JPH02110374A - 定性酵素アッセイの視覚的識別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素イムノアッセイ、特にβ−ガラクトシダ
ーゼ相補的アッセイに関する。

〔背　景〕

イムノアッセイは、広範囲の種類の分析物を検出するた
めに多くの異なった方法論に基づいて開発されて来た。

アッセイ方法のほとんどは、熟練者及び実験装置を必要
とする。野外で行なうことができるアッセイの必要性が
存在するけれども、数種類のアッセイのみが好結果をも
って適合されて来た。たとえば、妊娠の徴候を示すホル
モンのレベルを決定するための酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）が、市販されて来た。しかしながら、
他のタイプの適用、たとえば調節物質についての尿、汚
染物についての水又は抗生物質についてのミルクを試験
するためのアッセイの必要性が存在する。早く且つ容易
に行なうことができ、そして準備し、そして分析する装
置をほとんど又はまったく必要としない他に、このアッ
セイは感度が高く且つ正確であるべきである。

〔関連文献〕

変性されたβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び酵素受
容体は、化学合成及び組換え方法により調製されて来た
。変性されたフラグメントは相補的に基づいてβ−ガラ
クトシダーゼ活性を保持し、そしてフラグメントの生成
及びフラグメントへの分析物の結合を促進する。たとえ
ばアメリカ特許第４．７０８．９２９号及び本明細書に
引用された文献を参照のこと。

〔発明の要約〕

サンプル中において特異的結合対（ｓｂｓ）のメンバー
である分析物の存在を決定するためのβ−ガラクトシダ
ーゼ相補的アッセイが提供され、このアッセイはこれら
のサンプル間の視覚的識別を可能にし、ここで分析物は
予定された限界濃度以上で存在する。その方法は、ｓｂ
ｐ複合体含有アッセイ媒体を形成するために、サンプル
と疎水性酵素供与体−（ＥＤ−）分析物接合体及びｓｂ
ｐの相補的メンバー、とを混合することを含んで成る。

少量のアッセイ媒体が、吸収性固体支持体に付着された
酵素受容体（ＥＡ）上に滴下され、続いて酵素基質溶液
による処理を伴う。サンプル中の分析物濃度が限界値以
下である場合、限界値以上である分析物濃度に比べて実
質的に大きな部分が検出される。このアッセイは特に、
野外試験用途、たとえばミルク中の抗生物質の存在、水
中の毒素の存在又は血清又は尿中の薬物の存在を決定す
ることにおいて有用である。その方法を容易にするキッ
トもまた提供される。

〔特定の態様の記載〕

限界濃度の分析物〔該分析物は特異的結合対（ｓｂｐ）
のメンバーである〕の存在を検出するためのβ−ガラク
トシダーゼ相補的アッセイ方法が提供される。その方法
は、ＥＡ紙を形成するために、吸収性固体支持体に付着
されたβ−ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）を使用
する。サンプルは、ｓｂｐメンバー間の複合体を含むア
ッセイ媒体を形成するために、サンプル中に存在するい
づれかの分析物及び接合体が前記相補的な特異的結合対
メンバーと競争的に反応するのに十分な時間、疎水性酵
素供与体−（ＥＤ−）分析物の接合体及び前記相補的な
特異的結合対メンバーと共に混合される。少量のアッセ
イ媒体がＥＡ紙上に滴下され、そしてその適用部位から
放射状に内側からはじきとばされた形に成る。次にその
ＥＡ紙を、酵素基質溶液と組合せる。分析物が限界濃度
以下である場合、前記限界濃度以上である前記分析物に
比べて実質的に大きな部分が検出できる。

本発明のアッセイ方法は、従来技術のイムノアッセイ又
は相補的方法により決定されるいづれかの分析物を検出
するために使用され得る。そのアッセイ方法は、分析物
を含む水性媒体と共に使用され得る。分析物は、免疫原
、たとえば高分子量（ＭＷ＞１０００）のペプチド、タ
ンパク質又は炭水化物であるが、しかし通常、ハブテン
（ＭＷ＜１０００）　、たとえば薬物又は毒素ではない
。この方法は、所望により野外で試験される分析物のた
めに、たとえば体液、たとえば尿、血清又は血漿中に存
在する調節された物質の検出のために特に適切である。

その方法はまた、ミルク中の抗生物質又は水又は土壌サ
ンプル中の毒素、たとえば殺菌剤、ジオキシン、パラチ
オン又は同様のものを検出するためにも使用される。水
溶液にサンプルを供給し、そして粒状物を除去する以外
、サンプルの前処理は通常、本発明のアッセイ方法のた
めには行なわれないであろう。

