NO344764B1 - Isolerte eller syntetiske oligonukleotidanaloger eller salt eller ester derav som inkluderer 5-aza-cytosin, farmasøytisk sammensetning derav, alle for anvendelse i fremstilling av et medikament, farmasøytisk kombinasjon derav, alle for anvendelse i terapi, samt et sett derav - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder formulering, syntese og anvendelse av oligonukleotidanaloger som er anvendbare som terapeutiske og diagnostiske midler samt som forskningsreagenser. Det tilveiebringes oligonukleotidanaloger som inkorporerer en analog av cytosin, 5-aza-cytosin, i oligonukleotidsekvensen, f.eks. i form av 5-aza-2’-deoksycytidin eller 5-aza-cytidin. Slike analoger kan anvendes for modulering av DNA-metylering, spesielt for effektiv inhibering av metylering av cytosin i C-5-posisjon ved mer spesifikt å være rettet mot CpG-øyene i det humane genomet. Fremgangsmåter for syntese av disse oligonukleotidanalogene og for modulering av C-5-cytosinmetylering tilveiebringes. Spesielt tilveiebringes fosforamidittbyggesteiner og oligonukleotider som inneholder desitabin (5-aza-2’-deoksycytidin, D), DpG-rike (decitabin-fosfodiesterbinding-Guanosin) øyer og derivater. Også tilveiebragt er fremgangsmåter for fremstilling, formulering og administrering av disse forbindelsene eller sammensetningene som terapeutiske midler til en vert med behov for dette.

Beskrivelse av teknikkens stand

Decitabin er for tiden under utvikling som et nytt farmasøytisk middel for behandling av kronisk myelogen leukemi (CML), myelodysplastisk syndrom (MDS), ikkesmåcellet lungekreft (NSCL), sigdcelleanemi og akutt myelogen leukemi (AML). Det kan skilles mellom to isomere former av decitabin. β-anomeren er den aktive form, som vises i figur. 1. Decitabin har en rekke farmakologiske egenskaper. På molekylært nivå blir den inkorporert inn i DNA under S-fasen i cellesyklus. På cellulært nivå kan decitabin indusere celledifferensiering og utøve hematologisk toksisitet. Til tross for en kort halveringstid in vivo har decitabin en utmerket vevsfordeling.

Én av funksjonene til decitabin er dets evne til spesifikt og kraftig å inhibere DNA-metylering. DNA-metylering er en epigenetisk effekt som er vanlig i mange systemer. Denne modifikasjonen involverer kovalent modifisering av cytosin i C-5-posisjon (1a’’). Metyleringsmønstre bevares stabilt i CpG-dinukleotider av en familie av DNA metyltransferaser som gjenkjenner hemimetylert DNA etter DNA-replikasjon. Inne i cellen omdannes decitabin først til sin aktive form, det fosforylerte 5-aza-deoksycytidin, av deoksycytidinkinase, som hovedsakelig syntetiseres under S-fasen av cellesyklusen. Affiniteten til decitabin for det katalytiske setet i deoksycytidinkinase er tilsvarende til det naturlige substratet, deoksycytidin (Momparler et al. 1985 Mol. Pharmacol. 30:287-299). Etter omdanning til dets trifosfatform av deoksycytidinkinase inkorporeres decitabin i replikerende DNA med en hastighet som svarer til den for det naturlige substratet, dCTP (Bouchard og Momparler 1983 Mol. Pharmacol. 24:109-114).

CpG-rike sekvenser i husholdningsgener er vanligvis beskyttet mot metylering i normale celler. I kreftceller er avvikende hypermetylering i promoterregionen CpG-øyer i tumorsupressorgener én av de vanligste begivenhetene assosiert med progresjon av den tumorigene fenotypen. Hver klasse av differensierte celler har sitt eget, distinkte metyleringsmønster. Inkorporering av decitabin i DNA-tråden har en hypometylerende effekt. Etter kromosom duplisering, for å bevare dette metyleringsmønsteret, tjener 5-metylcytosin på foreldretråden til å styre metylering av den komplementære datter-DNA-tråden. Substituering av karbonet i C-5-posisjonen i cytosinet med nitrogen interfererer med denne normale prosessen for DNA-metylering. Erstatning av cytosin med decitabin i et spesifikt sete for metylering danner en irreversibel inaktivering av DNA-metyltransferase. Decitabin opptrer korrekt som en cytosinrest inntil DNA-metyltransferase enzymene forsøker å overføre en metylgruppe til de hemimetylerte DNA-trådene i dattercellene. I dette trinnet blir DNA-metyltransferase enzymet kovalent fanget av decitabin i DNA og kan ikke videre ”silence” (metylere) ytterligere cytosinrester (Juttermann et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11797-11801). Denne unike virkningsmekanismen for decitabin gjør at gener som har blitt ”silenced” (som én gang ble metylert) i tidligere runder med celledeling kan bli uttrykt på nytt. Den aktive fellen er tilstede i hemimetylert DNA i opptil 48 timer etter decitabin behandling. Etter videre DNA-syntese og cellesyklusdeling resulterer etterkommertrådene fra det hemimetylerte DNA i DNA-tråder som er fullstendig umetylerte i disse setene (Jones P. 2001 Nature 409: 141, 143-4). Ved spesifikt å inhibere DNA-metyltransferaser, enzymet som er nødvendig for metylering, kan avvikende metylering av tumorsupressorgenene reverseres.

