärjestelmät ovat edullisia tuumorinekroositekijän ilmentymisen kannalta. Vaikka tuumorinekroosi tekijämolekyyli sisältää kaksi kys-teiiniryhmää ja vaatii siten mahdollisesti jossain määrin luennan jälkeistä käsittelyä mahdollisen disulfidisillan 30 muodostamiseksi, ilmentää esimerkiksi E. coli biologisesti aktiivista tuumorinekroositekijää. Käytettävissä on runsaas- • «« ti soveltuvia vektoreita. Mikrobiaalisen vektorin tulee yleensä sisältää repiikoitumisen aloituskohta, jonka käytettäväksi aiottu isäntä tunnistaa, isännässä toimiva pro-35 moottori ja fenotyyppinen valikointigeeni, esimerkiksi geeni, joka koodaa proteiineja, jotka antavat antibiootti- !l Ittlt nti; i i-t-s» . i - 95472 25 resistenssin tai toteuttavat jonkin kasvuedellytyksen. Muita isäntiä varten muodostetaan samanlaisia rakenteita. E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttämällä pBR322, eräästä E. coli -kannasta peräisin olevaa plasmidia /Bolivar 5 et ai., Gene 2 (1977) 95J. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssigeenit ja tarjoaa siten helpon tavan transformoitujen solujen identifioimiseksi.

Vektorien tulee sisältää promoottori, jonka isäntä-organismi tunnistaa. Tämä on yleensä aiotulle isännälle 10 homologinen promoottori. Yhdistelmä DNA:iden muodostamisessa yleisesti käytettäviin promoottoreihin kuuluvat /9-lak-tamaasi- (penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemit /Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; Goeddel et ai.,

Nature 281 (1979) 5447, tryptofaanipromoottorisysteemi 15 (TRP) /Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8 )180) 4057 ja EP-hakemusjulkaisu 36 7767 ja tae-promoottori /H. De Boer et ai., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 80 (1983) 21-257. Vaikka nämä promoottorit ovat yleisimmin käytettyjä, ovat myös muut tunnetut mikrobiaaliset promoottorit soveltuvia. Nuk-20 leotidisekvenssejä koskevia yksityiskohtia annetaan julkaisuissa, mikä tekee alaa taitavalle mahdolliseksi ligatoida ne toiminnallisesti tuumorinekroositekijää koodaavaan DNA:han plasmidivektoreissa /Siebenlist et ai., Cell 20 (1980) 2697· Tällä hetkellä edullinen vektori on pBR322-25 johdos, joka sisältää E. colin alkalinen fosfataasi -promoottorin yhdessä trp-Shine-Dalgarno-jakson kanssa. Promoottori ja Shine-Dalgamo-jakso kytketään toiminnallisesti TNFiää koodaavaan DNA:han, ts. ne sijoitetaan siten, että ne edistävät TNF-mRNA:n kopiointia DNA:sta.

30 Prokaryoottien lisäksi voidaan tuumorinekroositeki- jää koodaavilla vektoreilla transformoida eukaryoottisia . ‘\ mikrobeja, kuten hiivasoluviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae eli tavallinen leivinhiiva on yleisimmin käytetty alemmista eukaryoottisista isäntämikro-organismeista, vaikka joukko 35 muita kantoja on myös yleisesti saatavissa. Hiivavektorit sisältävät yleensä replikoitumisen aloituskohdan, joka on 26 - 95472 peräisin kahden mikronin hiivaplasmidista tai itsenäisesti replikoituvan jakson (ARS), promoottorin, TNF-geenin, jaksot polyadenylaatiota ja kopioinnin lopetusta varten ja va-likointigeenin. Soveltuva plasmidi hiivassa tapahtuvaa tuu-5 morinekroositekijän ilmentymistä varten on YRp7 /Stinchcomb et ai., Nature 282 (1979) 39; Kingsman et ai., Gene 7 (1979) 141; Tschemper et ai., Gene 10 (1980) 157./. Tämä plasmidi sisältää valmiiksi trp1-geenin, joka toimii valikointimark-kerina sille hiivamutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kas-10 vaa tryptofäänissä, esimerkiksi ATCC-nrolla 44076 eli PEP4-1:lle /Jones, Genetics 85 (1977) 127. trp1-vaurion läsnäolo hiivaisäntäsolun genomissa tarjoaa tehokkaan keinon de-tektoida transformoituminen tryptofaanin poissa ollessa tapahtuvan kasvun avulla.

15 Soveltuviin hiivavektorissa esiintyviin promoottori- jaksoihin sisältyvät promoottorit metallotioneiinia, 3-fos-foglyseraattikinaasia /kitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073.7 tai muita glykolyyttisiä entsyymejä /Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; Holland et ai., 20 Biochemistry 17 (1978) 4900.7, kuten enolaasia, glyseralde-hydi-3-fosfaattidehydrogenaasia, heksokinaasia, pyruvaat-tidekarboksylaasia, fosfofruktokinaasia, glykoosi-6-fos-faatti-isomeraasia, 3-fosfoglyseraattimutaasia, pyruvaatti-kinaasia, trioosifosfaatti-isomeraasia, fosfoglykoosi-iso-25 meraasia ja glykokinaasia varten. Hiivassa tapahtuvaan il-mentymiseen soveltuvia vektoreita ja promoottoreita kuvaavat tarkemmin R. Hitzeman et ai. EP-julkaisussa 73 657.

Muita promoottoreita, joiden lisäetuna on kasvuolosuhteiden säätelemä kopiointi, ovat promoottorialueet al-30 koholidehydrogenaasi 2, isosytokromi C, hapanta fosfataa-sia, typpimetaboliaan liittyviä hajottavia entsyymejä ja • edellä mainittuja metallotioneiinia ja glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasia, samoin kuin maltoosin ja galaktoo-sin hyväksikäytöstä vastaavia entsyymejä varten. Muodos-35 tettaessa soveltuvia ilmentymisplasmideja ligatoidaan il-mentymisvektoriin myös näihin geeneihin liittyvät terminaa- il !U i B 11. I . ! :n - 95472 27 tiojaksot tuumorinekroositekijää koodaavien jaksojen 3'-puolelle mENA:n polyadenylaation ja terminaation aikaansaamiseksi .

Mikro-organismien lisäksi voidaan isäntinä käyttää 5 myös monisoluisten organismien soluviljelmiä. Tämä ei kuitenkaan ole edullista niiden erinomaisten tulosten takia, joita on saavutettu tähän mennessä TNF:ää ilmentävillä mikrobeilla. Periaatteessa mikä tahansa korkeamman eukaryoo-tin, olipa se selkärankainen tai ei, soluviljelmä on käyt-10 tökelpoinen. Selkärankaissoluihin on kuitenkin tunnettu suurempaa mielenkiintoa ja selkärankaissolujen lisäämisestä viljelmässä (kudosviljelmässä) on tullut viime vuosina rutiinimenettely /Tissue Culture, toim. Kruse ja Petterson, Academic Press. 1973./. Esimerkkejä käyttökelpoisista solu-15 linjoista ovat VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin muna-sarjasolulinjät (CHO) ja WI38-, BHK-, COS-7- ja MDCK-solu-linjat. Tällaisille soluille käytettävät ilmentymisvektorit sisältävät yleensä replikoitumisen aloituskohdan (mikäli välttämätöntä), promoottorin ilmennettävän geenin edellä 20 sekä ribosomisitoutumiskohdan. RNA-simukoitumiskohdan (jos käytetään introneja sisältävää genomi-DNA:ta), polyadeny-laatiokohdan ja kopioinnin lopetusjakson.

IImentymisvektorien, joita on määrä käyttää selkärankaissolujen transformointiin, kopioinnin ja luennan sää-25 telyjaksot ovat usein virusperäisiä. Yleisesti käytettäviä • promoottoreita ovat esimerkiksi polyomasta, adenovirus 2:sta ja edullisimmin simianvirus 40:stä (SV40:stä) peräisin olevat promoottorit. Aikaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska ne saadaan helposti vi-30 ruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-viruksen replikaation aloituskohdan /Fiers et ai., Nature 273 (1978) : 113]. Pienempiä ja suurempiä SV40-fragmentteja voidaan myös käyttää sillä edellytyksellä, että ne sisältävät noin 259 emäsparin jakson, joka ulottuu Hindlll-kohdasta viruksen 35 replikoitumisen aloituskohdassa sijaitsevaan Bgll-kohtaan päin. Lisäksi on usein mahdollista, ja usein toivottavaa, 28 9 5 4 7 2 käyttää ihmisen genomin promoottori-, säätely- ja/tai sig-naalijaksoja, jotka normaalisti liittyvät tuumorinekroosi-tekijään, sillä edellytyksellä, että tällaiset säätelyjaksot ovat yhteensopivia isäntäsolusysteemien kanssa.

5 Replikoitumisen aloituskohta voidaan saada aikaan joko rakentamalla vektori siten, että se sisältää eksogee-nisen aloituskohdan, kuten SV40:stä tai muusta viruksesta (esimerkiksi polyomasta, adenoviruksesta, VSVrstä tai BPVistä) saatavan tai replikoitumisen aloituskohta voi olla 10 isäntäsolun kromosomaalisen replikoitusmekanismin aikaansaama. Jos vektori integroituu isäntäsolun kromosomiin, on jälkimmäinen usein riittävä.

Valittaessa edullista nisäkäsisäntäsolua transfek-toitavaksi vektorilla, joka sisältää sekä tuumorinekroosi-15 tekijää että dihydrofolaattireduktaasia (DHFR) koodaavat DNA-jaksot, on usein asiallista valita isäntä käytettävän DHFR-proteiinin tyypin mukaan. Jos käytetään villin tyypin DHRF-proteiinia, on edullista valita isäntäsolu, jossa on DHFR-vajaus, jolloin DHFR-koodausjaksoa voidaan käyttää 20 markkerina onnistuneelle transfektiolle selektiivisessä alustassa, josta puuttuu hypoksantiini, glysiini ja tymi-diini. Sopiva isäntäsolu on tässä tapauksessa kiinanhams-terin munasarjasolulinja (CHO-solulinja), jossa on CHFR-ak-tiivisuuden vajaus ja joka valmistetaan ja lisätään Urlaubin 25 ja Chasinin /Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 77 (1980) 4 216.7 kuvaamalla tavalla.'

Jos säätelyjaksona kuitenkin käytetään DNA:ta, joka koodaa DHFR-proteiinia, jolla on alhainen sitoutumisaffi-niteetti metotreksaatin (MTX) suhteen, ei ole välttämätöntä 30 käyttää DHFR-resistenttejä soluja. Koska mutantti-DHRF on resistentti MTX:lie, voidaan MTC-pitoista alustaa käyttää : valikointivälineenä, sillä edellytyksellä, että itse isän- täsolut ovat MTX-herkkiä. Useimmat eukaryoottisolut, joilla on kyky absorboida MTX:ää, näyttävät olevan metotreksaatti-35 herkkiä. Eräs tällainen käyttökelpoinen solulinja on CHO-linja CHO-K1 (ATCC-nro CCL 61).

!R iti ! HI I ft j I i t ia - 95472 29

Tuumorinekroositekijä otetaan talteen viljelmistä. Transformoidut erittämättömät solut hajotetaan äänikäsitte-lyllä tai muulla hyväksyttävällä menetelmällä ja solujät-teet erotetaan sentrifugoimalla, kun taas erittävistä so-5 luista (kuten indusoiduista solulinjoista) saatavat super-natantit yksinkertaisesti erotetaan soluista sentrifugoimalla. Sitten voidaan käyttää yhtä tai useampaa seuraavis-ta vaiheista tai niiden sijasta kokonaan muita menetelmiä. Seuraavaa menetelmää käytettiin tuumorinekroositekijän puh-10 distamiseksi riittävässä määrin sekventointia varten. Tämä ei välttämättä ole samanlainen kuin terapeuttisen tuotteen vaatima puhdistus.

Ensimmäisessä puhdistusvaiheessa tuumorinekroositekijä adsorboidaan hydrofobiselle aineelle hajotetusta vil-15 jelmästä tai kasvualustasupernatantista. Hydrofobinen aine on edullisesti muu kuin gelatiinipinta, joka on hydrofobinen, kuten silikaatti tai polyolefiini, vaikka alkyyli-Sepharose on myös soveltuva. Kontrolloitu huokoslasi on edullinen suoritusmuoto. Kontrolloitua huokoslasia sekoi-20 tetaan supernatanttiin tilavuussuhteessa noin 1:50, ja ad-sorboitumisen annetaan edetä noin 4°C:ssa sekoittamatta noin 30 minuuttia - kaksi tuntia, edullisesti noin yksi tunti, lievästi emäksisissä olosuhteissa. Adsorbentti tulisi yleensä sen jälkeen pestä soveltuvalla puskurilla siihen 25 tarttuneiden kontaminoivien proteiinien poistamiseksi.

Adsorboitunut tuumorinekroositekijä eluoidaan hydrofobiselta aineelta muuttamalla ympäröivän väliaineen solva-tointiominaisuuksia. Eluointi voidaan tehdä johtamalla aineen läpi liuosta, joka on puskuroitu pH-arvoon noin 7 -30 8,5, edullisesti noin 8 ja joka sisältää 1 mmol/1 suolaa ja vaikuttavan määrän veteen sekoittuvan orgaanisen polyolin, kuten esimerkiksi etyleeniglykolin tai glyseriinin, tavallisesti etyleeniglykolin, jonka osuus on noin 10-30 tila-vuus-%, edullisesti noin 20 tilavuus-%, vesiliuosta. Opti-35 miolosuhteet riippuvat luonnollisesti käytettävästä poly-olista. Tuumorinekroositekijää sisältävät eluoituneet 30 95472 fraktiot havaitaan tutkimalla in vitro jäljempänä kuvattavalla tavalla tai jollain muulla soveltuvalla tavalla. Mo-nosyyttisoluviljelmän tuotteen puhdistuminen ja saanto tässä vaiheessa samoin kuin myöhemmissä vaiheissa esitetään 5 taulukossa I.

