JPS6312260B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

被分析物を含有すると予想される試料中の被分
析物の存在を測定するために、新規な、より簡単
な、より迅速な技術を発展させる研究が続けられ
ている。被分析物は広範囲にわたり、例えば、医
薬、天然に存在する生理学的化合物、汚染物質、
フアインケミカルス、異物等である。多くの場
合、測定にはスピードが重要であり、特に生理学
的に活性な化合物にとつてはそうである。また簡
便さも重要となる。 広く適用されている簡便な技術は“浸漬棒
（dip stick）”である。試料中に浸漬し、次に初
めの試料中の被分析物の量に基づいた信号を生成
するように処理することのできる固体の棒または
フイルムは非常に簡便である。固体表面に結合し
た化合物の信号、例えば光吸収や螢光を測定する
のは大きな装置で行なう。浸漬棒はまた取扱い、
移動、分離等が便利である。 分析を関発するに当つては、分析を行なう際の
工程および移動が少ないこと、分離試薬が少ない
ことが望ましい。浸漬棒は分離を簡便にするが、
分離それ自体は望ましいものではない。さらに、
包装し、加え、調製すべき試薬が少なければ少な
い程、分析にもたらされるエラーは少なくなり、
かつ分析の経済性と簡便さは大きくなる。 したがつて新しい分析方法、特に測定用分析媒
体から分離してもしなくてもよい硬質の固体表面
を用い、固体表面上の観測信号に影響を与えるよ
うな溶液中の試薬の存在に関係なく、信号が発生
しうるような方法を開発することが望ましい。 種々のテストストリツプの種々の固定試薬に関
する特許は、米国特許第3993451；4038485；
4046514；4129417；4133639；および4160008号、
およびドイツ公開第2636244号である。結合およ
び非結合抗体の分離を含む種々の方法を開示して
いる特許は、米国特許第Re.29169；3949064；
3984533；3985867；4020151；4039652；
4067959^*；4108972；4145406；および4168146^*号
である。（＊印は特に興味ある特許） 免疫学的対の一員（“mip”と略す）が結合し
ている比較的硬質で不溶性な、そして好ましくは
吸収性の表面を使用する方法が提供される。この
免疫学的対はリガンド、およびリガンドに特異的
に結合している受容体あるいは本発明の目的にと
つてこれらの機能的等価物であるものからなつて
いる。表面の他に、信号生成系が提供され、これ
はその一員として触媒（通常は酵素）を有し、触
媒はmipに結合している。被分析物の量によつ
て、触媒で標識化したmip、分析媒体のバルク溶
液（bulk solution）と表面との間に分配される。
信号生成系は表面で信号発生化合物を生成し、こ
れは信号を発生する。この信号はバルク溶液中に
生成または存在するいかなる信号発生化合物にも
大きく影響されない。したがつて、信号発生化合
物は分析媒体中において非結合触媒で標識化した
mipの存在下に発生しうる。信号生成系の触媒の
みがmipを標識化する触媒である場合、バルク溶
液に比較して表面での信号発生化合物の生成速度
の差を高めるために種々の手段、（例えば表面で
の触媒転換速度を高める）を用いることができ
る。このプロトコールを簡単にするために、信号
発生系の最後の成分はmipに結合した触媒の添加
時または添加前に加えられる。 分析の感度と精度を最適にするために、表面お
よび若干量の種々の試薬の組み合わせからなる組
成物が分析を実施するために提供される。 本発明の分析は、簡単な効果的な、再現性のあ
る方法で、広範な被分析物を検出および測定する
便利な方法を提供するものであり、該方法は表面
に結合した生成物の分光光度性を測定する通常の
装置または肉眼的検査を使用しうるものである。 本発明により多様な被分析物を測定するための
分析方法および分析組成物が提供される。この場
合、被分析物は免疫学的対の一員（mip）であ
り、該対は、リガンドおよび該リガンドに特異的
に結合する受容体（抗リガンド）からなるかまた
は本分折にとつて機能的に等価のものからなる。
分析方法は２つの本質的要素：mipが結合してい
る表面；および信号生成系；を有する。該信号生
成系は該表面上に信号発生化合物をもたらし、こ
れは分析媒体中の被分析物の量に相関した量で検
出可能信号を生成する。好ましくは信号生成系は
一つまたはそれ以上の化合物を有する二工程以上
の転換を行なつて信号発生化合物を生成し、阻止
しまたは破壊する。この場合、信号発生化合物の
濃度変化量は表面上の二個の分子間の平均距離に
関係する。この分子は同一でも異つてもよい。表
面での免疫学的結合は表面での信号生成系の化合
物の濃度を局部的に高める。また第三成分として
掃去剤（スカベンジヤー）を用いることもでき
る。これはバルク溶液中の中間体、触媒または信
号発生化合物を掃去することによつて、バルク溶
液中の信号生成系における活動を阻害するように
働く。 表面は実質的にその形状を保持するならばどの
ような構造でもよいし、容器から分離可能でもよ
く、また容器の一部であつてもよい。mipを表面
に結合する方法は、同族パートナーに結合するに
充分な量のmipが露出していさえすれば限定的な
ものではない。 信号生成系は少なくとも二種の成分を有する。
それはmipに結合する触媒、通常は酵素；および
溶質であり、溶質は表面に結合している物質と反
応し、それによつて検出可能信号の生成を直接的
または間接的に増すかまたは阻害する。信号生成
系の一員と表面とを一緒にすることによつて不溶
化、表面上の化合物との錯体形成または表面上の
化合物との相互作用（反応を含む）が生ずる。 信号生成系により中間物質が溶解形でバルク溶
液中および表面の両方に生成する場合は、バルク
溶液中に生じた中間物質と表面との相互反応を実
質上最少にするためにスカベンジヤーが有効に使
用しうる。 バルク溶液と比べて表面での生成物の生成度合
を変えるために、そしてバルク溶液中で生成され
るかまたはバルク溶液中へ移動した中間体または
生成物が表面と相互反応するのを阻止するため
に、広範な種々の系が使用しうる。ある種のプロ
トコールによつては、種々の添加物、培養工程お
よび試薬類が用いられる。 試料中の被分析物の量に相関した検知可能信号
発生物質を表面上に生成させることによつて、表
面から検知される信号レベルを溶液中の被分析物
の量に関係づけることができる。既知量の被分析
物を含有する標準体を未知量の時と同一のまたは
実質的に同一の条件下で用いることによつて、試
料中の被分析物の量と検知信号レベルを定量する
ことができる。 本発明によれば、結合した触媒−結合−mipと
未結合の触媒−結合−mipの分離をする必要がな
く、また試料中の他の成分から被分析物を分離す
ることが望ましいとしてもその必要もなく本方法
を実施できる。これは分析工程にとつて好都合で
あり、かつきれいに分離することの困難性を避け
るに有益である。 本発明はリガンドおよびリガンド受容体を検出
および測定するための、正確、特異的かつ鋭敏な
技術を達成する。本方法は硬質表面での信号発生
に関係する化合物を該硬質表面で選択的に生成さ
せ、生成を阻害し、あるいは破壊する。この表面
における信号発生化合物は表面上または表面中充
分な深さにあり、測定可能な信号を出す。 多数の被分析物にとつて、対象の濃度範囲は
100μｇ〜1pｇ／mlである。多くの被分析物にと
つて、対象の濃度範囲は約２倍〜100倍にわたる
ので、定量分析は分析媒体中の被分析物の濃度の
わずかな相違を識別する能力が必要となる。免疫
分析はリガンドと受容体との間の錯化に基づくも
のであり、このうちの片方または両方を標識化し
うる。被分析物の濃度が低ければ、生成する錯体
の数は少ない。したがつて生成した標識化錯体の
数を正確に測定することができるためには、極め
て低レベルでも効果的に計数されるような信号を
標識が出さねばならないか（例えば放射性照射）、
あるいは錯体が増幅または増加可能でなければな
らない（螢光または接触反応）。 増幅系を用いる時は、多くの問題が出現する。
一つの大きな問題は、錯体以外すなわちバツクグ
ランドから生ずる信号である。バツクグランド信
号は試料中の物質すなわち、免疫学的対のメンバ
ーを標識化した時の標識化された不純物および未
結合の標識化メンバーに由来する。分析の発展に
は、標識化した錯体によつて生じる信号はバツク
グランドからの信号によつて不明瞭にされてはな
らないし、バツクグランド信号より実質的に大き
くなければならない。したがつて信号発生系によ
つて達成される増幅は、主に（もし一つでなけれ
ば）バツクグランド標識にではなく標識化錯体に
関係しなければならない。 標識化した免疫錯体とバツクグランド標識とを
きれいに分離することは、多くの分析手法におい
て必要であり、その際、非特異的効果に充分な注
意が向けられなければならない。例えば、螢光標
識が不均質系、例えば浸漬棒に使用される場合、
すべての試薬と浸漬棒とを結合させた後、浸漬棒
をとり出し、注意深く洗つて非特異的に結合して
いる螢光体をすべて除去しなければならない。そ
の上、被分析物リガンドに第１受容体が結合し、
第１受容体に第２標識化受容体が結合することに
よつて増幅を行うことができるとしても、錯体に
含まれる螢光体の数は免疫対の一員に丁度結びつ
く数に制限される。この工程は別の試薬をさらに
加えたり、非特異的相互作用を避けるために注意
深く分離したりしなければならない。 本発明の他の方法の多くの短所を除くかまたは
最小にする。触媒を使用することによつて、各錯
体に対して複数の信号発生が行なわれる。触媒は
分析媒体中の被分析物の量に比例してバルク溶液
と表面との間に分配される。表面での接触反応か
ら生じた信号発生生成物の生成は、バルク溶液中
で同時に生成した（もしあれば）信号発生物の生
成と実質的に無関係である。したがつて、表面に
おける信号発生化合物の量を調整している間、分
析はバルク溶液中に存在する触媒で行なわれる。
たとえばバルク溶液から表面を分離することが好
ましいとしても、本発明においては信号を測定す
るためにバルク溶液から注意深くあろうとなかろ
うと、表面を分離する必要がない。 その上、本発明においては、信号発生化合物は
表面の上または中に実質的に深く存在しうる。表
面における触媒の存在により、多くの信号発生化
合物が析出または転換して強い信号を生ずる。こ
れは測定が肉眼的検査である時、特に信号発生が
光の吸収である際、重要である。 本発明をさらに説明する前に、用語を定義す
る。 定 義 被分析物……測定すべき化合物または組成物であ
つて、モノまたはポリエピトープ性、通常は抗
原性またはハプテン性のリガンド、少なくとも
一つの共通なエピトープ部位または決定基部位
を共有する単一または複数の化合物または受容
体である。 特異結合体……２種の異なる分子、そのうちの一
つの分子は表面上またはくぼみ中にもう一つの
分子の特定の空間および極性組識に特異的に結
合している領域をもつている。特異結合対のメ
ンバーはリガンドおよび受容体（抗リガンド）
と称する。これらの本発明では免疫学的対のメ
ンバーと（members of an immunological
pair）称され、“mip”と略される。同族
（homologous）または補足mipはリガンドおよ
び受容体であり、一方相似（analogous）mip
はリガンド受容体のいずれかであつて、これら
は例えば標識のような方法で区別される。 リガンド……それに対する受容体が天然に存在す
るかまたは生成しうるところの有機化合物。 受容体（抗リガンド）……分子の特定の空間およ
び極性組織すなわちエピトープ部位または決定
基端位を認識しうる化合物または組成物。受容
体の例示として、例えばチロキシン結合性グロ
ブリン、抗体、酵素、Fab断片、レクチン、核
酸等の天然に存在する受容体がある。 リガンド相似体（Ligand Analog）……受容体
に対して相似リガンド（analogous ligand）
と拮抗することのできる変性されたリガンド。
この変性によりリガンド相似体を他の分子に結
びつけることができる。リガンド相似体は水素
を置換してリガンド相似体をハブまたは標識へ
つなぐ結合とした点でリガンドと通常相違す
る。 ポリ（リガンド−相似体）−複数のリガンドまた
はリガンド相似体が通常はハブ核（hub
nucleus）に一緒に共有結合したもの。ハブ核
は多官能性物質であつて、通常は高分子性であ
り、結合のための部分として例えばヒドロキ
シ、アミノ、メルカプト、エチレン性等の官能
基を複数有している。ハブ核は水溶性または少
なくとも水分散性であり、通常少なくとも約
35000ダルトンでかつ約600000ダルトン以下で
ある。ハブ核の例には、多糖類、ポリペプチ
ド、（蛋白質を含む）、核酸、イオン交換樹脂等
がある。 表面……表面は非分散性で、少なくとも約1μm²、
通常はそれ以上の大きさであり、しばしば約１
mm²以上、大ていは約0.5cm²〜10cm²である。これ
は水に不溶性の物質であつて、mipに結合する
ために必要な性質を提供し、そして所望の信号
レベルを出すための検知可能な信号発生化合物
を提供する。望ましくは、表面はゼラチン状、
透過性、多孔性であるか、または粗いもしくは
不規則な構造であり、溝またはぎざぎざをもつ
ていてもよく、通常全体積に比較して実質的な
空隙体積を有する。検知可能信号発生化合物の
性質によつて表面は吸着性または非吸着性であ
り好ましくは弱または非吸着性である。表面は
透明または不透明であり、単一物質または複数
物質であるか、混合物または積層体である。多
種類の物質および形状が使用しうる。表面は分
析条件下でその完全性を留めることができるの
で、表面に結合した物質は表面に結合したまま
残り、溶液中に拡散しない。 信号生成系……信号生成系は少なくとも次の二つ
のメンバーをもつている：(1)触媒メンバー；お
よび(2)溶質。溶質は触媒メンバーによつて触媒
される反応を行ない表面上または表面内におい
て直接または間接的に検知可能信号を提供する
生成物となる。望ましくは、バルク溶液に比べ
て表面の信号発生化合物の変化速度を高める第
三化合物が存在するとよい。これはこの成分が
表面に結合するかまたは信号生成系の別のメン
バーと相互作用する結果としてなりうるのであ
る。 触媒メンバーは酵素性か非酵素性のものであ
るが、酵素性が好ましい。一つまたはそれ以上
の酵素が使用されるが少なくとも一つの酵素が
mipに結合する。（触媒としてはたらく酵素は
受容体としてはたらく酵素と区別されるできで
ある）。 溶質は信号生成系の触媒メンバーによつて触
媒される反応を行うことができる化合物であれ
ばいかなるものでもよい。この反応は表面にお
いて検知可能信号発生化合物が生成するのを直
接または間接的に調節する。信号発生化合物が
表面に付着するのは、溶質が接触反応を行なつ
た時生成した生成物が不溶性であること、この
生成物が表面上の化合物と錯化すること、また
は表面上の化合物が接触反応の生成物と反応も
しくは相互作用することの結果であろう。 信号発生化合物は電磁性信号、例えば分光光
度的または可視的検知信号、電気化学的または
電子的検知信号を出す。信号発生化合物はその
不溶解性によつて、または表面への共有または
非共有結合によつて、表面に付着する。表面か
らの検知可能測定信号は、触媒−結合−mipが
mip−結合−表面に結合することによつて表面
に結合した触媒の量に相関する。 表面での検知可能信号の生成を増し、一方バ
ルク溶液中の物質からの妨害を最小にするため
に種々の手法および種々の試薬の組み合わせを
用いうる。 標識（Label）……標識の別の分子に結合した分
子であつて、これらの分子の各々はそれ以前に
は別々に存在したか存在しえたもの。大部分の
場合、標識はmipに結合した化合物である。抗
リガンドに結合した触媒の場合は、その試薬は
触媒−結合−抗リガンドと称され、一方、表面
に結合しリガンドの場合は、その試薬はリガン
ド−結合−表面と称される。 方 法 本分析方法は水性帯域または水性媒体中で行な
われる。試薬を別々に添加するかまたは試薬の添
加とインキユベーシヨンとを組み合わせて行なう
か、水性媒体から表面をとり出して、一つ以上の
試薬を含有する別の水性媒体に移す分離工程を行
なうかあるいはこれらの組み合わせの工程を行な
つた後に最終の分析媒体となる。しかし、本方法
は、表面に結合した同族パートナー（mip−結合
−表面）に結合している触媒−結合−mipから未
結合の触媒−結合−mipを分離する必要はない。
媒体は液相と“表面”である非流体相とからなつ
ている。 分析を行なうには、同時にかまたは順次にかの
いずれかの方法でmip−結合−表面を試料に、信
号生成系のメンバーに、そして水性媒体中の補助
物質に接触させ、表面において検知可能信号を発
生させる。検知可能信号は表面に結合した触媒−
結合−mipの量に関係し、すなわち試料中の被分
析量の量に関係する。信号生成系の性質および信
号を測定する方法によつて、表面を分析媒体中で
測定してもよいし、分析媒体から出して測定して
もよい。 分析を行なうには通常水性媒体が用いられる。
他の極性溶媒も用いられるが、通常は炭素原子数
１〜６、より普通には１〜４の酵素化有機溶媒が
用いられ、アルコール類、エーテル類等である。
これらの補助溶剤は通常約40重量％以下、より普
通には20重量％以下で存在する。 媒体のPHは通常約４〜11であるが、より普通に
は約５〜10であり、さらに好ましくは約6.5〜9.5
である。PHは信号生成効果を最適にしながら、受
容体による特異結合の量を充分維持するように選
択される。ある場合にはこの二つの条件の間で妥
協するであろう。所望のPHにし、かつ測定中PHを
維持するために種々の緩衝剤が用いられる。緩衝
剤の例としては、ホウ酸塩、燐酸塩、炭酸塩、ト
リス（Tris）、バルビタール等がある。特に用い
られる緩衝剤はこの発明としては限定的なものは
ないが、個々の分析にとつてはある緩衝剤が他の
