FI98217C - Menetelmä nekroositekijän valmistamiseksi - Google Patents

Description

! 9θ2 1/

Menetelmä nekroositekijän valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta FI 852626.

5 Tämä hakemus koskee menetelmää ihmisen oleellises ti homogeenisen tuumorinekroositekijän valmistamiseksi, jolla on vaatimuksessa 1 esitetty aminohapposekvenssi.

Immuunisolut, kuten B-solut, T-solut, luonnolliset tappajasolut ja makrofagit, muodostavat tunnetusti ainei-10 ta, joilla on sytotoksinen vaikutus kasvainsoluihin, mutta ovat vaarattomia normaaleille soluille. Näille aineille on annettu erilaisia nimiä, esimerkiksi lymfotoksiini, tuumorinekroositekijä, NK-solujen sytotoksinen tekijä, hemorraginen nekroositekijä, makrofagisytotoksiini ja 15 makrofagin sytotoksinen tekijä. Tällä hetkellä ovat näihin nimiin liittyvien proteiinien indentiteetit epäselviä. Päävaikeutena on ollut se, että biologiset kokeet, joita käytetään proteiinien detektointiin, eivät tee eroa niiden välillä, se, että proteiinit näyttävät luonnossa 20 esiintyvän aggregaatteina tai hydrolyysituotteina ja se, että tähän asti saadut määrät ovat olleet niin pieniä, ettei ole saavutettu korkeaa puhdistumisastetta, jota vaaditaan proteiinien täydelliseen karakterisointiin.

Tällaisia sytotoksisia aineita löytyy tyypillises-25 ti intaktien eläinten seerumeista tai imusolu- tai imuso- • · j '/· lulinjaviljelmien supernatanteista sen jälkeen, kun eläi- ·;· met tai solut on käsitelty aineella, jonka tiedetään sti- ;’j’j muloituvan immuunisolujen lisääntymistä ( "indusoija" ).

Tämän jälkeen seerumi tai supernatantti otetaan talteen . .·. 30 Ja siitä tutkitaan sytotoksinen aktiivisuus kohdekasvain- • * · solulinjaa vastaan. Tavanomainen kohde on L929, hiiren • · · • · · *. kasvainsolulinja. Tämä ja muut tämäntyyppisissä biologi- sissa kokeissa käytettävät solulinjat ovat epäspesifisiä lyyttiseltä vasteeltaan, koska erilaiset, näennäisesti 35 erilliset imusolutuotteet pystyvät saamaan aikaan lyysin. Samanlaisia epäspesifisiä vasteita havaitaan tuumorinek-roosikokeissa in vitro. Siten sytolyysikokeet, joissa tehdään havainto- ja solulinjojen lysoitumisesta in vitro 98217 2 tai kasvainsolukon kuolemisesta in vivo, ovat kykenemättömiä erottamaan toisistaan erilaisia sytotoksisia imuku-dostuotteita.

Sytotoksiset tekijät on kokeiluluontoisesti luoki-5 teltu imusolujen, joista ne indusoituvat, perusteella.

Esimerkiksi lymfotoksiini on nimitys, jota yleensä käytetään B- tai T-lymfosyyttien tai niistä peräisin olevien solulinjojen sytotoksisista eritystuotteista, kun taas nimitystä tuumorinekroositekijä käytetään usein kuvaamaan 10 makrofagien tai niistä peräisin olevien solulinjojen sytotoksisia tuotteita. Tämä luokitusjärjestelmä ei kuitenkaan ole kehittynyt pisteeseen, jossa olisi mitään takeita siitä,että viitataan vain yhteen proteiiniin tai että proteiinit, joista käytetään eri nimiä, todella ovat eri-15 laisia.

On tehty yrityksiä kunkin solutyypin erittämien sytotoksisten tekijöiden puhdistamiseksi ja karakterisoi-miseksi. Siitä, missä määrin raportit vaihtelevat jonkin sytotoksisen tekijän jonkin tietyn ominaisuuden suhteen 20 tai ovat täysin ristiriitaisia, voitaisiin päätellä, että karakterisointi on ollut virheellinen tai että kukin solutyyppi erittää useita erillisiä sytotoksisia tekijöitä.

'···' Esimerkiksi makrofageista, monosyyteistä tai monosyytti- ' - : solulinjoista peräisin olevilla sytotoksisilla tuotteil- • "·· 25 la, vaikka niistä joskus käytetään yleisnimitystä tuumo- t · • ’/· rinekroositekijä, on raportoitu olevan ominaisuuksia, •i* jotka näyttävät ristiriitaisilta yhden sytotoksisen tuot- • · ·· ·*·'; teen teorian yhteydessä. Viittaan esimerkiksi seuraaviin julkaisuihin: R. MacFarlan et ai., AJEBAK 58(pt 5) (1980) . 30 489-500; D. Mannel et ai., Infection and Immunology 30(2) • · · (1980) 523-530; H. Ohnishi et ai., GB-patenttijulkaisu 2 • · · *. 106 117A; ja J. Hammerström, Scand. J. Immunol. 15 (1982) V·: 311-318.

Toisaalta C. Zacharzuk et ai. [Proc. Natl. Acad.

35 Sei. USA 80 (1983) 6341-6345] ehdottavat, että marsun ! lymfotoksiini ja marsun makrofagien sytotoksinen tekijä olisivat immuunikemiallisesti samanlaisia elleivät 3 98217 identtisiä. Samanlaisia päätelmiä esittävät Ruff et ai., /Lymfokines 2 ( 1981 ) 235-272, sivuilla 241-242./.

Yritykset karakterisoida immuunisytotoksisia tekijöitä ovat myös keskittyneet eläinten, jotka on altistettu 5 immunogeenisille antigeeneille, seerumien tai vatsaonte-lonesteiden käyttämiseen lähtöaineena. Nämä lähteet sisältävät rasitetun immuunijärjestelmän koko tuotannon kaikessa runsaudessaan vastakohtana yhden solutyypin tai -linjan tuotteelle tai tuotteille. Viittaan seuraaviin tämäntyyppi-10 siin julkaisuihin: S. Green et ai., J. Natl. Cancer Inst. 68(6) (1982) 997-1003 ("tumor necrosis-inducing factor"); M. Ruff et ai., J. Immunology 125(4) (1980) 1671-1677 ("tumor necrosis factor"); H. Enomoto et al., EP-hakemus 86475 ("antitumor substance"); H. Oettgen et al., "Recent 15 Results Cancer Res. 75 (1980) 207-212 ("tumor necrosis factor"); F. Kull et al., J. Immunol. 126(4) (1981) 1279- 1233 ("Tumor Cell Cytotoxin"); D. Mannel et al., Infection and Immunity 28(1) (1980) 204-211 ("cytotoxic factor"); N. Matthews et al., Br. J. Cancer 42 (1980) 416-422 20 ("tumor necrosis factor"); S. Green et al.·, Proc. Nat.

Acad. Sci. USA 73(2) (1976) 381-385 ("serum factor"); N. Satomi et al., Jpn J. Exp. Med. 51(6) 1981 317-322; N. Matthews, Br. J. Cancer 40 (1979) 534-539 ("tumor : necrosis factor"); K. Haranaka et al., Jpn. J. Exp. Med.

25 51(3) (1981) 191-194 ("tumor necrosis factor"); ja L. Old et al., EP-hakemus 90892: T. Umeda et al. , Cellular and Molecular Biology 29 (5) (1983) 349-352; ja H. Enomoto et ·«« **)* al. , EP-hakemus 86475.

• · ·

Muuta kirjallisuutta, johon tulisi tutustua, ovat 30 seuraavat julkaisut: J. Nisse-Meyer et al., Infection and Immunity 38 (1) (1982) 67-73; J. Klostergaard et al., Mol.

• · · V : Immunol. 18(12) (1981) 1049-1054; N. Sloane, US-patentti- . : julkaisu 4 359 415; H. Hayashi et al., US-patenttijulkai- : su 4 447 355; K. Hanamaka et al., EP-hakemus 90 892 35 (1983); ja G. Grabger et äl., Cellular Immunology 38 ·’ : (1978) 388-402.

98217 4 EP-hakemusjulkaisussa 100 641 kuvataan sytotoksis-ta polypeptidiä, jokea puhdistettiin suurin piirtein vapaaksi epäpuhtauksista ja joka saatiin ihmisen lymfoblas-toidisolu -viljelmästä. Tämä polypeptidi nimettiin lymfo-5 toksiiniksi, vaikkasensukulaisuus muihin lymfotoksiiniksi kutsuttuihin, kirjallisuudessa kuvattuihin polypeptidei-hin on arveluttava. Ei tiedetty, oliko tämä ainoa immuu-nisolujen tuottama sytotoksinen polypeptidi, kuten Zac-harchuk et ai. (imid.) ehdottavat vai onko se mahdolli-10 sesti jäsen sytotoksisten tekijöiden ryhmässä.

Edellä mainitun hakemuksen mukaisessa polypepti-dissä on kaksi aminopäätä, suurempi muunnos päättyy jaksoon Leu Pro Gly Vai Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr ... , 15 ja pienempi muunnos typistettyyn aminopäähän His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala ...

iemman kirjallisuuden mukaan interferonit, joilla on jonkin verran kasvaimia estävää aktiivisuutta ja heikosti karakterisoitu proteiini, jolla on AlaAla-aminopää 20 (GB-hakemusjulkaisu 2 117 385A) olivat ehdokkaita syto- toksiksi tekijöiksi, jotka eivät ole lymfotoksiineja.

Kuten tullaan havaitsemaan, tämän keksinnön mukaisesti '··' valmistettu tuumorinekroositekijä ei ole interferoni eikä : lymfotoksiini eikä siinä ole AlaAla-päätä. Tämän tutki- • 25 muksen päämääränä on (a) määrittää lopullisesti, onko « · ίolemassa muuta tuumorinekroositekijää kuin lymfotoksiini ·;· vai ei ja jos sellainen on olemassa, identifioida se sil- • · ·* .*·*; lä tavalla, että se selvästi erottuu muista tällaisista tekijöistä; (b) tuottaa tällaista tekijää muilla mene- # .·. 30 telmillä kuin soluviljelmän indusointi, joka on kallis ja ♦ · · tuottaa tuotetta, joka sisältää epäpuhtautena indu- • « · sointiainetta tai induktoimalla ääreisverilymfosyyttejä, joka on taloudellisesti epäkäytännöllistä, heikosti toistettavissa ja tuottaa homologisilla soluja plasma-35 proteiineilla kontaminoituneen tuotteen; (c) saada ai- kaantällaista tuumorinekroositekijää koodaava DNA ja ilmentää tämä DNA yhdistelmäviljelmelmässä; (e) muuntaa 5 pi p r'' Ί r-7 ^cz 1/ tällaisen tekijän koodausjaksoa tai rakennetta; (f) formuloida tällainen tekijä terapeuttisiin annostelumuotoih-in ja antaa sitä eläimille kasvainten hoitamiseksi, ja (g) tuottaa tällaiseen tekijään liittyviä diagnostisia 5 reagensseja.

Sytotoksinen tekijä on puhdistettu homogeeniseksi, karakterisoitu ja sitä on ilmennetty yhdistelmäviljelmäs-sä. Tätä tekijää kutsutaan mukavuuden vuoksi tuumorinek-roositekijäksi (TNF), ja se määritellään jäljempänä. Se 10 saadaan soluviljelmästä suurin piirtein homogeenisessa muodossa, jonka ominaisaktiivisuus on suurempi kuin noin 10 miljoonaa yksikköä/mg proteiinia ja yleisesti noin 100 miljoonaa yksikköä/mg.

Yhdistelmäviljelmässä syntetisoidulle ihmisen tuu-15 morinekroositekijälle on luonteenomaista sellaisten solu- komponenttien, proteiinit mukaan luettuina, läsnäolo, jotka eivät ole ihmissoluista peräisin ja jotka esiintyvät sellaisina määrinä ja ovat luonteeltaan sellaisia, että ne ovat fysiologisesti soveltuvia annettaviksi poti-20 laille yhdessä tuumorinekroositekijän kanssa. Nämä komponentit ovat yleensä peräisin hiivasta, prokaryootista tai muusta korkeammasta eukaryootista kuin ihmisestä ja niitä esiintyy vaarattomina kontaminoivina määrinä, jotka ovat suuruusluokaltaan alle noin 1 paino-%. Yhdistelmäso-25 luviljelmä tekee lisälcsi mahdolliseksi tuumorinekroosi- *tekijän tuottamisen täydellisesti vapaana homologisista ·;· proteiineista. Homologiset proteiinit ovat proteiineja, /;’· joita normaalisti liittyy tuumorinekroositekijään sen esiintyessä luonnossa, ts. soluissa, solueritteissä ja . 30 elimistön nesteissä. Eräs ihmisen tuumorinekroositekijäl- * · · .'I! le homologinen proteiini on esimerkiksi ihmisen seerumi- t « *. albumiini. Heterologisten proteiinien kohdalla tilanne on « * päinvastainen, ts. ne eivät luonnossa liity kyseessä olevaan tuumorinekroositekijään eivätkä esiinny yhdessä sen . ; 35 kanssa.

Tarjotaan käytettäväksi DNA, joka koodaa tuu-morinekroositekijää ja joka ilmennettynä yhdistelmä- 98217 6 eli transformanttiviljelmässä tuottaa runsaita määriä tuu-morinekroositekijää. Tämä DNA on uusi, koska cDNA, joka saadaan indusoidusta monosyyttisolulinjasta saadusta mRNArsta käänteiskopioinnilla, ei sisällä introneja ja on 5 vapaa mahdollisista reuna-alueista, jotka koodaavat organismien, joista mRNA on peräisin, muita proteiineja.

Kromosomaalinen DNA, joka koodaa TNF:ää, saadaan tutkimalla genomi-DNA-kirjastoja käyttäen cDNA:ta koettimena. Kromosomaalinen DNA on vapaa muita proteiineja koo-10 daavista reuna-alueista, mutta voi sisältää introneja.

Eristettyä tuumorinekroositekijä-DNA:ta on helppo muuntaa nukleotidisubstituutiolla, -deleetoilla tai -in-sertioilla, jolloin saadaan uusia DNA-jaksoja, jotka koodaavat tuumorinekroositekijää tai sen johdoksia. Näitä 15 muunnettuja jaksoja käytetään mutanttituumorinekroositeki-jän tuottamiseen ja valmiin tuumorinekroositekijän suoraan ilmentämiseen. Muunnetut jaksot ovat käyttökelpoisia myös tuumorinekroositekijän ilmentymistehon parantamiseen valituissa isäntä-vektorisysteemeissä, esimerkiksi muunta-20 maila jaksot isäntäsolun kodonipreferenssin mukaisiksi.

Nämä uudet DNA-jaksot tai niiden fragmentit leimataan ja niitä käytetään hybridisaatiokokeissa, joissa tut-. . kitaan tuumorinekroositekijää koodaavaa geneettistä mate- /; riaalia.

25 Menetelmissä tuumorinekroositeki jän syntetisoima- • " seksi DNA, joka koodaa tuumorinekroositeki jää, ligatoidaan • · : V replikoituvaan (lisääntyvään) vektoriin, vektorilla trans- ..II" formoidaan isäntäsolut, isäntäsoluja viljellään ja tuumori- :T: nekroositekijä otetaan talteen viljelmästä. Tätä yleismene- 30 telmää käytetään valmistettaessa tuumorinekroositekijä, . .·. jolla on monosyytin tuumorinekroositeki jän ominaisuudet • · ♦ tai uusia tuumorinekroositeki jän johdoksia, vektorin ra- • · · kenteesta ja transformoitavaksi valitusta isäntäsolusta.

• · *

Tuumorinekroositekijäspesieksiin, joita voidaan tällä ta-: 35 valla syntetisoida, kuuluvat valmis (valyyliaminoterminaa- : linen) tuumorinekroositekijä, pretuumorinekroositekijä π Ο Ο Ί *7 7 - kjoZ 1/ ("preTNF", määritelty tässä hakemuksessa) ja TNF-johdokset mukaan luettuina (a) fuusioproteiinit, joissa TNF tai jokin sen fragmentti on liittyneenä muihin proteiineihin tai poly-peptideihin TNF:n tai sen fragmenttien amino- ja/tai kar-5 boksyyliterminaalisissa aminohapoissa olevien peptidisi-dosten kautta, (b) TNF-fragmentit valmis tuumorinekroosi-tekijä ja preTNF-fragmentit, joissa mahdollinen preproteii-niaminohappo on fragmentin aminoterminaalinen aminohappo, mukaan luettuina, (c) TNF:n tai sen fragmenttien (valmis 10 tuumorinekroositekijä mukaan luettuna) mutantit, joissa yksi tai useampi aminohapporyhmä on substituoitu, tuotu lisää tai poistettu ja/tai (d) edellä mainittujen proteiinien, fragmenttien tai mutanttien johdokset, joiden aminopäähän on lisätty metionyyli tai muunnettu metionyyli (kuten for-15 myylimetionyyli tai muu suojattu metionyylispesies).

Jos nisäkässolu transformoidaan (a) vektorilla, joka sisältää koko tuumorinekroositekijän rakennegeenin (5'-pään aloituskodoni mukaan luettuna) tai (b) valmista tuumorinekroositekijää tai tuumorinekroositekijäjohdosta 20 koodaavalla geenillä, joka on ligatoitu eukaryootin eritys-esijaksoon (joka voi olla myös esijakso, joka saa aikaan tuumorinekroositekijän erittymisen) ja solua viljellään, saadaan tavallisesti talteen valmista tuumorinekroosite-···' kijää viljelmästä.

: 25 Samalla tavalla, jos DNA, joka koodaa TNF:ää, liga- ; *·· toidaan vektorissa eritysesijaksoon, jota transformoitava • · • isäntäsolu (tavallisesti organismi, josta mainittu esijak- ·;· so on saatu) käsittelee oikealla tavalla, isäntä transfor- • •m :*·*; moidaan vektorilla ja sitä viljellään, syntetisoituu tuumo- 30 rinekroositekijä, jossa ei ole aminoterminaalista metionyy- . .·. liä tai suojattua metionyyliä. Erityisesti E. coli, joka • · · ·" on transformoitu vektoreilla, joissa valmista tuumorinek- • · · · • · · roositekijää koodaava DNA on ligatoitu 5'-päästään DNA:han, joka koodaa STII-enterotoksiinisignaalipolypeptidiä, kä-35 sittelee oikealla tavalla suuren osan hybridipreproteii-.·. : nista valmiiksi tuumorinekroositekijäksi. Voidaan myös 8 96217 valita sellaiset eritysesijaksot ja isäntäsolut, jotka johtavat valmiin proteiinin asianmukaiseen kuljetukseen solun periplasmaan.

Tässä kuvataan myös muut tuumorinekroositekijäjoh-5 dokset kuin aminohapposekvenssi- tai glykosylaatiomuun-nokset. Tällaisille johdoksille on luonteenomaista kova-lenttinen tai aggregaatin kautta tapahtuva liittyminen kemiallisiin ryhmiin. Nämä johdokset kuuluvat yleensä johonkin seuraavista kolmesta ryhmästä: suolat, kovalent-10 tiset sivuketju- tai pääteryhmämuunnokset ja adsorptio-kompleksit.

Jos valmista tuumorinekroositekijää koodaava DNA ligatoidaan vektoriin, vektorilla transformoidaan isäntä-solu ja solua viljellään, esiintyy valmista tuumorinek-15 roositekijää solun sytoplasmassa. Siten on tarpeetonta rakentaa erityisjärjestelmiä valmiin tuumorinekroositekijän saamiseksi. Tämä oli yllättävää, koska suora ilmentyminen tavallisesti saa aikaan metionyloituneen proteiinin. Proteiini on lisäksi pysyvä ja liukenee yhdistelmä-20 soluviljelmään, ts. se ei pilkkoudu solunsisäisten pro- teaasien vaikutuksesta eikä saostu. Siten on saatu aikaan uusia viljelmiä, jotka sisältävät alempien eukaryoottien tai prokaryoottien soluja, joiden sytoplasmassa esiintyy : metionyloitumatonta tuumorinekroositekijää.