Til tross for dets påviste antileukemiske virkninger i CML, MDS og AML har den mulige anvendelsen av decitabin blitt hindret av en forsinket og vedvarende myelosuppresjon. Lavere doser av decitabin gitt over et lengre tidsrom har minimalisert myelosuppresjonen til et håndterbart nivå uten å kompromittere dets evne til å undertrykke kreft via dets hypometyleringseffekt. Ved høyere doser var den tilhørende toksisiteten uoverkommelig. Imidlertid har behandling av hematologiske og faste tumorer i maksimalt tolererte doser av decitabin vært ineffektivt. Årsaken til myelosuppresjonen er ikke klar. Det er plausibelt at siden decitabin blir tilfeldig og ekstensivt inkorporert i DNA i S-fase celler, inkludert beinmargsceller som er involvert i normal hematopoiese, fører den alvorlige DNA-skaden, som skyldes ustabiliteten av decitabin, til nekrose. Siden inkorporeringen av decitabin ikke er begrenset til kun de CpG-rike sekvensene kan det oppstå DNA-brudd, grunnet ustabiliteten av decitabin, noe som krever reparasjon i flere seter utenfor CpG-øyene.

Decitabin og azacitidin er ustabile i vandige medier og gjennomgår hydrolytisk degradering. I surt miljø blir decitabin hydrolysert ved romtemperatur til 5-azacytosin og 2-deoksyribose. I nøytralt medium ved romtemperatur foregår åpningen av triazinringen i 6-stillingen, for å danne det forbigående intermediære formylderivatet, som videre degraderes til amidino-urea-derivatet og maursyre (Piskala, A.; Synackova, M.; Tomankova, H.; Fiedler, P.; Zizkowsky, V. Nucleic Acids Res. 1978, 4, s109-s-113). Denne hydrolysen i 6-stillingen skjer i sure og basiske vandige medier med enda raskere hastigheter.

Syntesen av oligonukleotider som omfatter 5-azacytosinrester har blitt beskrevet av Garcia et al, Antisense & Nucleic Acid Drug Development Vol. 11, nr. 6, 369-378 (2001); Aviñó et al., Bioorg & Med. Chem. Letters, Vol. 5, No.20, 2331-2336, 1995;

WO1989/009779; og McIntosh et al., Biochemistry 1985, VoI. 24, nr. 18, 4806-4814.

I lys av den kjemiske ustabilitet og toksisiteten assosiert med decitabin eksisterer det et behov for å utvikle ikke bare mer stabile derivater av decitabin, men overlegne hypometyleringsmidler, hvor inkorporering er lokalisert til CpG-øyene i så stor grad som mulig eller hypometylering oppnås uten å signifikant påvirke integriteten av DNA.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oligonukleotidanaloger som inkorporerer 5-azacytosin i oligonukleotidsekvensen, f.eks. i form av 5-aza-2’-deoksycytidin (decitabin) eller 5-aza-cytidin.

Aspekter av oppfinnelsen er angitt i de medfølgende krav.

Oligonukleotidanalogen er valgt fra gruppen som består av 5’-DpG-3’, 5’-GpD-3’ hvor D er decitabin, p er en fosfolinker, og G er 2’-deoksyguanosin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for syntese av oligonukleotidanalogene og for modulering av nukleinsyremetylering.

Kort beskrivelse av figurene

De nye egenskapene til oppfinnelsen beskrives utførlig i de vedlagte krave. En bedre forståelse av egenskapene til og fordelene ved den foreliggende oppfinnelse vil oppnås ved henvisning til den påfølgende, detaljerte beskrivelse, som beskriver illustrerende utførelser i hvilke prinsippene for oppfinnelsen benyttes, og de vedlagte figurer, av hvilke:

Figur 1 viser strukturen til decitabin, D (1a), cytosin, C (1a’), og 5-metylcytosin, mC (1a’’).

Figur 2A viser eksempler på decitabin-fosforamidittbyggesteiner.

Figur 2B viser decitabin-fosforamidittbyggestein 1d, hvor R1 er fenoksyacetyl.

Figur 3A viser 3’- og 5’-O-blokkerte og kontrollert-pore glass 3’-bundede decitabinderivater.

Figur 3B viser beskyttet decitabin 3’-bundet på kontrollert-pore glass underlag. Figur 4 viser eksempler på 3’-O-blokkerte decitabinderivater.

Figur 5 viser en standardsyklus for oligonukleotidsyntese.

Figur 6A viser synteseskjemaer for GpD-dinukleotider og –tetranukleotider, hvor X<+ >er et mot-ion.

Figur 6B viser et eksempel på en syntesesyklus for GpD-dinukleotid (2a) og DpGpGpD-tetranukleotid (3b).

Figur 7 viser DpGpGpD-tetranukleotid.

Figur 8 viser synteseskjemaer for GpD-dinukleotider og –tetranukleotider.

Figur 9 viser GpDpG-trinukleotid og GpDpDpG-tetranukleotid.

Figur 10 viser beskyttet decitabin 3’-koblet til poly(etylenglykol).

Figur 11 viser synteseskjemaer for 3’- og 5’-O-blokkert GpD-dinukleotid.

Figur 12 viser synteseskjemaer for 3’- og 5’-O-blokkert DpG-dinukleotid.

Figur 13 viser Gpd- og DpG-dinukleotider med nukleaseresistent fosfotioatbinding. Figur 14 viser GpDpGpD- og DpGpGpD-tetranukleotider med nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 15 viser DpGpDpG- og GpDpDpG-tetranukleotider med nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 16 viser GpD- og DpG-dinukleotider med cytidindeaminaseresistente

4-aminogrupper.

Figur 17 viser GpD- og DpG-dinukleotider med cytidindeaminaseresistente

4-aminogrupper og nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 18 viser GpDpGpD- og DpGpGpD-tetranukleotider med cytisindeaminaseresistente 4-aminogrupper.

Figur 19 viser GpDpGpD- og GpDpGpD-tetranukleotider med cytidindeaminaseresistente 4-aminogrupper og nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 20 viser Cap-O-GpD-O-Cap- og Cap-O-DpG-O-Cap-dinukleotider med cytidindeaminaseresistente 4-aminogrupper.