ものより好ましいということがある。 分析を行なうには通常穏和な温度が用いられ
る。対照試料と比較せずに分析を行なう場合の
み、測定中の温度を一定に保つ必要がある。測定
温度は一般に約10〜50℃の範囲であり、より普通
には15〜45℃である。 分析される被分析物の濃度は一般に10^-4〜
10^-15モルであるが、より一般的には10^-6〜10^-13
モルである。例えば分析が定性であるか、半定量
であるか、定量であるかを考慮し、また分析手段
および被分析物の濃度を考慮して他の試薬の濃度
を決定する。 種々の試薬の濃度は、いかなる方法が用いられ
るかにより、また、被分析物の性質、表面に結合
しているmipの性質、触媒に結合してるmipの性
質、分析の所望感度等により広範囲にわたる。あ
る場合には、mipの片方または他の片方を過剰に
用いてもよい。一方あるプロトコールの場合には
分析の感度はmip比の変化に応答する。 これを説明すると、被分析物がポリエピトープ
性抗原である場合、もし表面が初めに試料に接触
し、次に信号生成系に接触するなら、分析の感度
に重大な影響を与えずに抗リガンド−結合−表面
としての抗リガンドと触媒−結合−抗リガンドと
しての抗リガンドを過剰にすることができる。抗
リガンドが試料であり、プロトコールが抗原−結
合−表面を接触させるに先だつて被分析物と触媒
−結合−抗リガンドとを混合するものである時
は、分析感度は被分析物と触媒−結合−抗リガン
ドの濃度の比に関係する。 プロトコール以外にさらに考慮すれば、試薬の
濃度は抗リガンドの結合定数、特定の抗血清に対
する結合定数特性、所望の分析感度に依存する。
すべての信号生成系が液相中に存在する場合は、
触媒基質と補助試薬の濃度は、多量の信号生成性
生成物が形成される前に免疫対が結合するような
濃度になるべきである。分析の感度が濃度に関係
する場合は、しばしば特定の濃度が実験的に決定
される。試料が同族触媒−結合−mipと混合され
る場合、一般に触媒−結合−mipの全結合部位濃
度は被分析物の結合部位に基づく対象の最小濃度
の約0.1倍以上であり、かつ被分析物の結合部位
に基づく対称の最大濃度の1000倍以下、通常は約
0.1〜100倍、より普通には約0.3〜10倍である。
被分析物がmip−結合−表面に予め吸着されてい
る時は、触媒−結合−mipの濃度は、表面への所
望の結合速度、液相中の信号発生化合物に対する
妨害、試薬の価格等によつてきまる。 表面に密着し、表面内で閉塞している無効液体
中の触媒−結合−mipの量が、触媒−結合−mip
が表面に結合した結果生じた表面での信号発生化
合物の濃度変化の測定を妨害しないように、触媒
−結合−mipの濃度を選択する。この濃度選択は
測定の感度、所望する定量の度合、分析対象の最
低濃度を識別することのできる正確さ等によつて
影響を受ける。 大ていの場合、表面に結合しない無効な触媒−
結合−mipの表面に結合している触媒−結合−
mipに対する濃度比は、被分析物の最高濃度にお
いて、好ましくは中程度の濃度範囲において約
100倍以下、通常は約10倍以下であるべきである。 触媒−結合−mipを試料と混合する前に、また
は同時に、または後で、固体表面と試料を混合す
る。表面として単一ユニツトまたはそのものを使
用することによつて、大きな試料中で被分析物を
濃縮することができる。また表面は、測定結果を
妨害する試料中の物質から被分析物を分離するこ
とができる。したがつて、表面を試料と一緒に
し、次に媒体を含有する試料から表面をとり出
し、分析媒体に移すのが好ましい方法である。 さもなくば、表面を試料と接触させたまま他の
試薬を加える。また、場合によつては望ましいこ
とではないのであるが、試料を触媒−結合−mip
と一緒にし、次に表面を分析触媒に加えることも
可能である。例えば、リガンド被分析物、触媒−
結合−抗リガンドおよびリガンド−結合−表面の
場合にこの最後の方法は効果的である。 しばしば、例えば表面を分離または洗浄すると
いうような中間工程なしに、触媒−結合−mipと
ほぼ同時に信号生成系の最後の成分を加える。 受容体が被分析物である場合には、単一の免疫
学相対の代りに２種の免疫学的対を使用すること
ができる。その場合、受容体は一つの対ではリガ
ンドとしてはたらき、他の対では受容体としては
たらく。例えばIgEの場合、アレルゲンすなわち
抗原を表面に結合させ、触媒を抗−IgEに結合さ
せることができる。この方法では、IgEは相互に
使用しえない二種のmipの間の橋として作用す
る。mipについていえば、この状態は存在するこ
とが予期される特殊なケースを考えるべきであ
る。 方法のプロトコールを開発するに当り、ある基
本的な考えが試薬の添加順序および組み合わせを
支配する。第一の考えは、好ましくは表面−結合
−mipおよび触媒−結合−mipが異なるメンバー
である場合（例えば一つがリガンドで一つが抗リ
ガンドである）、この二つは表面と混合する前ま
たは混合とほぼ同時に一緒になる。触媒−結合−
mipおよび溶質は、溶質が、触媒−結合−mipの
基質である時以外は単一の試薬として混合するの
が好ましい。しばしば表面および試料は、他の試
薬を添加する前または添加とほぼ同時に混合され
る。 種々のプロトコールは種々の程度の複雑さを有
する。簡単なプロトコールにおいては、信号生成
系に２種の触媒があり、その一つはmipに結合
し、他は表面に結合する。一つの触媒、好ましく
は表面−結合−触媒は、溶質と反応して第１の生
成物を成する。この第１の生成物は第２の触媒に
よつて作用を受け、第１の生成物自身でまたは他
の試薬と組み合わさつて第２の生成物を生成し、
第２の生成物は、表面に接して生成した時、表面
に選択的に結合するかまたは表面に結合している
化合物と相互に作用する。これは不溶性の第２生
成物を生成することによつて有利に達せられる。
不溶性とは約10^-3モル以下の溶解度を意味する。
不溶性生成物は電気的性質例えば静電性の変化を
生じさせ、或は、紫外線または可視光線波長範囲
における吸収、化学ルミネツセンス、反射率およ
びけい光、（好ましくは吸収）を含む分光光度性
を有する。 反復回数を最少にするために、種々の例示プロ
トコールを集めた表を用意する。表がポリエピト
ーブ性抗原を指示している場合、抗原に代つてハ
プテンが用いうる。しかしハプテンでは受容体間
を橋かけするのに通常は有利でない。そこで橋か
けを要求しているプロトコールでは、橋かけを提
供するのにポリ（リガンド相似体）の添加が必要
となる。被分析物がハプテンである時は、通常ハ
プテン含有試料を受容体に加える。触媒−結合−
mipが受容体である時は、表面に結合するmipは
通常ハプテンである。表面に結合するmipが受容
体である時は、触媒に結合するmipは通常ハプテ
ンである。したがつて通常受容体結合部位の一部
をハプテン被分析物で飽和し、残りの部位を表面
か触媒かのいずれかに接合しているハプテンと結
合させる。 抗原性またはポリエピトープ性被分析物はリガ
ンドとしてさらに別の可撓性を現わし、ポリ（リ
ガンド相似体）を加えずに受容体が触媒と表面の
両方に結合しうる。リガンドが表面に結合してい
る場合、リガンド被分析物および表面上のリガン
ドは限られた標識化受容体の量または多価受容体
の量に対して競合し、リガンド−結合−表面と触
媒−結合−リガンドとの間の橋として作用する。
受容体が表面に結合している時は、触媒−結合−
受容体を表面に結合させるために、リガンドは受
容体−結合−表面と触媒−結合−受容体とは同時
に結合する橋としての作用をする。後者の場合、
触媒−結合−受容体を添加する前に受容体−結合
−表面とリガンド含有試料とを混合すると、大過
剰の標識化受容体をうることができる。何故な
ら、表面に結合する標識化受容体の量は表面に結
合しているリガンドの量に直接関係するから。受
容体−結合−表面が受容体被分析物と共に用いら
れる場合は、２つの受容体が限定量の触媒−結合
−抗原に接して競合する。 リガンドが被分析物であつて、かつリガンドが
表面に結合している場合、まず初めにリガンドを
含有する試料を触媒−結合−受容体と混合してリ
ガンドと触媒−結合−受容体とを結合させ、表面
に結合したリガンドが掃去しうる受容体の利用部
位の数を減少させる。受容体が表面に結合してお
り、かつリガンドが被分析物である場合、通常は
表面を触媒−結合−受容体と接触させる前に試料
を表面と一緒にすることが好ましいめであるが、
混合順序を変更することもある。普通は信号発生
化合物が形成された後に表面上の信号の変化を時
間と共に観察して変化率を出す。変化率は表面に
結合する標識の量に相関するであろう。この測定
は被分析物、触媒−結合−mipおよびmip−結合
−表面の間の平衡が充分確立する前に行なつても
よい。そしてこの率は時間と共に変わり得る。

【表】 １ 表面mip……免疫学的対の一員であつて、信
号生成系の他のメンバーの他のさらに表面に
結合している免疫学的対の一員。＋は表面を
表わす。 AgおよびAbはそれぞれリガンドおよび抗
リガンドであり、表面に共有結合または非共
有結合している。どのプロトコールにおいて
もAbおよびAgの役割を逆転しうる。 Cat₂……触媒を意味し、通常は酵素である。信
号生成系のメンバーとして別の触媒（通常は
酵素）と協同する。 Ｒ……試薬。表面に共有結合または非共有結合
しており、信号生成系の一部としての触媒の
生成物と反応する。 接合mip（Conjugated mip）……触媒（通常は
酵素）が共有結合しているリガンドまたは抗
リガンド。 Cat₁……触媒、通常は酵素である。信号生成系
の一部であつて溶質または溶質から形成され
る生成物と反応する。 溶質……信号生成系の一部としてCat₁または
Cat₂と反応する中程度の溶解性の化合物。 Anc.試薬……信号生成系に必要な別のすべて
の試薬。酵素、酵素基質、酵素補因子、活性
化剤、スカベンジヤー等である。 ²各ラインは、そのライン上の物質が次のライ
ン上の物質を添加する前に配合されることを示し
ている。多くの場合、何等かの添加順序が好まし
いとしても、各ライン上の物質は同時にまたは連
続して加えてもよい。接合micを添加する前に表
面と試料とを混合する時は、表面を接合mipまた
は他の試薬と接触させる前に表面を試料から分離
してもよいし、しなくてもよい。インキユベーシ
ヨン工程は工程と工程との間におよび一つの工程
の一部としての物質添加の間に含まれる。 一つ以上の触媒を信号生成系の一つ以上の中間
体成分および溶質と一緒に使用することによつて
種々のプロトコールが存在しうる。プロトコール
を開発する場合、信号の生成の最大化をもくろ
み、したがつて信号発生分子を表面に優先的に生
成させる。さらに測定および添加の必要回数を最
小にするために試薬はできるだけ分離調製を少な
くして配合するのが望ましい。 mipに結合した触媒が溶質と反応して表面の孔
または溝の中に信号発生体を沈積生成する場合は
その表面を測定のために分析媒体から分離する必
要はない。もし表面上の信号発生体を測定する都
合で分析媒体からとり出す場合は、非特異的に結
合した信号発生体または触媒−結合−mipを除去
するために洗浄する必要がない。 ２種以上の触媒、特に酵素を用いて信号発生体
を表面に局部的に多く生成することもできる。溶
質として酵素の一つの基質、好ましくは表面に結
合した酵素の基質を使用することにより、この溶
質からできた生成物が別の酵素（普通はmipに結
合している）の基質である場合には、このmipに
結合した酵素によつて生成するバルク溶液中の信
号発生化合物の生成率を最小にすることができ
る。結局、表面に生成した触媒−結合−mipの基
質を使つてバルク溶液中の信号発生化合物の生成
率を最小にすることができる。何故なら、一般に
バルク溶液中におけるこのような基質の濃度は極
めて小さいからである。 表面で生成した基質を使うほかに、バルク溶液
中の信号発生化合物の生成を最小にするために他
の方法が用いられる。例えば、上記例において、
溶質の生成物に作用してそれ以上の反応を阻止す
るスカベンジヤーをバルク溶液中で使用する。さ
もなくば、酵素阻害剤を使用する。酵素阻害剤は
酵素−結合−mipを表面に結合させた後で加え
る。これはバルク溶液中で酵素と一緒の場合有効
であり、表面に結合した酵素と一緒の場合に無効
となる。さらに別の方法は、表面に結合する試薬
を使うもので、これは酵素生成物と反応して信号
発生化合物を生成する。 別のプロトコールは表面上で信号生成物質が生
成するのを阻害する酵素−結合−mipを使用する
ものである。例えば、溶質が中間生成物に転換す
るのを触媒する酵素を表面に結合する。表面に結
合した第２の酵素をその中間生成物を信号発生化
合物に転換するのに使用する。酵素−結合−mip
には信号発生化合物を生成せずに中間体と反応す
ることのできる別の酵素を使用する。酵素−結合
−mipが表面に結合した時、それは表面上で信号
発生化合物が生成するのを阻害する。このプロト
コールは、触媒−結合−mipが表面に最大に結合
する時、最小の信号が生ずるという利点を提供す
る。したがつて被分析物および触媒−結合−mip
がmip−結合−表面結合部位に対して競合するよ
うなプロトコールでは、被分析物が存在しないと
信号が最小になり、存在すると信号が増大する。 上記プロトコールによれば、信号発生化合物は
試料中の被分析物の量に応じて生成したり消失し
たりする。表面に結合した信号発生化合物はバル
ク溶液に生成した（もしあれば）信号発生化合物
の量と実質的に無関係である。すなわち、信号発
生化合物がバルク溶液中に生成されるが、バルク
溶液から表面へ拡散し、表面に結合する量は、被
分析物の濃度範囲の最小の信号量でも固体表面に
生成する信号発生化合物に比較して無視しうる位
少ない。 表面にリガンドが受容体かのどちらを結合させ
るかの選択は因子の数による。ポリエピトープリ
ガンドが被分析物である時は、触媒−結合−受容
体を用いると表面へ結合する被分析物の各分子に
多くの触媒が結合するようになつて分析応答を増
加させる。リガンドまたは受容体の純度もまた重
要である。抗血清はしばしば不均質で、わずかな
割合の所望受容体しかもたないので、触媒−結合
−受容体は過剰量の信号発生化合物をバルク溶液
内に生成させる。したがつて、触媒が結合すべき
mipを決定する際にリガンドの純度を受容体と比
較しなければならない。その上多くの場合、対象
被分析物の濃度が極めて低いので、mipのメンバ
ーの結合は比較的遅いであろう。したがつて、も
し表面上に被分析物と同種のmipを大過剰使用す
ると、被分析物の結合速度は増し、その結果、表
面における信号発生化合物の生成が増大しうる。 他に考慮することは、最少数の処方に最大数の
試薬を配合することの便宜と効率である。溶質に
関していえば２種以上の触媒である系を使用する
ことによつて酵素触媒を他の酵素の基質と結合す
ることができる。さらに、２種の触媒に必要な補
助試薬を加えて単一試薬とすることもできる。何
故なら酵素の接触反応は他の酵素がその基質を生
成するまでおこらないである。 明白なことであるが、種々の試薬の添加および
組み合わせ（表面を分析媒体に入れることも含
む）の順序は多様である。リガンドか受容体のい
ずれかの限定された結合部位に対して競合が存在
すれば、試料が試料の同族mip（対の片方）にま
ず結合し、次に競合する相似mipを添加するのが
普通である。あるいはすべての試薬を同時に配合
してもよい。次に信号発生化合物を生成するに必
要な他の試薬を相似mipと同時に加えるかまたは
相似mipを加えた後に加えてもよい。特に信号生
成系が単一触媒を用いている場合は、分析媒体中
の信号発生化合物の生成速度が、表面とバルク溶
液との間で違いを生ずるような成分によつて影響
を受けるのが望ましい。表面上における局部的変
化の制御、PH、溶質濃度等の如き因子を使用して
酵素活性を相違させることができる。 試料を表面に結合したその同族mipに混合して
いる時にしばしばインキユベーシヨンを行なつて
多量の被分析物を結合させることができる。第２
のインキユベーシヨン工程は、触媒−結合−相似
mipが同族mip−結合−表面の残りの結合部位に
結合する時、またはリガンドが２種の受容体（−
つは表面に接合し他は触媒標識に接合している）
の橋として作用する時に行なわれる。第２のイン
キユベーシヨン工程が行なわれるか否かは、結合
速度の程度、分析に要求される感度、および固体
表面における信号発生化合物の生成速度による。
都合のよいことに、触媒−結合−mipと信号生成
系の残りのメンバーをほぼ同時に混合し、触媒−
結合−mipが表面に結合している間に信号発生化
合物を生成することができる。 以下は数種の典型的プロトコールの説明であ
る。第１のプロトコールでは単一の酵素触媒が使
用され、これは受容体、例えば抗体に結合する。
やはり受容体が結合する多孔性表面が用いられ
る。ポリエピトープリガンド被分析物を含有する
試料を抗体−結合−表面と混合し、この混合物を
充分な時間インキユベートすると、検出可能量の
被分析物が結合する機会を有するようになる。次
にこの混合物に酵素−結合−抗リガンドを加え、
この混合物を再び充分な時間インキユベートする
と、検出可能量の酵素接合体が表面に結合したリ
ガンドに結合する。酵素接合体のリガンドに対す
る結合を増すために、酵素−結合−抗リガンドと
共に緩衝剤に加えてもよい。 充分にインキユベートした後、溶質と酵素活性
測定用試薬を単一試薬として加える。ベルク溶液
に比較して表面での酵素活性を高める薬剤、例え
ば、巨大分子酵素阻害剤例えばポリ抗酵素、もこ
れに含まれる。この阻害剤は表面に結合した酵素
に結合することを立体的に阻まれる。別の方法で
は、一つ以上またはすべての必要な基質または補
因子を酵素−結合−抗リガンドと混合し、酵素−
結合−抗リガンドと一緒に分析媒体に加える。酵
素反応に必須の成分を使用しない限り、酵素反応
に必要な他の試薬を単一試薬として酵素と共に加
えてもよい。酵素反応に必要な試薬を加えた後、
