JPS6250664A - 標識試薬の集中域を有する多区域分析試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 本発明は、液状試験媒体中の分析対象物の測定に有用な
多区域分析素子に間する。特に、本発明は、蛍光又は色
素のような検知可能な物理的性質□を有する化学基を含
む標識された試薬（標識試薬）を使用する多層イムノア
ッセイ試験具に関する。

（先行技術の説明） 多区域分析素子又は試験具は、従来から提案されて来て
おり、液状試験媒体中の分析対象物を測定するための、
抗体又は抗原の特定の分析対象物に対する結合補力に依
存する１例えばイムノアッセイのような結合試験法に応
用されてきた。そのような測定法には、分析対象物又は
その抗体の標識体のような標識試薬が、抗原−抗体反応
に関与してそのＭ離種と結合種とを形成し、そのような
種のうちの一つの標識試薬の量を液状試験媒体中の分析
対象物の量に関係づけることができるようにしたイムノ
アッセイが含まれる。原則として、そのような試験法は
、試験を完全に行うために該遊離種と結合種を分離しな
ければならないために、不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ）イムノアッセイと呼ばれる。

必要な分離工程を独自に遂行し液状試験媒体を施した後
にさらなる操作を必要としない多区域、特に、多層分析
素子は、今や当業界で公知である。一般に、そのような
試験具は、イムノアッセイを実行するために、そして、
その試験に含まれる必要な分離工程を達成するために必
要な試薬を含む複数の層を具備する。かかる試験具の多
くは結合種又は遊離種のうちのいずれかの標識試薬によ
って発せられる信号がそこで検知され、測定される検知
層を更に含む。そのような試験具によって提供される検
知可能な信号は、通常１色の変化、蛍光等の光学的な性
質のものである。あるいは、検出は、例えば、電位差測
定又は電流測定の技術を用いた電気化学的測定により達
成することができる。

例えば、そのような多層イムノアッセイ用分析素子は、
欧州特許公報第９７，９５２号及び西独−特許公開公報
（ＤＥ−Ｏ５）第３３２９７２８号に記載されており、
そこには、抗原に対する固定化抗体のような結合相手の
固定化体と検知可能な物質によって標識された抗原とが
組み込まれている。液状試験媒体をそのような試験具に
施すと、試験媒体からの抗原は、固定化抗体との結合に
関して試験具に組み込まれた標識抗原と競合する。標識
抗原の遊離種が固定化区域から離れて移動すると、遊離
種と結合種とへの分離が起きる。

同様に、欧州特許公報第５１，１８３号及び６６．６４
８号には、そのような試験具が開示されているが、それ
らにおいては液状試験媒体中の抗原又は抗体の測定が、
抗原（又は抗体）と抗原（又は抗体）の標識体との、固
定化抗体（又は抗原）のよ、うな、その結合相手の固定
化体に対する競合的結合に依存している。

米国特許第４，２５８，００１号に記載されているもの
のような他の多層イムノアッセイ試験具も提案されてお
り、それらは多数の有機高分子粒子によって形成された
微粒子の３次元格子から成る１以上の層を具備している
。該粒子は、相互に連関した空所を形成し、これによっ
て、高分子量分析対象物が中を通って移送されるとされ
ている。必ずというわけではないが、抗原又は抗体のよ
うな反応性組成物を、それらが共有結合しうる活性な連
結又は結合部位を該粒子上に設けることにより、該粒子
上に固定化することが提案されている。

また別のそのような試験具が、米国特許第４．４４６，
２３２号に記載されており、これは、酵素標識抗体上の
一定数の認識部位に対する分析対象物の結合部及び遊離
種間の競合という原理に基づいている。試験試料中の分
析対象物の測定は、該分析対象物の試験具の一区域にお
ける酵素標識抗体との結合に依存しており、その分析対
象物は次に該試験具の別の区域に入り、そこで分析対象
物に結合した酵素連結抗体の酵素活性が検出される。そ
れらの区域の一つは、さらに結合し固定化された分析対
象・物を含み、それが試験試料からの分析対象物と、酵
素標識抗体との結合に関して競合し、試験試料からの分
析対象物に結合しない酵素標識抗体があればそれと結合
し固定化する。

そのような試験具のとりわけ不利な点は、逆方向への液
体の移行により、下層もしくは検知層へ移行した反応生
成物が上層に再び逆移行して化学的干渉を生じせしめ、
試験の応答を弱めることである。この欠点を克服するた
めに、そのような、流体による反応生成物の逆移行を局
所に食い止めるか又は防止することを試みた分析試験具
が提案されている。

例えば欧州特許公報第５１，１８３号及び６６．６４８
号は、親水性の高分子物質から成る検知可能な反応生成
物を捕集するための層を提案している。欧州特許第６６
．６４８号は検知層に、検知可能な反応生成物に対して
強力な相互作用を示す媒染剤を組み込んで、該層中に検
知可能な反応生成物を捕集することを更に提案している
。かかる媒染剤としては陽イオンポリマー、陰イオンポ
リマー及び第４級塩が載げられる。

同様に、米国特許第４，１４４，３０６号及び４．０４
２，３３５号は多層分析素子を開示しており、これは、
検知し得る種のための媒染体を包含する登録層（ｒｅｇ
ｉｓｔｒａｔｉｏｎ　１ａｙｅｒ）を含み、そこへ、検
知し得る種を捕集することにより、該登録層から検知し
得る種が拡散又は移行することを防いでいる。

かかる試験具の変種が、米国特許第 ４．４５９，３５８号に開示されており、展開層、拡散
性の標識化された抗体を包含する反応層及びラテンクス
粒子のような抗体と非特異的に結合、固定化若しくはこ
れを「媒染」するための物質を包含する登録層を含む多
層素子について記載している。該試験具に、液状試験媒
体を施すことにより、試験媒体からの分析対象物は反応
層中の標識化された抗体と結合して、そこで免疫反応に
よる沈澱物を生ずる。分析対象物と結合しない標識化さ
れた抗体があれば登録層へ拡散し、そこで該層中に包含
された媒染剤によって固定化される。

しかしながら、媒染剤を使用すると、媒染剤の非特異的
結合の結果として、検出し得る反応生成物の形成又は放
出に必要な前提となる反応を妨害することがある。その
ような妨害は、検知及び測定の両者を信頼できないもの
にするばかりでなく、試験具の感受性をも低下させる。

登録層中の媒染剤の難点を克服せんとして、登録層以外
の層中に媒染剤を用いて、形成された検出可能な反応生
成物の登録層又は検知層以外の層内への移行を防止する
ようにした他の分析素子が提案されている。さもないと
そのような移行により検知可能な反応生成物の検出は不
可能になる。

かかる試験具は米国特許第４，１６６．０９３号に開示
され、これは多層分析素子の放射遮断層と試薬層との間
に配備された、種の移行阻止層を含む。検知可能種のた
めの移行阻止層は、分析対象物に対しては透過性を有し
、検知可能な種、例えば試薬層中に形成されている染料
を大部分定着せしめるか又はこれが放射遮断層まで更に
移動するのを防いでいる。そのような検知可能種の移動
阻止層は、試薬層中に形成されている特定の検知可能種
のための媒染剤を含む、しかしながら、そのような阻止
層は、分析対象物の存在によって開始された反応を妨害
し、検知可能種の形成又は放出を防げるか又は実質的に
阻止するという媒染剤の欠点をなおも有する。

多層分析試験素子における流体の逆移行の問題を解決す
るためのまた別の試みが国際特許公開公報ＷＯ３４７０
２１９３号に開示され、これは多孔性又は微細孔性の支
持材料に担持された、酵素標識抗分析対象物抗体に結合
した分析対象物から成る免疫複合体を捕集することを特
徴とする色原体支持体によるイムノアッセイ法を提供し
ている。該支持体は、該支持体材料中の、信号を発する
試薬と反応した際に、標識成分によって発せられる色信
号を集中せしめる働きをする０反応生成物の支持材に対
する共有結合の結果色信号の集中が生じ、流体の逆移行
の問題が単一層を設ることにより解決される。しかしな
がらイムノアッセイには信号を支持体上に局在化すなわ
ち集中させるための多くのインキュベーションや洗浄の
工程が必要である。該イムノアッセイ法においては、色
信号形成に必要な反応がそこで行われる単一層支持体を
設ることにより、流体の逆移行が解決されてはいるが、
多層分析素子には必要とされない長時間のインキュベー
ション及び洗浄工程が必要であるという欠点をなお有す
る。