25 Vaikka tuumorinekroositekijää voidaan valmistaa ;*♦*; viljelemällä eläinsolulinjoja, esimerkiksi monosyyttiso- • · lulinjaa, joka indusoidaan kasvattamalla 4-beta-forboli-12-myristaatti-13-asetaatin (PMAtn) läsnä ollessa tai • · * immortaalisolulinjoja, kuten hybridoomia tai EBV-trans- . 30 formoituja soluja (US-patenttijulkaisu 4 464 465), on • · · *;j·* edullista syntetisoida tuumorinekroositekijää yhdistelmä- • · « *·* * soluviljelmässä jäljempänä kuvattavalla tavalla.

Kun tuumorinekroositekijä on valmistettu fermen-toimalla, se yleensä puhdistetaan ottamalla talteen vil-35 jelmän supernatanttineste tai hajotetut solut, poistamal-’ ; la kiinteä aines, adsorboimalla tuumorinekroositekijä supernatanttiseoksesta (joka sisältää tuumorinekroosite- 9 O O o Λ Γ· 1/ kijän ja muita proteiineja) hydrofobiselle aineelle, eluoimalla tuumorinekroositekijä tältä aineelta, adsorboimalla tuumorinekroositekijä anioninvaihtohartsille (edullisesti kvaternaarisilla aminoryhmillä substituoi-5 tu), jolla on suurin piirtein yhtenäinen hiukkaskoko ja eluoimalla tuumorinekroositekijä hartsilta. Tuumorinek-roositekijäkoostumuksia mahdollisesti väkevöidään ja puhdistetaan kromatografisin menetelmin missä tahansa puh-distusmenettelyn vaiheessa, esimerkiksi isoelektrisesti 10 kokoamalla tai johtamalla seulontageelin, kuten Sephadex G-25:n, läpi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle tuumorinekroosi-tekijän valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

15 Yhdistelmä- tai indusoidusta soluviljelmästä saatu puhdistettu TNF yhdistetään terapeuttista käyttöä varten fysiologisesti vaarattomiin stabilointiaineisiin ja apuaineisiin ja valmistetaan annostelumuotoon esimerkiksi kylmäkuivaamalla annostelupulloissa tai säilyttämällä 20 stabiloituina vesipitoisina valmisteina. Vaihtoehtoisesti tuumorinekroositekijä sisällytetään polymeerimatriisiin istutettavaksi kasvaimiin tai leikkauskohtiin, joista on poistettu kasvaimia, jolloin saadaan aikaan tuumorinek-roositekijän pitkäaikainen vapautuminen paikallisesti ; 25 suurena pitoisuutena.

Koostumukset saadaan keksinnön mukaisesti vapaina • « kontaminoivista sytotoksisista tekijöistä, kuten lymfo- • · · · toksiinista, interferoneista tai muista sytotoksisista • · t proteiineista, joihin kirjallisuudessa viitataan. Tera- . 30 peuttisissa sovellutuksissa on kuitenkin edullista yhdis- • · · tää tuumorinekroositekijä ennalta määrättyihin määriin • · · *·[ * lymfotoksiinia ja/tai interferonia. Koostumukset, jotka sisältävät tuumorinekroosi teki jää ja interferonia, kuten . · gammainterferonia, ovat erityisen käyttökelpoisia, koska 35 niillä on havaittu olevan synergistinen sytotoksinen vai- * ; kutus.

Tuumorinekroositekijäkoostumuksia annetaan eläimille, erityisesti potilaille, joilla on pahanlaatuisia 10 PO Ο Ί 7 yöZ i/ kasvaimia, terapeuttisesti vaikuttavina annoksina. Asiantuntijoille ovat selviä hoidon yhteydessä soveltuvat annokset, kuten jäljempänä tarkemmin kuvataan.

Kuvio 1 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis-5 käyrää kontrolloidusta huokoslasista.

Kuvio 2 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis-käyrää dietyyliaminoetyyliselluloosasta.

Kuvio 3 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis-käyrää nopeassa proteiini-nestekromatografiässä.

10 Kuvio 4 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis- käyrää kromatofokusoinnissa.

Kuvio 5 esittää tuumorinekroositekijän molekyyli-painoa SDS-PAGE-geelielektroforeesilla määritettynä.

Kuvio 6 esittää tuumorinekroositekijän molekyyli-15 painoa HPLC-eluutiolla määritettynä.

Kuvio 7 esittää tuumorinekroositekijän eluoitumis-käyrää HPLC-C4-kolonnista.

Kuvio 8 valaisee tuumorinekroositekijän trypsiini-pilkkomisfragmenttien erottumista HPLC:llä.

20 Kuvio 9 valaisee gamma-interferonin ja tuumorinek roositekijän seosten sytotoksista vaikutusta.

Kuviossa 10 esitetään ihmisen pretuumorinekroosi-tekijän, tuumorinekroositekijän koko eritysesijakso mukaan luettuna, nukleotidi- ja aminohapposekvenssi.

25 Kuvio 11 esittää tuumorinekroositekijän ilmenty- .*.·. misvektorin muodostamista.

• · • ·

Tuumorinekroositekijä määritellään polypeptidiksi, t’\·' joka on muu kuin lymfotoksiini ja jolla on kyky saada ♦ « « aikaan preferentiaalinen sytotoksinen vaikutus ja joka . 30 sisältää alueen, jossa esiintyy funktionaalisten amino- ♦ « ψ '···' happojen homologiaa kuviossa 10 esitetyn valmiin tuumori- • · · *.* * nekroositekijän aminohapposekvenssin, sen fragmentin tai tällaisen polypeptidin tai fragmentin johdoksen kanssa.

Preferentiaalinen sytotoksinen aktiivisuus on mää-35 ritelmän mukaan kasvainsolujen tuhoamista tai niiden kasvun estämistä ensisijaisesti verrattuna normaalisoluihin samoissa olosuhteissa. Preferentiaalisen sytotoksisen aktiivisuuden detektointi tapahtuu tarkastelemalla polypep- „ 98217 tidin vaikutusta kasvainsoluihin in vivo tai in vitro verrattuna vaikutukseen normaalisoluihin tai -kudokseen. Solujen hajoaminen on yleensä diagnostisena osoituksena in vitro, kun taas kasvainten nekroosi määritetään kokein in 5 vivo. Sytotoksisesta aktiivisuudesta voi kuitenkin olla osoituksena myös sytostaasi tai antiproliferatiivinen aktiivisuus. Soveltuvat koejärjestelyt ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi jäljempänä kuvattava solujenhajotuskoe, jota käytetään tuumorinekroositekijän ominaisaktiivisuuden mää-10 rittämiseen, on hyväksyttävä, samoin kuin koe, jota kuvaavat B. Aggarwal et ai. teoksessa "Thymic Hormones and Lymphokines", toim. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center, 1983 (tässä julkaisussa mainittu solulinja A549 on 15 saatavana ATCC:sta numerolla CCL185) .

TNF:n ominaisaktiivisuutta kuvataan kohdesolujen hajoamisella sytostaasin sijasta. Yksi yksikkö tuumorinek-roositekijää määritellään siksi määräksi, joka vaaditaan kuhunkin syvennykseen esimerkin 1 mukaisesti levitettyjen 20 kohdesolujen hajottamiseksi 50-%:isesti. Tällä ei kuitenkaan ole tarkoitus sulkea pois muita kokeita ominaisaktiivisuuden mittaamiseksi, esimerkiksi menetelmiä, jotka perustuvat kohdesolujen kasvunopeuteen.

-··' PreTNF on tuumorinekroositekijäspesies, joka sisäl- : 25 tyv edellä esitettyyn tuumorinekroositekijän määritelmään.

: '· Sille on luonteenomaista se, että molekyylissä on signaali- • · • (eli esi-) polypeptidi, joka luennan jälkeen ohjaa proteiini· nin johonkin kohtaan solussa tai sen ulkopuolella. Yleensä ·*·*: signaalipolypeptidi (jolla itsellään ei ole tuumorinekroo- 30 siaktiivisuutta) lohkeaa proteolyyttisesti proteiinin muus-. .·. ta osasta, jolla on tuumorinekroositekijäaktiivisuus, osa- • t ·

Ij*. na erittymisprosessia, jossa proteiini siirtyy isäntäsolun • · · *. periplasmaan tai kasvualustaan. Signaalipeptidi voi olla • · '·.'· mikrobin tai nisäkkään peptidi (luontainen, 76-ryhmäinen 'i**: 35 esijakson mukaan luettuna), mutta edullisesti se on signaa- : li, joka on homologinen isäntäsolulle.

• ♦« • « 12 η π η ί π yo A 1/

Normaaleista biologisista lähteistä saatavan luontaisen tuumorinekroositekijän arvioitu molekyylipa!no on noin 17 000 natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigee-lielektroforeesilla (SDS-PAGE) tässä kuvatulla tavalla mää-5 ritettynä, isoelektrinen piste on noin 5/3, ja polypeptidi on herkkä trypsiinihydrolyysille useasta kohtaa. RP-HPLC:llä puhdistettu luonnon tuumorinekroositekijä hydrolysoituu trypsiinillä vähintään yhdeksäksi fragmentiksi tässä hakemuksessa kuvatuissa olosuhteissa. Fragmenttien, joiksi tuu-10 morinekroositekijä hydrolysoituu trypsiinin vaikutuksesta, lukumäärä riippuu sellaisista tekijöistä kuin trypsiinin aktiivisuus, tuumorinekroositekijäpitoisuus ja inkubointi-parametrit, ionivahvuus, pH, lämpötila ja inkubointiaika mukaan luettuina.

15 Tuumorinekroositekijä ei näytä olevan glykoproteii- ni, se ei pidäty lektiiniaffiniteettikolonneihin ja päätellyn aminohapposekvenssin analysointi ei osoita todennäköisiä glykolysoitumiskohtia. Myös yhdistelmä- E. coli -viljelmässä tuotettu materiaali (jolla ei ole glykosyloitumis-20 kykyä) liikkuu yhdessä luonnon TNF:n kanssa SDS-PAGE:ssa.

Aminohapposekvenssihomologia-aste, joka tuo polypep- tidin tässä annetun tuumorinekroositekijän määritelmän piiriin, vaihtelee riippuen siitä, osuuko ehdokasproteii- ‘·;' nin ja tuumorinekroositekijän välinen homologisuus sytotok- : 25 sisen aktiivisuuden aikaan saavien tuumorinekroositekijän .· ’· alueiden sisä- vai ulkopuolelle; alueilla, jotka'ovat rat- • · • */· kaisevia sytotoksiselle aktiivisuudelle, pitäisi olla kor- kea homologia-aste, jotta polypeptidi olisi määritelmän mukainen, kun taas jaksoissa, jotka eivät liity tuumori-30 nekroositekijän rakenteen ylläpidon tai reseptoreihin si- . .·. toutumisen aikaansaamiseen, voi homologisuus olla suhteel- • · · ·*· lisen alhainen. Ratkaisevat alueet voivat lisäksi olla sy- • » · «* f » · tolyyttisesti aktiivisia ja tässä määritellyllä tavalla ho-

» I

mologisia, jos ryhmiä, jotka sisältävät funktionaalisesti ’*·"· 35 samanlaisia aminohappo s ivuket juja, korvautuu toisillaan.

.·. · Funktionaalisesti samanlainen viittaa sivuketjujen 98217 13 vallitseviin ominaisuuksiin, kuten emäksisyys, neutraalisuus tai happamuus tai eteerisen esteen läsnä- tai poissa olo. Tässä määritelty tuumorinekroositekijä ei kuitenkaan missään tapauksessa ole lymfotoksiini.

5 Tuumorinekroositekijäksi määritelty polypeptidi si sältää yleensä kuvion 10 mukaisen proteiinin tai sen fragmentin kanssa suurin piirtein homologisia alueita, jotka ovat jatkuvan 20-100 aminohappoa käsittävän jakson mittaisia, erityisesti ryhmien 35 ja 66 sekä 110-133 välisten 10 jaksojen kanssa homologisia alueita.

Merkittävin tekijä polypeptidin määrittelemisessä tuumorinekroositekijäksi on antiseerumien, joilla on kyky oleellisilta osiltaan kumota kuvion 10 mukaisen valmiin tuumorinekroositekijän sytolyyttinen aktiivisuus, kyky ku-15 mota oleellisilta osiltaan myös kyseessä olevan polypeptidin sytolyyttinen aktiivisuus. On kuitenkin otettava huomioon, etteivät immunologinen ja sytotoksinen luonne ole välttämättä toisensa kattavia. Kuvion 10 mukaisen tuumorinekroositeki jän aktiivisuuden kumoava vasta-aine ei ehkä 20 sitoudu ehdokkaana olevaan proteiiniin, koska aktiivisuuden kumoava vasta-aine sitoutuu spesifisesti tuumorinekroositeki jän sellaiseen kohtaan, joka ei ole ratkaiseva syto-• . toksisen aktiivisuuden kannalta. Vasta-aine saattaa sitou- ,'! tua proteiinin· vaikutuksen kannalta merkityksettömään koh-

» I

• I I

' 25 taan ja saada aikaan kumoavan vaikutuksensa steerisen es- « « •e teen kautta. Siksi ehdokkaana oleva proteiini, jossa on « · · J *’ mutaatio tällä merkityksettömällä alueella, ei enää sido vaikutuksen kumoavaa vasta-ainetta, mutta on siitä huoli-' matta tuumorinekroositekijä huomattavan homologian ja bio- 30 logisen aktiivisuuden kannalta katsottuna.

• ·*: On tärkeää ottaa huomioon, että kuvion 10 mukaisel- »·» le luonnon eli villin tyypin valmiille ihmisen tuumorinek-,* , roositekijälle, joka on saatu ääreislymfosyytti- tai solu- linjaviljelmistä, annetut ominaisuudet, kuten molekyylipai-’ ' 35 no, isoelektrinen piste ja vastaavat, ovat kuvaavia vain • ‘tuumorinekroositeki jän luonnossa esiintyville spesieksille.

c r r) Λ f7 ,4 ^0/1/

Edellä esitetyn määritelmän mukaisiin tuumorinekroosite-kijoihin kuuluu spesieksiä/ joilla ei ole luonnon tuumori-nekroositekijän kaikkia luontaisia ominaisuuksia. Vaikka tässä määritelty käsite tuumorinekroositekijä sisältää 5 luonnon tuumorinekroositekijän, sisältyy määritelmän piiriin muitakin sille sukua olevia sytotoksisia polypeptide-jä. Esimerkiksi sellaiset TNF-johdokset kuin insertiomu-tantit, deleetiomutantit ja fuusioproteiinit, joita edellä kuvattiin/ eroavat molekyylipainoltaan luonnossa esiinty-10 västä ihmisen tuumorinekroositekijästä (fuusioproteiineil-la valmiin tuumorinekroositekijän kanssa tai itse preTNFrllä samoin kuin insertiomutanteilla on suurempi molekyylipaino kuin valmiilla luonnon tuumorinekroositekijällä, kun taas luonnossa esiintyvän valmiin tuumorinekroositekijän delee-15 tiomutanttien molekyylipaino on pienempi). Tuumorinekroo-sitekijää voidaan myös käsitellä alttiuden hydrolysoitua trypsiinin tai muiden proteaasien vaikutuksesta vähentämiseksi tai poistamiseksi. Lopuksi mainittakoon/ että ihmisen preTNF:n luennan jälkeinen prosessointi solulinjois-20 sa, jotka ovat peräisin muista nisäkkäistä kuin kädellisistä, voi johtaa mikroheterogeenisuuteen aminoterminaa-lisella alueella, niin että aminoterminaalisena aminohappona ei enää ole väliini.

Ihmisen tuumorinekroositeki jän aminohapposekvenssi, ' 25 joka on päätelty sen cDNA:sta, esitetään kuviossa 10. Val- : mistä eli luonnossa esiintyvää tuumorinekroositeki jää vas- taavat aminohapot 1-157. Huomaa, että tämä jakso sisältää -«· 76 ryhmästä koostuvan signaali jakson, jonka uskotaan pois- 4« i« ?*T\ tuvan luetun transkriptin normaalissa prosessoinnissa vai- 4 30 miiksi proteiiniksi. Trypsiinihydrolyysikohdat osoitetaan » nuolin.

« « · ‘44 ‘w Huomaa, että ilmaus "kykenevä" sytotoksiseen aktii- ϊ · * *. visuuteen tai tuumorinekroosiin in vivo tarkoittaa sitä, että termin "tuumorinekroositekijä" piiriin kuuluvat poly-35 peptidit, joita voidaan muuttaa esimerkiksi entsymaatti-, ·. : sella hydrolyysillä, epäaktiivisesta, tsymogeenin kanssa 15 ρ π Ο Ί n • ycZ f/ ananalogisesta tilasta polypeptidifragmentiksi, jolla on haluttu biologinen vaikutus. Tyypillisiä epäaktiivisia esiasteita ovat fuusioproteiinit, joissa valmis tuumorinekroosite-kijä on liittyneenä karboksyylipäästään peptidisidoksen kaut-5 ta johonkin ihmisproteiiniin tai sen fragmenttiin. Tämän peptidisidoksen kohdalla tai sen lähellä oleva sekvenssi on siten valittu, että se on herkkä proteolyyttiselle hydrolyysil-le, jolloin tuumorinekroositekijä vapautuu joko in vivo tai, osana valmistusohjelmaa, in vitro. Siten muodostuneella tuu-10 morinekroositekijällä on tällöin määritelmän edellyttämä sy-totoksinen aktiivisuus.

Vaikka tuumorinekroositekijällä vleensä tarkoitetaan ihmisen tuumorinekroositekijää, kuuluvat sellaisista lähteistä kuin hiiri, sika, hevonen tai nauta peräisin olevat 15 tuumorinekroositekijät tuumorinekroositekijän määritelmän piiriin, kunhan ne muutoin täyttävät edellä kuvatut homologisia alueita ja sytotoksista aktiivisuutta koskevat vaatimukset. TNF ei ole lajispesifinen, ihmisen TNF vaikuttaa esimerkiksi hiiren kasvaimiin. Jonkin lajin TNF:ää voidaan siten 20 käyttää toisen lajin hoidossa.

Tuumorinekroositekijä-nimikkeen alle kuuluvat myös multimeeriset muodot. Tuumorinekroositekijä aggregoituu spontaanisti multimeereiksi, tavallisesti dimeereiksi tai korkeammiksi multimeereiksi. Multimeerit ovat sytotoksisia ja 25 siten soveltuvia käytettäviksi terapiaan in vivo. Vaikka on • · .:. toivottavaa ilmentää ja ottaa talteen tuumorinekroositekijä • · · · suurin piirtein homogeenisena multimeerinä tai monomeerinä, • « » voidaan tuumorinekroositekijä käyttää terapeuttisesti erilaisten multimeerien seoksena.

• I · 30 Tuumorinekroositekijän johdokset sisältyvät tuu- • · · *·] ' morinekroositekijä-termin piiriin. Johdoksiin kuuluvat ami- nohapposekvenssimutantit, glykosyloitumismuunnokset ja kova-lenttisesti tai aggregoitumalla muodostuneet yhteenliitty-mätmuiden kemiallisten ryhmien kanssa. Kovalenttisia joh- ; 35 doksia valmistetaan liittämällä funktionaalisia ryhmiä TNF-aminohapposivuketjuissa tai N- tai C-päässä esiintyviin 16 98217 ryhmiin alalla tunnetuin keinoin. Näihin johdoksiin kuuluvat esimerkiksi: karboksyylipään tai karboksyylisivuket-juja sisältävien ryhmien, esimerkiksi asp10:n alifaattiset esterit tai amidit; hydroksyyliryhmän sisältävien aminohap-5 poryhmien, kuten ser52:n, ser3:n, ser4:n tai ser5:n, O-asyy-lijohdokset; aminoterminaalisen aminohapon tai aminoryhmän sisältävien aminohapporyhmien, esimerkiksi lysiinin tai ar-giniinin, N-asyylijohdokset; ja cys101:n ja cys69:n johdokset. Asyyliryhmä on alkyyliryhmä (C^_^Q-n-alkyylit mukaan 10 luettuina), jolloin muodostuu alkanoyylijohdos tai karbosyk-linen tai heterosyklinen yhdiste, jolloin muodostuu aroyy-lijohdos. Reaktiiviset ryhmät ovat edullisesti difunkttonaalisia yhdisteitä, joita sinänsä tiedetään käytettävän proteiinien silloittamiseen liukenemattomiksi matriiseiksi 15 reaktiivisten siuryhmien kautta. Edullisia johdosten muo-dostuskohtia ovat kysteiini- ja histidiiniryhmät.