!l Ht t »lii l i i a 31 95472

G

<ϋ Ό 3 3 to

n * -H

O tn vo τ-λ > C ^ I oo c\j co σι Π} <#> f"· «5 'S- ·“· Tj

tO /g ~· S

3 w « P :tö to -n

P -H

*3 I r* ^ ·§ to φ $

ie -H O O rL P

„ £ & l^^r^roo tn

C ΐ E ^ cvj co O

itu ^ » pv

•r> °< P tsj ro H

•H ^ M

X , ω

jS « x .S

-H G -H -H .,

0) 0) -H 10 P

o G P M * g o "Ί Ίϊ: to to vo vo § M '-Ira o O vo O o 3 KA H W ^ »H O ^ , t m Q) -H W tn *-H ^ ® ai nJ 3 ε x x * X x e Ή t- .5 S -ΐη f" cm co σι nj

tj -H to .ro o <—i oo vo rv. S

0 3 G Ή :0 o *v σι — — 5 1 W 0 > * - “o*' 2 S o ! .,j, 1

H e +»p * + -S

A 5t Jj f-l A? * Ti o <u TlTl sL^ vo vd vo vo vo cd ^ « &t!wae o o o o o

2 "H *5 ί\ τ< »-H f-H *-H *-H pH

3 e i—l flj -O 5

Il 5g“^ * XX X X P

S £ · I ΐ ~ ^ °l °l s g

Eng W G to to s £ « * evT § rg I -H g*

m “ e 2 S

s «s „ a ä« etu σ' o « o . t! JO ii n ^ oo σ> O O -n 3 ti is ? g ® « ti g8 3 «s -v S“j * dg e 2 _p — O om m vo -H 3

O oo oo l r·^ nJ P

S & ° ° | ~ e *?, 5 03 S " ιΟ -H I 3 C £ * j ζ 10 ·Η (d Ο) -H ·· 3

_ nJOnJOJE G to w P

F 3POPPOPO) Q

W p I M-l H Ή OF >0) Ui G

*. ‘D | -H -H (tj 3 ttJ F -H Π U 0)

- F m <DO10P<HHCU<D Ή O tJ 3 tO

„ 3 G H Ιβ Cl H&i l+J(d +J|<MHA -M -H

g Tj -H M H O <DO to -H « U O <0 ffi P «J

” m <o o <n p topo<i)mp<pp> <d p

-h (d :0 H O <β Ιπί G <d td CU P Cu -nP

° rrjH P P Λί g ωεΟιβΡΟιΙΛίΟί HP

f J3 G O O «£OG^;CP<Dtn<DI oto

3rt »d O 3 H MPO-HOPQiH-vr «O

g p* > Hl « JS .* QjKiSCUPCUCOQJU * „ 95472 32

Tuumorinekroositekijää puhdistetaan edelleen adsorboimalla se tertiaariselle tai kvaternaariselle anionin-vaihtohartsille. Edullisia hartseja tähän tarkoitukseen ovat hydrofiiliset matriisihartsit, kuten silloitettu poly-5 styreeni, dekstraani tai selluloosa, jotka on substituoitu alkyyli(tertiaarinen tai kvaternaarinen amino)ryhmillä. Tämäntyyppisiä kaupallisesti saatavia tuotteita ovat DEAE-selluloosa, QAE Sephadex ja kauppanimellä Mono Q myytävä tuote (kussakin näistä tuotteista alkyylisubstituentti on 10 etyyli). Parhaita tuloksia saavutetaan proteiinien pikakro-matografiamenetelmällä, jota kuvaa J. Richey (American Laboratory, lokakuu 1982) ja jossa käytetään Ugelstadin et ai. /Nature 303 (1983) 95-96\J mukaisia suurihuokosisia suurin piirtein yhdenmukaisia hiukkasia. Tämä menetelmä teki 15 mahdolliseksi tuumorinekroositekijän puhdistamisen korkeaan puhtausasteeseen.

Puhdistaminen suurin piirtein homogeeniseksi saadaan aikaan vain erottamalla edelleen SDS-PAGE-elektroforeesilla tai C4-vastafaasisuurpainenestekromatografiällä (RP-HPLC) 20 jäljempänä kuvattavalla tavalla. Tämä tuote ei kuitenkaan ole terapiatarkoituksiin suositeltava, koska se on menettänyt oleellisesti aktiivisuuttaan joutuessaan SDS:n tai HPLC:n orgaanisen liuottimen vaikutuksen alaiseksi. Proteiinipitoisuus määritettiin M. Bradfordin /Anal. Biochem. 72 25 (1976) 248-254J menetelmällä. Viimeisten puhdistusvaihei- den aikana proteiinipitoisuutta arvioitiin sekä aminohappo-koostumuksen että myös aminohapposekvenssin perusteella. Tuumorinekroositekijä preparoidaan antamista varten sekoittamalla tuumorinekroositekijä, jolla on haluttu puhtausas-30 te, fysiologisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin, ts. kantaja-aineisiin, jotka ovat saajilleen myrkyttömiä käy-: tettävinä annoksina ja pitoisuuksina. Yleensä tähän liittyy tuumorinekroositekijän yhdistäminen puskureihin, hapettumi-senestoaineisiin, kuten askorbiinihappoon, pienimolekyyli-35 siin (alle 10 ryhmää) polypeptideihin, proteiineihin, aminohappoihin, hiilihydraatteihin glukoosi ja dekstriinit •B : Sϋ ! Bill! I I I iti < - 95472 33 mukaan luettuina, kelatoiviin aineisiin, kuten EDTA:aan ja muihin stabiloiviin ja täyteaineisiin. Kantaja tulisi formuloida siten, että se stabiloi tuumorinekroositekijän dimeeriksi ja/tai, edullisesti, trimeeriksi. Tämä saadaan 5 aikaan välttämällä sellaisia suola- tai detergenttipitoi-suuksia, jotka hajottavat tuumorinekroositekijän monomee-reiksi. Myös sellaisia olosuhteita, joissa tuumorinekroosi-tekijä aggregoituu korkeammiksi multimeereiksi, tulisi välttää. Yleensä käytetään ionitonta pinta-aktiivista ainetta, 10 kuten Tween 20, liiallisen aggregoitumisen estämiseksi puhdistuksen samoin kuin kylmäkuivauksen tai vesiseoksena säilytyksen aikana. Tuumorinekroositekijän, jota on määrä käyttää terapeuttiseen antamiseen, tulee olla steriiliä.

Tämä saadaan helposti aikaan suodattamalla tuote steriloi-15 vien suodatuskalvojen läpi. Tuumorinekroositekijä säilytetään yleensä kylmäkuivattuna.

Tuumorinekroositekijä voidaan yhdistää muihin kasvainten vastaisiin aineisiin, kuten kemoterapeuttisiin antibiootteihin (aktinomysiini-D, adriamysiini, aklasinomysii-20 ni A) tai immuunivastetta lisääviin tai stimuloiviin aineisiin, esimerkiksi immunoglobuliineihin, kuten gammaglobuliiniin, immunoglobuliinit, joilla on affiniteetti kasvain-solujen pinta-antigeenien suhteen, mukaan luettuina. Lisäksi, koska interferonit toimivat synergistisesti tuumorinek-25 roositekijän kanssa soluhajotuskokeissa, on edullista yh-‘ ' distää alfa-, beta- tai gamma-interferonia tuumorinekroo- sitekijäkoostumuksiin tai tuumorinekroositekijää ja lymfo-toksiinia sisältäviin koostumuksiin. Tyypillinen formula sisältää tuumorinekroositekijää ja gamma-interferonia ak-30 tiivisuusyksikkösuhteessa noin 0,1:1 - 200:1, yleensä 10:1, ja voi sisältää lymfotoksiinia korvaamassa osan tuumori- : - nekroositekijästä. Näitä suhteita voidaan luonnollisesti muuttaa hoitokokemusten vaatimalla tavalla.

Tuumorinekroositekijäkoostumuksia annetaan eläimil-35 le, joilla on kasvaimia. Antotapa on tunnettujen menetelmien mukainen, esimerkiksi laskimon—, vatsakalvon—, lihaksen— 95472 34 tai leesionsisäisinä infuusioina tai injektioina tai hidas-tetusti vapauttavien systeemien avulla, kuten jäljempänä kuvataan. Tuumorinekroositekijä annetaan leesionsisäises-ti, so. ruiskuttamalla suoraan, kiinteisiin kasvaimiin.

5 Disseminoituneiden kasvaimien, kuten leukemian, ollessa kyseessä tapahtuu antaminen edullisesti laskimonsisäisesti tai imukudosjärjestelmään. Vatsa-alueen kasvaimia, kuten munasarjasyöpää, hoidetaan edullisesti vatsakalvonsisäisel-lä infuusiolla käyttämällä vatsaontelodialyysilaitteistoa 10 ja vatsaontelolle sopivia liuoksia. Tuumorinekroositekijää annetaan tavallisesti kuitenkin jatkuvana infuusiona, vaikka suuret kertaruiskeetkin ovat hyväksyttäviä.

Tuumorinekroositekijää annetaan edullisesti istutettavissa olevasta hitaasti vapauttavasta tuotteesta. Esi-15 merkkeinä järjestelmistä, jotka soveltuvat proteiineille, joilla on tuumorinekroositekijädimeerejä tai -trimeerejä vastaava molekyylipaino, ovat L-glutamiinihapon ja gamma-etyyli-L-glutamaatin kopolymeerit /ϋ. Sidman et ai., Biopolymers 22(1) (1983) 547-556.7, poly (2-hydroksietyyli- 20 metakrylaatti) /r. Langer et ai., J. Biomed. Mater. Res.

15 (1981) 167-277; ja R. Langer et ai., Chem. Tech. 12 (1982) 98-105.7 ja etyleenivinyyliasetaatti (R. Langer et ai., imibid.). Tämä valmiste istutetaan leikkauskohtaan, josta kasvain on poistettu. Vaihtoehtoisesti tuumorinekroosite-25 kijä kapseloidaan puoliläpäiseviin mikrokapseleihin tai li-' posomeihin kasvaimeen ruiskuttamista varten. Tämä antotapa on erityisen edullinen kasvaimille, joita ei voida poistaa kirurgisesti, esimerkiksi aivokasvaimille.

Annettava tuumorinekroositekijämäärä riippuu esimer-30 kiksi antotavasta, kyseessä olevasta kasvaimesta ja potilaan kunnosta. Lecsionsisäiset injektiot vaativat vähemmän tuumorinekroositekijää potilaan painoon nähden kuin laski- monsisäinen infuusio, kun taas jotkut kasvaintyypit, esimerkiksi kiinteät kasvaimet, näyttävät olevan resistentim-35 piä tuumorinekroositekijälle kuin toiset, esimerkiksi leu-kemiakasvaimet. Siten hoitavan lääkärin on välttämätöntä 35 9 5 4 7 2 laskea annostus ja muuntaa antotapaa kohteena olevan kasvaimen vastaisen optimaalisen sytotoksisen vaikutuksen saavuttamiseksi vaadittavalla tavalla, joka voidaan määrittää esimerkiksi kasvaimesta otettujen kudosnäytteiden avulla 5 tai tutkimalla oletettuja syöpämarkkereita, kuten karsino-embryoonista antigeeniä, ottaen huomioon mahdollinen toksisuus kohotetuilla annoksilla. Tuumorinekroositekijäännökset aina annostukseen noin 120 ^ug/painokilo/vrk asti laskimonsisäisesti annettuna on yleensä havaittu suurin piirtein 10 myrkyttömiksi ja tehokkaiksi in vivo.

Tuumorinekroositekijän ei uskota olevan sytotoksiselta aktiivisuudeltaan lajispesifinen, niin että muuta kuin ihmisen tuumorineksooritekijää, esimerkiksi nauta-tai sikaperäistä tuumorinekroositekijää saatettaisiin voi-15 da käyttää ihmisten kasvaimien hoitoon. On kuitenkin toivottavaa käyttää hoidettavasta lajista peräisin olevaa tuumorinekroositeki jää autoantibodien mahdollisen muodostumisen estämiseksi.

Esimerkkien yksinkertaistamiseksi kuvataan tiettyjä 20 usein esiintyviä menetelmiä lyhyesti.

Plasmideja merkitään pikku-p-kirjaimella, joka on ennen isoja kirjaimia ja/tai numeroita tai niiden jälkeen. Tässä käytetyt lähtöaineplasmidit ovat kaupallisesti saatavia, ovat yleisön saatavissa rajoittamattomasti tai voi-25 daan muodostaa saatavissa olevista plasmideista julkaistu-jen menetelmien mukaisesti. Lisäksi alalla tunnetaan muita vastaavia plasmideja ja ne ovat alaa tavanomaisesti hallitsevalle ilmeisiä.

DNA:n pilkkomisella tarkoitetaan DNA:n katkomista 30 katalyyttisesti entsyymillä, joka vaikuttaa vain tiettyihin DNA:n kohtiin. Tällaisia entsyymejä kutsutaan restriktio-*: entsyymeiksi ja paikkaa, jolle kukin entsyymi on spesifinen, kutsutaan restriktiokohdaksi. "Osittaisella" pilkkomisella tarkoitetaan restriktioentsyymillä tehtävää epätäydellistä 35 pilkkomista, ts. valitaan olosuhteet, jotka johtavat DNA-substraatissa olevien joidenkin, mutta ei kaikkien, tiettyä 95472 36 restriktioendonukleaasia vastaavien kohtien katkeamiseen. Tämän keksinnön yhteydessä käytetyt eri restriktioentsyymit ovat kaupallisesti saatavia ja niiden yhteydessä käytettiin valmistajien antamia reaktio-olosuhteita, kofaktorei-5 ta ja muita vaadittavia tekijöitä. Restriktioentsyymejä merkitään yleensä lyhentein, jotka koostuvat isosta kirjaimesta, jota seuraa muita kirjaimia ja sitten yleensä numero, joka edustaa mikro-organismia, josta kyseessä oleva restriktioentsyymi on alunperin saatu. Yleensä käytetään 10 noin 1 ^ug plasmidi- tai DNA-fragmenttia ja noin 1 yksikkö entsyymiä noin 20 yul:ssa puskuriliuosta. Valmistaja ilmoittaa kullekin restriktioentsyymille sopivan puskurin ja substraatin määrät. Yleensä käytetään inkubointiaikoja noin yksi tunti 37°C:ssa, mutta ne voivat vaihdella valmistajan 15 ohjeiden mukaan. Inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja pilkottu nukleiinihappo otetaan talteen vesifraktiosta saostamalla etanolilla. Restriktioentsyymipilkkomista seuraa joskus harvoin hydrolysoiminen bakteerin alkalisella fosfataasilla termi-20 naalisten 5'-fosfaattien, jotta saataisiin estetyksi DNA-fragmentin kahden restriktiopilkotun pään "sirkularisoitu-minen" eli suljetun lenkin muodostuminen, joka voisi estää toisen DNA-fragmentin sijoittamisen restriktiokohtaan. Ellei toisin mainita, plasmidien pilkkomista ei seuraa 5'-ter-25 minaalinen defosforylaatio. Defosforylaatiossa käytettävät menettelyt ja reagenssit ovat tavanomaisia (T. Maniatis et ai. Molecular Cloning, 1982, s. 133-134).

Tietyn DNA-fragmentin "talteenotto" eli "eristäminen" restriktiopilkkomisseoksesta tarkoittaa pilkkomistuoteseok-30 sen erottamista polyakryyliamidigeenielektroforeesilla, . mielenkiinnon kohteena olevan fragmentin identifioimista : - vertaamalla sen liikkuvuutta molekyylipainoltaan tunnettu jen markkeri-DNA-fragmenttien liikkuvuuteen, halutun fragmentin sisältävän geelin osan poistamista ja geelin erotta-35 mistä DNA:sta. Tämä menettely on yleisesti tunnettu. Katso esimerkiksi R. Lawn et ai., Nucleic Acids Res, 9 (1981) - 95472 37 6103-6114 ja D. Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057.

