NO863249L - Flersone analytisk element inneholdende konsentrasjonssone for merket reagens. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører flersone analytiske elementer som er nyttige for bestemmelse av en analytt i et flytende forsøksmedium. Spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse flerlags forsøksinnretninger for immunoanalyse innbefattende anvendelsen av merkede reagenser inneholdende en kjemisk gruppe som har en detekterbar fysikalsk egenskap såsom fluorescens eller farge.

Flersone analytiske elementer eller forsøksinnretninger har tidligere vært foreslått og har vært anvendt ved bindingsanalyser, f.eks. immunoanalyser, som bygger på et antistoff eller antigens evne til å bindes til en spesifikk analytt for bestemmelse av analytten i det flytende forsøks - mediet. Slike analyser innbefatter de immunoanalysene hvor en merket reagens, såsom en merket form av analytten eller et antistoff for denne, deltar i en antigen-antistoff-reaksjon slik at det dannes et fritt spesies og et bundet spesies derav slik at mengden av den merkede reagensen i et av disse spesiene kan korreleres med mengden analytt i det flytende forsøksmediet. Slike analyser betegnes prinsipielt heterogene immuno-analyser fordi det frie og bundne spesies må separeres for å fullføre analysen.

Flersone, spesielt flerlags, analytiske elementer er nå kjente innen teknikken, disse utfører det påkrevde separasjonstrinnet slik at ingen ytterligere manipuleringer er påkrevet etter påføring av det flytende forsøksmediet. Generelt innbefatter slike innretninger et stort antall lag som inneholder de nødvendige reagensene for å utføre en immunoanalyse og for å bevirke det nødvendige separasjonstrinnet som er innbefattet deri. Et antall slike innretninger innbefatter videre et deteksjonslag hvorfra signalet produsert ved hjelp av en merket reagens i enten det bundne eller frie spesies detekteres og måles. Detekterbare signaler tilveiebrakt ved hjelp av slike innretninger er vanligvis av optisk natur såsom fargeendringer, fluorescens eller liknende. Alternativt kan deteksjon oppnås ved elektrokjemiske målinger ved å anvende f.eks. potensiometriske eller amperometriske teknikker.

F.eks. er slike flerlags analytiske elementer for immunoanalyse beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 97.952 og tysk publikasjon nr. DE-OS 3329728 hvor en immobilisert form av en bindingspartner, såsom et immobilisert antistoff til et antigen, og et antigen merket med et detekterbart stoff er innbefattet. Ved påføring av et flytende forsøks-medium på en slik innretning vil antigenet fra forsøksmediet konkurrere med merket antigen innbefattet i innretningen om binding til det immobiliserte antistoffet. Separasjon av det bundne spesies fra det frie spesies finner sted ved migrering av det frie spesies av det merkede antigenet bort fra den immobiliserte sonen.

Tilsvarende beskriver europeisk patentpublikasjon nr. 51.183 og 66.648 slike innretninger hvor bestemmelsen av antigenet eller antistoffet i et flytende forsøksmedium er avhengig av den konkurrerende bindingen av antigenet (eller antistoffet) med en merket form av antigenet (eller antistoffet) til en immobilisert form av en bindingspartner dertil, såsom immobilisert antistoff (eller antigen).

Andre flerlags forsøksinnretninger for immunoanalyser har også vært foreslått, såsom beskrevet i US patent nr. 4.258.001, denne innretningen innbefatter et eller flere lag inneholdende partikkelformige, tredimen-sjonale gittere dannet av et stort antall organopolymerpartikler. Partiklene danner sammenhengende hulrom som angis å muliggjøre transport av analytter med høy molekylvekt derigjennom. Selv om det ikke er påkrevet er det foreslått at gjensidig aktive forbindelser, såsom antigener eller antistoffer, kan immobiliseres på partiklene ved at det tilveiebringes aktive forbindelses- eller bindingsseter på partiklene hvortil slike vekselvirkende sammensetninger kan bindes kovalent.

En annen slik innretning er beskrevet i US patent nr. 4.446.232 som er basert på prinsippet med konkurranse mellom bundne og frie spesies av analytt om et fastsatt antall gjenkjenningsseter på et enzym-merket antistoff. Bestemmelsen av analytt i en prøve avhenger av bindingen av analytten til enzym-merkede antistoffer i en sone av innretningen og som deretter passerer inn i en annen sone av innretningen hvor enzym-aktiviteten av de enzym-tilknyttede antistoffene bundet til analytt detekteres. En av sonene innbefatter videre bundet og immobilisert analytt som konkurrerer med analytt fra prøven om binding til de enzym-merkede antistoffene og som binder og immobiliserer de av de enzym-merkede antistoffene som ikke blir bundet til analytt fra prøven.

En spesiell ulempe ved slike innretninger er imidlertid at revers fluidmigrering finner sted i reaksjonsproduktene, dvs. at fluid som har migrert inn i det lavere eller deteksjonslaget migrerer tilbake opp i de øvre lagene, hvilket resulterer i kjemisk interferens og nedsatt forsøks-respons. For å overvinne denne ulempen er det foreslått analytiske forsøksinnretninger hvor man forsøker å lokalisere eller på annen måte forhindre slik revers fluidmigrering av reaksjonsproduktene.

F.eks. foreslår europeisk patentpublikasjon nr. 51.183 og 66.648 lag for samling av det detekterbare reaksjonsproduktet innbefattende hydrofile stoffer av høy molelkylvekt. EP 66.648 foreslår videre innbefatningen av beisemidler i deteksjonslaget, disse har en sterk vekselvirkning med det detekterbare reaksjonsproduktet slik at det detekterbare reaksjonsproduktet samles deri. Slike beisemidler innbefatter kationiske polymerer, anioniske polymerer og kvaternære salter.

Tilsvarende beskriver US patent nr. 4.144.306 og 4.042.335 flerlags analytiske elementer som innbefatter et registreringslag inneholder et beisemiddel for et detekterbart spesies slik at det detekterbare spesies samles deri, og derved forhindres diffusjon eller migrering av det detekterbare spesies ut av registreringslaget.

En variasjon av slike innretninger er beskrevet i US patent nr. 4.459.358 som beskriver et flerlags element innbefattende et spredende lag, et reaksjonslag inkorporert med et diffunderbart merket antistoff, og et registreringslag inkorporert med materialer tilpasset for å ikke-spesifikt binde, immobilisere eller "beise" antistoffer, såsom latekspartikler. Ved påføring av et flytende forsøksmedium på innretningen, vil analytt fra forsøksmediet forbinde seg med det merkede antistoffet i reaksjonslaget og immunoutfelles deri. Eventuelle deler av det merkede antistoffet som ikke blir bundet til analytten dif funderer inn i registreringslaget hvor det immobiliseres ved hjelp av beisemidlet innbefattet deri.

Imidlertid kan anvendelsen av beisemidler interferere med de forutsatte reaksjonene som er påkrevet for dannelsen eller frigivelsen av det detekterbare reaksjonsproduktet som et resultat av ikke-spesifikk binding av beisemidlet. Slik interferens kan gjøre både deteksjon og måling upålitelig, så vel som nedsette følsomheten av forsøksinnretningen.

I forsøk på å overvinne ulempene med beisemidler i et registreringslag har det vært foreslått andre analytiske elementer hvor det anvendes beisemidler i et annet lag enn et registreringslag for å forhindre migreringen av et dannet detekterbart reaksjonsprodukt inn i et annet lag enn et registrerings- eller deteksjonslag som ellers ville gjøre det detekterbare reaksjonsproduktet udetekterbart. En slik innretning er beskrevet i US patent nr. 4.166.093 som innbefatter et spesies migrerings-inhiberende lag plassert mellom et strålingsblokkerende lag og et reagenslag i et flerlags analytisk element. Det detekterbare spesies migrerings-inhiberende laget er gjennomtrengelig for analytt og fikserer eller forhindrer på annen måte en betydelig del av eventuelle detekterbare spesies, såsom et fargestoff dannet i reagenslaget, fra videre migrering opp i det strålingsblokkerende laget. Slike detekterbare spesies migrerings-inhiberende lag innbefatter et beisemiddel for det spesielle detekterbare spesies som dannes i reagenslaget. Imidlertid har slike inhiberende lag fremdeles ulempen med et beisemiddel som kan interferere med reaksjoner som initieres ved nærværet av analytt og forhindre eller i det vesentlige inhibere dannelsen eller frigivelsen av det detekterbare spesies.

