NO882300L - Fremgangsmaate og testanordning for separering av merket reagens i en immunometrisk-analyse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikke bindingsanalyser som krever separasjon av frie og bundede former av et merket reagens for "bestemmelse av en analytt i et væsketestmedium. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt homogene immunoanalyser som benytter reagenspartikler for separasjon av de frie formene av et me-rket reagens av de bundede formene av et merket reagens.

Forskjellige heterogene spesifikke bindingsanalyser er blitt utviklet som generelt innbefatter spesifikk bindingsinterak-sjdner i en reaksjonsblanding mellom analytten som skal detekteres, en spesifikk bindingspartner for analytten og et merket reagens som kan være den samme eller forskjellig fra bindingspartneren for analytten. Når man utfører slike analyser, blir det merkede reagenset bundet til dets korresponderende bindingspartner for å danne en bundet form av de merkede reagenser, hvorpå det merkede reagenset som ikke er slik bundet utgjør de frie formene, hvori grad av binding er en funksjon av mengden av analytt som er tilstede. På grunn av et den detekterbare responsen til det merkede reagenset ikke kan skjelnes mellom de bundede og frie formene, er det dermed nødvendig å fysisk separere slike bundede og frie former fra hverandre for å effektivt bestemme mengden av analytt som er tilstede. Når de bundede og frie formene til det merkede reagenset er blitt separert fra hverandre, blir mengden av markør som er tilstede i begge fraksjonene bestemt ved måling av aktiviteten til den bestemte markøren til det merkede reagenset og korrelering av slik aktivitet til mengden av analytt som er tilstede.

Slik separasjon utføres vanligvis ved anvendelse av bestemte faste f asereagensstof f er som har evnen til å bindes til de frie formene for å kunne fysisk separere de frie formene fra de bundede formene, men som til tross for dette krever innviklede og ofte uhensiktsmessig manipulerende trinn for å utføre en slik separasjon. US-patent nr. 4.200.436 beskriver for eksempel en immunanalyse som anvender en immobilisert form av et antigen som skal bli målt og som blir satt til en immunanalysereaksJonsblanding for binding til de frie formene av det merkede reagens. For å separere de frie formene som er bundet til det immobiliserte antigenet fra de bundede formene, må reaksjonsblandingen derimot bli sentrifugert for å tilveiebringe en slik separasjon. Når-reaksjonsblandingen er blitt sentrifugert, må enten en aliquot bli tilveiebragt fra supernatanten, eller så må supernatanten bli fjernet, for å måle markøren til de bundede formene som er inne i supernatanten, eller markøren til de sedimenterte frie formene, respektivt.

Forskjellige fremgangsmåter er også blitt beskrevet som anvender partikulat faste fasematerialer som enten blir immobilisert på en kromatografisk testanordning, eller som kan bli gJ.ort immobil på en slik anordning, for separering av den frie formen av det merkede reagens fra den bundede formen. Europa-patent-søknad publikasjon nr. 120.602 beskriver for eksempel et analysesystem som anvender et merket reagens som delvis er tilstede i en form som er mobil på et valgt kromatograf i sk medium og som delvis er en form som ikke er mobil. Et antistoff til analytten blir bundet eller immobilisert til det partikulate fastfasematerialet som ikke er mobilt på det valgte kromatografiske mediumet og som bindes til prøveanalytt. En merket form av antistoffet til analytten blir anvendt, som bindes til ledige bindingsseter på prøveanalytten som er bundet til immobilisert antistoff. Merket antistoff som ikke er bundet slik vandrer bort fra applikeringspunktet på det kromatografiske mediumet ved å påføre et oppløsningsmiddel dertil, hvorved mengden av markøren til det immobile merkede antistoffet bundet til fast fasemateriale eller det frie merkede antistoffet blir målt og relatert til mengden av analytt i prøven.

Europa-patentsøknad publikasjon nr. 120.602 beskriver videre separasjonen av agglutinerte partikler fra ikke-agglutinerte partikler ved et analysesystem som anvender latekspartikler som det partikulate faste fasemateriale. Avhengig av hvilket spesielle immunanalyseformat som blir anvendt, f.eks. konkurrerende immunanalyse eller sandwich-immunanalyse agglutinerer latekspartiklene i fravær eller nærvær, respektivt, av analytt, hvorved de agglutinerte partiklene blir separert fra ikke-agglutinerte partikler på et valgt kromatografisk medium hvorpå den første er immobil og den siste er mobil, og mengden av markør til det merkede reagenset til den ene eller den andre blir målt.

Konsentrasjonen til de agglutinerte partiklene som skal bli målt på en sugende matrise, er også beskrevet i Europa-patensøknad publikasjon nr. 135.324, som tilveiebringer et observerbart signal i relasjon til konsentrasjonen til partiklene på matrisen. I nævær av analytt, kan de anvendte partiklene bli forhindret fra migrering eller bli latt migrere, og tilstedeværelse av et detekterbart signal ved et bestemt eller konsentrert sted på matrisen kan bli relatert til tilstedeværelse av analytten. Konsentrering av partiklene blir oppnådd ved tilveiebringing av spesifikke bindingsledd som broer mellom partiklene. For eksempel i en analyse for et hapten, blir haptenet koblet til farvede kuler som individuelt er mobile på matrisen, og immobile når de blir agglutinert. Prøvehaptenet blir reagert med antistoffer dertil, og deretter reagert med kulene for binding til tilgjengelige bindingsseter til haptenet på kulene, hvori f.eks. i. fravær av prøvehapten, oppstår det'en vesentlig mengde bloddannelse mellom kulene på grunn av antistoffene, dvs. agglutinasjon. Ved kontakt med matrisen, blir en konsentrering av agglutinerte kuler som blir indikert ved farven på kulen, observert i fravær av hapten som et resultat av immobiliteten derav på matrisen, mens i nærvær av hapten, er det ikke noe agglutinasjon og derfor ingen konsentrering av kuler og ikke noen observerbar farve, For bestemmelse av antigen, blir kuler merket med antistoffer til antigenet og med enzymer inkubert med prøveantigenet hvori broer blir dannet mellom kulene ved at antigen bindes til antistoffene til kulene. Tilstedeværelse av antigen resulterer i agglutinasjon av kulene som beskrevet ovenfor, og matrisen blir kontaktet med substrat for enzymet og en hensiktsmessig indikat forbindelse, for å indikere tilstedeværelse av enzym bundet til antigen-agglutinerte kuler tilbakeholdt av matrisen ved konsentreringsstedet.

En fremgangsmåte for deteksjon og bestemmelse av konsentrasjonen til prøveanalytt ved agglutinasjon eller agglutina-sjonsinhibering, er beskrevet i tysk utleggsskrift nr. 3.511.012. Metoden anvender en partikkel som innbefatter minst en kompnent av et bioaffinitetsbindingssystem, f.eks. antigen eller antistoff, og minst en komponent av et signalproduserende system, f.eks. et enzym, som blir anvendt i en agglutinasjon eller agglutinasjonsinhiberingsanalyse som nevnt ovenfor og som er kjent innenfor fagområdet. Separasjon av agglutinerte og ikke-agglutinerte partikler blir utført på en testanordning innbefattende en applikasjonssone, en reaksjonssone, en separasjonssone og en detekteringssone. Partiklene blir inkorporert inn i reaksjonssonen eller applisert dertil før eller samtidig med applisering av prøveantistoffer eller antigener til applikasjonssonen. Tilstedeværelse av prøveantistoff eller antigen produserer eller forhindrer agglutinasjon av prartiklene, respektivt. Separasjonen blir tilveiebragt av separasj onssonen som ei; permeabel for de uagglutinerte partiklene, men impermeabel for agglutinerte partikler. DeteksJonssonen er inkorporert med en annen komponent av det signaldannende systemet, f.eks. et substrat for enzymet, hvorved enzymmarkøren til de uagglutinerte partiklene som migrerer deri reagerer med substratet for å tilveiebringe et signal som er korrolert til mengden av prøveantigen eller antistoff.