Kovalenttiset tai aggregaattijohdokset ovat hyödyllisiä reagensseja immuunitutkimukseen ja affiniteettipuh-distuksiin. Tuumorinekroositekijä voidaan esimerkiksi tehdä 20 liukenemattomaksi sitomalla se kovalenttisesti syanogeeni-bromidilla aktivoituun Sepharose-geeliin sinänsä tunnetuin menetelmin tai adsorboida polyolefiinipinnoille (mahdolli-'...· sesti glutaarialdehydisilloituksen avulla) käytettäväksi ·.: · anti-TNF-vasta-aineiden tai solujen pintareseptorien tut- : 25 kimiseen tai puhdistukseen. Tuumorinekroositekijä voidaan myös leimata detektoitavissa olevalla ryhmällä, esimerkiksi ··· radiojodata kloramiini T -menettelyllä, sitoa kovalentti- • · · · .*:·. sesti harvinaisia maametalleja sisältäviin kelaatteihin tai liittää johonkin muuhun fluoresoivaan ryhmään, käytet-30 täväksi diagnostisissa tutkimuksissa, erityisesti biolo- • · · gisten näytteiden TNF-pitoisuuksien mittaamiseen kompeti- · · *’ * tiivistä tyyppiä oleville immuunitutkimuksilla. Tällaiset ί/.ϊ johdokset voivat olla edellä annetun TNF:n määritelmän ul- ·:·· kopuolella, koska ei ole välttämätöntä, että niillä on sy- .* . 35 totoksinen vaikutus, vaan ristireaktiivisuus anti-TNF:n ’ ; kanssa riittää.

17 r> ο ο λ f? yöt !/

Tuumorinekroositekijän mutanttijohdoksiin kuuluvat ennalta määrätyt/ ts. paikkaspesifiset, TNF:n tai sen fragmenttien mutantit. Mutanttien muodostuksen tarkoituksena on saada aikaan DNA, joka koodaa edellä määritellyn kal-5 täistä tuumorinekroositekijää, ts. tuumorinekroositekijää, jolla on sytotoksinen vaikutus kasvainsoluihin in vitro tai joka aiheuttaa kasvainsolujen kuoleman in vivo ja jolla on jäljellä homologiaa kuvion 10 mukaisen sekvenssin kanssa, mutta jolla on myös parantuneet ominaisuudet ja paran-10 tunut aktiivisuus. Mutanttituumorinekroositekijä määritellään polypeptidiksi, joka muuten täyttää tässä hakemuksessa aiemmin annetun tuumorinekroositekijän homologiamääritel-män ehdot, mutta jonka aminohapposekvenssi eroaa tuumorinekroositekijän sekvenssistä deleetion, substituution tai 15 insertion kautta. Tuumorinekroositekijän lysiini- tai argi-niiniryhmät (arginiini 2, 6, 82, 44 ja 131 ja lysiini 98, 90 ja 85) voidaan esimerkiksi vaihtaa histidiiniin tai muuhun aminohapporyhmään, joka ei tee proteiinista proteolyyt-tisesti labiilia. Samoin voitaisiin kysteiini 101 korvata 20 muilla ryhmillä ja silloittaa kemiallisesti stabiilisuuden antamiseksi hapettumista vastaan. Ei ole välttämätöntä, • <t että mutantit täyttävät tuumorinekroositekijälle asetetut aktiivisuusvaatimukset, koska jopa biologisesti inaktiivi-' set mutantit ovat käyttökelpoisia reagensseina immuunitut- " 25 kimuksissa. Tässä tapauksessa tulee mutantissa kuitenkin ; ·' säilyä ainakin yksi epitooppinen kohta, joka reagoi tuumo- ...:* rinekroositekijän vasta-aineen kanssa.

• ·· : Tuumorinekroositekijän alueet, jotka ovat ryhmien 35-66 ja 110-133 välillä mainitut ryhmät mukaan luettuina, : 30 ovat merkittävässä määrin homologisia (50-%:isesti) lymfo- • ·· toksiinin kanssa. Näiden kahden molekyylin hydrofobiset .* . karboksyylipäät (tuumorinekroositekijän ryhmät 150-157) • · · *· ovat myös merkittävästi samanlaiset. Koska molemmilla pro teiineilla on sytotoksinen vaikutus tai kasvainsolujen tap-:*·.· 35 pamiskyky in vivo, uskotaan näiden alueiden olevan tärkeitä ·;··;* lymfotoksiinin ja tuumorinekroositekijän yhteisen 18 O P 9 1 Γ·τ yoi !/ aktiivisuuden kannalta. Siten näillä alueilla olevat ryhmät ovat edullisia muutettaviksi silloin, kun mutageneesin tarkoituksena on vaikuttaa suoraan tuumorinekroositekijän vaikutukseen tiettyyn soluun. Tuumorinekroositekijän ryh-5 mien 67-109 välisen suhteellisen paljon muuttuneen alueen tehtävänä saattaa olla sitä ympäröivien kahden suhteellisen homologisen alueen sijoittaminen sytotoksisen vaikutuksen kannalta välttämättömään oikeaan konformaatioon. Tällaisen sijoittamisen, jonka voisi saada aikaan tuumorinek-10 roositekijässä oleva Cys69-Cys101-disulfidisilta, voisi samalla tavalla saada aikaan lymfotoksiinin vastaava alue ja se voi olla syynä eroihin näiden kahden molekyylin spesifisyydessä ja aktiivisuudessa. Tässä yhteydessä mainittakoon, että koska näiden ryhmien otaksutaan muodostavan tuu-15 morinekroositekijän aktiivisen ytimen, voidaan ne syntetisoida kemiallisesti tai deleetiomutageneesin kautta typistettyinä, lyhyinä polypeptideinä, joilla on tuumorinekroo-sitekijävaikutus.

Vaikka mutaatiokohta on ennalta määrätty, ei itse 20 mutaation tarvitse olla määrätty ennalta. Esimerkiksi (asema 131) -mutanttien tehon optimoimiseksi voidaan tehdä sat-. . tumanvarainen mutageneesi arginiinia 131 vastaavan kodonin .“i kohdalla ja tutkia ilmentyneet tuumorinekroositekijämutan- ;,· ' tit sytotoksisen aktiivisuuden ja proteaasinkeston optimaa- « · ·' " 25 lisen yhdistelmän löytämiseksi. Menetelmät substituutio- I I | ! .* mutaatioiden aiheuttamiseksi sekvenssiltään tunnetun DNA:n ennalta määrättyihin kohtiin ovat tunnettuja, esimerkiksi • m s.! · M13-alukemutageneesi.

Tuumorinekroositekijän mutageneesi toteutetaan teke- : 30 mällä aminohappoinsertioita, tavallisesti noin 1-10 amino- ««» hapon mittaisia tai noin 1-30 ryhmän deleetioita. Substi- .* . tuutioita, deleetioita, insertioita tai näiden mitä tähän- • · · *· sa kombinaatioita voidaan yhdistää toisiinsa lopullisen ra-

* · * · I

kenteen aikaansaamiseksi. Insertioihin sisältyvät amino-35 tai karboksyyliterminaaliset fuusiot, esimerkiksi karbok-,··; syylipäähän lisätty hydrofobinen jatke. Edullisesti tehdään p C Λ ri >ϋΖ. 1/ 19 kuitenkin vain substituutiomutaatioita. On ilmeistä, etteivät koodaavan DNA:n mutaatiot saa saattaa jaksoa luku-kehyksen ulkopuolelle ja on edullista, etteivät ne synnytä komplementaarisia alueita, joista voisi syntyä sekun-5 daarinen mRNA-rakenne.

Kaikki tuumorinekroositekijää koodaavan DNA:n mutaatiot eivät ilmenny lopullisessa erittyneessä tuotteessa. Tärkeä ryhmä DNA-substituutiomutaatioita ovat esimerkiksi mutaatiot, joissa erilainen eritysesijakso tai sig-10 naali on korvannut ihmisen luontaisen eritysesijakson joko esijaksossa tehtyjen deleetioiden tai substituutioiden kautta, joissa luontainen esijakso tai suurin osa siitä vaihdetaan esijaksoon, jonka isäntä, jota aiotaan käyttää, todennäköisemmin tunnistaa. Muodostettaessa esi-15 merkiksi prokaryoottiilmentymisvektoria ihmisen eritysesi jakso poistetaan bakteerin alkalisen fosfataasin tai lämpöstabiilin enterotoksiini II:n esijaksojen eduksi ja hiivaa varten tämä esijakso korvataan hiivan invertaasin, alfa-tekijän tai happaman fosfataasin esijaksojen eduksi. 20 Ihmisen eritysesijakson voivat kuitenkin tunnistaa muutkin isännät kuin ihmissolulinjat, todennäköisimmin korkeampien eukaryoottien viljelmässä olevat solut. Kun isäntä "tunnistaa" eritysesijakson, fuusioproteiini, joka koostuu tuumorinekroositekijästä ja esijaksosta, katkeaa 25 esijakson ja tuumorinekroositekijän välisen peptidisidok- ··♦ sen kohdalta niiden tapahtumien yhteydessä, jotka johta- ···· vat tuumorinekroositekijän erittymiseen. Siten, vaikka isännän transformointiin käytettäisiin mutantti-preTNF-DNA:ta ja välituotteena syntetisoituu mutantti-preTNF:ää, • · * ::: 30 on tuotteena oleva tuumorinekroositekijä tavallisesti • · · m\ ’ luontainen valmis tuumorinekroositekijä.

Toinen tärkeä ryhmä DNA-mutantteja, jotka eivät :·· ilmenny tuumorinekroositekijä johdoksina, ovat nukleotidi- substituutiot, joita tehdään ilmentymisen edistämiseksi, ; 35 pääasiallisesti aminoterminaalisten silmukoiden välttämi seksi tai kodonien, joita valitun isännän on helpompi ko- Γ· η η η ri 20 Ϊ01Ί/ pioida, esimerkiksi tunnettujen E. coli -preferenssi-kodonien E. coli -ilmentymistä varten, aikaansaamiseksi .

Oleellisilta osiltaan homogeenisella tuumorinek-5 roositekijällä tarkoitetaan tuumorinekroositekijää, joka on suurin piirtein vapaa muista proteiineista, jotka ovat luontaisia lähteelle, josta tuumorinekroo-sitekijä eristettiin. Tämä tarkoittaa sitä, että homogeeninen tuumorinekroositekijä on suurin piirtein 10 vapaa veren plasmaproteiineista, kuten albumiinista, fibrinogeenista, seriiniproteaaseista, a-globulii-neista, sytotoksisista polypeptideistä, jotka eivät ole tuumorinekroositekijöitä, kuten lymfotoksiinista ja interferoneista ja tuumorinekroositekijäsynteesi-15 paikkana toimivan solun tai organisminmuista prote iineista, kokonaiset solut ja hiukkasmaiset solujät-teet mukaan luettuina. Homogeeninen tuumorinekroositekijä voi kuitenkin sisältää sellaisia aineita kuin jäljempänä kuvattavia stabilointi- ja täyteaineita, 20 ennalta määrättyjä määriä synteesipaikkana toimivan solun tai organismin proteiineja, proteiineja, jotka ovat lähtöisin muista kuin tuumorinekroositekijän lähdesoluista tai -organismeista ja synteettisiä po-lypeptidejä, kuten poly-L-lysiiniä. Yhdistelmätuumo-25 rinekroositekijä, joka ilmentyy allogeenisessa : . isäntäsolussa, esimerkiksi bakteerissa, ilmentyy ..1·1 luonnollisesti täysin vapaana geenilähteen proteii- • ·· :: : neista.

Tuumorinekroositekijä syntetisoidaan edulli- ; 30 sesti yhdistelmäorganismiviljelmissä. Ääreisverilym- *·· fosyytit (PBL:ät) ja solulinjat eivät ole toivotta- # via. Käytännössäon vaikeaa saada jonkin ryhmän PBL- ♦ · · *♦ :iä, jotka ovat vapaita muiden ryhmien solujen aiheuttamasta kontaminaatiosta, esimerkiksi B- tai T- 35 soluista vapaita makrofageja. Tällainen kontaminaatio tekee mainittujen solujen tuotteiden erottamisen vaikeammaksi kontaminoiviensolujen mahdollisesti vapauttamien sytotoksistentekijäiden ja proteiinien vuoksi. Muista kuin yhdistelmäviljelmistä saatava tuumorinek- 21 η η π <1 n > o ζι / roositekijästä, joten näiltä viljelmiltä puuttuu yhdistel-mäviljelmän joustavuus tuumorinekroositekijän ominaisuuksien parantamiseksi.

DNA, joka koodaa tuumorinekroositekijää, saadaan ke-5 maallisella synteesillä, PBL- tai solulinjaviljelmistä saatavan mRNA:n käänteiskopiointituotteita tutkimalla tai tutkimalla mistä tahansa solusta peräisin olevien genomikir-jastoja. Soveltuvia solulinjaviljelmiä ovat monosyyttiso-lulinjat, kuten promyelosyyttisolulinjat, joista käytetään 10 merkintää "HL-60" (ja joista eräs on saatavana ATCC:stä numerolla CCL 240) tai histiosyyttinen lymfoomasolulinja U 937 (ATCC CRL 1593). Nämä ja muut solulinjat indusoidaan ilmentämään ja erittämään tuumorinekroositekijää altistamalla solut alalla tunnetuille kemiallisille tai fysikaa-15 lisille tekijöille, yleensä kasvaimia aiheuttaville tai mitogeenisille tekijöille. Tuumorinekroositekijä voidaan indusoida tietyissä monosyyttisolulinjoissa tehokkaasti vain PMA;lla; muuten tavanomaiset aineet, kuten lipopoly-sakkaridi, stafylokokkaalinen enterotoksiini B tai tymosii-20 ni OC-1, eivät olleet yhtä tehokkaita kuin PMA tuumorinekroositekijän indusoimiseksi näissä solulinjoissa. Koska / ' täytyy tehdä vaihtelevia määriä tutkimuksia tuumorinekroo- : ,· sitekijää ilmentävän (ja siten haluttua mRNA:ta sisältä- .·] vän) solui in jän paikallistamiseksi, saattaa olla tehokkaam- \ , 25 paa yksinkertaisesti syntetisoida geeni. Synteesi on edul- • t ^ • * linen, koska sen avulla voidaan muodostaa ainutkertaisia ··· ·”) restriktiokohtia (jolloin on mahdollista käyttää geeniä • · · *·* * vektoreissa, jotka sisältävät restriktiokohtia, joita muu toin esiintyisi luontaisessa sekvenssissä) ja suorittaa s.:.: 30 luentatehoa parantavia toimenpiteitä, joita käsitellään jäljempänä.

.* . Tämä DNA leimataan kovalenttisesti detektoitavissa • · · • · · * ’ olevalla aineella, kuten fluoresoivalla ryhmällä, radioak- ’ tiivisella atomilla tai kemiluminesoivalla ryhmällä, sinän- ·/· 35 sä tunnetuin menetelmin. Sitten sitä käytetään tavanomai- siin hybridisaatiotutkimuksiin. Tällaisia tutkimuksia Π Π Ο Ί 7 22 >ϋΖ 1/ käytetään TNF-vektoreiden ja transformanttien identifioimiseen tämän hakemuksen esimerkeissä kuvattavalla tavalla tai in vitro -diagnooseihin, kuten TNF-mRNA:n havaitsemiseen punasoluista.

5 TNF:ää vastaavaa mRNA:ta on yllättävästi suhteelli sen vähän jopa indusoiduissa HL-60-soluissa, mikä ehkä johtuu tuntemattomien tekijöiden aiheuttamasta lähetti-RNA:n epästabiilisuudesta. Lisäksi aika, joka kuluu TNF-mRNA:n ilmaantumiseen solun indusoinnista lukien, on tärkeä. TNF-10 mRNArta ilmaantuu soluihin vain lyhyeksi ajaksi noin neljän tunnin kuluttua indusoinnista. Tässä suhteessa sen ilmaantuminen on erilainen kuin lymfotoksiinin, joka ilmaantuu noin 12 tunnin kuluttua indusoinnista. Tästä syystä jää cDNA helposti huomaamatta, ellei tiedetä mitä etsitään.

15 Kuitenkin, kun tiedetään sen läsnäolo ja käytettävissä on täydellisesti komplementaarista DNA:ta, minkä tämä keksintö tekee mahdolliseksi, on tuumorinekroositekijä-cDNA:n etsiminen indusoidusta HL-60- tai PBL-soluista saaduista cDNA-kirjastoista tällaisia DNA-sekvenssejä sisältävien 20 koettimien avulla rutiinityötä. Esimerkeissä tutkitut kaksi HL-60-fagikirjastoa sisältävät suhteellisen samanlaisen . . määrän positiivisia plakkeja, joten on selvää, että rutii- ninomaisilla hybridisaatiotutkimuksilla voidaan identifioi-' da halutun DNA:n sisältävä faagi.

" 25 HL-60-solulinjan tuumorinekroositekijää syntetisoi- • ·' via soluja viljellään aluksi tavanomaisella tavalla, kun- ..!:* nes saavutetaan tiheys noin 8-12 x 10 solua/ml. Solut • ·· · poistetaan viljelmästä, pestään, siirrostetaan seerumista vapaaseen alustaan ja kasvatetaan PMA:ta sisältävässä alus- : 30 tässä. Kasvatusta jatketaan, kunnes haluttu tuumorinekroo- • · · sitekijäpitoisuus, tavallisesti noin 400 yksikköä/ml, on .* . akkumuloitunut kasvualustaan. Sen jälkeen viljelmäsuperna- • · · *· '· tantti edullisesti kirkastetaan sentrifugoimalla tai muul la keinolla, jolla voidaan erottaa solujätteet liukoisista 35 komponenteista. Sentrifugointi tulisi tehdä niin pienellä kierrosnopeudella, että vain suspendoituneet hiukkaset 23 98217 poistuvat. Sitten supernatantti puhdistetaan tässä hakemuksessa kuvattavalla tavalla.

Vaihtoehtoisesti ja edullisesti, tuumorinekroosi-tekijä syntetisoidaan isäntäsoluissa, jotka on transfor-5 moitu tuumorinekroositekijää koodaavaa DNA:ta sisältävillä vektoreilla. Vektori on replikoituva DNA-rakennelma. Vektoreita käytetään tässä yhteydessä tuumorinekroosite-kijää koodaavan DNA:n amplifiointiin ja/tai ilmentämiseen. Ilmentymisvektori on replikoituva DNA-rakennelma, 10 jossa tuumorinekroositekijää koodaava DNA-sekvenssi on sopivin toimenpitein kytketty soveltuviin säätelyjaksoihin, joilla on kyky saada aikaan tuumorinekroositekijän ilmentyminen sopivassa isännässä. Tällaisia säätelyjakso-ja ovat mm. transkriptiopromoottori, lisäoperaattorijak-15 so, joka ohjaa kopiointia, soveltuvia mRNA:n ribosomisi-toutumiskohtia koodaava jakso ja kopioinnin ja luennan lopetusta ohjaavat jaksot.