Nok et forsøk å overvinne problemet med revers fluidmigrering i flerlags analytiske elementer er beskrevet i den internasjonale publikasjon nr. WO 84/02193 som tilveiebringer en immunoanalyse med kromogen bærer som innbefatter samling av et immunkompleks innbefattende analytt bundet til et enzym-merket anti-analytt-antistoff på et porøst eller mikroporøst bærermateriale. Bæreren fungerer slik at den konsentrerer det kromatiske signalet som er generert av merkekomponenten ved reaksjon med signalgenererende reagenser i bærermaterialet. Konsentrasjon av det kromatiske signalet oppstår ved kovalent tilknytning av reaksjonsproduktet til bæreren, og problemet med revers fluidmigrering er overvunnet ved at det tilveiebringes et enkelt lag. Immuno-analysen krever imidlertid et antall inkuberings- og vasketrinn for å lokalisere og konsentrere signalet på bæreren. Selv om immuno-analysen overvinner problemet med revers fluidmigrering ved at det tilveiebringes et enkelt bærerlag hvori de påkrevde reaksjonene for produksjon av det kromatiske signalet finner sted, innbefatter den fremdeles ulempene med omfattende inkuberings- og vasketrinn som ikke er påkrevet med et flerlags analytisk element.

Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å overvinne de nevnte ulempene ved tilveiebringelse av en spesifikk bindingsanalyse i en flersone, eller flerlags, forsøksinnretning, som konsentrerer den detekterbare responsen av en merket reagens uten å påvirke de spesifikke bindingsreaksjoner innbefattet i analysen.

Et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe, i en flersone, eller flerlags, forsøksinnretning, en spesifikk bindingsanalyse som har et endepunkt i analysen hvor ytterligere migrering av det detekterbare spesies ikke finner sted.

Videre er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en følsom spesifikk bindingsanalyse for meget nøyaktig bestemmelse av analytt fra et flytende forsøksmedium og som har i det vesentlige lavt eller ikke noe bakgrunnssignal.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en flersone forsøksinnretning for bestemmelse av analytt fra et flytende forsøksmedium basert på bindings-vekselvirkninger mellom analytten, den merkede reagensen, og et immobilisert bindende stoff for den merkede reagensen. Forsøksinnret-ningen innbefatter, i væskestrømskontakt, (1) en reagenssone inkorporert med den immobiliserte reagensen som vil være en immobilisert form av analytten eller en bindingsanalog derav, eller en immobilisert form av en bindende partner for analytten, avhengig av immunoanalysefremgangs-måten som benyttes, og (2) en deteksjonssone inkorporert med en immobilisert form av et bindende stoff for den merkede reagensen. Den merkede reagensen er en form av en bindingspartner for analytten, eller en form av analytten eller en bindingsanalog derav, som er merket med en kjemisk gruppe som har en detekterbar fysikalsk egenskap og som videre innbefatter et bindingssete for det immobiliserte bindende stoffet i deteksjonssonen.

Hovedfordelene ved foreliggende oppfinnelse ligger i anvendelsen av en merket reagens som har sin egen detekterbare egenskap og som kan gjøres immobil i deteksjonssonen ved en naturlig eller introdusert bindingsaffinitet. Ingen separat migrerbare detekterbare spesies genereres som ved tidligere kjente innretninger, og immobilisering og konsentrasjon av responsen oppstår ved meget spesifikke og sterke bindingsveksel-virkninger.

Den immobiliserte reagensen i reagenssonen og den merkede reagensen velges slik at de utgjør spesifikke bindingspartnere som vil bindes til hverandre avhengig av mengden analytt tilstede. Når den merkede reagensen er en merket form av analytten eller en analog derav, vil den immobiliserte reagensen være en immobilisert form av en bindende partner for analytten, og analytten og merket reagens vil konkurrere om binding til den immobiliserte reagensen. Når den merkede reagensen er en merket form av en bindende partner for analytten, vil den immobiliserte reagensen være en immobilisert form av analytten eller en analog derav, og den merkede reagensen som ikke blir bundet til analytten vil bli immobilisert ved binding til den immobiliserte reagensen. Enten merket analytt eller merkede bindingspartnere er innbefattet, vil en del av den merkede reagensen forbli eller bli ubundet til den immobiliserte reagensen avhengig av mengden analytt tilstede.

Den resulterende merkede reagensen som forblir eller blir fri til å migrere inn i eller ut av reagenssonen passerer deretter inn i deteksjonssonen hvor bindingssetet for den merkede reagensen, binder det immobiliserte bindende stoffet i deteksjonssonen. Den resulterende immobiliserte merkede reagensen forhindres fra migrering fra deteksjonssonen opp i reagenssonen, og den detekterbare kjemiske gruppen på den merkede reagensen tilveiebringer et detekterbart fysikalsk signal i deteksjonssonen som måles og korreleres med mengden analytt i forsøks-mediet. Fig. 1 er et tverrsnitt av en flerlags forsøksinnretning som inneholder et reagenslag og et deteksjonslag konstruert ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 er et tverrsnitt av en flerlags forsøksinnretning som inneholder to reagenslag og et deteksjonslag konstruert ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 er et tverrsnitt av en flerlags forsøksinnretning som inneholder to reagenslag, et deteksjonslag, og en bærer konstruert ifølge foreliggende oppfinnelse.

Flersone forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en spesifikk bindingsanalyse i en sone inndelt eller lagdelt forsøks-strimmel eller en innretning. Analysen avhenger av fordelingen av en merket reagens, som enten påføres på innretningen eller inkorporeres i innretningen, mellom å være tilbakeholdt i reagenssonen ved binding eller immobilisering til den immobiliserte reagensen, og å være fri til å migrere inn i deteksjonssonen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig innretning for konsentrering av den merkede reagensen som migrerer til deteksjonssonen.

For i det følgende å begrense beskrivelsen, vil forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse nedenfor hovedsakelig bli beskrevet som innbefattende en lagdelt struktur. Det skal understrekes at andre typer soner kan gi det samme resultatet. Videre vil den merkede reagensen bli valgt slik at den er en merket form av en bindende partner for analytten og den immobiliserte reagensen vil bli valgt slik at den er immobilisert form av analytten (hvor immobilisert analytt kan erstattes av en immobilisert form av en analog av analytten, som kjent innen teknikken).

Spesielt innbefatter forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse minst et reagenslag og et deteksjonslag, og kan, som det vil bli beskrevet i større detalj nedenfor, videre innbefatte et andre reagenslag. Reagenslaget er inkorporert med den immobiliserte reagensen som innbefatter en immobilisert form av analytten som ikke er i stand til å oppløseliggjøres eller på annen måte fjernes fra reagenslaget ved kontakt med forsøksmediet. Deteksjonslaget er inkorporert med en immobilisert form av et bindende stoff for den merkede reagensen, dette bindende stoffet er på tilsvarende måte ikke i stand til å oppløseliggjøres eller på annen måte fjernes fra deteksjonslaget. Der hvor et andre reagenslag anvendes, er det første reagenslaget inkorporert med den merkede reagensen som oppløseliggjøres av forsøksmediet når dette påføres, og det andre reagenslaget er inkorporert med den immobiliserte formen av analytten.

Det skal understrekes at ifølge foreliggende oppfinnelse er lagene som utgjør forsøksinnretningen i fluidkontakt med hverandre hvorved lagene i forsøksinnretningen som er forbundet med hverandre tillater diffusjon av et fluid inn i og mellom disse lagene. Slik fluidkontakt tillater passasje av minst noen komponenter av en væskeprøve, f.eks. antigener, haptener og/eller antistoffer, mellom lagene i innretningen og passasjen er fortrinnsvis uniform langs kontaktgrenseflaten mellom lagene som står i fluidkontakt med hverandre. Ved påføring av det flytende forsøksmediet og merket reagens på reagenslaget tillates selvfølgelig det flytende forsøksmediet og den merkede reagensen å dif fundere og trenge inn i og gjennom reagenslaget og inn i deteksjonslaget. Der hvor et første og andre reagenslag er tilveiebrakt, tillates det flytende forsøksmediet tilsvarende å dif f undere og trenge inn i og gjennom det første reagenslaget hvorved den merkede reagensen inkorporert deri oppløseliggjøres, og det flytende forsøksmediet og den merkede reagensen dif funderer videre og trenger inn og beveger seg inne i det andre reagenslaget og inn og inne i deteksjonslaget.