したがって、本発明の目的は、化学基と、これと相互作
用性の検知試薬との相互作用による検知可能な反応生成
物を試験に含まれる特異的結合反応を妨害することなし
に集中せしめる多区域すなわち多層試験具に゛おける特
異的結合測定法を提供することにより上記の難点を解決
することである。

本発明のまた別の目的は、多区域すなわち多層試験具に
おいて、検知可能種の更なる移行を生じない分析方法に
おける終局点を有する特異的結合測定法提供することで
ある。

さらに、本発明の目的の一つは、液状試験媒体からの分
析対象物の正確な測定のための、実質的に背景信号のほ
とんど無い感受性のよい特異的結合測定法を提供するこ
とである。

［発明の要約］ 本発明は、分析対象物、標識試薬及び標識試薬を検出す
るための固定化された相互作用性試薬間の結合相互作用
に甚く液状試験媒体からの分析対象物の測定を行うため
の多区域試験具を提供する。

本試験具は、流体が流通するような接触状態で、（１）
使用されるイムノアッセイの形式（方式）によって分析
対象物もしくはその結合類縁体の固定化体又は分析対象
物の結合相手の固定化体である固定化試薬を包含した試
薬区域ならびに（２〕標識試薬に対する結合性物質の固
定化体を包含した検知区域からなることを特徴とする。

標識試薬は検知可能な物理的性質を有する化学基で標識
化されかつ検知区域中の、固定化された結合性物質に対
する結合部位を更に有する、分析対象物の結合相手の形
又は分析対象物若しくはその結合類縁体の形をしている
。

本発明の主な利点は、それ自身の検知可能な性質を有し
、固有の又は導入された結合性親和力により、検知区域
中に固定化されうる標識試薬を使用することにある。従
来技術の試験具にあるような別個に移行する検出可能種
は発生せず、応答の固定化及び集中は、極めて特異的か
つ強力な結合相互作用から得られる。

試薬区域中の固定化試薬及び標識試薬は、存在する分析
対象物の量に応じて相互に結合する特異的な結合相手を
含むように選ばれる。標識試薬が分析対象物若しくはそ
の類縁体の標識体である場合、固定化された試薬は分析
対象物の結合相手の固化体であり、分析対象物及び標識
試薬は、固定化試薬への結合に関して競合する。標識試
薬が分析対象物の結合相手の標識体である場合、固定化
される試薬は分析対象物若しくはその類縁体の固定化体
であり、分析対象物と結合しない標識試薬は固定化され
た試薬と結合せしめることにより固定化される。標識分
析対象物又は標識結合相手のいずれを用いた場合にも、
標識試薬の一部は存在する分析対象物の量に応じて固定
化された試薬と結合せずに残るか又は結合が解除される
。

自由に試薬区域内及びそこから移行することができる又
はすることができるようになった標識試薬は検知区域へ
移行し、そこで標識試薬の結合部位が検知区域内の固定
化された結合物質と結合する。その結果固定化された標
識試薬は検知区域から試薬区域まで逆戻りして移行する
ことが防止され、標識試薬の検知し得る化学基は検知可
能な物理的信号を検知区域内に与え、これを測定し試験
媒体中の分析対象物の量と関連づけることができる。

［好ましい実施態様の説明］ 本発明の多区域試験具は１区域化された又は成層された
試験片又は試験具における特異的結合試験法を提供する
。この試験法は、試験具に施すか、又は試験具中に包含
せしめた標識試薬を固定化試薬に結合すなわち固定化せ
しめることにより試薬区域中に保持されるものと自由に
検知区域へ移行するものとに分配することに基づいてい
る。

本発明は検知域へ移行する標識試薬を集中せしめるため
の有利な手段を提供する。

以下の記載を簡単にするために、以後、本発明の試験具
は、主として成層構造から成るものとして記載する。他
の種類の区域が同様の結果を達成することができるとい
うことは理解されるであろう、また、標識試薬は分析対
象物の結合相手の標識体となるように選ばれ、また固定
化試薬は分析対象物の固定化体となるように選ばれる（
当業界では理解されるように固定化分析対象物の代わり
に、分析対象物の類縁体の固定化体を用いてもよい）。

特に、本発明の試験具は、少くとも１つの試薬層と検知
層とから成り、以下により詳細に説明するように、さら
に第２の試薬層を具備することができる。試薬層は、試
験媒体と接触した際に可溶化されない若しくは試薬層か
ら除去され得ない分析対象物の固定化体から成る固定化
された試薬を包含する。検知層は標識試薬のための固定
化された結合物質を包含し、この結合性物質は同様に可
溶化したり、あるいは他の仕方で検知層から除去したり
することができない。第２の試薬層を用いる場合、第１
の試薬層は試験媒体を施したときにそれにより可溶化す
る標識試薬を包含し、第２の試薬層は分析対象物の固定
化体を包含する。

本発明の教示によると、試験具を構成する層は、互いに
流体接触（ｆｌｕｉｄ　ｃｏｎｔａｃｔ）　（流体が流
通するような接触状態）下にあり、これにより、互に関
連している試験具の層は、液体をこれらの層中及び層間
に拡散させることができるようになることに注目すべき
である。そのような流体接触は、試験具の層間に液体試
料、例えば、抗原、ハプテン及び／又は抗体の少くとも
幾つかの成分が通過できるようにするが、流体接触状態
の層間の接触界面に浴って均一であることが好ましい。

したがって、液状試験媒体及び標識試薬を試薬層に施す
と、液状試験媒体及び標識化試薬は試薬層を通過して検
知層中に拡散浸透する。第１と第２の試薬層が設けられ
ている場合は、液状試験媒体は、同様にして第１の試薬
層へ拡散浸透し、それにより、そこに包含された標識試
薬が可溶化され、液状試験媒体及び標識試薬は更に第２
の試薬層を通って検知層へと拡散浸透する。

以上述べたように、一度液状試験媒体及び標識試薬が試
薬層に施され、それに浸透すると、検出される分析対象
物が液状試験媒体中に存在している場合は、存在する実
質的に全ての分析対象物は次に標識試薬と直接流体接触
し、これと特異的に結合する。試薬層と検知層間の流動
性の結果として、形・成された分析対象物／標識試薬複
合体は自由に試薬層内を移行しそれから検知層へ移行す
る。以下により詳細に説明するように、標識試薬は、分
析対象物が標識試薬に結合するための唯一の使用可能な
結合部位を与えることが好ましい。

その結果、一度そのような使用可能な結合部位が分析対
象物によって占められてしまうと１分析対象物／結合相
手複合体は、試薬層中の固定化分析対象物によって固定
化されることなく自由に試薬層内を移行しそれから出る
ことができる。同様に、第１と第２の試薬層が設けられ
ている場合は、液状試験媒体を第１の試薬層に施すこと
により標識試薬は可溶化され、存在する実質的に全ての
分析対象物が標識試薬と直接流体接触し、これと特異的
に結合する。その結果形成された分析対象物／標識試薬
複合体は第１の層内及びそこから第２の試薬層を介して
検知層中に移行して入る。

試験媒体からの分析対象物と結合しない標識試薬があれ
ば、試薬層中の固定化分析対象物に結合し固定化され、
また第１と第２の試薬層が設けられている場合は第２の
試薬層に固定化される。

本発明の教示により１分析対象物／標識試薬複合体が検
知層に一旦移行したならば、該複合体は検知層中に固定
化された標識試薬に対する結合性物質に特異的に結合し
固定化されることに注目すべきである。以下に詳細に説
明するように、標識試薬は、検知可能な物理的性質を有
する化学基を含み、これは液状試験媒体からの分析対象
物と結合して検知層に移行した際に検知測定され、液状
試験媒体中の分析対象物の量と関係づけることができる
。したがって、検知層中に分析対象物／標識試薬を固定
化することにより検知層から複合体が移行して試薬層へ
入ることを防ぎ、正確かつ高感度の検知を可能にし、ま
た検知層中の試験媒体からの分析対象物に結合した標識
試薬の全てを測定することを可能にする。