Vektoreihin kuuluvat plasmidit, virukset (faagit mukaan luettuina) ja integroitavissa olevat DNA-frag-20 mentit (ts. fragmentit, jotka voidaan integroida isän-nängenomiin rekombinaation kautta). Kun vektorilla on transformoitu soveltuva isäntä, se replikoituu ja toimii isännän genomista riippumattomasti tai saattaa, joissa-: .. kintapauksissa, integroitua itse genomiin. Tässä selos- 25 tuksessa "vektori" on yleisnimitys, joka sisältää "plas- • » midin", mutta plasmidit ovat tällä hetkellä yleisimmin • · « · käytettyjä vektorityyppejä. Kaikki muutkin vektorityypit, jotka palvelevat samaa tarkoitusta ja ovat alalla tunnet- . tuja tai tulevat sellaisiksi, ovat kuitenkin soveltuvia *** 30 tämän keksinnön mukaiseen käyttöön. Soveltuvien vektorien • « * * tulee sisältää replikoni ja säätelyjaksot, jotka ovat peräisin isännän, jota aiotaan käyttää ilmentämiseen, kanssa yhteensopivasta lajista. Transformoidut isän-täsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai trans-35 fektoitu yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistetuilla tuumorinekroositekijävektoreilla. Transformoidut isän-nätyleensä ilmentävät tuumorinekroositekijää. Ilmentynyt tuumorinekroositekijä jää solun sisään tai 24 pQA-in >Öl\/ erittyy joko periplasmatilaan tai viljelmäsupernatanttiin valitusta isäntäsolusta riippuen.

DNA-alueet ovat toiminnallisesti kytkettyjä, jos ne' liittyvät toisiinsa funktionaalisesta. Esimerkiksi esijak-5 soa tai eritysesijaksoa koodaava DNA on kytketty toiminnallisesti polypeptidiä koodaavaan DNA:hän, jos se ilmentyy preproteiinina, joka osallistuu polypeptidin erittymiseen; promoottori on kytketty toiminnallisesti koodausjaksoon, jos se ohjaa tämän sekvenssin kopiointia; tai ribosomin si-10 toutumiskohta on kytketty toiminnallisesti koodausjaksoon, jos se sijaitsee siten, että luenta on mahdollinen. Toiminnallisesti kytketty merkitsee yleensä jatkuvaa ja, erittymisesijaksojen ollessa kyseessä, jatkuvaa ja samassa lukukehyksessä olevaa.

15 Soveltuvia isäntäsoluja ovat prokaryootti-, hiiva- tai korkeammat eukaryoottisolut. Prokaryootteihin kuuluvat gram-negatiiviset ja -positiiviset organismit, esimerkiksi E. coli ja basillit. Korkeampiin eukaryoottisoluihin kuuluvat nisäkäsperäiset vakiinnutetut solulinjat, joita ku-20 vataan jäljempänä. Edullinen isäntäsolu on faagiresistent-ti E. coli W3110 (ATCC 27325) -kanta, jota kuvataan esi-' merkeissä, vaikka myös muut prokaryootit, kuten E. coli B, : .· E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli 294 (ATCC 31446), ;·, Pseudomonas-lajit ja Serratia marcesans, ovat soveltuvia.

• 4 25 Prokaryoottiset isäntä-vektorijärjestelmät ovat 1 edullisia tuumorinekroositekijän ilmentymisen kannalta.

··· *;*· Vaikka tuumorinekroosi tekijämolekyyli sisältää kaksi kys- • « t *·* ' teiiniryhmää ja vaatii siten mahdollisesti jossain määrin luennan jälkeistä käsittelyä mahdollisen disulfidisillan « 50 muodostamiseksi, ilmentää esimerkiksi E. coli biologisesti • ·« ί#ϊ f aktiivista tuumorinekroositekijää. Käytettävissä on runsaas- .·[ ; ti soveltuvia vektoreita. Mikrobiaalisen vektorin tulee • · · * ’ yleensä sisältää replikoituna.sen aloituskohta, jonka käy- . tettäväksi aiottu isäntä tunnistaa, isännässä toimiva pro- 35 moottori ja fenotyyppinen valikointigeeni, esimerkiksi gee-ni, joka koodaa proteiineja, jotka antavat antibiootti- 25 98217 resistenssin tai toteuttavat jonkin kasvuedellytyksen. Muita isäntiä varten muodostetaan samanlaisia rakenteita. E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttämällä pBR322, eräästä E. coli -kannasta peräisin olevaa plasmidia /Bolivar 5 et ai., Gene 2 (1977) 957. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssigeenit ja tarjoaa siten helpon tavan transformoitujen solujen identifioimiseksi.

Vektorien tulee sisältää promoottori, jonka isäntä-organismi tunnistaa. Tämä on yleensä aiotulle isännälle 10 homologinen promoottori. Yhdistelmä DNA:iden muodostamisessa yleisesti käytettäviin promoottoreihin kuuluvat /J-lak-tamaasi- (penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemit /Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; Goeddel et ai.,

Nature 281 (1979) 5447, tryptofaanipromoottorisysteemi 15 (TRP) /Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8 )180) 4057 ja EP-hakemusjulkaisu 36 7767 ja tae-promoottori /H. De Boer et ai., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 80 (1983) 21-257· Vaikka nämä promoottorit ovat yleisimmin käytettyjä, ovat myös muut tunnetut mikrobiaaliset promoottorit soveltuvia. Nuk-20 leotidisekvenssejä koskevia yksityiskohtia annetaan julkaisuissa, mikä tekee alaa taitavalle mahdolliseksi ligatoida ne toiminnallisesti tuumorinekroositekijää koodaavaan DNA:han plasmidivektoreissa /Siebenlist et ai., Cell 20 (1980) 2697· Tällä hetkellä edullinen vektori on pBR322-' ' 25 johdos, joka sisältää E. colin alkalinen fosfataasi -pro- ; ·' moottorin yhdessä trp-Shine-Dalgarno-jakson kanssa. Pro- moottori ja Shine-Dalgamo-jakso kytketään toiminnallisesti ♦ ·· V · TNF:ää koodaavaan DNArhan, ts. ne sijoitetaan siten, että ne edistävät TNF-mRNA;n kopiointia DNArsta.

j 30 Prokaryoottien lisäksi voidaan tuumorinekroositeki- • ·· .*·*· jää koodaavilla vektoreilla transformoida eukaryoottisia .* . mikrobeja, kuten hiivasoluviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae • · · • ** eli tavallinen leivinhiiva on yleisimmin käytetty alemmista eukaryoottisista isäntämikro-organismeista, vaikka joukko 35 muita kantoja on myös yleisesti saatavissa. Hiivavektorit ;·· sisältävät yleensä replikoitumisen aloituskohdan, joka on ρ. Γ> Γ) y] ry 26 ^ 1/ peräisin kahden mikronin hiivaplasmidista tai itsenäisesti replikoituvan jakson (ARS), promoottorin, TNF-geenin, jaksot polyadenylaatiota ja kopioinnin lopetusta varten ja välikö intigeenin. Soveltuva plasmidi hiivassa tapahtuvaa tuu-5 morinekroositekijän ilmentymistä varten on YRp7 /Stinchcomb et ai., Nature 282 (1979) 39; Kingsman et ai., Gene 7 (1979) 141; Tschemper et ai., Gene 10 (1980) 157/. Tämä plasmidi sisältää valmiiksi trp1-geenin, joka toimii valikointimerk-kerina sille hiivamutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kas-10 vaa tryptofäänissä, esimerkiksi ATCC-nrolla 44076 eli PEP4-1:lle /Jones, Genetics 85 (1977) 12/. trp1-vaurion läsnäolo hiivaisäntäsolun genomissa tarjoaa tehokkaan keinon de-tektoida transformoituminen tryptofaanin poissa ollessa tapahtuvan kasvun avulla.

15 Soveltuviin hiivavektorissa esiintyviin promoottori- jaksoihin sisältyvät promoottorit metallotioneiinia, 3-fos-foglyseraattikinaasia /"Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073J tai muita glykolyyttisiä entsyymejä /Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; Holland et ai., 20 Biochemistry 17 (1978) 4900J, kuten enolaasia, glyseralde-hydi-3-fosfaattidehydrogenaasia, heksokinaasia, pyruvaat- • ·, tidekarboksylaasia, fosfofruktokinaasia, glykoosi-6-fos- . faatti-isomeraasia, 3-fosfoglyseraattimutaasia, pyruvaatti- kinaasia, trioosifosfaatti-isomeraasia, fosfoglykoosi-iso- ’ 25 meraasia ja glykokinaasia varten. Hiivassa tapahtuvaan il- * · · ^ : ·’ mentymiseen soveltuvia vektoreita ja promoottoreita kuvaa- ...V vat tarkemmin R. Hitzeman et ai. EP-julkaisussa 73 657.

i,i · Muita promoottoreita, joiden lisäetuna on kasvuolo suhteiden säätelemä kopiointi, ovat promoottorialueet al- : 30 koholidehydrogenaasi 2, isosytokromi C, hapanta fosfataa- ·· · j‘j1. siä, typpimetaboliaan liittyviä hajottavia entsyymejä ja / . edellä mainittuja metallotioneiinia ja glyseraldehydi-3- • · · ** Ί fosfaattidehydrogenaasia, samoin kuin maltoosin ja galaktoo- I < 1 « sin hyväksikäytöstä vastaavia entsyymejä varten. Muodos-·,: 35 tettaessa soveltuvia ilmentymisplasmideja ligatoidaan il-

* I

j mentymisvektoriin myös näihin geeneihin liittyvät terminaa- 27 non /1 π yoi 1/ tiojaksot tuumorinekroositekijää koodaavien jaksojen 3'-puolelle mRNA:n polyadenylaation ja terminaation aikaansaamiseksi.

Mikro-organismien lisäksi voidaan isäntinä käyttää 5 myös monisoluisten organismien soluviljelmiä. Tämä ei kuitenkaan ole edullista niiden erinomaisten tulosten takia, joita on saavutettu tähän mennessä TNF:ää ilmentävillä mikrobeilla. Periaatteessa mikä tahansa korkeamman eukaryoo-tin, olipa se selkärankainen tai ei, soluviljelmä on käyt-10 tökelpoinen. Selkärankaissoluihin on kuitenkin tunnettu suurempaa mielenkiintoa ja selkärankaissolujen lisäämisestä viljelmässä (kudosviljelmässä) on tullut viime vuosina rutiinimenettely /Tissue Culture, toim. Kruse ja Petterson, Academic Press. 1973/. Esimerkkejä käyttökelpoisista solu-15 linjoista ovat VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin muna-sarjasolulinjat (CHO) ja WI38-, BHK-, COS-7- ja MDCK-solu-linjat. Tällaisille soluille käytettävät ilmentymisvektorit sisältävät yleensä repiikoitumisen aloituskohdan (mikäli välttämätöntä), promoottorin ilmennettävän geenin edellä 20 sekä ribosomisitoutumiskohdan. RNA-simukoitumiskohdan (jos käytetään introneja sisältävää genomi-DNA:ta), polyadeny- -t laatiokohdan ja kopioinnin lopetusjakson.

. Ilmentymisvektorien, joita on määrä käyttää selkä rankaissolujen. transformointiin, kopioinnin ja luennan sää- 25 telyjaksot ovat usein virusperäisiä. Yleisesti käytettäviä < I I ^ • promoottoreita ovat esimerkiksi polyomasta, adenovirus 2:sta ..ti* ja edullisimmin simianvirus 40:stä (SV40:stä) peräisin ole- • ·· · vat promoottorit. Aikaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska ne saadaan helposti vi- s 30 ruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-viruksen *·« « Ϊ*. replikaation aloituskohdan /friers et ai., Nature 273 (1978) « .· . 113.7. Pienempiä ja suurempiä SV40-fragmentteja voidaan myös * t · '* '· käyttää sillä edellytyksellä, että ne sisältävät noin 259 t emäsparin jakson, joka ulottuu Hindlll-kohdasta viruksen . · 35 replikoitumisen aloituskohdassa sijaitsevaan Bgll-kohtaan ί päin. Lisäksi on usein mahdollista, ja usein toivottavaa, 98217 28 käyttää ihmisen genomin promoottori-, säätely- ja/tai signaali jakso ja, jotka normaalisti liittyvät tuumorinekroosi-tekijään, sillä edellytyksellä, että tällaiset säätelyjaksot ovat yhteensopivia isäntäsolusysteemien kanssa.

5 Replikoitumisen aloituskohta voidaan saada aikaan joko rakentamalla vektori siten, että se sisältää eksogee-nisen aloituskohdan, kuten SV40:stä tai muusta viruksesta (esimerkiksi polyomasta, adenoviruksesta, VSV:stä tai BPV:stä) saatavan tai replikoitumisen aloituskohta voi olla 10 isäntäsolun kromosomaalisen replikoitusmekanismin aikaansaama. Jos vektori integroituu isäntäsolun kromosomiin, on jälkimmäinen usein riittävä.

Valittaessa edullista nisäkäsisäntäsolua transfek-toitavaksi vektorilla, joka sisältää sekä tuuraorinekroosi-15 tekijää että dihydrofolaattireduktaasia (DHFR) koodaavat DNA-jaksot, on usein asiallista valita isäntä käytettävän DHFR-proteiinin tyypin mukaan. Jos käytetään villin tyypin DHRF-proteiinia, on edullista valita isäntäsolu, jossa on DHFR-vajaus, jolloin DHFR-koodausjaksoa voidaan käyttää 20 markkerina onnistuneelle transfektiolle selektiivisessä alustassa, josta puuttuu hypoksantiini, glysiini ja tymi-diini. Sopiva isäntäsolu on tässä tapauksessa kiinanhams-terin munasarjasolulinja (CHO-solulinja) , jossa on CHFR-ak-; tiivisuuden vajaus ja joka valmistetaan ja lisätään Urlaubin • 25 ja Chasinin /Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 77 (1980) 42167 kuvaamalla tavalla.

• · ··· Jos säätely jaksona kuitenkin käytetään DNA: ta, joka ·*»· koodaa DHFR-proteiinia, jolla on alhainen sitoutumisaffi- ' · niteetti metotreksaatin (MTX) suhteen, ei ole välttämätöntä 30 käyttää DHFR-resistenttejä soluja. Koska mutantti-DHRF on • · · .*!! resistentti MTX:lie, voidaan MTC-pitoista alustaa käyttää • · · *. * valikointivälineenä, sillä edellytyksellä, että itse isän- • · täsolut ovat MTX-herkkiä. Useimmat eukaryoottisolut, joilla :··· on kyky absorboida MTX:ää, näyttävät olevan metotreksaatti- .* . 35 herkkiä. Eräs tällainen käyttökelpoinen solulinja on CHO- ’* linja CHO-K1 (ATCC-nro CCL 61).

29 Λ Q Π Ί π ö ζ 1 /

Tuumorinekroositekijä otetaan talteen viljelmistä. Transformoidut erittämättömät solut hajotetaan äänikäsitte-lyllä tai muulla hyväksyttävällä menetelmällä ja solujätteet erotetaan sentrifugoimalla, kun taas erittävistä so-5 luista (kuten indusoiduista solulinjoista) saatavat super-natantit yksinkertaisesti erotetaan soluista sentrifugoimalla. Sitten voidaan käyttää yhtä tai useampaa seuraavis-ta vaiheista tai niiden sijasta kokonaan muita menetelmiä. Seuraavaa menetelmää käytettiin tuumorinekroositekijän puh-10 distamiseksi riittävässä määrin sekventointia varten. Tämä ei välttämättä ole samanlainen kuin terapeuttisen tuotteen vaatima puhdistus.

Ensimmäisessä puhdistusvaiheessa tuumorinekroosite-kijä adsorboidaan hydrofobiselle aineelle hajotetusta vil-15 jelmästä tai kasvualustasupernatantista. Hydrofobinen aine on edullisesti muu kuin gelatiinipinta, joka on hydrofobinen, kuten silikaatti tai polyolefiini, vaikka alkyyli-Sepharose on myös soveltuva. Kontrolloitu huokoslasi on edullinen suoritusmuoto. Kontrolloitua huokoslasia sekoi-20 tetaan supernatanttiin tilavuussuhteessa noin 1:50, ja ad-sorboitumisen annetaan edetä noin 4°C:ssa sekoittamatta noin 30 minuuttia - kaksi tuntia, edullisesti noin yksi tunti, lievästi emäksisissä olosuhteissa. Adsorbentti tuli-’· : · si yleensä sen jälkeen pestä soveltuvalla puskurilla siihen • '· 25 tarttuneiden kontaminoivien proteiinien poistamiseksi.

: **: Adsorboitunut tuumorinekroositeki jä eluoidaan hydro- ··· fobiselta aineelta muuttamalla ympäröivän väliaineen soiva- ·· · · ;*·*. tointiominaisuuksia. Eluointi voidaan tehdä johtamalla ai- neen läpi liuosta, joka on puskuroitu pH-arvoon noin 7 - . .·. 30 8,5, edullisesti noin 8 jä joka sisältää 1 mmol/1 suolaa ja • · « '•y vaikuttavan määrän veteen sekoittuvan orgaanisen polyolin, • ♦ · kuten esimerkiksi etyleeniglykolin tai glyseriinin, taval- • · .·.*·· lisesti etyleeniglykolin, jonka osuus on noin 10-30 tila- •vuus-%, edullisesti noin 20 tilavuus-%, vesiliuosta. Opti-.·’ ; 35 miolosuhteet riippuvat luonnollisesti käytettävästä poly- | Olista. Tuumorinekroositekijää sisältävät eluoituneet 3o ^8217 fraktiot havaitaan tutkimalla in vitro jäljempänä kuvattavalla tavalla tai jollain muulla soveltuvalla tavalla. Mo-nosyyttisoluviljelmän tuotteen puhdistuminen ja saanto tässä vaiheessa samoin kuin myöhemmissä vaiheissa esitetään 5 taulukossa I.

* 1 · • ♦ • · • · ·

Mm • · · • · · • · « • · · • i « ·· « • · · • · · • · · · • « · 3i 58217

C

CD

T3 3 0 tn

n * ‘H

vj in r— vo .-h > G I oo c\j oo cn a) o'? r— vo «3· r—I ·-]

M « ~ M

d w m 5 £ “

£ -H

*2 I c; -« .c ‘ ~ 0) d t/i φ Q. -ή C * z, ^ Tj -ι-l i— o o r- *rt

rt g I ·—1*3- «3- CO W

c 7= G *-h c\j ro o •f-l CM CO 2

•P *-< S

* , Φ +j I 5 H C Ή ‘H ϊ< to Φ ·ρ cn h ο β -P ^ * 2 o ^ vo vo vo vo d

M rHCO'— O O VO O O G

0* f-H W *"*· r—4 f“H fH *“H . t λϊ 0 »H W *—< ^ S φ «j g e x x x x r •H r— cvj OO CT. (3 U O -h CO vo f— g O d G Ή :0 O — σι - - 5 g w O > M 0- ° £ S $ 0 ' t! H ^ |

λ S Φ ι-l AC -K -H

0<U Γ 11 V, VO VO VO VO VO rt M cn >i f; o oo o o V^ -pH »-H t-H r—I *-H t—1 rt

d E Ή rt H

H ^ OM x XX X X -H

S 'H >. φ E °L s g fHd w C tn s - 10 cvT rt rrj I -ri g*

λ 2 5 S S

:. S rt 3 vn «· S ft S

• G Φ O O «3" O . t.