"Southern-analyysi" on menetelmä, jonka avulla varmistetaan DNA-sekvenssien läsnäolo pilkkomistuoteseoksessa 5 tai DNA:ta sisältävässä koostumuksessa tekemällä hybridisaatio tunnetun leimatun oligonukleotidin tai DNA-fragmen-tin kanssa. Tässä yhteydessä, ellei toisin mainita, Southern-analyysillä tarkoitetaan pilkkomistuotteiden erottamista 1-%:isella agaroosilla, denaturoimista ja siirtoa nitrosel-10 luloosaan E. Southernin [J. Mol. Biol. 98 (1975) 505-5177 menetelmällä ja hybridisoimista T. Maniatisin et ai. /Cell 15 (1978) 687-7017 kuvaamalla tavalla.

"Transformointi" merkitsee DNA:n tuomista organismiin siten, että tämä DNA on replikoitavissa, joko kromoso-15 min ulkopuolisena osana tai kromosomiin integroituneena elementtinä. Ellei toisin mainita, on tässä yhteydessä E. colin transformointiin käytetty menetelmä Mandelin et ai. [J. Mol. Biol. 53 (1970) 1547 CaCl2-menetelmä.

"Ligaatio" tarkoittaa fosfodiesterisidosten muodos-20 tamista kahden kaksisäikeisen nukleiinihappofragmentin välille (T. Maniatis et ai., ibid., s. 146). Ellei toisin mainita, ligaatio voidaan tehdä käyttämällä tunnettuja puskureita ja olosuhteita ja noin 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia ("ligaasia")/0,5 ^ug ligatoitavia DNA-fragmentteja, joiden 25 moolimäärät ovat suurin piirtein yhtä suuret.

• . DNA:n "preparoiminen" transformanteista tarkoittaa plasmidi DNA:n eristämistä mikrobiviljelmästä. Ellei toisin mainita, voidaan käyttää Maniatisin et ai. (ibid. s.

90) emäs/SDS-menetelmää.

30 "Oligonukleotidit" ovat lyhyitä yksi- tai kaksisäi- keisiä polydeoksinukleotideja, jotka syntetisoidaan kemial-; lisesti tunnetuin menetelmin ja puhdistetaan sitten polyak- ryyliamidigeeleillä.

Kaikki lainaukset kirjallisuudesta ilmoitetaan viit- 35 te inä.

38 95472

Esimerkki 1

Tutkimukset

Tuumorinekroositekijän ominaisaktiivisuus määritettiin aiemmin kuvatulla solulyysitutkimuksella /b. Spofford, 5 J. Immun. 112 (1974) 2111/. Hiiren L-929-fibroblastisoluja (ATCC CCL-929) kasvatettiin 96-syvennyksisissä tasapohjaisissa maljoissa (3040; Falcon Plastics, Oxnard, CA) tiheytenä 30 000 solua/syvennys (0,1 ml) aktinomysiini D:n (1 ^ug/ml) ja sarjalaimennetun tutkittavan näytteen (0,125 10 ml) läsnä ollessa. Soluja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02, 37°C:ssa. Tutkittava näyte poistettiin 18 tunnin kuluttua, maljat pestiin ja solujen hajoaminen detektoitiin värjäämällä maljat liuoksella, joka sisälsi 0,5 % kristalliviolettia metanolivesiseoksessa 15 (tilavuussuhteessa 1:1). Päätepisteet mikromaljoilla määritettiin automaattisella Microelisa-lukulaitteella (Dynatech), jonka absorptioaallonpituus oli säädetty 450 nm:ksi ja transmissioaallonpituus 570 nm:ksi. Solut, jotka olivat alttiina vain kasvualustalle, toimivat 0—%:ista hajoamista 20 vastaavana standardina ja 4 M guanidiinihydrokloridiliuok-sella käsitellyt solut katsottiin 100-%risesti hajonneiksi. Yksi yksikkö tuumorinekroositekijää on määritelmän mukaan se määrä tuumorinekroositekijää (0,125 ml:n tilavuudessa määritettynä) joka saa aikaan 50-%sisen solujen hajoamisen.

25 Tuumorinekroositekijä tutkittiin myös tuumorinekroo- sikokeella in vivo. Lyhyesti sanottuna tämä koe tehtiin kasvattamalla Meth A -sarkoomasoluja (5 x 105 solua) CB6F^-naarashiirissä /(BALB/c x C57BL/6)F1-7 7-10 vuorokautta ja ruiskuttamalla sitten tuumorinsisäisesti tuumorinekroosi-30 tekijänäyte. Hiiret tapettiin 24 tunnin kuluttua taittamalla niska, kasvaimet poistettiin ja nekroosi arvostel-. tiin histologisesti E. Carswellin et ai. /Proc. Nat. Acad.

Sei. 72 (1975) 3666-3670,/ kuvaamalla tavalla.

!l Itt I liiti |:i I ¢1 39 95472

Esimerkki 2 PBL:ien tai monosyyttisolulinjan käyttö tuumorinek-roositekijän syntetisoimiseen

Ihmisen HL-60-promyelosyyttisolulinjan alkuviljel- 5 mää, jonka solutiheys oli 1x10^ solua/ml, kasvatettiin 2 2 litran telapulloissa (890 cm ) käyttämällä 500 ml RPMI 1640 -alustaa (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), joka sisälsi 10 mmol/1 HEPES:iä, 0,05 mmol/1 - merkaptoetanolia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä, 100 ^ug/ml streptomysiiniä 10 ja 10 % naudan sikiöseerumia. Kun oli kasvatettu kolme vuorokautta 37°C:ssa, jolloin solutiheys oli saavuttanut arvon 8-12 x 105 solua/ml, solut kerättiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 1 000 x g 10 minuuttia, pestiin kahdesti seerumivapaalla RPMI 1640 -alustalla ja siirrostettiin yl-15 lä kuvattuun alustaan, joka ei kuitenkaan sisältänyt see- 5 rumia, solutiheydeksi 15-20 x 10 solua/ml. Soluja kasvatettiin 2 litran telapulloissa PMA:n (10 mg/ml) läsnä ollessa. 16-24 tunnin kuluttua solut poistettiin suodattamalla 3 yum:n Sealkleen-suodattimen läpi (Pall Trinity Micro 20 Corp., Cortland, NY). Kirkas suodos tutkittiin tuumorinek-roositekijän suhteen ja sitä käytettiin jatkopuhdistukseen ja karakterisointiin. Tällä menettelyllä saatiin tuumori-nekroositekijää noin 400 yksikköä/ml viljelmäsupernatant-tia.

25 Myös ihmisen ääreisverimonosyyttejä käytettiin tuu- ’ morinekroositekijän tuotantoon. Verihiutalefereesitähteet toimitti American Red Cross, Boston, MA ja ne käytettiin 24 tunnin kuluessa keräämisestä. Monosyyttien ensimmäinen erotus erytrosyyteistä tehtiin sentrifugoimalla Ficoll-Hypaque-30 gradientteja käyttäen kiihtyvyydellä 1 000 x g 30 minuuttia. Rajapinnalle kertyneet solut pestiin kolmesti fosfaat-tipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella. Kultakin luovuttajalta peräisin olevia soluja kasvatettiin erikseen 2 litran telapulloissa seerumittomassa RPMI 1640 -alustas-35 sa tiheytenä 2,5 x 106 solua/ml. Viljelmään lisättiin 1 ^ug/ml stafylokokkienterotoksiini B:tä (SEB) ja yhdis- - 95472 40 telinätymosiini ot-1: kumpaakin ja soluja kasvatettiin kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10 % C02, 37°C:ssa.

24—72 tunnin kuluttua, luovuttajasta riippuen, solusuper— natantit otettiin talteen ja käsiteltiin HL-60-solulinjas-5 ta saadun supernatantin yhteydessä kuvatulla tavalla. PBL-viljelmistä saadut tuumorinekroositekijäsaannot vaihtelivat suuresti käytetyistä indusoijista riippuen. PMA:n lisääminen edellä kuvattuun induktiosysteemiin lisäsi solusuper-natanttien sytolyyttistä aktiivisuutta. Solusupernatantit 10 sisälsivät kuitenkin sekä tuumorinekroositekijää että lym-fotoksiinia (lymfotoksiinin tai tuumorinekroositekijän määrittäminen tuumorinekroositekijän ja lymfotoksiinin seoksista tehtiin suorittamalla solulyysikokeet näytteillä, joita oli esi-inkuboitu tuumorinekroositekijän tai lymfotoksiinin 15 vaikutuksen kumoavan kaniini vasta-aineen läsnä ollessa ja määrittämällä jäännösaktiivisuus kokeella, jossa tutkittiin L-929-solujen hajoamista).

Esimerkki 3

Kontrolloidusta huokoslasista valmistetuilla helmil-20 lä tehtävä kromatografia

Tuumorinekroositekijäaktiivisuus absorboitiin soluviljelmästä panosmenetelmällä kontrolloituihin huokoslasi-helmiin (.Electro-Nucleonics, Fairfield, NJ. luettelo-nro CPG 00350) , jotka oli tasapainotettu käyttämällä 10 mM nat-25 riumfosfaattipuskuria, pH 8,0, sekoittaen tasaisesti 4°C:ssa. Lasihelmiä käytettiin 100 ml/5 1 alustaa. Kun oli sekoitettu yksi tunti, helmien annettiin laskeutua ja supernatant-ti dekantoitiin pois. Sitten helmet kaadettiin huoneen lämpötilassa 5 x 50 cm:n kolonniin ja pestiin 10 mM natrium-30 fosfaattipuskurilla, pH 8,0, joka sisälsi 1 mol/1 NaCl. Tuumorinekroositekijäaktiivisuus eluoitiin lasihelmistä - liuoksella, joka sisälsi 20 % etyleeniglykolia ja 1 mol/1

NaCl 10 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 8,0. HL-60-super-natantin eluoitumiskäyrä kolonnista esitetään kuviossa 1.

41 95472

Esimerkki 4 DEAE-selluloosakromatografia

Esimerkistä 3 saatu eluaatti syötettiin suoraan DEAE-selluloosa 53 (Whatman) sisältävään kolonniin (2,5 x 20 cm), 5 joka oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 8,0, joka sisälsi 0,01 % Tween 20, käyttäen virtausnopeutta noin 500 ml/h. Kun virtausnopeus kolonnissa oli säädetty arvoon 100 ml/h, lisättiin 4,2 x 106 yksikköä tuumo-rinekroositekijää 1 080 ml:n näytteessä 4°C:ssa, kolonni 10 huuhdottiin tasapainotuspuskurilla ja tehtiin eluointi käyttäen portaittaista gradienttia 75, 150 ja 500 mmol/1 nat-riumkloridia 10 mM fosfaattipuskurissa (pH 8,0). Eluaatin absorbanssia aallonpituudella 280 nm ja tuumorinekroositeki jäaktiivisuutta seurattiin eluoitujen fraktioiden funktio-15 na. Tulokset annetaan kuviossa 2.

Esimerkki 5 FPLC (proteiinien nopea kromatografia)

Esimerkissä 4 saatu tuumorinekroositekijäaktiivi-suuden sisältävä fraktio väkevöitiin ja dialysoitiin 20 mM 20 Tris.HCl-puskuria (pH 8,0), joka sisälsi 0,01 % Tween 20 ja 1 mmol/1 natriumatsidia (puskuri A) vastaan Amicon-se-koituskennolla käyttämällä YM-10-kalvoa tai muuta dialyysi-kalvoa, jonka molekyylipainoraja on TNFtn molekyylipainon alapuolella. Kalvo pestiin kahdesti puskuri Ailia. Kolonni, 25 joka sisälsi kvaternaarisilla ammoniumryhmillä substituoi-tuja Sepharose-helmiä (9,8 yUm:n helmiä 5 x 0,5 cm:n kolonnissa; myydään nimellä Mono Q -hartsi, Pharmacia) ja joka oli sijoitettu FPLC-yksikköön (proteiinipikakromatografia) (Pharmacia), joka oli varustettu gradienttiohjelmointiyk-30 siköllä (GP-500) ja kahdella pumpulla (P-500), tasapainotettiin ennalta dialyysipuskureilla virtausnopeudella 1 ml/ min J. Richeyn (American Laboratory, lokakuu 1982, s. 1) tarkemmin kuvaamalla tavalla. Yhdistetyt huuhtoutuneet liuokset ja dialyysikonsentraatti laitettiin kolonniin, 35 kolonni huuhdottiin puskuri Ailia ja eluoitiin sitten käyttäen lineaarista gradienttia 40-75 mmol/1 natriumklo- 95472 42 ridia puskuri A:ssa. Lineaariset gradientit ohjelmoitiin seuraavasti 5,1 - 5 minuuttia, 25 mM NaCl; 15,1 - 25 minuuttia, 40 mM NaCl; 25-60 minuuttia, lineaarinen gra-dientti 40 —> 75 mM NaCl; 60-65 minuuttia 75 mM NaCl; 65,1 -5 70 minuuttia, 100 mM NaCl; 70-80 minuuttia, lineaarinen gradientti 100 —> 1 000 mM NaCl; 80-90 minuuttia, 100 mM NaCl; 90,1 - 110 minuuttia tasapainotuspuskuri. Effluentti kerättiin 2 ml:n fraktioina, joista tutkittiin absorbanssi aallonpituudella 280 nm, ominaisjohtokyky ja tuumorinekroo-10 sitekijäaktiivisuus. Tulokset esitetään kuviossa 3.

Esimerkki 6

Kromatofokusointi

Kromatofokusointi tehtiin käyttäen Pharmacia Mono P -kolonnia (20 x 0,5 cm) esimerkin 5 mukaisessa FPLC-sys-15 teemissä. Biologisesti aktiivinen (tuumorinekroositekijä) fraktio, joka eluoitui esimerkissä 5 fraktioissa 37-45, väkevöitiin ja dialysoitiin Amicon-sekoituskennolla YM-10-kalvoa käyttäen kolonnin tasapainotuspuskuria, ts. 0,025 M bis-Tris.HCl:ää (pH 6,7), vastaan. Näyte syötettiin Mono P 20 -kolonniin huoneen lämpötilassa ylähaaran kautta virtausnopeudella 1 ml/min. Kolonnia huuhdottiin tasapainotuspus-kurilla, kunnes absorbanssi aallonpituudella 280 nm palasi perustasoon ja eluoitiin sitten lineaarisella pH-gradien-tilla, joka saatiin aikaan huuhtomalla kolonnin 7,5-%:isel-25 la polypuskuri 74:llä (pH 4,7) (Pharmacia). Kerättiin 1 ml:n fraktioita ja rekisteröitiin absorbanssi aallonpituudella 280 nm ja pH. Tulokset esitetään kuviossa 4. Kuten kuviosta 4 on havaittavissa, oli tuumorinekroositekijän isoelektri-nen piste noin 5,3.