信号発生化合物が多孔表面内に生成するに充分な
時間待ち、そしてこのように生じた信号を対照信
号、例えば既知量の被分析物により生じた信号と
比較する。さもなくば二回の測定を行い、信号強
度の時間に関する変化を測る。もう一つの方法は
酵素に必要な補因子および基質のすべてを完全に
添加してから一定時間経過後、表面をとり出し分
析媒体の外で測る。 橋としてリガンドを使用することから明らかな
ように、ハプテン被分析物は競合型の例である。
この典型的なプロトコールでは、ハプテン被分析
物を含有する試料を、信号発生化合物への前駆体
が結合しているハプテン−結合−表面および酵素
−結合−受容体と混合し、この混合物を適当にハ
プテンが受容体に結合し酵素−結合−受容体が表
面に結合するのに充分な時間インキユベートす
る。次に溶質と補助試薬を分析媒体に加える。分
析媒体では前駆体と反応して信号発生化合物を生
成する物質を酵素が生成する。次に、信号発生化
合物が固体表面上に生成される速度を測定するた
めに、一定間隔が１回以上の測定を行なう。これ
は試料中のハプテン被分接物が結合した後の受容
体の利用可能な結合部位数に相関する。 単一酵素を使用する別の方法は、オリゴマー性
基質をエキソヒドロラーゼと共に使用するもので
ある。例えば染料に結合した二糖類を使用する。
これは無色の試薬であるが、糖が分離すると不溶
性の着色染料となる。二糖類は２つの酵素接触加
水分解を要し、結局一種の酵素が二種の異なつた
基質に使用するので、第三成分が必要となる。し
たがつて、二酵素系に類似した状況であつて、第
１段階で一酵素が作用して第二酵素に対する基質
を生成し、第二酵素は第二段階で作用する。かか
る基質により、バルク溶液に比較して表面での酵
素活性を高める薬剤を加えることは重要ではなく
なる。 第三の典型的プロトコールでは、二種の酵素触
媒を用いる。酵素と抗体は表面に結合する。（酵
素および抗体−結合−表面）。表面をポリエピト
ープ抗原被分析物と混合し、この混合物を充分な
時間インキユベートして抗原を表面上で受容体と
結合させる。通常は抗原の結合は希釈しない試料
中で行なわれる。次にこの混合物に受容体に結合
した酵素触媒、溶質（表面に結合した酵素の基
質）および残りの試薬（信号発生化合物への別の
すべての前駆体を含む）を単一試薬として加え
る。ここで溶質から得られる生成物は信号発生化
合物への前駆体のみではない。別法としては表面
をこの単一試薬に移入する。前記した如く、信号
は分析媒体中で表面の上でよみとられるかまたは
表面を分析媒体からとり出して、別の所でよみと
られる。表面から検出しうる信号は表面に結合し
た触媒−結合−mipの量に比例するであろう。い
いかえれば試料中の被分析物に比例するものであ
ろう。 表面上に第２酵素を使用する代りに、異なつた
mip上に二種の異つた酵素を結合する（すなわち
二つともリガンド上か二つとも受容体上かのいず
れかに結合する）か、あるいは二つとも同じmip
上に結合することができる。重要なフアクター
は、免疫学的対結合は表面における信号生成系の
二つのメンバーまたは分子の濃度を部分的に高め
ることであり、このメンバーは互に反応し合うこ
となく信号発生化合物の濃度変化を高めるように
相互作用する。 信号発生化合物を調製するために２段階工程を
用いる場合には信号生成系の成分として溶質およ
び触媒−結合−mipの他にさらに第三試薬を加え
てもよいしまたは加えなくてもよい。重要なこと
は、表面での免疫学的結合はバルク溶液と比較し
て表面での信号生成系の成分を濃くする機会を生
ずることである。 信号発生化合物の全体的な生成速度または破壊
速度に対する信号生成系成分の協同作用または相
互作用が信号生成系の成分の平均的な空間距離
（近接さ）に関係する場合、免疫学的対結合を介
して触媒−結合−mipを表面に結合することは信
号生成系の成分の濃度をバルク溶液に比較して部
分的に高めさせ、その結果バルク溶液中の信号発
生化合物の発生が表面の信号発生化合物の量に与
える影響を最小にする。 別法として、あるいはさらに追加する方法とし
て、バルク溶液中の溶質以外の信号生成系成分と
選択的に反応または相互作用するスカベンジヤー
を加える方法がある。スカベンジヤーは触媒反応
または非触媒反応の進行を防げるかあるいは信号
発生化合物が信号を発するのを妨げるのかのいず
れかによつてバルク溶液中で信号生成系が作動す
るのを妨害するようにはたらく。 通常、信号は電磁線（特に紫外線または可視光
線）の吸収または発光（特に吸収）または表面の
電気的性質を観測することによつて行なわれる。
望ましくは光線は約250〜800nｍ、普通は約350
〜700nｍの範囲である。肉眼的な検査、レフレ
クトメーター、螢光計、分光光度計等が使用さ
れ、それらは信号発生化合物によりまたは表面の
性質（すなわち不透明か透明か）による。通常被
分析物の量に関係するのは表面上の信号発生体の
強さ（透過または放射）である。 信号観測温度は約−190〜50℃、より普通には
約15〜40℃である。 既知量の被分析物を有する標準試料が作られ
る。次に濃度と信号を関係づけるために各標準試
料の観測信号をプロツトしまたは肉眼的に比較す
る。さもなければ、種々の濃度に対応していくつ
かの表面を用意し、試料の表面と標準とを肉眼的
にまたは分光的に比較する。所望の精度により、
標準を前カラーチヤートのように作つてもよい
し、試料測定する分析者が作つてもよい。一度標
準曲線ができ上ると、観測信号は直接被分析物の
濃度に関係づけられる。 カリブレーシヨンの好ましい方法は、分析に使
用したmipの結合していない表面と同一の表面を
使用することである。受容体−結合−表面と触媒
−結合−受容体を使用してポリエピトープ性抗原
の分析をする場合、触媒−結合−受容体が表面に
結合しないということは試料中に抗原が存在しな
いことを示している。カリブレーシヨン表面は抗
原が存在する場合でも触媒−結合−受容体に結合
できないから、試料と一緒にmip−結合−表面を
用いたのと同じプロトコールにしたがう時、この
表面はネガテイブな試料に対して適当な対照を提
供する。カリブレーシヨン表面からの信号をmip
−結合−表面からの信号と比較することにより、
その相違はすべて抗原の存在を示すことになる。 もう一つの別法は、被分析物およびその同族
mipと異なるmipを有するカリブレーシヨン系を
用いるものである。触媒または触媒−結合−mip
を、カリブレーシヨン表面に結合した受容体によ
つて認識されたハプテンで変性するか、あるいは
特異mip結合に無関係な触媒上または触媒−結合
−mip上の自然部位（natural site）に対する受
容体を用いるのが好都合である。 カリブレーシヨン表面上の受容体濃度を調整す
ることによつて、被分析物の予め定めた濃度（通
常０）によつて作られた信号に一致する擬似分析
応答が生じうる。 上述したように、カリブレーシヨン表面と分析
表面（mip−結合−表面）とを同一の分析条件に
おき、信号を比較する。被分析物濃度が高くなつ
た結果、信号が増加したか減少したかによつて、
そのどちらかの方向におけるカリブレーシヨン表
面と分析表面との間の信号の差が被分析物の存在
を示す。 所望感度、被分析物濃度、結合速度、信号生成
系の性質等の因子に基いて信号測定時間はきま
る。０時には初めの信号に変化がないので、１回
の測定は最後のインキユベーシヨンの終りにのみ
行なわれる必要がある。よりよい定量ではインキ
ユベーシヨン中の合間に測定が行なわれる。イン
キユベーシヨン時間は５秒から36時間にわたる。 リガンド被分析物はモノ−またはポリエピトー
プ性でありうる。表面に結合した受容体と触媒−
結合−受容体との間の橋としてハプテンを用いる
ことができない場合をのぞいて、ハプテンと抗原
被分析物は類似の扱いをうける。もし橋が所望な
らば、複数のハプテンが結合し、限定量の触媒−
結合−受容体を用いるポリ（リガンド相似体）が
使用される。このプロトコールでは、受容体−結
合−表面を試料およびポリ（リガンド相似体）と
混合し、次に触媒−結合−受容体を加える。勿
論、ポリ（リガンド相似体）と触媒−結合−受容
体を触媒に結合したハプテン（ハプテン−結合−
触媒）で替えることができる。 受容体が被分析物の場合、限定量の触媒−結合
−リガンドに対して受容体被分析物と受容体−結
合−表面との間で競合させることができる。さも
なければ、前述したように受容体被分析物に対し
て橋として抗原を用いることができる。その場合
受容体被分析物は受容体に結合した抗原に対して
受容体−結合−表面の場合と同じように触媒−結
合−受容体と競合する。 被分析物、mip−結合−表面および触媒−結合
−mipがすべて同じメンバーである場合には同族
メンバーを加えねばならない。そしてこの同族メ
ンバーは例えば受容体（例えば抗体または多価受
容体……この受容体は抗体以外のもの）かリガン
ド｛例えばポリハプテン（ポリ（リガンド−相似
体））またはポリエピトープ性抗原｝かのいずれ
かに対してポリエピトープ形でなければならな
い。 本方法は複数（２種またはそれ以上）の被分析
物を同時に測定するのに役立つ。異なつた被分析
物（例えば抗原）に対して複数のmipを有する表
面（例えばストリツプ）を使用することによつ
て、（したがつて各mipは固体表面上の特定位置
に置かれ、各被分析物に対して特異的な複数の触
媒−結合−mipと混合される）、各部位の信号発
生は別々の被分析物を示すことになる。 材 料 本分析法に用いられる材料は、被分析物、表
面、信号生成系、および適当なポリ（リガンド相
似体）または多価受容体である。信号生成系は触
媒−結合−mipと溶質との少なくとも二種のメン
バーを有し、しばしば別のメンバーも有する。 被分析物 本発明のリガンド被分析物は、モノエピトープ
性またはポリエピトープ性であることで特徴づけ
られる。ポリエピトープ性リガンド被分析物は通
常ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチドおよ
びタンパク質、多糖類、核酸およびこれらの組み
合わせである。このような組み合わせとしては、
細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリ
ア、核、細胞膜等がある。 大ていの場合、本発明で用いるポリエピトープ
性リガンド被分析物は分子量が少なくとも約
5000、普通は約10000以上である。ポリ（アミノ
酸）の範疇では、対象ポリ（アミノ酸）は一般に
分子量が約5000〜5000000、通常は約20000〜
1000000であり；対象ホルモンの場合には分子量
が通常約5000〜60000の範囲である。 類似構造のタンパク質、特定の生物学的機能を
もつタンパク質、特異な微生物特に病原性微生物
に関係するタンパク質等の一連のタンパク質に関
して多種類のタンパク質が存在しうる。細胞およ
びウイルスに対しては組識適合抗原または表面抗
原（surface antigens）がしばしば重要である。 以下は構造に関するタンパク質の分類である。 プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬タンパク質類 リンタンパク質類 ムコタンパク質類 色素タンパク質類 リポタンパク質類 核タンパク質類 糖タンパク質類 プロテオグリカン類 未分類タンパク質（例えば、ソマトトロピン、
プロラクテン、インシユリン、ペプシン） 人の血漿中に存在する若干のタンパク質は臨床
的に重要であり、次のものがある。 プレアルブミン アルブミン α₁−リポタンパク質 α₁−酸糖タンパク質 α₁−抗トリプシン α₁−糖タンパク質 トランスコルチン ４，6S−ポストアルブミン トリプトフアン−欠乏 α₁−糖タンパク質 α₁x−糖タンパク質 チロキシン結合性グロブリン インター−α−トリプシン阻害因子 Gc−グロブリン （Gc １−１） （Gc ２−１） （Gc ２−２） ハプトグロビン （Hp １−１） （Hp ２−１） （Hp ２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−リポタンパク質 ミオグロビン Ｃ−反応性タンパク質 α₂−マクロブリン α₂−HS−糖タンパク質 Zn−α₂−糖タンパク質 α₂−ノイラミノ−糖タンパク質 エリスロポイエチン β−リポタンパク質 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノーゲン プラスミノーゲン β₂−糖タンパク質 β₂−糖タンパク質 免疫グロブリンＧ、（IgG）、またはrG−グロブ
リン 分子式：γ₂κ₂またはγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ、（IgA）またはγA−グロブ
リン 分子式：（α₂κ₂）ｎまたは（α₂λ₂）ｎ 免疫グロブリンＭ（IgM）またはγM−グロブリ
ン 分子式：（μ₂κ₂）⁵または（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ、（IgD）またはγD−グロブ
リン（γD） 分子式：（δ₂κ₂）または（δ₆λ₂） 免疫グロブリンＥ、（IgE）またはγE−グロブ
リン（γE） 分子式：（ε₂κ₂）または（ε₂λ₂） 遊離κおよびλライト・チエイン（Light
chains） 相補因子： C′₁ C′_1q C′_1r C′_1s C′₂ C′₃ β₁A α₂D C′₄ C′₅ C′₆ C′₇ C′₈ C′₉ 重要な血液凝固因子には下記のものがある。 血液凝固因子 国際記号 名 称 フイブリノーゲン プロトロビン ａ トロンビン 組織性トロンボプラスチン と プロアクセレリン、促進剤グロブリン プロコンバーチン 抗血友病性グロブリン（AHG） クリスマス因子、血シヨウトロンボプ
ラスチン成分（PTC） スチユアート−プロワー因子、アウト
プロトロンビン XI 血シヨウトロンボプラスチン前駆体
（PTA） XII ハゲマン因子 XII フイブリン安定化因子 重要なタンパク質ホルモンには次のものがあ
る。 ペプチドおよびタンパク質ホルモン 上皮小体ホルモン チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリスロポイエチン メラノトロピン（黒血球刺激ホルモン、インテ
ルメジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（向副腎皮質性ホルモン） チロトロピン（向甲状腺性ホルモン） 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） 黄体乳腺刺激ホルモン（ルテオトロピン、プロ
ラクチン） ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシンおよび ブラデイキニン 人胎盤性ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バンプレツシン 放出因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、PIF、MIF 対象となる他の重合体物質はムコ多糖類および
多糖類である。 微生物から誘導される抗原性多糖類の例を次に
示す。

【表】

【表】 分析を受ける微生物は、そのままでも、或いは
溶解、粉砕その他の破砕処理したものでもよく、
得られた組成物またはタンパク質（例、抽出によ
り）を分析する。対象となる微生物は下記を含
む。 コリネバクテリウム属 ジフテリア菌（Corynebacterium diptheriae） 肺炎球菌（Pneumococci） 肺炎双球菌（Diplococcus pheumoniae） 連鎖球菌属 化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes） ストレプトコツクス・サリバルス
（Streptococcus salivarus） ブドウ球菌属 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） 白色ブドウ球菌（Staphylococcus albus） ナイセリア属 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis） 淋菌（Neisseria gonorrheae） 腸内菌科 大腸菌群細菌： 大腸菌（Esherichia coli） アエロゲネス菌（Aerobacter aerogenes） 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae） サルモネラ属： 腸チフス菌（Salmonella typhosa） 豚コレラ菌（Salmonella chcoleraesuis） ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium） シゲラ属： 赤痢菌（Shigella dysenteriae） シユミツツ菌（Shigella schmizii） シゲラ・アラビノタルダ（Shigella
arabinotarda） フレキシナー菌（Shigella flexneri） ボイド菌（Shigella boydii） ゾンネ菌（Shigella sonnei） その他の腸内菌 プロテウス属： 尋常変形菌（Proteus vulgaris） 奇径変形菌（Proteus mirabilis） モルガン変形菌（Proteus morgani） 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） アルカリ大便菌（Alcaligenes faecalis） コレラ菌（Vibrio cholerae） ヘモフイルス−ボルデテラ族 インフルエンザ菌（Hemophilus influnezae） ヘモフイルス・ドウクレイ（H.ducreyi） ヘモフイルス・ヘモフイルス（H.hemophilus） ヘモフイルス・アエギプチクス（H.