酵素供与体及び酵素受容体は、β−ガラクトシダーゼの
部分配列である。いづれかの部分配列が、配列の生成、
分析物の結合又は同様のことを促進するために突然変異
され得る。酵素受容体及び酵素供与体−分析物接合体は
、−緒にされる場合、活性酵素複合体を形成することに
よって特徴づけられる。酵素供与体−分析物接合体が相
補的な特異的結合対メンバーに結合される場合、観察さ
れる酵素活性は、その相補的な特異的結合対メンバーの
不在下で観察される活性と異なる。従って、酵素供与体
−分析物接合体と結合する特異的結合対の相補的メンバ
ーの有効性は、媒体中の分析物の盪と共に変化するであ
ろう。

β−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び受容体は、分析物
及び酵素供与体−分析物接合体であるものとして、アメ
リカ特許第４．７０８．９２９号に記載され、そしてこ
れを引用により本明細書に組込む。係続出願であるアメ
リカ特許出願第１５１．４１２号（１９８８年２月２日
に提出された）は、相補的アッセイのための反応条件及
び試薬を記載する。その出願に記載されるアッセイの条
件は、本発明に適用できる。

β−ガラクトシダーゼＥＡは、ＥＡ紙を形成するために
吸収性固体支持体に付着されるであろう。

その支持体は十分に堅＜ＥＡを結合する吸収性物質であ
るので、支持体が水溶液中に含浸される場合、ＥＡは支
持体に付着され、そしてこの結合は相補性を妨げないで
あろう。さらに、支持体は十分に疎水性環境を付与し、
その結果、支持体に適用される疎水性ＥＤ−分析物接合
体はその適用部分から移動せず、又は短い距離移動する
に過ぎないであろう。本発明のイムノアッセイ方法に使
用される多くの吸収性固体支持体が文献中に報告され、
そしてその支持体として、変性されたセルロース性支持
体、たとえば紙、ニトロセルロース及び所望により非セ
ルロース性支持体、たとえばナイロン膜、ポリエステル
基材の膜及びポリアミド基材の膜を列挙することができ
る。便利には、その固体支持体は、化学的反応性膜、た
とえば処理ナイロン膜であり、これはその膜と共にイン
キュベートされるタンパク質を共有結合又は非共有結合
するであろう。タンパク質のアミノ基との結合の形成を
通してタンパク質を共有結合することが報告されるナイ
ロン膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＣｏｒｐｏｒａｔＩｏ
ｎ（“Ｉ＋ｎｍｏｂｉｌｏｎ”）　　及びＦａｌｌ　　
ＣｏｒｐｏｒａｔＩｏｎ　　（”Ｉｍｍｕｎｏ−ｄｙｎ
ｅ”）から入手できる。Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ膜は、膜
上に付着されたＥＡがＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜よりもＩｍ
ｍｕｎｏｄｙｎｅ膜による貯蔵に基づいて長期間安定す
るので好ましい。

酵素受容体は、支持物質にタンパク質を共有結合又は非
共有結合するために従来の手段により固体支持体に結合
されるであろう。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜へのＥＡの結合
のための好ましい方法は、実験部分に詳しく説明される
。通常、酵素受容体は、固体支持体の全表面を被覆する
であろう。しかしながら、ＥＡは前記紙の選択された部
分に適用される。

所望により、ＥＡは実質的に一定した濃度でその紙の表
面上に存在するであろう。酵素受容体の結合の後、その
紙を、所望により界面活性剤を含む水性緩衝溶液により
注意して洗浄し、その紙に堅く結合されないＥＡを除去
する。ＥＡの結合の後、その紙をブロッキング剤、たと
えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はカゼインにより
被覆し、そのＥＡ紙へのタンパク質性物質の非特異的結
合を最少にする。調製した後、そのＥＡ紙を吸着乾燥せ
しめ、そして所望により真空デシケータ−中に貯蔵する
。乾燥条件下でその紙を貯蔵することは、ＥＡの安定性
を増強することが見出された。その紙は室温で貯蔵する
か又は長期安定性のためには冷蔵庫中に貯蔵することが
できる。

その相補的な特異的結合対メンバーへの結合の不在下で
ＥＡ紙に適用される部分に存続するのに十分に疎水性で
あるＥＤ−分析物接合体が使用される。しかしながら、
その接合体が特異的結合対の相補的メンバーと組合され
る場合、その接合体は適用部位から実質的に離れて放射
状に移動し、そしてこの距離は、酵素基質への暴露の後
、実質的に大きな検出可能部分を明瞭に示すであろう。

所望により、その接合体は、その特異的結合対メンバー
と複合体化される場合、その適用の部位から少なくとも
２倍、通常４倍、好ましくは溶媒前部まで放射状に内側
から移動するであろう。