Når det flytende forsøksmediet og den merkede reagensen er påført og har trengt inn i reagenslaget som beskrevet ovenfor, vil, dersom analytten som detekteres er tilstede i det flytende forsøksmediet, i det vesentlige all analytt som er tilstede bringes i direkte fluidkontakt med, og spesifikt bindes til den merkede reagensen. Som et resultat av fluiditeten mellom reagenslaget og deteksjonslaget vil det resulterende analytt-(merket reagens) komplekset som derved dannes være fritt til å migrere inne i og ut av reagenslaget og inn i deteksjonslaget. Som det skal beskrives ytterligere i detalj nedenfor tilveiebringer den merkede reagensen fortrinnsvis bare et tilgjengelig bindingssete for binding av analytten til den merkede reagensen. Som et resultat vil, når først et slikt tilgjengelig bindingssete er besatt av analytt, det analytt-(merkede reagens) komplekset være fritt til å migrere inne i og ut av reagenslaget uten å bli immobilisert av den immobiliserte analytten som er innbefattet deri. Tilsvarende vil, der hvor et første og andre reagenslag er tilveiebrakt, ved påføring av det flytende forsøksmediet på det første reagenslaget, den merkede reagensen oppløseliggjøres og i det vesentlige all analytt som er tilstede vil bringes i direkte fluidkontakt med, og spesifikt bindes til, den merkede reagensen. Det resulterende analytt-(merket reagens)komplekset som derved dannes tillates å migrere inne i og ut av det første reagenslaget, gjennom det andre reagenslaget, og inn i deteksjonslaget. Eventuelle deler av den merkede reagensen som ikke ble bundet til analytten fra forsøksmediet, bindes til, og immobiliseres av, den immobiliserte analytten i reagenslaget, eller immobiliseres i det andre reagenslaget der hvor et første og et andre reagenslag er tilveiebrakt.

Det skal understrekes at ifølge foreliggende oppfinnelse vil, når først analytt-(merket reagens) komplekset migrerer inn i deteksjonslaget, komplekset bli spesifikt bundet til, og immobilisert av, et bindende stoff for den merkede reagensen som er immobilisert i deteksjonslaget. Som det skal beskrives i større detalj nedenfor, innbefatter den merkede reagensen en kjemisk gruppe som har en detekterbar fysikalsk egenskap som kan detekteres, måles og korreleres til mengden analytt i det flytende forsøksmediet til binding til analytten fra det flytende forsøks-mediet og migrering inn i deteksjonslaget. Følgelig forhindrer immobilisering av analytt-(merket reagens)komplekset i deteksjonslaget migrering av komplekset ut av deteksjonslaget og inn i reaksjonslaget(lagene) og tillater nøyaktig og følsom detektering og måling av all den merkede reagensen som er bundet til analytten fra forsøksmediet i deteksjonslaget.

Ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter den merkede reagensen en kjemisk gruppe som har en detekterbar fysikalsk egenskap og et bindingssete for det bindende stoffet som er immobilisert i deteksjonslaget. Det skal understrekes at det immobiliserte bindende stoffet i deteksjonslaget ikke deltar i den innledende bindingsreaksjonen mellom analytten, merket reagens, og immobilisert reagens. Følgelig avhenger valget av et egnet bindende stoff for immobilisering i deteksjonslaget nødvendigvis at den selektive gjenkjennelsen av slikt bindingssete av det bindende stoffet. Fortrinnsvis innbefatter den merkede reagensen en ligand-enhet som danner et spesifikt bindende par med det bindende stoffet. Spesielt innbefatter foretrukne eksempler på bindende par for ligand-enheten og det bindende stoffet slike bindende par som haptener og antistoffer, eller fragmenter derav, til slike haptener; biotin og avidin; karbohydrater og lecitiner; og antistoff, eller fragment derav, som har et intakt bindingssete for protein A og protein A; og liknende. Ytterligere bindende par innbefatter komplementære enkeltkjedede oligonukleotidsekvenser; effektormolekyler og reseptorpar; prostetiske grupper og apoprotein; enzymkofaktorer og enzymer; polymere syrer og baser; fargestoffer og proteinbindere; peptider og spesifikke proteinbindere (f.eks. ribonuklease, S-peptid og ribonuklease S-protein); enzyminhibitorer (reversible og irreversible), enzymer og liknende.

Videre kan den merkede reagensen være selektivt immobilisert ved binding til et adsorpsjonsmiddelmateriale for den merkede reagensen, såsom et ionevekslingsmateriale, som virker som det bindende stoffet som er immobilisert i deteksjonslaget. Andre materialer kan også anvendes som det bindende stoffet ifølge foreliggende oppfinnelse, naturligvis forutsatt at det bindende setet på den merkede reagensen og det bindende stoffet har selektivitet for binding til hverandre og ikke er utsatt for vesentlig ikke-spesifikk binding til andre reagenser i analyse-systemet.

Den detekterbare kjemiske gruppen på den merkede reagensen vil være et stoff som har en detekterbar fysikalsk egenskap. Slike stoffer er velkjente innenfor feltet immuno-analyser, og generelt kan et tilnærmet hvilket som helst merke som anvendes i immuno-analyser anvendes ved den merkede reagensen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Spesielt er kjemiske grupper som har detekterbare fysikalske egenskaper de gruppene som detekteres på basis av sine egne fysikalske egenskaper og som ikke krever en kjemisk reaksjon med et annet kjemisk stoff eller annet stoff for å gi et detekterbart signal. Slike grupper innbefatter prinsipielt fluorescerende stoffer såsom umbelliferon, fluorescein, resorufin, forskjellige rhodaminer, dansylderivater, og aminonaftalin-sulfonsyrer (se Clin. Chem. (1979) 25:353), fosforescente molekyler såsom pyren, kromoforer såsom para- eller orto-nitrofenol, fenolnaftalein, naftol AS, paranitroanilid og tymolftalein, radioisotoper såsom ^H, ^ S, ^ 2pt<1>2<5>i og<14>C, spinnmerker innbefattende nitroksydrester såsom "DOXYL"-, "PROXYL"- og "TEMPO"-derivater; eller elektroaktive enheter såsom protoner, fluorid, oksygen, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

Når de aktuelle bindingsreaksjonene har funnet sted som beskrevet ovenfor, bindes den resulterende merkede reagensen som migrerer inn i deteksjonslaget til, og immobiliseres av, det egnede bindende stoffet for den merkede reagensen som er immobilisert deri. Følgelig resulterer immobiliseringen av komplekset i et lokalisert eller konsentrert signal som tilveiebringes av den kjemiske gruppen i den merkede reagensen i deteksjonslaget og hvorfra det detekterbare signalet som derved tilveiebringes detekteres og måles. Det bør understrekes at den naturlige fysikalske egenskap for, eller karakteristiske trekk ved, et slikt merke som har en detekterbar fysikalsk egenskap overflødiggjør behovet for inkorporering av den kjemiske reaktant eller et vekselvirkende stoff i deteksjonslaget siden signalet produseres og derved er detekterbart uten en kjemisk reaksjon eller vekselvirkning med et vekselvirkende stoff.

Det detekterbare signalet måles fortrinnsvis ved å føre forsøksinn-retningen gjennom en sone som er utstyrt med egnet apparatur for deteksjon av det endelige optiske signalet, f.eks. ved refleksjons-, transmisjons- eller fluorescensfotometri. En slik apparatur retter f.eks. en energikilde, såsom lys, på og/eller inn i elementet i forsøksinnret-ningen. Lyset reflekteres deretter fra elementet tilbake til deteksjonsinn-retningen der hvor en reflekterende bærer anvendes, eller passerer gjennom elementet til en detektor i tilfelle transmisjonsdeteksjon der hvor en strålings-transmitterende eller transparent bærer anvendes. Konvensjonelle teknikker vedrørende fluorescensspektrofotometri eller luminescensmålinger kan også anvendes dersom dette er ønsket. I fremgangsmåter hvor det benyttes et elektroaktivt spesies som et merke, kan deteksjonen utføres med amperometriske eller potensiometriske detek-sjonsinnretninger.

Med referanse til tegningene viser fig. 1 en utførelse av flerlags forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse som innbefatter minst et reagenslag og et deteksjonslag som befinner seg i fluidkontakt med hverandre. Reagenslaget er inkorporert med den immobiliserte formen av analytten (angitt som " |-An"), og deteksjonslaget er inkorporert med en immobilisert form av et bindende stoff på den kjemiske gruppen som utgjør merket i den merkede reagensen (angitt som "binder" som beskrevet ovenfor).