aegypticus） パラインフルエンザ菌（H.parainfluenzae） 百日咳菌（Bordetella pertussis） パスツレラ属 ペスト菌（Pasteurella patis） 野兎病菌（Pasheurella tulareusis） ブルセラ属 マルタ熱菌（Brucella melitensis） 牛流産菌（Ｂ rucella abortus） 豚流産菌（Brucella suis） 好気性胞子形成菌 炭ソ菌（Bacillus anthracis） 枯草菌（Bacillus subtilis） 巨大菌（Bacillus megaterium） セレウス菌（Bacillus cereus） 嫌気性胞子形成菌 ボツリヌス菌（Clostridium botulinum） 破傷風菌（Clostridium tetani） ウエルチ菌Ａ型（Clostridium perfringens） ノービ菌（Clostridiim novyi） セプチツクス菌（Clostridium septicum） ヒストリチクス菌（Clostridium
histolyticum） 第三型ロデラ菌（Clostridium tertium） クロストリジウム・ビフエルメンタンス
（Clotridium bifermentans） スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes） ミコバクテリウム属 人型結核菌（Mycobacterium tuberculosis
hominis） 牛型結核菌（Mycobacterium bovis） 鳥型結核菌（Mycobacterium avium） ライ菌（Mycobacterium leprae） パラ結核性腸炎菌（Mycobacterium
paratuberculosis） 放線菌類（真菌様細菌） 牛放線菌（Actinomyces israelii）および
（Actinomyces bovis） アクチノマイセス・ナエスルソデイ
（Actinomyces naeslundii） ノカルジア・アステロイデス（Nocaradia
asteroides） ノカルジア・ブラジリエンシス（Nocardia
brasiliensis） スピロヘータ目 梅毒トレポネーマ（Treponema pallidim） フランベジア・トレポネーマ（Treponema
pertenue） ピンタ・トレポネート（Treponema
carateum） 小スピリルム（Spirillum minus） ストレプトバチルス・モニルホルミス
（Streptobacillus moniliformis） オーベルマイエ回帰熱スピロヘータ（Borrelia
recurrentis） 黄ソ出血病レプトスピラ（Leptospira
icterohemorrhagiae） 犬レプトスピラ（Leptospira canicola） マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニユーモニアエ
（Mycoplasma pneumoniae） その他の病気菌 単球病リステリア（Listeria monocytogenes） 豚丹毒菌（Erysipelothrix rhrsiopathiae） ストレプトバチルス・モニリホルミン
（Streptobacillus moniliformis） ソ径肉芽腫菌（Donvania grannilomatis） バチルス型バルトネラ（Bartonella
bacilliformis） リケツチア属（細菌様寄生虫） 発疹熱リケツチア（Rickettsia prowazekii） リケツチア・ムーセリ（Rickettsia mooseri） 斑点熱リケツチア（Rickettsia rickettsii） コノリ・リケツチア（Rickettsia conori） リケツチア・オーストラリス（Rickettsia
australis） リケツチア・シビリクス（Rickettsia
sibiricus） リケツチア・アカリ（Rickettsia akari） つつが虫リケツチア（Rickettsia
tsutsugamushi） Ｑ熱リケツチア（Rickettsia burnetii） リケツチア・キンタナ（Rickettsia quintana） クラミジア（分類不可能な寄生虫、細菌／ウイル
ス性） クラミジア薬剤（名称未確定） 菌 類 クリプトコツクス・ネオフオルマンス
（Cryptococcus neoformans） ブラストマイセス・デルマチジス
（Blastomyces dermatidis） ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma
capsilatum） コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides
immitis） パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス
（Paracoccidioides brasiliesis） ガロ瘡カンジダ（Candida albicans） アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus
fumigatus） かさ状ケカビ（Mucor corymbifer（Absibia
corymbifera） 藻菌類： リズプス・オリザエ（Rhizopus oryzae） リゾプス・アルリスズ（Rhizopus arrhizus） リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus
nigricans） スポロトリカム・シエンキイ（Sporotrichum
schenkii） フオンセカエア・ペドロゾイ（Fonsecaea
pedrosoi） フオンセカエア・コンパクタ（Fonsecaea
compacta） フオンセカエア・デルマチジス（Fonsecaea
dermatidis） クラドスポリウム・カルリオニイ
（Cladosporium corrionii） フイアロフオラ・ベルルコサ（Phialophora
verrucosa） アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus
nidulans） マズレラ・マイセトミ（Madirella
mycetomi） マズレラ・グリセア（Maburella prisea） アレシエリア・ボイジイ（Allescheria
boydii） フイアロスホラ・ゼアンセルメイ
（Phialosphora jeanselmei） ミクロポルム・ギプセウム（Microsporum
gypseum） トリコフイトン・メンタグロフイテス
（Trichophyton mentagrophytes） ケラチノマイセス・アジエルロイ
（Keratinomyces ajelloi） ミクロポルム・カニス（Microsporum conis） トリコフイトン・ルブルム（Trichophyton
rubrum） ミクロスポルム・アンドウイニ
（Microsporum andouini） ウイルス アデノウイルス類 ヘルペスウイルス類 単純性疱疹 水痘 帯状疱疹 ウイルスＢ シトメガロウイルス 痘疹ウイルス類 天然痘（痘瘡） 種疱 牛痘ウイルス 変態痘 伝染性軟属腫 ピコルナウイルス（Picornavirus）類 ポリオウイルス コツサクサツキ−ウイルス エコーウイルス（Echovirus） リノウイルス（Rhinovirus） 粘液ウイルス類 インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） 耳下腺炎ウイルス ニユーカツスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス 犬ジステンパーウイルス 呼吸シンシチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス（Arbovirus）類 東部馬脳炎ウイルス 西部馬脳縁ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグンヤ（Chikigunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラ（Mayora）ウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフオルニア脳炎ウイルス コロラドチツク熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス（Reovirus）類 レオウイルス１〜３型 肝炎ウイルス類 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス類 ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロニー（Maoloney）白血病ウイルス エプシユタインバル（Epstein Barr）ウイル
ス 下記病気に関係するその他の寄生虫 ドツクハートワーム（ミクロフイラリア） マラリア 住血吸虫症 胞子虫症 放毛虫症 モノエピトープ性リガンド被分析物は一般に約
100〜2000の分子量であり、普通には125〜1000で
ある。対象被分析物は薬剤、代謝産物、毒物、汚
染物質等である。対象薬剤には、アルカロイド類
がある。アルカロイド類の中には、モルフイネ、
コデイン、ヘロイン、デキストロメトルフアン、
これらの誘導体および代謝産物であるモルフイネ
アルカロイド；コカイン、ベンジルエクゴニン、
これらの誘導体および代謝産物であるコカインア
ルカロイド、リゼルグ酸のジエチルアミドを含む
麦角アルカロイド；ステロイドアルカロイド；イ
ミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアルカロイ
ド；イソキノリンアルカロイド；キノリンアルカ
ロイド（キニンおよびキニジンを含む）；ジテル
ペンアルカロイド；これらの誘導体および代謝産
物がある。 次の薬剤群はステロイド類である。ステロイド
類にはエストロゲン、ゲストゲン、アンドロゲ
ン、アンドレノコルチカルステロイド、胆汁酸、
強心性の配糖体およびアグリユン（ジゴキシン、
ジゴキシゲニンを含む）、サポニンおよびサポゲ
ニン、これらの誘導体および代謝産物がある。ま
たジエチルスチルベストロールの如きステロイド
擬似物質も含まれる。 次の薬剤群は５〜６員環のラクタムで、これに
は例えばフエノバルビタールおよびセコバルビタ
ールのようなバルビツール酸塩、ジフエニルヒダ
ントイン、プリミドン、エトスクシイミドおよび
それらの代謝産物がある。 次の薬剤群はアルキル基に２〜３の炭素原子を
有するアミノアルキルベンゼン（例、アンフエタ
ミン）、カテコールアミン、（例フエドリン）、Ｌ
−ドーバ、エピネフイリン、ナルセイン、パパベ
リン、これらの代謝産物である。 次の薬剤群はベンズ複素環類で、オキサゼパ
ン、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラ
ミン、これらの誘導体および代謝産物を含み、複
素環はアゼピン、ジアゼピンおよびフエノチアジ
ン類である。 次の薬剤群はプリン類であつて、テオフイリ
ン、カフエイン、これらの誘導体および代謝産物
を含む。 次の薬剤群は大麻から誘導される薬剤であつ
て、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビ
ノールを含む。 次の薬剤群はビタミン類であつて、例えば、ビ
タミンＡ、Ｂ（例、B₁₂）Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、
葉酸、チアミンである。 次の薬剤群はプロスタグランジン類であり、こ
れはヒドロキシル化および不飽和の程度や位置に
よつて異なる。 次の薬剤群は抗性物質であつて、ペニシリン、
クロロマイセチン、アクチノマイシン、テトラサ
イクリン、テラマイシン、これらの代謝産物およ
び誘導体がある。 次の薬剤群はヌクレオシドおよびヌクレオチド
であつて、適当な糖およびリン酸塩置換基を有す
るATP、NAD、FMM、アデノシン、グアノシ
ン、チミジンおよびシチジンである。 次の薬剤群は、個々別々のいろいろな薬剤であ
つて、メタドン、メプロバメート、セロトニン、
メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプ
ロカインアミド、プロプラノノール、グリセオフ
ルヴイン、バルプロン酸、ブチロフエノン類、抗
ヒスタミン類、コリン抑制剤（アトロピン等）、
これらの代謝産物および誘導体である。 次の化合物群はアミノ酸および小さなペプチド
であつて、ポリヨードチロニン類、例えばチロキ
シンおよびトリヨードチロニン、オキシトシン、
ACTH、アンギオテンシン、メトおよびロイ−
エンケフアリン、これらの代謝産物および誘導体
である。 病気の状態に関連する代謝産物はスペルミン、
ガラクトース、フエニルピルビン酸およびポルフ
イリンタイプＩである。 次の薬剤群はアミノグリコシド類であつて、例
えばゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイ
シンおよびアミカシンである。 多くの対象薬剤はアラルキルアミン構造をもつ
ており、例えばアルカロイド、フエノバルビドー
ル、ジランチン、エピネフリン、Ｌ−ドーパ等の
ような複素環構造の一部であつてもよいし、なく
てもよい。構造上は類似性があるが、活性に関し
ては広く相違する。 薬剤を使用する本来の目的に関して薬剤自体に
も考慮が払われる。多くの場合、ぜん息、てんか
ん性疾患、心臓血管病、高血圧、細菌性またはウ
イルス性感染症、胃腸感染症等の治療に使用する
薬の薬量を監視して薬の機能を維持するように調
整することが望ましい。それぞれの場合、血液、
血清、唾液等の生理学的液体を検査して投与した
薬が個々の治療薬量の範囲内であることを確め
る。 対象毒薬にはポリハロゲン化ビフエニル類、リ
ン酸エステル類、チオリン酸エステル類、カーバ
メート類、ポリハロゲン化スルフエンアミド類、
これらの代謝産物および誘導体がある。 受容体被分析物の場合、分子量は一般に10000
〜２×10⁶の範囲であり、普通10000〜10⁶である。
免疫グロブリン、IgA、IgG、IgEおよびIgMで
は分子量は一般に約160000〜10⁶の範囲である。
酵素の分子量は一般に約10000〜6000000である。
天然受容体は広範囲であつて、一般に分子量が少
なくとも約25000であり、10⁶またはそれ以上のも
のもありうる。例えばアビジン、チロキシン結合
性グロブリン、チロキシン結合性プレアルブミ
ン、トランスコルチン等の物質がある。 リガンド相似体 リガンド相似体は水素または官能基を結合の手
または結合基（例えばヒドロキシル、アミノ、ア
リール、チオ、オレフイン等の活性な官能基をも
つ他の分子に共有結合するための官能基を有す
る）で置換されている点リガンドと相違する。そ
の結果生ずる化合物は水素が置換したことよりは
むしろその化合物が結合した分子によつてリガン
ドと相違する。結合基は弾常水素以外の原子を１
〜20有し、これらの原子は炭素、酸素、硫黄、窒
素および原子番号17〜35のハロゲンである。これ
に含有される官能基はカルボニル（オキソと非オ
キソの両方）、活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプ
ト、エチレン、特別に活性化したエチレン、アミ
ノ等である。複素原子の数は一般に約０〜６の範
囲であり、普通は約１〜６、好ましくは約１〜４
である。結合基の詳細は米国特許第3817837号に
あり、その記述をここに参照引用する。 大ていの場合、結合基は脂肪族であるが、ジア
ゾ基をもつ芳香族基もある。一般に結合基は鎖中
に約１〜10の原子、普通は約１〜６の原子を有す
る２価の鎖である。酸素は通常オキソまたはオキ
シとして存在し、炭素および水素に結合してお
り、好ましくは炭素にのみ結合している。一方窒
素は通常アミノとして存在して炭素にのみ結合し
ているかアミドであり、また硫黄は酸素と類似し
ている。 結合すべき分子と結合基との間に共有結合を形
成する官能基はアルキルアミン、アミド、アミジ
ン、チオアミド、尿素、チオ尿素、グアニジンお
よびジアゾが普通である。 ポリペプチドとの結合に特に用いられる結合基
はカルボン酸類であり、これはジイミド類と併用
してもよいし、または炭酸モノエステルとともに