（標識試薬及び検出システム） 本発明の教示によれば、標識試薬は検知可能な物理的性
質及び検知層中に固定化された結合物質のだめの結合部
位を有する化学基を含む、検知層中に固定化された結合
物質は、当初の分析対象物、標識試薬及び固定化試薬間
の結合反応には関与しないことに注目すべきである。し
たがって検知層中の固定化のための適切な結合性物質の
選択は必ず結合性物質によるそのような結合部位に対す
る選択的認識力によって決定される。好ましくは、標識
試薬は、結合性物質と特異的な結合対を形成するリガン
ド部分を含む、特に、リガンド部分と結合性物質の好ま
しい、代表的な結合対としてはハプテン類とかかるハプ
テン類に対する抗体若しくはそれらのフラグメント；ビ
オチンとアビジン；炭水化物とレクチン；Ａ蛋白質のた
めの完全な結合部位を有する抗体若しくはそれらのフラ
グメントとＡ蛋白質等のような結合対が挙げられる。さ
らに、結合対としては相補的−重鎖オリゴヌクレオチド
配列；エフェクター分子と受容体の対；補欠分子族とア
ポ蛋白質；酵素補因子と酵素；高分子酸と塩基；染料と
蛋白質結合剤；ペプチドと特異的蛋白質結合剤（例えば
リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチド及びリボヌクレアーゼ
Ｓ蛋白質）；酵素阻害物質（可逆性及び不可逆性）と酵
素等が挙げられる。

さらに、標識試薬は、検知区域内に固定化される結合性
物質として作用する、イオン交換物質のような、標識試
薬のための吸着材と結合せしめることにより選択的に固
定化される。言うまでもなく、標識試薬上の結合部位及
び結合性物質が相互の結合に関して選択性を有し、かつ
試験系中の他の試薬と実質的に非特異的結合しないなら
ば、その他の材料も本発明の結合性物質として用いても
よい。

標識試薬の検知可能な化学基は、検知可能な物理的性質
を有する物質である。そのような物質は、イムノアッセ
イの分野ではよく開発されており、一般にそのような方
法におけるほとんどいかなる標識でも本発明の標識試薬
として適用することができる。

特に、検知可能な物理的性質を有する化学基は、検知可
能な信号を与えるのに他の化学品又は物質との化学反応
を必要としないそれら自身の物理的性質に基づいて検知
される基である。そのような基には、主として、ウンベ
リフェロン、フルオレセイン、レゾルフィン（ｒｅｓａ
ｒｕｆ　ｉｎ）、多種のローダミン、ダンシル誘導体、
及びアミノナフタレンスルホンＨ（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ
ｗ、　　（１９７９）２５：３５３参照）のような蛍光
体；ピレンのようなリン光分子；パラ−又はオルト−ニ
トロフェノール、フェノールフタレイン、ナフトールＡ
Ｓ、バラニトロアニリド及びチモールフタレイン等の発
色団、　　３，３５Ｓ、３２．　１２５工及び１４Ｃの
ような放射性同位元素、ＤＯＸＹＬ、ＰＲＯＸＹＬ及び
ＴＥＭＰＯ誘導体等のような窒素酸化物基を始めとする
スピン標識；又はプロトン、フッ化物、酸素、アンモニ
ア及び過敏化水素のような電気活性残基がある。

上記のように、一旦適切な結合反応が起きると、その結
果、検知層へ移行する標識試薬はそこに固定化されてい
る、標識試薬のための適切な結合性物質によって結合固
定化される。したがって、複合体の固定化により、検知
層中の標識試薬の化学基によって与えられた信号は局在
化すなわち集中せしめられ、ここから得られる信号は感
知され測定される。検知可能な物理的性質を有する、か
かる標識に固有の物理的性質又は特徴は、信号が生み出
され、それにより相互作用性物質との化学反応又は相互
作用なしに信号が感知されるので、検知層中に化学反応
物又は相互作用性物質を組み入れる必要がないことであ
る。

検知可能な信号は、反射、透過又は蛍光測光法などによ
って最終的な光学的信号を検知するための好適な装置を
備えた区域に、該試験具を通すことにより測定すること
が好ましい、そのような装置においては１例えば、試験
具素子の上に及び／又はその中に光のようなエネルギー
の源が向けられる。光は、次に１反射性支持体が使用さ
れている場合は、該素子から反射して検知手段に帰り、
放射線透過性の若しくは透明な支持体が使用されている
透過光検知の場合には、該素子を通過して検知器に達す
る。所望ならば、蛍光分光測光又はルミネセンス測定の
従来技術を用いることもできる。電気活性種が、標識と
して使用されている技術においては、電流（ａｍｐｏｍ
ｅｔｒｉｃ）又は電位差検知装置を用いて検知すること
ができる。

（多層分析素子） さて、図面を参照すると、第１図は、互いに流体接触し
ている少くとも、１の試薬層と検知層とから成る本発明
の多層試験具の実施態様を示すものである。上に説明し
てきたように、試薬層には、分析対象物の固定化体（ｒ
）−ＡｎＪで示す）が包含せしめられており、検知層に
は、標識試薬の化学基標識と相互作用性の検出試薬の固
定化体（「ト試薬」で示す　）が包含せしめられている
。

゛　　　分析対象物を含有している液状試験媒体及び標
識試薬の両方を試薬層に施すと、試験媒体及び標識試薬
は試薬層中に拡散し、それにより試薬層中に固定化され
ている分析対象物と流体接触する。

本実施態様において標識試薬及び試験媒体は別個に施し
てもよく、また混合物として一緒に施してもよいが、後
者は標識試薬と試験媒体からの分析対象物との間の固定
化分析対象との結合に関する同等の競合を与えるので好
ましい。したがって、液状試験媒体中にもし分析対象物
が存在すれば、標識試薬である１分析対象物の結合相手
と結合し、それによって形成された複合体は試薬層中を
自由に移行し、またそこから検知層へと移行する。試験
媒体からの分析対象物と結合しない過剰の標識試薬があ
れば、標識試薬中の分析対象物の結合相手を介して試薬
層中の固定化分析対象物と結合し固定化され、検知層へ
の移行が防止される。

また、公知のように、標識試薬を以下により詳細に説明
するように単独成分として液状試験媒体と共に加えたり
、又は別の試薬層中に包含せしめることによって加るこ
とをしなくてもよく、標識試薬は、試薬層中の固定化試
薬と予め結合せしめておいてもよい、結合は可逆性のも
のであるため、分析対象物が存在すればかかる結合のあ
るものは入れ替わりによって検出可能な量の標識試薬を
放出する。

本発明の教示により、分析対象物の結合相手は分析対象
物に対して唯一の特異的結合部位を有することが好まし
いことに注目すべきである。好ましくは、かかる結合相
手は、分析対象物に対して調製された抗体の一価のフラ
グメントであり、これはモノクロナール抗体から精製又
は誘導される。

かかる−価の抗体フラグメントは正常な全ＩｇＧ抗体を
、パパインのような蛋白質分解酵素を用いて消化し、当
業界において一般にＦａｂフラグメントと呼ばれる抗体
フラグメントを製造することにより容易に調製できる。

またかかる−価の抗体フラグメントはまた正常な全Ｉｇ
Ｇ抗体をベズシンのような蛋白質分解酵素を用いて消化
し、次いで化学的に還元して当業界で一般にＦａｂ’フ
ラグメントと呼ばれる抗体フラグメントを製造すること
によっても調製される。

しかしながら、他の結合相手も使用することができるが
、勿、論、結合相手は測定される分析対象物に唯一の特
異的で使用可能な結合又は認識部位を有することが好ま
しい、そのような他の結合相手には、全抗体ハイブリッ
ド、レセプター分子等が含まれる０例えば、幾つかの操
作により得られる全抗体ハイブリッドを用いることがで
きる。かかるハイブリッドは、分泌性骨髄腫（ミエロー
マ）細胞と問題の抗体を分泌する牌臓細胞との交雑によ
り製造されるモノクローナル細胞系統から生体内におい
て調製することができる。得られた細胞系統は、問題の
特異性を有する一つの結合サブユニー／　）とミエロー
マ細胞系統によって規定される特異性を有する第二のサ
ブユニ？）から成るハイブリッド分子を自発的に製造す
ることができる。そのような抗体は、当業界で公知の通
常のタンパク質精製技術によって、最初のミエローマ抗
体又は牌臓細胞の同種の二量体から分離することができ
る。また、ハイブリッドは、尿素（８モル濃度）とジチ
オトレイトールのような還元剤の添加などによる適当な
変性条件下、抗分析対象物抗体を第２の抗体と共に混合
し１次に変性剤を除去して抗体ハイブリッドの再構成を
可能ならしめることにより化学的に形成することができ
る。したがって、再構成された試料の一部は、該第２の
担体抗体用の結合部位を有するハリブリッドを含有し、
これをさらに、当業界で公知の通常のタンパク質精製技
術により精製することができる。