Ved påføring av både det flytende forsøksmediet inneholdende analytt og den merkede reagensen på reagenslaget, dif funderer forsøksmediet og den merkede reagensen inn i reagenslaget og bringes derved i fluidkontakt med den immobiliserte analytten i reagenslaget. I denne utførelsen kan den merkede reagensen og forsøksmediet påføres uavhengig av hverandre eller sammen som en blanding, det sistnevnte er foretrukket idet dette tilveiebringer lik konkurranse mellom den merkede reagensen og analytten fra forsøksmediet om binding til den immobiliserte analytten. Følgelig vil eventuelle mengder av analytten som er tilstede i det flytende forsøksmediet bli bundet til den bindende partneren for analytten av den merkede reagensen og det resulterende komplekset som derved dannes er fritt til å migrere inne i og ut av reagenslaget og inn i deteksjonslaget. Et eventuelt overskudd av merket reagens som ikke ble bundet til analytt fra forsøksmediet ble bundet til den immobiliserte analytten i reagenslaget via bindingspartneren for analytten av den merkede reagensen og forhindres fra å migrere inn i deteksjonslaget.

Alternativt kan, som kjent innen teknikken, den merkede reagensen på forhånd bindes til den immobiliserte reagensen i reagenslaget, fremfor å tilsette den merkede reagensen som en separat komponent, enten ved tilsats med det flytende forsøksmediet eller ved å være inkorporert i et separat reagenslag som beskrevet i større detalj nedenfor. Idet bindingen vil være reversibel, vil nærværet av analytt reversere noe av denne bindingen slik at det frigjøres en detekterbar mengde av den merkede reagensen.

Det skal understrekes at ifølge foreliggende oppfinnelse har bindingspartneren for analytten fortrinnsvis bare et spesifikt bindingssete for analytten. Fortrinnsvis er en slik bindingspartner et enverdig fragment av et antistoff fremstilt mot analytten som er renset eller avledet fra et monoklonalt antistoff.

Slike enverdige antistoff-fragmenter kan lett fremstilles ved nedbrytning av normalt helt IgG-antistoff med et proteolytisk enzym, såsom papain, slik at det dannes antistoff-fragmenter, som innen teknikken vanligvis betegnes som Fab-fragmenter. Alternativt kan slike enverdige antistoff-fragmenter også fremstilles ved nedbrytning av normalt helt IgG-antistoff med et proteolytisk enzym såsom pepsin, etterfulgt av kjemisk reduksjon slik at det dannes antistoff-fragmenter som innen teknikken vanligvis betegnes som Fab'-fragmenter.

Imidlertid kan andre bindingspartnere også benyttes, fortrinnsvis naturligvis bindingspartnere som bare har et spesifikt, tilgjengelig bindings-eller gjenkjenningssete for analytten som skal bestemmes. Slike andre bindingspartnere innbefatter hele antistoff hybrider, reseptormolekyler og liknende. F.eks. kan det anvendes et helt antistoff hybrid som kan oppnås ved en rekke fremgangsmåter. Slike hybrider kan fremstilles in vivo fra en monoklonal cellelinje produsert ved hybridisering mellom en utskil-lende myelomacelle og en miltcelle som utskiller antistoffet av interesse. Den resulterende cellelinjen kan spontant produsere hybridmolekyler bestående av en bindende underenhet med spesifisiteten av interessse og en andre underenhet med en spesifisitet som er definert av myeloma-cellelinjen. Slikt antistoff kan isoleres fra homogene dimerer av det opprinnelige myeloma-antistoffet eller miltcellen ved konvensjonelle teknikker for proteinrensing som er kjent innen teknikken. Hybrider kan også dannes kjemisk ved sammenblanding av anti-analytt-antistoff med et andre antistoff under egnede denatureringsbetingelser, f.eks. ved tilsats av urea (8 molar) og reduksjonsmidler såsom ditiotreitol, etterfulgt av fjernelse av denatureringsmidlet for å tillate gjenoppbygning av antistoff-hybridene. Følgelig vil en del av den rekonstituerte prøven inneholde hybrider med et bindingssete for det andre bærer-antistoffet som kan renses ytterligere ved konvensjonelle teknikker for proteinrensing som er kjent innen teknikken.

Når følgelig analytten fra forsøksmediet er bundet til den enverdige bindingspartneren derav av den merkede reagensen, f.eks. det enverdige fragmentet av antistoffet til analytten, forhindres ikke-spesifikk immobilisering av det resulterende komplekset ved den immobiliserte analytten i reagenslaget som et resultat av den manglende tilgjengeligheten av et bindingssete på den merkede reagensen for den immobiliserte analytten. Ved migrering av analytt-(merket reagens)komplekset inn i deteksjonslaget blir den merkede reagensen bundet til, og immobilisert av, det immobiliserte bindende stoffet for denne. Den bindende vekselvirkningen av analytt-(merket reagens)komplekset med det immobiliserte bindende stoffet konsentrerer eller lokaliserer signalet som tilveiebringes av merket i den merkede reagensen i deteksjonslaget for deteksjon og måling derav enten visuelt eller ved hjelp av et egnet instrument.

Som det skal beskrives i større detalj nedenfor er, bortsett fra reflekterende lag og strålings-blokkerende midler, de forskjellige sonene eller lagene og bærerne ifølge foreliggende oppfinnelse strålings-transmitterende i de fleste tilfeller. Slike soner eller lag og bærere tillater effektiv passasje av synlig lys, fluorescent- eller luminescent emisjon, radioaktiv stråling og liknende. Valget av et spesielt strålings-transmitterende materiale vil avhenge av den spesielle strålingen som velges for anvendelse med et element hvori materialet skal inkorporeres. Følgelig tillater forsøksinnretningen som beskrevet ovenfor deteksjon av signalet som produseres ved enten den immobiliserte merkede reagensen i reagenslaget eller det immobiliserte analytt-(merket reagens)komplekset i deteksjonslaget. Følgelig kan signalet som derved produseres, f.eks. fluorescens eller farge, detekteres, måles og korreleres med mengden analytt tilstede i det flytende forsøksmediet. Imidlertid vil nærværet av den merkede reagensen i både reagenslaget og deteksjonslaget resultere i deteksjon av signalene som produseres fra begge lag, uavhengig av fra hvilken retning signalene detekteres, dvs. detekteres med et egnet instrument rettet mot reagenslaget eller deteksjonslaget, disse signalene vil ikke kunne adskilles fra hverandre. Det er derfor ønskelig å benytte enten strålings-blokkerende midler innbefattet i et spesielt lag eller et reflekterende eller strålings-blokkerende lag mellom et eller flere lag i innretningen.

Spesielt, anvendt ved flerlags innretningen ifølge foreliggende oppfinnelse, vil et strålings-blokkerende lag være anbrakt mellom reagenslaget og deteksjonslaget i innretningen vist i fig. 1. Ved å inkorporere et slikt lag mellom reagenslaget og deteksjonslaget, vil et eventuelt signal som produseres fra den immobiliserte merkede reagensen i reagenslaget detekteres uten et interfererende signal produsert av det immobiliserte analytt-(merket reagens)komplekset i deteksjonslaget som et resultat av at et slikt ikke-transmitterende lag er inkorporert mellom disse lagene. På denne måten kan signalet som produseres i hvert lag detekteres, måles, og korreleres med mengden analytt i det flytende forsøksmediet uten et interfererende signal produsert av det andre laget.

Alternativt kan det være ønskelig å anvende strålings-blokkerende midler som kan inkorporeres i enten reagenslaget eller deteksjonslaget. Opakifi-serende pigmenter, såsom titandioksyd, bariumsulfat eller sinkoksyd kan anvendes for dette formålet. Matte polymerer kan også anvendes, enten uavhengig, eller inkorporert med pigmenter for å fremme strålings-blokkeringen eller andre egenskaper. Slike strålings-blokkerende lag og midler er kjent innen teknikken og innbefatter de som er beskrevet i US patent nr. 4.042.335 og 4.255.384.

Der hvor en fluorofor anvendes som merke i den merkede reagensen, kan det detekterbare signalet alternativt maskeres fra deteksjonssystemet ved anvendelsen av slukke-fenomener uten behov for strålings-blokkerende lag eller materialer. De lag eller soner hvori signalet skal blokkeres, f.eks. reagenslaget når det måles i deteksjonslaget, kan inkorporeres med en immobilisert stoff som effektivt slukker fluorescensen av merket som et resultat av endringer i mediepolariteten eller inkorporering av slukkende grupper, såsom tunge atomer, f.eks. I~.

Deteksjon av signalet som produseres av den merkede reagensen i enten reagenslaget eller deteksjonslaget kan oppnås ved anvendelse av et egnet instrument, såsom et spektrofotometer, et reflektometer, et fluorometer eller luminometer. I tilfeller hvor, f.eks., deteksjonen er basert på absorbans eller fluorescens, rettes en energikilde fra et slikt instrument enten mot eller gjennom reagenslaget eller mot eller gjennom deteksjonslaget. I tilfeller hvor på den annen side deteksjonen er basert på luminescens, anvendes et egnet instrument som detekterer slik luminescens uten behov for en energikilde.