ＥＤに結合される分析物又は分析類似体は、陽性及び陰
性のアッセイ結果間に識別を付与するために十分に疎水
性の接合体を生成することができる。そうでない場合、
１又はそれ以上の疎水性置換基が疎水性接合体を付与す
るためにＥＤに結合され得る。所望により、疎水性原子
、たとえばＣ１Ｈ，Ｓ又はハロゲンは、ＥＤ上に合計置
換基（分析物を含む）の少なくとも約５０重量％、通常
少なくとも約６０重量％を含有するであろう。いづれか
追加の置換基が、分析物結合部位と同じ部位又は異なっ
た部位でＥＤに結合され得る。分析物と同じ部位で結合
される場合、置換基は分析物にのみ結合されるか、又は
ＥＤに分析物を結合する、少なくとも約６個の炭素原子
の結合基として作用することもできる。その置換基は、
１又は複数の疎水性成分、たとえばコレステロール、脂
肪酸、Ｔ３又はＴ４であり得る。

接合体が陽性及び陰性サンプル間を識別するために十分
に疎水性であるかどうかを決定するための典型的な機能
的方法は、実験部分に詳しく説明されている。これらの
方法は、相補的な特異的結合対メンバーを有する及びそ
れを有さないアッセイ媒体中でブレインキュベートした
後、ＥＡ繊紙上スポットされる場合に移動する接合体の
距離の差異の決定に基づかれている。

イムノアッセイに使用され得る多くの特異的結合対が知
られている。接合体への相補的メンバーの結合がＥＡ紙
の表面上で補足する接合体の能力の差異を提供する場合
、前記特異的対のいづれかのメンバーが分析物として作
用することができる。

通常、特異的結合対の少なくとも１つのメンバーは、タ
ンパク質又はタンパク質フラグメント、たとえば抗原／
抗体、レクチン／糖、等であろう。

通常、その対は、受容体／リガンド対（この際リガンド
は分析物として作用する）であろう。受容体として、抗
体（ポリクローナル又はモノクローナルのいづれか）が
通常使用されるであろう。他方、他の受容体／リガンド
対、たとえばビタミンＢ−１２−内因子及び葉酸−フオ
レート結合タンパク質が使用され得る。

アッセイ媒体を形成するためにサンプルと組合した後、
酵素供与体−分析物接合体の濃度は通常、約１０Ｍ〜約
６０ｎＭ、より普通には約１ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲で
存在するであろう。酵素受容体は通常、ＥＡ繊紙上実質
的に過剰に存在するであろう。酵素供与体−分析物接合
体：酵素受容体のモル比は通常、１；５０〜１：１０，
０００、普通１：１００〜１：２０００であろう。酵素
供与体−分析物接合体及び相補的な特異的結合対メンバ
ーの濃度は、予定された限界濃度の分析物がサンプル中
に存在する場合、分析物受容体に結合されないＥＤ−分
析物接合体を提供する。

ＥＤ−分析物接合体及びその相補的な特異的結合対メン
バーの最適比は、分析物の予定された限界濃度を決定し
、そしてまたバックグラウンド活性を最少にするために
ＥＡの存在下で決定されるであろう。バックグラウンド
レベルに関する応答は最適化される。濃度を最適化する
だめの可能性ある１つの方法は、便利には２段階方法で
ある。

第１に、ＥＤ−分析物接合体及び相補的な特異的結合対
メンバーの濃度の比は、所望する分析物の濃度範囲（亡
おいて分析物濃度と共に変化する酵素比率の直線性を維
持しながら、アッセイ条件下で最少の酵素比率を実質的
に達成するような比である。この濃度は所望により、反
応の速度学を研究することによって溶液中において決定
される。たとえば、１９８８年２月２日に提出された係
続出願第１５１、４１２号（これは、接合体及び抗体濃
度を最適化することを詳しく説明する）を参照のこと。

普通、相補的な特異的結合対メンバー及び接合体の濃度
は、条件を最適化するのに必要な濃度の少なくとも８５
％以内、より普通には少なくとも９５％以内であろう。

さらに、相補的な特異的結合対メンバーが抗体である場
合、ＥＡ紙と接触する前、抗−分析物抗体に対して特異
的な第二抗体の添加がβ−ガラクトシダーゼ触媒反応速
度を低めることができる。

所望する分析物濃度範囲における最適な相補的特異的結
合対メンバー及び接合体の濃度が溶液アッセイにおいて
決定された後、これらの濃度は本発明のアッセイに使用
される。限界分析物濃度よりもわずかに高い濃度のサン
プルを用いる場合、接合体が適用部位部分に存続するま
で、種々の量の相補的な特異的結合対メンバーが添加さ
れる。

適用部位から接合体の移動は、限界濃度又はそれ以下の
濃度の分析物を有するサンプルにより観察される。限界
分析物濃度で接合体移動を提供する最少の相補的特異的
結合対メンバー濃度が、本発明のアッセイに使用するた
めに最適である。