30 Esimerkki 7

Preparatiivinen SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo- * reesi

Valmistettiin 15-%:iset polyakryyliamidigeelit (11 x 16 cm), joiden paksuus oli 1,5 - 3,0 mm, U. Laemmlin /Nature 35 227 (1970) 680-6857 menetelmän muunnosta käyttäen. Sekä erottavat että tarttuvat geelit sisälsivät 0,1 % SDSrää ja 95472 43 ja 0,05 % Tween 20. Muut puskurit ja silloitusreagenssi olivat samat kuin analyyttisissä SDS-PAGE-geeleissä. Esimerkin 5 tai 6 mukaiset fraktiot, jotka sisälsivät tuumori-nekroositekijäaktiivisuutta, yhdistettiin, väkevöitiin ja 5 dialysoitiin 6,25 mM Tris.HCl:ää (pH 7,0), joka sisälsi 0,005 % SOS, vastaan Amicon-sekoituskennolla käyttämällä YM-10-kalvoa. Dialysoidun konsentraatin poistamisen jälkeen kalvo pestiin kolmesti pienellä tilavuudella näyte-puskuria (0,2 % SDS:ää, 0,02 % Tween 20, 30 % glyserolia, 10 0,03 mol/1 Tris.HCl (pH 6,8) ja 0,005 % tunnistusväriä).

Dialysoitu konsentraatti ja pesuliuokset yhdistettiin (kokonaistilavuus 1-4 ml), lisättiin mahdollisesti merkaptoeta-nolia SDS-PAGE-pelkistysolosuhteiden aikaansaamiseksi, ja näyte laitettiin tarttuvaan geelin valettuun suureen syven-15 nykseen. Näytesyvennyksen viereisiin pieniin syvennyksiin laitettiin ennalta värjättyjä molekyylipainomarkkereita fosforylaasi-a (94 K), naudan seerumialbumiini (67 K), ovalbumiinia (43 K), karbonianhydraasi (30 K), soijapapu-trypsiini-inhibiittori (20 K) ja lysotsyymi (14,4 K). Gee-20 lejä ajettiin pystysuorassa elektroforeesisysteemissä (Biorad), joka oli jäähdytetty 12°C:seen, vakiovirralla 20 mA/mm (geelin paksuus), kunnes tunnistusväri saavutti geelin alareunan.

Elektroforeesin jälkeen poistettiin yksi lasilevyis-25 tä geeliltä, ja todettiin molekyylipainomarkkerien sijain-* nit. Tuumorinekroositekijänäytteen sisältävä kaista leikat tiin sitten 0,25 cm:n paloihin markkeriproteiinien molekyy-lipainojen mukaisesti. Nämä geelipalat laitettiin sitten polypropyleeniputkiin, jotka sisälsivät 1-2 ml 10 mM am-30 moniumbikarbonaattiliuosta (pH 8,0), joka sisälsi 0,01 % Tween 20 ja annettiin eluoitua 16 tuntia 4°C:ssa. Eluaa-: teista tutkittiin sitten tuumorinekroositekijäaktiivisuus; tulokset esitetään kuviossa 5. Tuumorinekroositekijän mo-lekyylipaino SDS-geelillä oli noin 17 000 sekä pelkistä-35 vissä että pelkistämättömissä olosuhteissa, mikä viittaa yksiketjuiseen molekyyliin.

„ 95472 44

Proteiini otettiin geelipalaeluaateista talteen suoloista ja pienimolekyylisistä aineista vapaana seuraavan käsittelyn avulla: Valmistettiin pienet kolonnit, jotka sisälsivät 0,2 ml Sep-pak C18 -hartsia, joka oli esihuuhdot-5 tu asetonitriilillä, 1-propanolilla, 1-%:isella trifluori-etikkahapolla (TFA) ja tislatulla vedellä ja tasapainotettu sitten 10 mM ammoniumbikarbonaatilla, joka sisälsi 0,01 % Tween 20 (pH 8,0). Geelieluaatti syötettiin kolonniin ja kerättiin effluentti. Sitten hartsi huuhdottiin tislatulla 10 vedellä ja 0,1-%:isella TFA:11a, joita kumpaakin käytettiin noin 5 ml, vapaiden aminohappojen ja puskurisuolojen poistamiseksi. Tuumorinekroositekijä eluoitiin kolonnista 1 ml:11a liuosta, joka sisälsi 50 % 1-propanolia 0,1-ikisessä TFA:ssa. Tehtiin vielä lisäksi eluoinnit liuoksilla, 15 jotka sisälsivät 50 % 1-propanolia 1-%:isessa TFA:ssa ja 99 % 1-propanolia 1-%:isessa TFA:ssa (1 ml kumpaakin liuosta) , mutta yleensä proteiini eluoitui ensimmäisellä puskurilla. Tuumorinekroositekijän biologisesta aktiivisuudesta tuhoutui noin 80 % tässä vaiheessa. Vaikka täten saatua 20 tuumorinekroositekijää voidaan käyttää sekvenssianalyysiin, on edullista käyttää tähän tarkoitukseen esimerkissä 8 kuvattavaa HPLC-effluenttia.

Esimerkki 8 HPLC-kromatografia 25 Luontaisen, muuttumattoman tuumorinekroositekijän molekyylipaino määritettiin suurpainegeelipermeaatiokroma-tografiällä. Tämä tehtiin huoneen lämpötilassa käyttäen TSK G2000 SW -geeliä sisältävää HPLC-kolonnia (Alltech Associates, Deerfield, IL) (7,5 x 60 mm). 1 ml:n näyte esimerkissä 5 30 saatua puhdistettua tuumorinekroositekijää, joka sisälsi noin 1 ^ug proteiinia ja 16 000 aktiivisuusyksikköä, eluoi-: tiin isokraattisesti geelikolonnista virtausnopeudella 0,5 ml/min eluenttina 0,2 M natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0. Kolonni kalibroitiin naudan seerumialbumiinilla (M = 66 000), 35 ovalbumiinilla (M = 45 000), naudan karbonianhydraasi B:llä (M = 29 000) ja lysotsyymillä (M = 14 300) . Kerättiin ut-L mm i.i * »* 95472 45 1 ml:n fraktioita, joista tutkittiin tuumorinekroositeki-jäaktiivisuus. Fraktiot, joissa oli tuumorinekroositeki-jäaktiivisuutta, eluoituivat molekyylipainoa 45 000 ± 6 000 vastaavalla kohdalla (kuvio 6).

5 Esimerkki 9

RP-HPLC

Tuumorinekroositekijä puhdistettiin myös RP-HPLC:llä käyttämällä C4 Synchropak -kolonneja Water's Associates, Incin kromatograafisiin järjestelmiin kirjal-10 lisuudessa kuvatulla tavalla [W. Kohr et ai., Anal. Bio-chem. 122 (1982) 348-359]. Proteiinipiikit detektoitiin aallonpituuksilla 210 ja 280 nm, kun oli tehty eluointi lineaarisella gradientilla 1 —> 23 tilavuus-% 1-propanolia 0,l-%:isessa TFA:ssa ensimmäiset 15 minuuttia ja 15 23 —> 30 tilavuus-% 1-propanolia 0,l-%:isessa TFA:ssa seuraavat 15 minuuttia virtausnopeuden ollessa 1 ml/min. Piikeistä analysoitiin sytolyyttinen aktiivisuus. Orgaaniset liuottimet, joita käytettiin tuumorinekroositekijän eluoimiseen C4-kolonnista, alensivat tuumorinekroositeki-20 j äaktiivisuutta noin 80 %. Tällä menetelmällä puhdistettu tuumorinekroositekijä kuivattiin alipaineessa ja käsiteltiin sitten aminohappoanalyysiä ja sekventointia varten. Tulokset esitetään kuviossa 7. Kuvio 7 osoittaa, että esimerkin 5 effluentin mukana saatu tuumorinekroositekijä 25 sisälsi biologisesti inaktiivisia proteiiniepäpuhtauksia, jotka eluoituivat noin 16 ja 19 minuutin retentioajoilla. C4-RP-HPLC:stä saatu biologisesti aktiivinen effluentti oli suurin piirtein homogeenista aminohapposekvenssiä arvosteluperusteena käytettäessä.

30 Esimerkki 10 ; Tuumorinekroositekijän aminohapposekvenssin osit- täinen määritys

Tuumorinekroositekijä pilkottiin trypsiinillä seuraavasti: Esimerkin 9 mukaisesti saatu homogeeninen tuu-35 morinekroositekijä liuotettiin, kuivattiin ja liuotettiin takaisin 100 mM ammoniumbikarbonaattipuskuriin (pH 8,0), joka sisälsi 5 paino-% TPCK-trypsiiniä (Worthington 95472 46

Biochemicals), 1 mmol/1 CaCl2 ja 0,01 % Tween 20, entsyymiä ja substraatin välisen suhteen ollessa 1:20, inkuboi-tiin kuusi tuntia 37°C:ssa, lisättiin vielä 5 paino-% trypsiiniä ja inkuboitiin hydrolyysiseosta vielä 12 tuntia 5 37°C:ssa. Reaktioseos laitettiin edellä kuvatun kaltaiseen C4-HPLC-kolonniin peptidifragmenttien erottamiseksi. Tulokset esitetään kuviossa 8. Saatiin kaikkiaan yhdeksän fragmenttia (fragmentit 2 ja 2' eluoituivat yhdessä piikkinä, josta kuviossa 8 käytetään merkintää T2). 10. frag-10 mentin uskotaan jääneen pidättymättä kolonniin. Esimerkkien 8 ja 9 mukaisten kokonaisten tuumorinekroositekijoiden ja tässä esimerkissä saatujen trypsiinihydrolyysifragmenttien aminohapposekvenssit määritettiin automaattisella jaksoittaisella Edman-hajotuksella käyttämällä muunnettua Beckman-15 sekventoijaa (malli 890B), joka oli varustettu kylmälou-kuilla. Kupissa käytettiin kantajana polybreeniä (1,25 mg). Kokonaisen molekyylin aminohappokoostumuksen perusteella on kokonaisen tuumorinekroositekijän molekyylipaino 17 100. Tämä luku sopii yhteen SDS—PAGE-tulosten kanssa ja vahvis-.· 20 taa sitä, ettei glykosylaatiota esiinny.

Esimerkki 11

Tuumorinekroositekijän ja gamma-interferonin syner-gistinen vaikutus

Hiiren melanooma B16 -solut (Mason Research, 25 Worcester, MA., C57B1/6-peräinen solulinja) ympättiin mik-romaljalle tiheydeksi 5 000 solua/syvennys ja inkuboitiin neljä tuntia 37°C:ssa kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC>2, ennen lymfokiinien lisäämistä. Esimerkin 1 mukaisesti saatu tuumorinekroositekijä puhdistettiin suu-30 rin piirtein homogeeniseksi HPLC:llä ja sen aktiivisuuden määrä analysoitiin edellä kuvatulla kokeella, jossa tutkittiin L929-solujen hajoamista. Samoin määritettiin hiiren puhdistetun yhdistelmägamma-interferonin /p. Gray et ai., Proc. Natl. Acad. Sei USA 80 (1983) 5842-58467 virus-35 ten vastainen aktiivisuus EMC-infektoituja L-soluja vastaan /D. Goeddel et ai., Nature (London) 287 (1980) 411-4167.

AI

95472

Hiiren gamma-interferoni ja ihmisen tuumorinekroositekijä laimennettiin erikseen kuviossa 10 esitettävällä tavalla. Merkittyihin syvennyksiin lisättiin ensin gamma-interferonia ja heti sen jälkeen laimennettua tuumorinekroositekijää 5 lopullisen tilavuuden ollessa 0,2 ml/syvennys. 72 tuntia kestäneen inkuboinnin lopussa solut värjättiin liuoksella, joka sisälsi 0,5 % kristalliviolettia 20-%:isessa metano-lissa. Tulokset esitetään kuviossa 10. B16 on suhteellisen resistentti sekä pelkälle tuumorinekroositekijälle että 10 pelkälle IFN-r:lle; tuumorinekroosipitoisuudella 1 000 yk-sikköä/ml ei havaittu silminnähtävää sytolyysiä. Hyvin pienten gamma-interferonimäärien lisääminen (jopa niin vähän kuin 5 yksikköä/ml) johti kuitenkin sytolyysiin.

Esimerkki 12 15 Lähetti-RNA:n eristäminen HL-60-soluviljelmistä (4 tuntia PMA-induktion jälkeen) tai esimerkissä 2 kuvatulla tavalla viljellyistä ää-reisverilymfosyyteistä eristettiin kokonais-RNA suurin piirtein Wardin et ai. /J. Virol. 9 (1972) 61/ kuvaamalla 20 tavalla. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoi-tiin sitten uudelleen liuokseen, joka sisälsi 10 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris.HCl (pH 7,5) ja 1,5 mmol/1 MgCl2· Solut hajotettiin lisäämällä NP-40 (loppupitoisuudeksi 1 %) ja tumat pelletoitiin sentrifugoimalla. Supernatantti si-25 sälsi kokonais-RNA:n, joka puhdistettiin edelleen uuttamal-; la useaan kertaan fenolilla ja kloroformilla. Vesifaasin

NaCl-pitoisuus säädettiin 0,2 mol/l:ksi, ja saostettiin sitten kokonais-RNA lisäämällä kaksinkertainen tilavuus etanolia. Tyypillinen saanto 1 g:sta viljeltyjä soluja oli 30 noin 6 mg kokonais-RNA:ta. Polyadenyloitu mRNA (n. 100 ^ug) saatiin käsittelemällä oligo(dT)selluloosalla H. Avivin et - : ai. /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 1408-1412/ mene telmällä.

95472

Esimerkki 13 cDNA-kirjasto 7,5 ^ug esimerkissä 12 saatua poly(A)+-mRNA:ta muutettiin kaksisäikeiseksi cDNA:ksi käsittelemällä peräkkäin 5 käänteistranskriptaasilla, DNA-polymeraasin Klenow-frag-mentilla ja S1-nukleaasilla [9. Gray et ai., Nature 295 (1982) 503-508; M. Wickers et ai., J. Biol. Chem. 253 (1978) 2483-2495_7. Polyakryyliamidigeeliltä eristettiin noin 80 ng cDNA:ta, jonka pituus oli enemmän kuin 600 emäs-10 paria.

Synteettinen DNA-adaptorisekvenssi 5'AATTCATGCGTTCTTACAG 3' 3'GTACGCAAGAATGTC 5' 15 ligatoitiin cDNA:han tarttuvan EcoRI-pään muodostamiseksi. Kuten alalla on tavanmukaista, adaptori syntetisoitiin kemiallisesti kahtena erillisenä säikeenä, toisen säikeen 5'-pää fosforyloitiin polynukleotidikinaasilla ja saadut 20 kaksi säiettä emäspariutettiin. Sitten eristettiin cDNA (20 ng) uudelleen polyakryyliamidigeeliltä, sijoitettiin ligaation avulla EcoRI-pilkottuun Agt-10:een, pakattiin faagipartik-keleihin ja lisättiin E. coli -kannassa C600hfl (Hyunh et ai., Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press Ltd., 25 Oxford, England, 1984) tai muuhun lambdafaagin lisäämiseen soveltuvassa kannassa. Saatiin noin 200 000 itsenäistä kloonia sisältävä cDNA-kirjasto.

