JPS63238462A - 特異結合分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、医療分野や生化学分野で汎用されている抗原
−抗体反応に代表される特異結合反応を利用した分析方
法に関するものである。

［従来技術］ 抗原（ハプテンを含む）−抗体、アビジン−ビオチン、
糖−レクチン、免疫グロブリンのＦＣｆｉ位−プロチイ
ンＡ、特定のＤＮＡとそれに相補的なりＮＡ等等異異的
親和性を示すもの同志のベアは、種々の物質の分析や分
離精製に利用されている。特に抗原−抗体反応やＤＮＡ
のハイブリダイゼーションは、医療分野等で広く分析法
に応用されている反応である。

これらの反応を利用した主な分析方法に共通する点は、
反応に関与する物質を何らかの手段により標識し、最終
的に反応にあずかった（又はあずからなかった）物質に
由来する標識の量を測定する点である。

現在標識として実用化されているものを挙げれば、放射
性同位元素、酵素（特開昭４７−１３９９４）、補酵素
（特公昭６０−５２３７８、同６ｌ−１６９３８）、あ
るいは非生物学的触媒（特開昭６ｌ−２４９３９９）、
蛍光性物質、発光性物質等である。

標識物質を特に必要としない免疫比濁法や、粒子担体に
感作した免疫学的活性物質とそのパートナ−との反応を
粒子担体の凝集をパラメーターとして光学的にあるいは
肉眼で追跡する方法等を除けば、上記標識量の測定にあ
たって特殊な機器や試薬が必要となる０例えば酵素を標
識物質として用いた場合には、特異結合分析法における
結合反応を行わせるステップの他に酵素２！質試薬を使
った酵素反応を行わせるステップが必要となり、分析時
間の浪費を招く、又反応ステップや試薬の種類の増加は
、分析誤差の発生につながるものでもあり好ましいもの
ではない、このような問題点は酵素以外の標識物質を用
いた系にも共通するものである。

［発明の構成］ 本発明は、 １）分析対象物質を１分析対象物質に特異的親和性を有
する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
出する特異結合分析法であって、ａ）有色物質で標識し
た特異結合性物質と分析対象物質とを反応させ。

ｂ）有色物質で標識した特異結合性物質と分析対象物質
との複合体は通さないが遊離状ｆムの有色物質で標識し
た特異結合性物質ならびに分析対象物質は通過させる分
離手段により反応液から前記複合体を分離し。

Ｃ）分離された前記複合体及び／又は遊離状態の有色物
質で標識した特異結合性物質に由来する有色物質の量を
測定する、 ことからなることを特徴とする特異結合分析法。

及び ２）分析対象物質を１分析対象物質に特異的親和性を有
する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
出する特異結合分析法であって、ａ）分析対象物質と一
定量の特異結合性物質とを反応させ、 ｂ）ａ）で得られた反応液に特異結合性物質に対して分
析対象物と同様の親和性を示す有色物質で標識した一定
量の標識−アナライトを加えて反応させ、 Ｃ）標識−アナライトと特異結合性物質との複合体は通
さないが遊離状態の特異結合性物質、分析対象物質、及
び標識−アナライトは通過させる分離手段により前記複
合体を反応液から分離し、 ｄ）分離された複合体及び／又は遊離状態の標゛　　識
−アナライトに由来する有色物質の量を測定する、 ことから成ることを特徴とする特異結合分析法、ならび
に ３）分析対象物質を、分析対象物質に特異的親和性を有
する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
出する特異結合分析法であって、ａ）分析対象物質と、
特異結合性物質に対して分析対象物質と同様の親和性を
示す有色物質で標識された一定量の標識−アナライトを
混合し、 ｂ）ａ）で得られた混合液に一定量の特異結合性物質を
加えて反応させ、 Ｃ）標識−アナライトと特異結合性物質との複合体は通
さないが遊離状ＩＥの特異結合性物質、分析対象物質、
及び標識−アナライトは通過させる分離手段により前記
複合体を反応液から分離し、 ｄ）分離された複合体及び／又は遊離状態の標識−アナ
ライトに由来する有色物質の量を測定する、 ことから成ることを特徴とする特異結合分析法である。

本発明における分析対象物質及び特異結合性物質は、各
々後に述べるような特異結合性を示すペアのいずれか一
方ずつを含むものであって、例えば抗原を分析対象物質
とするときには特異結合性物質は抗体であり、一方抗体
を分析対象物質とするときには特異結合性物質は抗原（
場合によっては該抗体を認識する抗体やプロティンＡを
用いることも可能）となる。