En av ulempene ved å utføre slik konkurrerende og to-sted sandwich-analyser hvor det merkede reagens som er bundet til det faste fasestoffet blir målt, er. nødvendigheten av å fjerne alt merket reagens som ikke er slik bundet, som hvis tilstede, ville resultere i et interfererende bakgrunnssignal og redusere analysefølsomheten. Når man utfører slike immunoanalyser som benytter en testanordning for separasjon av bundede og frie former av et merket reagens, er det nødvendig med et vasketrinn i tillegg hvor man benytter en vaskeoppløsning for å forårsake at det mobile merkede reagenset reagerer bort fra det immobile merkede reagensste-det. Der hvor et enzym blir benyttet som markør for det merkede reagenset, vil et oppløselig enzymsubstrat inkorporert i anordningen være oppløst og bli vasket bort av vasekoppløsningen, og dermed ville kreve enten et tilleggs-trinn innbefattende benytting av en enzymsubstratoppløsning etter vaskeoppløsningen, eller inkorporering av enzym-substratet inn i vaskeoppløsningen.

Der hvor de mobile - formene av det merkede reagenset i stedet blir målt i henhold til slike konkurrerende og sandwich-immunoanalyseformater, krever den nøyaktige målingen at mengde merket reagens benyttet i immunoanalysen blir nøye kontrollert. En slik mengde i overskudd er begrenset av nødvendigheten av å ha et signal i et målbart område. Slik måling vil også resultere i doserespons som har et høyt bakgrunnssignal i fravær av analytten.

I et konkurrerende immunanalyseformat er mengden av antistoff som er immobilisert til det faste fasestoffet også kritisk for utførelsen av immunanalysen, doserespons er ikke lineær over et vidt område av analyttkonsentrasjon, og vanskelig å lineærisere innenfor et mindre, område og krever utvidede inkubasjonsperloder .

Slike fremgangsmåter som er avhengig av agglutinasjon av partikler for separasjon av bundede og frie former av et merket reagens, trenger aggregater av bare noen få partikler for å bli separert fra monodisperse partikler, hvor forskjel-len i størrelsen derav er av en størrelsesorden eller mindre. Valg av kromatografisk matrise må være nøye overveiet slik at den sjeldner mellom agglutinerte partikler fra ikke-agglutinerte partikler. Slike metoder krever også at partiklene forblir monodisperse før utførelsen av den bestemte analysen, og likeledes i løpet av utførelsen av en immunanalyse i fravær av analytt. Agglutinering av slike partikler kan derimot oppstå for eksempel i løpet av lagring eller i nærvær av biologiske fluider.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for spesifikk bindingsanalysebestemming av analytt på en kromatografisk testanordning som ikke krever flere reagenser eller fremkallingsoppløsninger for å tilveiebringe et detekterbart signal.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for spesifikk bindingsanalysebestemmelse av analytt på en kromatografisk testanordning som tilveiebringer et detekterbart signal som resulterer i en lineær doserespons med lite eller ikke noe interfererende bakgrunnssignal.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for separering av den bundede og frie formen av et merket reagens i en immunometrisk bindingsanalyse, som anvender et reagenspartikkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav immobilisert til en uoppløselig partikkel og et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe. Den bundede<p>g frie formen av det merkede reagens blir separert på en reagenspartikkelseparerings- og detekteringstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering ar vannholdige væsker ved kapillær virkning. Den porøse matrisen innbefatter en separeringssone som er vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkelen, og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransport kontakt med separeringssonen. Separerings- og detekteringssonene er fysisk distinkte områder som kan være beliggende langs lengden av en forlenget strimmel bestående av et enkelt, kontinuerlig, fast, porøst matrisemateriale som er vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkelen, eller så kan de fysisk distinkte områdene innbefattende separerings- og detekteringssonene være sammensatt av fysiske distinkte faste, porøse matrisematerialer som enten kan være beliggende langs lengden- av den forlengede strimmelen eller laminert i form av lag.

I henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, blir væsketestmediumet inneholdende analytten, merket reagens, og reagenspartikkelen samtidig eller sekvensielt kombinert, fortrinnsvis sekvensielt, for å danne en vannholdig væske-reaksjonsblanding hvorved det merkede reagens bindes til analytten for å danne den bundede formen, og reagenspartikkelen er tilstede i en mengde som er i overskudd av det som har evnen-til å bindes til vesentlig alt av denf rie formen av det merkede reagens som ikke bindes til analytten. En aliquot av reaksjonsblandingen ble deretter applisert i separeringssonen til testanordningen, hvorved reagenspartikkelen som har den frie formen av det merkede reagens immobilisert til seg blir tilbakeholdt og dermed forhindret fra migrering ut av separeringssonen, og den bundede formen av det merkede reagens blir transportert av væsketestmediumet fra separeringssonen og inn i detekteringssonen. Den detekterbare kjemiske gruppen til den bundede formen i detekteringssonen blir deretter målt og korrelert til mengden av analytt som er tilstede i testmediumet.

Siden fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ikke krever et vasketrinn for å forårsake at den bundede formen migrerer fra separeringssonen og inn i detekteringssonen, ert ikke flere trinn nødvendig for å tilveiebringe separering derav når aliquoten i reaksjonsblandingen blir applisert i separeringssonen.

Separering av den bundede formen fra den immobiliserte frie formen til det merkede reagenset begynner vesentlig samtidig med den opprinnelige dannelsen av det detekterbare signalet i detekteringssonen uten flere manipulerende eller mekaniske trinn. Kontrollert separering og detektering av den bundede formen av det merkede reagens i løpet av en vesentlig tidsperiode er dermed tilveiebragt.

På grunn av at den immunometriske analysemetoden som blir benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse ikke krever et vasketrinn for å fjerne overskudd og/eller uspesifisert bundet merket reagens, kan en oppløselig form av en detek-ter ingsmiddelkomponent for markøren til det merkede reagens, slik som et substrat for en enzymmarkør, bli inkorporert inn i testanordningen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et bilde i perspektiv av en testanordning ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende ved fysisk distinkte områder langs lengden av den forlengede strimmel. Fig. 2 er et bilde i perspektiv av en testanordning ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende en separeringssone og en detekteringssone sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer i væsketransportkontakt beliggende langs lengden av en forlenget strimmel. Fig. 3 er et bilde i perspektiv av testanordningen ifølge foreliggende oppfinnelse innbefattende en separeringssone og en detekteringssone sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer i form av lag i væsketransportkontakt.

Fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en immunometrisk teknikk for spesifikk bindingsanalysebestemming av en analytt i et vannholdig væsketestmedium innbefattende binding blant analytt fra væsketestmediumet, det merkede reagens, og reagenspartikkelen, merket reagens som ikke bindes til analytten fra testmediumet blir bundet til analytten eller bindingsanalogen derav, som er immobilisert til reagenspartikkelen. Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir den vannholdige væskereaksjonsblandingen først dannet, innbefattende væsketestmediumet, det merkede reagens og reagenspartikkelen, og deretter applisert i separeringssonen av reagens-parrtikkelseparerings- og detekteringstestanordnlngen ifølge foreliggende oppfinnelse. Reagenspartikkelen er tilstede i en mengde som er i overskudd av det som kan bindes til alt av den frie formen til det merkede reagens som ikke blir bundet til analytten fra testmediumet. Mengden av reagenspartikkel i overskudd er i et slikt overskudd at en tilstrekkelig mengde er tilstede for å binde vesentlig alt av den frie formen av det merkede reagens for fullstendig immobilisering og separering av vesentlig alt av den frie formen fra den bundne formen.