Esimerkki 14

Deoksioligonukleotidikoettimen valmistaminen tuumo-30 rinekroositekijä-cDNA:ta varten • 42 nukleotidin DNA-hybridisaatiokoetin, joka perus- tui trypsiinikäsittelyllä saadun tuumorinekroositekijäpep-tidin TD-6 (E-T-P-E-G-A-E-A-K-P-W-Y-E-K-) alustavaan aminohappo jaksoon , suunniteltiin käyttäen hyväksi julkaistuja 35 kodonien käyttötiheystietoja /¾. Grantham et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 43-477 ja ihmisen IFN-Y:n [9. Gray . 95472 49 et ai./ 295 (1982) 503-508/ ja ihmisen lymfotoksiinin ko-donien suosimistietoja. Alustavassa sekvenssissä oli virhe (viimeisen K:n olisi pitänyt olla P). Tämä sekvenssi johti kuitenkin onnistuneeseen koettimeen. Synteettisen koettimen 5 sekvenssi Oli 5' dGAAACCCCTGAAGGGGCTGAAGCCAAGCCCTGGTATGAAAAG 3' ja se syntetisoitiin R. Crean et ai. /Nucleic Acids Res. 8^ (1980) 2331-2348/ menetelmällä. Koetin fosforyloitiin (Ύ- P)-ATP:llä ja T4-polynukleotidikinaasilla kirjallisuudessa kuvatulla tavalla /Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544/.

1 o Esimerkki 15

Tuumorinekroositekijää koodaavia jaksoja sisältävän cDNA-kloonin identifioiminen

Agt 10 -cDNA-kirjaston noin 200 000 kloonia tutkittiin DNA-hybridisäätiöila käyttäen ^P-leimattua 42-meeriä 15 (esimerkki 14) ankaruudeltaan lievissä olosuhteissa A.

Ullrichin et ai. mukaisesti /EMBO J. 3 (1984) 361-364/ (tai vaihtoehtoisesti P. Grayn et ai. /fcroc. Natl. Acad. Sei.

USA 80 (1983) 5842-5846/, S. Andersonin et ai. /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 6836-6842/ ja M. Jayen et ai.

20 /Nucleic Acids Res. 11 (1983) 2325-2335/ menetelmällä). Yhdeksän eri kloonia hybridisoitui koettimen kanssa ja ne puhdistettiin täplämenetelmällä. Sitten valmistettiin P-leimattu cDNA käyttämällä indusoimattomien HL-60-solujen mRNA:ta. Näistä yhdeksästä faagikloonista seitsemän DNA ei 25 hybridisoitunut tämän "indusoimattoman" koettimen kanssa ja ;V niiden pääteltiin siten olevan ehdokkaita tuumorinekroosi teki jä-cDNA-sekvensseiksi. Suurimman insertin sisältävälle cDNA-kloonille annettiin nimeksi λ.42-4. Tämä insertti sek-ventoitiin dideoksiketjuterminaatiomenetelmällä /A. Smith, 30 Methods in Enzymology 65 (1980) 560-580; F. Sanger et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463-5467/, sen jälkeen kun se oli subkloonattu vektoriin M13mp8 fJ. Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321/.

*42-4:lle saatu cDNA-sekvenssi sisälsi koko valmista 35 tuumorinekroositekijää ynnä osaa sen signaalipeptidistä koodaavan alueen. DNA:n oikea orientaatio ja lukukehys 95472 50 pääteltiin vertaamalla tuumorinekroositekijän trypsiini-pilkkomispeptidin T4 aminohapposekvenssiin. Proteiinisek-ventoinnilla määritetty tuumorinekroositekijän aminoterminaalinen valiiniryhmä on aminohappo 1 ja sitä seuraa 5 156 muuta aminohappoa, ennen kuin lukukehyksessä kohda taan lopetuskodoni. Laskettu molekyylipaino on 17 356 daltonia.

Esimerkki 16

Koko PreTNF:ää koodaavat sekvenssit sisältävän 10 cDNA-kloonin identifiointi cDNA-klooni λ. 42-4 sisältää valmiin TNF:n koko koo-dausalueen, mutta siitä puuttuu täydellistä signaalipep-tidiä koodaava sekvenssi, mistä on osoituksena aloitusko-donin puuttuminen. Puuttuvien sekvenssitietojen saamisek-15 si syntetisoitiin kemiallisesti heksanukleotidialuke dTGGATGTTCGTCCTCC (komplementaarinen nuklotideille 855-870), kuvio 10). Tämä aluke emäspariutettiin, esimerkin 12 mukaiseen mRNAihan ja syntetisoitiin sitten cDNA esimerkin 13 mukaisella menetelmällä. Valmistettiin uusi, 20 noin 200 000 cDNA-kloonia sisältävä kirjasto gtl0:ssä esimerkin 13 mukaisella menetelmällä. Tämä kirjasto tutkittiin hybridisaatioanalyysillä käyttäen koettimena X42- 4-cDNA-lnserttiä, joka oli leimattu 32P:llä. Saatiin 16 positiivista kloonia, joista pisin (Λ16-4) sisälsi cDNA-. 25 insertin, joka ulottui 337 emäsparia kauemmaksi 5'-suun- taan kuin \42-4-insertti. TNF-cDNA-inserttien X16-4:n (nukleotidit 1-870) ja λ42-4:η (nukleotidit 1-1643) yhdistetty sekvenssi esitetään kuviossa 10.

Esimerkki 17 30 Ilmentymisvektorin muodostaminen tuumorinekroosi- .! tekijän suoraa ilmentämistä varten

Menettely, jota käytettiin esimerkissä 15 saadun tuumorinekroositekijää vastaavan DNA-sekvenssin ilmentämiseen esitetään kuviossa 11. Esimerkin 15 mukainen faagi 35 Λ42-4, joka sisälsi koko valmista tuumorinekroositekijää koodaavan jakson ja osan tuumorinekroositekijän oletetusta eritysesijaksosta, pilkottiin EcoRIzllä ja otettiin talteen noin 800 emäsparin fragmentti, joka sisälsi tuumori- 95472 51 nekroositekijää koodaavan alueen. Tämä fragmentti pilkottiin Aval:llä ja HindIII:lla ja otettiin talteen 578 emäs-parin fragmentti ("C" kuviossa 11). Tämä fragmentti koodaa tuumorinekroositekijän aminohappoja 8-157.

5 Valmistettiin kaksi synteettistä deoksioligonukleo- tidia (fragmentti "B" kuviossa 11) (ks. adaptorisekvenssin muodostaminen esimerkissä 13), joiden 5'-päässä oli tarttuva Xbal-pää ja 3'-päässä tarttuva Aval-pää ja jotka sisälsivät met—aloituskodonin ja tuumorinekroositekijän seitse— 10 mää ensimmäistä aminoterminaalista aminohappoa vastaavat kodonit. Näitä aminohappoja vastaavat kodonit valittiin E. coli -preferenssin perusteella. Aloituskodonin edellä oleva AATT-sekvenssi valittiin sopivalla tavalla erottamaan aloituskodoni trp-ribosomisitomissekvenssistä ja yhdistetty-15 nä aminohappokodoneihin estämään mahdollinen mRNA-silmukka.

Sitten segmentit B ja C liitetään kolmella ligaa-tiolla pBR322-johdokseen, joka sisältää trp-promoottorijak-son ja trp-esipeptidin Shine-Dalgarno-jakson (EP-hakemus-julkaisu 36 766). Valitaan tai muodostetaan johdos, joka 20 sisältää ainutkertaiset Xbal- ja HindiII-kohdat trp-pro- moottorin ja TetR-geenin välissä. Joko pLTtrpI /Gray et ai., Nature 312 (1984) 721-724J tai ptrpETA /Gray et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 2645-26497 ovat soveltuvia tämäntyyppisiä lähtövektoreita, vaikka muitakin voidaan 25 muodostaa pBR322:sta, trp-promoottorista ja mahdollisesti ·' · tarvittavista synteettisistä kytkijöistä. Sekä pBR322 että trp—promoottorin sisältävät plasmidit ovat yleisesti saatavilla. Valitun vektorin pBR322-osasta voi puuttua Aval-PvuII-segmentti emäsparien 1424 ja 2065 välistä (tällöin 30 käytetään plasmidin nimessä merkintää "XAP"). Mikä tahansa edellä mainituista plasmideista pilkotaan samanaikaisesti : Xbal:llä ja HindIII:lla ja otetaan talteen suuri vektori- fragmentti. Tämä fragmentti ja fragmentit B ja C ligatoi-daan T4-DNA-ligaasin avulla ja ligaatioseoksella transfor-35 moidaan E. coli 294 (ATCC 31 446). Valikoitiin ampisillii-niresistentit pesäkkeet, otettiin talteen plasmidi-DNA ja 52 95472 ja karakterisoitiin sen restriktioendonukleaasikartoituk-sella ja DNA-sekventoinnilla. Saatiin pTrpXAPTNF, joka sisälsi insertit B ja C.

Esimerkki 18 5 Tuumorinekroositekijän ilmentyminen E. colissa E. colia (ATCC 31 446), joka oli transformoitu pTNFtrp:llä, kasvatettiin M9-alustassa, joka sisälsi 20 ^ug/ml ampisilliinia ja viljelmä kasvatettiin optiseen tiheyteen A550 = 0,3. Lisättiin indolietikkahappoa loppu-10 pitoisuudeksi 20 ^,ug/ml ja viljelmää kasvatettiin, kunnes A550 = 1* 10 ml soluDa väkevöitiin ja ne suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen. Solut äänikäsiteltiin ja laimennettiin esimerkin 1 mukaisesti tehtävää tuumorinekroositekijämääritystä varten. Saa- 5 15 tiin noin 10 aktiivisuusyksikköä/ml viljelmää. Tämä aktiivisuus kumoutui esi-inkuboitaessa tuotetta kaniinin antiseerumin kanssa, joka oli saatu ihmisen tuumorinekroosi-tekijää vastaan immunoiduista kaniineista.

Esimerkki 19 ' 20 Tuumorinekroositekijän ilmentyminen E. colissa Tämä menetelmä on edullisempi kuin esimerkin 18 mukainen menetelmä.

Edellä mainittujen vektorien yhteydessä käytettävä isäntä on edullisesti taantumaton tonA-E. coli -kanta. Täl-25 laiset kannat ovat bakteriofaagiresistenttejä ja siksi paljon paremmin soveltuvia laajamittaiseen viljelyyn kuin villin tyypin kannat. Seuraavassa kuvataan soveltuvaa menetelmää tällaisen kannan aikaansaamiseksi. E. coli W3110 transdusoidaan A;:Tn10:llä, joka on paikasta toiseen siir-30 rettävissä olevan elementin Tn10 sisältävä lambdabakterio-faagi, jolloin saadaan E. coli W3110:n Tn10-hyppäystuotteiden yhdistelmä /N. Klecker et ai., J. Mol. Biol. 116 (1977) 125/.

E. coli W3110::Tn1O-hyppäystuoteyhdistelmää kasva-35 tetaan L-liemessä 37°C:ssa solutiheyteen noin 1 x 109 so-lua/ml. 0,5 ml viljelmää sentrifugoidaan ja pelletti „ 95472 53 suspendoidaan 0,2 ml:aan *phi80- (tai T1-) lysaattia, joka sisältää 7,0 x 109 plakin muodostavaa yksikköä (pfu). Faa-gin annetaan adsorboitua 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten suspensio levitetään EMB-maljoille, jotka on täydennetty tet-5 rasykliinillä (15 ^ug/ml). Kun on inkuboitu yön yli 37°C:ssa, yhdistetään vaaleanpunaiset pesäkkeet 3 ml:aan L-lientä, kasvatetaan yön yli 37^C:ssa, pestään kahdesti ja suspen— doidaan takaisin L-liemeen. Tämä viljelmä infektoidaan bak-teriofaagi P1 kc:llä ja otetaan talteen faagilysaatti (J.

10 Miller, Experiments on Molecular Biology, Cold Spring Harbor

Laboratory, 1972, s. 304).

E. coli AT982 (E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn, nro 4546) muutetaan tetrasykliiniresistentik-si tämän P1 ke -lysaatin avulla. Transduktantit valikoi-15 daan L-liemimaljoilla, joihin on lisätty tetrasykliiniä (15 ^ug/ml) ja diaminopimeliinihappoa (dap, 40 ^ug/ml). Tuloksena olevista transduktanteista tutkitaan tetrasyk- .- + , , Rv liiniresistenssi ja dap-geenin regeneraatio (dap , tet ). dap+,tetR-transduktanteista tutkitaan sitten A,phi80- (tai 20 T1-) resistenssi.

Sitten valmistetaan P1 ke -lysaatit useista dap , tetR,A.phi80- (tai T1-) resistenteistä kannoista. Lysaa-teilla transdusoidaan E. coli W3110 tetrasykliiniresisten-tiksi. Transduktantit tutkitaan ja valikoidaan Aphi80-25 (tai T1-) resistenssin perusteella.

* Valikoidaan tetrasykliiniresistentit solut W3110 fhuA::Tn10-Xphi80R-transduktanttien joukosta fs. Naloy et ai., J. Bact. 145 (1981) 1110J. Näiden eristettyjen solujen faagi Aphi80-resistenssi ja tetrasykliiniherkkyys var- 30 mistetaan yksipesäkepuhdistuksen jälkeen.

Eristetään DNA muutamista tetrasykliiniherkistä, • phi80-faagiresistenteistä mutanteista ja pilkotaan se Sstll:11a. Sstll-pilkottu DNA karakterisoidaan Southern-täplämenetelmällä käyttäen radionuklidileimattua, Sstll- 35 pilkottua X: :Tn10-DNA:ta koettimena sen määrittämiseksi, onko Tn10 poistunut (R. Davis et ai., Advenced Bacterial 54 95472

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Toinen tet-rasykliiniresistenteistä eristetyistä mutanteista on menettänyt kaksi Tn1O-hybridisaatiovyöhykettä verrattuna 7v: :TnlO-DNA:n ja parentaalisen W3110 fhuA: : Tnl01phi80R: n vä-5 liseen hybridisaatioon. Kolmannen hybridisaatiovyöhykkeen liikkuvuus on muuttunut, mikä viittaa siihen, että on tapahtunut Tn10:n epätäsmällisen poistumisen aiheuttama de-leetio.