又標識−アナライトは、特異結合性物質に対して分析対
象物質と同様の親和性を示すものであればよく、必ずし
も分析対象物質と同一物質を標識して用いる必要はない
０例えば、ある種のステロイドホルモンのようなハプテ
ン性化合物を分析対象物質とするときには、適当な高分
子物質に該ステロイドホルモンあるいは同一の抗原性を
有するその誘導体を多数結合させたいわゆるポリハプテ
ンを標識して用いることができる。この場合、該高分子
物質として有色物質を用いてもよい。

本発明に応用可使な特異結合性を示す物質のペアとして
は、抗原（ハプテンを含む）−抗体、アビジン−ビオチ
ン、糖−レクチン、免疫グロブリンのＦｃ部位−プロチ
インＡ、特定のＤＮＡとそれに相補的なりＮＡ等が挙げ
られる。したがって本発明による特異結合分析法で、上
記ペアのいずれの物質も分析可使である。

更に具体的に列挙すれば、抗原としては各種ホルモン、
微生物やウィルスに由来する抗原、癌細胞由来抗原、薬
剤等のハプテンが、抗体としてはポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体、複数種のモノクローナル抗体、な
らびにこれらの混合物が、糖としては文字どおり純粋な
糖の分子の他に各腫瘤のマーカーとして注目されている
糖鎖抗原に代表される分子中に糖鎖を持つものも含まれ
る。

４１色の標識物質としては１色素、金コロイド、着色ラ
テックス等が挙げられる。前記分離手段として物理的分
離手段を利用する場合には、これら標識物質の大きさは
、分離を迅速に且つ正確に行えるように、標識された特
異結合性物質（又は標識−アナライト）と分析対象物質
（又は特異結合性物質）との複合体の大きさと、それら
が遊離状ｆＥｊにあるときの大きさの差がなるべく大き
くなるように設定するとよい８分離手段として分析対象
物質や特異結合性物質に対して特異的親和性を有する第
二の特異結合性物質を固定化してなる分離１段を用いる
場合には１分子の大きさには大きな影響を受けることな
く所望の物質を確実に捕捉することが可億であるから、
物理的分離手段を利用する場合と異なり標識物質として
より広範囲の物質を選択できる。

有色物質による標識方法としては、色素や着色ラテック
ス等と所望の物質との化学的結合、あるいは着色ラテッ
クス°や金コロイド等への所望の物質の物理的吸着等が
挙げられる゛、化学的結合としては、標識物質分子（又
は所望の物質の分子）にカルボキシル基等の官ス＠基を
導入しこれと所望の物質の分子（又は標識物質分子）中
７ミノ基を反応させる方法や、標識物質と所望の物質と
の間にマレイミド化合物やアミノカプロン酸等のスペー
サーを介入させて両者を結合させる方法等が応用できる
。

このほか、糖や蛋白質からなる物質（例えば抗原、抗体
、プロティンＡ及び糖等）を標識する場合には上記標識
方法以外に染色による標識も可使である。すなわち、抗
体等の蛋白質をその特異的親和性を損なうことなくテト
ラブロモフェノールブルー、クマシーブリリアントブル
ー、ピロガロールレッド等で染色するのである。特異的
親和性を損なうことのない染色の具体例を示せば、被標
識物質として抗体（イムノグロブリンＧ）を例にとると
イムノグロブリンＧ分子の抗原結合部位以外の部分すな
わち、Ｃ末端、Ｈ鎖に存在する糖鎖部分、並びにペプシ
ン処理等で得られるＳＨ基等を染色すればよいのである
。

本発明においては、上記のような直接的標識方法の他に
次のような間接的な標識方法を用いてもよい０例えば分
析対象物質として抗にＣを、特異結合物質として抗体を
利用する場合を例にとると、抗体を直接有色物質で標識
する他に次に示すようなｅ！識方法が可能である。

■抗体はアビジン又はその誘導体で標識しておき、これ
に有色物質で標識したビオチン又はその誘導体を反応さ
せる。

■抗体はレクチンで標識しておき、これに有色物質で標
識した糖を反応させる。

■抗体としてイムノグロブリンＧを用い、これに有色物
質で標識したプロティンＡを反応させる。

■抗体はそのまま用い、これに有色物質で標識したこの
抗体を認識する抗体を反応させる。

■抗体を抗原で標識しておき、これに有色物質で標識し
たこの抗原を認識する抗体を反応させる。

もちろんこれら標識方法は、抗体に限らずその他の物質
の標識方法としても応用可使である。又アビジン−ビオ
チンや糖−レクチンの関係を逆にしてもこれら間接的標
識法が可使であることにかわりはない、更に、イムノグ
ロブンＧの標識に限っていえば、特に糖を結合させなく
ても、その分子中に存在するｔＪ！Ｊ鎖部分に標識した
レクチンを結合させることもできる。