アッセイ条件及びサンプル、ＥＤ−分析物接合体及び分
析物受容体が組合される緩衝液は、アッセイ媒体中にお
ける相補的な特異的結合対メンバー及びＥＤ−分析物接
合体又は分析物の間での複合体の形成を提供する。アッ
セイ媒体がＥＡ繊紙上スポットされる場合、緩衝液はま
た、固体支持体付着性β−ガラクトシダーゼを形成する
ために、酵素供与体と酵素受容体との間に相補性を提供
する。その緩衝液配合は臨界ではない。−船釣に、生理
的緩衝液、たとえばリン酸緩衝溶液、トリス緩衝液及び
同様の緩衝液が有用である。好ましい緩衝液は、約１０
０ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａＰＯ＜　、約５ｍＭ〜約１
０ｍＭのＥＧＴＡ及び約１０ｍＭ〜２０ｍＭのＮａＮ５
（ｐＨ６〜８）を含有する。温度は普通少なくとも約２
０℃、好ましくは高温（但し６０℃以下）であろう。

アッセイが野外で使用される場合、はとんどのアッセイ
は、約り０℃〜約３０℃、より普通には約２５℃で行な
われる。アッセイは大気圧で行なわれる。

サンプル中の分析物の存在を検出するための第１段階と
して、サンプルは、相補的な特異的結合対メンバー及び
ＥＤ−分析物接合体と共に、前記相補的な特異的結合対
メンバーが分析物と十分に反応する時間インキニベート
される。その時間は、インキュベーション温度及び特異
的結合対メンバーの親和性に依存して変化し、そして普
通、反応が平衡を達成するまでで十分であろう。普通、
インキュベーション時間は、約り０℃〜約３７℃で少な
くとも約１５分間、より普通には約３０〜６０分間であ
る。便利には、ＥＤ−分析物接合体及び相補的な特異的
結合対メンバーは、サンプルと接触する前、特異的結合
対複合体を形成するために組合される。その複合体は、
ＥＡ繊紙上スポットする前、サンプル中の分析物が複合
体中の相補的な特異的結合対メンバーと反応するための
十分な時間、サンプルと共にインキュベーションされる
であろう。予備形成された複合体を用いる場合、ポリフ
ローナル抗体を用いる典型的なジゴキシンアッセイにお
いて、サンプルへのその複合体の添加の後、平衡は１５
〜約６０分で達した。

アッセイ媒体を形成するために緩衝液中でＥＤ−分析物
接合体及び相補的な特異的結合対メンバーと共に混合さ
れる場合、種々の量のサンプルが使用され得、そしてそ
の世は、サンプル中における期待分析ｙＩＪａ度に依存
する。普通、サンプルは、アッセイ媒体の体積の少なく
とも約１〜２０％を占めるであろう。

少量のアッセイ媒体がＥＡ紙に適用されるであろう。そ
のアッセイ媒体の量は、乾燥ＥＡ紙による適用装置から
引き出され、そしてウィッキングされるために十分に少
量であり、そしてその紙上で流れず、そして玉状になら
ない程度の量である）。便利には、約１０ｍ以下、普通
約３〜約５４が使用されるであろう。アッセイ媒体の体
積は便利には、ＥＡ紙に適用されるべき体積又はひじよ
うに少量のサンプル体積を可能にし、そしてむだなアッ
セイ試薬を避けるいくぶん多量の体積であろう。しかし
ながら、測定の便利性又は同様のことを所望する場合、
実質的に多くのアッセイ媒体体積が使用され得る。

アッセイ媒体は便利には、媒体を含有する毛管とＥＡ紙
の予定された部分とを接触せしめることによって適用さ
れ、そして適用部位から放射状にウィッキングするであ
ろう。ＥＡ紙は、インキュベーション温度に依存して、
約５〜約３０分、より普通には約１０〜３０分間インキ
ュベートされるであろう。普通インキュベーションは、
固体支持体付着性β−ガラクトシダーゼを形成するため
にＥＡがＥＤと反応するのに十分な時間待なわれるであ
ろう。

その後、ＥＡ紙は、酵素基質溶液と共にインキニベート
される。酵素により分解される場合、吸光度（光学濃度
）又はアッセイ媒体の発光の量の変化をもたらす酵素基
質が用いられる。すなわち、基質の分解は、着色又は螢
光生成物の出現又は清白をもたらす。酵素基質は、沈殿
性又は非沈殿性生成物を生成することができる。所望に
より、非沈殿性生成物を用いる場合、その生成物はＥＡ
紙に非特異的に結合されるであろう。好ましい酵素基質
は、クロロフェノール、レッドガラクトシド（ｃＰＲＧ
）である。ＣＰＲＧ及び他の匹敵する酵素基質、たとえ
ばオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｏ
ＮＰＧ）は、市販されている。酵素基質とのインキュベ
ーションは便利には、酵素基質溶液中にＥＡ紙を含浸す
ることによって行なわれる。