Figur 21 viser Cap-O-GpD-O-Cap- og Cap-O-DpG-O-Cap-dinukleotider med cytidindeaminaseresistente 4-aminogrupper og nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 22 viser DpGpDpG- og GpDpDpG-tetranukleotider med cytidindeaminaseresistente 4-aminogrupper.

Figur 23 viser DpGpDpG- og GpDpDpG-tetranukleotider med cytidindeaminaseresistente 4-aminogrupper og nukleaseresistent fosfotioatbinding.

Figur 24A viser ⎯DpG-øyer med naturlig fosfodiesterryggrad eller modifisert ryggrad.

Figur 24B viser en ⎯DpG-øy-peptidryggrad.

Figur 25 viser skjematisk en cellebasert GFP-analyse for DNA-metylering. Felt a) viser kontrollceller og felt b) celler behandlet med oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse og uttrykkende GFP.

Figur 26 opplister eksempler på oligonukleotidanaloger ifølge oppfinnelsen som spesifikt er rettet mot promoterområdet i P15, BRAC1 eller P16, hvor D kan være decitabin eller decitabinanaloger og px = p for naturlig fosfatbinding, px = ps for fosforotioatbinding, px = bp for boranofosfat, px = mp for metylfosfonatbinding.

Figur 27 gir sekvensen til P15-promoterområdet og eksempler på segmenter av dette, basert på hvilke DpG- og GpD-rike oligonukleotidanaloger kan fremstilles.

Figur 28 gir sekvensen til P16-promoterområdet og eksempler på segmenter derav, basert på hvilke DpG- og GpD-rike oligonukleotidanaloger kan fremstilles.

Figur 29 gir sekvensen til BRCA1-promoterområdet og eksempler på segmenter derav, basert på hvilke DpG- og GpD-rike oligonukleotidanaloger kan fremstilles.

Figur 30 er et massespektrum av GpD (2a)-trietylammoniumsalt.

Figur 31 er et massespektrum av DpG (2b)-trietylammoniumsalt.

Figur 32 er et massespektrum av DpGpGpD (3b)-trietylammoniumsalt.

Figur 33 er et massespektrum av GpDpG (3c’)-trietylammoniumsalt.

Figur 34 er et massespektrum av DpGpDpG (3c)-trietylammoniumsalt.

Figur 35 er et massespektrum av fosforotioatsammenbundet DpG (2f)-trietylammoniumsalt.

Figur 36 er et massespektrum av DpG (2b)-natriumsalt.

Figur 37 er et massespektrum av HEG-DpG (2d)-trietylammoniumsalt.

Figur 38 er et massespektrum av decitabinfosforoamidittbyggesteinen (1d, R1 = fenoksyacetyl).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oligonukleotidanaloger som inkorporerer en analog av cytosin, 5-aza-cytosin, i oligonukleotidsekvensen, f.eks. i form av 5-aza-2’-deoksycytidin (også kjent som decitabin) eller 5-aza-cytidin (5-azaC). Det antas at inkorporeringen av én eller flere 5-aza-cytosinrester inn i et oligonukleotid vil ha en DNA-hypometyleringseffekt, siden erstatning av cytosin med decitabin i et spesifikt sete for metylering fører til en irreversibel inaktivering av DNA-metyltransferase. Fortrinnsvis blir decitabin inkorporert inn i oligonukleotidet i 5’-nabostilling til en guaninrest for å danne en DpG-øy, for mer spesifikk å målrette til CpG-øyene i det humane genom.

Oppfinnelsen er rettet mot å overvinne mulig toksisitet forbundet med konvensjonelle hypometyleringsmidler som decytabin og 5-aza-cytidin. Sammenlignet med de frie nukleosidformene, som inkorporeres tilfeldig og ekstensivt i hele genomet, kan de innovative forbindelsene fungere som primere og inkorporeres hovedsakelig i de CpG-rike øyene i DNA under replikasjonen. Fortrinnsvis fungerer de innovative forbindelsene som primere og inkorporeres spesifikt i de CpG-rike øyene i promoterne til terapeutisk eller diagnostisk viktige gener, slik som tumorsupressorgenene. De innovative forbindelsene kan danne midlertidig hemimetylerte tråder med foreldretråden og fungere som den aktive felle for DNA-metyltransferaser uten å bli inkorporert. De innovative forbindelsene kan også direkte binde og fange DNA-metyltransferase uten å bli inkorporert i genomet. Siden DNA-modifisering er lokalisert til de CpG-rike øyene i promoterregionene i tumorsupressorgener, når de innovative forbindelsene blir inkorporert, er den aktive fellen optimalt plassert, og totalstabiliteten til resten av genomet forblir ikke-kompromittert.