混合無水物として用いてもよくまたはＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフエニルの
如き活性なカルボン酸エステルとして用いてもよ
い。窒素性類似化合物はイミドエステルとして用
いられる。還元的アミノ化条件、例えば水素化ホ
ウ素の存在下でイミン形成のためにアルデヒドを
用いるとアルキルアミンが生成する。使用しうる
その他の非−オキソカルボニル基はイソシアネー
ト類およびイソチオシアネート類である。また活
性ハロゲン化物も使用することができ、特にブロ
ムアセチル基が用いられる。 多くの場合、リガンドは結合基に結合するため
の部位として使用可能な官能基を１つまたはそれ
以上もつている。特にヒドロキシ、アミノおよび
アリール基、特に活性化したアリール基が使用さ
れる。また、オキソ官能基からオキシムも作ら
れ、ヒドロキシルがカルボキシメチルのような結
合基に結合するための部位として用いられる。 結合基の選択は非常に広範であり、リガンドに
存在する官能基、リガンドが結合すべき化合物中
の官能基、所望の結合基の性質および長さ等によ
つて選択がきまる。 固体表面 表面は多様である。通常、表面は信号生成系の
メンバーを強く吸着しないように（これは分析に
悪影響を及ぼす）、信号発生系によつて発生した
信号の測定を妨げないように、そして分析中表面
の物理的完全性が保てるように選ばれる。表面は
いろいろな形をしていてよく、種々の物理的特性
もつてもいてもよく、種々の化学組成をもつてい
てもよく、組成物や積層体の混合物やまたはそれ
らの組み合わせのように１つまたはそれ以上の組
成物であつてもよい。特定の表面は、表面上に信
号発生化合物を不溶化することによつて信号発生
化合物と相互作用し、あるいは表面に結合した化
合物を錯化させ、反応させ、または相互作用させ
て信号発生化合物を形成または破かいする。 表面は使用方法および測定方法により種々の形
状および形態でよく、また種々の大きさをとりう
る。表面は棒、管またはカピラリー、せんい、ス
トリツプ、円板、プレート、つぼ等によつて支持
されている。表面は適用層が比較的厚みの小さい
ものである場合、すなわち通常0.1μ以上、より通
常は1μ以上、普通には10μ以上または表面の性
質、使い易さ、および所望の性質によつてはそれ
以上の場合、支持体の必須部分であるかまたは支
持体と別になつている。 表面は不透明、半透明または透明である。また
表面は固体、ゲルまたは粘性液体であり、透過性
または不透過性であり、多孔性または非多孔性で
あり、吸収性、網状、渦巻形溝形であり、でこぼ
こであり平滑であり、あるいは連続、非連続層で
被覆されていてもよい。表面は信号発生化合物が
少なくとも0.1μの深さまで、より好ましくは少な
くとも1μ、さらに好ましくは少なくとも10μまで
浸透できるものが好ましい。 また表面をその機能にしたがつて考えてみる。
表面は媒体から識別しかつ通常は媒体から分離す
ることができるように、水性分析溶液中に別個の
不連続の存在を維持する基体または支持体として
役立つ。表面は表面に結合するmipを支持するの
に役立つので、mipか表面と無関係に溶液中に拡
散することが不可能である。さらに、表面は信号
発生化合物の支持体として、すなわち、析出層の
基体としてかあるいは共有または非共有付着のた
めの支持体としてはたらく。表面は表面を浸漬す
る液体媒体から区別しうるという点で実際上非流
動的で非連続的であり、mip、信号発生系のメン
バーまたは共有的または非共有的に結合している
他の適当な化合物を支持するための画然とした基
体またはフアンデーシヨンを提供する。表面は帯
電形または非帯電形で存在してもよい。帯電が信
号生成系の作動に有利な場合は帯電する。 いろいろな材料が使用されるが、まず第１の条
件は、信号発生化合物を表面に結合させること信
号発生を妨害しないこと、表面に容易に結合する
こと等である。 固体反応の材料としては、多様な有機および無
機ポリマー類（天然および合成の両方）が使用し
うる。ポリマー類の例としては、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポ
リスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレ
ンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ
（ビニルブチレート）、シリコン類、ポリホルムア
ルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロ
セルロース等がある。その他の使用可能な材料
は、紙、ガラス、セラミツク、金属、非金属、半
導体、サーメツト等である。さらにゲル形成物質
があり、例えば、ゼラチンのようなタンパク質、
リポ多糖類、シリケート、アガロースである。ま
たポリアクリルアミドあるいは数種の水性相を形
成するポリマー類、例えばデキストラン、ポリア
ルキレングリコール（アルキレンは炭素原子数２
〜３）または両親媒性化合物の如き表面活性剤、
例えば燐脂質、長鎖（炭素数12〜24）アルキルア
ンモニウム塩等である。 固体表面が多孔質である場合、系の性質により
孔の大きさはいろいろとなる。ある場合には、孔
の大きさは表面に結合した触媒に近づかないよう
に限定される。カツトオフサイズは数万例えば
20000〜数百万ダルトン例えば２千万にわたり、
通常は5000ダルトン以上である。 固体表面に用いる特定の材料は分析媒体に不溶
性であり、膨潤性でも非膨潤性でもよいが非膨潤
性が好ましく、疎水性でも親水性でもよく、すな
わち極性でも非極性でもよく、好ましくは親水性
であり、薄い単分子層または異つた組成の多分子
層で被覆されていてもよく被覆されていなくても
よく、単一物質でも特に積層体やせんいのような
複数の物質でもよく、織られていても、鋳造され
ていても、押出成型されていても、蝕刻されてい
ても、凝集されていてもよい。 表面を作る場合、積層体のように複数の材料を
使つて種々の性質をうることができる。例えば、
多孔層を非多孔性の透明なつぼ（cuvette）の壁
に付着させる。これは隣接層を保護しながら信号
をみるための窓を提供する。表面は、信号発生化
合物の結合性を強め、特定方向への移動を阻止
し、半透過性膜として作用する等の目的のために
調整することができる。非特異的結合を阻止し、
共有結合を簡単にし、信号検知を高める等のため
に、例えばゼラチンのようなタンパク質被覆をし
てもよい。しかし、使用する物質が吸着性の強い
ものであつてはならないということが理解されね
ばならない。何故なら、バルク溶液中で生成して
表面に拡散する信号発生化合物を吸着してしまう
ためである。 表面支持体は、試料の大きさ、プロトコール、
信号測定手段等により特定の大きさのものが都合
がよい。 minと表面との間、あるいは結合しなければな
らない他の化合物の間に共有結合を生じさせるた
めに、反応は多官能性であるか、または多官能化
されうるものであるのが普通である。表面上に存
在し結合のために使用される官能基は、カルボン
酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
基、ヒドロキシル基、メルカプト基等である。多
様な化合物を種々の表面に結合する方法は公知で
あり、文献に充分説明されている。例えば“非可
動化酵素（Immoblized Enzymes）”、（Ichiro
Chibata、Halsted Press、New York、1978）
および“Cuatrecasas、”（J.Biol、Chem.245
3059（1970））参照）。 結合基の長さは結合される化合物の性質、結合
される化合物と表面との間の距離が結合される化
合物の性質に及ぼす結果、結合される化合物の架
橋力等によつて広範にわたる。 結合基は結合の手であつてもあるいは鎖中約12
以下、通常は約10以下の原子を有してもよい。結
合基は脂肪族、脂環族、芳香族、複素環族または
これらの組み合わせでもよい。結合基の水素以外
の全原子数は約20以下、通常は約16以下であり、
これらは炭素、酸素（オキシまたはオキソをし
て、オキソ−カルボニルおよび非オキソ−カルボ
ニル、の両方）、窒素（アミノまたはアミドとし
て）およびイオウ（チオまたはチオノとして）で
ある。例えば、メチレンカルボニル、コハク酸イ
ミド、α−ハロアセチル、チオメチレン、グリシ
ルまたはポリグリシル、スクシンジオイル、マレ
ジオイル、グルタール、ジアルキリデン、メチレ
ンフエニルジアゾおよびウレイドがある。 mipは常に共有または非共有的に固体表面に結
合される。プロトコールの性質により、結合mip
の量は、限定されているかあるいは試料中に存在
すると予想される最高量の被分析物量（被分析物
の結合部位に基づく）より過剰である。さらに信
号生成系の１またはそれ以上のメンバーも固体表
面に結合しうる。しばしば結合する信号生成系の
メンバーの量は比例的であるので、大過剰量が用
いられる。 信号生成系 信号生成系は少なくとも２種のメンバーを有す
る。触媒（通常は酵素）；および溶質である。溶
質は接触反応を行なうことができ、接触反応は信
号発生化合物を直接生ずるか、信号発生化合物へ
の前駆体を生ずるか、あるいは、他の化合物と反
応または相互作用して信号発生化合物を生成、保
護、破かいするような生成物を生成する。 すでに述べたように、１種または複数種の触媒
が用いられ、通常、触媒の少なくとも１種は酵素
である。２種以上の触媒を用いる場合は、通常触
媒の数が３種以上になるとその効果は急速に不利
益によつて相殺される。したがつて、一般に触媒
は３種より多くはならない。追常は２種より多く
ならない。 少なくとも１種の触媒は共有または非共有的
に、例えば特異結合対により、mipに結合する。
１種の触媒分子または同一または異種の複数の触
媒分子が１種またはそれ以上のmipに結合するこ
とができ、さもなくば複数のmipが単一触媒分子
に結合しうる。触媒が複数の場合、どの触媒を固
体表面および／またはmipに結合させるかの選択
は、試薬を作る際の便宜、結合の容易さおよび分
析感度への影響によつてきまる。したがつて、し
ばしばどの触媒を固体表面に結合し、どの触媒を
mipに結合するかを選択することになる。 信号をバルク溶液よりも表面り優先的に伴わせ
るために種々のテクニツクが用いられる。例え
ば、信号発生化合物の不溶化；表面で信号発生化
合物を優先的に生成して表面に結合させること、
ハルク溶液中の触媒−結合−mipを掃去または防
止すること；表面で信号生成系の成分をスカベン
ジヤーから保護しながら、バルク溶液中の信号発
生化合物、触媒または前駆体を掃去すること；お
よび表面で表面上の化合物と相互作用する（反応
も含む）化合物を生成することである。これらの
方法は個々に使われるだけでなく、一緒に使われ
て効果を上げることができる。 不溶性の信号発生化合物を生成するために不溶
化するには、化合物は溶解型から不溶解型へ接触
的に転位する；染料ではロイコ型から有色型へ；
螢光体では非螢光化合物から螢光化合物へ。 多くの染料は種々の天然せんいに結合する時有
色に変ることに基づいて存在する。本発明の場合
も染料が接触的に（特に酵素作用により）不溶化
する際に同じタイプの変化がある。不溶化は酸
化、還元、または加水分解、特に水溶性基、例え
ば有機および無機エテル類、例えばホスフエー
ト、ピロホスフエート、カルボキシレート（例、
ウロネート、サルフエート等）、またはエーテル
類（（例、グリコシジルエーテル）の加水分解で
ある。 種々の化合物をその疎水性−すなわち水性媒体
中での溶解性欠除−を高めるために変化させる。
次にこれらの化合物をその親水性を増すために変
化させる。例えば、信号発生力をかく得した生成
物を触媒除去の際に生じさせるような水溶性置換
基による置換である。例えば、フエノール性化合
物を有機または無機酸でエステル化するか、糖類
でエーテル化する。アミン類をアシル化する。複
素環を酸化または還元して溶解性または不溶解性
を高める。それぞれの場合、生成物は信号発生可
能であるか信号発生に影響を与えることができる
が、反応物は信号発生することができない。 種々の化合物が溶質として用いられ、これらは
接触転位して（１または２工程）信号発生体とし
ての不溶性の電子活性分子または変化分子、発色
団または発螢光団生成物となる。 ある場合には、レドツクス反応が短波長の光吸
収性を有する溶解性化合物をそれより長波長の光
吸収性を有する不溶性化合物に変化させる。別の
方法で溶質として用いることのできる市販の化合
物が不溶性生成物を生成しない場合には、このよ
うな市販化合物を慣用手段により疎水性基、例え
ば炭化水素（例、アルキル）、ハロゲン（例、ク
ロルおよびブロム）、シアノ、ニトロまたはこれ
らの組み合わせで置換して変性することができ
る。市販化合物が不溶性で信号発生化合物の要求
を充たすことができる場合には、このような市販
化合物は、水溶性を付与し化合物の電子活性発色
性または螢光性に実質な変化をもたらす接触的に
除去可能な基で置換するならば溶質として用いる
ことができる。 また本発明は写真に使用する有色カツプリング
生成物を用いるのにも役立つ。触媒−結合−mip
として銀以外の触媒を、活性化して表面に結合し
た化合物と反応して有色カツプリング生成物を生
成する溶質と共に用いると、信号生成系はカラー
写真に匹敵する。本発明に用いられる組成物の優
れた該説および表は“写真工程の理論（The
Theory of the Photsgraphic Process）”第３
版、T.H.James著、The Macmillan Co.、New
York発行（1966）383〜396頁を参照されたい。
この頁を参考のためにここに記載する。 置換アニリン類（特にアミノ置換アニリン類）
とフエノール類（特にナフトール類）のような組
み合わせが特に興味がある。個々の化合物は、α
−ベンゾイル−３−〔α−（４−カルボキシメチル
フエノキシ）アセタミド〕−アセタニリド；１−
フエニル−３−〔３−（４−シアノメチルフエノキ
シ）ベンヅアミド〕−５−ピラザロン；１−〔４−
（３，５−ジメチルフエノキシ）フエニル〕−３−
（４−アミノエトキシ−３−メチルベンザミド）−
５−ピラザロン；および１−ヒドロキシ−Ｎ−
〔γ−（２−ｔ−アミル−４−カルボキシメチルフ
エノキシ）プロピル〕−２−ナフタミドである。
これらの化合物は表面に共有結合しうるか、また
はさらに親油性基で変性して表面に非共有結合す
るようになる。 次の表は溶質として用いられる化合物であり、
これらは１または２工程の接触転位により信号発
生化合物を生成する。ある場合には、化合物の溶
解特性のために、所望の性質を得るための若干の
置換が必要である。発色団および発螢光団の表は
表中の反応の性質のカテゴリーに組みこまれてい
る。 発色団および発螢光団反応 酸化還元 テトラゾリウム塩→ホルマザン ロイコメチレンブルー→メチレンブルー ロイコメルドラブルー→メルドラブルー ４−Cl−１−ナフトール→有色酸化生成物 ロイコフエナジンメルトサルフエート→フエナジ
ンメトサルフエート Ｎ−３，５−ジブロモまたはＮ−３，５−ジクロ
ロ−４−ヒドロキシフエニル−ｐ−ジメチルアミ
ノアニリン→Ｎ−（ｐ−ジメチルアミノフエニル）
３，５−ジブロモ−または３，５−ジクロロキ
ノンモノイミンジヒドロピオシアニン→ピオシ
アニン ２−（2′−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３
−（4′−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムク
ロリド→ホルマザン誘導体 ジヒドロサフラニン→サフラニン※ ロイコベンジルヴイオロゲン→ベンジルヴイオロ
ゲン ジアミノベンジジン→有色酸化生成物 ｏ−トルイジン→有色酸化生成物 α−ナフトール＋ピロニン→螢光生成物 ５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラ
ジンジオン→hv アミノアンチピレン＋１，７−ヒドロキシナフト
ール→有色カツプリング生成物 加水分解 ウンベリフエリルホスフエート→ウンベリフエロ
ン ２，４−ジニトロナフチル−1β−Ｄ−ガラクト
サイド→２，４−ジニトロナフトール Ｎ−（2′−メトキシフエニル）６−ブロモ−３−
カルボキサミド−ナフチル−2β−Ｄ−グルコシ
ドロン酸エーテル→Ｎ−（2′−メトキシフエニル）
６−ブロモ−３−カルボキサミド−２−ナフト
ール ※ 水溶性 好ましい分光光度活性化合物（染料、螢光体お
よび化学発光体）はヒドロキシル基、特に１また
はそれ以上のフエノール性基を有しており、これ
らは親化合物中に存在しているかあるいは導入さ