Kannan, jossa esiintyy epätäsmällinen Tn10-delee-10 tio, ulommista kalvoista tehdyn preparaatin SDS-geelielek-troforeesi osoittaa, että vyöhykkeen, jonka otaksutaan olevan fhuA-proteiini, elektroforeettinen liikkuvuus on muuttunut verrattuna villin tyypin fhuA-proteiiniin. Tuloksena oleva proteiini ei toimi Xphi80-faagireseptoripro-15 teiinina. Toisella, edellisestä riippumattomalla kannalla, jolle myös on tapahtunut Tn10:n epätäsmällinen poistuminen, ei näy ollenkaan fhuA-proteiinia SDS-geelillä.

Kummassakaan näistä kannoista ei esiinny taantumista tetrasykliiniresistenssiin tai 1phi80-herkkyyteen, mikä • 20 viittaa siihen, että on tapahtunut Tn10—transposonin tai sen osan epätäsmällinen poistuminen yhdessä fhuA—geenin joko osittaisen tai täydellisen deleetion kanssa. Erästä tällaisista W3110—kannoista (NL106) käytetään edullisesti isäntänä TNF:ää koodaaville vektoreille, joita kuvataan 25 toisaalla tässä hakemuksessa.

* NL106 transformoitiin ptrpXAPTNF:llä ja tuotteella inokuloitiin 10 litraa alustaa (pH 7,4) , jolla oli seuraa— va koostumus: !l ht > *itl #* - - · 95472 55

Aineosa g/i (nh4)2so4 5,0 K2HP04 6'°

NaH2P04 3'° 5 Na-sitraatti 1 L-tryptofaani O'2 NZ Amine AS ^'0

Hiivauute 4,0

MgS04 1'2 10 Glukoosi 2510

Hivenaineliuos (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B ja

Mn-ioneja) 0,5 ml

Tetrasykliini ^

Viljelmään alettiin syöttää glukoosia nopeudella 15 1 g/min, kun viljelmän A55Q-arvo oli noussut noin 20 reen.

Fermentointia jatkettiin 30°C:ssa, kunnes A^q = 136 (noin 20 tuntia). Viljelmä sentrifugoidaan, jolloin muodostuu so-lutahna, ja tahnaa uutetaan sitten 30 minuuttia pH-arvossa 8,0 ja huoneen lämpötilassa 50 mM tris-puskurilla, joka 20 sisältää 10 mmol/1 EDTA, 1 000 mmol/1 NaCl, 2 000 mmol/1 ureaa ja 0,1 % beta-merkaptoetanolia. Uute laimennettiin ja tutkittiin esimerkin 1 mukaisesti. Tämän tutkimuksen mukaan g 1 mg tuumorinekroositekijää sisälsi 1 x 10 yksikköä tuu-morinekroositekijäaktiivisuutta. Saatiin jopa noin 2 g tuu— 25 morinekroositekijää litraa kohden viljelmää. Aminoterminaa-linen sekventointi osoitti, että noin 75-86 paino-% tästä oli valyyliaminoterminaalista (valmista) tuumorinekroositeki jää, lopun ollessa met-TNF:ää. Korkeiden ilmentymista-sojen lisäksi proteiini ei myöskään esiintynyt refraktii-30 lisissä elementeissä eikä näyttänyt muutenkaan olevan myrkyllistä soluille, mitä osoittavat saavutetut äärimmäisen suuret solutiheydet.

56 95472

Esimerkki 20

Tuumorinekroositekijämutanttigeenin muodostaminen ja ilmentyminen Tässä esimerkissä toimittiin muuten esimerkkien 17 5 ia 18 mukaisesti, mutta syntetisoitiin oligonukleotidifrag-mentti B, jossa oli histidiinikodoni CAT arginiini 6 -kodo-nin CGT tilalla. Tällöin ilmentyi mutanttituumorinekroosi-tekijä.

Esimerkki 21 10 Toisen tuumorinekroositekijämutanttigeenin muodosta minen ja ilmentyminen Tässä esimerkissä toimittiin muuten esimerkkien 17 ja 18 mukaisesti, mutta käytettiin oligonukleotidifragment-tia B, joka koodasi leusiinia (CTT) arginiini 2:n sijasta. 15 Alustavissa yrityksissä saatiin noin 1 200 mg valmista TNF:ää viljelmälitraa kohden. Käsittelemätöntä TNFrää ei ollut havaittavissa viljelmässä.

Esimerkki 22

Vektorin, joka koodaa tuumorinekroositekijän ja eri-20 tyssignaalisekvenssin fuusioproteiinia, muosotaminen E. colin lämpöstabiilia enterotoksiinia vastaavan geenin STII sekvenssiä kuvaavat Picken et ai. /infection and Immunity 42(1 ) (1983) 269-275_7. Tässä esimerkissä li- gatoitiin fragmentti, joka sisältää STII-erityssignaalin 25 ja Shine-Dalgarno-sekvenssin, E. colin alkalisen fosfataa-? sin promoottorin alapuolelle (jälkeen). STII-signaalia seu raa 3'-suunnassa synteettinen oligonukleotidi, joka sisältää tuumorinekroositekijän seitsemää ensimmäistä aminohappoa vastaavat kodonit ja loppuosa tuumorinekroositekijää 30 koodaavasta jaksosta. Kaikki edellä mainitut sekvenssit sijoitettiin pBR322-vektoriin.

9 pWM501 /Picken et ai., Infection and Immunity 41(1) (1983) 269-275J sisältää STII-geenin. pWM501 pilkottiin Xbal:llä ja Nsil:llä, ja eristettiin noin 90 emäsparin 35 fragmentti. Tämä fragmentti voitaisiin myös syntetisoida il : fttii »il! l·! i m - 95472 57 kemiallisesti sinänsä tunnetuin menetelmin (fragmentti A).

Esimerkissä 17 kuvattu pBR322-Trp-plasmidi (p29kLT) pilkottiin Sbal:llä ja Hindlll:11a ja otettiin talteen suuri fragmentti (fragmentti B). Tämä fragmentti sisältää E.

5 colin replikoitumisen aloituskohdan ja geenin, joka antaa ampisilliiniresistenssifenotyypin.

Syntetisoitiin synteettinen oligonukleotidi kahtena erillisenä säikeenä, jotka emäspariutettiin seuraavaksi rakenteeksi (tarttuvat restriktiokohtapäät ja oligonukleo-10 tidin koodaamat aminohapot ovat myös näkyvissä).

VAL ARG SER SER SER ARG THR

5' GTA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3' ACGT CAT ACG AGA AGA AGA GCA TGA GGCT Nsil Aval Tästä fragmentista käytetään merkintää fragmentti C.

Esimerkin 18 mukainen pTNFtrp pilkottiin Avalrllä ja HindIII:lla. 578 emäsparin Aval-Hindlll-fragmentti (fragmentti D) otettiin talteen. Se sisältää koko TNF:ää, 20 seitsemää ensimmäistä aminohappoa lukuun ottamatta, koodaa-van sekvenssin.

DNA-sekvenssi, joka sisältää E. colin alkalisen fos-fataasiri (AP) promoottorin kytkettynä heterologiseen Shine-Dalgano (S.D.) -sekvenssiin (trp) ja jossa on EcoRI- ja 25 Xba-pää, muodostettiin seuraavasti: DNA-fragmentti, joka ' ' sisältää osan AP-promoottorista, eristettiin plasmidista pHI-1 /H. Inouye et ai., J. Bacteriol. 146 (1981) 668-675_7, vaikka mitä tahansa soveltuvia A-promoottori-DNA:n sisältäviä lähteitä voitaisiin käyttää. pHI-1 pilkottiin Hpal:llä 30 plasmidin avaamiseksi, plasmidiin ligatoitiin synteettinen

GAATTCGAATTC

... EcoRI-kytkijä CTTAAGCTTAAG, ja kytkijällä varustettua plas- midia pilkottiin ylimäärällä EcoRI kaikkien EcoRI-kohtien katkaisemiseksi ja alimäärällä RsaI kaikkien Rsal-kohtien 35 katkaisemiseksi vain osittain (EcoRI- ja Rsal-käsittelyt voitaisiin tehdä myös peräkkäin samanaikaisen käsittelyn 58 95472 sijasta). EcoRI-Rsal-pilkkomistuotteesta otettiin talteen 420 emäsparin fragmentti, joka sisälsi AP-promoottorin.

trp S.D. -sekvenssi saatiin seuraavasti. Plasmidi tai organismi, joka sisältää trp-promoottorin /PIFN-beta 2, 5 D. Leung et ai., Biotechnology 2 (1984) 458-4647, pilkottiin Xbal:llä ja Rsal:llä, ja otettiin talteen 30 emäsparin fragmentti, joka sisältää trp S.D. -sekvenssin. Tämä fragmentti ligatoitiin 420 emäsparin AP-promoottorifrag-menttiin, jolloin saatiin 450 emäsparin EcoRI-Xbal-frag-10 mentti E. Fragmentti E:n nukleotidisekvenssi on

EcoRI

GAATTCAACTTCTCCATACTTTGGATAAGGAAATACAGACATGAAAAATCTCATTGCTGAGTTGTTATTT AAGCTTGCCCAAAAAGAAGAAGAGTCGAAAGAACTGTGTGCGCAGGTAGAAGCTTTGGAGATTATCGTCA 15 CTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTA CGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTA TTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTT

trpS.D. Xbal atagtcgctttgtttttattttttaatgtatttgtacgcaagttcacgtaaaaagggtatUTägä 20 Fragmentit A, B, C ja D ligatoitiin keskenään ja li- gaatioseoksella transformoitiin E. coli 294. Transformantit identifioitiin kasvattamalla ampisilliiniä sisältävillä LB-maljoilla. Plasmidi trpSTIITNF eräästä transformantti-pesäkkeestä. Tämä plasmidi pilkottiin Xbal:llä ja EcoRI:llä 25 trp-promoottorin poistamiseksi ja ligatoitiin sitten 450 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmenttiin E, joka sisältää E. colin alkalisen fosfataasin promoottorin. Tuloksena olevalle plas-midille annetaan nimeksi pAPSTIITNF.

Esimerkki 23 30 Tuumorinekroositekijän ja erityssignaalisekvenssin . fuusioproteiinin ilmentyminen ja prosessointi E. coli NL106 transfektoitiin pAPSTIITNF:llä ja tuotteella inokuloitiin 10 litraa alustaa (pH 7,0), jonka koostumus oli: !M m f «ti· n t«t · 59 £5472

Aineosa 9A

(nh4)2so4 5'° k2hpo4 2'6

NaH2P04 1,3 5 Na-sitraatti KC1 1/5 NZ Amine AS -*/0

Hiivauute 2 A

MgS04 1,2 10 Glukoosi 25,0

Hivenaineliuos (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B ja Mn-ioneja)

Ampisilliini 20,0 mg_

Viljely tehtiin samalla tavalla kuin esimerkissä 19, mutta 15 tällä kertaa saavutettiin A^g-arvo 140. Tässä vaiheessa viljelmä sisälsi noin 400 mg/1 tuumorinekroositekijää, joista noin 70-80 % oli elektroforeesigeelin perusteella arvioituna prosessoitunut asianmukaisesti valmiiksi proteiiniksi. Suunnilleen saman verran tuumorinekroositekijä-20 aktiivisuutta saatiin talteen esimerkin 19 mukaisella kokonaisten solujen uutolla ja solujen osmoottisella shokilla. Esimerkki 24

Muiden tuumorinekroositekijäjohdosten muodostaminen j a ilmentyminen 25 Kuvion 10 TNF-aminohapposekvenssin mutanttijohdoksia .: I valmistettiin, jotta saavutettaisiin yksi tai useampia ai nakin seuraavista päämääristä: Puoliintumisajan in vivo piteneminen, sytolyyttisen aktiivisuuden kasvu, kasvainsolui-hin ja normaalisoluihin kohdistuvan sytolyyttisen vaiku-30 tuksen erotuksen suurentaminen. TNF-immunogeenien valmistaminen anti-TNF-vasta-aineiden saamiseksi diagnostisiin käyttötarkoituksiin, ainutkertaisten kohtien valmistaminen kovalenttista muuntamista varten (esimerkiksi kohdat, joihin entsyymimerkkiaineet sitoutuvat kovalenttisesti valmis-35 tettaessa diagnostisia EMIT- tai ELISA-reagensseja) ja TNF:n fysikaalisten ominaisuuksien, esimerkiksi liukoisuu- 60 - S5472 den, pirn ja vastaavien, muuttaminen. Haluttu aktiivisuus määritetään valituista johdoksista sinänsä tunnetuin soveltuvin rutiinikokein.

On edullista, etteivät TNF ja sen johdokset sisällä 5 TNFrää, jonka jakso vastaa ei-kädellisten TNFrn jaksoa, eikä niillä edullisesti ole myöskään ei-kädellisten TNF:ien aminopäitä, esimerkiksi deValArg-aminopäätä, joka on luonteenomainen kaniinin tuumorinekroositekijälle, eikä myöskään TNFrn aminopäätä Val-Arg-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-10 Pro-Val-Ala-Val-Ser-Val-Ala-Asn-Pro-Aln-Ala-Glu-Gly- /Wang et ai., Science 228 (1985) 149-154/.

Seuraava, J. Adelmanin et ai. julkaisuun /DNA 2(3) 183-1937 perustuva menetelmä on yleensä käyttökelpoinen minkä tahansa mutantti-TNF-DNA-sekvenssien, jotka sisältä-15 vät hiljaisia mutaatioita tai koodaavat mutantti-TNFrää, muodostamiseen ja ilmentämiseen. Hakemuksen liian pituuden välttämiseksi kuvataan tässä tyypillisiä johdoksia, joissa Arg 32 on muutettu histidyyliksi (substituutio), His 73 on poistettu (deleetiomutaatio) ja Leu 157:ään on fuusioitu 20 leusyyli (insertio). Kaikki muut mutanttispesiekset muodostetaan kuitenkin samalla tavalla.

Alan asiantuntijat tietävät muitakin menetelmiä, jotka soveltuvat hiljaisten tai ilmentyvien mutaatioiden synnyttämiseen tuumorinekroositekijää koodaavaan DNArhan.

25 Mutantti-DNA voidaan esimerkiksi muodostaa yksinkertaises-ti syntetisoimalla kemiallisesti koko sekvenssi tai syntetisoimalla osa sekvenssistä ja ligatoimalla saatu fragmentti loppuosaan tarvittavasta DNA rsta. Kemiallinen DNA-syntee-si on edullinen, kun halutaan valmistaa mutantti suoraan 30 hankkimatta ensin luonnollisista lähteistä tuumorinekroosi-y tekijää koodaavaa DNArta. Tavallisesti kuitenkin lähtö-DNA

koodaa luonnollista aminohapposekvenssiä, sen alleelliset muunnokset mukaan luettuina ja halutaan valmistaa siitä tiettyjä mutanttijohdoksia. .