Ved å modulere DNA-metylering kan de innovative forbindelsene anvendes som terapeutiske og diagnostiske midler så vel som forskningsreagenser, spesielt innen områdene kreft og hematologiske forstyrrelser. Avvikende transkripsjonell ”silencing” av en rekke gener, slik som tumorsupressorgener, er direkte forbundet med patogenesen til kreft og andre sykdommer. På grunn av metylering av kreftrelaterte gener undertrykkes ekspresjonen av disse genene eller blir helt tause (”silencing”). I mellomtiden er ekspresjonen av disse genene nødvendig for induksjon av vekstarrest, differensiering og/eller apoptotisk celledød av transformerte celler. Inaktivitet av disse genene i de transformerte cellene fører til ukontrollert proliferasjon av disse cellene, noe som til slutt resulterer i kreft. Ved anvendelse av de innovative forbindelsene til aktivt å fange DNA-metyltransferaser direkte og uten å bli inkorporert i genomet eller inkorporert i de CpG-rike øyene i disse genene, kan følgelig transkripsjonen av genene reaktiveres gjennom inhibering av metylering av promoterne, og derved resulterer i undertrykkelse av kreftcelleproliferasjon.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være anvendbare for forskning og diagnose, siden noen utførelser av de innovative forbindelsene kan hybridisere til en 5’-ikke-translatert region eller en promotersekvens i et gen, noe som muliggjør å konstruere ”sandwich”-analyser og andre analyser for å utnytte dette faktum. Hybridisering av oligonukleotidanalogene ifølge oppfinnelsen til promotersekvensen kan påvises ved midler som er kjente innen faget. Slike midler kan inkludere konjugering eller ikke-kovalent binding av et enzym til oligonukleotidanalogen, radioaktiv merking av oligonukleotidanalogen eller hvilke som helst andre egnede påvisningsmidler. Sett som anvender slike påvisningsmidler for modulering av aktiviteten av promoteren i genet i en prøve kan også fremstilles.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for syntese av disse oligonukleotidanalogene og for modulering av C-5.cytosinmetylering. Nærmere bestemt tilveiebringes fosforamidittbyggesteiner og oligonukleotider som inneholder decitabin (5-aza-2’-deoksycytidin, D), DpG-rike (decitabin-fosfodiesterbinding-guanosin) øyer og derivater. Videre tilveiebringes fremgangsmåter for fremstilling, formulering og administrering av disse forbindelsene eller sammensetningene som terapeutiske midler til en vert med behov for dette. forbindelsene, syntesefremgangsmåtene, formuleringene av farmasøytiske sammensetninger, fremstilling av beholdere og sett og anvendelse av forbindelsene eller sammensetningene ifølge oppfinnelsen for behandling av sykdommer eller tilstander beskrives i detalj nedenfor.

1. Oligonukleotidanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et isolert eller syntetisk oligonukleotidanalog, eller et salt eller ester derav med den generelle formlen 5’-DpG-3’ eller 5’-GpD-3’ hvor D er decitabin, p er en fosfolinker, og G er 2’-deoksyguanosin.

Genet er fortrinnsvis et pattedyrsgen, mer foretrukket et humant gen og mest foretrukket et humant tumorsupressorgen. Eksempler på det humane genet inkluderer VHL (Von Hippon Landau-genet som er involvert i nyrecellekarsinom), P16/INK4A (involvert i lymfom), E-kadhern (involvert i metastase av bryst-, skjoldbrusk- og magekreft), hMLH1 (involvert i DNA-reparasjon ved kolon-, mage- og endometriumkreft), BRCA1 (involvert i DNA-reparasjon ved bryst- og ovariekreft), LKB1 (involvert i kolon- og brystkreft), P15/INK4B (involvert i leukemi slik som AML og ALL), ER (østrogenreseptor, involvert i bryst-, kolonkreft og leukemi), O6-MGMT (involvert i DNA-reparasjon i hjerne-, kolon-, lungekreft og lymfom), GST-pi (involvert i bryst-, prostata- og nyrekreft), TIMP-3 (vevsmetalloprotease, involvert i av kolon-, nyre- og hjernekreft metastase), DAPK1 (DAP-kinase, involvert i apoptose av B-celle lymfomceller), P73 (involvert i apoptose av lymfomceller), AR (androgenreseptor, involvert i prostatakreft), RAR-beta (retinsyrereseptor beta, involvert i prostatakreft), Endotelin-B-reseptor (involvert i prostatakreft), Rb (involvert i cellesyklusreguleringen i retinoblastom), P14ARF (involvert i cellesyklusregulering), RASSF1 (involvert i signaloverføring), APC (involvert i signaloverføring), Caspase-8 (involvert i apoptose), TERT (involvert i aldring), TERC (involvert i aldring), TMS-1 (involvert i apoptose), SOCS-1 (involvert i vekstfaktorrespons til hepatokarsinom), PITX2 (hepatokarsinom brystkreft), MINT1, MINT2, GPR37, SDC4, MYOD1, MDR1, THBS1, PTC1 og pMDR1 som beskrevet i Santini et al. (2001) Ann. of Intern. Med. 134:573-586.

Nukleotidsekvensen til disse genene kan lastes ned fra nettstedet til National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Som eksempler vises promotersekvensene til tumorsupressorgenene p15, p16 og BRCA1 i henholdsvis figur 27, 28 29. Eksempler på oligonukleotidanaloger med minst 75 % sekvenshomologi med et segment av p15, p16 og BRCA1 vises i henholdsvis figur 27, 28 29.

Det er kjent for fagfolk innen feltet nukleinsyrer at den høyere graden av sekvenshomologi for et analysepolynukleotid med dets målpolynukleotidet, jo høyere stringensitet av betingelsene hvor analysepolynukleotidet kan forbli hybridisert til målpolynukleotidet. Følgelig er oligonukleotidanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse som er utformet for målretting til et spesifikt gen de oligonukleotidanalogene som hybridiserer til målgenet under svært lave til svært høy stringens betingelser.