本発明に好適な分離手段の１つとしては、メンブランフ
ィルタ−のような多孔性の膜、濾紙、多孔性セラミック
ス、ｗ＆維層等の物理的分離手段が挙げられる。これら
物理的分離手段の孔径は、標識された物質とこれに対応
する物質とで最終的に形成される複合体と、それ以外の
遊離状態で存在する物質とを正確に、効率的に分離でき
るように適宜選択する０本発明の特異結合分析法におい
ては場合により標識された物質以外の物質同志が結合し
て成る複合体を生成することがあるが、この複合体は標
識されていないので、仮に分離不衡となっても分析結果
に影響を及ぼすことはない。

その他の分離手段としては、分析対象物質や標識−アナ
ライト対する第二の特異結合性物質を固定化したものが
挙げられる。抗原、抗体、レクチン、糖、プロティンＡ
等をセルロースあるいはその誘導体等に固定したもので
所望の物質を捕捉するようにすれば、正確で迅速な分離
を行うことができる。又、１つの分離手段をいくつかに
区画して多項［１分析を同時に行う場合には拡散浸透し
た試料や試薬が異種項目の間で干渉しないように。

非浸透性物質で区画する、あるいはたとえば第１図に示
すような切欠部を設ける等の手段を講じるとよい。

」二足のような分離手段とともに、グラスフィルターや
ポリビニルホルマールｌ化合物のような高分子吸収体等
の液体吸収性に優れる素材を合わせて用いると、不要な
液体を吸収するため迅速な分離が期待できる。高分子吸
収体は、紙オムツや女性生理用品等で実用化されている
種々の物質が利用可能である。

以下実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。

［実施例］、 ｌ）、有色物質として金コロイドを１分析対象物質とし
て抗、［（ｈＣＧ）を用いた分析 ・金コロイド標識抗ｈＣＧ抗体 金コロイド（粒径１〜４０ｕ膳）に抗ＣＥ抗体を常法［
ザ　ジャーナル　オブ　ヒストケミストリー　アンド　
サイトケミストリー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈａ■。

（：ｙｔｏｃｈｅｍ、）２６．１０７４（１９７８）］
により感作し、赤紫色の金コロイド標識抗ｈＣＧ抗体を
得た。

・フィルターの作製 直径２　ｃ”■の円形濾紙（アトパンチツク■製、ＮＯ
，２）を逆円錐形に加工し、その下にグラスフィルター
ＧＦ１００　（ワットマン社製、商品名）をしいてフィ
ルターとした。　　゛ ・試験 １ＬＣＧを２００及び１０００　ｓｌＵ／ｍｌ含む尿、
並びにｈＣＧを含有していない尿を試料として用いた。

試ネ４２００ＪＪＩと金コロイド標識抗ｈＣＧ抗体２０
０Ｊｌｌを混和し、数分間室温で放置した後、上記フィ
ルター−Ｌに滴下した。フィルターによる分離が速やか
に行われないときには、フィルターにシリンジを連結し
て圧力を与えた。

ｈＣＧを含イｉしない尿ではフィルター上に金コロイド
の色は観察されなかったのに対して、ｈｃＧを２００■
ＩＩＩ／ｍｌ含有する尿では淡い赤紫色が、１０００■
ＩＩＩ／ｍｌ含有する尿では強い赤紫色が各々観察され
た。

２）、有色物質として着色ラテックスを、分析対象物質
としてＣＥＡを用いた分析 ・着色ラテックス標識抗ＣＥＡ抗体 着色ラテックス（日本合成ゴム■製、粒径０．１〜１．
４Ｊｌ量）に抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体を物理
的吸若により感作した６感作条件は次のとおりである０
着色ラテックス懸濁液（１０％Ｗ／Ｖ　）０．１ｍｌに
抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体（１％）５０Ｊ＋を
加え、室温で４時間放置した後生理食塩水で洗浄した。

洗浄後、生血情アルプミン溶液（０，１％）で処理し、
更に生理食塩水で洗浄した後グリシン緩衝液（０，２Ｍ
）　２０ｓ＋ｌに浮遊させて着色ラテックス標識抗ＣＥ
Ａマウスモノクローナル抗体を得た。