·· U o Ä ^ co eri O O -n ^ : . +> -G H o vo co w m o y ε σ» 'o rt * P* ^ ί0 : .· ω i < ω : " rt~ £ 2 • h H iH ^ ’rt * ·· rt fi _ , % ··· ^ jj ·— O Ou-> vn vo -Hp ::: ? ^ o 00011— rt -p w 1¾ 0 ° . ~ -g ""g rt Ον G o ·—1 L 5 , rt2

si 0 0 vn m'liL 1 ö -S

-x j — tn -h rt ·Ρ ·· 0 ..*. rt o rt Φ £ G en en p ·.:.· β d ·η o ·η +> o Φ Φ a ... .r, -P 1 m riw OP G Φ wc ; : · rt I -P -P rt 0 rt P M -P P U Φ . Zi tn φομρηρ&φ -p o P G en

• Tl d CrHrttr» Η0> I4J«! 4J|>HtIP( -P -P

.·.· ,¾ Ij ·η η h O ΦΟ tn-HrtOOrtffi -P rt

·.? , tn rtOen.p. tn-POCrtepPrtJP-Pi rt -P

*' Λ ·η φ :0 POrt Irt GrtrtiG-POj-n-P

....: g ro'jd -p -p a: E weotopai^pi p-p , ZU £!βοθίίθβΛί&>Φωφΐ otn drt :rt O d P WPO-HOPOr-C^· «0 g piwxja: p^sOi+j^wou *

Op 9 η 7 22 s kj /C i /

Tuumorinekroositekijää puhdistetaan edelleen adsorboimalla se tertiaariselle tai kvaternaariselle anionin-vaihtohartsille. Edullisia hartseja tähän tarkoitukseen ovat hydrofiiliset matriisihartsit, kuten silloitettu poly-5 styreeni, dekstraani tai selluloosa, jotka on substituoitu alkyyli(tertiaarinen tai kvaternaarinen amino)ryhmillä. Tämäntyyppisiä kaupallisesti saatavia tuotteita ovat DEAE-selluloosa, QAE Sephadex ja kauppanimellä Mono Q myytävä tuote (kussakin näistä tuotteista alkyylisubstituentti on 10 etyyli). Parhaita tuloksia saavutetaan proteiinien pikakro-matografiamenetelmällä, jota kuvaa J. Richey (American Laboratory, lokakuu 1982) ja jossa käytetään Ugelstadin et ai. /Nature 303 (1983) 95-96/ mukaisia suurihuokosisia suurin piirtein yhdenmukaisia hiukkasia. Tämä menetelmä teki 15 mahdolliseksi tuumorinekroositekijän puhdistamisen korkeaan puhtausasteeseen.

Puhdistaminen suurin piirtein homogeeniseksi saadaan aikaan vain erottamalla edelleen SDS-PAGE-elektroforeesilla tai C4-vastafaasisuurpainenestekromatografiällä (RP-HPLC) 20 jäljempänä kuvattavalla tavalla. Tämä tuote ei kuitenkaan ole terapiatarkoituksiin suositeltava, koska se on menettänyt oleellisesti aktiivisuuttaan joutuessaan SDS:n tai ·...·' HPLC:n orgaanisen liuottimen vaikutuksen alaiseksi. Prote- : : : iinipitoisuus määritettiin M. Bradfordin /Anal. Biochem. 72 25 (1976) 248-254/ menetelmällä. Viimeisten puhdistusvaihei- :*·*. den aikana proteiinipitoisuutta arvioitiin sekä aminohappo- • ** koostumuksen että myös aminohapposekvenssin perusteella.

···· .··· Tuumorinekroositekijä preparoidaan antamista varten sekoit- • · · tamalla tuumorinekroositekijä, jolla on haluttu puhtausas- . 30 te, fysiologisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin, ts.

• · · *;|·* kantaja-aineisiin, jotka ovat saajilleen myrkyttömiä käy- • · · *·* * tettävinä annoksina ja pitoisuuksina. Yleensä tähän liittyy tuumorinekroositeki jän yhdistäminen puskureihin, hapettumi-senestoaineisiin, kuten askorbiinihappoon, pienimolekyyli-,· 35 siin (alle 10 ryhmää) polypeptideihin, proteiineihin, ami- nohappoihin, hiilihydraatteihin glukoosi ja dekstriinit

• I

33 p Cl l~S < f: > c· l mukaan luettuina, kelatoiviin aineisiin, kuten EDTA:aan ja muihin stabiloiviin ja täyteaineisiin. Kantaja tulisi formuloida siten, että se stabiloi tuumorinekroositekijän dimeeriksi ja/tai, edullisesti, trimeeriksi. Tämä saadaan 5 aikaan välttämällä sellaisia suola- tai detergenttipitoi-suuksia, jotka hajottavat tuumorinekroositekijän monomee-reiksi. Myös sellaisia olosuhteita, joissa tuumorinekroosi-tekijä aggregoituu korkeammiksi multimeereiksi, tulisi välttää. Yleensä käytetään ionitonta pinta-aktiivista ainetta, 10 kuten Tween 20, liiallisen aggregoitumisen estämiseksi puhdistuksen samoin kuin kylmäkuivauksen tai vesiseoksena säilytyksen aikana. Tuumorinekroositekijän, jota on määrä käyttää terapeuttiseen antamiseen, tulee olla steriiliä.

Tämä saadaan helposti aikaan suodattamalla tuote steriloi-15 vien suodatuskalvojen läpi. Tuumorinekroositekijä säilytetään yleensä kylmäkuivattuna.

Tuumorinekroositekijä voidaan yhdistää muihin kasvainten vastaisiin aineisiin, kuten kemoterapeuttisiin antibiootteihin (aktinomysiini-D, adriamysiini, aklasinomysii-20 ni A) tai immuunivastetta lisääviin tai stimuloiviin aineisiin, esimerkiksi immunoglobuliineihin, kuten gammaglobu-., liiniin, immunoglobuliinit, joilla on affiniteetti kasvain- '···' solujen pinta-antigeenien suhteen, mukaan luettuina. Lisäk- : si, koska interferonit toimivat synergistisesti tuumorinek- ; ’· 25 roositekijän kanssa soluhajotuskokeissa, on edullista yh- • t ' • distää alfa-, beta- tai gamma-interferonia tuumorinekroo- *;· sitekijäkoostumuksiin tai tuumorinekroositekijää ja lymfo- • · · · toksiinia sisältäviin koostumuksiin. Tyypillinen formula sisältää tuumorinekroositekijää ja gamma-interferonia ak- , 30 tiivisuusyksikkösuhteessä noin 0,1 :1 - 200:1 , yleensä 10:1, • · · ..·[! ja voi sisältää lymfotoksiinia korvaamassa osan tuumori- • ϊ · nekroositekijästä. Näitä suhteita voidaan luonnollisesti • · :.\r muuttaa hoitokokemusten vaatimalla tavalla.

·"·' Tuumorinekroositekijäkoostumuksia annetaan eläimil- : 35 le, joilla on kasvaimia. Antotapa on tunnettujen menetel- mien mukainen, esimerkiksi laskimon-, vatsakalvon-, lihaksen- 98217 34 tai leesionsisäisinä infuusioina tai injektioina tai hidas-tetusti vapauttavien systeemien avulla, kuten jäljempänä kuvataan. Tuumorinekroositekijä annetaan leesionsisäisesti, so. ruiskuttamalla suoraan, kiinteisiin kasvaimiin. Disse-5 minoituneiden kasvaimien, kuten leukemian, ollessa kyseessä tapahtuu antaminen edullisesti laskimonsisäisesti tai imu-kudos järjestelmään. Vatsa-alueen kasvaimia, kuten munasarjasyöpää, hoidetaan edullisesti vatsakalvonsisäisellä in-fuusiolla käyttämällä vatsaontelodialyysilaitteistoa ja 10 vatsaontelolle sopivia liuoksia. Tuumorinekroositekijää annetaan tavallisesti kuitenkin jatkuvana infuusiona, vaikka suuret kertaruiskeetkin ovat hyväksyttäviä.

Tuumorinekroositekijää annetaan edullisesti istutettavissa olevasta hitaasti vapauttavasta tuotteesta. Esi-15 merkkeinä järjestelmistä, jotka soveltuvat proteiineille, joilla on tuumorinekroositekijädimeerejä tai -trimeerejä vastaava molekyylipaino, ovat L-glutamiinihapon ja gamma-etyyli-L-glutamaatin kopolymeerit [U. Sidman et ai., Biopo-lymers 22(1) (1983) 547-556], poly(2-hydroksietyylimetakry-20 laatti) [R. Langer et ai., J. Biomed. Mater. Res. 15 (1981) 167-277; ja R. Langer et ai., Chem. Tech. 12 (1982) 98-105] ja etyleenivinyyliasetaatti (R. Langer et ai., imibid.). Tämä valmiste istutetaan leikkauskohtaan, josta kasvain on poistettu. Vaihtoehtoisesti tuumorinekroositekijä kapseloi-\ 25 daan puoliläpäiseviin mikrokapseleihin tai liposomeihin * ** kasvaimeen ruiskuttamista varten. Tämä antotapa on erityi- • · « •••j sen edullinen kasvaimille, joita ei voida poistaa kirurgi- • · · *·* ‘ sesti, esimerkiksi aivokasvaimille.

Annettava tuumorinekroositekijämäärä riippuu esi-:.f#! 30 merkiksi antotavasta, kyseessä olevasta kasvaimesta ja po- :V: tilaan kunnosta. Leesionsisäiset injektiot vaativat vähem- . män tuumorinekroositekijää potilaan painoon nähden kuin laskimonsisäinen infuusio, kun taas jotkut kasvaintyypit, esimerkiksi kiinteät kasvaimet, näyttävät olevan resisten-35 timpiä tuumorinekroositekijälle kuin toiset, esimerkiksi leukemiakasvaimet. Siten hoitavan lääkärin on välttämätöntä ΟΡΟΊ '? 35 · yo I i/ laskea annostus ja muuntaa antotapaa kohteena olevan kasvaimen vastaisen optimaalisen sytotoksisen vaikutuksen saavuttamiseksi vaadittavalla tavalla, joka voidaan määrittää esimerkiksi kasvaimesta otettujen kudosnäytteiden avulla 5 tai tutkimalla oletettuja syöpämarkkereita, kuten karsino-embryoonista antigeeniä, ottaen huomioon mahdollinen toksisuus kohotetuilla annoksilla. Tuumorinekroositekijäännökset aina annostukseen noin 120 ^ug/painokilo/vrk asti laskimonsisäisesti annettuna on yleensä havaittu suurin piirtein 10 myrkyttömiksi ja tehokkaiksi in vivo.

Tuumorinekroositekijän ei uskota olevan sytotoksi-selta aktiivisuudeltaan lajispesifinen, niin että muuta kuin ihmisen tuumorineksooritekijää, esimerkiksi nauta-tai sikaperäistä tuumorinekroositekijää saatettaisiin voi-15 da käyttää ihmisten kasvaimien hoitoon. On kuitenkin toivottavaa käyttää hoidettavasta lajista peräisin olevaa tuumorinekroositeki jää autoantibodien mahdollisen muodostumisen estämiseksi.

Esimerkkien yksinkertaistamiseksi kuvataan tiettyjä 20 usein esiintyviä menetelmiä lyhyesti.

Plasmideja merkitään pikku-p-kirjaimella, joka on ennen isoja kirjaimia ja/tai numeroita tai niiden jälkeen. Tässä käytetyt lähtöaineplasmidit ovat kaupallisesti saa-: .·, tavia, ovat yleisön saatavissa rajoittamattomasti tai voi- .·. 25 daan muodostaa saatavissa olevista plasmideista julkaistu- . jen menetelmien mukaisesti. Lisäksi alalla tunnetaan muita • · · • · * vastaavia plasmideja ja ne ovat alaa tavanomaisesti hallit-··· **** sevalle ilmeisiä.

• · * • · · *·’ * DNA:n pilkkomisella tarkoitetaan DNA:n katkomista 30 katalyyttisesti entsyymillä, joka vaikuttaa vain tiettyihin %:.· DNA:n kohtiin. Tällaisia entsyymejä kutsutaan restriktio- • · · V · entsyymeiksi ja paikkaa, jolle kukin entsyymi on spesifinen, .·. : kutsutaan restriktiokohdaksi. "Osittaisella" pilkkomisella tarkoitetaan restriktioentsyymillä tehtävää epätäydellistä 35 pilkkomista, ts. valitaan olosuhteet, jotka johtavat DNA- · substraatissa olevien joidenkin, mutta ei kaikkien, tiettyä 36 η Π O Ί >7 - >0/ !/ restriktioendonukleaasia vastaavien kohtien katkeamiseen. Tässä yhteydessä käytetyt eri restriktioentsyymit ovat kaupallisesti saatavia ja niiden yhteydessä käytettiin valmistajien antamia reaktio-olosuhteita, kofaktoreita ja muita 5 vaadittavia tekijöitä. Restriktioentsyymejä merkitään yleensä lyhentein, jotka koostuvat isosta kirjaimesta, jota seuraa muita kirjaimia ja sitten yleensä numero, joka edustaa mikro-organismia, josta kyseessä oleva restriktioent-syymi on alunperin saatu. Yleensä käytetään noin 1 yg plas-10 midi- tai DNA-fragmenttia ja noin 1 yksikkö entsyymiä noin 20 yl:ssa puskuriliuosta. Valmistaja ilmoittaa kullekin restriktioentsyymille sopivan puskurin ja substraatin määrät. Yleensä käytetään inkubointiaikoja noin yksi tunti 37 °C:ssa, mutta ne voivat vaihdella valmistajan ohjeiden mu-15 kaan. Inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja pilkottu nukleiinihappo otetaan talteen vesifraktiosta seostamalla etanolilla. Res-triktioentsyymipilkkomista seuraa joskus harvoin hydrolysoiminen bakteerin alkalisella fosfataasilla terminaalisten 20 5'-fosfaattien, jotta saataisiin estetyksi DNA-fragmentin kahden restriktiopilkotun pään "sirkularisoituminen" eli suljetun lenkin muodostuminen, joka voisi estää toisen DNA-fragmentin sijoittamisen restriktiokohtaan. Ellei toisin mainita, plasmidien pilkkomista ei seuraa 5'-terminaalinen 25 defosforylaatio. Defosforylaatiossa käytettävät menettelyt • · * ja reagenssit ovat tavanomaisia (T. Maniatis et ai. Mole- ··· •**| cular Cloning, 1982, s. 133-134).

*·* * Tietyn DNA-fragmentin "talteenotto" eli "eristämi nen" restriktiopilkkomisseoksesta tarkoittaa pilkkomistuo- « J.:.< 30 teseoksen erottamista polyakryyliamidigeenielektroforeesil- • * · i la, mielenkiinnon kohteena olevan fragmentin identifioimis- .·* : ta vertaamalla sen liikkuvuutta molekyylipainoltaan tunnet

* » I

* ! tujen markkeri-DNA-fragmenttien liikkuvuuteen, halutun frag mentin sisältävän geelin osan poistamista ja geelin erotta-35 mistä DNA:sta. Tämä menettely on yleisesti tunnettu. Katso esimerkiksi R. Lawn et ai., Nucleic Acids Res, 9 (1981) 37 98217 6103-6114 ja D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057.

"Southern-analyysi" on menetelmä, jonka avulla varmistetaan DNA-sekvenssien läsnäolo pilkkomistuoteseoksessa 5 tai DNA:ta sisältävässä koostumuksessa tekemällä hybridisaatio tunnetun leimatun oligonukleotidin tai DNA-fragmen-tin kanssa. Tässä yhteydessä, ellei toisin mainita, Southern-analyysillä tarkoitetaan pilkkomistuotteiden erottamista 1-%:isella agaroosilla, denaturoimista ja siirtoa nitrosel-10 luloosaan E. Southernin /j. Mol. Biol. 98 (1975) 505-517/ menetelmällä ja hybridisoimista T. Maniatisin et ai. /Cell 15 (1978) 687-701/ kuvaamalla tavalla.

"Transformointi" merkitsee DNA:n tuomista organismiin siten, että tämä DNA on replikoitavissa, joko kromoso-15 min ulkopuolisena osana tai kromosomiin integroituneena elementtinä. Ellei toisin mainita, on tässä yhteydessä E. colin transformointiin käytetty menetelmä Mandelin et ai. [J. Mol. Biol. 53 (1970) 154/ CaC^-menetelmä.

"Ligaatio" tarkoittaa fosfodiesterisidosten muodos-20 tamista kahden kaksisäikeisen nukleiinihappofragmentin välille (T. Maniatis et ai., ibid., s. 146). Ellei toisin mainita, ligaatio voidaan tehdä käyttämällä tunnettuja pus-. kureita ja olosuhteita ja noin 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia • ("ligaasia") /0,5 ^ug ligatoitavia DNA-fragmentteja, joiden . . 25 moolimäärät ovat suurin piirtein yhtä suuret.

DNA:n "preparoiminen” transformanteista tarkoittaa • « • · ·,·. plasmidi DNA:n eristämistä mikrobiviljelmästä. Ellei toi- sin mainita, voidaan käyttää Maniatisin et ai. (ibid. s.

t: : ‘ 90) emäs/SDS-menetelmää.

30 "Oligonukleotidit" ovat lyhyitä yksi- tai kaksisäi- *90 '«·* keisiä polydeoksinukleotideja, jotka syntetisoidaan kemial- V : lisesti tunnetuin menetelmin ja puhdistetaan sitten polyak- ·*·.· ryyliamidigeeleillä.

• · · .j Kaikki lainaukset kirjallisuudesta ilmoitetaan viit- 35 teinä.

38 ο Ο Π Ί Π yOL 1/

Esimerkki 1

Tutkimukset

Tuumorinekroositekijänominaisaktiivisuus määritettiin aiemmin kuvatulla solulyysitutkimuksella [B. Spof-5 ford, J. Immun. 112 (1974) 2111]. Hiiren L-929-fibroblas-tisoluja (ATCC CCL-929) kasvatettiin 96-syvennyksisissä tasapohjaisissa maljoissa (3040; Falcon Plastics, Oxnard, CA) tiheytenä 30 000 solua/syvennys (0,1 ml) aktinomysii-ni D:n (1 pg/ml) ja sarjalaimennetun tutkittavan näytteen 10 (0,125 ml) läsnä ollessa. Soluja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CO2, 37 °C:ssa. Tutkittava näyte poistettiin 18 tunnin kuluttua, maljat pestiin ja solujen hajoaminen detektoitiin värjäämällä maljat liuoksella, joka sisälsi 0,5 % kristalliviolettia meta-15 nolivesiseoksessa (tilavuussuhteessa 1:1). Päätepisteet mikromaljoilla määritettiin automaattisella Microelisa-lukulaitteella (Dynatech), jonka absorptioaallonpituus oli säädetty 450 nm:ksi ja transmissioaallonpituus 570 nmtksi. Solut, jotka olivat alttiina vain kasvualustalle, 20 toimivat 0-%:ista hajoamista vastaavana standardina ja 4 M guanidiinihydrokloridiliuoksella käsitellyt solut kat-·, sottiin 100-%:isesti hajonneiksi. Yksi yksikkö tuumori- • I t nekroositekijää on määritelmän mukaan se määrä tuumori- nekroositekijää (0,125 ml:n tilavuudessa määritettynä) . 25 joka saa aikaan 50-%:isen solujen hajoamisen.

• · · • · • Tuumorinekroositekijä tutkittiin myös tuumorinek- *·· roosikokeella in vivo. Lyhyesti sanottuna tämä koe teh-V * tiin kasvattamalla Meth A -sarkoomasoluja (5 x 10° solua) CB6F^-naarashiirissä [(BALB/c x C57BL/6)F1) 7-10 vuorok-30 autta ja ruiskuttamalla sitten tuumorinsisäisesti tuumo-ϊ*Γ; rinekroositekijänäyte. Hiiret tapettiin 24 tunnin kulut- . tua taittamalla niska, kasvaimet poistettiin ja nekroosi * «i I arvosteltiin histologisesti E. Carswellin et ai. [Proc.

Nat. Acad. Sei. 72 (1975) 3666-3670] kuvaamalla tavalla.

39

Op 9 1'? 0 Z.. (/

Esimerkki 2 PBL:ien tai monosyyttisolulinjan käyttö tuumorinek-roositekijän syntetisoimiseen

Ihmisen HL-60-promyelosyyttisolulinjan alkuviljel- 5 5 mää, jonka solutiheys oli 1 x 10 solua/ml, kasvatettiin 2 litran telapulloissa (890 cm^) käyttämällä 500 ml RPMI 1640 -alustaa (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), joka sisälsi 10 mmol/1 HEPES:iä, 0,05 mmol/1 - merkaptoetanolia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä, 100 pg/ml streptomysiiniä ja 10 10 % naudan sikiöseerumia. Kun oli kasvatettu kolme vuorokaut ta 37 eC:ssa, jolloin solutiheys oli saavuttanut arvon 8-12 5 x 10 solua/ml, solut kerättiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 1 000 x g 10 minuuttia, pestiin kahdesti seerumiva-paalla RPMI 1640 -alustalla ja siirrostettiin yllä kuvat-15 tuun alustaan, joka ei kuitenkaan sisältänyt seerumia, so- 5 lutiheydeksi 15-20 x 10 solua/ml. Soluja kasvatettiin 2 litran telapulloissa PMA:n (10 mg/ml) läsnä ollessa. 16-24 tunnin kuluttua solut poistettiin suodattamalla 3 pm:n Sealkleen-suodattimen läpi (Pall Trinity Micro Corp., Cort-20 land, NY). Kirkas suodos tutkittiin tuumorinekroositekijän suhteen ja sitä käytettiin jatkopuhdistukseen ja karakterisointiin. Tällä menettelyllä saatiin tuumorinekroositekijää noin 400 yksikköä/ml viljelmäsupernatanttia.