Merket reagens er fortrinnsvis også tilstede i overskudd relativt til den beregnede mengde eller konsentrasjon av antatt analytt i testmediumet. En slik overskuddsmengde tilveiebringer et tilstrekkelig antall spesifikke bindingspartnere for den antatte analytten i testmediumet slik at vesentlig alt untatt analytt blir bundet av merket reagens. Det er en fordel at siden overskudd merket reagens bindes, og gjør at vesentlig all antatt analytt i testmediumet blir detekterbart, kan en nøyaktig og veldig sensitiv bestemmelse av analytten bli utført.

Anvendelse av reagenser i overskudd som er beskrevet ovenfor, resulterer i fordelaktige kinetiske og/eller 1ikelvektsfor-deler. Overskudd av reagenser aksellererer kinetikken til bindingsreaksjonene og skifter likevekten til reaksjonen for å begunstige dannelsen av bundet form, selv ved lave analyttkonsentrasjoner, hvorved det begrensende -reagens i analysen blir selve analytten. Dermed, siden analysereagensene er i overskudd, er effekten av variasjoner i disse konsentrasjonene på analyseutførelsen .mindre signifikant enn for eksempel det som oppstår i et konvensjonell konkurrerende immunoassay-format, og en feilmargin i reagenstilset-ningene er dermed tillatt når de i hvertfall gjøres i overskuddsmengder.

Ved å skifte likevekten som beskrevet ovenfor, blir det også mulig å maksimalisere mengden av analytt bundet av merket reagens og dermed optimalisere sensistiviteten til analysen. Når enkel antistoffimmunometrisk fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse blir benyttet, forårsaker tilstedeværelse av uspesifikk binding ikke et bakgrunnssignal som ellers ville redusere sensitiviteten til analysen, slik som oppstår ved konvensjonell sandwich-immunanalyser hvor to antistoffbindingsreaksjoner er involvert, og hvori markøren bundet til et fast fasemateriale eller reagenspartikkel blir målt. Enkel antistoffimmunometrisk fremgangsmåte tillater også å bli anvendt for detektering av analytter som har en enkelt epitope, hvilket ikke er mulig i en sandwich immunoanalyse. Hvor monoklonale monovalente antistoffer blir anvendt i overskudd i en analyse, sammen med andre analyse-reagenser i overskudd, blir produksjonen av en lineær doseresponskurve som letter anvendelsen av et slikt analyse-format til en hensiktsmessig og kalibreringsfremgangsmåte tilveiebragt.

Det bør være klart at selv om de førnevnte analysereagensene kan bli kombinert samtidig for å dannee reaksjonsblandingen som beskrevet ovenfor, kombineres analysereagensene fortrinnsvis sekvensielt for å danne reksjonsblandingen. En første reaksjonsblanding innbefattende testmediumet inneholdende analytten om merket reagens, blir dannet og inkubert i en forutbestemt tidsperiode som er tilstrekkelige for å tillate binding av alt analytt fra testmediumet til merket reagens. Første reaksjonslbanding blir deretter- kombinert med de magnetisk mottagelige reagenspartiklene for dannelsen av en andre reaksjonsblanding og inkkubert i' en forutbestemt tidsperiode for å tillate binding av alle frie formene til merket reagens til de magnetisk mottagelige reagenspartiklene.

Når reaksjonsblandingen er blitt dannet og de hensiktsmessige bindingsreaksjonene er blitt dannet som beskrevet ovenfor, blir en aliquot av reaksjonsblandingen applisert i separeringssonen, og separeringssonen til testanordningen blir nedsenket i reaksjonsblandingen. Separering av den frie formen av det merkede reagens bundet til reagenspartikkelen fra den bundede formen av det merkede reagens, oppnås ved evnen som separeringssonen har til å tilbakeholde eller på annen måte immobilisere reagenspartikkelen. Slik immobilisering av reagenspartikkelen forhindrer dermed migrering inn i detekteringssonen mens, på samme tid, tillater kapillær transport av den bundede formen ut av separeringssonen og inn i detekteringssonen for å tilveiebringe slik separasjon. Evnen som separeringssonen har til å tilbakeholde reagenspartikkelen, vil derfor avhenge av interaksjonen mellom reagenspartikkelen og separeringssonematrisematerialet, hvorved separeringssonen blir vesentlig ugjennomtrengelig som et resultat av en slik interaksjon.

Slik interaksjon mellom reagenspartikkel og separeringssone-matrisematerlale, kan være hvilken som helst interaksjon som gjør separeringssonematrisen vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkelen. Separeringssonematrisematerialet og reagenspartikkelen kan for eksempel bli biologisk modifisert med bindingsmotparter, så som biotin og avidin eller andre spesifikke bindingspartnere o.l., for å tilveiebringe en interaktiv bindingsegenskap hvorved reagenspartikkelen bindes til og blir immobilisert av separeringssonematrisematerialet ved kontakt med denne. Alternativt kan separeringssonematrisematerialet og/eller reagenspartikkelen bli kjemisk modifisert for å tilveiebringe en ønsket bindingsi-nteraksjon derimellom, så som ionisk, hydrofob, kovalt o.l. bindings-interaksjoner.

Reagenspartikkelen blir tilbakeholdt av separeringssonematrisematerialet ved filtrering, hvorved reagenspartikkelen har en slik størrelse som er tilstrekkelig for å infiltrere matrisematerialet til separeringssonen mens den på samme tid blir forhindret av matrisematerialet fra å migrere deri i noen særlig grad. Reagenspartiklene er generelt noe større enn minimum effektiv porestørrelse til separeringssonematrisematerialet og generelt mindre enn den maksimum effektive porestørrelsen derav, som også vil bli beskrevet mere detaljert nedenfor.

Reagenspartikkel

Reagenspartiklene som blir benyttet ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter en vannuoppløselig partikkel hvorpå analytten under bestemming, eller en bindingsanalog derav, har evnen til å bli kovalent bundet, ikke-kovalent bundet (f.eks. fysisk absorpsjon), eller på annen måte immobilisert dertil. Selv om partikkelen generelt er i form av en kule, kan andre konfigurasjoner også bli anvendt og som vil være kompatible med det som er beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Slike konfigurasjoner innbefatter for eksempel staver, fibre, geometriske konfigurasjoner o.l., og uregelmessige konfigurasjoner derav. Generelt er slike partikler som har som største dimensjon, mindre enn 50 mikron, fortrinnsvis fra mellom 0,1 mikron og 20 mikron, mest foretrukket er fra mellom omtrent 0,5 mikron og 3,0 mikron.

Slike partikler kan spesielt bli fremstilt fra materialer så som polystyren, polyakrylater, polyakrylamid eller naturlig forekommende materialer så som polysakkarider, spesielt kryss-bundede polysakkarider,.så som agarose, dekstran, mikrokrystallinsk cellulose, stivelse, fiberformede partikler så som glassfibere og cellulosefibere o.l. Andre materialer innbefatter polyvinyltoluen, eller styrenbutadiaminkopolyme-rer, polyakryleinmikrosfsere, polyuretan, pollen, partikler, sporopollenin, polystyren eller polyvinylnaftalenkjerner omgitt av skall av polylysidylmetakrylat, mikrokrystallinsk cellulose eller kombinasjoner derav, polyvinylalkohol, kopolymer av hydroksyetylmetakrylat og metylakrylat, silikoner og silisiumoksyd, glass, gummi, nylon,, diatome-jord, silisiumoksyd o.l.