ＣＰＲＧを用いる場合、ＥＡ紙は便利には、約０．５〜
２１ＴｌｉＡの間のＣＰＲＧの溶液中において室温で１
〜１０分間インキュベートされるであろう。所望により
、ＥＡが発色を強めるために基質溶液に添加され得る。

他方、その基質は、別々の溶液としてよりもむしろ、Ｅ
Ａ紙中に組込まれ又はアッセイ媒体中に存在することが
できる。この場合、ＥＡ紙と共にアッセイ媒体をインキ
ュベーションすることは、ＥＡ紙の進展を提供するであ
ろう。

サンプルが予定された限界濃度以上の濃度の分析物を含
む場合、接合体は適用部位の近くに存続し１、そして基
質による展開の後、検出できる小さな部分を生ぜしめる
。ＣＰＲＧを用いる場合、小さな黒い点がその適用部位
で形成される。分析物が予定された限界濃度以上の濃度
で存在しない場合、接合体は、より薄い色を有する実質
的に大きな検出できる部分を形成するために、適用部位
から実質的に離れて放射状にウィッキングする。

本発明を促進する試薬を含むキットがまた、考慮される
。そのキットは、吸収性固体支持体に付着されたＥＡ及
びβ−ガラクトシダーゼＥＤ−分析物接合体並びに特異
的結合対の相補的メンバーを含んで成る。ＥＤ−分析物
接合体及び相補的な特異的結合対メンバーは、同じか又
は異なった容器中に、便利には予備形成された複合体と
同じ容器中に供給され得る。酵素基質溶液は、キット中
に含まれるか又は別々に売られている。キットはさらに
、陽性及び陰性の分析物対照を含むことができる。ＥＡ
紙は乾燥形で供給されるであろう。

追加の試薬は、液体又は乾燥形で供給され得る。

便利には、その追加の試薬は、１回のアッセイのために
十分な最の試薬を含む錠剤の形で供給されるであろう。

次の例は例示的であって、限定するものではない。

実験 例Ｉ ＥＡ紙の調製 膜にＥＡを結合するために、ＥＡ２２の溶液〔５０ｍＭ
のＰＯ４３−緩衝液（ｐＨ７，４）中、約５〜ＩＯＨの
濃度で〕でおおわれた膜を、室温（ＲＴ）で３０分間、
振盪した。次にその膜を、ＰＢＳ中、１％カゼイン溶液
によりブロックしく振盪、６０分、ＲＴ）　、次いで０
．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにより２度す
すいだ（振盪、１５分、ＲＴ）。次にその膜を吸収乾燥
せしめ、そして真空デシケータ−中に保存した。

存在するタンパク質の完全な結合のためには、膜上のタ
ンパク質結合部位と競争するチオールが存在しないこと
が好ましい。従って、次の例のために使用されるＥＡは
、貯蔵チオールが５ｅｐｈａｄｅｘカラムを通して除去
されている“交換された”ＥＡ２２であった。

交換されたＥＡは、チオール保護のためにＥＧＴＡの添
加を伴って又はその添加を伴わないで７日間までの間、
冷蔵庫中に保存され、又は固定化後、匹敵する酵素活性
を供給するために７日又はそれ以上の間貯蔵するために
１０％グリセロールと共に冷凍された。

例２ 抗体及びＥＤ−分析物接合体の濃度の最適化免疫複合体
を、まず１〜８ｍＭのＢＤＴＡ及び６ｍＭのＭｇ　（Ｏ
ＡＣ）　２を含む２５０ｍＭのＰｏ、３−緩衝液中、５
０ｎＭのＥＤ４Ｔ３及び１：２００の希釈度のモノクロ
ーナル抗−Ｔ３抗体を３７℃で４５分間インキュベート
することによって調製した。次にこの免疫複合体を希釈
し、５ｎＭにし、そして放射状にウィッキングする形態
により５ｎＭのＥＤ４Ｔ３と比べた。この免疫複合体は
、適用部位で小さな点で残るＥｉＤ４Ｔ３に比べて溶媒
前部まで前進した。従って、抗体の存在又は不在間に卓
越した識別が存在した。

次の実験は、使用される濃度を最適化するための免疫複
合体中の抗−Ｔ３抗体の濃度の滴定であった。免疫複合
体を抗−Ｔ３抗体（１：１６００〜１：２００の範囲）
により構成し、そして次にＰａ１ｌ−ε入紙上にスポッ
トした。１：２００又は１：４００の希釈度の抗−Ｔ３
が使用される場合、免疫複合体は溶媒前部まで放射状に
ウィッキングした。しかしながら、１：１６００の希釈
度が使用される場合、中央が黒い点がＣＰＲＧによる展
開の後、現われ始めた。