したがって、試験媒体からの分析対象物が一旦標識試薬
の一価の結合相手と（例えば抗体の一価のフラグメント
が分析対象物と）結合すると、その結果標識試薬上には
固定化分析対象物のための使用できる結合部位がないの
で複合体が試薬層中の固定化分析対象物によって非特異
的に固定化されるのが防止される０分析対象物／標識試
薬複合体が検知層に移行すると、標識試薬は固定化され
た相互作用性検出試薬と相互作用を起こす０分析対象物
／標識試薬複合体の固定化試薬との相互作用により、検
知層中に反応生成物が集中すなわち局在化し、それによ
り生じる信号が目視又は適切な器具を使用することによ
って検知測定される。

以下に、より詳細に説明するように、反射層及び放射線
遮蔽剤を除く、本発明の種々の区域すなわち層及び支持
体は、殆んどの場合放射線透過性のものである。かかる
区域すなわち暦及び支持体は可視光、蛍光又はルミネセ
ンスの発光を有効に通過せしめる。特定の放射線透過性
材料は、該材料が包含される素子に用いるために選ばれ
る特定の放射線に応じて選ばれる。したがって上記の試
験具においては、試薬層中の固定化標識試薬又は検知層
中の固定化分析対象物／標識試薬複合体のどちらかによ
って発せられる信号を検知することが可能である。その
結果、それらにより発せられた信号、例えば蛍光又は色
素は検知測定され、液状試験媒体中に存在する分析対象
物の量と関係づけることができる。しかしながら試薬層
と検知層の両方に標識試薬が存在すると、信号を検知す
る方向には関係なく、すなわち適切な装置を試薬層又は
検知層に向けて検知を行っても、そのような信号は互い
に区別することが不可能であるため、両方の層から発せ
られる信号が検知されてしまう、それ放散射線遮蔽剤を
特定の層に包含せしめるか、又は試験具の１ケ所以上の
層と層との間に反射性若しくは放射遮蔽層を組み入れる
ことが望ましい。

特に、本発明の多層試験具に適用されているように、放
射線遮蔽性の層は、第１図に図示した試験具の試薬層及
び検知層の間に位置せしめる。かかる暦を試薬層と検知
層の間に組み入れることにより、試薬層中の固定化標識
試薬から発せられる信号は、非透過性層をそれらの間に
組み入れた結果として検知層中に固定化された分析対象
物／標識試薬複合体によって発せられる信号による妨害
なしに検知される。このようにして、他の層から発せら
れる妨害信号なしに、各層によって発せられる信号が検
知°測定され、液状試験媒体中の分析対象物の量に関係
づけられる。

あるいは、試薬層又は検知層のどちらかに包含せしめる
放射線遮蔽剤を利用することが望ましい。

二酸化チタン、硫酸バリウム、又は酸化亜鉛のような不
透明顔料をこの目的に用いることができる。プラッシュ
ポリマーも、単独に用いるか又は顔料と共に包含せしめ
て、放射線遮蔽性又は他の特性を高めてもよい。そのよ
うな放射線遮蔽層及び放射線遮蔽剤は当業界公知であり
、米国特許第４．０４２．３３５号及び米国特許第４．
２５５，３８４号に記載のものが挙げられる。

標識試薬において、発蛍光団が標識として用いられる時
は、検知可能な信号は、どちらか一方を消光現象を利用
して検知システムから隠すことができ、放射線遮蔽層又
は放射線遮蔽剤の必要がない、信号が遮蔽されるべき層
すなわち区域、例えば検出層で測定する時の試薬層には
、媒体の極性における変化又は例えばＴ−のような重い
原子の消光基の包含の結果として効果的に標識の蛍光を
消光する固定化物質を包含せしめることができる。

試薬層又は検知層のどちらかの標識試薬から発せられる
信号の検知は分光光度計、反射光度計、蛍光光度計又は
ルミネセンス光度計のような適切な器具を用いることに
より達成される０例えば検知が吸収若しくは蛍光に基〈
場合は、かかる器具からのエネルギー源は試薬層に向け
られてこれを透過するか又は検知層に向けられてこれを
透過する。一方、検知がルミネセンスに基く場合は、エ
ネルギー源を必要とせずにそのようなルミネセンスを検
知する適切な器具が用いられる。

さて、図面の第２図を参照すると、第１図に示した試験
具と同様の試験具が示しである。この実施態様において
、試験具は第１の試薬層と検出層との間に配置された第
２の試薬層を更に有する。

この付加層は試験媒体によって可溶化される標識試薬を
そこに包含せしめることを可能にし、第１図に示した試
験具に関してはそうであるように液状試験媒体と標識試
薬とを、試験具に施す前に予゛　　備混合したり、又は
単独に施す必要がない、特に第１の試薬層に試験媒体に
より可溶化される標識試薬（「標識試薬」で示す）を包
含せしめれば、液状試験媒体が該層中に拡散して流体接
触した際に可溶化される。上記のように第２の試薬層に
は分析対象物の固定化体（ｒトＡｎＪで示す）を包含せ
しめ、検知層には標識試薬と結合する物質の固定化体（
「ト結合剤」で示す）を包含せしめる。

液状試験媒体を第１の試薬層に施すと、液状試験媒体は
第１の試薬層中に拡散し、試験媒体からの分析対象物を
、該層中の標識試薬と流体接触せしめる一方、同時に標
識試薬を可溶化する。したがって、試験媒体からの分析
対象物はその結合相手である標識試薬と結合してそれに
より形成された分析対象物／標識試薬複合体は第１の試
薬層中を移行し、またそこから第２の試薬層へ移行する
。第１の試薬層中に結合しない標識試薬、すなわち過剰
の標識試薬があれば、これも第１の試薬層中を移行し、
またこれから第２の試薬層へ移行する。標識試薬の分析
対象分に対する一価の結合相手の結合部位は、試験媒体
からの分析対象物と結合することにより占められている
ので、一旦第２の試薬層中に入ると分析対象物／標識試
薬複合体は固定化されることなく第２の試薬層中を移行
し、またそこから検知層へ移行する。一旦検知暦内に入
ると、標識試薬は該層中に包含される固定化された相互
作用性検知試薬と相互作用を起こし、上記のように反応
生成物を生成する。しかしながら、第２の試薬層中の結
合されない標識試薬は、第２の試薬層中の固定化分析対
象物に対する結合部位を有しており、標識試薬はこれと
結合し、それによって固定化されて検知層へ更に移行す
るのが防止されることに注目すべきである０次に、反応
生成物によって生み出された信号は、上記のように検知
測定され、試験媒体からの分析対象物の量と関係づける
ことができる。

本発明の多層試験具の種々の層は、それ自体が支持体で
あってもよいが、そのような層を支持部材上にコーティ
ングするか、さもなけらばその上に位置せしめることが
好ましい、支持部材は、光又は他のエネルギーに対して
透明であり、意図された信号検知の態様と両立可能なも
のである６例えば、試験具の化学反応により、気体検知
電極によって検出される気体状生成物が発生する場合は
、支持体は、そのような電極と流体接触する液体浸透性
の層である。好ましい支持部材としては、約２００ｒ＋
ｍ〜約９０ｎｍの間の領域内の波長の電磁放射線を通す
ことの可能な透明な支持体材料がある。支持体は、勿論
、２００〜９００ｎｍの全領域にわたって透過性である
必要はないが１分析結果の支持体を介しての蛍光測定に
よる検出にとっては、支持体はより広い領域にわたって
透過性であること、あるいは、検出用に用いられる蛍光
物質の励起スペクトル及び発光スペクルで透過性である
ことが望ましい、また、狭い波長帯において透過性で、
透過率を隣接する波長に縮小した支持体を有することが
望ましい、このことは、例えば、支持体に適当な吸収特
性を有する１以上の着色剤を含浸せしめるか又は被覆す
ることによって達成することができる。

放射線透過性又透明な支持部材は、光のようなエネルギ
ーのビームがそこを通過することを可能にする。該ビー
ムは、次に放射線遮蔽層等から反射して、機器の検知用
構成部分に還る。

例えば、第３図には、本発明の教示により構成された第
１及び第２の試薬層と、検知層をそこにエネルギー源が
向けられる放射線透過性の支持部材上に取り付けるか又
は他の仕方で位置せしめた多層試験具を示したものであ
る。第１の試薬層には、多くの染料分子で標識化され、
結合部分としてそこに結合されたビオチンを有する、測
定される分析対象物に対する一価の抗体フラグメントか
も成る、液状試験媒体によって可溶化する標識試薬（Ｆ
ａｂ−染料ｎ−ビオチン」で示す）が包含される。第２
の試薬層には分析対象物の固定化体（ｒトＡｎＪで示す
）が包含され、検知層には、標識試薬のビオチン結合部
分に対する結合性物質として７ビジンの固定化体（「ト
アビジン」で表わす）を包含する。固定化されたアビジ
ンは標識試薬に対してその過剰量が包含せしめてあり、
検出層中に移行する、実質的に全ての分析対象物／標識
試薬複合体が、固定化される。分析対象物を含有する液
状試験媒体を第１の試薬層に施すと、該媒体からの分析
対象物は標識試薬と直接流体接触し、該媒体の分析対象
物に対する抗体の一価の抗体フラグメントと結合する。