Partiklene som blir benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis ensartede, vannsuspenderbare, latekspartikler. Slike partikler er kommersielt tilgjengelige, eller kan bli fremstilt ved emulsjonspolymerisering, eller ved suspensjonspolymerisering, resulterende i partik-kelstørrelser på mindre enn 5 mikron i diameter, eller større enn 5 mikron i diameter, respektivt. I tillegg kan partik-kelstørrelser i området fra 2-20 mikron i diameter effektivt bli produsert ved "svellet emulsjonspolymerisering" (Bangs, L., Uniform Latex Particles, Seragen, Inc., 1984).

Latekspartikler innbefatter hvilke som helst av de mange forskjellige partikulate materialer som er disperserbare eller suspenderbare i vannholdig media uten signifikant gravitasjonsfelling, og som derfor har evnen til å forbli i suspensjon i reaksjonsblanding uten konstant blanding. Dermed blir, sammen med Brownian, bevegelse og høy overflate til volumforhold, effektiv og rask bindingskinetikk forsik-ret .

Hvor det er ønskelig å kovalent binde analytten eller bindingsanalogen derav til partikkelen, bør partikkelen være polyfunksjonell eller ha evnen til å bli polyfunksjonalisert. Mange forskjellige latekspartikler som har slike funksjonelle grupper er kommersielt tilgjengelige, eller kan bli inkorporert i henhold til kovalente. koblingsteknikker som er kjent innenfor fagområdet (se f.eks. Cuatrecasas, J. Biol. Chem., Vol,. 245, s. 3059 (1970)). Funksjonelle grupper innbefatter karboksylsyrer, aldehyder, aminer, amider, aktiverte etylener så som maleimid, hydroksyler, sulfonsyrer, merkaptaner o.l. Kobling av analytter og andre biologiske molekyler til agarose og polyakrylamider er f.eks. beskrevet av J. Biol.

Chem. 245, s. 3059-3065 (1970) og W.B. Jacoby og M. Wilchek, Methods in Enzymology, Vol. 34, Åcademic Press, New York

(1974).

Analytten eller bindingsanalogen derav immobilisert til den magnetisk mottagelige reagense partikkel som beskrevet ovenfor, kan bli valgt for bestemmelse av en hvilken som helst analytt, for hvilket det er en bindingsmotpart tilgjengelig. Analytten er vanligvis ét peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid, nukleinsyre eller annet organisk molekyl som det eksisterer en bindingsmotpart for eller som kan produsere de biologiske systemer eller bli syntetisert. Analytten, i funksjonelle betegnelser, blir vanligvis valgt fra gruppen bestående av antigener, haptener, komplementære polynukleotidsekvenser, hormoner, vitaminer, metaboliter og farmakologiske midler. Vanligvis er analytten et immunologisk-aktivt polypeptid eller protein, som vanligvis har en molekyvekt på mellom omtrent 1.000 og omtrent 10.000.000, slik som et antigent polypeptid eller protein, eller et hapten som har en molekylvekt på mindre enn omtrent 100, og vanligvis omtrent mindre enn 1.500.

Representative polypeptidanalytter er angiotensin I og II, C-peptid, oksytoksin, vasopressin, neurofysin, gastrin, sektrin, bradykinin og glukagon.

Representative proteinanalytter innbefatter klassene protaminer, mukoproteiner, glykoproteiner, globuliner, albuminer, scleroproteiner, fosfoproteiner, histoner, lipoproteiner, kromoproteiner . og nukleoproteiner. Eksempler på spesifikke proteiner er prealbumin, a^-lipoproteiner, human serumalbumin, a^-syreglykoprotein, a^-antitrypsin, a^-glykoprotein, transkortin, tyroksinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, glykosylerte peptidsekvenser så som glykosylert N-terminalpeptidsekvens i beta-subenheten til humant hemoglobin, myoglobulin, ceruloplasmin, otg-mak- roglobulin,3-lipoprotein, erytropoietin, transferrin, hemopeksin, fibrinogen, immunoglobuliner så som IgG, IgM, IgA, IgD og IgE og deres fragmenter, f. eks. Fc og Fatø, kompiimentfaktorer, prolaktin, blodkoagulerende faktorer så som fibrinogen, trombin osv., insulin, melanotropin, somatotropin, tyrotropin, follikkelstimulerende hormon, leutiniserende hormon, enkefaliner, protamin, vevantigener, baginadotropin, humant chorionisk gonadotropin, tyroidstimul-erende hormon, placental laktogen, instrinisk faktor, transkobalamin, serumenzymer så som alkalisk fosfatase, laktisk dehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, cholines-terase, glutaminoksaloeddiktransaminase, glutaminpyruv transaminase og uropepsin, endorfiner, enkefaliner, protamin, vevsantigener, bakterielle antigener, viralantigener så som hepatitt assosierte antigener (f.eks. HbsAg, HBcAg og HBeAg), og svulstmarkører (f.eks. CEA. alfa fetoprotein, prostatisk syrefosfatase, prostatisk spesifikk antigen, neuronspesifikk enolase, estrogenreseptor, CA125, CA19-9 o.l.)

Representative haptenanalytter innbefatter de generelle klasser av medikamenter, metabolitter, hormoner, vitaminer, toksiner og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner innbefatter tyroksin og triiodotyronin. Vitaminer innbefatter vitaminene A, B, f.eks. tiamin, B^g»c»D, E og K og folinsyre. Medikamenter innbefatter antibiotika slik som aminoglykosider, f.eks. gentamicin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, kloromycetin og aktinomycetin; nukleosider og nukleotider som adenosindifosfat (ADP) adenosin trifosfat (ATP), flavinmononukleotid (FMN), nikotinamid adenindinuk-leotid (NAD) og dets fosfatderivat (NADP), tymidin, guanosin og adenosin; prostaglandiner; steroider så som østrogener, f.eks. estriol og estrafiol, sterogener, androgener, digoksin, digitoksigenin, digitoksin, digoksigenin, 12-0-acetyldigoksigin, og adrenokortikalsteroider; og andre så som fenobarbital, fenytoin, primidon, etosuksimid, karbamazepin, valproat, teofyllin, kaffein, propranolo, prokainamid, guinidin, amitryptilin, kortisol, desipramin, disopyramid, dokepin, doksorubicin, nortryptilin, metotreksat, imipramin, lidokain, prokainamid, N-acetylprokainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer. Toksiner innbefattende acetyl T-2 toksin, alfatoksin, koleratoksin, citrinin, cytokalasiner, stafylokokkal enterotoksin.B, HT-2 toksin o.l.

Merket reagens

Merket reagens som blir anvendt i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter en spesifikk bindingspartner for analytten som skal bestemmes, merket med en detekterbar kjemisk gruppe. Den spesifikke bindingspartner er en som har evnen til binding til enten analytten til væsketestmediumet eller til analytten eller bindingsanalogen derav, immobilisert til det magnetisk mottagelige reagenspartiklet.

Den spesifikke bindingspartneren for analytten kan være et helt antistoff, så som en hvilken som helst av klassene og subklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM o.l., eller monovalente og divalente antistoff-fragmenter fra IgG, konvensjonelt kjent som Fab og Fab', og F(ab')2»respektivt. Immunoglobulinkilden for antistoffkomponenten kan bli tilveiebragt på hvilken som helst tilgjengelig måte, så som konvensjonell antiserum og monoklonalteknikker. Antiserum kan bli tilveiebragt ved velkjente teknikker innbefattende immunisering av et dyr, så som en mus, kanin, marsvin eller geit, med et hensiktsmessig immunogen. Immunoglobulinet kan også bli tilveiebragt ved somatiske cellehybreringsteknikker, slike som resulterer i hva som vanligvis blir referert til som monoklonale antistoffer, som også innbefatter bruken av et hensiktsmessig immunogen.