・フィルターの作製 直径２　ｃ鵬のイムノアフィニティーメンブレン（日本
ボール■製、商品名）の中心に０．５μｇ／＋＋１の抗
ＣＥＡ抗体を直径５〜１０ｍｍの範囲に滴下し、室温で
１０時間放置して固定化後、脱脂粉乳のリン酸緩衝液（
０，２Ｍ、ｐＨ７，２）溶液（０，５％）に浸し、数回
洗浄してフィルターとした。

・試験 ＣＥＡを５．２０、及び４０　ｎｇ／ｍｌ含有する血清
並びにＣＥＡを含有しない血清を試料として用いた０着
色ラテックス標識抗ｅＥＡマウスモノクローナル抗体１
００ＪＩＩと試料４００μＩを混和し。

３分間放置した後フィルターの抗体固定化部分に滴下し
てフィルター上に残る色を観察した。

ＣＥＡを含有しない血清では、はとんど着色が観察され
なかったが、ＣＥＡ含有血清ではＣＥＡＣ度の−Ｌ　’
ｙｌにともなって７ｉ色ラテックスの強い色調がｌＢｌ
察された。

３）、有色物質として金コロイドを、分析対象物質とし
てヒ）　Ｉ　ｇＧ及びヒ）　Ｉ　ｇＭを用いた多項１１
同時分析 ・金コロイド標識抗ヒ）ＩｇＧヤギ抗体、及び金コロイ
ド標識抗ヒ）　Ｉ　ｇＭヤギ抗体実施例１．と同様の方
法により、金コロイド標識抗ヒ）ＩｇＧヤギ抗体、及び
金コロイド標識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体を得た。

金コロイド標識抗ヒ）ＩｇＧヤギ抗体及び金コロイド標
識抗ヒトＩ　ｇＭヤギ抗体の混合物の濃度（金コロイド
の濃度は５４０ｎ層における吸光度が２．２）、並びに
か紙に固定化する抗体量は、１５００　ｍｇ／ｄ１以上
のヒトＩｇＧ及び１５０　ｍｇ／ｄ１以上のヒ）ＩｇＭ
（いずれも正常値とされている値）を検出できるように
設定した。

・フィルターの作製 第１図に示すような切欠部を備えた形状を有する濾紙（
ワットマン社製、ＧＦ／Ｄ）の切欠部をはさんで対向す
る部分に、抗ヒトＩｇＧウサギ抗体及び抗ヒトＩｇＧウ
サギ抗体を各々直径１ｃ＋ｓとなるように実施例２．と
同様の方法で固定化し。

抗体固定化濾紙を得た。この抗体固定化濾紙を扱い易く
するため、抗体固定部分にあたる位置に直径８麿腫の穴
をあけた濾紙と同型のプラスチックプレート、及び実施
例１．で用いた吸収バットではさんでフィルターとした
。このフィルターの分解斜視図を第１図に示す。

・試験 フィルターの２個の穴に被検血清ｉ　００ＪＩＩを各々
滴下し、完全に浸透させた。つづいて金コロイド標識抗
ヒ）　Ｉ　ｇＧヤギ抗体、及び金コロイド標識抗ヒ）　
Ｉ　ｇＭヤギ抗体の混合物をフィルターの２個の穴に各
々２００ＪＩＩづつ滴下した。

抗ヒトＩｇＧウサギ抗体を固定した部分ではヒトＩ　ｇ
Ｇｒａ度に応じた。又抗ヒ）ＩｇＭウサギ抗体を固定し
た部分ではヒ）　Ｉ　ｇＭ濃度に応じた金コロイドによ
る着色が観察された。

［発明の効果］ 未発ＩＩによれば、実施例からもＩＪＩらかなように基
質溶液等の特殊な試薬を用いることなく特異結合分析を
行うことができる。そのため分析に要する時間は短縮さ
れ、迅速な分析が可能となる。

又、実施例のように色の現れ方を肉眼で判読するだけで
半定量的測定が可能であり、比色計等の特殊な機器を利
用することなく分析を行い得る。

一般の特異結合分析法、たとえば免疫学的担体凝集反応
が粒子担体の凝集程度を読み取るという熟練を要するも
のであるのに比べ１本発明の特異結合分析法では色の判
定という容易な操作で分析を行い得るという利点が生じ
るのである。もちろん色の現れ方を色差計等で読み取る
ことによって。