Med referanse til fig. 2 i tegningene, er det vist en forsøksinnretning som er lik forsøksinnretningen i fig. 1. I denne utførelsen innbefatter forsøksinnretningen ytterligere et andre reagenslag anbrakt mellom det første reagenslaget og deteksjonslaget. Det ekstra reagenslaget tillater inkorporering av en form av den merkede reagensen som er oppløselig i forsøksmediet, som overflødiggjør behovet for forblanding av det flytende forsøksmediet og den merkede reagensen før påføring derav på forsøks-innretningen eller den uavhengige påføringen derav, som med forsøks-innretningen vist i fig. 1. Spesielt er det første reagenslaget inkorporert med den merkede reagensen som er oppløselig i mediet (betegnet som "merket reagens"), som oppløseliggjøres ved fluidkontakt med det flytende forsøksmediet som diffunderer der inn. Det andre reagenslaget er inkorporert med den immobiliserte formen av analytten (betegnet som " | - An"), og deteksjonslaget er inkorporert med den immobiliserte formen av det bindende stoffet for den merkede reagensen (betegnet som binder") som beskrevet ovenfor.

Ved påføring av det flytende forsøksmediet på det første reagenslaget diffunderer det flytende forsøksmediet inn i det første reagenslaget og bringer eventuell analytt fra forsøksmediet i direkte fluidkontakt med den merkede reagensen deri, samtidig som det oppløseliggjør den merkede reagensen. Følgelig vil eventuell analytt fra forsøksmediet bli bundet til bindingspartneren derav av den merkede reagensen og analytt-(merket reagens)komplekset som derved dannes migrerer inne i og ut av det første reagenslaget og inn i det andre reagenslaget. Det skal understrekes at eventuell ubundet merket reagens i det første reagenslaget, f.eks. overskudd av merket reagens, også vil migrere inne i og ut av det første reagenslaget og inn i det andre reagenslaget. Siden bindingssetet på den enverdige bindende partneren for analytten i den merkede reagensen er besatt ved bindingen av analytten fra forsøksmediet, vil, når det først befinner seg i det andre reagenslaget, analytt-(merket reagens)-komplekset tillates å migrere inne i og ut av det andre reagenslaget uten å bli immobilisert, og inn i deteksjonslaget. Når den befinner seg inne i deteksjonslaget, vil den merkede reagensen vekselvirke med den immobiliserte vekselvirkende deteksjonsreagensen som er inkorporert deri slik at reaksjonsproduket dannes som beskrevet ovenfor. Siden imidlertid den ubundne merkede reagensen i det andre reagenslaget har et tilgjengelig bindingssete for den immobiliserte analytten i det andre reagenslaget, vil den merkede reagensen bindes dertil og immobiliseres derved og for hindres fra ytterligere migrerering inn i deteksjonslaget. De resulterende signaler som genereres av reaksjonsproduktet detekteres deretter, måles og korreleres med mengden analytt fra forsøksmediet som beskrevet ovenfor.

Selv om de forskjellige lagene i flerlags innretningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan være selvbærende, er det foretrukket at slike lag er belagt eller på annen måte anbrakt på et bærerelement. Bærerelementet er transparent for lys eller annen energi og vil være kompatibelt med den planlagte fremgangsmåten for signaldeteksjon. Der hvor f.eks. kjemien for forsøksinnretningen genererer et gassformig produkt for deteksjon derav med en gassfølsom elektrode, er bærerelementet et fluid-gjennomtrengelig lag i væskekontakt med en slik elektrode. Foretrukne bærerelementer innbefatter transparente bærermaterialer som er i stand til å transmittere elektromagnetisk stråling av en bølgelengde i området mellom ca. 200 nm og ca. 900 nm. Bæreren må nødvendigvis ikke transmittere over hele 200-900 nm-området, selv det for fluorometrisk deteksjon av analyseresultater gjennom bæreren er ønskelig at bæreren transmitterer over et bredere område eller, alternativt, transmitterer ved eksitasjons- og emisjons-spektra fra de fluorescerende materialene som benyttes for deteksjon. Det kan også være ønskelig å ha en bærer som transmitterer over en trang bølgelengdebåndbredde og som har redusert transmittans for nærliggende bølgelengder. Dette kan f.eks. oppnås ved impregnering eller belegging av bæreren med et eller flere fargemidler som har egnede absorpsjons-egenskaper.

Et strålings-transmitterende eller transparent bærerelement tillater en energistråle, såsom lys, å passere gjennom. Strålen reflekteres deretter, f.eks. fra et strålings-blokkerende lag, tilbake til en registrerings-komponent i instrumentet.

F.eks. er det i fig. 3 vist en flerlags forsøksinnretning konstruert ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder første og andre reagenslag og et deteksjonslag montert eller på annen måte anbrakt på et strålings-transmitterende bærerelement hvorigjennom en energistråle rettes. Det første reagenslaget er inkorporert med den merkede reagensen som er oppløselig i det flytende forsøksmediet innbefattende et enverdig antistoff-fragment av et antistoff for analytten som skal bestemmes, merket med et antall fargestoff molekyler som inneholder biotin bundet dertil som bindende enhet (angitt som "Fab-fargestoffn-biotin"). Det andre reagenslaget er inkorporert med en immobilisert form av analytten (angitt som " |-An"), og deteksjonslaget er inkorporert med en immobilisert form av avidin (angitt som " | -Avidin") som det bindende stoffet for biotin-bindingsdelen av den merkede reagensen. Det immobiliserte avidinet er inkorporert i overskudd relativt til den merkede reagensen slik at i det vesentlige alt analytt-(merket reagens) kompleks som migrerer inn i deteksjonslaget immobiliseres. Ved påføring av det flytende forsøksmediet inneholdende analytt på det første reagenslaget, vil analytten derfra bringes i direkte fluidkontakt med den merkede reagensen og bli bundet til det enverdige antistoff-fragmentet av antistoffet til analytten. Det analytt-(antistoff-fragment)-biotinylerte fargestoff-komplekset som derved dannes migrerer inne i og ut av det første reagenslaget, gjennom det andre reagenslaget og inn i deteksjonslaget hvor komplekset immobiliseres ved binding av biotin-bindingsdelen til det immobiliserte avidin-bindende stoffet deri. Som beskrevet ovenfor vil følgelig, når analytten fra forsøksmediet er blitt bundet til det enverdige antistoff-fragmentet av den merkede reagensen, ikke-spesifikk immobilisering av det resulterende komplekset ved den immobiliserte analytten i det andre reagenslaget forhindres som et resultat av den manglende tilgjengeligheten av et bindende sete på den merkede reagensen for den immobiliserte analytten.

Siden eventuelle mengder av den merkede reagensen som ikke ble bundet til analytten fra forsøksmediet vil bli immobilisert i det andre reagenslaget, er det nødvendig å forhindre deteksjon av det interfererende signalet som produseres derfra ved deteksjon av signalet som produseres av det merkede reagenskomplekset som er immobilisert i deteksjonssonen. Dette oppnås ved inkorporere et strålings-blokkerende stoff i det andre reagenslaget, eller alternativt, ved å anbringe et strålings-blokkerende lag mellom det andre reagenslaget og deteksjonslaget. Når følgelig en energikilde rettes fra et instrument gjennom det strålings-transmitterende bærerelementet og inn i deteksjonslaget, reflekteres energien tilbake gjennom deteksjonslaget og bærerelementet på grunn av det strålings-blokkerende stoffet eller laget og påvirkes derved bare av merket som er tilstede i deteksjonslaget. Et strålings-blokkerende stoff eller lag er spesielt ønskelig når det flytende forsøksmediet innbefatter et farget stoff, såsom rød blodcelle i tilfeller hvor det flytende forsøksmediet er helt blod, i hvilket tilfelle det strålings-blokkerende stoffet eller laget forhindrer interferens med fargen av røde blodceller som ville bli filtrert ut og forbli i et lag over deteksjonslaget.

Det skal understrekes at de forskjellige lagene i flerlags forsøksinnret-ningen ifølge foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til lagene og konfigurasjonene som beskrevet ovenfor. Ytterligere lag for anvendelse med flerlags forsøksinnretningen er beskrevet og er kjente innen teknikken, disse lagene forsterker og/eller modulerer virkningen av slike forsøksinnretninger. F.eks. kan en spredningssone eller et lag innbefattes, dette ville være anbrakt straks over og i kontakt med det første reagenslaget. Sp rednings sonen utmåler og fordeler jevnt en påført flytende prøve på det underliggende første reagenslaget. Slike spredningssoner eller lag er kjente innen teknikken og innbefatter lagene beskrevet i US patent nr. 3.992.158 og 4.427.632.