Antistoffet er vanligvis divalent antistoffragment [F(ab')2]eller fortrinnsvis et monovalent antistoffragment .(Fab eller Fab'). Divalente og monovalente IgG antistoffragmenter kan bli tilveiebragt i henhold til kjente fremgangsmåter som benytter standard proteolytisk spaltingsprosedyrer med pepsin eller papain,. For eksempel kan Divalente antistoff-fragmenter [F(ab')2]bli fremstilt ved spalting av hele IgG antistoffet med pepsin [Nisonoff, Methods Med. Res., vol. 10, 132 (1964)], og deretter redusere F(ab')2fragmentet til det korresponderende Fab'-fragmentet med ditiotreitol . Alternativt kan Fab-fragmentene bli tilveiebragt ved papainspalt-ing av IgG [Porter, Biochem, J., vol. 73, 119(1959)].

Den detekterbare kjemiske gruppen til det merkede reagenset kan være et hvilket som helst stoff som har en detekterbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike stoffer er godt utviklet innen immunanalyser, og generelt kan en hvilken som helst markør som er anvendelige I slike metoder bli benyttet i foreliggende oppfinnelse.

Kjemiske grupper som har detekterbare fysiske egenskaper, er de gruppene som blir detektert på basis av deres egne fysiske egenskaper og som ikke krever en kjemisk reaksjon eller interaksjon med annet kjemikal eller stoff for å tilveiebringe et detekterbart signal. Slike grupper innbefatter prinsipielt fluoriserende stoffer så som umbelliferon, fluoreskein, resorufin, forskjellige rodaminer, dansylderiva-ter og aminonaftalensulfonsyre [se Clin. Chem., 25:353

(1979)]; fosforiserende molekyler så som pyren, 4-nitrobiofe-nyl, benzaldehyd, benzofenon eller trivalente metallchelater av dibenzoylmetan (f.eks. Al<+3>, T<+3>); kromoforer så som para-eller ortonitrofenol, fenolftalein, naftol AS , - paranitorani-lid og tymolftalein; radioisotoper så som<3>H,<35>S, 32P, 125j og<14>C; spinnmarkører innbefattende nitroksydrester så som Doxyl, Proksy og Tempo-derivater; eller elektroaktive bestanddeler så som protoner, fluorid, oksygen, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

Kjemiske grupper som har detekterbare kjemiske egenskaper, er slike grupper som blir detektert på basis av deres egen kjemiske reaktivitet eller interaksjon med en detekterende middelkomponent til denne, for å tilveiebringe et detekter bart signal. Slike kjemiske grupper som har detekterbare kjemiske egenskaper, danner ikke et detekterbart produkt eller på annen måte tilveiebringer et detekterbart signal før de reagerer med en slik detekteringsmiddelkomponent og innbefatter enzymatisk aktive grupper så som enzymer (se Clin. Chem., 22:1232(1976 ), US opptrykt p_at. 31.006, og U.K. pat. 2.019.308), enzymsubstrater (se British Pat. Spee. 1.548.741), koenzymer (se US-pat. nr. 4.230.797 og 4.238.565), enzyminhibitorer og aktivatorer, kjemisk luminescensformer, kjemiske katalysatorer, metallkatalysa-torer, medlemmer I enzymveiene, kloroforslukker eller energioverføringspar (se US-pat. nr. 3.996.345; 4.174.384; 4.199,559 og 4.233.401) og spesifikt bindbare ligander så som biotin eller et hapten.

Hvor markøren til ..det merkede reagenset er en detekterbar kjemisk gruppe med en detekterbar kjemisk egenskap, blir detekteringskomponenten til denne inkorporert inn i detekteringssonen til separering og detektering av testanordningen i foreliggende oppfinnelse. En slik detekterbar kjemisk gruppe er fortrinnsvis et enzym, hvorpå det bestemte substratet for den valgte enzymmarkøren blir inkorporert inn i detekteringssonen til testanordningen. Spesielle enzymer som kan bli anvendt innbefatter, men er ikke ment å være begrensende til, g<->D-galaktosidase, peroksydase, glukoseok-sydase, alkalinfosfatase, glukose-6-fosfatdehydrogenase, luciferase, pyruvat kinase, laktase dehydrogenase, galaktose oksydase, tyrosinase, invertase, xantanin oksydase, urease, urikase, alkoholoksydase o.l.

Reagenspartikkelseparering og detekteringstestanordning

Reagenspartikkelseparering og detekteringstestanordning innbefatter en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker og som innbefatter en separeringssone og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand fra og i væsketransportkontakt med separeringssonen. Det vil senere bli beskrevet i større detalj , at separeringssonen og detekteringssonen kan bli sammensatt av og beliggende langs lengden av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale, eller kan være sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer i væskestrømkontakt.

Separeringssonen innbefatter spesielt et fast, porøst matrisemateriale, fortrinnsvis fiberformet, som er vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkel som beskrevet ovenfor, og som er gjennomtrengelig for vannholdige væsker, og minst noen komponenter av en væsketestprøve, f.eks. antigener, haptener, antistoffer o.l. Væsketestmediumet inneholdende analytten som skal bestemmes, kan være en naturlig forekommende eller kunstig dannet væske som antas å inneholde analytt, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning- derav. Slike biologiske væsker innbefatter serum, helt blod, plasma, urin, spytt og amniotisk og cerebrospinale væsker. Valg av et matrisemateriale som er vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkel vil i de fleste tilfeller også være en som har evnen til fjerning av cellulære komponenter så som røde blodceller, hvite blodceller, blodplater o.l. fra slike biologiske væsker.

Separeringssonematrisemateriale blir valgt fra forskjellige fiberformige materialer som er kjent innenfor fagområdet og som har evnen til filtrering av reagenspartikler, og som har evnen til transportering av vannholdige væsker ved kapillær virkning. Separeringssonematrisemateriale bør ha evnen til rask kapillæritet for å konsentrere reagenspartiklene på det stedet hvor kontakt med væskereaksjonsblandingen oppstår er mest foretrukket. Slike matrisematerialer innbefatter, men er ikke ment å være begrensende til, papir, glassfiber, porøs plast, sintret glass eller plast, cellulosepartikler, geler av agarose og andre polymerer, eller vevede materialer så som klede, nylon eller andre polymeriske mesh-materialer, eller andre fiberformede materialer, enten dannet fra naturlig materiale eller syntetisk materiale. US-patent nr. 3.846.247 beksriver f.eks. bruken av filt og vevet eller mattet glassfibere, og anvendelse av syntetisk harpiksull og glassfiberfilt er beskrevet i GB-patent nr. 1,369.1139. Andre fiberformede matrisematerialer er også beskrevet i US-PS 3.802.842, 3.809.605, 3.897.214 og 3.987.214.

De forskjellige matrisematerialene som blir benyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også bli behandlet med stoffer som er kjent innenfor fagområdet for å lette permebiliteten av den bundede formen av merket reagens. For eksempel detergenter så som Tween 20, Triton X-100 eller natriumdodecylsulfat kan bli satt til enten matrisematerialene eller til væsketestprøven eller reaksjonsblandingen. På lignende måte kan protein så som bovinserumalbumin, laktal-bumin eller gammaglobulin bli satt til væsketestprøven, testanordningen eller til reaksjonsblandingen.

Fagmannen vil forstå at evnen som separeringssonematrisematerialet har til å filtrere reagenspartikkelen vil avhenge av størrelsen og formen av reagenspartikkelen og den effektive porestørrelsen eller formen til det bestemte materialet som separeringssonen er laget av. Matrisematerialet til separeringssonen Innbefatter spesielt en minimum porestørrelse som i hvertfall er noe mindre enn størrelsen på den bestemte latekspartikkelen som er valgt, hvorved reagenspartikkelen ved kontakt med separeringssonen blir forhindret fra migrering ut av separeringssonen og inn i' detekteringssonen. For at reagenspartikkelen skal bli fanget av separerIngssonematrisen, må matrisematerialet fortrinnsvis ha en maksimum effektiv pore_størrelse i en begrenset grad som er større enn latekspartikkelen, for å tillate infiltrering av latekspartikkelen som beskrevet ovenfor. Dermed kan seleksjon av et hensiktsmessig separeringssonematrisemateriale bli gjort av fagmannen i henhold til hensynet som er beskrevet ovenfor.