I en hvilken som helst av utførelsene ovenfor er linkeren mellom Z- og G-restene eller mellom hvilke som helst to av baserestene i oligonukleotidanalogen fortrinnsvis en sukker-fosfodiesterbinding. Fortrinnsvis er linkeren en fosforodiesterbinding via 2’-deoksyribose eller ribose, som i den naturlige sukker-fosfodiesterryggrad i henholdsvis DNA og RNA. Eventuelt for å øke rsistensen overfor nukleasedegradering in vivo kan den naturlige fosforodiesterbinding -O-P(=O)(O-)-O-CH2- bli modifisert til en fosforotioatbinding -O-P(=O)(S-)-O-CH2-, en bornofosfat- eller metylfosfonatbinding, 2’-hydroksylgruppen i ribose kan modifiseres til en 2’-metoksygruppe, en 2’-metoksyetylgruppe eller en 2’-fluorgruppe. Eksempler på slike oligonukleotidanaloger med unaturlig ryggrad vises i figur 24A, hvor decitabin er bundet til guanosin via en ribosefosfatryggrad. Den naturlige sukkerfosforodiesterryggrad kan også om ønskelig erstattes med en proteinnukleotide (PNA)-ryggrad, hvor ryggraden dannes av repeterende N-(2-aminoetyl)-glysinenheter bundet sammen med peptidbindinger. Et eksempel på en slik oligonukleotidanalog med PNA-ryggrad vises i figur 24B, hvor 5-aza-cytosin er bundet til guanin via en PNA-ryggrad. Andre typer av linkere for oligonukleotider som er utformet for å være mer resistente overfor nukleasedegradering enn den naturlige ryggrad beskrives i US patentskrifter nr. 6 900 540 og 6 900 301.

Oligonukleotidanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være slike som er isolert fra biologiske kilder, slik som vev, celler og kroppsvæske, og fortrinnsvis renset til en vesentlig grad av renhet, mer foretrukket til minst 80 % renhet og mest foretrukket til minst 95 % renhet. Oligonukleotidanalogene kan også være syntetiske, slike som er ikke-naturlig forekommende oligonukleotider som omfatter en 5-aza-cytidin, f.eks. kjemisk eller enzymatisk syntetisert in vitro.

Oligonukleotidanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter hvilke som helst farmasøytisk aksepterbare salter, estere eller salter av slike estere.

Begrepet ”farmasøytisk aksepterbare salter” viser til fysiologisk og farmasøytisk aksepterbare salter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, dvs. salter som bevarer den ønskede biologiske aktiviteten til utgangsforbindelsen og som ikke innfører uønskede toksikologiske effekter i denne.

Farmasøytisk aksepterbare baseaddisjonssalter dannes med metaller eller aminer, slik som alkali-, og alkaliske jordmetaller eller organiske aminer. Eksempler på metaller som anvendes som kationer er natrium, kalium, magnesium, kalsium og lignende. Eksempler på egnede aminer er N,N’-dibenzyletylendiamin, klorprokain, cholin, dietanolamin, disykloheksylamin, etylendiamin, N-metylglukamin og prokain (se for eksempel Berge et al., ”Pharmaceutical Salts”, J. of Phama Sci., 1977, 66, 1-19). Baseaddisjonssaltene av de sure forbindelsene fremstilles ved å sette den frie syreform i forbindelse med en tilstrekkelig mengde av den ønskede base for å danne saltet på konvensjonell måte. Den frie syreformen kan regenereres ved å sette saltformen i forbindelse med en syre og isolere den frie syren på konvensjonell måte. De frie syreformene er noe forskjellige fra de tilsvarende saltformene når det gjelder visse fysiske egenskaper, slik som løseligheten i polare løsemidler, men ellers er saltene ekvivalente med de tilsvarende frie syrene for formålet til den foreliggende oppfinnelse.

Som anvendt her omfatter et ”farmasøytisk addisjonssalt” et farmasøytisk aksepterbart salt av en syreform av én av bestanddelene i sammensetningene ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer organiske eller uorganiske syresalter av aminene. Foretrukne syresalter er hydrokloridene, acetatene, salisylatene, nitratene og fosfatene. Andre egnede, farmasøytisk aksepterbare salter er velkjente blant fagfolk og omfatter basiske salter av en rekke forskjellige uorganiske og organiske syrer, slik som for eksempel med uorganiske syrer, slik som for eksempel saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre eller fosforsyre, med organiske karboksylsyrer, sulfonsyrer, sulfosyrer eller fosfosyrer eller N-substituerte sulfaminsyrer, for eksempel eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, ravsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre, metylmaleinsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, melkesyre, oksalsyre, glukonsyre, glukarsyre, glukuronsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, salisylsyre, 4-aminosalisylsyre, 2-fenoksybenzosyre, 2-acetoksybenzosyre, embonsyre, nikotinsyre eller isonikotinsyre, og med aminosyrer, slik som de 20 alfa-aminosyrene som er involvert i syntesen av proteiner i naturen, for eksempel glutaminsyre eller asparaginsyre, og også med fenyleddiksyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, 2-hydroksyetansulfonsyre, etan-1,2-disulfonsyre, benzensulfonsyre, 4-metylbenzensulfonsyre, naftalen-2-sulfonsyre, naftalen-1,5-disulfonsyre, 2- eller 3-fosfoglyserat, glukose-6-fosfat, N-sykloheksylsulfaminsyre (med dannelse av syklamater) eller med andre sure organiske forbindelser, slik som askorbinsyre. Farmasøytisk aksepterbare salter av forbindelser kan også fremstilles med et farmasøytisk aksepterbart kation. Egnede, farmasøytisk aksepterbare kationer er velkjente blant fagfolk og inkluderer kationer av alkali-, alkaliske jord-, ammonium og kvaternært ammonium kationer. Karbonater eller hydrogenkarbonater er også mulige.

For oligonukleotidanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer foretrukne eksempler på farmasøytisk aksepterbare salter (a) salter dannet med kationer som natrium, kalium, ammonium, magnesium, kalsium, polyaminer som sermin og spermidin og så videre, (b) syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer, for eksempel saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og lignende, (c) salter dannet med organiske syrer som eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, benzosyre, garvesyre, palmitinsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfonsyre, metansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, naftalendisulfonsyre, polygalakturonsyre og lignende, og (d) salter dannet fra elementære anioner som klor, brom og jod.