れうる。ヒドロキシル基はエステル化してエステ
ル、例えばホスフエートおよびウロネートを形成
したり、エーテル、特にグリコシジルエーテルを
形成したりするのに都合のよい部位である。 すでに示したように、酵素性または非酵素性の
触媒が用いられる。酵素性触媒を用いるのが好ま
しい。何故なら、それらはしばしば反応を促進
し、多様な反応に対して融通性があり、且つよく
特徴づけられた性質を有する。 酵素を選ぶに当つては、対象となる反応に関す
るものの他にさらに多くのことを考慮する。例え
ば酵素の安定性、高い反覆率への所望、物理的環
境の変化に対する変化率の感度、基質および生成
物の性質、酵素の有用性、酵素の結合が酵素の性
質に及ぼす影響、試料溶液中に偶然存在するかも
しれない物質の酵素活性に及ぼす影響、酵素の分
子量等である。 以下は国際生化学会の分類にしたがつた前記酵
素類のカテゴリーである。 第表 １ 酸化還元酵素 1.1 供給体のCH−OH基に作用するもの 1.1.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.1.2 受容体としてチトクロームをもつもの 1.1.3 受容体としてO₂をもつもの 1.1.99 その他の受容体をもつもの 1.2 供給体のアルデヒドまたはケト基に作用す
るもの 1.2.1 受容体としてNAPまたはNADPをもつも
の 1.2.2 受容体としてチトクロームをもつもの 1.2.3 受容体としてO₂をもつもの 1.2.4 受容体としてリポエートをもつもの 1.2.99 その他の受容体をもつもの 1.3 供給体のCH−CH基に作用するもの 1.3.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.3.2 受容体としてチトクロームをもつもの 1.3.3 受容体としてO₂をもつもの 1.3.99 その他の受容体をもつもの 1.4 供給体のCH−NH₂基に作用するもの 1.4.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.4.3 受容体としてO₂をもつもの 1.5 供給体のＣ−NH基に作用するもの 1.5.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.5.3 受容体としてO₂をもつもの 1.6 供給体としての還元NADまたはNADPに作
用するもの 1.6.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.6.2 受容体としてチトクロームをもつもの 1.6.4 受容体としてジスルフイド化合物をもつ
もの 1.6.5 受容体としてキノンまたは関連化合物を
もつもの 1.6.6 受容体として窒素基をもつもの 1.6.99 その他の受容体をもつもの 1.7 供給体としてのその他の窒素化合物に作用
するもの 1.7.3 受容体としてO₂をもつもの 1.7.99 その他の受容体をもつもの 1.8 供給体のイオウ基に作用するもの 1.8.1 受容体としてNADまたはNADPをもつも
の 1.8.3 受容体としてO₂をもつもの 1.8.4 受容体としてのジスルフイド化合物をも
つもの 1.8.5 受容体としてキノンまたは関連化合物を
もつもの 1.8.6 受容体として窒素基のもつもの 1.9 供給体のヘム基に作用するもの 1.9.3 受容体としてO₂をもつもの 1.9.6 受容体として窒素基をもつもの 1.10 供給体としてジフエノールおよび関連物質
に作用するもの 1.10.3 受容体として0₂をもつもの 1.11 供給体としてのH₂O₂に作用するもの 1.12 供給体としての水素に作用するもの 1.13 酸素を混入して単一供給体に作用するもの
（酸素酵素） 1.14酸素を１種の供給体に混入して対の供給体に
作用するもの（ヒドロキラーゼ） 1.14.1 １種の供給体として還元NADまたは
NADPを用いるもの 1.14.2 １種の供給体としてアスコルベートを用
いるもの 1.14.3 １種の供給体として還元プテリジンを用
いるもの ２ トランスフエラーゼ 2.1 １炭素基を転移するもの 2.1.1 メチルトランスフエラーゼ 2.1.2 ヒドロキシメチル−、ホルミル−および
関連トランスフエラーゼ 2.1.3 カルボキシル−およびカルバモイルトラ
ンスフエラーゼ 2.1.4 アミジノトランスフエラーゼ 2.2 アルデヒドまたはケトン残基を転移するも
の 2.3 アシルトランスフエラーゼ 2.3.1 アシルトランスフエラーゼ 2.3.2 アミノアシルトランスフエラーゼ 2.4 グリコシルトランスフエラーゼ 2.4.1 ヘキソシルトランスフエラーゼ 2.4.2 ベントシルトランスフエラーゼ 2.5 アルキル基または関連基を転移するもの 2.6 窒素基を転移するもの 2.6.1 アミノトランスフエラーゼ 2.6.3 オキシミノトランスフエラーゼ 2.7 燐含有基を転移するもの 2.7.1 受容体としてアルコール基をもつホスホ
トランスフエラーゼ 2.7.2 受容体としてカルボキシル基をもつホス
ホトランスフエラーゼ 2.7.3 受容体として窒素基をもつホスホトラン
スフエラーゼ 2.7.4 受容体としてホスホトランスフエラーゼ 2.7.5 明らかに分子内であるホスホトランスフ
エラーゼ 2.7.6 ピロホスホトランスフエラーゼ 2.7.7 ヌクレオチジルトランスフエラーゼ 2.7.8 その他の置換ホスホ基に対するトランス
フエラーゼ 2.8 イオウ含有基を転移するもの 2.8.1 サルフアトランスフエラーゼ 2.8.2 スルホトランスフエラーゼ 2.8.3 CoA−トランスフエラーゼ ３ ヒドロラーゼ 3.1 エステル結合に作用するもの 3.1.1 カルボン酸エステルヒドロラーゼ 3.1.2 チオールエステルヒドロラーゼ 3.1.3 燐酸モノエステルヒドロラーゼ 3.1.4 燐酸ジエステルヒドロラーゼ 3.1.5 三燐酸モノエステルヒドロラーゼ 3.1.6 硫酸エステルヒドロラーゼ 3.2 グリコシル化合物に作用するもの 3.2.1 グリコシドヒドロラーゼ 3.2.2 Ｎ−グリコシル化合物を加水分解するも
の 3.2.3 ｓ−グリコシル化合物を加水分解するも
の 3.3 エーテル結合に作用するもの 3.3.1 チオエーテルヒドロラーゼ 3.4 ペプチド結合に作用するもの（ペプチドヒ
ドロラーゼ） 3.4.1 α−アミノアシル−ペプチドヒドロラー
ゼ 3.4.2 ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ 3.4.3 ジペプチドヒドロラーゼ 3.4.4 ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ 3.5 ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用する
もの 3.5.1 線状アミド中の 3.5.2 環状アミド中の 3.5.3 線状アミジン中の 3.5.4 環状アミジン中の 3.5.5 シアニド中の 3.5.99 その他の化合物中の 3.6 酸無水物結合に作用するもの 3.6.1 燐含有無水物中の 3.7 Ｃ−Ｃ結合に作用するもの 3.7.1 ケトン系物質中の 3.8 ハロゲン結合に作用するもの 3.8.1 Ｃ−ハロゲン化化合物中の 3.8.2 Ｐ−ハロゲン化化合物中の 3.9 Ｐ−Ｎ結合に作用するもの ４ リアーゼ 4.1 炭素−炭素リアーゼ 4.1.1 カロボキシ−リアーゼ 4.1.2 アルデヒド−リアーゼ 4.1.3 ケト酸−リアーゼ 4.2 炭素−酸素リアーゼ 4.2.1 ヒドロ−リアーゼ 4.2.99 その他の炭素−酸素リアーゼ 4.3 炭素−窒素リアーゼ 4.3.1 アンモニア−リアーゼ 4.3.2 アミジン−リアーゼ 4.4 炭素−イオウリアーゼ 4.5 炭素−ハロゲンリアーゼ 4.99 その他のリアーゼ ５ イソメラーゼ 5.1 ラセマーゼおよびエピメラーゼ 5.1.1 アミノ酸および誘導体に作用するもの 5.1.2 ヒドロキシ酸および誘導体に作用するも
の 5.1.3 炭水化物および誘導体に作用するもの 5.1.99 その他の化合物に作用するもの 5.2 シス−トランスイソメラーゼ 5.3 分子内酸化還元酵素 5.3.1 アルドースおよびケトースを相互転位す
るもの 5.3.2 ケトおよびエノール基を相互転位するも
の 5.3.3 Ｃ＝Ｃ結合を転位するもの 5.4 分子内トランスフエラーゼ 5.4.1 アシル基を転移するもの 5.4.2 ホスホリル基を転移するもの 5.4.99 その他の基を転移するもの 5.5 分子内リアーゼ 5.99 その他のイソメラーゼ ６ リガーゼまたはシンセターゼ 6.1 Ｃ−Ｏ結合を形成するもの 6.1.1 アミノ酸−RNAリガーゼ 6.2 Ｃ−Ｓ結合を形成するもの 6.2.1 酸−チオールリガーゼ 6.3 Ｃ−Ｎ結合を形成するもの 6.3.1 酸−アンモニアリガーゼ（アミドシンセ
ターゼ） 6.3.2 酸−アミノ酸リガーゼ（ペプチドシンセ
チーゼ 6.3.3 シクロ−リガーゼ 6.3.4 その他のＣ−Ｎリガーゼ 6.3.5 Ｎ−供給体としてグルタミンをもつＣ−
Ｎリガーゼ 6.4 Ｃ−Ｃ結合を形成するもの 特に重要な酵素はクラス１の酸化還元酵素およ
びクラス３のヒドロラーゼであるが、クラス２の
トランスフエラーゼ、クラス４のリアーゼおよび
クラス５のイソメラーゼも特定の場合には重要で
ある。 次の表は、特に重要な酵素のサブクラスおよび
該サブクラス内の特異な酵素を示す。酸化還元酵
素の中では、NADまたはNADP、酸素または過
酸化水素を有するものが特に重要である。ヒドロ
ラーゼの中では、ホスフエートおよびグリコシド
を有するものが特に重要である。 第表 １ 酸化還元酵素 1.1 供給体のCH−OH基に作用するもの 1.1.1 受容体としてNADまたはNADPを有する
もの １ アルコールデヒドロゲナーゼ ６ グリセロールデヒドロゲナーゼ 27 ラクテートデヒドロゲナーゼ 37 マレートデヒドロゲナーゼ 49 グルコース−６−ホスフエートデヒド
ロゲナーゼ 1.1.3 受容体としてO₂を有するもの ４ グルコースオキシダーゼ ガラクトースオキシダーゼ 1.2 供給体のアルデヒドまたはケト基に作用す
るもの 1.2.1 受容体としてNADまたはNADPを有する
もの 12 グリセルアルデヒド−３−ホスフエー
トデヒドロゲナーゼ 1.2.3 受容体としてO₂を有するもの ２ キサンチンオキシダーゼ ルシフエラーゼ 1.4 供給体のCH−NH₂基に作用するもの 1.4.3 受容体としてO₂を有するもの ２ Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ ３ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ 1.6 供給体としての還元したNADまたはNADP
に作用するもの 1.6.99 その他の受容体を有するものジアホラー
ゼ 1.7 供給体としてのその他の窒素化合物に作用
するもの 1.7.3 受容体としてO₂を有するもの ３ ウリカーゼ 1.1.1 受容体としてのH₂O₂に作用するもの 1.11.1 ６ カタラーゼ ７ ペルオキシダーゼ ２ トランスフエラーゼ 2.7 燐含有基を転移するもの 2.7.1 受容体としてCH−OHを有するホスホト
ランスフエラーゼ １ ヘキソキナーゼ ２ グルコキナーゼ 15 リボキナーゼ 28 トリオキナーゼ 40 ピルベートキナーゼ 2.7.5 １ ホスホグルコムターゼ ３ ヒドロラーゼ 3.1 エステル結合に作用するもの 3.1.1 カルボン酸エステルヒドロラーゼ ７ コリンエステラーゼ ８ 擬コリンエステラーゼ 3.1.3 リン酸モノエステルヒドロラーゼ １ アルカリホスフアターゼ ２ 酸ホスフアターゼ ９ グルコース−６−ホスフアターゼ 11 フラクトースジホスフアターゼ 3.1.4 リン酸ジエステルヒドロラーゼ １ ホスホジエステラーゼ ３ ホスホリパーゼＣ 3.2 グリコシル化合物に作用するもの 3.2.1 グリコシドヒドロラーゼ １ アルフアアミラーゼ ２ ベータアミラーゼ ４ セルラーゼ 17 ムラミダーゼ 18 ノイラミニダーゼ 21 ベータグルコシダーゼ 23 ベータガラクトシダーゼ 31 ベータグルクロニダーゼ 35 ヒアルロニダーゼ 3.2.2 Ｎ−グリコシル化合物を加水分解するも
の ５ DPNアーゼ ４ リアーゼ 4.1 炭素−炭素リアーゼ 4.1.2 アルデヒド−リアーゼ 13 アルドリアーゼ 4.2.1 ヒドロ−リアーゼ １ 炭酸脱水酵素 ５ イソメラーゼ 5.4 分子内トランスフエラーゼ 5.4.2 ホスホリル基を転移するもの トリオースホスフエートイソメラーゼ 非酵素触媒も使用しうるが、通常はそれ自体で
使用するのではなく酵素触媒と結合して使用す
る。したがつてそれらの使用は固体表面で信号発
生化合物を優先的に生成することに関連して討議
される。 本発明で特に重要なことは、対の触媒（通常は
２種またはそれ以上）を使用することであり、そ
の場合、１種の酵素の生成物は他の酵素の基質と
して役立つ。１種の酵素は必らずmipに結合する
が１種以上の酵素は表面に結合する。さもなけれ
ば、２種の酵素がmipに結合し、別の酵素は表面
に結合する場合としない場合がある。溶質はどれ
か１つの酵素の基質となるが、表面に結合した酵
素の基質となるのが好ましい。酵素反応は溶質を
別の酵素の基質となる生成物にかえるか、あるい
は溶質を実質的に含有せず酵素基質として役立つ
化合物を生成する。まず初めは、アルカリホスフ
アターゼによりグルコース−６−ホスフエートを
接触加水分解してグルコースにし、このグルコー
スはグルコースオキシダーゼの基質となる。次に
グルコースをグルコースオキシダーゼにより酸化
して過酸化水素を生成し、この過酸化水素が信号
発生前駆体と酵素的に反応して信号発生体を生成
する。 対の触媒はまた非酵素触媒と酵素とを有する。
酵素は非酵素触媒によつて触媒される反応する反
応体を生成するか、または非酵素触媒が酵素のた
めの基質（補酵素も含む）を生成する。例えばメ
ルドラブルーはNADおよびハイドロキノンを
NADHに転換し、NADHは長鎖アルデヒドの存
在下FMN酸化還元酵素および細菌性ルシフエラ
ーゼと反応して光を発生する。 本発明で用いられる多様な非酵素触媒は米国特
許出願第815636号に示されており、その一部をこ
こに参照した。非酵素触媒は１−電子転移により
反応する第１化合物および２−電子転移により反
応する第２化合物を反応体として用いる。これら
２つの反応体はもし酵素がないとしても互にゆつ
くり反応することができる。 酵素の種々の組み合わせを使つて表面に信号発
生化合物を生成することができる。特にヒドロラ
ーゼ類の組み合わせを使つて不溶性の信号発生体
を作ることができる。単一のエキソヒドロラーゼ
は適当な基質を使うと一酵素対と同等に作用する
ことができる。またヒドロラーゼと酸化還元酵素
とを組み合わせると信号発生体を生ずることがで
きる。また酸化還元酵素類の組み合わせも不溶性
の信号発生体を生成するのに用いられる。次表は
信号発生化合物を表面に優先的に生成するために
用いられる種々の組み合わせである。前述したよ
うに表面で触媒を適当に選択すると多くの試薬が
一製剤になるので、表面に好ましい触媒があるよ
うにするのが普通である。 以下の表において、第１酵素は表面に結合する
ものであり、第２酵素はmipに結合するものであ
る。ただし、特定の場合には、逆転することが好
ましいこともある。

【表】 ゼ フエートデヒドロゲナ
エニルホルマザン
ーゼ
7.アルカリホス β−ガラクトシダーゼ O^７−(β−D
−ガラクトシジル−6′− ４−アルキルウムベリ
フターゼ ホスフエート
）４−アルキルウムベ フエロン
ル−リフエロ
ン

【表】 ゼ
2.グルコース−６−ホスフエート＋NA
DP→NADPHフエナジンメトサルフエート＋NADPH
＋トリフエニルテトラゾリウムクロ
リド→ホルマザン
7 アルカリホス 1.O^７−(β−D−ガラクトシジル−6
′−ホスフエート)−4−アルキルウムベリフエロン
フアターゼ →O^７−(β−D−ガラクトシジル)−
４−アルキルウムベリフエロン
2.O^７−(β−D−ガラクトシジル)４−
アルキルウムベリフエロン→4−アルキルウムベ
リフエロン

【表】
ン

【表】
ン
＊ 信号発生体への前駆体は固体表面に共有結合
しうる。
上記の染料の多くを本発明に必要な溶解性をも
つ他の染料または本発明に必要な溶解性をもつよ
うに変りうる他の染料に替えることは勿論可能で
ある。さらに染料を局部的に高濃度にすることに
よつて染料が表面に急速に結合することも認識す
べきである。さらにバルク溶液から表面へ拡散す