Hvor separeringssonen og detekteringssonen er sammensatt av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale som beskrevet ovenfor, vil detekteringssonen selvfølgelig være sammensatt av det samme matrisematerialet og ha de samme karaktertrek-kene som separeringssonematrisematerialet. Det er derimot underforstått at i de tilfeller det er ønskelig at separeringssonen og detekteringssonen er sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer, kan slike, materialer være like eller forskjellige, hvorved detekteringssonematrisematerialet kan bli valgt fra de før nevnte matr i semater ialene. Hvor slike matrisematerialer er forskjellige, må detekteringssonematrisematerialet minst ha evnen til transportering av vannholdige væsker ved kapillærvirkning, men trenger ikke nødvendigvis å være vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikkel slik som separeringssonematrisematerialet må være.

Ifølge foreliggende oppfinnelse mottar detekteringssonen den bundede formen til det merkede reagenset som migrerer ut av separeringssonen og inn i detekteringssonen ved kapillær-virkningen. Når den er I detekteringssonen, blir det detekterbare signalet tilveiebragt av markøren til den bundede formen av det merkede reagenset målt og korrelert til mengden av tilstedeværende analytt i væsketestprøven. Dannelsen av det detekterbare signalet vil selvfølgelig være avhengig av den bestemte markøren som blir anvendt, dvs. den som enten har en detekterbar fysisk egenskap eller en detekterbar kjemisk egenskap. For eksempel hvor markøren har en detekterbar fysisk egenskap, tilveiebringer markøren til den bundede formen et detekterbart signal som, når det er i detekteringssonen, lett kan bli målt uten å reagere med en detekterende komponent som hører til denne for å tilveiebringe det detekterbare signalet i detekteringssonen. På den annen side, hvor markøren har en detekterbar kjemisk egenskap, blir detekteringssonen inkorporert med den detekterende komponenten for markøren, slik som et enzymsubstrat I de tilfeller hvor markøren er et enzym som reagerer med markøren for å tilveiebringe det detekterbare signalet i detekteringssonen. I begge tilfellene blir signalet som blir dannet av markøren til den bundede formen i detekteringssonen målt med et hensiktsmessig instrument, så som et spektrofotometer, spesielt et Seralyzer refletance fotometer (Miles Diagnostics, Elkhart, IN, USA) som lett kan tilpasses til testanordningen.

I henhold til en foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelse (fig. 1), er separeringssonen og detekteringssonen beliggende ved fysisk distinkte områder langs lengden av en forlenget strimmel sammensatt av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale som er vesentlig ugjennomtrengelig for reagenspartikler som beskrevet ovenfor. Separeringssonen og detekteringssonen er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra, og i væsketransportkontakt med hverandre, langs lengden av- strimmelen for å tillate separering av reagenspartikkelen ved en ende av strimmelen, og detektering av den bundne formen av det merkede reagenset i den andre enden av strimmelen, respektivt.

Siden separering av den magnetisk mottagelige reagenspartikkelen fra den bundede formen av det merkede reagenset fremkommer fra evnen som matrisematerialet har til å transportere vannholdige væsker ved kapillærvlrkningen, blir slik separering best oppnådd ved transportering av et relativt stort volum av væsketestmedium. gjennom et relativt smalt område. Dermed er vidden av den forlengede strimmelen generelt, men er ikke ment å være begrensende til, mindre enn 20 mm vidt, fortrinnsvis fra mellom omtrent 1,0 mm og 23 mm vidt, og fra mellom omtrent 4,0 mm til 8,0 mm vidde er mest foretrukket. Lengden av strimmelen er vanligvis, men er ikke begrenset til, fra mellom omtrent 2,0 cm og 40 cm lang, fortrinnsvis fra mellom omtrent 4,0 cm til 25 cm lang, mest foretrukket er lengder fra mellom 6,0 cm til 20 cm.

I henhold til en annen foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelse (fig. 2), er separeringssonen og detek teringssonen sammensatt av individuelle, fysisk bestemte deler likt beliggende langs lengden av en forlenget strimmel og sammensatt av fysisk bestemte matrisematerialer. De individuelle matrisematerialene, som kan være like eller forskjellige som beskrevet ovenfor, er beliggende 1 en ende-mot-ende-forhold hvorved disse endene er i væsketransportkontakt for å tillate migrering av den bundede formen av det merkede reagens inn i detekteringssonen. En kilde for å påføre et magnetisk felt er på lignende måte plassert under separeringssonen for å tilveiebringe separering derav fra reagenspartikkelen som beskrevet ovenfor. Selv om de individuelle matrisematerialene fortrinnsvis danner en forlenget strimmel som har de dimensjonene som er beskrevet ovenfor, kan de individuelle matrisematerialene som danner separeringssonen og detekteringssonen variere i lengde, hvorved lengden av en kan være forskjellig fra, og ikke nødvendigvis, lengden til den andre.

I henhold til en annen foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelse (fig. 3), er separeringssonen og detekteringssonen sammensatt av fysisk distinkte matrisematerialer som kan være like eller forskjellige, lagt eller på annen måte plassert relativt til hvernadre i form av lag i væsketransportkontakt. Slike lag kan bli opprettholdt i et laminært forhold ved bruk av klebestoffet kjent innen fagområder som tillater vannholdig væskepassasje og komponenter derav, som beskrevet ovenfor, mellom- lagene for å tillate separering av reagenspartikkelen fra den bundede formen. Selv om de respektive lagene generelt har lik lengde og bredde, dvs., firkantet, kan andre kompatible konfigurasjoner bli valgt av fagmannen.

I de tilfeller hvor en lagdelt testanordning som beskrevet ovenfor blir benyttet med et merket reagens innbefattende en detekterbar kjemisk gruppe som har en detekterbar fysisk egenskap, er det videre ønskelig å innbefatte en bestrå-r 1ingsblokkerende sone eller lag beliggende mellom separer ingslaget og detekteringslaget. Ved inkorporering av slike lag mellom separerpingslaget og detekteringslaget, ville et hvilket som helst signal som blir dannet fra den bundede formen i detekteringslaget bli detektert uten et interfererende signal som blir dannet av det merkede reagens bundet til reagenspartiklene i separeringslaget som et resultat av at et ikke-overførende lag er inkorporert derimellom. På denne måten kan signalet produsert fra detekterIngslaget bli detektert, målt og korrelert til mengden av analytt i væsketestmediumet uten et interfererende signal som er dnanet fra separeringslaget.

Det kan alternativt være ønskelig å anvende bestrålingsblok-kerende midler som ville bli inkorporert inn i separeringslaget. Pigmenter som medfører ugjennomsiktighet, så som titandioksy, bariumsulfat eller sinkoksyd, kan bli anvendt for dette formål. Slør (blush-polymerer) kan også bli anvendt, enten uavhengig eller Inkorporert med pigment for å forsterke bestrålIngs-blokker ing eller andre egenskaper. Slike bestrålings-blokkerende lag og midler er kjent innenfor fagområdet og innbefatter de som er beskrevet i US-patent nr. 4.042.335 og 4.55.384.