分析の機械化も可能である。

更に本発明において、標識物質として使用する有色物質
は、一般に酵素等従来の標識物質に比べて化学的に安定
であるから、寿命の長い試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による多項［１特異結合分析を行ラのに
好適な分離手段の１実施例を示す分解済視図である。 図中、 ｌ・・・Ｐ紙、２・・・切欠部、３・・・抗体固定部分
、４・・・プラスチックプレート、５・・・吸収バット
。 ６・・・穴

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）分析対象物質を、分析対象物質に特異的親和性を有
   する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
   出する特異結合分析法であって、ａ）有色物質で標識し
   た特異結合性物質と分析対象物質とを反応させ、 ｂ）有色物質で標識した特異結合性物質と分析対象物質
   との複合体は通さないが遊離状態 の有色物質で標識した特異結合性物質なら びに分析対象物質は通過させる分離手段に より反応液から前記複合体を分離し、 ｃ）分離された前記複合体及び／又は遊離状態の有色物
   質で標識した特異結合性物質に由 来する有色物質の量を測定する、 ことからなることを特徴とする特異結合分析法。 ２）分離手段が、分析対象物質に対して特異的親和性を
   有する第二の特異結合性物質を固定化して成るものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の特異
   結合分析法。 ３）分析対象物質を、分析対象物質に特異的親和性を有
   する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
   出する特異結合分析法であって、ａ）分析対象物質と一
   定量の特異結合性物質とを反応させ、 ｂ）ａ）で得られた反応液に特異結合性物質に対して分
   析対象物と同様の親和性を示す有 色物質で標識した一定量の標識−アナライ トを加えて反応させ、 ｃ）標識−アナライトと特異結合性物質との複合体は通
   さないが遊離状態の特異結合性物 質、分析対象物質、及び標識−アナライト は通過させる分離手段により前記複合体を 反応液から分離し、 ｄ）分離された複合体及び／又は遊離状態の標識−アナ
   ライトに由来する有色物質の量を 測定する、 ことから成ることを特徴とする特異結合分析法。 ４）分析対象物質を、分析対象物質に特異的親和性を有
   する特異結合性物質との結合反応を利用して測定又は検
   出する特異結合分析法であって、ａ）分析対象物質と、
   特異結合性物質に対して分析対象物質と同様の親和性を
   示す有色物 質で標識された一定量の標識−アナライト を混合し、 ｂ）ａ）で得られた混合液に一定量の特異結合性物質を
   加えて反応させ、 ｃ）標識−アナライトと特異結合性物質との複合体は通
   さないが遊離状態の特異結合性物 質、分析対象物質、及び標識−アナライト は通過させる分離手段により前記複合体を 反応液から分離し、 ｄ）分離された複合体及び／又は遊離状態の標識−アナ
   ライトに由来する有色物質の量を 測定する、 ことから成ることを特徴とする特異結合分析法。 ５）分離手段が、特異結合性物質に対して特異的親和性
   を有する第二の特異結合性物質を固定化して成るもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第３項又は第４項
   に記載の特異結合分析法。 ６）分析対象物質が、抗原、抗体、アビジン、ビオチン
   、糖、レクチン、免疫グロブリンのＦｃ部位、プロテイ
   ンＡ、ＤＮＡ、及びそれらの誘導体から成る群から選択
   されたものであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項、第４項、及び第５項のいずれかに記載の特異結合分
   析法。 ７）有色物質で標識された特異結合性物質又は標識−ア
   ナライトにおけるアナライトが、抗原、抗体、アビジン
   、ビオチン、糖、レクチン、免疫グロブリンのＦｃ部位
   、プロテインＡ、ＤＮＡ、及びそれらの誘導体から成る
   群から選択されたものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項、第３項、及び第４項のいずれかに記載の
   特異結合分析法。 ８）抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
   、及び複数種のモノクローナル抗体から成る群から選択
   された１つ又は２つ以上の組合せであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第６項又は第７項に記載の特異結合分
   析法。 ９）有色物質が、色素、金コロイド、着色ラテックス、
   及び着色リボソームから成る群から選択されたものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第３項、及
   び第４項のいずれかに記載の特異結合分析法。 １０）分離手段が物理的分離手段であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項、第３項、及び第４項のいずれ
   かに記載の特異結合分析法。 １１）物理的分離手段が、多孔性膜、濾紙、多孔性セラ
   ミックス、多孔性樹脂、及び繊維から成る群より選択さ
   れた少なくとも１つの素材で構成されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第１０項に記載の特異結合分析法
   。