形成された分析対象物／抗体フラグメント／ビオチン化
染料複合体は第１の試薬層中を移行し、またそこから第
２の試薬層を経て検知層へと移行し、そこで該複合体は
、ビオチン結合性部分を該層中の固定化されたアビジン
結合物質と結合せしめることにより固定化される。した
がって、上記のように、一旦試験媒体からの分析対象物
が標識試薬の一画の抗体フラグメントと結合すると、固
定化分析対象物のための標識試薬上には結合部位が残さ
れていないため、その結果固定化分析対象物によって複
合体が第２の試薬層中に非特異的に固定化されることが
防止される。しかしながら、第２の試薬層中に移行する
結合されない標識試薬は、標識試薬の一価の抗体フラグ
メントを固定化分析対象物と結合させることにより該層
中に固定化される。

試験媒体からの分析対象物と結合していない標識結合相
手のいずれも第２の試薬層で固定化されるために、検知
区域中に固定化された標識試薬複合体の発する信号を検
知する際、そこから発生する妨害信号の検知を防ぐこと
が必要である。このことは、放射線遮蔽物質を第２の試
薬層に包・含せしめることにより、あるいは、その代わ
りに１、放射線遮蔽層を第２の試薬層と検知層の間には
さむことにより達成することができる。しかして、エネ
ルギー源を放射線透過性の支持部材を通り、検知層中に
至るように方向づけると、該エネルギーは放射線遮蔽性
物質若しくは層によって反射され、検出層に存在する標
識によってのみ影響される。液状試験媒体が有色物質、
例えば液状試験媒体が全血のときには赤血球を含有する
場合、放射線遮蔽物質又は層は特に好ましく、この場合
放射線遮蔽物質又は層は赤血球による着色の妨害が防止
され、赤血球は濾過されて検知層より上の層内に停る。

本発明の多層分析試験具の種々の層は、上に説明した層
及び配置に限定されるものではないことは理解されるべ
きである。多層試験具と共に用い、そのような試験具の
性能を高め、及び／又は調節する追加の層は、すでに開
示されており当業界で公知である０例えば、第１の試薬
層のすぐ上にそれに隣接して位置せしめられる展開（ｓ
ｐｒｅａｄｉｎｇ）区域又は層を具備せしめてよい。

展開層は、施した液状試験試料を測定し、下にある第１
の試薬層に等しく分布せしめる。

そのような展開区域又は層は、当業界で公知であり、米
国特許第３，９９２，１５１号及び第４．４２７，６３
２号に記載されているものがある。

試験具は、また、種々の層の間に、接着性の又は下塗り
の層として機能して居間の接着を容易にし、さらに１層
の固体支持部材への接着を容易にする中間区域又は層を
具備することができる。中間の区域又は層は、例えば１
分析対象物の中のあるものの検出をさまたげる妨害物質
を除くための試薬を含有するものを用いてもよく、ある
いはまた、生成物検出時の妨害を防ぐために試験具の区
域又は層を隠蔽する放射線遮蔽区域又は暦であってもよ
い、全血中の赤血球のような試験試料中にある種々の妨
害物質の存在を隠蔽するそのような放射線遮蔽層を用い
ることもできる。

多層試験具に包含せしめられている種々の試薬が、その
種々の層を通って拡散する速度をする調節するタイミン
グ区域又は層を設けることが好ましい時もある。そのよ
うなタイミング区域又は層は、試験具中の試薬の使用前
の相互作用を防ぐことにより、インキュベーション時間
及び反応連鎖を調節し、あるいは、試験具の製造を容易
にするために、試験具中に包含せしめられる。

本発明の試験具は、特にクロマトグラフィー分析に適合
した配置に組み立てた、試薬区域、検出区域等を有する
多区域試験具であってもよい、そのような試験具は、液
状試験媒体中に浸漬される吸収性区域を具備し、その場
合、該試験媒体は上向きに拡散して種々の区域に入る。

その様な多区域試験具の区域は、液状試験媒体中に浸漬
されるか又は短時間浸漬されるのに適合したプラスチッ
ク製の支持部材上に取り付けられた試薬パッドの形態で
あってもよい０区域を形成する試薬パッドは、支持部材
上に端部から端部へという関係で位置せしめられ、それ
らの端部は互いに流体接触（流体が流れるような接触状
態）下にある。特に、このような試薬パッドは、それぞ
れをその上に位置せしめた、最下層の液状試験媒体吸収
性パッド又は区域、第１及び第２の試薬パッド又は区域
と、第２の試薬区域上に位置せしめた検知パッド又は区
域を具備する。

上記の試薬区域及び検出区域には、既に説明した多層試
験具の種々の試薬を包含せしめてあり、それらの機能と
同様の機能を遂行することは評価されるすべきである。

しかし、この態様においては、液状試験媒体の試料を試
験具に施す代わりに、多区域試験具の最下層の吸収性パ
ッドが液状試験媒体中に浸漬される。このようにし、吸
収性パッドは試験媒体を吸収し第１の試薬区域、第２の
試薬区域及び検知区域にそれぞれ拡散せしめる燈芯とし
て機能する。米国特許第４．３０１，１３９号及び第４
，３６１，５３７号に記載され、展開液の使用を必要と
する配置の試験具も、本発明に適合させることができる
。上に説明したごとく、第１の試薬区域に拡散する試験
媒体からの分析対象物は、その中に包含せしめられた標
識試薬と結合し、それにより形成された複合体は移動を
続Ｃすて、第２の試薬層を通って。

検知層中に至り、そこで分析対象物／標識試薬複合体は
該層中に固定化された相互作用性検出試薬と相互反応を
起こし、それにより、更に検知測定のための反応生成物
を生じる。同様に、試験媒体からの分析対象物に結合し
ていない第１の試薬区域中の一価の標識試薬はいずれも
、第２の試薬区域中に移行し、そこで、そこに包含せし
められた分析対象物の固定化体により固定化される。

本発明の教示によれば１本明細書中に説明された種々の
層は、液状試料の少くとも幾つかの成分、例えば抗原、
ハプテン、及び／又は抗体に対して透過性の多孔性マト
リックスからなることが好ましいが、そのような透過性
は、通常、多孔性、膨潤能又はその他の特性により生じ
るものである。マトリックス材としては、セルロース、
紙、フリース、フェルト、織布等の多種の多孔性、繊維
性材料等をあげることができ、それらは天然又は合成の
材料のいずれでもよい。そのような材料は、例えば、米
国特許第３．８０２．８４２号、第３．８０９，６０５
号、第３，８９７，２１４号及び第３，９８７，２１４
号に記載されている。

多孔性であるが非繊維性である他の材料としては、米国
特許第３．５５２．９２９号において言及されているも
の等のような微孔性ポリマー等があげられる。

本発明の試験具の種々の層のマトリックス形成材料は、
ゼラチン、アガロース等の浸透性の材料であることが好
ましい、そのような材料は１紙又は織物のようなｍ雄性
で多孔性の材料の場合そうであるような毛管流によるよ
りも、むしろ拡散によって液体を通過せめる。上に説明
した多孔性で繊維性の材料を用いることは可能であるが
、ゼラチン、アガロース等が、光又は他の電磁放射線を
通過せしめる能力のみならず、液体に対する均一な浸透
性の故に、特に好ましい０分析される液状試験媒体が分
かれば、当業者には、適切な材料の選択は明白となる。