これは、抗体に結合されていない接合体が存在すること
を指摘する。抗体の存在又は不在の間の識別を示す条件
が確立された後、次の研究は、限界濃度の分析物の存在
を識別する試みであった。

より濃縮された免疫複合体を、この研究のために調製し
た：　５００ｎＭの［ＥＤ４Ｔ３及び１：１００の抗−
Ｔ３抗体。この複合体を希釈し、２ｎＭのＩＥＤ４Ｔ３
にし、そして１　：２５，０００の抗−Ｔ３にし、そし
て５０ｎｇ／−〇Ｔ３と共に３７℃で１５分間、検量器
中でインキユベートした。分析物を有するサンプルは、
分析物を有さないサンプルと比べて明らかに内部が黒い
点を示した。

例３ 予定された分析物濃度を検出するための抗体／接合体比 溶媒前部までの距離と等しい直径の薄い点を生せしめる
濃度よりも低い、分析物の一定の予定された限界濃度が
ＣＰＲＧ及び分析物を用いて内部が黒い点を生ぜしめる
ために必要とされるアッセイが開発された。初めの研究
は、５０ｎＭのＢＤ４Ｔ３及び１：４００の抗−Ｔ３に
より調製された免疫複合体を用い、そして前記複合体は
１０倍に希釈され、そして０　、１０．２５．５０又は
９０ｎｇ／ｍｌのＴ３　　（システムの濃度）と共にイ
ンキユベートされた。内部が黒い点は、すべての濃度の
Ｔ３で見られた。しかしながら、その色は、検量器中の
高い割合の血清による相補性の阻害により５０及び９０
ｎｇ／ｍ１で薄かった（溶液中において動的アッセイで
別々に示される場合）。０及び１０ｎｇ／ｒｄの間のサ
ンプルの溶液中でのその割合の差異は、無限の分析物用
量（９０ｎｇ／−のＴ３）の４２％対６１％を示した。

従って、１０ｎｇ／−のＴ３サンプルによるその溶液割
合の約１９％の正味差異が、ウィッキングアッセイにお
ける内部点の識別を十分に可能にした。

より高い限界濃度のＴ３　（５０％ｇ／ｍｆ）へのアッ
セイを応答せしめるためには、抗−Ｔ３の濃度を、免疫
複合体の形成のために１＋１００に高めた。

５０％ｇ／ｒｎｌのＴ３では、内部点は見られなかった
。

溶液中でアッセイする場合の比較し得る割合は、５０１
ｇ／ｍｊ’の用量が開放割合、すなわち無限分析物用量
に関する割合のたった４４％に達したことを示した。閉
鎖割合、すなわち限界分析物濃度に関する割合は、開放
割合の３４％に達した。従って、これらの２種のサンプ
ル間の差異は、１０％の正味増加率に過ぎなかった。こ
れらの２種の研究からのデータは、約１０〜約１９％の
正味差異がアッセイにおいて内部点を生ぜしめ、そして
従って限界濃度以上及び以下の濃度のサンプル間の識別
を可能にしたことを示した。

最後の研究は、１：２００の抗−Ｔ３抗体の存在下で調
製された免疫複合体により行なわれた。酵素の割合は溶
液中でモニターされ、そして多量のアッセイ媒体は上記
のように放射状にじみを作った。その割合は次のとおり
である： 溶　液　　　　　　ウィッキング ＯＴ３＝３７％開放割合　　　内部点は存在しない１０
７３３９　　　　　　　　　内部点は存在しない２０Ｔ
３５２　　　　　　　　　内部点は存在する４０７３６
３　　　　　　　　　内部点は存在する従って、内部点
を生せしめるための最少量である２０％ｇ／ｍｌのサン
プルは、閉鎖割合よりも１５％の正味上昇率の結果であ
った。限界アッセイは事実、所望とする分析物濃度に対
して敏感である免疫複合体を得るために抗体を滴定する
ことによって他の分析物のために開発され得ることがこ
れらの研究から明らかである。

例４ 界面活性剤の効果 これまでの例において使用されたすべての接合体は、い
づれの安定剤をも含まない２５０ｍＭのリン酸緩衝液中
で調製された。接合体は所望により安定剤と共に貯蔵さ
れるので、ＥＤ４及びＥＤ４Ｔ３のウィッキングに対す
る２種の界面活性剤の効果を試験した。ＥＤ４及びＩＩ
！Ｄ４Ｔ３の溶液（５％Ｍ）を、０．２４％のラウロイ
ルサルコシン又は０．９％のＴｗｅｅｎ２０により又は
それによらないで調製し、そしてこれまでのようにＰａ
１ｌ−ＥＡ腹膜上スポットした。界面活性剤は、ＥＤ４
のウィッキング又は色彩進行に対して効果を持たなかっ
た。Ｔｗｅｅｎ　２０の存在は、ＩＥＤ４Ｔ３サンプル
の半径のわずかな増加を単に引き起こした。それぞれの
特異的接合体及び界面活性剤の組合せが所望により試験
されるだろうけれども、この研究は、アッセイ試薬への
界面活性剤の添加はアッセイを妨害しないであろうこと
を示唆する。