35 Valmistettaessa mutantti-TNF-johdoksia, on toivoit- tavaa välttää sellaisia kodonimuutoksia, jotka antavat I III I H ill I I I 33 . ; 95472 61 ' DNA:sta kopioituneelle mRNA:lie mahdollisuuden muodostaa lujia varsi-silmukka-rakenteita. Tällaisten rakenteiden välttäminen parantaa yleensä saantoja. Samasta syystä tu—_ lisi käyttää transformoitavan isännän kannalta edullisia 5 kodoneja.

Soveltuva lähtöaine-DNA on pTrpXAPTNF:n (esimerkki 17) EcoRI-HindIII-fragmentti, joka saadaan pilkkomalla peräkkäin EcoRI:llä ja HindIII:lla ja eristämällä sitten TNF-geenin sisältävä fragmentti. Tämä fragmentti sisältää trp-10 promoottorin ja metionyyli-tuumorinekroositekijää vastaavan rakennegeenin. Tämän geenin mutageneesiin sopivan yksisäi-keisen kopion saamiseksi EcoRI-HindIII-fragmentti kloonataan faagin M13 mp8 RF DNA:n polykytkijäkohtaan [J. Messing et ai., Gene 19 (1982) 269-276; "RF" tarkoittaa faagin 15 replikoituvaa muotoa; tämä faagi on kaupallisesti saatavissa/. Annos EcoRI-HindiII-pilkkomisseosta lisätään ligaa-tioreaktioseokseen, joka sisältää 10 ng M13 mp8 RF -DNA:ta, joka on ennalta pilkottu EcoRI:llä ja HindIII:lla. Kun li-gaatioseosta on inkuboitu huoneen lämpötilassa kaksi tun-20 tia, sillä transformoidaan E. coli JM103 (kaupallisesti saatavissa oleva kanta; myös kantaa JM101 voidaan käyttää). Transformoidut solut siirrostetaan käyttäen pinta-agaria, joka sisältää X-GAL:ia (dibromidikloori-indolyyligalaktosi-dia) ja IPTG:tä (isopropyylitiogalaktosidia). Bakteerivil-25 jelmiä (1 ml), jotka on infektoitu värittömistä plakeista poimituilla faageilla, käytetään M13 mp8/TNF RF —DNA:n eristämiseen Miniscreen-menettelyllä /Birnboim ja Doly,

Nuc. Acids Res, 7 (1980) 1513-1523/. Saatavassa yhdistelmä- faagissa M13 mp8/TNF on TNF-geenin koodaava säie.

30 Paikkaohjattua mutageneesia varten syntetisoidaan oligodeoksiribonukleotideja (mutageneesioligomeerejä), joiden sekvenssit ovat komplementaarisia jaksoille, jotka ulottuvat 15 emäksen verran mutaatiokohdan kummallekin puolelle, kuten ilmenee seuraavasta kaaviosta, jossa N tar-35 koittaa komplementaarisia emäksiä ja M insertoitavaa, de-letoitavaa tai substituoitavaa nukleiinihappoa. Insertiot 62 95472 ja deleetiot tehdään tavallisesti kolmen emäksen ryhminä geenin loppuosan pitämiseksi "vaiheessa".

Deleetioihin: oligomeeri-DNA (N),,- (N)*-

ID ID

vektori-DNA (N)15 ^N^15 5 Substituutioihin: oligomeeri-DNA (N).^ ) (N)15 vektori-DNA (N)1C (M~) (N),c

l d 1 ID

Insertioihin: oligomeeri-DNA (N) ^N^15 vektori-DNA (N)Λ c (N)Λ c

ID ID

tarkoittaa emästä tai oligomeeriä, joka ei ole komplemen-10 täärinen emäkselle tai oligomeerille M2* on tässä haluttu mutanttisekvenssi. On tavallista valmistaa myös oligo-meerejä, jotka saavat aikaan useamman kuin yhden tyyppisiä mutaatioita samalla kertaa.

Antisense-oligomeeri Arg-his 32 -mutanttia varten 15 on p CAG GAG GGC ATT GGC ATG GCG GTT CAG CCA CTG-OH.

Antisense-oligomeeri His 73 -deleetiota varten on p GTG GGT GAG GAG CAC GGT GGA GGG GCA GCC-OH.

Antisensen-oligomeeri Leu 58 -insertiota varten on p TGT TCG TCC TCC TCA AAG CAG GGC AAT GAT CCC-OH.

20 Nämä alukkeet syntetisoidaan tavanomaisin menetel min. Mutageneesissä käyttämistä varten 10 pikomoolia oligo-meerejä tai lac-aluketta 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-31 kutakin fosforyloidaan 30 minuuttia 37°G:ssa 10 ^,ul:ssa 50 mm Tris. HC1 (pH 7,5), joka sisältää 0,1 mmol/1 EDTA ja 10 mmol/1 25 MgCL2, 10 mmol/1 ditiotreitolia, 0,1 mmol ATPrtä ja kaksi : yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. Koettimina käyttämistä varten (ks. infra) fosforyloidaan kaksi pikomoolia synteettistä oligonukleotidia muuten edellä kuvatulla tavalla, 32 mutta korvataan ATP (0,1 mmol/1) - P-ATP:llä (1 ^umol/1, 30 Amersham). Ominaisaktiivisuudet ovat yleensä korkeampia kuin 5 x 10® cpm/pmol oligonukleotidiketjua.

* Kunkin oligomeerin ja lac-alukkeen hybridisointi yksisäikeiseen faagi M13 mp8/TNF:stä saatavaan DNA:han, jota seuraa alukelaajennus, johtaa osittaisten heterodup-35 leksi-DNA:iden muodostumiseen, joiden toinen säie sisältää mutantti-DNA:n.

95472 63

Osittaisen heterodupleksin muodostamista varten pidetään yksisäikeistä M13 mp8/TNF-DNA:ta (300 ng) 80°C:ssa (2 min), 50°C:ssa (5 min) ja huoneen lämpötilassa (5 min) 20 ^ulissa 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), joka sisältää 0,1 mmol/1 5 EDTA, 50 mmol/1 NaCl ja 1 pmol kutakin fosforyloitua oligo-ja aluketta (lisätään annoksina kinaasireaktioseok— sesta). Alukelaajennus aloitetaan lisäämällä 30 /Ui 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), joka sisältää 0,1 mmol/1 EDTA, 12 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 ditioreitolia, 0,7 mmol/1 ATPstä, 0,2 10 mmol/1 dGTPrtä, dTTP:tä ja dCTP:tä kutakin, kaksi yksikköä E. coli:n DNA-polymeraasi I:n suurta fragmenttia ja 20 yksikköä T4-DNA-ligaasia. Kun reaktioseoksia on pidetty 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, reaktioseoksia inkuboidaan neljä tuntia 37°C:ssa ja sitten yön yli 4°C:ssa. Uutetaan 15 annoksittain fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan 15 /Ul:aan vettä. Näiden annosten sisältämällä DNA:11a transformoidaan E. coli JM103.

lac-aluke hybridisoituu faagin oligomeerin 5'-puolelle. Alukepidennys stabiloi heterodupleksin rakennetta.

20 Oligomeeri ja aluke fosforyloidaan entsymaattisesti, jotta T4-DNA-ligaasi voi liittää kytkettävät DNA-ketjut.

Fenolilla uutettu DNA annoksesta C (10 /Ui) lisätään 10 /ul:aan 0,06 M Na-asetaattia (pH 4,5), joka sisältää 0,6 mol/1 NaCl, 0,6 mmol/1 ZnCl2 ja 200 yksikköä S.,-25 nukleaasia. Kun seosta on inkuboitu 37°C:ssa viisi minuut-: tia, lisätään hiivan tRNAsta (5 /Ug) ja nukleiinihapot otetaan talteen uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolilla. Käytettäessä samoja S^-olosuhteita, saadaan 30 /ug:sta yksisäikeistä M13 mp8 -DNA:ta (noin 10 000 pfu) alle 100 30 täplää DNA-transformaatiotutkimuksessa, kun taas sama määrä RF-DNA:ta säilyttää transformointikykynsä yli 80-%:isesti.

S -käsitellyllä DNA:11a transformoidaan E. coli JM103, ja tuloksena olevat faagit analysoidaan tutkimalla täplät in situ.

35 Bakteerimaljoista (läpimitta 15 cm), jotka sisältä vät joitakin satoja yhdistelmä-M13-faagitäplää, tutkitaan 64 95472 in situ -täplähybridisaatiolla /Benton et al., Science 196 (1977) 180-1827 sekä parenteraalinen että mutanttigenotyyp-pi käyttämällä asianmukaisia leimattuja oligomeerejä erillisillä suodatinsarjoilla (noin 106 cpm/suodatin). Hybri-5 disoidaan yön yli 50°C:ssa 5 x SSC:ssä, joka sisältää 40 % formamidia. Suodattimet pestään 45°C:ssa 2 x SSC:ssä, joka sisältää 0,02 % natriumdodekyylisulfaattia, kuivataan ilmassa ja kuvataan röntgenfilmille -70°C:ssa kuvanvahvistus-levyä käyttäen.

10 On välttämätöntä vaihdella hybridisaatio-olosuhtei- den ankaruutta (SSC-pitoisuutta muuttamalla), jotta saadaan erotetuksi toisistaan oligomeerin hybridisoituminen mutantti-DNA-säikeeseen (täydellinen komplementti) ja lähtö-aine-DNA:han; kullakin mutantilla on erilainen hybridisoi-15 tumiskyky korvattujen, poistettujen tai sijoitettujen emästen luonteen ja lukumäärän mukaan. Yhden emäksen mutaation havaitseminen vaatii esimerkiksi hyvin ankaria olosuhteita, jotta pystyttäisiin erottamaan toisistaan mutantti ja muuttumaton parentaali-DNA. Kun mutaatio on pieni, esimerkiksi 20 yhden kodonin deleetio tai 1-3 emäksen korvautuminen, tulisi hybridisaatiokoettimen olla pienempi kuin mutaatiossa käytettävä oligomeeri. Koettimen pituus on tällöin tyypillisesti noin 14-20 emästä. Deleetiomutanttien tutkimista voidaan helpottaa käyttämällä koetinta, joka sisältää pois-25 tetun jakson tai koostuu siitä, tämän jakson häviämisen : tutkimiseen. Jos tämä koetin ei hybridisoidu valitun täplän sisältämän DNA:n kanssa, voidaan päätellä, että on tapahtunut haluttu kohdejakson poistuminen.

Täplä, joka hybridisoituu lainatun oligomerin kans-30 sa, poimitaan ja sillä inokuloidaan E. coli JM103. Yksi-säikeinen (ss) DNA preparoidaan supernatantista ja kaksi- φ säikeinen (ds) DNA solupelletistä. ssDNA:ta käytetään templaattina kloonin dideoksisekventointiin, joka tehdään käyttämällä M13-yleisaluketta tai synteettistä oligomeeriä, 35 joka on komplementaarinen jaksoille, jotka sijaitsevat tuu-morinekroositekijä-DNA mutaatioalueen 3'-puolella.

il ia i mii m i st 65 9547-2

Dideoksisekventoinnilla varmistetaan, että talteen otettu täplä sisältää mutantti-DNA:n. Tällaisesta faagista käytetään merkintää M13 mp8/TNFmtnt.

M13 mp8/TNFmtnt pilkotaan EcoRI:llä ja HindIII:lla 5 ja otetaan talteen TNF:ää koodaava fragmentti. pTrpXAPTNF pilkotaan EcoRI:llä ja HindIII:lla ja otetaan talteen vek-torifragmentti. Mutanttifragmentti ligatoidaan sitten vek-torifragmenttiin ja ligaatioseoksella transformoidaan E. coli W3110, NL106 tai 294 (ATCC 31 446). Mutantti-TNF ote-10 taan talteen esimerkkien 18 ja 19 mukaisella menetelmällä. M13-mutageneesistä löytyy lisätietoja GB-hakemusjulkaisusta 2 130 219A.

Tällä menetelmällä valmistetut mutantit jakautuvat kolmeen ryhmään: substituutiot, deleetiot ja insertiot ja 15 edelleen alaryhmiin seuraavassa taulukossa esitettävällä tavalla. Ellei toisin mainita, mutantit ovat kuvion 10 mukaisen valmiin tuumorinekroositekijän mutantteja.

• t • i » 66 95472

Osoitetussa koh-

Mutanttityyppi dassa tapahtuva _TNF - kohta_tyypillinen muutos A.Substituutiot 5 I. Muutokset varauksen määrässä tai luonteessa 1. arg 6 hi s 2. lys 65 arg 3. pro 20 arg 10 4. asp 10 his 5. glu 53 thr 6. gin 47 asp 7. asp 45 gin or asn 8. asn 39 asp 15 9. asn 34 gin 10. leu 29 asp 11. tyr 115 Ile 12. glu 116 lys 13. pro 117 thr 2o 14. glu 127 tyr 15. lys 128 his 16. ala 134 tyr 17. glu 135 lys 18. tyr 141 pro 25 19. asp 143 ser Λ 20. ala 145 thr 21. glu 146 asn 22. gin 149 lys 23. leu 120 lys 30 II. Muutokset hydrofiilisessä tai hydrofobisessa luonteessa * I. leu 57 tyr 2. ser 52 leu 3. vai 41 tyr 35 4. gly 108 phe 67 95472

Osoitetussa kohdassa tapahtuva tyypil-Mutanttityyppi_TNF-kohta linen muutos__ 5> leu 120 thr 5 6. ser 133 gly 7. ala 134 thr 8. gly 148 ser 9. vai 16 thr III. eteerinen muutos (muutoksia ™ sivuketjun koossa) 1. Leu 63 phe 2. Ser 52 tyr 3. Ile 58 leu 4. gly 40 ile 15 5. vai 13 phe 6. leu 120 phe 7. ile 146 gly 8. asn 137 glu 9. ile 154 phe 20 10. ile 155 gly 11. phe 144 ile B. Insertiot

1. 157:n jälkeen g!y gly-COOH

25 2. Asp 10:n ja Lys 11:n välissä his 3. ile 58:n ja tyr 59:n välissä leu 4. Ser 60:n ja gin 61:n välissä lys 5. arg 31:n ja arg 32:n välissä ala 6. gly 121:n ja gly 122:n välissä gly 30 7. ennen vai 1 immunogeeninen poly- peptidi 8. leu 157:n jälkeen immunogeeninen poly- peptidi 9. gin 149:n ja vai 150:n välissä gly gly 35 10. preTNF:n ala-1:n ja vai 1:n välissä !YS ar9 68 95472

Osoitetussa kohdas- w ^ sa tapahtuva tyy-

Mutant ti tyyppi_TNF -kohta_ pillinen muutos 5 C· 1. Gin 149 2. lys 112 3. vai 1 - arg 2 4. vai 1 - pro 8 5. ala 22 10 * 6· arg 32 7. glu 53 8. ala 111 - lys 112 9· ala 123 10. il e 154 H· glu 127 D. Kombinaatiot 1* ile 58 leu leu 57 phe 20 , c’ 9ln 149 poistetaan tyr 151 phe lys 112 poistetaan glu 115 lys 4* vai 1 thr . 25 ala 22 lys : ! gly 24 asn ala 33 asp 5· tyr 115 phe glu 116 lys 30 6‘ sijoitetaan gly gly 121:n ja gly 122:n väliin, lisätään gly gly-COOH leu 157:n jälkeen V 7. poistetaan vai 1 - Gly 66 ja korvataan jaksolla NH2-Leu Ala Ile Ile Gly Phe Tyr Vai Gin Gly Ser Glu Ala-