Myös ihmisen ääreisverimonosyyttejä käytettiin tuu- 25 morinekroositekijän tuotantoon. Verihiutalefereesitähteet J % · * toimitti American Red Cross, Boston, MA ja ne käytettiin 24

* «I

*»·· tunnin kuluessa keräämisestä. Monosyyttien ensimmäinen ero- + · n V tus erytrosyyteistä tehtiin sentrifugoimalla Ficoll-Hypa- quegradientteja käyttäen kiihtyvyydellä 1 000 x g 30 mi-:.j.‘ 30 nuuttia. Rajapinnalle kertyneet solut pestiin kolmesti fos- **ί’ί faattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella. Kulta- . kin luovuttajalta peräisin olevia soluja kasvatettiin erik seen 2 litran telapulloissa seerumittomassa RPMI 1640 -alustassa tiheytenä 2,5 x 10^ solua/ml. Viljelmään lisättiin 1 • j 35 pg/ml stafylokokkienterotoksiini B:tä (SEB) ja yhdis- 40 98217 telmätymosiini ct-1: kumpaakin ja soluja kasvatettiin kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10 % 37°C:ssa.

24-72 tunnin kuluttua, luovuttajasta riippuen, solusuper-natantit otettiin talteen ja käsiteltiin HL-60-solulinjas-5 ta saadun supernatantin yhteydessä kuvatulla tavalla. PBL-viljelmistä saadut tuumorinekroositekijäsaannot vaihtelivat suuresti käytetyistä indusoijista riippuen. PMA:n lisääminen edellä kuvattuun induktiosysteemiin lisäsi solusuper-natanttien sytolyyttistä aktiivisuutta. Solusupernatantit 10 sisälsivät kuitenkin sekä tuumorinekroositekijää että lym-fotoksiinia (lymfotoksiinin tai tuumorinekroositekijän määrittäminen tuumorinekroositekijän ja lymfotoksiinin seoksista tehtiin suorittamalla solulyysikokeet näytteillä, joita oli esi-inkuboitu tuumorinekroositekijän tai lymfotoksiinin 15 vaikutuksen kumoavan kaniini vasta-aineen läsnä ollessa ja määrittämällä jäännösaktiivisuus kokeella, jossa tutkittiin L-929-solujen hajoamista).

Esimerkki 3

Kontrolloidusta huokoslasista valmistetuilla helmil-20 lä tehtävä kromatografia

Tuumorinekroositekijäaktiivisuus absorboitiin soluviljelmästä panosmenetelmällä kontrolloituihin huokoslasi-helmiin (Electro-Nucleonics, Fairfield, NJ. luettelo-nro CPG 00350), jotka oli tasapainotettu käyttämällä 10 mM nat-·...· 25 riumfosfaattipuskuria, pH 8,0, sekoittaen tasaisesti 4°C:ssa.

·.· · Lasihelmiä käytettiin 100 ml/5 1 alustaa. Kun oli sekoitet- :*·.. tu yksi tunti, helmien annettiin laskeutua ja supernatant- :*·*; ti dekantoitiin pois. Sitten helmet kaadettiin huoneen läm- • · pötilassa 5 x 50 cm:n kolonniin ja pestiin 10 mM natrium-30 fosfaattipuskurilla, pH 8,0, joka sisälsi 1 mol/1 NaCl.

• · ·

Tuumorinekroositekijäaktiivisuus eluoitiin lasihelmistä . liuoksella, joka sisälsi 20 % etyleeniglykolia ja 1 mol/1 • · · ”** NaCl 10 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 8,0. HL-60-super- '·' ‘ natantin eluoitumiskäyrä kolonnista esitetään kuviossa 1.

Γ Ο Ο Ί Γ7 41 2 O / i /

Esimerkki 4 DEAE-selluloosakromatografia

Esimerkistä 3 saatu eluaatti syötettiin suoraan DEAE-selluloosa 53 (Whatman) sisältävään kolonniin (2,5 x 20 cm), 5 joka oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 8,0, joka^sisälsi 0,01 % Tween 20, käyttäen virtausnopeutta noin 500 ml/h. Kun virtausnopeus kolonnissa oli säädetty arvoon 100 ml/h, lisättiin 4,2 x 10® yksikköä tuumo-rinekroositekijää 1 080 ml:n näytteessä 4°C:ssa, kolonni 10 huuhdottiin tasapainotuspuskurilla ja tehtiin eluointi käyttäen portaittaista gradienttia 75, 150 ja 500 mmol/1 nat-riumkloridia 10 mM fosfaattipuskurissa (pH 8,0). Eluaatin absorbanssia aallonpituudella 280 nm ja tuumorinekroosite-kijäaktiivisuutta seurattiin eluoitujen fraktioiden funktio-15 na. Tulokset annetaan kuviossa 2.

Esimerkki 5 FPLC (proteiinien nopea kromatografia)

Esimerkissä 4 saatu tuumorinekroositekijäaktiivi-

suuden sisältävä fraktio väkevöitiin ja dialysoitiin 20 mM

20 Tris.HCl-puskuria (pH 8,0), joka sisälsi 0,01 % Tween 20 ja 1 mmol/1 natriumatsidia (puskuri A) vastaan Amicon-se- koituskennolla käyttämällä YM-10-kalvoa tai muuta dialyysi- kalvoa, jonka molekyylipainoraja on TNF:n molekyylipainon alapuolella. Kalvo pestiin kahdesti puskuri Ailia. Kolonni, 25 joka sisälsi kvaternaarisilla ammoniumryhmillä substituoi- i.i · tuja Sepharose-helmiä (9,8 ,um:n helmiä 5 x 0,5 emin kolon- • · · j nissa; myydään nimellä Mono Q -hartsi, Pharmacia) ja joka oli sijoitettu FPLC-yksikköön (proteiinipikakromatografia) ··· (Pharmacia) , joka oli varustettu gradienttiohjelmointiyk- ·· ·· 30 siköllä (GP-500) ja kahdella pumpulla (P-500) , tasapaino- tettiin ennalta dialyysipuskureilla virtausnopeudella 1 ml/ . ^ min J. Richeyn (American Laboratory, lokakuu 1982, s. 1) • · · tarkemmin kuvaamalla tavalla. Yhdistetyt huuhtoutuneet liuokset ja dialyysikonsentraatti laitettiin kolonniin, 35 kolonni huuhdottiin puskuri Ailia ja eluoitiin sitten :··: käyttäen lineaarista gradienttia 40-75 mmol/1 natriumklo- 5. Γ; A ^ n 'ύί 1/ ridia puskuri A:ssa. Lineaariset gradientit ohjelmoitiin seuraavasti 5,1 - 5 minuuttia, 25 mM NaCl; 15,1 - 25 minuuttia, 40 mM NaCl; 25-60 minuuttia, lineaarinen gra-dientti 40 —> 75 mM NaCl; 60-65 minuuttia 75 mM NaCl; 65,1 -5 70 minuuttia, 100 mM NaCl; 70-80 minuuttia, lineaarinen gradientti 100 —> 1 000 mM NaCl; 80-90 minuuttia, 100 mM NaCl; 90,1 - 110 minuuttia tasapainotuspuskuri. Effluentti kerättiin 2 ml:n fraktioina, joista tutkittiin absorbanssi aallonpituudella 280 nm, ominaisjohtokyky ja tuumorinekroo-10 sitekijäaktiivisuus. Tulokset esitetään kuviossa 3.

Esimerkki 6 Kromatofokusointi

Kromatofokusointi tehtiin käyttäen Pharmacia Mono P -kolonnia (20 x 0,5 cm) esimerkin 5 mukaisessa FPLC-sys-15 teemissä. Biologisesti aktiivinen (tuumorinekroositekijä) fraktio, joka eluoitui esimerkissä 5 fraktioissa 37-45, väkevöitiin ja dialysoitiin Amicon-sekoituskennolla YM-10-kalvoa käyttäen kolonnin tasapainotuspuskuria, ts. 0,025 M bis-Tris.HCl:ää (pH 6,7), vastaan. Näyte syötettiin Mono P 20 -kolonniin huoneen lämpötilassa ylähaaran kautta virtausnopeudella 1 ml/min. Kolonnia huuhdottiin tasapainotuspus-kurilla, kunnes absorbanssi aallonpituudella 280 nm palasi perustasoon ja eluoitiin sitten lineaarisella pH-gradien-., tiliä, joka saatiin aikaan huuhtomalla kolonnin 7,5-%:isel- /·; 25 la polypuskuri 74:llä (pH 4,7) (Pharmacia). Kerättiin 1 ml:n :·'· ; fraktioita ja rekisteröitiin absorbanssi aallonpituudella • · : *” 280 nm ja pH. Tulokset esitetään kuviossa 4. Kuten kuviosta • · ; 4 on havaittavissa, oli tuumorinekroositekijän isoelektri- nen piste noin 5,3.

30 Esimerkki 7

• — I- I

Preparatiivinen SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo- . .·. reesi * · · .··. Valmistettiin 15-%:iset polyakryyliamidigeelit (11 x 16 cm), joiden paksuus oli 1,5 - 3,0 mm, U. Laemmlin /Nature 35 227 (1970) 680-685.7 menetelmän muunnosta käyttäen. Sekä erottavat että tarttuvat geelit sisälsivät 0,1 % SDS:ää 98217 43 ja 0,05 % Tween 20. Muut puskurit ja silloitusreagenssi olivat samat kuin analyyttisissä SDS-PAGE-geeleissä. Esimerkin 5 tai 6 mukaiset fraktiot, jotka sisälsivät tuumo-rinekroositekijäaktiivisuutta, yhdistettiin, väkevöitiin 5 ja dialysoitiin 6,25 mM Tris.HCl:ää (pH 7,0), joka sisälsi 0,005 % SDS, vastaan Amicon-sekoituskennolla käyttämällä YM-10-kalvoa. Dialysoidun konsentraatin poistamisen jälkeen kalvo pestiin kolmesti pienellä tilavuudella näyte puskuria (0,2 % SDS:ää, 0,02 % Tween 20, 30 % glyse-10 rolia, 0,03 mol/1 Tris.HCl (pH 6,8) ja 0,005 % tunnistus-väriä). Dialysoitu konsentraatti ja pesuliuokset yhdistettiin (kokonaistilavuus 1-4 ml), lisättiin mahdollisesti merkaptoetanolia SDS-PAGE-pelkistysolosuhteiden aikaansaamiseksi, ja näyte laitettiin tarttuvaan geelin 15 valettuun suureen syvennykseen. Näytesyvennyksen viereisiin pieniin syvennyksiin laitettiin ennalta värjättyjä molekyylipainomarkkereita fosforylaasia (94 K), naudan seerumialbumiini (67 K), ovalbumiinia (43 K), karbonian-hydraasi (30 K), soijapaputrypsiini-inhibiittori (20 K) 20 ja lysotsyymi (14,4 K). Geelejä ajettiin pystysuorassa elektroforeesisysteemissä (Biorad), joka oli jäähdytetty 12 °C:seen, vakiovirralla 20 mA/mm (geelin paksuus), kunnes tunnistusväri saavutti geelin alareunan.

Elektroforeesin jälkeen poistettiin yksi lasile-25 vyistä geeliltä, ja todettiin molekyylipainomarkkerien t » » · :*. _ sijainnit. Tuumorinekroositekijänäytteen sisältävä kaista leikattiin sitten 0,25 cm:n paloihin markkeriproteiinien • · * molekyylipainojen mukaisesti. Nämä geelipalat laitettiin sitten polypropyleeniputkiin, jotka sisälsivät 1-2 ml 10

Iti *·* * 30 mM ammoniumbikarbonaattiliuosta (pH 8,0), joka sisälsi 0,01 % Tween 20 ja annettiin eluoitua 16 tuntia 4 eC:ssa. Eluaateista tutkittiin sitten tuumorinekroositekijäaktii-visuus, tulokset esitetään kuviossa 5. Tuumorinekroosite-kijän molekyylipaino SDS-geelillä oli noin 17 000 sekä ,, 35 pelkistävissä että pelkistämättömissä olosuhteissa, mikä viittaa yksiketjuiseen molekyyliin.

44 98217

Proteiini otettiin geelipalaeluaateista talteen suoloista ja pienimolekyylisistä aineista vapaana seuraavan käsittelyn avulla:· Valmistettiin pienet kolonnit, jotka sisälsivät 0,2 ml Sep-pak C18 -hartsia, joka oli esihuuhdot-5 tu asetonitriilillä, 1-propanolilia, 1-%:isella trifluori-etikkahapolla (TFA) ja tislatulla vedellä ja tasapainotettu sitten 10 mM ammoniumbikarbonaatilla, joka sisälsi 0,01 % Tween 20 (pH 8,0). Geelieluaatti syötettiin kolonniin ja kerättiin effluentti. Sitten hartsi huuhdottiin tislatulla 10 vedellä ja 0,1-%:isella TFA:11a, joita kumpaakin käytettiin noin 5 ml, vapaiden aminohappojen ja puskurisuolojen poistamiseksi. Tuumorinekroositekijä eluoitiin kolonnista 1 ml:11a liuosta, joka sisälsi 50 % 1-propanolia 0,1-%:ises-sa TFA:ssa. Tehtiin vielä lisäksi eluoinnit liuoksilla, 15 jotka sisälsivät 50 % 1-propanolia 1-%:isessa TFA:ssa ja 99 % 1-propanolia 1-%:isessa TFA:ssa (1 ml kumpaakin liuosta) , mutta yleensä proteiini eluoitui ensimmäisellä puskurilla. Tuumorinekroositekijän biologisesta aktiivisuudesta tuhoutui noin 80 % tässä vaiheessa. Vaikka täten saatua 20 tuumorinekroositekijää voidaan käyttää sekvenssianalyysiin, on edullista käyttää tähän tarkoitukseen esimerkissä 8 kuvattavaa HPLC-effluenttia.

Esimerkki 8 . , HPLC-kromatografia 25 Luontaisen, muuttumattoman tuumorinekroositeki jän ·*;· · molekyylipaino määritettiin suurpainegeelipermeaatiokroma- • ·

·’ ** tografiällä. Tämä tehtiin huoneen lämpötilassa käyttäen TSK

• : V G2000 SW -geeliä sisältävää HPLC-kolonnia (Alltech Associates, ..]·* Deerfield, IL) (7,5 x 60 mm). 1 ml:n näyte esimerkissä 5 :J‘: 30 saatua puhdistettua tuumorinekroositekijää, joka sisälsi noin 1 ^,ug proteiinia ja 16 000 aktiivisuusyksikköä, eluoi-. .*. tiin isokraattisesti geelikolonnista virtausnopeudella • tl 0,5 ml/min eluenttina 0,2 M natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0. Kolonni kalibroitiin naudan seerumialbumiinilla (M = 66 000), 35 ovalbumiinilla (M = 45 000) , naudan karbonianhydraasi B:llä • (M = 29 000) ja lysotsyymillä (M = 14 300). Kerättiin o O O "1 Γ7 45 1 ml:n fraktioita, joista tutkittiin tuumorinekroositeki-jäaktiivisuus. Fraktiot, joissa oli tuumorinekroositeki-jäaktiivisuutta, eluoituivat molekyylipainoa 45 000 ± 6 000 vastaavalla kohdalla (kuvio 6).

5 Esimerkki 9

RP-HPLC

Tuumorinekroositekijä puhdistettiin myös RP-HPLC-:llä käyttämällä C4 Synchropak -kolonneja Water’s Associates, Inc:n kromatograafisiin järjestelmiin kirjalli-10 suudessa kuvatulla tavalla [W. Kohr et ai., Anal. Bio-chem. 122 (1982) 348-359]. Proteiinipiikit detektoitiin aallonpituuksilla 210 ja 280 nm, kun oli tehty eluointi lineaarisella gradientilla 1 -> 23 tilavuus-% 1-propanolia 0,l-%:isessa TFA:ssa ensimmäiset 15 minuuttia ja 23 -* 30 15 tilavuus-% 1-propanolia 0,l-%:isessa TFA:ssa seuraavat 15 minuuttia virtausnopeuden ollessa 1 ml/min. Piikeistä analysoitiin sytolyyttinen aktiivisuus. Orgaaniset liuottimet, joita käytettiin tuumorinekroositekijän eluoimi-seen C4-kolonnista, alensivat tuumorinekroositekijäaktii-20 visuutta noin 80 %. Tällä menetelmällä puhdistettu tuumorinekroositeki jä kuivattiin alipaineessa ja käsiteltiin sitten aminohappoanalyysiä ja sekventointia varten. Tulokset esitetään kuviossa 7. Kuvio 7 osoittaa, että esimerkin 5 effluentin mukana saatu tuumorinekroositekijä 25 sisälsi biologisesti inaktiivisia proteiiniepäpuhtauksia, j jotka eluoituivat noin 16 ja 19 minuutin retentioajoilla.

:***: C4-RP-HPLC:stä saatu biologisesti aktiivinen effluentti oli suurin piirtein homogeenista aminohapposekvenssiä ar-

• •«I

vosteluperusteena käytettäessä.

• · 30 Esimerkki 10 . Tuumorinekroositekijän aminohapposekvenssin osit- • · · • · · ··* täinen määritys

Tuumorinekroositekijä pilkottiin trypsiinillä seuraavasti: Esimerkin 9 mukaisesti saatu homogeeninen tuu-35 morinekroositekijä liuotettiin, kuivattiin ja liuotettiin takaisin 100 mM ammoniumbikarbonaattipuskuriin (pH 8,0), joka sisälsi 5 paino-% TPCK-trypsiiniä (Worthington 46 96217

Biochemicals), 1 mmol/1 CaC^ ja 0,01 % Tween 20, entsyymin ja substraatin välisen suhteen ollessa -1:20, inkuboi-tiin kuusi tuntia 37°C:ssa, lisättiin vielä 5 paino-% trypsiiniä ja inkuboitiin hydrolyysiseosta vielä 12 tuntia 5 37°C:ssa. Reaktioseos laitettiin edellä kuvatun kaltaiseen C4-HPLC-kolonniin peptidifragmenttien erottamiseksi. Tulokset esitetään kuviossa 8. Saatiin kaikkiaan yhdeksän fragmenttia (fragmentit 2 ja 2' eluoituivat yhdessä piikkinä, josta kuviossa 8 käytetään merkintää T2). 10. frag-10 mentin uskotaan jääneen pidättymättä kolonniin. Esimerkkien 8 ja 9 mukaisten kokonaisten tuumorinekroositekijoiden ja tässä esimerkissä saatujen trypsiinihydrolyysifragmenttien aminohapposekvenssit määritettiin automaattisella jaksoittaisella Edman-hajotuksella käyttämällä muunnettua Beckman-15 sekventoijaa (malli 890B), joka oli varustettu kylmälou-kuilla. Kupissa käytettiin kantajana polybreeniä (1,25 mg). Kokonaisen molekyylin aminohappokoostumuksen perusteella on kokonaisen tuumorinekroositekijän molekyylipaino 17 100. Tämä luku sopii yhteen SDS-PAGE-tulosten kanssa ja vahvis-20 taa sitä, ettei glykosylaatiota esiinny.