例５ 接合体の疎水性度 種々の濃度のＢＤ４Ｔ３　（１〜１０１００ｎをスポッ
トし、モしてＥＡと共にインキユベートされていないが
、しかし１％カゼインによりブロックされたＰａ１ｌ膜
上で放射状に内側からの拡大を可能にした。その膜をＥ
Ａ及びＣＰＲＧにより進行せしめた。すべての場合、色
彩は中央の点に制限され、そしてこれは溶媒前部に達し
なかった。従って、前の研究においては、ＥＤ４は溶媒
前部まで進行したけれども、前記ブロックされたＰａ１
ｌ膜は溶媒前部へのＥＤ４Ｔ３のウィッキングを可能に
しなかった。接合体のこの非特異的結合はＥＤ−Ｔ３接
合体の疎水性性質に帰する。さらに一連の他の接合体を
研究し、陽性及び陰性サンプル間の識別のために必要と
される疎水性度を決定した。

Ｆａｌ！膜と５−のＥＡとを反応せしめることによって
調製されたＥＡ紙を、種々の接合体の溶液５１１１〜１
０ｎＭによりスポットした。初めの研究におけるように
、ＥＤ４スポットは溶媒前部に拡張し、ところがＢＤ４
Ｔ３は小さな点として存続した。ＥＤ４Ｔ４は、εＤ４
Ｔ３と同一の挙動を示した。ＥＤ４−ジゴキシンは中央
に存続し、ところがその半径はＴ３及びＴ４の接合体の
スポットよりも大きかった。

ＩＩ！０４−８１２は溶媒前部に拡張した。ＥＤ４−Ｋ
ＬＨ及びＥＤ４−ＢＳＡの溶液は、不十分ではあるが、
溶媒前部に拡張した。

これらの結果は、抗体の不在下での接合体移動の程度は
、接合体の疎水性度と反比例して相互関係することを示
す。すなわち、Ｔ３及びＴ４接合体が最っとも疎水性で
あり、続いてジゴキシン接合体であり、そしてこれらは
溶媒前部に拡張しなかった唯一の接合体である。

例６ ［Ｅ［］４−８１２　アッセイ εＤ４Ｔ３に関する研究を、εＤ４Ｔ３よりも低い疎水
性である接合体によりくり返した。６０４−８１２を、
広範囲の濃度の抗−Ｂ１２　（１：　５０００〜１：１
００）と共にインキュベートし、免疫複合体を形成した
。

これらを溶液中においてアッセイし、相補性の阻害率を
決定し、そしてＰａ１ｌ−ＢＡ紙上にスポットした。最
っとも低い抗−８１２濃度で、その溶液はたった２２％
阻害され、そしてその膜のスポットに関する色の進行の
低下は存在しなかった。膜上の色の進行の低下は、より
高い抗−Ｂ１２濃度により形成された免疫複合体により
観察され、そしてそれは溶液アッセイにおける相補性の
阻害率（１：１０００〜１：１００の抗−８１２濃度で
５５〜６４％の阻害率）の上昇と相互関係した。このア
ッセイを開発するために、免疫複合体（１：２０００の
抗−８１２）を、アッセイ及びスポットする前、５〜１
１００ｎの８１２と共にインキュベートした。その複合
体を添加物なしに４４％阻害し、そして最っとも高いＢ
１２濃度で３４％を阻害し、これはＢＤ−８１２及び抗
−Ｂ１２の割合が、最適化を要することを示した。

しかしながら、色彩進行の領域は、分析物の存在により
わずかに影響されたに過ぎなかった。溶媒前部での色彩
濃度は分析物を有さないサンプルの濃度と同一であるが
、ちょうど中心部で濃度のわずかな上昇が存在した。こ
のデータから、種々の成分の濃度が最適化されれば、感
度の高いアッセイが８１２のために開発され得ることは
明らかである。