本発明の試験具中の分析対象物の固定化のために当業界
で公知の種々の方法を用いることができ、あるいは、試
験具中への固定化を容易にするために該分析対象物の誘
導体又は適当な類縁体を調製することができる。共有結
合によって分析対象物又はその類縁体を固定化するのが
好ましいが、イオン交換又は吸着等の非共有的関係を利
用する他の手段も使用することができる。分析対象物の
固定化は、例えば、紙中のセルロース等の試験具の担体
マトリックス中に、あるいは、薄膜状のゼラチン又はア
ガロース中に直接包含せしめることにより達成すること
ができる。あるいはまた１分析対象物類縁体は、ポリマ
ー担体に結合せしめ、それを次に試験具のマトリックス
中に包含せしめることが可能であるが、該ポリマーは結
合用及び検出用の居間での有意な拡散が防止されるに足
る大きさである。例えばゼラチンにおいては、分子量１
０，０００より大きなポリマーが示すゼラチンマトリッ
クスへの拡散は無視することができる。同様に、アガロ
ースにおいては、分子１２０．０００より大きなポリマ
ーならばマトリックス中に拡散するのが防止される。分
析対象物はポリスチレンマイクロビーズのような極めて
小さい粒子に直接又はポリマー主鎖を介して結合されて
もよく、このマイクロビーズは次に試験具のマトリック
スに包含せしめる。そのような粒子は、ある粒径の範囲
で容易に入手可能であり、ポリスチレン、微品質セルロ
ース、架橋デキストラン及び架橋アガロース、イオン交
換樹脂等がある。それらの物質を担体上に結合するのに
、広範囲の化学技術を用いることができる０例えば、水
溶性カルボジイミドを用いて遊離カルボキシル基を活性
化し、次に種々のアミン化合物を始めとする求核試薬と
反応させることができる；アミド残基又はビーズをヒド
ラジンとの反応によりヒドラジドに変換し、これをさら
にグルタルアルデヒＦ、１．５−ジフルオロニトロベン
ゼン、４゜４′−ジフルオロ−３，３′−ジニトロフェ
ニルスルホン、２，４−ジクロロ−６−カルボキシメチ
ル−アミノー５−トリアジン、ジメチルアジビイミゾイ
ト、ジメチルスベリイミデート等の２官能性試薬と反応
させ、次に、問題の分析対象物又は類縁体と結合したア
ミン又は他の求核試薬と反応させることができる；ヒド
ラジドは亜硝酸との反応によりジアゾ化反応を介してア
ジド基に変換することができる；ヒドラジドは無水コハ
ク酸と反応させ、スペーサー結合基（ｓｐａｃｅｒ　ａ
ｒ■）を有するカルボキシレート基を包含せしめること
ができ；脂肪族アミン又は粒子も、スルフヒドリル誘導
体に高い特異性を示すマレイミド基のような多様な特異
性を有する官能基をアミンに結合させる複素２官能架橋
剤の使用を始めとして、ヒドラジド化学で用いられるも
のと類似の２官能性試薬と反応させることができる；水
酸基は、臭化シアン、塩化トシル、カルボニルジイミダ
ゾール、又はＰ−ニトロフェニルクロロホルメートによ
り活性化することができる：ポリスチレンのような粒子
をニトロ化し該ニトロ基を芳香族アミンに還元し、そし
て、該芳香族アミンを問題の求核性分析対象物／類縁体
との反応の前にジアゾ化することができる。ニトロセル
ロース、ジアゾベンゾキシメチル（ＤＭＢ）紙、誘導体
合成によるナイロンメツシュ、又は臭化シアン、ｐ−ニ
トロフェニルクロロホルメート、又はカルボキシルジイ
ミダゾールを用いて活性化した紙を求核試薬又は反応性
ポリマーに結合された試薬に結合するのに利用すること
ができる。

適切な結合試薬を試薬層に固定化された材料に直接結合
する代わりとして、特異的な結合相手を利用して、分析
の実行中にその場で必要な固定化を得ることもできる。

固定化されるべき材料、１即ち、分析対象物若しくは類
縁体又は結合相手は、別個の結合物質に対する結合部位
を有するか、又は有するように変成せしめることができ
、次に、この物質を試薬層に固定化せしめることができ
る。該固定化され得る材料は、かくして、試験具中のい
かなる好便な位置にも位置せしめることができ、分析の
実行とともに、適切な固定化をもたらす。検出区域中で
標識試薬を固定化する上記の結合性相互作用を用いるこ
とができる。同様に、分析対象物の固定化のために上記
に述べた方法はまた一般に種々の検知試薬又はそれらの
誘導体を固定化するために用いられる。

本発明の試験具は、上に説明してきたように、隣接する
層の間の流体接触を可能にするように組み合わせた複数
の試薬層を用いている。その種々の層は１次々に上に重
なるコーティングを形成するための皮膜形成剤を用いて
製造することができ、あるいはまたフィルター紙又はグ
ラスファイバー又は織物状ボエステル等のＷ＆雄性試薬
マトリックスの層を重ねることにより製造することがで
きる。あるいは、隣接した区域を、上記のごとく、各反
応区域の端部が直接流体接触した状態で各区域を支持部
材に取り付けたクロマトグラフィ一方式に配置せしめる
ことができる。

紙の複数の層は、例えば、周囲を囲むプラスチックの枠
、あるいはその代わりに液状の透過性メツシュスクリー
ンを並置して、あるいは水溶性接着剤を居間に包含せし
めることにより保持することができる。多層フィルムの
流延は、ドクターブレード、押出コーター、マイヤー棒
、パドルコーター又はグラビヤコーターの使用を始めと
する、フィルム流延のための当業界における多くの技法
により達成することができる。あるいは、複数の連続し
た層をカスケードコーターを用いて流延することもでき
る。上記の方法により形成されたフィルム状の層は、試
薬を含有し、一定期間インキュベートされる織物状又は
メツシュ状の材料を用いて表面に旋層することができる
。

（分析対象物） 本分析法は、使用可能な結合相手が存在するいかなる分
析対象物の検出にも適用可能である。通常、分析対象物
は、結合相手が存在し、生物学的システムにおいて生産
可能な若しくは合成可能なペプチド、ポリペプチド、蛋
白質、炭水化物、糖蛋白質、ステロイド、核酸又は他の
有機分子である０分析対象物は、官能基で、通常、抗原
及びその抗体；ハプテン及びその抗体；相補的ポリヌク
レオチド配列；並びにホルモン、ビタミン、代謝物及び
薬剤とそれらの結合相手からなる群から選択される。通
常、分析対象物は、抗体又は抗原ポリペプチド若しくは
蛋白質のような、通常的１．０００〜約１０，０００，
０００の分子量を有する免疫学的に活性なポリペプチド
又は蛋白質、あるいは１分子量約１００以上、そして通
常的１，５００未満を有するハプテンである。

代表的ポリペプチド分析対象物は、アンギオテンシンＩ
及びＨｌＣ−ペプチド、オギシトシン。

バンプレシン、ニューロフィシン、ガストリン、セクレ
チン、プラジキニン並びにグルカゴンである。

代表的な蛋白質分析対象物には、プロタミン、ムコ蛋白
質、糖蛋白質、グロブリン、アルブミン、硬蛋白質、リ
ン蛋白質、ヒストン、リボ蛋白質、色素蛋白質、及び核
蛋白質の類がある。特異性の蛋白質の例は、プレアルブ
ミン、α１−リボ蛋白質、ヒト血清アルブミン、αｌ−
酸糖蛋白質、α１−抗トリプシン、α□−糖蛋糖蛋白質
テトランスフルチンロキシン結合グロブリン、ハプトグ
ロビン、ヘモグロビン、ミオグロブリン、セルロプラス
ミン、α２−マクログロブリン、β−リボ蛋白質、エリ
スロボエチン、トランスフェリン、ヘモベキシン、フィ
ブリノーゲン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ
、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等並びにそれらのフラグメ
ント、例えＩｆ　Ｆ　ｃ及びＦａｂ、補体因子、プロラ
クチン；血液凝固因子、例えば、フィブリノーゲン、ト
ロンビン等、インシュリン、メラノトロピン、ソマトト
ロピン、チロトロピン、卵胞刺激ホルモン。

黄体形成ホルモン、ゴチドトロピン、甲状腺刺激ホルモ
ン、胎盤性ラクトゲン、内因子、トランスコバラミン、
血清酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ホスファター
ゼ、りａリンエステラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢
酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ビルピン酸トラ
ンスアミナーゼ、及びウロペプシン、エンドルフィン、
エンケファリン、プロタミン、組織抗原、細菌抗原、並
びに肝炎に関連した抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃ
Ａｇ及びＨＢ　ｅ　Ａ　ｇ）のようなウィルス抗原があ
る。