Oppfinnelsen omfatter også isolerte forbindelser. En isolert forbindelse viser til en forbindelse som representerer minst 10 %, fortrinnsvis 20 %, mer foretrukket 50 % og mest foretrukket 80 % av forbindelsen tilstede i blandingen og oppviser en påvisbar (dvs. statistisk signifikant) inhiberende virkning på DNA-metylering når analysert i biologiske analyser, slik som den kombinerte bisulfitt-restriksjonsanalyse eller COBRA (Xiong, Z., Laird, P.W. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 2532-2534) og radioaktivt merket metyl inkorporeringsanalyse (Francis, K.T., Thompson, R. W., Krumdieck, C. L. Am. J. Clin. Nutr. 1977, 30, 2028-202).

2. Farmasøytiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan oligonukleotidanalogene eller forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres til farmasøytisk aksepterbare sammensetninger for behandling av forskjellige sykdommer og tilstander.

De farmasøytisk aksepterbare sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen i assosiasjon med ett eller flere ikketoksiske, farmasøytisk aksepterbare bærere, og/elelr fortynningsmidler, og/elelr adjuvanser og/eller eksipienser, som under ett her betegnes ”bærer”-materialer, og om ønskelig andre aktive bestanddeler.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres via hvilken som helst administreringsvei, fortrinnsvis i form av en farmasøytisk sammensetning som er tilpasset en slik administreringsvei, som illustrert nedenfor, og er avhengig av tilstanden som skal behandles. Forbindelsene og sammensetningene kan for eksempel administreres oralt, parenteralt, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, transdermalt, sublingualt, intramuskulært, rektalt, transbukalt, intranasalt, liposomalt, ved inhalering, vaginalt, intraokulært, ved lokal administrering (for eksempel ved et kateter eller stent), subkutant, intraadiposalt, intraartikulært eller intratekalt.

Den farmasøytiske formuleringen kan om ønskelig videre omfatte en eksipiens tilsatt i en mengde som er tilstrekkelig til å forbedre stabiliteten til sammensetningen, bevare produktet i løsning eller forhindre bivirkninger (f.eks. mulig sårdannelse, karirritasjon eller ekstravasasjon) forbundet med administreringen av den inventive formuleringen. Eksempler på eksipienser inkluderer mannitol, sorbitol, laktose, dekstrose, syklodekstrin, slik som α-, β- og γ-syklodekstrin, og modifisert, amorft syklodekstrin, slik som hydroksypropyl-, hydroksyetyl-, glukosyl-, maltosyl-, maltotriosyl, karboksyamidometyl-, karboksymetyl-, sulfobutyleter- og dietylaminosubstituert α-, β- og γ-syklodekstrin. Syklodekstriner som Encapsin<® >fra Janssen Pharmaceuticals eller tilsvarende kan anvendes for dette formål.

For oral administrering kan de farmasøytiske sammensetningene foreligge som for eksempel tabletter, kapsler, suspensjoner eller væsker. Det farmasøytiske preparat er fortrinnsvis fremstilt i form av en doseringsenhet som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av den aktive bestanddel. Eksempler på slike doseringsenheter er tabletter og kapsler. For terapeutiske formål kan tablettene og kapslene i tillegg til den aktive bestanddel inneholde konvensjonelle bærere slik som bindemidler, for eksempel akasiegummi, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sorbitol eller tragakant, fyllstoffer, for eksempel kalsiumfosfat, glysin, laktose, maisstivelse, sorbitol eller sukrose, smøremidler, for eksempel magnesiumstearat, polyetylenglykol, kiselgel eller talkum, desintegrasjonsmidler, for eksempel potetstivelse, smaksstoffer eller fargestoffer eller aksepterbare fuktingsmidler. Orale, flytende preparater foreligger vanligvis i form av vandige eller oljebaserte løsninger, suspensjoner, emulsjoner, siruper eller eliksirer og kan inneholde konvensjonelle tilsetningsstoffer, slik som suspensjonsmidler, emulsjonsmidler, ikke-vandige midler, konserveringsmidler, fargestoffer og smaksstoffer. Eksempler på tilsetningsstoffer for flytende preparater inkluderer akasie, mandelolje, etylalkohol, fraksjonert kokosnøttolje, gelatin, glukosesirup, glyserol, hydrogenerte, spiselige fettstoffer, lecitin, etylcellulose, metyl- eller propyl-parahydroksybenzoat, propylenglykol, sorbitol eller sorbinsyre.

For topisk anvendelse kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse også fremstilles i former som er egnet for påførsel på huden eller slimhinnene i nese og hals, og kan være utformet som kremer, salver, flytende sprayer eller inhaleringsmidler, pastiller eller løsninger for pensling av halsen. Slike topiske formuleringer kan videre inkludere kjemiske forbindelser slik som dimetylsulfoksid (DMSO), som forbedrer overflatepenetrasjonen av den aktive bestanddel.

For administrering til øynene eller ørene kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse foreligge i flytende eller halvflytende form, formulert i hydrofobe eller hydrofile basiser som salver, kremer, lotioner, penslingsvæsker eller pulvere.

For rektal administrering kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i form av stikkpiller, sammenblandet med konvensjonelle stoffer som kakaosmør, voks eller andre glyserider.

Alternativt kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse foreligge i pulverform for rekonstituering i et egnet, farmasøytisk aksepterbart bærestoff på administreringstidspunktet.

De farmasøytiske sammensetningene kan administreres ved injeksjon.

Formuleringer for parenteral administrering kan foreligge i form av vandige eller ikkevandige, isotone, sterile løsninger eller suspensjoner for injeksjon. Disse løsningene eller suspensjonene kan fremstilles fra sterile pulvere eller granulater med én eller flere av de nevnte bærere for anvendelse i formuleringene for oral administrering. Forbindelsene kan være løst i polyetylenglykol, propylenglykol, etanol, maisolje, benzylalkohol, natriumklorid og/eller forskjellige buffere.

Oligonukleotidanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles og formuleres som emulsjoner. Emulsjoner er typisk heterogene systemer av én væske dispergert i en annen i form av små dråper som vanligvis har en diameter som er større enn 0,1 µm (Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 199, Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s.

245, Block i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 2, s. 335, Higuchi et al., i Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, s. 301). Emulsjoner er ofte tofasesystemer som består av to ikke blandbare, flytende faser som er nøye blandet sammen og dispergert i hverandre. Generelt kan emulsjoner enten være vann-i-olje (w/o) eller av olje-i-vann (o/w)-varianten. Når en vandig fase er finfordelt i og dispergert som små dråper i en oljefase betegnes den resulterende sammensetningen en vann-i-olje (w/o)-emulsjon. Alternativt, når en oljebasert fase er finfordelt i og dispergert som små dråper i en vandig fase betegnes den resulterende sammensetningen en olje-i-vann (o/w)-emulsjon.

Emulsjoner kan inneholde ytterligere bestanddeler i tillegg til de dispergerte fasene og det aktive medikament, som kan foreligge som en løsning i enten vannfasen eller oljefasen, eller foreligge som en separat fase. Farmasøytiske eksipienser slik som emulsjonsmidler, stabilisatorer, fargestoffer og antioksidanter, kan også foreligge i emulsjoner etter behov. Farmasøytiske emulsjoner kan også være multiple emulsjoner som består av mer enn to faser slik som for eksempel olje-i-vann-i-olje (o/w/o)- og vann-i-olje-i-vann (w/o/w)-emulsjoner. Slike kompliserte formuleringer byr ofte på visse fordeler som enkle binære emulsjoner ikke har. Multiple emulsjoner i hvilke enkeltvise oljedråper i en o/w-emulsjon omslutter små vanndråper utgjør en w/o/w-emulsjon. Likeså gir et system av oljedråper innesluttet i vanndråper som er stabilisert i en oljebasert kontinuerlig fase en o/w/oemulsjon.

Emulsjoner særpreges ved liten eller ingen termodynamisk stabilitet. Ofte er den dispergerte eller diskontinuerlige fasen i emulsjonen godt dispergert i den ytre eller kontinuerlige fasen, og opprettholdes i denne form ved hjelp av emulsjonsmidler eller viskositeten til formuleringen. En av fasene i emulsjonen kan være halvfast eller fast, noe som er tilfelle for salvebasiser og kremer av emulsjonstype. Andre midler for stabilisering av emulsjoner omfatter anvendelse av emulsjonsmidler, som kan innføres i hvilken som helst fase i emulsjonen. Emulsjonsmidler kan grovt sett fordeles i fire kategorier: syntetiske surfaktanter, naturlig forekommende emulsjonsmidler, absorpsjonsbasiser og finfordelte faste stoffer (Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 199).

Syntetiske surfaktanter, også betegnet overflateaktive midler, har fått bred anvendelse ved formulering av emulsjoner, og oversikter over disse finnes i litteraturen (Rieger, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 285, Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, bind 1, s.

199). Surfaktanter er typisk amfifile forbindelser som omfatter en hydrofil og en hydrofob del. Forholdet mellom surfaktantens hydrofile og hydrofobe egenskaper har blitt betegnet den hydrofile/lipofile balanse (HLB) og er et verdifullt verktøy for kategorisering og utvelgelse av surfaktanter ved fremstilling av formuleringer. Surfaktanter kan fordeles på forskjellige klasser basert på den hydrofile gruppens egenskaper: ikke-ionisk, anionisk, kationisk og amfotær (Rieger, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 5, s. 285).

Naturlig forekommende emulsjonsmidler som anvendes i emulsjonsformuleringer inkluderer lanolin, bivoks, fosfatider, lecitin og akasie. Absorpsjonsbasiser besitter hydrofile egenskaper, slik at de kan suge opp vann og danne w/o-emulsjoner, men like fullt bevare sin halvfaste konsistens, slik som vannfri lanolin og hydrofil vaselin. Finfordelte faste stoffer har også blitt anvendt som gode emulsjonsmidler, særlig i kombinasjon med surfaktanter og i viskøse preparater. Disse inkluderer polare uorganiske faste stoffer, slik som tungmetallhydroksider, ikke-svellende leirer, slik som bentonitt, atapulgitt, hektoritt, kaolin, montmorrilonitt, kolloidalt aluminiumsilikat og kolloidalt magnesiumaluminiumsilikat, pigmenter og upolare faste stoffer, slik som karbon eller glyseryltristearat.

Et bredt utvalg av ikke-emulgerende materialer inngår også i emulsjonsformuleringer og bidrar til egenskapene til emulsjoner. Disse omfatter fettstoffer, oljer, vokser, fettsyrer, fettalkoholer, fettestere, fuktighetsbevarende midler, hydrofile kolloider, konserveringsmidler og antioksidanter (Block, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 335, Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, New York, N.Y., bind 1, s. 199).

Hydrofile kolloider eller hydrokolloider omfatter naturlig forekommende gummier og syntetiske polymerer, slik som polysakkarider (for eksempel akasie, agar, alginsyre, karraginan, guargummi, karajagummig og tragakant), cellulosederivater (for eksempel karboksymetylcellulose og karboksypropylcellulose) og syntetiske polymerer (for eksempel karbomerer, celluloseetere og karbovinylpolymerer). Disse dispergerer eller sveller i vann for dannelse av kolloidale løsninger som stabiliserer emulsjoner ved å danne kraftige interfasefilmer rundt dråpene av den dispergerte fasen og ved å øke den ytre fases viskositet.