Innretningen kan også innbefatte en mellomsone eller et lag mellom de forskjellige lagene som tjener som et klebe- eller mellomlag som letter adhesjonen mellom lagene og som ytterligere letter adhesjonen av lagene til et fast bærerelement. Mellomsoner og lag kan også anvendes som f.eks. inneholder midler for fjernelse av interfererende elementer som kan forhindre deteksjon av noe av analytten, eller kan være en strålings-blokkerende sone eller lag som maskerer soner eller lag av innretningen for å forhindre interferens ved deteksjon av produktet. Slike strålings-blokkerende lag kan også anvendes som maskerer nærværet av forskjellige interfererende stoffer som finnes i en prøve, såsom røde blodceller i helt blod.

Det er også i noen tilfeller foretrukket å tilveiebringe en "tidsmålings"-sone eller -lag som kontrollerer diffusjonshastigheten av de forskjellige reagensene inkorporert i flerlags forsøksinnretningen gjennom de forskjellige lagene. Slike "tidsmålings"-soner eller -lag er inkorporert i forsøksinnretningen for å tilveiebringe kontrollerte inkuberingstider og trinnsvise reaksjoner eller for å lette fremstillingen av innretningen ved å forhindre for tidlig vekselvirkning mellom reagensene i innretningen.

Innretningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være en flersone innretning som har reagenssoner, deteksjonssoner, og liknende sammen-satt i en konfigurasjon som er spesielt tilpasset for kromatografisk analyse. En slik innretning vil innbefatte et absorpsjonsmiddelområde som vil være neddykket i det flytende forsøksmediet hvori det flytende forsøksmediet vil diffundere i en oppadgående retning inn i de forskjellige sonene.

Sonene i en slik flersone innretning kan foreligge i form av reagensputer som er montert på et plastbærerelement utformet for neddykking i et flytende forsøksmedium. De sone-dannende reagensputene er anbrakt på bærerelementet fra den ene enden til den andre, hvori endene derav står i væskestrømskontakt med hverandre. Spesielt innbefatter slike reagensputer en nedre, forsøksmedium-absorberende pute eller sone, første og andre reagensputer eller -soner, henholdsvis, anbrakt over førstnevnte, og en deteksjonspute eller -sone anbrakt over den andre reaksjonssonen.

Det skal understrekes at reagens- og deteksjonssonene er inkorporert med de forskjellige reagensene i flerlags forsøksinnretningen beskrevet ovenfor og utfører de samme funksjonene som beskrevet. I denne utførelsen neddykkes imidlertid den nederste absorberende puten av flersone innretningen i det flytende forsøksmediet i stedet for at en flytende prøve påføres på innretningen. På denne måten tjener den absorberende puten som en veke for absorpsjonen av forsøksmediet og den oppadgående diffusjonen derav inn i den første reagenssonen, den andre reagenssonen og deteksjonssonen. Innretninger med konfigurasjoner som beskrevet i US patent nr. 4.301.139 og 4.361.537 som anvender en fremkallervæske kan også tilpasses for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Som beskrevet ovenfor bindes analytt fra forsøksmediet som diffunderer inn i den første reagenssonen til den merkede reagensen som er inkorporert deri, og komplekser som derved dannes fortsetter å migrere gjennom den andre reagenssonen og inn i deteksjonssonen hvor analytt-(merket reagens)komplekset vekselvirker med den vekselvirkende deteksjonsreagensen som er immobilisert deri slik at det derved gene reres reaksjonsprodukt for ytterligere deteksjon og måling derav. Tilsvarende vil eventuell merket reagens i den første reagenssonen som ikke er bundet av analytten fra forsøksmediet migrere inn i den andre reagenssonen hvor den immobiliseres av den immobiliserte formen av analytten som er inkorporert deri.

Ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter de forskjellige lagene som er beskrevet fortrinnsvis en porøs matriks som er gjennomtrengelig for i det minste noen komponenter av en flytende prøve, f.eks antigener, haptener og/eller antistoffer, slik gjennomtrengelighet skyldes generelt porøsitet, mulighet for å svelle og eventuelle andre egenskaper. Matriksmaterialet kan innbefatte forskjellige porøse fiberformige materialer såsom cellulose, papir, ull, filt, vevde stoffer og liknende, enten disse er fremstilt fra naturlige eller syntetiske materialer. Slike materialer er f.eks. beskrevet i US patent nr. 3.802.842; 3.809.605; 3.897.214 og 3.987.214. Andre porøse, men ikke-fiberformige materialer innbefatter mikroporøse polymerer, som de som er beskrevet i US patent nr. 3.552.929.

Fortrinnsvis er de matriks-dannende materialene i de forskjellige lagene av flerlags forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse gjennom-trengelige materialer såsom gelatin, agarose og liknende. Slike materialer tillater passasje av fluider ved diffusjon, fremfor ved kapillarvirkning som med fiberformige, porøse materialer såsom papir eller vevde materialer. Selv om de porøse, fiberformige materialene beskrevet ovenfor kan benyttes, er gelatin, agarose og liknende spesielt foretrukket på grunn av den uniforme gjennomtrengeligheten for væsker, så vel som materialenes evne til å tillate passasje av lys eller annen elektromagnetisk stråling. Når det flytende forsøksmediet som skal analyseres er kjent, vil valget av et egnet materiale være enkelt for fagmannen.

Forskjellige kjente fremgangsmåter er tilgjengelig for immobilisering av analytten i forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et derivat eller en egnet analog av analytten kan fremstilles for å lette immobiliseringen derav i forsøksinnretningen. Selv om immobilisering ved kovalent tilknytning av analytten eller analogen derav er foretrukket, kan andre fremgangsmåter som bygger på ikke-kovalent tilknytning såsom ioneveksling eller adsorpsjon også benyttes. Immobilisering av analytt kan f.eks. oppnås ved direkte inkorporering i bærermatriksen av innretningen, såsom cellulose i papir, eller i gelatin eller agarose i filmer. Alternativt kan analyttanalogen knyttes til en polymer bærer som deretter inkorporeres i matriksen av innretningen, hvor polymeren har en tilstrekkelig størrelse til å forhindre betydelig diffusjon mellom bindingen og detek-sjonslagene. I gelatin vil f.eks. polymerer med molekylvekt høyere enn 10.000 vise neglisjerbar diffusjon gjennom gelatinmatriksen. Tilsvarende vil i agarose polymerer med molekylvekt større enn 2.000.000 være forhindret fra å dif f undere gjennom matriksen. Analytten kan også være bundet direkte eller via polymerryggraden til svært små partikler såsom polystyren-mikrokuler som deretter kan inkorporeres i matriksene i innretningen. Slike partikler er lett tilgjengelige i et område av størrelser og innbefatter polystyren, mikrokrystallinsk cellulose, kryssbundne dekstraner og kryssbundne agaroser, ionevekslerharpikser og liknende. Et bredt område av kjemiske teknikker er tilgjengelige for å kople midlene til bæreren. F.eks. kan vann-oppløselige karbondiimider benyttes for å aktivere frie karboksylgrupper for etterfølgende reaksjon med nukleofile midler innbefattende forskjellige aminforbindelser; amidrester eller perler kan omvandles ved reaksjon med hydrazin til hydrazider som kan omsettes videre med bifunksjonelle reagenser såsom glutaraldehyd, 1,5-difluornitrobenzen, 4,4'-difluor-3,3'-dinitrofenylsulfon, 2,4-diklor-6-karboksymetyl-amino-5-triazin, dimetyadipimidat eller dimetylsuberimidat, og liknende, etterfulgt av omsetning med aminer eller andre nukleofile knyttet til analytten eller en analog av interesse; hydrazider kan omvandles til azidgrupper ved omsetning med salpetersyrling ved en diazoteringsreaksjon; hydrazider kan omsettes med ravsyreanhydrid for å innbefatte karboksylatgrupper med en avstandsgiverarm; alifatiske aminer eller partikler kan også omsettes med bifunksjonelle reagenser analoge med hydrazidkjemien, innbefattet anvendelsen av heterobifunksjonelle kryssbindingsmidler som tillater tilknytning til aminene av funksjonelle grupper med forskjellige spesifisiteter såsom en maleimidgruppe som viser forøket spesifisitet for sulfhydrylderivater; hydroksylgrupper kan aktiveres ved cyanogenbromid, tosylklorid, karbonyldimidazol eller p-nitrofenylkloroformat; partikler såsom polystyren kan nitreres, nitrogruppene reduseres til aromatiske aminer, og de aromatiske aminene kan diazoteres før reaksjon med en nukleofil-analytt/analog av interesse. Nitrocellulose, diazobenzoksymetyl (DMB)-papir, derivatiserte nylonnettverk, eller papir aktivert med cyanogenbromid, p-nitrofenylkloroformat, eller karboksyldi-imidazol kan også benyttes for å knytte sammen nukleofile reagenser eller reagenser knyttet til reaktive polymerer.