Esimerkki 11

Tuumorinekroositekijän ja gamma-interferonin syner-gistinen vaikutus • ·, Hiiren melanooma B16 -solut (Mason Research, .]! 25 Worcester, MA., C57B1/6-peräinen solulinja) ympättiin mik- *;1 ‘ romaljalle tiheydeksi 5 000 solua/syvennys ja inkuboitiin \ neljä tuntia 37°C:ssa kostutetussa atmosfäärissä, joka si- • · · : ·1 sälsi 5 % CO2, ennen lymfokiinien lisäämistä. Esimerkin 1 mukaisesti saatu tuumorinekroositekijä puhdistettiin suu- • · · : 30 rin piirtein homogeeniseksi HPLC:llä ja sen aktiivisuuden määrä analysoitiin edellä kuvatulla kokeella, jossa tut-: kittiin L929-solujen hajoamista. Samoin määritettiin hii- • »1 :1·1: ren puhdistetun yhdistelmägamma-interferonin /p. Gray et ai., Proc. Natl. Acad. Sei USA 80 (1983) 5842-5846_7 virus- ' ; 35 ten vastainen aktiivisuus EMC-infektoituja L-soluja vas taan [Ό. Goeddel et ai., Nature (London) 287 (1980) 411-416.7.

· CP 0·1'7 47 Ο Z ί /

Hiiren gamma-interferoni ja ihmisen tuumorinekroositekijä laimennettiin erikseen kuviossa 10 esitettävällä tavalla. Merkittyihin syvennyksiin lisättiin ensin gamma-interferonia ja heti sen jälkeen laimennettua tuumorinekroositekijää 5 lopullisen tilavuuden ollessa 0,2 ml/syvennys. 72 tuntia kestäneen inkuboinnin lopussa solut värjättiin liuoksella, joka sisälsi 0,5 % kristalliviolettia 20-%:isessa metano-lissa. Tulokset esitetään kuviossa 10. B16 on suhteellisen resistentti sekä pelkälle tuumorinekroositekijäile että 10 pelkälle IFN-Y:lle; tuumorinekroosipitoisuudella 1 000 yk-sikköä/ml ei havaittu silminnähtävää sytolyysiä. Hyvin pienten gamma-interferonimäärien lisääminen (jopa niin vähän kuin 5 yksikköä/ml) johti kuitenkin sytolyysiin.

Esimerkki 12 15 Lähetti-RNA:n eristäminen HL-60-soluviljelmistä (4 tuntia PMA-induktion jälkeen) tai esimerkissä 2 kuvatulla tavalla viljellyistä ää-reisverilymfosyyteistä eristettiin kokonais-RNA suurin piirtein Wardin et ai. /J. Virol. 9 (1972) 61/ kuvaamalla 20 tavalla. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoi-tiin sitten uudelleen liuokseen, joka sisälsi 10 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris.HCl (pH 7,5) ja 1,5 mmol/1 MgC^· Solut hajotettiin lisäämällä NP-40 (loppupitoisuudeksi 1 %) . ' ja tumat pelletoitiin sentrifugoimalla. Supernatantti si- • 25 saisi kokonais-RNA:n, joka puhdistettiin edelleen uuttamal- ί*· la useaan kertaan fenolilla ja kloroformilla. Vesifaasin

NaCl-pitoisuus säädettiin 0,2 mol/l:ksi, ja saostettiin • · * .·. sitten kokonais-RNA lisäämällä kaksinkertainen tilavuus **1^ etanolia. Tyypillinen saanto 1 g:sta viljeltyjä soluja oli • · · ’ 30 noin 6 mg kokonais-RNA:ta. Polyadenyloitu mRNA (n. 100 ^ug) saatiin käsittelemällä oligo(dT)selluloosalla H. Avivin et *·ί·* ai. /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 1403-1412/ mene- • · · v : telmällä.

98217 48

Esimerkki 13 DNA-kirj asto 7,5 pg esimerkissä 12 saatua poly(A)+-mRNA:ta muutettiin kaksisäikeiseksi cDNA:ksi käsittelemällä peräk-5 käin käänteistranskriptaasilla, DNA-polymeraasin Klenow-fragmentilla ja Sl-nukleaasilla [P. Gray et ai.. Nature 295 (1982) 503-508; M. Wickers et ai., J. Biol. Chem. 253 (1978) 2483-2495], Polyakryyliamidigeeliltä eristettiin noin 80 ng cDNAtta, jonka pituus oli enemmän kuin 600 10 emäsparia.

Synteettinen DNA-adaptorisekvenssi 5'AATTCATGCGTTCTTACAG 3' 3'GTACGCAAGAATGTC 5' 15 ligatoitiin cDNA:han tarttuvan EcoRI-pään muodostamiseksi. Kuten alalla on tavanmukaista, adaptori syntetisoitiin kemiallisesti kahtena erillisenä säikeenä, toisen säikeen 5'-pää fosforyloitiin polynukleotidikinaasilla ja 20 saadut kaksi säiettä emäspariutettiin. Sitten eristettiin cDNA (20 ng) uudelleen polyakryyliamidigeeliltä, sijoitettiin ligaation avulla EcoRI-pilkottuun Xgt-10:een, pakattiin faagipartikkeleihin ja lisättiin E. coli -kannassa C600hfl (Hyunh et ai., Practical Approaches in Bio-25 chemistry, IRL Press Ltd., Oxford, England, 1984) tai • · • *·· muuhun lambdafaagin lisäämiseen soveltuvassa kannassa.

• Saatiin noin 200 000 itsenäistä kloonia sisältävä cDNA- ·;· kirjasto.

• · t«

Esimerkki 14 30 Deoksioligonukleotidikoettimen valmistaminen tuumo- . .·. rinekroositekijä-cDNA: ta varten • · · !» 42 nukleotidin DNA-hybridisaatiokoetin, joka perus tui trypsiinikäsittelyllä saadun tuumorinekroositekijäpep-tidin TD-6 (E-T-P-E-G-A-E-A-K-P-W-Y-E-K-) alustavaan ami-35 nohappojaksoon, suunniteltiin käyttäen hyväksi julkaistuja : kodonien käyttötiheystietoja [R. Grantham et ai., Nucleic 1 Acids Res. 9 (1981) 43-47] ja ihmisen IFNy:n [P. Gray 98217 49

et ai., 295 (1982) 503-508] ja ihmisen lymfotoksiinin ko-donien suosimistietoja. Alustavassa sekvenssissä oli virhe (viimeisen K:n olisi pitänyt olla P). Tämä sekvenssi johti kuitenkin onnistuneeseen koettimeen. Synteettisen koettimen 5 sekvenssi oli 5'dGAAACCCCTGAAGGGGCTGAAGCCAAGCCCTGGTATGAAAAG

3' ja se syntetisoitiin R. Crean et ai. [Nucleic Acids Res.

8 (1980) 2331-2348] menetelmällä. Koetin fosforyloitiin (1- 23 P)-ATP:llä ja T4-polynukleotidikinaasilla kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 10 544].

Esimerkki 15

Tuumorinekroositekijää koodaavia jaksoja sisältävän cDNA-kloonin identifioiminen

Igt 10 -cDNA-kirjaston noin 200 000 kloonia tutkit-15 tiin DNA-hybridisaatiolla käyttäen ^P-leimattua 42-meeriä (esimerkki 14) ankaruudeltaan lievissä olosuhteissa A. Ull-richin et ai. mukaisesti [EMBO J. 3 (1984) 361364] (tai vaihtoehtoisesti P. Grayn et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 80 (1983) 5842-5846], S. Andersonin et ai. [Proc. Natl. 20 Acad. Sei. USA 80 (1983) 6836-6842] ja M. Jayen et ai.

[Nucleic Acids Res. 11 (1983) 2325-2335] menetelmällä). Yhdeksän eri kloonia hybridisoitui koettimen kanssa ja ne puhdistettiin täplämenetelmällä. Sitten valmistettiin ^P-leimattu cDNA käyttämällä indusoimattomien HL-60-solujen j. 25 mRNArta. Näistä yhdeksästä faagikloonista seitsemän DNA ei • · j hybridisoitunut tämän "indusoimattoman" koettimen kanssa ja :*·*? niiden pääteltiin siten olevan ehdokkaita tuumorinekroosi- • · ·*· tekijä-cDNA-sekvensseiksi. Suurimman insertin sisältävälle • · « r cDNA-kloonille annettiin nimeksi 142-4. Tämä insertti sek- • · 1 30 ventoitiin dideoksiketjuterminaatiomenetelmällä [A. Smith, Methods in Enzymology 65 (1980) 560-580; F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463-5467], sen jäi- • « · ·' ' keen kun se oli subkloonattu vektoriin M13mp8 [J. Messing V·: et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321].

;·: 35 142-4:lie saatu cDNA-sekvenssi sisälsi koko valmis- ; ta tuumorinekroosi teki jää ynnä osaa sen signaalipept idistä koodaavan alueen. DNA:n oikea orientaatio ja lukukehys pääteltiin vertaamalla tuumorinekroositekijän trypsiinipilkko- 98217 50 mispeptidin T4 aminohapposekvenssiin. Proteiinisekventoin-nilla määritetty tuumorinekroositekijän aminoterminaalinen valiiniryhmä on aminohappo 1 ja sitä seuraa 156 muuta aminohappoa, ennen kuin lukukehyksessä kohdataan lopetuskodo-5 ni. Laskettu molekyylipaino on 17 356 daltöniä.

Esimerkki 16

Koko PreTNFzää koodaavat sekvenssit sisältävän cDNA-kloonin identifiointi cDNA-klooni 142-4 sisältää valmiin TNF:n koko koo-10 dausalueen, mutta siitä puuttuu täydellistä signaalipepti-diä koodaava sekvenssi, mistä on osoituksena aloituskodonin puuttuminen. Puuttuvien sekvenssitietojen saamiseksi syntetisoitiin kemiallisesti heksanukleotidialuke dTGGATGTTCGTCCTCC (komplementaarinen nukleotideille 855870, 15 kuvio 10). Tämä aluke emäspariutettiin esimerkin 12 mukaiseen mRNA:han ja syntetisoitiin sitten cDNA esimerkin 13 mukaisella menetelmällä. Valmistettiin uusi, noin 200 000 cDNA-kloonia sisältävä kirjasto gtl0:ssä esimerkin 13 mukaisella menetelmällä. Tämä kirjasto tutkittiin hybridisaa- 20 tioanalyysillä käyttäen koettimena 142-4-cDNA-inserttiä, 32 joka oli leimattu P:llä. Saatiin 16 positiivista klooniat joista pisin (116-4) sisälsi cDNA-insertin, joka ulottui 337 emäsparia kauemmaksi 5'-suuntaan kuin 142-4-insertti.

< TNF-cDNA-inserttien λ16-4:η (nukleotidit 1-870) ja 142-4:n i 25 (nukleotidit 337-1643) yhdistetty sekvenssi esitetään ku- ·*·.. viossa 10.

.·.·. Esimerkki 17 • · ' • ·

Ilmentymisvektorin muodostaminen tuumorinekroosite- « kijän suoraa ilmentämistä varten • · * 30 Menettely, jota käytettiin esimerkissä 15 saadun tuumorinekroositekijää vastaavan DNA-sekvenssin ilmentämi- • · · *···’ seen esitetään kuviossa 11. Esimerkin 15 mukainen faagi 142-4, joka sisälsi koko valmista tuumorinekroositekijää koodaavan jakson ja osan tuumorinekroosite]cijän oletetus-35 taeritysesijaksosta, pilkottiin EcoRI:llä ja otettiin talteen noin 800 emäsparin fragmentti, joka sisälsi tuumori- ΠΟΟ Ί ^ >0/1/ nekroositekijää koodaavan alueen. Tämä fragmentti pilkottiin Avalrllä ja Hindlllrlla ja otettiin talteen 578 emäs-parin fragmentti ("C" kuviossa 11). Tämä fragmentti koodaa tuumorinekroositekijän aminohappoja 8-157.

5 Valmistettiin kaksi synteettistä deoksioligonukleo- tidia (fragmentti "B" kuviossa 11) (ks. adaptorisekvenssin muodostaminen esimerkissä 13), joiden 5'-päässä oli tarttuva Xbal-pää ja 3'-päässä tarttuva Aval-pää ja jotka sisälsivät met-aloituskodonin ja tuumorinekroositekijän seitse-10 mää ensimmäistä aminoterminaalista aminohappoa vastaavat kodonit. Näitä aminohappoja vastaavat kodonit valittiin E. coli -preferenssin perusteella. Aloituskodonin edellä oleva AATT-sekvenssi valittiin sopivalla tavalla erottamaan aloituskodoni trp-ribosomisitomissekvenssistä ja yhdistetty-15 nä aminohappokodoneihin estämään mahdollinen mRNA-silmukka.

Sitten segmentit B ja C liitetään kolmella ligaa-tiolla pBR322-johdokseen, joka sisältää trp-promoottorijakson ja trp-esipeptidin Shine-Dalgarno-jakson (EP-hakemus-julkaisu 36 766). Valitaan tai muodostetaan johdos, joka 20 sisältää ainutkertaiset Xbal- ja HindiII-kohdat trp-pro- moottorin ja Tet -geenin välissä. Joko pLTtrpI /Gray et ai., Nature 312 (1984) 721-724J tai ptrpETA /Gray et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 2645-2649.7 ovat soveltuvia , , tämäntyyppisiä lähtövektoreita, vaikka muitakin voidaan *··; 25 muodostaa pBR322:sta, trp-promoottorista ja mahdollisesti ί·: ; tarvittavista synteettisistä kytkijöistä. Sekä pBR322 että ·· • · : ** trp-promoottorin sisältävät plasmidit ovat yleisesti saata- • · • V villa. Valitun vektorin pBR322-osasta voi puuttua Aval- #<*j* PvuII-segmentti emäsparien 1424 ja 2065 välistä (tällöin j*;*: 30 käytetään plasmidin nimessä merkintää "XAP") . Mikä tahansa edellä mainituista plasmideista pilkotaan samanaikaisesti . .·, Xbal:llä ja HindIII:lla ja otetaan talteen suuri vektori- • · · fragmentti. Tämä fragmentti ja fragmentit B ja C ligatoi- daan T4-DNA-ligaasin avulla ja ligaatioseoksella transfor-35 moidaan E. coli 294 (ATCC 31 446) . Valikoitiin ampisillii-niresistentit pesäkkeet, otettiin talteen plasmidi-DNA ja » 4 » 98217 52 ja karakterisoitiin sen restriktioendonukleaasikartoituk-sella ja DNA-sekventoinnilla. Saatiin pTrpXAPTNF, joka sisälsi insertit B ja C.

Esimerkki 18 5 Tuumorinekroositekijän ilmentyminen E. colissa E. colia (ATCC 31 446) , joka oli transformoitu pTNFtrp:llä, kasvatettiin M9-alustassa, joka sisälsi 20 yug/ml ampisilliinia ja viljelmä kasvatettiin optiseen tiheyteen A^q = 0,3. Lisättiin indolietikkahappoa loppu-10 pitoisuudeksi 20 ^ug/ml ja viljelmää kasvatettiin, kunnes A550 = 10 ml solu3a väkevöitiin ja ne suspendoitiin uu delleen fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen. Solut äänikäsiteltiin ja laimennettiin esimerkin 1 mukaisesti tehtävää tuumorinekroositekijämääritystä varten. Saa- 5 15 tiin noin 10 aktiivisuusyksikköä/ml viljelmää. Tämä aktiivisuus kumoutui esi-inkuboitaessa tuotetta kaniinin antiseerumin kanssa, joka oli saatu ihmisen tuumorinekroosi-tekijää vastaan immunoiduista kaniineista.

Esimerkki 19 20 Tuumorinekroositekijän ilmentyminen E. colissa Tämä menetelmä on edullisempi kuin esimerkin 18 mukainen menetelmä.

Edellä mainittujen vektorien yhteydessä käytettävä isäntä on edullisesti taantumaton tonA-E. coli -kanta. Täi-• · ·1 ‘ 25 laiset kannat ovat bakteriofaagiresistenttejä ja siksi pal- * « l.i · jon paremmin soveltuvia laajamittaiseen viljelyyn kuin • · Ϊ 1.· villin tyypin kannat. Seuraavassa kuvataan soveltuvaa mene- telmää tällaisen kannan aikaansaamiseksi. E. coli W3110 • i ··· transdusoidaan Ä^:Tn10:llä, joka on paikasta toiseen siir- «Ml i1. 30 rettävissä olevan elementin Tn10 sisältävä lambdabakterio- • « · « faagi, jolloin saadaan E. coli W3110:n Tn10-hyppäystuottei-' S' den yhdistelmä /N. Klecker et ai., J. Mol. Biol. 116 (1977) 125/.

* < 1 2 * · « E. coli W3110::Tn1O-hyppäystuoteyhdistelmää kasva- * o q ’·/·: 35 tetaan L-liemessä 37 C:ssa solutiheyteen noin 1x10 so- . lua/ml. 0,5 ml viljelmää sentrifugoidaan ja pelletti t · « t 2 » t 53 98217 suspendoidaan 0,2 ml:aan xphi80- (tai T1-) lysaattia, joka 9 sisältää 7,0 x 10 plakin muodostavaa yksikköä (pfu). Faa-gin annetaan adsorboitua 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten suspensio levitetään EMB-maljoille, jotka on täydennetty tet-5 rasykliinillä (15 ^ug/ml). Kun on inkuboitu yön yli 37°C:ssa, yhdistetään vaaleanpunaiset pesäkkeet 3 mlraan L-lientä, kasvatetaan yön yli 37°C:ssa, pestään kahdesti ja suspendoidaan takaisin L-liemeen. Tämä viljelmä infektoidaan bak-teriofaagi P1 keillä ja otetaan talteen faagilysaatti (J.

10 Miller, Experiments on Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, s. 304).

E. coli AT982 (E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn, nro 4546) muutetaan tetrasykliiniresistentik-si tämän P1 ke -lysaatin avulla. Transduktantit valikoi-15 daan L-liemimaljoilla, joihin on lisätty tetrasykliiniä (15 ^ug/ml) ja diaminopimeliinihappoa (dap, 40 ^ug/ml).

Tuloksena olevista transduktanteista tutkitaan tetrasyk-

+ R

liiniresistenssi ja dap-geenin regeneraatio (dap , tet ).

+ R

dap ,tet -transduktanteista tutkitaan sitten Aphi80- (tai 20 T1-) resistenssi.

Sitten valmistetaan P1 ke -lysaatit useista dap+, tet ,1phi80- (tai T1-) resistenteistä kannoista. Lysaa-teilla transdusoidaan E. coli W3110 tetrasykliiniresisten-, tiksi. Transduktantit tutkitaan ja valikoidaan Aphi80- i 25 (tai T1-) resistenssin perusteella.

• ( i j·· · Valikoidaan tetrasykliiniresistentit solut W3110 • · .

• ** fhuA::Tn10-Xphi80R-transduktanttien joukosta /S. Naloy et • · : V ai., J. Bact. 145 (1981) 1110J. Näiden eristettyjen solu- ,.)·1 jen faagi \phi80-resistenssi ja tetrasykliiniherkkyys var- •T: 30 mistetaan yksipesäkepuhdistuksen jälkeen.

Eristetään DNA muutamista tetrasykliiniherkistä, . phi80-faagiresistenteistä mutanteista ja pilkotaan se ···

SstII:lla. Sstll-pilkottu DNA karakterisoidaan Southern- . 1 · i täplämenetelmällä käyttäen radionuklidileimattua, Sstll-' 35 pilkottua Λ::Tn 10-DNA: ta koettimena sen määrittämiseksi, onko Tn10 poistunut (R. Davis et ai., Advenced Bacterial ) .

« < 1 98217 54

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Toinen tetrasykliiniresistenteistä eristetyistä mutanteista on menettänyt kaksi TnlO-hybridisaatiovyöhykettä verrattuna λ::TnlO-DNA:n ja parentaalisen W3110 fhuA::Tnl0Xphi80R:n 5 väliseen hybridisaatioon. Kolmannen hybridisaatiovyöhyk-keen liikkuvuus on muuttunut, mikä viittaa siihen, että on tapahtunut Tnl0:n epätäsmällisen poistumisen aiheuttama deleetio.