Tykkelsen av separeringssonen og detekterinssonematrise-materlalene er beskrevet ovenfor, og likeledes grad ay gjennomtrengelighet derigjennom, vil variere avhengig av den aktuelle anvendelse. Generelt er en tørr tykkelse fra mellom omtrent 0,1 mm og 2,0 mm foretrukket, selv om tykkelser som varierer enda mere kan bli valgt av fagmannen når det som er beskrevet foran blir tatt i betraktning og avhengig av de spesielle omstendighetene ved anvendelsen. Separeringssonen og detekteringssone-matrisematerialene blir fortrinnsvis lagt eller på annen måte plassert oppå en fast, ikke-porøs støtteanordning med et hensiktsmessig klebestoff. Forskjellige organiske og uorganiske stoffer, både naturlige og syntetiske og kombinasjsoner derav, kan bli benyttet forutsatt at bare støtte ikke interfererer med den kapillære virkningen av strimmelen eller de ikke-spesifikke binddings-analysekomponentene eller interfere med det signaldannende systemet. Illustrative polymerer innbefatter polyetylen, polypropylen, poly(4-metylbuten), polystyren, polymet-akrylat, poly(etylenterftalat) , nylon, poly(vinylbutyrat), glass, keramikk, metaller o.l.

Testkitt

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et testkitt innbefattende alle essensielle elementer som er nødvendige for å utføre immunanalysemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse. Testkittet er presentert i en kommersiell pakket form, i en komposisjon eller sammenblanding hvor kompatabili-teten av reagensene vil tillate, i en testanordningskon-figurasjon, eller vanligvis som et testkitt, dvs. en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere, anordninger eller lignende som inneholder de nødvendige reagensene og vanligvis Innbefatter skrevne instruksjoner for utføringen av immunanalysen.

Testkittet vil Ihvertfall innbefatte (1) reagenspartikler innbefattende analytt eller en bindingsanalog derav som er immobilisert til uoppløselige mikropartikler, fortrinnsvis latekspartikler, (2) et merket reagens, innbefattende en merket form av en spesifikk bindingspartner for analyttentfortrinnsvis et moknovalent antistoff-fragment avledet fra et monoklonalt antistoff til analysen som skal bestemmes, merket med et enzym, og (3) reagenspartlkkelseparerlngs- og detekteringstestanordningen til. foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis inkorporert med et substrat for enzymet som danner et detekterbart signal som kan bli målt og korrelert i mengden analytt som er tilstede i væsketestprøven.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli illustrert, men ikke ment å være begrensende, ved følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

Separering av latekspartikler på et papir-matrisematerlale

(a) For å demonstrere evnen som et papirmatrisemateriale har for å separere latekspartikler fra et vannholdig væsketestmedium, hl ir et 15,2 cm x 5,1 cm Whatman 54 ark (Whatman, Ltd. Maidstone, England) impregnert med 5,0 mM MgClg i 0,1 M bicin (pH 8,3), lufttørket og deretter skåret til 2,0 cm x 0,80 cm forlengede strimler. En 20,0 jjl aliquot av en 2, 5%

(vekt/volum) vannholdig suspensjon av røde polystyrenlateks-partikler med 3,0 yim diameter (Polybead, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) i vann, ble pipettert i midten av en strimmel omtrent 0,4 cm fra en av endene identifisert som separeringssone, og hvor den andre enden er identifisert som detekteringssonen. Selv om både separeringssonen og detekteringssonen ble vætet med vannet til suspensjonene, var latekspartiklene bare visuelt observert ved appliserings-stedet, dvs. separeringssonen, og migrerte ikke inn i detekteringssonen. (b) For å demonstrere evnen som partiklene som har en diameter som er tilstrekkelig mindre enn minimumseffektive porestørrelsen til matrisematerialet har til å migrere derigjennom, ble førnevnte latekspartikkelsuspensjon fremstilt for røde latekspartikler med 1,0 diameter ble anvendt og påført en annen forlenget strimmel som beskrevet ovenfor.. I dette tilfellet ble latekspartiklene visuelt observert i detekteringssonen for å indikere at partiklene ikke ble holdt tilbake av papirmatrisematerialet.

EKSEMPEL 2

Separering av latekspartikler på et glassfiber-matrisemateriale.

For å demonstrere evnen som et glassf ibermatrisemat-eriale har til å separere latekspartikler fra et vannholdig væsketestmedium, ble 15,2 cm x 5,1 cm Whatman GFA glassfiberark (Whatman, Ltd., Maidstone, England) skåret til 0,5 cm x 2,0 cm forlengede strimler og plassert på enden av 0,5 cm x 8,0 cm forlengede strimler (0,04 cm tykke) av polystyren (Trycite, Dow Chemical Co., Midland, MI, USA) med dobbeltsidig limbånd (Part Nr. 297MR, 3M Company, St. Paul, MN, USA). En av disse endene ble identifisert som separeringssone og den andre enden ble identifisert som detekteringssone.

Polystyrenlatekspartiklene (Polybead, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) som har gjennomsnittlig diametere på 0,48 pm, 0,83 pm og 3,0 pm ble derivatisert med antistoff-protein og<125>j merket protein A ved først å danne 2,5% suspensjoner derav (vekt/volum) i 0,1 M Tris-Cl pH 7,0 med 5,0 mg/mL bovint gammaglobulin (fraksjon II, Sigma, St. Louis, MO, USA). Partiklene ble inkubert ved 25°C i 30 minutter med sonikering. Gammaglobulinoppløsningen ble fjernet og partiklene ble vasket fire ganger med en vaskebuffer innbefattende 0,1% bovint serumalbumin, 0,1% Tween 20, og 50 mM Tris-Cl (pH 7,0). Partiklene ble resuspendert til 2,5%

(vekt/volum) i vaskebuffer og 20,0 pL 2,0 pCi<125>1-protein A (30,0 pg/mL, E. I. duPont de Memours & Co., Inc., NEN Research Products, Boston, MA, USA) ble tilsatt pr. ml latekssuspensjon. Latekssuspensjonene ble inkubert med<125>I-protein A i en time ved romtemperatur og dekantert. De ble

deretter vasket tre ganger med vaskevæsken beskrevet ovenfor, og<l25>I-protein A belagte latekspartikler ble lagret og anvendt ved 2,5% (vekt/volum) i vaskebuffer.

Hver av "de ^<2>^I-protein A belagte latekspartikkelprepratene ble vasket tre ganger på de glassfiberforlengede strimlene beskrevet ovenfor. I denne fremgangsmåten ble 30,0 jjL av suspensjonen pipettert i separeringssonen til en glassfiber-forlenget strimmel. Etter tredve sekunder ble den forlengede strimmelen skåret i to og<125>I-disintegrasjoner fra hver halvpart ble målt i ett minutt i en gammateller. Prosent av

•^2^I-protein A merkede partikler som forble i separeringssonen til den forlengede strimmelen ble bestemt for hver prøve som tellinger pr. minutt (cpm) i separeringssonen delt

på, cpm i separeringssonen pluss cpm i detekteringssonen, som beskrevet i tabell 1.

EKSEMPEL 3

Preparering av reagenspartikkelseparering

og detekteringstestanordning og bruk derav

i en immunanalyse

(a) Testanordning

Et 3,81 cm x 15,24 cm Whatman GFA glassfiberark ble impregnert ved nedsenking i 10,0 mM resorufin-galaktosld (preparert i henhold til metoden beskrevet i EP-PS publikasjon nr. 156.347) og 1,0% polystyren i dimetylformamid og tørket ved påført luft ved 50"C i 10 minutter. Dobbeltsidig limbånd ble påført den ene siden av det Impregnerte glassfiberarket, og deretter skåret i 2,0 cm vide forlengede strimler. De forlengede strimlene ble laminert i den ene enden av 8,3 cm x 2,0 cm polystyrenarkene (0,4 cm tykk), og deretter skåret i 8,3 cm x 0,5 cm forlengede strimler. De forlengede strimlene ble lagret i brune glassflasker med et tørkemiddel ved romtemperatur.