Som et alternativ til direkte binding av den aktuelle bindende reagensen til et materiale immobilisert i reagenslaget, kan man også trekke fordel av spesifikke bindende partnere for å oppnå den nødvendige immobiliseringen in situ under utførelsen av analysen. Materialet som skal immobiliseres, dvs. analytten eller analogen eller den bindende partneren, kan innbefatte, eller modifiseres slik at det innbefatter, et bindingssete for et distinkt bindende stoff som i sin tur kan immobiliseres i reagenslaget. Det immobiliserte materialet kan følgelig anbringes på et hvilket som helst hensiktsmessig sted i innretningen og vil ved utførelsen av analysen resultere i den egnede immobiliseringen. Bindende vekselvirk-ninger som beskrevet ovenfor for immobilisering av den merkede reagensen i deteksjonslaget kan benyttes. Tilsvarende kan fremgangsmåten beskrevet ovenfor for immobilisering av analytten også generelt anvendes for immobilisering av de forskjellige deteksjonsreagensene eller derivatene derav.

Forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse benytter flere reagenslag som er satt sammen slik at det tillates fluidkontakt mellom nabolag som beskrevet ovenfor. De forskjellige lagene kan fremstilles ved å anvende filmdannere for å fremstille etterfølgende overliggende belegg eller fremstilles ved å anbringe lag av fiberformige reagensmaterialer over hverandre, såsom f.eks. filterpapir, glassfiber eller vevd polyester. Alternativt kan nabosoner utformes i en kromatografiutførelse med hver sone knyttet til bærerelementet slik at kantene av hver reaksjonssone står i direkte fluidkontakt som beskrevet ovenfor.

F.eks. kan flere lag av papir holdes på plass ved siden av hverandre med en innesluttende plastramme, eller alternativt med en væskegjennom-trengelig nettskjerm eller ved inkorporering av et vannoppløselig klebemiddel mellom lagene. Støpingen av flerlags filmer kan oppnås ved et antall teknikker som er kjent innen teknikken for støping av filmer, innbefattende anvendelsen av et sjaberblad, ekstruderingsbeleggings-innretning, Meyer-stav, bassengbeleggingsinnretning eller gravyrbestryk- ningsinnretning. Alternativt kan flere etterfølgende lag støpes med en kaskadebelegger. Filmlag dannet ved fremgangsmåtene ovenfor kan anbringes over hverandre med et stoff eller nettmateriale som inneholder reagensene som inkuberes i et på forhånd bestemt tidsrom.

Foreliggende analyse kan anvendes ved deteksjon av en hvilken som helst analytt for hvilken det finnes en bindende motpart tilgjengelig. Analytten er vanligvis et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid, nukleinsyre eller et annet organisk molekyl for hvilket en bindende motpart finnes eller kan fremstilles i biologiske systemer eller kan syntetiseres. Analytten er, funksjonelt uttrykt, vanligvis valgt fra gruppen bestående av antigener og antistoffer dertil; haptener og antistoffer dertil; komplementære polynukleotidsekvenser; og hormoner, vitaminer, metabolitter og farmakologiske midler, og deres bindende motparter. Vanligvis er analytten et immunologisk aktivt polypeptid eller protein som vanligvis har en molekylvekt på mellom ca. 1.000 og ca. 10.000.000, som f.eks. et antistoff eller antigenisk polypeptid eller protein, eller et hapten som har en molekylvekt på minst ca. 100 og vanligvis mindre enn ca. 1500.

Eksempler på polypeptidanalytter er angiotensin I og II, C-peptid, oksytocin, vasopressin, neurofysin, gastrin, sekretin, bradykinin og glukagon.

Eksempler på proteinanalytter innbefatter klassene av protaminer, mucoproteiner, glukoproteiner, globuliner, albuminer, scleroproteiner, fosfoproteiner, histoner, lipoproteiner, kromoproteiner og nukleoproteiner. Eksempler på spesifikke proteiner er prealbumin, cq-lipoproteiner, humant serum albumin, cq-syreglykoprotein, cq-antitrypsin, aj-glykoprotein, transkortin, tyroksinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, myoglobulin, ceruloplasmin, c<2-makroglubulin,3-lipoprotein, erytropoietin, transferrin, hemopeksin, fibrinogen, immunoglobulinene såsom IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, og deres fragmenter, f.eks. Fc og Fatf, komplement - faktorer, prolaktin, blodkoaguleringsfaktorer såsom fibrinogen, trombin osv., insulin, melanotropin, somatotropin, tyrotropin, follikkelstimulerende hormon, leutiniserende hormon, gonadotropin, thyroidstimulerende hormon, placentalaktogen, instrinsikfaktor, transkobalamin, serumenzymer såsom alkalisk fosfatase, melkesyredehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, kolinesterase, glutaminsyreoksaloeddiksyre-transaminase, glutaminsyrepyruvinsyre-transaminase, og uropepsin, endorfiner, enke-faliner, protamin, vevsantigener, bakterielle antigener og virale antigener såsom hepatit-tilknyttede antigener (f.eks. HBsAg, HBcAg og HBeAg).

Eksempler på haptenanalytter innbefatter de generelle klassene av legemidler, metabolitter, hormoner, vitaminer, toksiner og liknende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner innbefatter thyroksin og trijodothyronin. Vitaminer innbefatter vitaminene A, B, f.eks. Bj^, C, D, E og K, folinsyre og thiamin. Legemidler innbefatter antibiotika såsom aminoglykosider, f.eks. gentamicin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, kloromycetin, og actinomycetin; nukleosider og nukleotider såsom adenosindifosfat (ADP), adenosintrifosfat (ATP), flavinmononukleotid (FMN), nikotinamid-adenindinukleotid (NAD) og dets fosfatderivat (NADP), thymidin, guanosin og adnosin; prostaglandiner; steroider såsom østrogenene, f.eks. østriol og estradiol, sterogener, androgener, digoksin, digitoksin og adrenokortiske steroider; og andre såsom fenobarbital, fenytoin, primidon, etosuksimid, karbamazepin, valproat, teofyllin, kaffein, propranolol, prokainamid, kinidin, amitryptilin, kortisol, desipramin, disopyramid, doksepin, dokso-rubicin, nortryptilin, metotrekssat, imipramin, lidokain, prokainamid, N-acetylprokainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer. Toksiner innbefatter acetyl T-2 toksin, alfatoksiner, koleratoksin, citrinin, cytochalasiner, stafylokokkisk enterotoksin B, HT-2 toksin og liknende.

Det flytende forsøksmediet som inneholder analytten som skal bestemmes kan være en naturlig forekommende eller en kunstig fremstilt væske som mistenkes for å inneholder analytten, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning derav. Biologiske væsker hvorfra analytten kan bestemmes innbefatter serum, helt blod, plasma, urin, spytt og foster-væske og cerebrospinalvæske.

Foreliggende oppfinnelse skal i det følgende beskrives ved hjelp av de følgende, ikke-begrensende, eksemplene:

EKSEMPEL 1

Fremstilling av fargestoff/biotin-merket antistoff.

Bukvæske inneholdende et anti-digoksin-antistoff (~6 mg/ml) fortynnes fem ganger i 0,1 M citratbuffer, pH 3,5 og inkuberes med en 1:50 (vekt/vekt) pepsimantistof f-oppløsning i 48 timer ved 37 "C. Etter oppkonsentrering til ca. 5 ml ved ultrafiltrering over en "Amicon PM30"-membran (Amicon Corp., Danvers, MA, USA), gelfiltreres prøven på en "Sephacryl S-300" (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) kolonne (2,4 x 90 cm) og får oppnå likevekt med 50 mM natriumfosfat og 0,10 M natriumklorid (pH 7,6) for å isolere F(ab')2-fragmentet av antistoffet. Antistoffet reduseres med 3 mM ditiotreitol i 45 minutter, etterfulgt av tilsats av 4 mM jodacetamid (endelig konsentrasjon) i en time for å alkylere frie sulfhydrylgrupper. Proteintoppen samles etter avsaltning på en "P-6DG"-polyakrylamidgelharpiks (Bio. Rad. Co., Richmond, CA).