Kannan, jossa esiintyy epätäsmällinen TnlO-delee-10 tio, ulommista kalvoista tehdyn preparaatin SDS-geeli-elektroforeesi osoittaa, että vyöhykkeen, jonka otaksutaan olevan fhuA-proteiini, elektroforeettinen liikkuvuus on muuttunut verrattuna villin tyypin fhuA-proteiiniin. Tuloksena oleva proteiini ei toimi Xphi80-faagireseptori-15 proteiinina. Toisella, edellisestä riippumattomalla kannalla, jolle myös on tapahtunut Tnl0:n epätäsmällinen poistuminen, ei näy ollenkaan fhuA-proteiinia SDS-geelil-lä.

Kummassakaan näistä kannoista ei esiinny taantu-20 mistä tetrasykliiniresistenssiin tai Aphi80-herkkyyteen, mikä viittaa siihen, että on tapahtunut TnlO-transposonin tai sen osan epätäsmällinen poistuminen yhdessä fhuA-gee-nin joko osittaisen tai täydellisen deleetion kanssa. Erästä tällaisista W3110-kannoista (NL106) käytetään j t 25 edullisesti isäntänä TNF:ää koodaaville vektoreille, joi-ta kuvataan toisaalla tässä hakemuksessa.

• · .·, NL106 transformoitiin ptrpXAPTNF:llä ja tuotteella ’y.'. inokuloitiin 10 litraa alustaa (pH 7,4), jolla oli seu- * raava koostumus: 1 · · • · · • · · • · · * · · 55 9821/

Aineosa g/1 (NH4)2S04 5,0 K2HP04 6,0

NaH2P04 3,0 5 Na-sitraatti 1,0 L-tryptofaani 0,2 NZ Amine AS 4,0

Hiivauute 4,0

MgS04 1,2 10 Glukoosi 25,0

Hivenaineliuos (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B ja

Mn-ioneja) 0,5 ml

Tetrasykliini 1,0 mg

Viljelmään alettiin syöttää glukoosia nopeudella 15 1 g/min, kun viljelmän A^Q-arvo oli noussut noin 20:een.

Fermentointia jatkettiin 30°C:ssa, kunnes A^q = 136 (noin 20 tuntia). Viljelmä sentrifugoidaan, jolloin muodostuu so- lutahna, ja tahnaa uutetaan sitten 30 minuuttia pH-arvossa 8,0 ja huoneen lämpötilassa 50 mM tris-puskurilla, joka 20 sisältää 10 mmol/1 EDTA, 1 000 mmol/1 NaCl, 2 000 mmol/1 ureaa ja 0,1 % beta-merkaptoetanolia. Uute laimennettiin ja tutkittiin esimerkin 1 mukaisesti. Tämän tutkimuksen mukaan 8 1 mg tuumorinekroositekijää sisälsi 1 x 10 yksikköä tuu-'' morinekroositekijäaktiivisuutta. Saatiin jopa noin 2 g tuu- I 25 morinekroositekijää litraa kohden viljelmää. Aminoterminaa- • '· linen sekventointi osoitti, että noin 75-86 paino-% tästä • · • oli valyyliaminoterminaalista (valmista) tuumorinekroosi- ·;· tekijää, lopun ollessa met-TNF:ää. Korkeiden ilmentymista- sojen lisäksi proteiini ei myöskään esiintynyt refraktii-30 lisissä elementeissä eikä näyttänyt muutenkaan olevan myr- . .·. kyllistä soluille, mitä osoittavat saavutetut äärimmäisen • · · Γ” suuret solutiheydet.

♦ · · * 98217 56

Esimerkki 20

Tuumorinekroositekijämutanttigeenin muodostaminen ja ilmentyminen Tässä esimerkissä toimittiin muuten esimerkkien 17 5 ja 18 mukaisesti, mutta syntetisoitiin oligonukleotidi-fragmentti B, jossa oli histidiinikodoni CAT arginiini 6 -kodonin CGT tilalla. Tällöin ilmentyi mutanttituumori-nekroositekij ä.

Esimerkki 21 10 Toisen tuumorinekroositekijämutanttigeenin muodos taminen ja ilmentyminen Tässä esimerkissä toimittiin muuten esimerkkien 17 ja 18 mukaisesti, mutta käytettiin oligonukleotidifrag-menttia B, joka koodasi leusiinia (CTT) arginiini 2:n 15 sijasta. Alustavissa yrityksissä saatiin noin 1 200 mg valmista TNF:ää viljelmälitraa kohden. Käsittelemätöntä TNF:ää ei ollut havaittavissa viljelmässä.

Esimerkki 22

Vektorin, joka koodaa tuumorinekroositekijän ja 20 erityssignaalisekvenssin fuusioproteiinia, muodostaminen E. colin lämpöstabiilia enterotoksiinia vastaavan geenin STII sekvenssiä kuvaavat Picken et ai. [Infection and Immunity 42(1) (1983) 269-275]. Tässä esimerkissä li-gatoitiin fragmentti, joka sisältää STII-erityssignaalin 25 ja Shine-Dalgarno-sekvenssin, E. colin alkalisen fosfa- taasin promoottorin alapuolelle (jälkeen). STII-signaalia • · seuraa 3'-suunnassa synteettinen oligonukleotidi, joka .··*. sisältää tuumorinekroositekij än seitsemää ensimmäistä • « t aminohappoa vastaavat kodonit ja loppuosa tuumorinekroo-30 sitekijää koodaavasta jaksosta. Kaikki edellä mainitut • · · *;j;’ sekvenssit sijoitettiin pBR322-vektoriin.

*.* * pWM501 [Picken et ai.. Infection and Immunity 41(1) : (1983) 269-275] sisältää STII-geenin. pWM501 pilkottiin

Xbal:llä ja Nsilrllä, ja eristettiin noin 90 emäsparin 35 fragmentti. Tämä fragmentti voitaisiin myös syntetisoida kemiallisesti sinänsä tunnetuin menetelmin (fragmentti A).

98217 57

Esimerkissä 17 kuvattu pBR322-Trp-plasmidi (p29kLT) pilkottiin Sbal:llä ja HindIII:lla ja otettiin talteen suuri fragmentti (fragmentti B). Tämä fragmentti sisältää E. colin replikoitumisen aloituskohdan ja geenin, joka antaa 5 ampisilliiniresistenssifenotyypin.

Syntetisoitiin synteettinen oligonukleotidi kahtena erillisenä säikeenä, jotka emäspariutettiin seuraavaksi rakenteeksi (tarttuvat restriktiokohtapäät ja oligonukleoti-din koodaamat aminohapot ovat myös näkyvissä).

10 VAL ARG SER SER SER ARG THR 5' GTA CGT TCT TCT TCT CGT ACT 3' ACGT CAT ACG AGA AGA AGA GCA TGA GGCT Nsil Aval 15 Tästä fragmentista käytetään merkintää fragmentti C.

Esimerkin 18 mukainen pTNFtrp pilkottiin Aval:llä ja HindIII:lla. 578 emäsparin Aval-Hindlll-fragmentti (fragmentti D) otettiin talteen. Se sisältää koko TNF:ää, 20 seitsemää ensimmäistä aminohappoa lukuun ottamatta, koodaa-van sekvenssin.

DNA-sekvenssi, joka sisältää E. colin alkalisen fosfataasin (AP) promoottorin kytkettynä heterologiseen ShineDalgano (S.D.) -sekvenssiin (trp) ja jossa on EcoRI-25 ja Xba-pää, muodostettiin seuraavasti: DNA-fragmentti, joka sisältää osan AP-promoottorista, eristettiin plasmidista pHI-1 [H. Inouye et ai., J. Bacteriol. 146 (1981) 668-675], ^1" vaikka mitä tahansa soveltuvia A-promoottori-DNA:n sisältä viä lähteitä voitaisiin käyttää. pHI-1 pilkottiin Hpal:llä 30 plasmidin avaamiseksi, plasmidiin ligatoitiin synteettinen

*·:·* GAATTCGAATTC

• · · *.* * EcoRI-kytkijä CTTAAGCTTAAG, ja kytkijällä varustettua plas- midia pilkottiin ylimäärällä EcoRI kaikkien EcoRI-kohtien katkaisemiseksi ja alimäärällä Rsal kaikkien Rsal-kohtien 35 katkaisemiseksi vain osittain (EcoRI- ja Rsal-käsittelyt voitaisiin tehdä myös peräkkäin samanaikaisen käsittelyn 90 Γ» Ί Π ΰζι/ sijasta). EcoRI-Rsal-pilkkomistuotteesta otettiin talteen 420 emäsparin fragmentti, joka sisälsi AP-promoottorin.

trp S.D. -sekvenssi saatiin seuraavasti. Plasmidi tai organismi, joka sisältää trp-promoottorin /PIFN-beta 2, 5 D. Leung et ai., Biotechnology 2 (1984) 458-464J, pilkottiin Xbalrllä ja Rsal:llä, ja otettiin talteen 30 emäsparin fragmentti, joka sisältää trp S.D. -sekvenssin. Tämä fragmentti ligatoitiin 420 emäsparin AP-promoottorifrag-menttiin, jolloin saatiin 450 emäsparin EcoRI-Xbal-frag-10 mentti E. Fragmentti E:n nukleotidisekvenssi on

EcoRI

GAATTCAACTTCTCCATACTTTGGATAAGGAAATACAGACATGAAAAATCTCATTGCTGAGTTGTTATTT AAGCTTGCCCAAAAAGAAGAAGAGTCGAAAGAACTGTGTGCGCAGGTAGAAGCTTTGGAGATTATCGTCA 15 CTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTA CGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTA TTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTT

trpS.D. Xbal

ATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCTAGA

20 Fragmentit A, B, C ja D ligatoitiin keskenään ja li- gaatioseoksella transformoitiin E. coli 294. Transformantit identifioitiin kasvattamalla ampisilliiniä sisältävillä LB-maljoilla. Plasmidi trpSTIITNF eräästä transformantti-·,,, pesäkkeestä. Tämä plasmidi pilkottiin Xbal:llä ja EcoRI:llä : ' 25 trp-promoottorin poistamiseksi ja ligatoitiin sitten 450 i . emäsparin EcoRI-Xbal-fragmenttiin E, joka sisältää E. colin :*·*; alkalisen fosfataasin promoottorin. Tuloksena olevalle plas- midille annetaan nimeksi pAPSTIITNF.

Esimerkki 23 30 Tuumorinekroositekijän ja erityssignaalisekvenssin . fuusioproteiinin ilmentyminen ja prosessointi • · · ;;** E. coli NL106 transfektoitiin pAPSTIITNF:llä ja • · ♦ ’·' tuotteella inokuloitiin 10 litraa alustaa (pH 7,0), jonka koostumus oli:

T· aa:L KIU i U

- 98217 59

Aineosa g/1 (NH4)2S04 5,0 K2HP04 2,6

NaH2P04 1,3 5 Na-sitraatti 1,0 KC1 1,5 NZ Amine AS 5,0

Hiivauute 2,0

MgS04 1,2 10 Glukoosi 25,0

Hivenaineliuos (Fe, Zn, Co, Mo, Cu, B ja Mn-ioneja) 0,5 ml

Ampisilliini 20.0 mg 15 Viljely tehtiin samalla tavalla kuin esimerkissä 19, mut ta tällä kertaa saavutettiin A^gg-arvo 140. Tässä vaiheessa viljelmä sisälsi noin 400 mg/1 tuumorinekroositeki jää, joista noin 70-80 % oli elektroforeesigeelin perusteella arvioituna prosessoitunut asianmukaisesti val-20 miiksi proteiiniksi. Suunnilleen saman verran tuumorinek-roositekijäaktiivisuutta saatiin talteen esimerkin 19 mukaisella kokonaisten solujen uutolla ja solujen osmoottisella shokilla.

Esimerkki 24 25 Tuumorinekroositekijän ilmentyminen hiivassa ADH- promoottorin ohjauksessa • ·

Plasmidi TrpXAPTNF muodostetaan muuten esimerkissä ·«*· .·; . 17 kuvatulla tavalla, mutta p20KLT tai ptrpETA (tai I f « pBR322) pilkotaan EcoRIrllä ja Hindllltlla Xbal:n ja 30 HindIII:n sijasta ja valmistetaan synteettinen fragmentti • · 4 B, jossa on tarttuva EcoRI-pää tarttuvan Xbal-pään sijas- • · · ’·* * ta. Ligaatioseoksella transformoidaan sitten E. coli

ATCC31 446 ja identifioidaan restriktioanalyysillä plasmidi pTNFRI, joka sisältää EcoRI-kohtien rajoittaman tuu-35 morinekroositekijää koodaavan DNA:n. Plasmidi pTNFRI

eristetään, pilkotaan EcoRIrllä ja otetaan talteen tuumo-rinekroositekijä-DNArn sisältävä fragmentti T-l.

60 Π Ο Ο Ί - 9gz1/

Plasmidi pFRPn (EP-hakemusjulkaisu 60 057A) pilkotaan EcoRI:lla, käsitellään alkalisella fosfataasilla re-sirkularisoitumisen estämiseksi, ligatoidaan tuumorinek-roositekijäfragmenttiin T-l käyttämällä T4-DNA-ligaasia 5 ja ligaatioseoksella transformoidaan sitten E. coli ATCC 31 446. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet tuottavat kahta plasmidiryhmää, joissa T-l-insertti on päinvastaisissa orientaatioissa agaroosielektroforeesigeeleillä tehdyllä restriktioanalyysillä määritettynä. E. coli -transforman-10 teista saatavat plasmidit puhdistetaan ja niillä transformoidaan hiiva, jossa on trpl-mutaatio (esimerkiksi hiivakanta RH218, rajoittamaton ATCC-talletusnro 44 076), joka antaa trp+-fenotyypin. Plasmidien, joissa orientaatio on sellainen, että segmentin T-l aloituskodoni on 15 alkoholidegydrogenaasipromoottorifragmentin vieressä, havaitaan transformoiva hiiva siten, että siinä ilmentyy tuumorinekroositekijä. Tuumorinekroositekijä otetaan talteen hiivatransformanttiuutteista. Plasmidin stabiilisuus laajamittaisissa fermentoinneissa paranee, kun käytetään 20 ilmentymisplasmidia, joka sisältää kahden mikronin repli koi tumisen aloituskohdan pRFPn:n kromosomaalisen replikoi tumisen aloituskohdan (ars 1) sijasta ja sen kanssa yhteensopivaa isäntäkantaa [J. Beggs Nature 275 (1978) 104-109].

25 Esimerkki 25 : *: Tuumorinekroositekijän ilmentyminen nisäkässoluis- ··· sa *♦ · · . Plasmidi pEHER (EP-hakemusjulkaisu 117 060A) pii- kotaan EcoRI:lla, käsitellään vasikan suoliston alkali- 30 sella fosfataasilla, ligatoidaan esimerkin 24 mukaiseen • · *

fragmenttiin T-l ja transformoidaan ligaatioseoksella E. *\ * coli ATCC 31 446. Eristetään kaksi plasmidia (pEHERTNF I

ja pEHERTNF II), jotka sisältävät TNF-DNA:n päinvastaisessa orientaatiossa polyakryyliamidigeeleillä tehdyllä 35 restriktioanalyysillä määritettynä. Näillä plasmideilla transformoidaan ja valikoidaan CHO DHFR-DUX-B11, CHO 1 ja Ltk"-solut.

98217 61

Kudosviljelmäsolut transfektoldaan sekoittamalla 1 pg pEFERTNF I tai pEHERTNF II 10 pg:aan rotan kantaja DNA:ta 250 pl:ssa 0,25 M CaC^, minkä jälkeen lisätään pisaroittain 250 μΐ HEPES-puskuroitua fysiologista suola-5 liuosta (280 mmol/1 CaC^, 1,5 mmol/1 50 mmol/1 HEPES:iä, pH 7,1). Annetaan seistä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lisätään liuos kudosviljelmäsoluille, jotka ovat 60 mm:n muovisissa kudosviljelymaljoissa. Käytetään CHO 1, CH0 DHFR-DUX-Bl1 ja Ltk’-soluja. Maljat 10 sisältävät 3 ml isäntäsoluille soveltuvaa kasvualustaa.

CHO 1 ja CHO DHFR-DUX-Bl1 -soluille kasvualusta on Ham F-12 -alusta (Gibco), johon on lisätty 10 % vasikan-seerumia, 100 pg/ml penisilliiniä, 100 pg/ml streptomysiiniä ja 2 pmM L-glutamiinia. Ltk+-solulinjan alusta on 15 Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta (DMEM), joka on täydennetty edellä kuvatulla tavalla.

Alusta poistetaan 3-16 tunnin kuluttua ja solut pestään liuoksella, joka sisältää 20 % glyserolia fos-faattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. Ku-20 hunkin maljaan lisätään tuoretta alustaa ja soluja inku-boidaan vielä kaksi vuorokautta.

Transfektoitujen isäntäsolujen valikointi tehdään trypsinisoimalla solut kahden vuorokauden kasvatuksen jälkeen (solut käsitellään steriilillä trypsiiniliuoksel- • 25 la (0,5 mg/ml), joka sisältää 0,2 mg/ml EDTA) ja lisää- • · 5 j *: mällä noin 3 x 10 solua 10 mm:n kudosviljelymaljoille, ··* joissa on selektiivistä alustaa, dhfr -soluja varten ···· alusta on F-12-alusta (Gibco), josta puuttuu glysiini, hypoksantiini ja tymidiini (GHT~-alusta). DHFR+-isän-. 30 täsoluille lisätään metotreksaattia (100 - 1 000 mol/1)

t I I

normaaliin kasvualustaan. Vertailunäytteinä toimivat so- • · · • « · *. lut, jotka transfektoidaan ilman plasmidia ja plasmidilla pFD-11 (EP-hakemusjulkaisu 117 060A), joka sisältää normaalin DHFR:n. Solujen, jotka ottavat vastaan ja ilmentä-35 vät DHRF-plasmidia, pesäkkeet tulevat näkyviin 1-2 viikon kuluessa. Identifioidaan ne transformantit, jotka ilmentävät tuumorinekroositekijää.

Claims (4)

98217

1. Menetelmä ihmisen oleellisesti homogeenisen tuumorinekroositekijän valmistamiseksi, jolla on amino-5 happosekvenssi: Vai Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala 10 His Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp 20 10 Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu 30 40 Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr 50 Leu Ile Tyr Ser Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro 60 70 15 Ser Thr His Vai Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 80 Vai Ser Tyr Gin Thr Lys Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys 90 Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 110 20 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Vai Phe Gin Leu 120 Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp 130 140 Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai Tyr Phe Gly Ile 150 25 Ile Ala Leu :***: 157 • · •« t • · * · .*i\ tunnettu siitä, että * · ' (a) adsorboidaan tuumorinekroositekijä seoksesta . .· 30 muiden proteiinien kanssa kontrolloidulle huokoslasille, * I » ^ minkä jälkeen tuumorinekroositekijä eluoidaan kontrolloi- \ ’ dulta huokoslasilta, (b) adsorboidaan vaiheen (a) tuote anioninvaihto- hartsihiukkasille, joilla on suurin piirtein yhtenäinen ·' 35 hiukkaskoko, minkä jälkeen eluoidaan tuumorinekroositeki- ' ; jä ja haluttaessa suoritetaan dialyysi, ja sitten » , 98217 (c) adsorboidaan vaiheen (b) tuote alkyylisefaroo-siadsorbentille, minkä jälkeen tuumorinekroositekijä eluoidaan alkyylisefaroosilta, ja haluttaessa, (d) puhdistetaan vaiheen (c) tuote SDS-polyakryy-5 liamidigeelielektroforeesilla tai käänteisfaasikorkeapai- nekromatografiällä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuumorinekroositekijä eluoidaan etyleeniglykolilla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anioninvaihtohartsi on kvaternaarisesti aminosubstituoitu ristisidottu polysty-reeni. • · • · · • 1 • · • I t ·· ·· • « « • · · • · · • · · • · · • · · · · * « » • · · 98217