代表的なハプテン分析対象物としては、一般医薬品、代
謝産物、ホルモン、ビタミン、毒素、及び類似の有機化
合物等がある。ハプテンホルモンとしてはチロキシン、
及びトリイオドチロニンがある。ビタミンとしては、ビ
タミンＡ、Ｂ、例えばＢ１２、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びに、葉酸
並びにチアミンがある。医薬品としては、アミノグリコ
シド、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミ
カシン、シソマイシン、カナマイシン及ヒネチルマイシ
ン、ペニシリン、テトラサイクリン、テラマイシン、ク
ロロマイセチン、並びに７セチノマイセチンのような抗
生物質；ヌクレオシド及びヌクレオチド、例えば、アデ
ノシンニリン酸（ＡＤＰ）、アデノシンニリン酸（ＡＴ
Ｐ）、　フラビンモノヌクレオチＦ　（ＦＭＮ）、ニコ
チンアミドアゾこンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、及びそ
のリン酸塩誘導体（ＮＡＤＰ）、チミジン、グアノシン
及びアデノシン；プロスタグランジン；ステロイド、例
えば、エストリオール及びエストラジオールのようなエ
ストロゲン、ステロゲン、アンドロゲン、ジゴキシン、
ジギトキシン、副腎皮質ステロイド；及びその他フェノ
バルビタール、フェニトイン、プリミドン、エトサクシ
ミド、カルバマゼピン、パルプロエイ’ｐ　（ｖａｌｐ
ｒｏａｔｅ）、テオフィリン、カフェイン、プロプラノ
ロール、プロ力インアミド、キニジン、アミトリブチリ
ン、コルチゾール、デシブラミン、ジンピラミド、ドキ
セピン、ドキソルビシン、ノルトリブチリン、メトトレ
キセート、イミプラミン、リドカイン、プロ力インアミ
ド、Ｎ−７セチルブロカインアミド、アンフェタミン類
、カテコールアミン、並びに坑ヒスタミン薬がある。毒
素としては、アセチルニー２トキシン、アルファトキシ
ン、コレラトキシン、シトリニン、サイトカラシン類、
ブドウ球菌エンテロキシンＢ、ＨＴ−２トキシン等があ
る。

（液状試験媒体） 測定される分析対象物を含有する液状試験媒体は、自然
に存在する又は人工的に形成される液体で分析対象物を
含有すると思われるものであってよく、通常生物学的液
体又はその希釈物である。

分析対象物が測定される生物学的液体には、血清、全血
、血漿、尿、唾液、羊水及び脳を髄液がある。

実速１殊ユ 染料／ビオチン標識抗体の製造 抗ジゴキシン抗体（〜６ｍｇ／＋Ｊ）含有する腹水症液
を０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液中で５倍に希釈しくｐＨ
３、５）　、　　１　：’　５０　（ｗ／ｗ）のペプシ
ン／抗体溶液で３７°Ｃで４８８時間温置た。アミコン
（Ａｍｉｃｏｎ）　ＰＭ３０膜〔米国、マサチューセッ
ツ州、ダンバースのアミコン社（ＡｍｉｃａｎＣｏｒｐ
、）製〕を用いた限外濾過により約５−に濃縮後、試料
をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ　−３００（
米国、ニューシャーシー州、ピスキャタウェイ（７）７
フルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）製〕カ
ラム（２，４Ｘ９０ｃｍ）上でゲル濾過し、５゜ｍＭの
リン酸ナトリウムと０．１０Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ
７、６）で平衡化せしめ、上記抗体のＦ（ａｂ’）２　
フラグメントを単離した。該抗体を３ｍＭのジチオトレ
イトールを用いて４５分間還元し１次いで４ｍＭのイオ
ドアセトアミド（最終濃度）を１時間かけて加え、アル
キレートの無いスルフヒドリル基とした。該蛋白質ピー
ク示す画分をＰ−６ＤＧポリアクリルアミドゲル樹脂〔
米国、リッチモンドのバイオΦラッド社（Ｂｉｏ、　Ｒ
ａｄ、　Ｇｏ、））上で脱塩した後、プールした。プー
ルした蛋白質の７リコートを５倍モル量の過剰のＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドアミノビオチン〔米国、イリノ
イ州、ロックフォードのピアース・ケミカル社（Ｐｉｅ
ｒｃｅ　（：ｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、））と２時間反応
させた０次に反応生成物をＰ−６ＤＧカラム上で脱塩し
、アミコン（Ａｓｉｃｏｎ）　ＰＭ　３０膜での限外濾
過により約ｌｌ１ｇ／ｍｌに濃縮した。

蛋白質のアリコートを次に、予めジメチルスルホキシド
に溶解せしめた２０倍モル量の過剰のテトラメチルロー
ダミン−β−インチオシアネート〔米国、オハイオ州、
クリーブランドのリサーチ・オーガニツクス社（Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ、　１ｎｃ、））と−晩
反応させた。反応生成物を、予め０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム及び０　、５１１／ｆ塩化ナトリウム（ｐＨ７、８
）で平衡化されたアビジン固定カラムに通した。結合蛋
白質を０．２Ｍ酢酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＨ４、０）で溶出し次いで、２０ｍＭのリン酸
ナトリウム及び１００ミリモルの塩化ナトリウム（ｐＨ
７，２）で平衡化されたＰ−６ＤＧカラム上でゲル濾過
し、蛋白質ピークを採集した。

支凰誇」 固定化分析対象物層の製造 ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　３１−　Ｅ　Ｔ　（
米国、ニューシャーシー州、クリフトンのホワットマン
社（Ｗｈａｔｍａｎ　ｒｎｃ、）　）紙を活性化し次に
パラ−ニトロフェニルクロロホルメート（ＮＰＣＦ）を
用いて誘導体を合成した０紙シートを蒸留水に１５分間
浸漬し、その水を次に傾瀉し、紙を、アセトンを次々に
６容量部用いてすすぎ、遊離水を除去した。その紙を次
に、アセトン中のＮＰＣＦＩＯ％の溶液中に浸漬し、６
時間温置し、次いで未反応ＮＰＣＦをアセトンで連続し
てすすいで除去した。すすぎ液は、ＩＮのＮａＯＨ１０
０ｐｉをそのすすぎ液３００ｇＭに加えて、ホルメート
の存在を試験した。すすぎは、アセトンを３容量部用い
て検知可能な黄色がなくなるまで続行し、１文の蒸留水
で洗浄し、次にアセトン１００−容積×５で洗浄し、溶
剤を風乾により除去した。

支立璽」 固定化結合層の製造 ホワットマン５４紙（３，７ｇ）をアセトン１００−中
の１，１′−カルボニルジイミダゾール２ｇと共に室温
で時々撹拌しながら１時間温置した。この紙をアセトン
２００−容積×３を用いて洗浄し、５０℃で約１０分（
即ち、それとわかるアセトンの臭いがなくなるまで）乾
燥し、シリカゲル乾燥剤を用いて４℃で次に用いるまで
貯蔵した。この紙を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７，４）中のストレパビジン〔米国、ミズリー州、セン
トルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇ＋ｏａＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ、））　１０ｍｇ／−と１４時間反応させ
た。その紙を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で長時間
にわたって洗浄した。

支直迩」 染料／ビオチン−抗体複合体層 ホワットマン３１紙を０．６Ｍのリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７，４中の抗ジゴキシンＦａｂ染料／ビオチン
ｉｏＩＩ１ｇ／ＷＪを含有する溶液に短時間浸漬し、４
０℃で２０分間乾燥した。

え直璽ｊ 多層試験具の組立て 上記の３つの試薬素子から、複合細片試験具を組み立て
た。複合体を両面接着テープ〔米国６　ミネソタ州、セ
ントボールのスリーエム社（３ＭＣｏｍｐａｎｙ））上
に積層し、幅１ｃｓ＋、長さ１２．７ｃｍのリボン状に
裁断した。この材料を、次に、幅８．３ｃｍ、長さ１２
．７ｃｍの透明なポリスチレン支持体〔米国、ミシガン
州、ミツドランドのダウケミカル社（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、）　）の一方の表面に、その端部の長
手沿いに積層した。１〜２ｍｍ細片の両面接着テープを
複合層の後側の端部沿いに貼着し、固定化分析対象物類
縁体を含有する試薬層の１ｃｍ幅のリボンをその両面接
着テープの細片で複合体の上に取り付けた。上記の方法
を繰り返して固定化結合蛋白質を含有する結合層の紙の
リボンを取り付けた。得られた多層試験具を種々の層を
その端部に取り付けた幅５ＩＩＩＩＩ×長さ８．３ｃｍ
の試薬片に切断した。