る染料の量が増加したとしても表面に沈積する染
料の量に殆んど影響を与えないであろう。染料の
性質により、染料による光吸収か、あるいは螢光
体であれば光放射が測定される。染料の代りに電
子活性化合物を生成して電気的性質を表面で測定
してもよい。 信号発生化合物を生成するための酵素生成物の
化学反応の代りに、酵素生成物を表面に結合する
際に選択的に該生成物の環境を変えて信号発生化
合物を生成することができる。例えば、エステル
またはエーテルを加水分解して表面でPH感応性の
染料の不溶な無色形を生成することができる。表
面上に変色した基をおくことによつて表面の局所
PHをバルク溶液と実質的に相違させうる。プロト
ン濃度に感応する信号発生化合物を用いることに
よつて、表面に結合した生成物からの観測信号は
バルク溶液中すなわち液相中の生成物からの信号
と大きく相違する。また、螢光物質消去剤の対を
用いることもでき、その場合、溶質は不溶性の消
去剤分子を生成し、これが表面に結合する。表面
上の消去剤分子の量が増加すれば、表面に結合し
た螢光分子からの螢光が実質的に減少する。 酸−塩基効果および螢光物質−消去剤対の他に
は、酵素−阻害剤−酵素の組み合わせ、疎水結合
によつて起る媒体効果、酸化還元反応、表面結合
染料を作る共有カツプリング等がある。 信号生成系の成分のためのスカベンジヤーを使
うことによつて、固体表面における信号発生体の
濃度と溶液中の信号発生体の濃度との差をさらに
増すことができる。スカベンジヤーの役割は信号
生成系の成分と相互作用して該成分が検出可能信
号を生成する機能を阻害することである。使用す
るスカベンジヤーは種々の方法で作用することが
できる。 まず第１の方法は、スカベンジヤーを信号発生
体と相互作用させて信号の形成を阻止するように
スカベンジヤーを使用することである。この阻止
作用は化学反応または特異的、非特異的結合の結
果生ずる。化学反応に関する限り、信号発生体の
性質により多様な化学反応が用いられる。例え
ば、もし酸化還元反応によつてロイコ形から有色
形へ染料が移行するならば、バルク溶液中の反応
を逆行させることによつてバルク溶液中の有色形
を実質的に最少にすることができる。使用するス
カベンジヤーは表面上の信号発生体と極めてゆつ
くり反応するか、あるいは全く反応しないかのい
ずれかでなければならない。好都合のスカベンジ
ヤーは酸化還元反応を逆にする酵素か、染料の吸
着特性または放射特性を変化させる抗体である。
表面の信号発生体と相互作用する能力を減少させ
るために、酵素または抗体は単量体または重合体
（例えば粒子に結合している）が用いられる。 信号発生体に対するスカベンジヤーを用いる代
りに、信号発生系の別の成分または中間体に対す
るスカベンジヤーを用いてもよい。表面に結合し
た触媒とバルク溶液中の触媒とを区別するため
に、表面の立体的大きさを利用することができ
る。粒子に結合した阻害性抗酵素を用いて、抗酵
素が酵素に結合する時バルク溶液中の酵素が反応
するのを阻害する。一方、表面に結合した酵素は
自由に反応する。同様に粒子に結合している別の
阻害剤もあり、これと酵素が反応して酵素活性を
消滅させる。 ２種の酵素があり、したがつて中間生成物が存
在する場合には、中間体を破かいする反応体をス
カベンジヤーとして使用しうる。例えば、中間生
成物が過酸化水素である場合、カタラーゼを加え
てバルク溶液中の過酸化水素を破かいする。しか
し、表面では表面に結合した比較的高濃度の触媒
が過酸化水素用カタラーゼとより効果的に競合す
る。この競合は、表面から立体的に閉め出された
粒子にカタラーゼをつけることによつてもつと有
利に行うことができる。所望の効果を達成するた
めに本発明の系を自由自在に使用した時、種々の
系で種々の方法を用いることができる。 最後に、接触反応の生成物と相互作用するであ
ろう表面結合化合物を提供することができる。例
えば、表面上の化合物と反応してこの化合物をロ
イコ形から有色形に変える化合物を生成すること
ができる。このような方法の例は、非酵素性触媒
と表面に結合したテトラゾリウム塩でNADHを
酸化することである。この触媒は例えばフエナジ
ンメトサルフエートまたはメルドラブルーであ
る。NADHは触媒と反応し、これは表面上のテ
トラゾリウム塩と反応して染料を作る。還元した
触媒を再酸化する酸化体の如きスカベンジヤーと
これを有利にカツプリングして、バルク溶液中に
形成された還元した触媒を急速に破かいする。別
の例は例えば表面に結合した１，７−ナフタレン
ジオールである。これはHRPにより生成したア
ミノアンチピリン酸化生成物を補かくする。色原
性の少ない求核電子はスカベンジヤーとしてはた
らく。 信号生成系の次の要素は溶質である。溶質は接
媒転移して生成物を作る初めの反応体である。す
でに述べたように、生成物は多くのさまざまな役
割を演ずることができる。生成物は、固体表面に
結合する信号発生体でありうる。別の場合には、
生成物は第２酵素の基質としてはたらく中間体で
あり、該第２酵素さらに生成物を転移させて信号
発生体を生ぜしめる。別の場合には、溶質は反応
を行なつて化合物を作り、この化合物は次に他の
化合物と反応して信号発生体を生成する。他の化
合物は溶液中に遊離しているか固体表面に結合し
ており、反応は接触反応かまたは非接触反応であ
る。 補助物質 本発明にはしばしば種々の補助物質が用いられ
る。特に分析媒体中には酵素基質、補因子、活性
化剤、スカベンジヤー阻害剤等が含まれる。 さらに通常は緩衝剤や安定剤が存在する。さら
にこれらに加えて、しばしば追加のタンパク質
（例えばアルブミン）や表面活性剤等に非イオン
性表面活性剤（例えばポリアルキレングリコー
ル）等も含まれる。 組成物 多様な被分析物の測定に使用するために、試薬
類の混合物の他に、新しい組成物および固体テス
トフイルムまたはストリツプが準備される。特に
重要なのはハプテンであり、ハプテンは生理学的
活性を有し、酵素、特に酸化還元酵素またはヒド
ロラーゼが共有結合している固体多孔支持体にパ
プテンも共有結合している。固体支持体は酵素が
結合している受容体と一緒に用いられ、その場合
酵素−結合−受容体は酵素−結合−固体支持体の
生成物を基質として用いる。酵素−結合受容体と
一緒に酵素−結合−固体支持体のための基質が用
いられる。固体支持体を含浸するのは固体支持体
上の酵素のための緩衝剤、基質および補因子でよ
く、酵素−結合−受容体と混合した基質または補
因子ではない。種々の試薬の量は被分析物の分析
感度を高めるために適正化される。 抗原被分析物の場合、該抗原に対する受容体か
該抗原かが固体支持体に酵素と共に共有結合され
る。受容体または抗原および酵素を含有する固体
支持体はハプテンを有する固体支持体と相似
（analogous）である。 別の場合には、共有結合している親電子性また
は求核性カツプラーと一緒にモノ−またはポリ−
エピトープ性抗原または受容体が結合している固
体支持体が用いられる。カツプラーはその適当な
相手と反応する。例えば、支持体に結合した求核
性カツプラーと一緒に芳香族アミン類のような現
象剤の酸化形がカツプリングの相手として用いら
れて染料を生成する。染料の還元形が酵素−結合
−mipと一緒に溶質として用いられる。この酵素
はペルオキシダーゼの如き酸化還元酵素である。
ペルオキシダーゼは現象剤の還元形、例えば芳香
族アミンを酸化させ、これが支持体上のカツプリ
ング剤として反応して染料を生成する。カツプリ
ング剤の例はフエノール類、β−ジケトン類、ピ
ラゾロン類等である。 最後に、固体支持体に共有結合した化合物と共
にハプテン、抗原または抗体をもつ固体支持体が
用いられる。この化合物は還元形のメドラブル
ー、フエナジンメトサルフエートまたはメチレン
ブルーと反応し、ロイコ形から有色形に変化させ
る。ストリツプを前述した還元剤の酸化形、酵素
−抗体、接合体と一緒に用いる。ここで酵素は、
望ましくはNADHまたはNADPHまたはその他
の還元剤を生成し、これらは前述の接触還元剤と
反応し、すなわち固体支持体上のロイコ形染料と
反応する。 実 験 次の例は説明のためのものであつて、これに限
定されるものではない。 すべてのパーセントおよび部は他の方法で示さ
れていない限り重量に基づく。ただしリガンド混
合物は容量で示されている。溶媒は指示されてい
ない場合、水を意味する。すべての温度は他の方
法で指示されていない限り摂氏である。次の省略
形が用いられる。 CMM…O₃−カルボキシメチルモルフイン；
HRP…わさび（horse radish）ペルオキシダー
ゼ；NHS…Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド；
EDCI…Ｎ−エチルN′−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド；DMF…Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド；THF…テトラヒドロフラ
ン；BSA…牛型血清アルブミン；HIgG…人の免
疫グロブリンＧ；THC…テトラヒドロカンナビ
ノール誘導体；RT…室温；GO…グルコースオ
キシダーゼ。 例 １ モルフイン−わさびペルオキシダーゼ（HRP）
接合体 10μモルのO³−カルボキシメチルモルフイン、
11μモルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび
12μモルのEDCIを一緒にし、DMF中全量12.1ml
として反応フラスコに入れた。これらの試薬を混
合した後、この混合物を窒素でフラツシユし、冷
室で一夜撹拌した。50ｍＭの炭酸ナトリウム水溶
液（PH9.5）中HRP（２mg）0.5mlに150mlのDMF
を加え、次に上記エステル溶液300μを加え、
この混合物を一夜4゜においた。次に反応混合物を
G50セフアデツクスの２×30cmカラムに入れ、
0.05Ｍトリス、PH7.6、0.1ＭKClで溶出し、タン
パク質をモニターした。空白のフラクシヨンを集
めて0.5mlを得た。これは0.2mg／mlの濃度を有し
た。放射性トレサーを使つてモルフイン／HRP
のモル比が1.86であり、HRPの濃度が200μｇ／
mlであることを検出した。 例 ２ 円形紙−モルフインへのタンパク質カツプリ
ング 以下は紙支持体へタンパク質をカツプリングす
るために使われる代表的なプロトコールである。
直径７cmのWhatman＃２円形紙を0.1Ｍの過ヨ
ウ素酸ナトリウム中で室温で５時間活性化した。
水で広範に洗い、THF中で乾燥させた後、0.2Ｍ
ホウ酸塩、PH8.5、0.5ＭNaCl、0.1M NaBH₃CN
中の適当なタンパク質溶液１mlをこの円形紙に
加え、この混合物を4゜で一夜おいた。次にこの混
合物に２mgのNaBH₄を含有するビシン緩衝液
（PH8.5）を1.4ml加え、これを室温で３時間放置
し、次に１Ｍホウ酸塩（PH8.5）、50ｍＭビシン、
0.2M KCl中で円形紙を洗つた。洗浄液は約20
mlであり、洗浄液中のタンパク質を測定し、円形
紙に結合したタンパク質の量をその差によつて
決定した。 次の表は使用した種々のタンパク質と円形紙
上のタンパク質濃度（μｇ／cm²）を示すものであ
る。

【表】 本発明を説明するために多くの測定が行なわ
れ、分析媒体中に存在するリガンド被分析物を測
定した。 以下の試料溶液が調製された。円形紙は紙
に結合している特定のタンパク質（１種または２
種以上）により指示化されている。

【表】 プロトコールは次のとおりである。円形紙
（デイスク）およびCMMまたはRIgを0.94μの
緩衝剤を使用して混合した。緩衝剤は50ｍＭトリ
ス、PH7.6、100ｍＭ KCl、および0.1mg／ml
BSAである。この混合物を５時間インキユベー
トし、つづいて適当な反応緩衝液１ml中のHRP
−ＭまたはRIg−HRPをインキユベーシヨン緩
衝液に加えるか、あるいはデイスクをインキユベ
ーシヨン緩衝液からとり出して水１mlで洗い、次
に反応緩衝液中のHRP−ＭまたはRIg−HRPと
混合する。紙上にグルコースオキシダーゼが存在
するか否かにより反応緩衝液は異なり、グルコー
スオキシダーゼが存在しない場合には90ｍＭ過酸
化水素20μを充分なＯ−ジアニシジンに加えて
0.1mg／mlとし、グルコースオキシダーゼが存在
する場合には、緩衝剤をグルコース中50ｍＭに調
製し、過酸化水素を加えなかつた。 奇数番号例はデイスクをインキユベーシヨン緩
衝液に保持しそして反応緩衝液を加えて実施した
ものであり、一方偶数番号例はデイスクをインキ
ユベーシヨン緩衝液からとり出し、洗い、次にこ
のデイスクと反応緩衝液とを混合して実施したも
のである。 各々の場合、１mlの反応緩衝液を用いた。奇数
番号例の場合は60分間のインキユベーシヨンを行
なつた。例１、３、５および７では20μの3.9
mg／mlカタラーゼ（30000μ／mg）を加え、例９
および11ではこのカタラーゼ液を10μだけ加え
た。偶数番号例ではカタラーゼを加えなかつた。 例１、５および９ではデイスクが例３、７およ
び11に比べて暗色であつた。この差はリガンドの
存在によつて起つたことを示している。 偶数番号例では、２、４、６および８の反応は
５分間行い、10および12では10分間行つた。偶数
番号例では結果に一層差異があり、デイスクはリ
ガンドが存在した場合は明らかに白色であり、リ
ガンドが不在の場合は暗褐色であつた。 これらの結果は、リガンド（ハプテン性および
抗原性の両方）または受容体の分析をmipに結合
した触媒を用いて行なうことができることを示し
ており、mipに結合した触媒はバルク分析媒体中
に存在するリガンドまたは受容体の量に比例して
表面とバルク分析媒体との間に分配される。本発
明の場合、不溶性の信号発生体が生成してこれが
表面に結合し、そして分析媒体中の被分析物の量
に応じて信号を測定することを可能にする。 次の問題は、被分析物の濃度を変化させること
によつて信号発生体の生成量に与える効果を評定
することである。結果として、媒体中の被分析物
量に表面で生成する信号発生体を関係づける標準
曲線を作つた。プロトコールは次のとうりであつ
た。 500μの緩衝液（50ｍＭトリス、PH7.6、200ｍ
Ｍ KCl、２mg／mlBSA）のはいつている管に、
20μのHRP−モルフイン接合体（0.2μｇ）を加
え、次に20μのO³−カルボキシメチルモルフイ
ン溶液を種々の濃度で加えた。次にこの管にAb_M
GO（２：１）の６mmデイスクを加え、この混合
物を室温で３時間インキユベートした。 次にこのデイスクを３通りの方法で現像した。
第１の方法ではデイスクから上澄液をとり除き、
１mlの緩衝液を加え、除去した。次に１mlの現像
緩衝液（100ｍＭホスフエート、PH6.0、200ｍＭ
KCl、0.1mg／mlＯ−ジアニシジン）と10μの
90ｍＭ過酸化水素を加え、この混合物を５分間反
応させ、次に洗つた。第２の方法では同じ方法を
用いたが、ただし過酸化水素を含有せず、β−Ｄ
グルコース中に15ｍＭで存在する緩衝液を２mlを
使つた点が相違した。反応を30分間つづけ、次に
デイスクをとり出し、洗い、乾燥した。第３の方
法では第２の方法をくり返したが、ただし10μ
の3.9mg／mlカタラーゼ溶液を加えた。 各々の場合、90μｇ／mlのO³−カルボキシメチ
ルモルフインの原料溶液から１：５の連続希釈を
経て最後に1.6×10^-12モルの量に達するまでに、
固体表面の暗色が確実に増加した。中点は1.2×
10^-10モルすなわちO³−カルボキシメチルモルフ
インが約40ngであることがわかつた。 研究の第２シリーズは代表的リガンドとしてモ
ルフインを用いて行なつた。この研究は、分析を
行なう時に種々のバツクグランドを生ずる種々の
試料液を使用した。試薬を次のように調製した。 例 ３ 円形紙−モルフインにタンパク質をカツプリ
ングさせる。 0.1ＭNaIO₄中で12.5cmのWhatman＃２紙を
５時間室温でインキユベートした。次にこの紙
を1Mエチレングルコール中で20分間インキユベ
ートし、つづいて６の脱イオン水で洗つた。次
にこの紙に、50ｍＭホウ酸塩、0.2ＭNaCl、PH
8.6中に適当なタンパク質を加えた溶液1.8mlを加
え、紙をタンパク質溶液と２時間室温で接触さ
せた。次表はタンパク質溶液の組成を示す。

【表】 の吸収度
次に同じ緩衝液中NaBH₄2mg／mlの２mlを紙
に加え、この混合物を室温で１時間放置した。次
に紙を水および緩衝液で洗い、５mg／ml
BSA15％スクロースの溶液に浸漬し、除去し、
凍結乾燥した。 分析に使用するために、3/8″のデイスクに抜孔
し、このデイスクを尿中に７分間室温でインキユ