Phe Asp Leu Tyr Asp Pro Arg Asn Ile Glu Ala Ser Leu Arq-

Asp Gly Lys Glu Leu Gin Phe Vai Gly Gly Leu Tyr Ile Pro-

Glu Tyr Trp Pro Lys Ala Glu Ala Gly Glu Pro Thr- 95472 69

Osoitetussa kohdas-.sa tapahtuva tyy-

Mutanttityyppi_TNF -kohta_pillinen muutos 8. poistetaan ala 111 5 ala 109 gin leu 120 his 9. asn 19 gin asn 92 gin •jO asn 137 gin

Huomionarvoisia ovat mutantit, joissa trypsiinihyd-rolyysikohdat arg 2, arg 6 (ks. esimerkit 20 ja 21), arg 32 ja arg 131 ovat poistuneet tai muuttuneet siten, etteivät 15 ne enää ole herkkiä trypsiinille. Tämä saattaisi pidentää tuumorinekroositekijän puoliintumisaikaa in vivo fermen-tatiivisen pilkkoutumisen mahdollisuuden pienetessä. Kohdat arg 2 ja arg 6 eivät ole ratkaisevia, koska biologinen aktiivisuus säilyy jopa näiden alueiden poistamisen jälkeen. 20 Pilkkoutuminen kohdista arg 32 ja arg 131 johtaa aktiivi-suushäviöihin. Siten on toivottavaa korvata arg 32 ja/tai arg 131 histidinyylillä tai, vähemmän edullisesti, ginillä. Tämä poistaa entsyymiherkkyyden tai alentaa sitä, mutta samalla sivuketjun emäksisyys säilyy. Myös Arg 31 korvataan 25 histidinyylillä tai, vähemmän edullisesti, glutamiinilla • < samoista syistä. Entsyymihydrolyysikohtia voidaan myös lisätä fuusiopolypeptidien ja TNF-sekvenssien väliin, jotta saataisiin kohtia valmiin tai mutantti-TNF:n ennalta määrättyä vapautumista varten tai tällaisilla kohdilla korva-30 taan ryhmiä preTNFin esijaksossa.

« asp 45:n korvautumisen asnillä ja ilmentymisen isän- täsolussa (esimerkiksi hiiva- tai nisäkässolussa), jolla on glykosylointikyky, odotetaan tuottavan glykosyloitua tuumorin ekroo s i tek i j ää .

70 95472

Esimerkki 25

Tuumorinekroositekijän ilmentyminen hiivassa ADH-promoottorin ohjauksessa

Plasmidi TrpXAPTNF muodostetaan muuten esimerkissä 5 17 kuvatulla tavalla, mutta p20KLT tai ptrpETA (tai pBR322) pilkotaan EcoRIrllä ja HindIII:lla Xbal:n ja HindIII:n sijasta ja valmistetaan synteettinen fragmentti B, jossa on tarttuva EcoRI-pää tarttuvan Xbal-pään sijasta. Ligaatio-seoksella transformoidaan sitten E. coli ATCC 31 446 ja 10 identifioidaan restriktioanalyysillä plasmidi pTNFRI, joka sisältää EcoRI-kohtien rajoittaman tuumorinekroositekijää koodaavan DNA:n. Plasmidi pTNFRI eristetään, pilkotaan EcoRIrllä ja otetaan talteen tuumorinekroositekijä-DNA:n sisältävä fragmentti T-1.

15 Plasmidi pFRPn (EP-hakemusjulkaisu 60 057A) pilko taan EcoRIrllä, käsitellään alkalisella fosfataasilla re-sirkularisoitumisen estämiseksi, ligatoidaan tuumorinekroo-sitekijäfragmenttiin T-1 käyttämällä T4-DNA-ligaasia ja ligaatioseoksella transformoidaan sitten E. coli ATCC 31 446. 20 Ampisilliiniresistentit pesäkkeet tuottavat kahta plasmi-diryhmää, joissa T-1-insertti on päinvastaisissa orientaatioissa agaroosielektroforeesigeeleillä tehdyllä restriktioanalyysillä määritettynä. E. coli -transformanteista saatavat plasmidit puhdistetaan ja niillä transformoidaan 25 hiiva, jossa on trp1-mutaatio (esimerkiksi hiivakanta *' RH218, rajoittamaton ATCC-talletus nro 44 076), joka antaa trp+-fenotyypin. Plasmidien, joissa orientaatio on sellainen, että segmentin T-1 aloituskodoni on alkoholidegydro-genaasipromoottorifragmentin vieressä, havaitaan transfor-30 moiva hiiva siten, että siinä ilmentyy tuumorinekroosite-kijä. Tuumorinekroositekijä otetaan talteen hiivatransfor- « ··· manttiuutteista. Plasmidin stabiilisuus laajamittaisissa fermentoinneissa paranee, kun käytetään ilmentymisplasmi-dia, joka sisältää kahden mikronin repiikoitumisen aloitus-35 kohdan pRFPn:n kromosomaalisen replikoitumisen aloituskohdan 95472 71 (ars 1) sijasta ja sen kanssa yhteensopivaa isäntäkantaa /j. Beggs Nature 275 (1978) 104-1097·

Esimerkki 26

Tuumorinekroositekijän ilmentyminen nisäkässoluissa 5 Plasmidi pEHER (EP-hakemusjulkaisu 117 060A) pilko taan EcoRI:lla, käsitellään vasikan suoliston alkalisella fosfataasilla, ligatoidaan esimerkin 25 mukaiseen fragmenttiin T-1 ja transformoidaan ligaatioseoksella E. coli ATCC 31 446. Eristetään kaksi plasmidia (pEHERTNF I ja pEHERTNF 10 II)/ jotka sisältävät TNF-DNA:n päinvastaisessa orientaatiossa polyakryyliamidigeeleillä tehdyllä restriktioanalyy-sillä määritettynä. Näillä plasmideilla transformoidaan ja valikoidaan CHO DHFR-DUX-B11, CHO 1 ja Ltk”-solut.

Kudosviljelmäsolut transfektoidaan sekoittamalla 15 1 ^ug pEFERTNF I tai pEHERTNF II 10 ^ug:aan rotan kantaja- DNA:ta 250 ^ulzssa 0,25 M CaCl2, minkä jälkeen lisätään pi-saroittain 250 ^ul HEPES-puskuroitua fysiologista suolaliuosta (280 mmol/1 CaCl2, 1,5 mmol/1 Na2PC>4, 50 mmol/1 HEPES:iä, pH 7,1). Annetaan seistä 30 minuuttia huoneen 20 lämpötilassa ja lisätään liuos kudosviljelmäsoluille, jotka ovat 60 mm:n muovisissa kudosviljelymaljoissa. Käytetään CHO 1, CHO DHFR-DUX-B11 ja Ltk”-soluja. Maljat sisältävät 3 ml isähtäsoluille soveltuvaa kasvualustaa.

CHO 1 ja CHO DHFR-DUX-B11 -soluille kasvualusta on 25 Ham F-12 -alusta (Gibco), johon on lisätty 10 % vasikan-seerumia, 100 ^ug/ml penisilliiniä, 100 ^ug/ml streptomysiiniä ja 2 ^umM L—glutamiinia. Ltk —solulinjan alusta on Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta (DMEM), joka on täydennetty edellä kuvatulla tavalla.

30 Alusta poistetaan 3-16 tunnin kuluttua ja solut pes tään liuoksella, joka sisältää 20 % glyserolia fosfaatti-* puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. Kuhunkin maljaan lisätään tuoretta alustaa ja soluja inkuboidaan vielä kaksi vuorokautta.

35 Transfektoitujen isäntäsolujen valikointi tehdään trypsinisoimalla solut kahden vuorokauden kasvatuksen 72 95472 jälkeen (solut käsitellään steriilillä trypsiiniliuoksella (0,5 mg/ml), joka sisältää 0,2 mg/ml EDTA) ja lisäämällä noin 3 x 10^ solua 10 mm:n kudosviljelymaljoille, joissa on selektiivistä alustaa. dhfr”-soluja varten alusta on 5 F-12-alusta (Gibco), josta puuttuu glysiini, hypoksantiini ja tymidiini (GHT -alusta). DHFR+-isäntäsoluille lisätään metotreksaattia (100 - 1 000 mol/1) normaaliin kasvualustaan. Vertailunäytteinä toimivat solut, jotka transfek-toidaan ilman plasmidia ja plasmidilla pFD-11 (EP-hakemus-10 julkaisu 117 060A), joka sisältää normaalin DHFR:n. Solujen, jotka ottavat vastaan ja ilmentävät DHRF-plasmidia, pesäkkeet tulevat näkyviin 1-2 viikon kuluessa. Identifioidaan ne transformantit, jotka ilmentävät tuumorinekroosi-tekijää.

tl - IB:e liiii ϊ ι ίϋ . . i

Claims (8)

95472 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä ihmisen tuumorinekroositekijän valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi I: 5 1 10 Vai Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala 20 His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp 10 30 40 Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu 50 Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr 60 70

15 Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro 80 Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 90 Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys 20 100 110 Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 120 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu 130 140

25 Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp 150 Tyr. Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai Tyr Phe Gly Ile 157 Ile Ala Leu 30 tai sen aminohapposekvenssimutantin valmistamiseksi, jossa Vai1 ja/tai Arg2 on säilytetty ja joka on valittu ryhmästä, joka koostuu TNF-varranteista, joissa on substituutio His Arg 6:lie, Leu Arg 2:lie, Arg Lys 65:lie, Arg 35 Pro 20:lie, His Asp 10:lle, Thr Glu 53:lle, Asp Gin 47:- 74 95472 lie, Gin tai Asn Asp 45:lie, Asp Asn 39:lie, Gin Asn 34:-lle, Asp Leu 29:lie, lie Tyr 115:lie, Lys Glu 116:lie, Thr Pro 117:lie, Tyr Glu 127:lie, His Lys 128:lie, Tyr Ala 134:lie, Lys Glu 135:lie, Pro Tyr 141:lie, Ser Asp 5 143:lie, Thr Ala 145:lie, Asn Glu 146:lie, Lys Gin 149:- lle, Lys Leu 120:lie, Tyr Leu 57:lie, Leu Ser 52:lie, Tyr Val 41:lie, Phe Gly 108:lie, Thr Leu 120:lie, Gly Ser 133: lie, Thr Ala 134:lle, Ser Gly 148:lle, Thr Val 16:-lle, Phe Leu 63:lie, Tyr Ser 52:lie, Leu lie 58:lie, lie 10 Gly 40:lie, Phe Val 13:lle, Phe Leu 120:lle, Gly lie 146: lie, Glu Asn 137:lle, Phe lie 154:lle, Gly lie 155:-lle, lie Phe 144:lie, tai insertio Gly-Gly-COOH Leu 157:n jälkeen, His Asp 10:n ja Lys ll:n välissä, Leu lie 58:n ja Tyr 59:n välissä, Lys Ser 60:n ja Gin 61:n välissä,

15 Ala Arg 31:n ja Arg 32:n välissä, Gly Gly 121:n ja Gly 122:n välissä, immunogeeninen polypeptidi ennen Val 1, immunogeeninen polypeptidi Leu 157:n jälkeen, Gly-Gly Gin 149 ja Vai 150:n välissä, tai Gin 149:n, Lys 112:n, Ala 22:n, Arg 32:n, Glu 53:n, Ala 111-Lys 112:n, Ala 123:n, 20 lie 154:n, Glu 127:n deleetio, tai substituutio Leu Ile 58:lie ja Phe Leu 57:lie, Gin 149:n deleetio ja substituutio Phe Tyr 151:lie, Lys 112:n deleetio ja substituutio Lys Glu 115:lie, substituutio Thr Val l:lle, Lys Ala 22:lie, Asn Gly 24:lie, ja Asp Ala 33:lie, substituutio 25 Phe Tyr 115:lie, ja Lys Glu 116:lie, insertio Gly Gly 121:n ja Gly 122:n välissä, ja Gly-Gly-COOH Leu 157:n jälkeen, substituutio Vai l:stä Gly 66:een NH2-Leu Ala Ile Ile Gly Phe Tyr Vai Gin Gly Ser Glu Ala Phe Asp Leu Tyr. Asp Pro Arg Asn Ile Glu Ala Ser Leu Arg Asp Gly Lys 30 Glu Leu Gin Phe Vai Gly Gly Leu Tyr Ile Pro Glu Tyr Trp ·' Pro Lys Ala Glu Ala Gly Glu Pro Thr: 11a, Ala lll:n delee tio ja substituutio Gin Ala 109:lie ja His Leu 120:lie, substituutio Gin kullekin Asn 19:lie, Asn 92:lie ja Asn 137:lie, ja jolla on laadullisesti sama toiminnallinen 35 biologinen aktiivisuus kuin mainittua aminohapposekvens- 95472 siä omaavalla tuumorinekroositekijällä, tunnettu siitä, että kaavan I mukaisen TNF:n tai sen edellä mainitun mutantin valmistamiseksi viljellään solu, joka on transformoitu DNA:11a, joka koodaa kaavan I mukaista ih-5 misen tuumorinekroositekijää, tai solu joka on transformoitu DNA:11a, joka koodaa mainittua aminohapposekvenssi-mutanttia; annetaan tuumorinekroositekijän tai sen mutantin akkumuloitua viljelmään; ja viljelmästä otetaan talteen tuumorinekroositekijä tai sen mutantti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu solu on proka-ryootti tai alempi eukaryootti.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen tuumo-15 rinekroositekijä, joka on lymfotoksiinivapaa ja joka kä sittää aminohapposekvenssin l 10 Vai. Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Ly s Pro Vai Ala 20 20 His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp 30 40 Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu 50

25 Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr 60 70 Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro 80 Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 30 90 Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys 100 11° Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 120

35 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu 95472 130 140 Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp 150 Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie 5 157 lie Ala Leu.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuumorinekroositekijä on sy- 10 totoksinen.

5. Ihmisen tuumorinekroositekijää koodaava eristetty ja puhdistettu DNA, tunnettu siitä, että sillä ei ole yhtään väliintulevia sekvenssejä, jotka eivät tule luetuiksi ja että tuumorinekroositekijällä on 15 aminohapposekvenssi 1 10 Vai Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala 20

20 His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp 30 40 Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu 50 Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr 25 60 70 Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro 80 Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 90

30 Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys *: 100 110 Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 120 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu 95472 Ile Ala Leu.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä että se on synteettinen.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se on replikoituvassa vektorissa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi tai virus. 78 95472