支息舅」 試験具の操作 正常ヒト血清の試料をジゴキシンと混合して５ｎＭにし
た。　０　、２〜５　、　ＯｎＭｇ）範囲ノ儂度のジゴ
キシンを正常ヒト血清を用いて試薬原液を希釈して調製
した。試料のアリコート８０ト交を試験具に施して試験
を開始した。試験具をその前面の蛍光測定を行うことの
できる蛍光光度計中に載置した〔例えばＷ　、　ハワー
ド（Ｗ、Ｈｏｗａｒｄ）等の「分析化学Ｊ　　（Ａｎａ
ｌｙｔ、　Ｃｈｅｍ、）５５　、８７８〜８８８　（１
９８３））。試薬パッドの法線に対して４５°に取り付
けられた光学Ｓ維束からの５４０ｎｍ干渉フィルター〔
３つの空洞を有する：米国、マサチューセッツ州、ハド
ソンのグイトリンクオンティクス社（口１ｔｒｉｃ　０
ｐｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）製〕を通過する励起光は試験具
の表面を照明する。発光は、これを５７０ｎｍ干渉フィ
ルター（３つの空洞を有する；米国マサチューセッツ州
、ハドソンのグイトリック・オプティクス社）及び関連
する電子検出系へ運ぶ、パッドに対して垂直に取り付け
られた光学繊維束により検知した。蛍光の変化を測定し
、施したジゴキシンの濃度と関連づけた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明により構成された試薬層と検知層を有
する多層試験具の断面図である。 第２図は、本発明により構成された２つの試薬層と１つ
の検知層を有する多層試験具の断面図である。 第３図は、本発明により構成された２つの試薬層、１つ
の検知層及び１つの支持体を有する多層試験具の断面図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ｉ）分析対象物、（ｉｉ）分析対象物もしくは
   その結合類縁体の標識体又は固定化体、及び（ｉｉｉ）
   上記（ｉｉ）の標識体又は固定化体に対応して、該分析
   対象物の結合相手の、それぞれ、固定化体又は標識体（
   ここで、分析対象物、その類縁体又は結合相手の標識体
   は検知可能な物理的性質を有する検知可能な化学基から
   なる標識試薬である）の間の結合を利用した、液体試料
   中の分析対象物の特異的結合試験用の多区域試験具であ
   って、液体が流通するような接触状態で、 （１）分析対象物、その類縁体又は結合相手の固定化体
   を包含した固体の多孔性マトリックスからなる試薬区域
   、及び、 （２）そこへ移行してくる標識試薬を受容し測定するた
   めの、該標識試薬に対する結合物質の固定化体を包含し
   た固体の多孔性マトリックスからなる検知区域 からなることを特徴とする試験具。 （２）標識試薬が、更にリガンド部分を含み、かつ検知
   区域中の、該標識試薬と結合する固定化体がかかるリガ
   ンド部分の結合相手である特許請求の範囲第１項記載の
   試験具。 （３）リガンド部分の結合相手が、かかる部分を特異的
   に認識する蛋白質である特許請求の範囲第２項記載の試
   験具。 （４）リガンド部分を特異的に認識する蛋白質が抗体又
   はそのフラグメントである特許請求の範囲第３項記載の
   試験具。 （５）リガンド部分がハプテンである特許請求の範囲第
   ４項記載の試験具。 （６）ハプテン部分がビオチン又はアビジンであり、か
   つリガンド部分の結合相手がそれぞれそれらの他方であ
   る特許請求の範囲第３項記載の試験具。 （７）リガンド部分が、炭水化物又はこれと特異的に結
   合するレクチンであり、かつリガンド部分の結合相手が
   それぞれそれらの他方である特許請求の範囲第２項記載
   の試験具。 （８）検知区域中の、標識試薬に対する固定化された結
   合物質が、該標識試薬と結合する抗体又はそのフラグメ
   ントである特許請求の範囲第１項記載の試験具。 （９）標識試薬が分析対象物に対する抗体又はそのフラ
   グメントを含み、かつ検知区域中の、標識試薬に対する
   固定化された結合物質が、該抗分析対象物抗体又はその
   フラグメントに対する抗体又はそのフラグメントである
   特許請求の範囲第８項記載の試験具。 （１０）標識試薬が蛋白質Ａに対する完全な結合部位を
   有する抗体又はそのフラグメントを含み、かつ検知区域
   中の、標識試薬に対する固定化された結合物質が蛋白質
   Ａである特許請求の範囲第１項記載の試験具。 （１１）検知区域中の、標識試薬に対する固定化された
   結合物質が該標識試薬に対する吸着材である特許請求の
   範囲第１項記載の試験具。 （１２）吸着材がイオン交換材である特許請求の範囲第
   １１項記載の試験具。 （１３）検知可能な化学基が蛍光団又は発色団である特
   許請求の範囲第１項記載の試験具。 （１４）標試試薬に対する結合性物質を、試験具中に含
   まれるマトリックスに共有結合せしめることにより検知
   区域中に固定化した特許請求の範囲第１項記載の試験具
   。 （１５）標識試薬に対する結合性物質を、該マトリック
   ス中に分散せしめた高分子量のポリマー物質に結合せし
   めることにより、検知区域中に固定化した特許請求の範
   囲第１項記載の試験具。 （１６）分析対象物に対する結合相手が抗体又はそのフ
   ラグメントである特許請求の範囲第１項記載の試験具。 （１７）試薬区域と検知区域とが、流体が流通するよう
   な接触状態の層形態をとっている特許請求の範囲第１項
   記載の試験具。 （１８）試験媒体によって可溶化される形の標識試薬を
   包含する固体の多孔性マトリックスからなる試薬層を更
   に含む特許請求の範囲第１７項記載の試験具。 （１９）試薬層から見て、検知層の反対側に位置する支
   持部材を更に含む特許請求の範囲第１７項記載の試験具
   。。 （２０）固体の多孔性クロマトグラフ部材を含み、試薬
   区域及び検知区域が、かかる部材の別々の部分を構成す
   る特許請求の範囲第１項記載の試験具。 （２１）分析対象物を含有する水性媒体との接触により
   検知可能な光学的信号を与える水性媒体液中の分析対象
   物を測定する多層イムノアッセイ試験具において、流体
   が流通するような接触状態で、以下の順序で連続する、 （１）分析対象物に対する抗体若しくはそのフラグメン
   トからなる水溶性の標識試薬を包含した固体の多孔性マ
   トリックスから成る第１の試薬層、 （２）該分析対象物又はその結合類縁体の固定化体を包
   含せしめた固体の多孔性マトリックスから成る第２の試
   薬層、 （３）検知層中に移行して来る標識試薬を受容し測定す
   るための固体の多孔性マトリックスから成り標識試薬に
   対する結合性物質の固定化体を包含する検知層及び （４）固体の非多孔性基材から成る支持部材から成るこ
   とを特徴とする試験具。 （２２）標識試薬がリガンド部分を更に含み、かつ検知
   区域中の、標識試薬に対する固定化結合性物質が、かか
   るリガンド部分の結合相手である特許請求の範囲第２１
   項記載の試験具。 （２３）リガンド部分の結合相手がかかる部分を特異的
   に認識する蛋白質である特許請求の範囲第２２項記載の
   試験具。 （２４）リガンド部分を特異的に認識する蛋白質が抗体
   又はそのフラグメントである特許請求の範囲第２３項記
   載の試験具。 （２５）リガンド部分がハプテンである特許請求の範囲
   第２４項記載の試験具。 （２６）リガンド部分がビオチン又はアビジンであり、
   かつリガンド部分の結合相手がそれぞれそれらの他方で
   ある特許請求の範囲第２３項記載の試験具。 （２７）検知層中の固定化された、標識試薬のための結
   合物質が該抗分析対象物抗体又はそのフラグメントに対
   する抗体又はそのフラグメントである特許請求の範囲第
   ２１項記載の試験具。 （２８）標識試薬に対する結合性物質を、試験具中に含
   まれるマトリックスに共有結合せしめることにより、検
   知層中に固定化した特許請求の範囲第２１項記載の試験
   具。 （２９）標識試薬が一価の抗分析対象物抗体フラグメン
   トを含む特許請求の範囲第２１項記載の試験具。 （３０）抗体フラグメントがモノクローナル抗体から誘
   導された特許請求の範囲第２９項記載の試験具。 （３１）支持部材が検知可能な光学的信号に対して透明
   である特許請求の範囲第２１項記載の試験具。 （３２）第２の試薬層が検知し得る光学的信号に対して
   不透明である特許請求の範囲第３１項記載の試験具。 （３３）第２の試薬層と検知層との間に位置し、検知可
   能な光学的信号に対して不透明の固体の多孔性マトリッ
   クスから成る不透明層を更に含む特許請求の範囲第３１
   項記載の試験具。