例７ ＢＤ４−ジゴキシンアッセイ ウィッキングアッセイ型をまた、ＢＤ４のジゴキシン接
合体を用いて試験した。免疫複合体を、３ｎＭのＢＤ４
−ジゴキシン、１＋５００のポリクローナル抗−ジゴキ
シン及び１：６のヤギ抗−ウサギ血清（ＧＡＲ３）によ
り形成した。この複合体を続いて分析物（０又は１１０
０ｎ／ｍｆ）のジゴキシン）と共に３７℃で３０分間イ
ンキニベートし、溶液中においてアッセイし、そしてま
たウィッキングアッセイのためにＰａ１ｌ−ＥＡ腹膜上
スポットした。抗体を有する１１００ｎ／ｍＡのサンプ
ルの活性は、抗体を有さないサンプルの割合の５１％で
あった。Ｏｎｇ／ｍｌ！のサンプルの割合は３４％であ
り、これは溶液中、１１００ｎ／ｍｆのサンプルにおい
て正味１５％の差異を与えた。Ｏｎｇ／ｍｆのサンプル
の色彩進行は、１１００ｎ／−のサンプルの色彩進行よ
りもひじょうに弱かった。これらの結果は、Ｔ３接合体
の結果に類似する。すなわち、約１０％と約２０％との
間の正味動的差異は、限界濃度の分析物を有するサンプ
ルとその限界濃度以下の濃度のサンプルとを区別するた
めに十分である。

この研究をくり返し、Ｏｎｇ／ｍｊ！及び１１００ｎ／
ｍＩ！のサンプル間の差異を最適化した。免疫複合体の
形成時間を６０分に高めることによって、溶液中におけ
るサンプル間の正味動的差異を３３％に高めた。しかし
ながら、膜の色彩進行の差異はさらに高められなかった
。ＧＡＲ３を省くことによって、すべてのサンプルの色
彩進行が高められ、そしてひじょうに良好な色彩の差異
がその膜により得られた。

上記例により例示されるように、本発明は、予定された
濃度以上でのサンプル中の分析物の存在及び不在間の視
覚的識別を付与する単純なアッセイ方法を提供する。こ
のアッセイ方法は、野外で容易に行なわれるように、最
少の操作及び少数の試薬を必要とする。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願は、
本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表示である。

すべての出版物及び特許出願を、引用により本明細書に
組込む。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載した
が、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンプル中の分析物（該分析物は、該分析物を含ん
   で成る特異的結合対メンバー及び相補的な特異的結合対
   メンバーである）の存在を決定するための方法であって
   ： （ａ）疎水性β−ガラクトシダーゼ酵素供与体／分析物
   の接合体及び前記相補的な特異的結合対メンバーを含有
   する溶液と前記サンプルとを、前記サンプル中に存在す
   るいづれかの分析物及び前記接合体が前記相補的な特異
   的結合対メンバーと反応するのに十分な時間、混合する
   ことによってアッセイ媒体を調製し； （ｂ）固体支持体付着性β−ガラクトシダーゼ酵素受容
   体を含んで成る吸収性固体支持体の予定された部分に前
   記アッセイ媒体の少量を適用し、そして前記アッセイ媒
   体が前記予定された部分を囲む部分に放射状に内側から
   はじきとばされた形になり；そして （ｃ）前記固体支持体を、β−ガラクトシダーゼとの反
   応に基づいて視覚的に検出可能な生成物を形成する酵素
   基質と共にインキュベートし、それによって、前記固体
   支持体上に視覚的に検出可能な部分（ここで該部分は前
   記サンプル中の分析物の量に比例する）を形成すること
   を含んで成る方法。 ２、前記視覚的に検出可能な部分が、前記分析物濃度が
   限界値以下である場合、前記限界値以上である前記分析
   物濃度に比べて実質的に大きい請求項１記載の方法。 ３、前記酵素基質が前記アッセイ媒体中に存在するか又
   は前記吸収性固体支持体に付着されているかのいづれか
   である請求項１記載の方法。 ４、前記吸収性固体支持体がナイロン膜である請求項１
   記載の方法。 ５、前記接合体及び前記相補的な特異的結合対メンバー
   が、前記サンプルが前記アッセイ媒体を形成するために
   前記溶液と混合される場合、予備形成複合体として存在
   する請求項１記載の方法。 ６、前記特異的結合対が抗原／抗体の対である請求項１
   記載の方法。 ７、前記接合体が、前記相補的な特異的結合対メンバー
   への結合の不在下で前記予定された部分に存続するのに
   十分に疎水性である請求項１記載の方法。 ８、前記接合体が、前記接合体に結合される少なくとも
   １種の疎水性成分を含有する請求項１記載の方法。 ９、疎水性吸着性固体支持体に付着されたβ−ガラクト
   シダーゼ酵素受容体及び疎水性β−ガラクトシダーゼ酵
   素供与体／分析物接合体並びに特異的結合対の相補的な
   特異的結合対メンバーを含んで成るキットであって、前
   記特異的結合対が分析物及び前記相補的な特異的メンバ
   ーを含んで成るキット。 １０、前記β−ガラクトシダーゼ酵素供与体／分析物接
   合体及び前記相補的な特異的結合対メンバーが、予備形
   成複合体として単一の容器中に存在する請求項９記載の
   キット。