En porsjon av det samlede proteinet omsettes i 2 timer med et fem gangers molart overskudd av N-hydroksysuccinimidaminobiotin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Reaksjonsproduktet avsaltes deretter på en "P-6DG"-kolonne og konsentreres til 1 mg/ml protein ved ultrafiltrering over en "Amicon PM30"-membran.

En porsjon av proteinet omsettes deretter over natten med en tyve ganger molart overskudd av tetrametylrhodamin-p-isotiocyanat (Research Organics, Inc., Cleveland, OH) på forhånd oppløst i dimetylsulfoksyd. Reaksjonsproduktet føres over en immobilisert avidinkolonne (Pierce Chemical Co.) som på forhånd er likevektsinnstilt med 0,1 M natriumfosfat og 0,5 M natriumklorid (pH 7,8). Det bundne proteinet elueres med 0,2 M natriumacetat, 0,5 M natriumklorid (pH 4,0), etterfulgt av gel-filtrering på en "P-6DG"-kolonne (likevektsinnstilt med 20 mM natriumfosfat, 100 mM natriumklorid (pH 7,2)) og proteintoppen samles.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av det immobiliserte analyttlaget.

"Whatman 31-ET" (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA) aktiveres for etterfølgende behandling med para-nitrofenylkloroformat (NPCF). Papirlag

neddykkes i 15 minutter i destillert vann og vannet dekanteres deretter og papiret renses deretter med seks etterfølgende volumdeler aceton for å fjerne fritt vann. Papiret neddykkes deretter i en 10% oppløsning av NPCF i aceton, inkuberes i 6 timer, og deretter fjernes uomsatt NPCF ved suksessive vaskinger med aceton. Renseoppløsningen undersøkes med henblikk på nærvær av formatet ved tilsats av 100 pl av en IN NaOH til 300 jjI av renseoppløsningen. Rensingen fortsettes med 3 volumdeler aceton inntil det ikke finnes noen detekterbar gulfarge, etterfulgt av vasking med 1 1 destillert vann og etterfølgende vaskingm ed 5 x 100 ml volumdeler av aceton, og oppløsningsmidlet fjernes ved lufttørking.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av immobilisert bindende lag.

"Whatman 54"-papir (3,7 g) inkuberes med 2 g l,l'-karbonyldiimidazol i 100 ml aceton i en time ved romtemperatur med leilighetsvis omrøring. Papiret vaskes med 3 x 200 ml aceton og tørkes ved 500 C i ca. 10 minutter (eller inntil det ikke forekommer noen detekterbar acetonlukt) og lagres med silikagel-tørkemiddel ved 4°C inntil videre bruk. Papiret omsettes deretter med 10 mg/ml strepavidin ("54762", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 50 mM natriumfosfat, pH 7,4, i 14 timer. Papiret vaskes omhyggelig med 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4.

EKSEMPEL 4

Fargestoffet/Biotin-antistoff-konjugatlag.

"Whatman 31 ET"-papir dyppes i en oppløsning inneholdende 10 mg/ml anti-digoksin Fab fargestoff/biotin i en 0,6 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, og tørkes ved 40 °C i 20 minutter.

EKSEMPEL 5

Sammensetning av flerlags innretningen.

En kompositt båndinnretning settes sammen av de tre reagenselementene beskrevet ovenfor. Konjugatlaget lamineres på et dobbeltklebende limbånd (3M Company, St. Paul, MN, USA) og skjæres til et 1 cm bredt og 12,7 cm langt bånd. Dette materiales lamineres deretter på og langs den lengste kanten av en overflate av et 8,3 cm bred og 12,7 cm lang klar polystyrenbærer ("Trycite", Dow Chemical Co., Midland, MI, USA). Et 1-2 mm bånd av dobbeltklebende limbånd monteres langs bakkanten av konjugatlaget og et 1 cm bredt bånd av reagenspapir som inneholder den immobiliserte analyttanalogen monteres derpå ved hjelp av biten av dobbeltklebende limbånd. Fremgangsmåten ovenfor gjentas for å montere båndet av det bindende laget av papir som inneholder det immobiliserte bindende proteinet. Den resulterende flerlags innretningen skjæres til 5 mm brede og 8,3 cm lange reagensbånd som inneholder de forskjellige lagene montert på endene derav.

EKSEMPEL 6

Drift av innretningen.

En normalt human serumprøve fastsettes til 5 nM med digoksin. Et konsentrasjonsområde fra 0,2 til 5,0 nM digoksin fremstilles ved fortynning av forrådsreagensen med normalt humant serum. En 80 ul porsjon av prøven påføres på forsøksinnretningen for å initiere forsøket. Forsøks-innretningen er montert i et fluorometer som er i stand til å måle en frontflate-fluorescensmåling av forsøksinnretningen (f.eks. Howard, W. et al., Analyt. Chem. 55^878-888 [1983]). Eksitasjonslyset illumineres overflaten av innretningen med lys som passerer gjennom et 540 nm interferensfilter (3 hulrom Ditric Optics, Inc., Hudson, MA) gjennom en fiberoptisk bunt plassert ved en 45°vinkel relativt til normalen til reagensputen. Emittert lys detekteres ved hjelp av en fiberoptisk bunt montert normalt til puten, som transporterer lyset til et 570 nm inter-ferensf ilter (3 hulrom, Ditric Optics, Inc., Hudson, MA, USA) og tilkoplet deteksjonselektronikk. Endringen i fluorescens måles og relateres med konsentrasjonen av digoksin som er påført.

Claims (10)

1. Flersone forsøksinnretning for spesifikk bindingsanalysebestemmelse av en analytt i et flytende forsøksmedium innbefattende binding blant (i) analytten, (ii) en merket eller immobilisert form av analytten eller av en bindende analog derav, og (iii) en immobilisert eller merket form, henholdsvis, av en bindende partner for analytten, det merkede spesies av analytten, analogen derav, eller den bindende partneren som er en merket reagens innbefattende en detekterbar kjemisk gruppe som har en detekterbar fysikalsk egenskap, karakterisert ved at forsøksinnretningen, i væskestrømskontakt, innbefatter (1) en reagenssone innbefattende en fast, porøs matriks inkorporert med det immobiliserte spesies av analytten, analogen derav eller bindings - partneren, og

(2) en deteksjonssone innbefattende en fast, porøs matriks for mottakelse og måling av merket reagens som migrerer inn i en slik sone og inkorporert med en immobilisert form av et bindende stoff for den merkede reagensen.

2. Forsøksinnretning ifølge krav 1, karakterisert ved at den merkede reagensen i tillegg innbefatter en ligand-enhet og det immobiliserte bindende stoffet for den merkede reagensen i deteksjonssonen er en bindende partner for en slik ligand-enhet.

3. Forsøksinnretning ifølge krav 2, karakterisert ved at den bindende partneren for ligand-enheten er et protein som spesifikt gjenkjenner en slik enhet, fortrinnsvis et antistoff eller et fragment derav i tilfeller hvor ligand-enheten er et hapten, eller biotin eller avivin når ligand-enheten er den andre derav.

4. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at det immobiliserte bindende stoffet for den merkede reagensen i deteksjonssonen er et antistoff, eller et fragment derav, som binder den merkede reagensen.

5. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at den merkede reagensen innbefatter et antistoff, eller et antistoff eller et fragment derav som har et intakt bindingssete for protein A, og det bindende stoffet for den merkede reagensen immobilisert i deteksjonssonen er protein A.

6. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at det immobiliserte bindende stoffet den merkede reagensen i deteksjonssonen er et adsorpsjons-materiale for den merkede reagensen, fortrinnsvis et ionevekslingsmateriale.

7. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at den detekterbare kjemiske gruppen er en fluorescerende gruppe eller en kromofor.

8. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at det bindende stoffet for den merkede reagensen er immobilisert i deteksjonssonen ved at det er kovalent koplet til matriksen som er innbefattet deri, eller ved det er knyttet til et polymert stoff av høy molekylvekt dispergert i nevnte matriks.

9. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at den bindende partneren for analytten er et antistoff eller et fragment derav.

10. Forsøksinnretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at reagens- og deteksjonssonene foreligger i form av lag i væskestrømskontakt og hvor forsøksinnretningen i tillegg innbefatter et reagenslag innbefattende en fast, porøs matriks inkorporert med en form av den merkede reagensen som er oppløselig i forsøksmediet og et bærerelement anbrakt på den motsatte siden av deteksjonslaget relativt til reagenslaget.