ベートした。尿はモルフインを含有しないかまた
は100nｇ／mlのモルフインを含有したものであ
る。次にこのデイスクを１mlの現像溶液に移し
た。現像溶液は、0.1mg／ml４−Cl−１−ナフト
ール、２mg／mlBSA、50ｍＭグルコース、0.1M
PO₄、PH7.0、0.2ＭNaClおよび0.1mg／mlｏ−ジ
アニシジンからなる。この溶液に4μのHRP−
Ｍ（20μｇ／ml）を加え、この混合物を室温で30
分間放置した。このテストを15μHRP−Ｍで60
分間くり返した。 両方の場合とも、(1)および(4)に対して明らかに
モルフインの存在を検出し、他の試料も差異が少
なかつた。したがつて複合タンパク質尿混合物中
のモルフインの微量をこの分析で検出しうる。 次の研究は牛乳中のモルフインを検出できるか
どうかを決定することであつた。100nｇ／mlの
モルフインを有する全粗乳および有しない全粗乳
１mlを用いて上記工程をくり返した。工程は
100μの2μｇ／mlHRP−Ｍおよびμの3.9mg／
mlカタラーゼを用い、室温で60分間インキユベー
トし、以下の組成の現像液を使用した点が相違し
た。現像液；50ｍＭビシン、PH8.0、200ｍＭ
KCl、２mg／mlBSA、50ｍＭβ−Ｄ−グルコー
スおよび0.1mg／ml４−Cl−１−ナフトール。
１：１のAb_M：GO溶液を使用して調製したデイ
スクを用いて、モルフイン含有および不含有試料
間の相違が明らかに検出された。（第表参照） 次の研究ではHIgGの測定のためにmipを結合
した固体表面を用いた。適当な濃度のHIgG・
20μを有する緩衝液0.5ml中に６mlの紙デイス
ク（Ab_HIgGGO）を室温で３時間インキユベート
した。上澄液を除去し、デイスクを洗い、0.5ml
の緩衝液とAb_HIg−HRP（DAKO）の13.8μｇ／ml
溶液50μとを加えた。次にこの混合物を３時間
室温でインキユベートし、次に100ｍＭ燐酸塩、
200ｍＭ KCl、50ｍＭグルコースおよび0.1mg／
mlｏ−ジアニシジンの１mlを加えた。室温で30分
経過後、デイスクをとり出し、洗つた。
HIgG0.16μｇから20μｇになるにつれてデイスク
の色が明らかに推移した。 例 ４ THC−HRP接合体 反応フラスコ中に７，９，12−ヘキサヒドロ−
６，６−ジメチル−９−オキソ−３−ペンチルジ
ベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−１−オルのｏ−カルボ
キシメチルオキシムのNHSエステルをDMFに溶
解した0.04Ｍ溶液0.19ml、0.28mlのHRP（1.5mg）、
0.1mlの１ＭNa₂CO₃、PH9.5および0.3mlのH₂Oを
入れ、この混合物を一夜撹拌した。遠心分離して
不溶性物質を除去した後、上澄液を0.1Ｍ
NaHCO₃、0.5ＭNaCl（４）に対して透析した。
残渣をセフアデツクスG50の20×1.5cmのカラム
で50ｍＭトリス、PH7.6、0.2mlでクロマトグラフ
イーし、空白部のピーク（vocd volumepcak）
を単離した。0.26mg／mlで３ml以下。 例 ５ 円形紙−THCにタンパク質をカツプリング
する。 50ｍＭホウ酸塩、PH8.5、0.2ＭKCl中に溶解し
た次のタンパク質溶液を用いた：抗テトラヒドロ
カンナビノール、IgG、23mg／ml；グルコースオ
キシダーゼ、18A₂₈₀／ml 円形紙（Whatman＃１、９cm）を0.1Ｍ
NaIO₄中で室温で４時間活性化し、つづいて３
以下のH₂Oで洗つた。活性化したデイスクに、
3.83A₂₈₀／cmグルコースオキシダーゼとテトラヒ
ドロカンナビノールに対する抗血清0.75mgとを含
有するタンパク質溶液2.5mlを加え、この混合物
を１時間室温で反応させ、つづいて４mg／ml
NaBH₄溶液0.5mlを加え、デイスクを20分毎に回
しながらこの反応混合物を室温で1.5時間放置し
た。次にデイスクを0.5ＭNaCl300mlとH₂O（２
回）で洗い、4゜で湿気を保持した。 THCに対する本方法を示すために、デイスク
（６mm以下）と種々の濃度のTHCを混入した１ml
の尿とを用いた。尿試料をデイスクと室温で10分
間接触させ、次にこのデイスクを、50ｍＭグルコ
ース、50ｍＭ酢酸バルビトール緩衝液、PH7.6、
0.1mg／ml４−Cl−１−ナフトールの１ml中に上
記THC−HRPを1/100に希釈した希釈液10μを
含有する現像液に移し、反応を室温で１時間進行
させた。その終点において、4.7mg／mlのTHCを
含有する尿中のデイスクは陰性の尿試料と明らか
に区別しえた。 本発明によれば、極めて低濃度で被分析物を測
定し、結果を半永久的に記録する簡単な感度の高
い技術を提供することができる。本技術は高度に
教育された人でなくても分析を実施できるもので
ある。免疫学的対のメンバーが結合する速さによ
り、種々のインキユベーシヨン時間が必要とさ
れ、一方信号の現像は比較的短い時間で実施でき
る。その上、試料はそのままかまたはわずかに希
釈するだけで用いられるので、免疫学的対のメン
バーが固体表面に結合する速度を高めることがで
きる。 本発明の方法はハプテン、抗原および受容体の
定性および定量測定を提供するものであり、標準
は信号を濃度に関係づけるようにする。表面の可
視的観察により定性または半定量的測定が充分行
われ得るし、一方器具類を使用して結果の定量性
を高めることもできる。また種々多様なテクニツ
クを使つて表面で生成した信号発生体とバルク溶
液中で生成した信号発生体を区別することができ
る。したがつて表面に発生した信号は直接媒体中
の被分析物の量に関係づけられる。 本発明の方法は最少の工程数と最少の試薬調製
数をもつ簡単なプロトコールにより極めて低濃度
の被分析物を測定する方法を提供する点で従来方
法を相違するものである。さらに本発明の方法
は、表面に接触的に結合して表面に信号発生化合
物を生成するmipの結合部位に対する競合または
該結合部位間の協力を有するものである。これは
表面に結合した触媒と溶液中の触媒とを分離する
必要なく達成される。 被分析物を測定するために表面を“浸漬棒”と
して使用することにより、非技術者でも使用でき
る−家庭でさえも使用できる−ようにしたので、
この方法ができる限り個々のステツプが少ないこ
と、同一条件下で対照を実施することを差引き考
慮してもこの方法がだれでもわかる程簡単明瞭で
あること、できる限り測定が少ないことは重要な
ことである。本発明はこれらの目的をかなりの程
度まで達成する。 本発明を理解するために説明および例示で詳細
に示したが、特許請求の範囲内で変更および修正
しうることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被分析物がリガンドと同族抗リガンドとから
   なる免疫学的対の一員（mip）である場合に、該
   被分析物を含有すると予想される試料中の該被分
   析物の存在を検出する方法であつて、 (i) mipに結合した酵素（酵素−結合−mip）を
   表面と液相との間に分配すること、ここで該分
   配はリガンド−抗リガンド結合を仲介として
   mip−結合−表面へ、試料中の被分析物の量に
   相関してなされ、そして該表面は非分散性であ
   ること；および (ii) 該表面に結合した該酵素によつて生成する反
   応生成物の量に影響を及ぼす表面における信号
   発生化合物の濃度変化 を包含し： (a) 水性分析媒体中に (1) 上記試料； (2) mip−結合−表面； (3) 酵素−結合−mip；および (4) 信号生成系の残りの成分 を混合し、ここで信号生成系は上記酵素−結合
   −mipを含む少なくとも１種の酵素と溶質とを
   有し、該溶質は接触反応を行なつて、表面にお
   ける信号発生化合物の生成または破かいをもた
   らす生成物を生成することができ、かつ検出可
   能信号を生成することができ（ただし、信号生
   成系が本質的に酵素−結合−mipとその基質と
   からなる場合、信号生成系が完成するのは、酵
   素−結合−mipを表面に加える時より遅くでは
   ない。）； (b) リガンド−抗リガンド結合の仲介により酵素
   −結合−mipの少なくとも一部が表面に結合す
   るに充分な時間、そして、表面における信号発
   生化合物の量が試料中の被分析物の量に相関し
   て変化するに充分な時間待ち； (c) 表面における検出可能信号の量を試料中の被
   分析物の量の関数として決定することからな
   る、前記方法。 ２ (ii)における変化は、表面に結合した該酵素に
   より生成した反応生成物の量に相関している信号
   発生化合物の濃度変化からもたらせる表面からの
   検出可能信号の強度の変化であり、(a)(2)におい
   て、mip−結合−表面のほぼ全部が均質に上記試
   料と接触していること、(a)(4)において信号生成系
   は上記酵素−結合−mipを含む少なくとも１種の
   酵素と溶質とを有し、該溶質は接触反応を行なつ
   て、表面における信号発生化合物の量に変化をも
   たらす生成物を生成することができ、かつ検出可
   能信号を生成すとることができること（ただし、
   信号生成系が本質的に酵素−結合−mipとその基
   質からなる場合、酵素−結合−mipの表面への結
   合と、信号発生化合物の生成は少なくとも一部同
   時に起る。）、および (c)において、表面における検出可能信号の強さ
   を試料中の被分析物の量の関数として決定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 信号生成系が第２酵素を有し、この第２酵素
   の生成物が酵素−結合−mipの基質となる特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４ 信号生成系の成分と反応し、液相中での信号
   生成系の作用を阻害するスカベンジヤーを信号生
   成系中に有する特許請求の範囲第２または３項記
   載のいずれかの方法。 ５ リガンドがハプテン性リガンドであり、該試
   料中のハプテン性リガンド被分析物の存在を検出
   する方法であつて、(i)において、ハプテン性リガ
   ンドに結合した酵素触媒（酵素−結合、ハプテン
   性リガンド）を表面と液相との間に分配するこ
   と、ここで該分配はリガンド−抗リガンド結合を
   仲介として抗リガンド−結合−表面へ試料中のハ
   プテン性リガンド被分析物の量に相関してなされ
   るものであり、(ii)において信号発生化合物は酵素
   −結合−ハプテン性リガンドの酵素の生成物とし
   て生成される不溶性染料であり、該濃度変化は表
   面に結合した上記酵素により生成した不溶性染料
   の量に相関しており、(a)(2)は抗リガンド−結合−
   表面であり、(a)(3)は酵素−結合−ハプテン性リガ
   ンドであり、(a)(4)において、該信号生成系は酵素
   −結合−ハプテン性リガンドを含む少なくとも１
   種の酵素と１種以上の酵素基質とを有し、該酵素
   基質はロイコ染料またはロイコ染料源を有し、ロ
   イコ染料またはロイコ染料源は酵素−結合−ハプ
   テン性リガンドによつて触媒される酵素接触反応
   を行なつて表面上に不溶性染料を沈着生成するこ
   とができ（ただし信号生成系が本質的に酵素−結
   合−ハプテン性リガンドと基質とからなる場合、
   表面への酵素−結合−リガンドの結合の少なくと
   も一部と不溶性染料の形成は同時に起る。）、 (b)においてリガンド−抗リガンド結合の仲介に
   より酵素−結合−ハプテン性リガンドが表面に結
   合するに充分な時間、そして表面における不溶性
   染料の量が試料中のハプテン性リガンドの量に相
   関して変化するに充分な時間待ちそして、 (c)において不溶性染料からの表面の検出可能信
   号の量を、試料中のハプテン性リガンドの量の関
   数として決定することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ６ 信号生成系が表面に結合した第２酵素を有
   し、この第２酵素が溶質と反応して酵素−結合−
   ハプテン性リガンドの酵素のための基質となる生
   成物を生成する特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７ 被分析物がポリエピトープ性抗原被分析物で
   あり、(ii)において、該信号発生化合物は不溶性染
   料であり、該変化は表面に結合した酵素により生
   成した不溶性染料の量に比例しており、 (a)(3)において、mip−結合−表面と酵素−結合
   −mipのmipのうちの１つは抗リガンドであり、
   (a)(4)において、該信号生成系は上記酵素−結合−
   mipを含む少なくとも１種の酵素を有し、上記酵
   素−結合−mipの酵素接触反応の結果信号発生化
   合物として不溶性染料を生成し、この不溶性染料
   は、酵素−結合−mipがリガンド−抗リガンド結
   合の仲介により表面に結合する時表面上に沈積し
   （ただし信号生成系が本質的に上記酵素−結合−
   mipと該酵素の基質とからなる場合、酵素−結合
   −mipの表面への結合の少なくとも一部と不溶性
   染料の生成とは同時に起る。）、 (b)において、上記酵素−結合−mipがリガンド
   −抗リガンド結合の仲介によつて表面に結合する
   に充分な時間、そして表面における信号発生化合
   物の量が試料中の被分析物の量に相関して変化す
   るに充分な時間待つことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ８ 信号生成系が表面に結合した第２酵素を有
   し、この第２酵素は溶質と反応して上記酵素−結
   合−mipの酵素の基質となる特許請求の範囲第７
   項記載の方法。 ９ 被分析物がリガンド被分析物であり、 (ii)において、該信号発生化合物は不溶性染料で
   あり、該濃度変化は表面に結合した酵素により生
   成した不溶性染料の量に相関し：該方法は (a) 水性分析媒体に (1) 上記試料； (2) mip−結合−表面、ここでmip−結合−表
   面は表面と実質的に均質に接触している；を
   混合し； (b) リガンド被分析物がmip−結合−表面に結合
   するに充分な時間インキユベートし； (c) 充分インキユベートした後ほぼ同時に酵素−
   結合−mipと； (d) 信号生成系の残りの成分を加え、ここで信号
   生成系は少なくとも酵素−結合−mipの酵素と
   溶質を有し、溶質は接触反応して生成物を生成
   することができ、その結果検出可能信号を生成
   できる不溶性染料である信号発生化合物を形成
   し； (e) 上記不溶性染料が試料中の被分析物の量に比
   例して表面上に沈積するに充分な時間インキユ
   ベートし； そして (f) 表面上の検出可能信号の量を試料中の被分析
   物の量の関係として決定することからなること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １０ 信号生成系を加える前に、リガンド被分析
   物が結合済のmip−結合−表面を試料から分離す
   る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 信号生成系は表面に結合した第２酵素を有
   し、溶質は該第２酵素の基質であり、その結果酵
   素−結合−mipの酵素の基質となる生成物を形成
   する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２ 信号生成系は液体媒体中にスカベンジヤー
   を有し、スカベンジヤーは信号生成系の成分と反
   応して液相中における信号生成系の作用を阻害す
   る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３ 被分析物がリガンドと同族抗リガンドとか
   らなる免疫学的対の一員（mip）である場合に、
   該被分析物を含有すると予想される試料中の、該
   被分析物の免疫学的分析用キツトであつて、 (i) (a)mipおよび(b)第２酵素と結合した不溶性表
   面； (ii) mipに結合した第１酵素；および (iii) ロイコ染料（該表面に結合力のある不溶性染
   料を接触反応によつて生成する能力を有する） の組合せを備えており、ここで該第１酵素および
   第２酵素は、一方が他方の性質である関係にあ
   る、前記キツト。