(b) Reagenspartikler

3-hydroksy-(5-karboksypentyl)-karbamoyldIgitoksygenin (0,132 mmol ) blir satt til 0,132 mmol isobutylklorformat og 0,132 mmol trietylamin i 5,0 mL dimetylformamid ved -10°C til -20°C under argon, og deretter dråpevis tilsatt til en oppløsning av bovinserumalbumin (110,0 mg/10,0 mL) i. 0,1 L natrium-pyrofosfat (pH 8,5) med omfattende omrøring ved 0-4°C i en

periode på 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter sonikert i en time. Etter henstand ved 4<0>C overnatt, ble reaksjonsblandingen justert til pH 7,0, applisert på en 45,0 cm x 2,5 cm Sephadex-kolonne (Sigma, St. Louis, MO, USA) ekvilibrert med 25,0 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0) og eluert med 25,0 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0).

Karboksylatmodifiserte polystyrenparamagnetiske latekspartikler (1,3 pm gjennomsnittlig diameter, 0,02-0,05 mequiv. av karboksylat/g partikler; Seragen, Inc., Indianapolis, IN, USA) blir skylt to ganger med vann og resuspendert ved 5,0%

(vekt/volum) i 0,1 M boratbuffer (pH 8,5) som inneholder 0,05 mg/mL BSA-digitoksygeninreagens beskrevet ovenfor. Suspensjonen blir inkubert i 20 timer og vasket tre ganger med 20,0 mM natriumfosfat, 0,1% Tween 20 (pH 7,0), to ganger i 1,0% natriumdodecylsulfat i 30 minutter ved 60° C, én gang i 20,0 mM natriumfosfat, 0,1% Tween 20 (pH 7,0), og to ganger i etanol. De paramagnetiske latekspartiklene blir lagret ved 5,0% (vekt/volum) i etanol ved 4 ° C. Etanolen blir dekantert og de paramagnetiske latekspartiklene blir resuspendert til 1,0% (vekt/volum) i reagensbuffer (0,05 M natriumfosfat, 0,05 M NaCl, 1,0 mM MgCl2, 0,02% NaN3og 0,01% bovint serumalbumin, pH 7,4) før bruk.

(c) Immunoanalyse og anvendelse av testanordningen

En immunoanalysereaksjonsblanding blir dannet inneholdende digoksin kalibratorserum (Optlmate liquld analyzer, Miles Diagnostics, Elkhart, IN, USA) fortynnet fem ganger i reagensbufferen beskrevet ovenfor, inneholdende et merket reagens (1,0 mM av et vesentlig rent anti-digoksin/p-D-galaktosidasemonokonjugatpreparat inneholdende et enkelt monovalent antistoff-fragment avledet fra et anti-digoksin-monoklonalt antistoff koblet til et enkelt p-D-galaktosidase-molekyl). Etter 5 minutter ved romtemperatur, blir et likt volum 2,0% (vekt/volum) av paramagnetisk lateksreagens tilsatt og inkubert i 3 minutter ved romtemperatur.

En forlenget strimmel som beskrevet ovenfor ble plassert på strimmelholderen til en Seralyzer refleksjonsfotometer (Miles Diagnostics, Elkhart, IN, USA) og 30,0 pl av reaksjonsblandingen beskrevet ovenfor ble applisert i separeringssonen til den forlengede strimmel. Signalet som ble dannet av det merkede reagens bundet til serum digoksirr som migrerte inn i detekteringssonen, ble målt , _ ieks1onskoeffisient)2 [K/S hastighet signalrespons = [\ x ^^jCnskoef f i slengi' bestemt mellom 70-90 sekunder etter plassering av en aliquot på den elongerte strimmelen] som gitt i tabell 2.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for spesifikk bindingsanalysebestemming av en analytt i et vannholdig væsketestmedium ved anvendelse av (i) et reagenspartikkel innbefattende analyt-ten eller en bindingsanalog derav som er immobilisert til en uoppløselig partikkel, (ii) et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe, og (ili) en reagenspartikkelseparerings- og detekteringstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker og som innbefatter en separeringssone som er vesentlig ugjennomtrengelig for nevnte reagenspartikkel og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone, karakterisert ved at man: (a) danner en vannholdig væskereakskjonsblanding innbefattende nevnte testmedium, nevnte merkede reagens og nevnte merkede reagenspartikkel i en mengde som er i overskudd av det som har evnen til å bindes til alt merket reagens som ikke blir bundet til nevnte analytt; (b) applisere nevnte reaksjonsblanding i nevnte separeringssone til nevnte testanordning, hvorved reagenspartikkelen blir holdt tilbake i nevnte separeringssone og det merkede reagens som ikke er bundet til nevnte reagenspartikkel blir transportert inn i detekteringssonen av væskemediumet; og (c) måler nevnte detekterbare kjemiske gruppe til merket reagens i detekteringssonen av testanordningen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man danner nevnte vannholdige væskereaksjonsbland-ing ved (i) danner en første reaksjonsblanding innbefattende nevnte testmedium og nevnte merkede reagens; (ii) inkuberer nevnte første reaksjonsblanding i en forutbestemt tidsperiode; (lii) danner en andre reaksjonsblanding innbefattende første reaksjonsblanding og reagenspartikkel; og (iv) inkuberer andre reaksjonsblanding i en forutbestemt tidsperiode .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, - karakterisert ved at nevnte uoppløste partikkel som kan anvendes er en vannsuspenderbar latekspartikkel.

4 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at nevnte testanordning som man anvender innbefatter en forlenget strimmel sammensatt av et fast, porøst matrisemateriale som har evnen til å transportere vannholdige væsker langs lengden derav ved kapillær virkning, og hvor nevnte separerings- og detek-teringssoner er beliggende ved fysisk distinkte områder langs nevnte strimmel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte forlengede strimmel som man anvender er sammensatt av et enkelt, kontinuerlig matrisemateriale som er vesentlig ugjennomtrengelig for nenvte reagenspartikkel.

6 . Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte matrisemateriale som anvendes er et fiberformet materiale, fortrinnsvis papir, glass, cellulose eller et vevet stoff.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 6, karakterisert ved at nevnte fysiske distinkte områdene til nevnte strimmel innbefattende nevnte separerings- og detekteringssonene som man anvender, " er sammensatt av fysisk distinkte matrisemateriale i væsketransportkontakt .

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at nevnte detekterbare kjemiske gruppe som man anvender har en detekterbar kjemisk egenskap og reagerer med en detekteringsmiddelkomponent for å tilveiebringe et detekterbart signal, og nevnte detekteringssone er inkorporert med nevnte detekteringsmiddelkomponent .

9. Reagenspartikkelseparering og detekteringstestanordning for anvendelse ved bestemming av en analytt i en vannholdig væsketestprøve hvori en spesifikk bindingsanalysereaksjons-blanding blir dannet innbefattende binding blandt (i) analytten (ii) et reagenspartikkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav som er immobilisert til en uoppløselig partikkel, og (ili) et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe, karakterisert ved at den innbefatter: en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker og som innbefatter en separeringssone som er vesentlig ugjennomtrengelig for nevnte reagenspartikkel og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone.

10. Testkitt for spesifikk bindingsanalysebestemming av en analytt i en vannholdig væsketestprøve, karakterisert ved at den Innbefatter: (a) en reagenspartikkel innbefattende analytten eller en bindingsanalog derav immobilisert til en uoppløselig partikkel; (b) et merket reagens innbefattende en spesifikk bindingspartner for analytten merket med en detekterbar kjemisk gruppe; og (c) en reagenspartikkelseparerings- og detekteringstestanordning innbefattende en fast, porøs matrise som har evnen til transportering av vannholdige væsker _og som innbefatter en separeringssone som er vesentlig ugjennomtrengelig for nevnte reagenspartikkel og en detekteringssone som er beliggende i en forutbestemt avstand bort fra og i væsketransportkontakt med nevnte separeringssone.