Siden emulsjoner ofte inneholder en rekke forskjellige bestanddeler, slik som karbohydrater, proteiner, steroler og fosfatider, som lett kan understøtte veksten av mikrober omfatter disse formuleringene ofte konserveringsmidler. Vanlig anvendte konserveringsmidler som inngår i emulsjonsformuleringer inkluderer metylparaben, propylparaben, kvaternære ammoniumsalter, benzalkoniumklorid, estere av p-hydroksybenzosyre og borsyre. Antioksidanter tilsettes også ofte til emulsjonsformuleringer for å forhindre forringelse av formuleringen. Antioksidanter som anvendes kan være forbindelser som fjerner frie radikaler slik som tokoferoler, alkylgallater, butylert hydroksyanisol, butylert hydroksytoluen, eller reduksjonsmidler som askorbinsyre og natriummetabisulfitt, og forbindelser som virker synergistisk med antioksidanter, slik som sitronsyre, vinsyre og lecitin.

Administrering av emulsjonsformuleringer dermalt, oralt og parenteralt og fremgangsmåter for fremstilling av dem har blitt gjennomgått i litteraturen (Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 199). Emulsjonsformuleringer for oral administrering har blitt veldig utbredt på grunn av enkle formuleringer, effektivitet fra et absorpsjons og biotilgjengelighetssynpunkt (Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 245, Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 199). Mineraloljebaserte avføringsmidler, oljeløselige vitaminer og høyt-fett næringspreparater er blant materialene som ofte blir administrert oralt som o/w-emulsjoner.

I én utførelse av den foreliggende oppfinnelse formuleres oligonukleotidanalogene som mikroemulsjoner. En mikroemulsjon kan defineres som et system av vann, olje og amfifil forbindelse som er en enkelt, optisk isotropisk og termodynamisk stabil flytende løsning (Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 245). Mikroemulsjoner er typisk systemer som fremstilles ved først å dispergere en olje i en vandig surfaktantløsning, og så tilsette en tilstrekkelig mengde av en fjerde bestanddel, vanligvis en alkohol med middels kjedelengde, slik at det dannes et gjennomsiktig system. Mikroemulsjoner har derfor også blitt beskrevet som termodynamisk stabile, isotropisk klare dispersjoner av to ikke-blandbare væsker som stabiliseres av interfasefilmer av overflateaktive molekyler (Leung og Shah, i: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., red., 1989, VCH Publishers, New York, s. 185-215). Mikroemulsjoner blir vanligvis fremstilt via en kombinasjon av tre til fem komponenter som inkluderer olje, vann, surfaktant, kosurfaktant og elektrolytt.

Hvorvidt mikroemulsjonen er av vann-i-olje (w/o)- eller olje-i-vann (o/w)-type avhenger av egenskapene til den benyttede olje og surfaktanten og av strukturen og den geometriske pakking av de polare hodene og hydrokarbonhalene til surfaktantmolekylene (Schott, i Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, s. 271).

Den fenomenologiske tilnærmingen ved anvendelse av fasediagrammer har blitt omfattende studert og har gitt omfattende kunnskap til fagpersonen når det gjelder hvordan formulere mikroemulsjoner (Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 245, Block, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 335). Sammenlignet med konvensjonelle emulsjoner har mikroemulsjoner den fordel at vannuløselige medikamenter solubuliseres i en formulering av termodynamisk stabile smådråper som dannes spontant.

Surfaktanter som anvendes ved fremstilling av mikroemulsjoner inkluderer ioniske surfaktanter, ikke-ioniske surfaktanter, Brij 96, polyoksyetylenoleyletere, polyglyserolfettsyreestere, tetraglyserol monolaurat (ML310), tetraglyserolmonooleat (MO310), heksaglyserol monooleat (PO310), heksaglyserol pentaoleat (PO500), dekaglyserol monokaprat (MCA750), dekaglyserol monooleat (MO750), dekaglyserol sequioleat (SO750), dekaglyserol dekaoleat (DAO750), alene eller i kombinasjon med kosurfaktanter.

Kosurfaktanten, vanligvis en kortkjedet alkohol som etanol, 1-propanol og 1-butanol, bidrar til å forhøye interfasefluiditeten ved å trenge inn i surfaktantfilmen og derved danne en uordnet film, grunnet tomrommet som dannes rundt surfaktantmolekylene. Mikroemulsjoner kan imidlertid fremstilles uten anvendelse av kosurfaktanter, og alkoholfrie, selvemulgerende mikroemulsjonssystemer er kjente innen faget. Den vandige fasen kan typisk være vann, en vandig løsning av medikamentet, glyserol, PEG300, PEG400, polyglyseroler, propylenglykoler og derivater av etylenglykol. Oljefasen kan omfatte materialer som Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, fettsyreestere, mono-, di- og triglyserider med middels kjedelengde (C8-C12), polyoksyetylerte glyserylfettsyreestere, fettalkoholer, polyglykolyserte glyserider, mettede polyglykolyserte C8-C10-glyserider, vegetabilske oljer og silikonolje.

Mikroemulsjoner er særlig av interesse når det gjelder legemiddelsolubilisering og forbedret absorpsjon av legemidler. Lipidbaserte mikroemulsjoner (både o/w og w/o) har blitt foreslått å forbedre den orale biotilgjengeligheten av legemidler, inkludert peptider (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390, Ruitschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Mikroemulsjoner byr på fordeler når det gjelder forbedret legemiddelsolubilisering, beskyttelse av legemidlet mot enzymatisk hydrolyse, mulig forbedret legemiddelabsorpsjon grunnet surfaktantinduserte endringer i membranfluiditet og –permeabilitet, enkel fremstilling, enkel oral administrerig sammenlignet med faste doseringsformer, forbedret klinisk aktivitet og redusert toksisitet (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385, Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Mikroemulsjoner kan ofte dannes spontant når bestanddelene bringes sammen ved romtemperatur. Dette kan være spesielt fordelaktig ved formulering av varmelabile medikamenter, peptider eller oligonukleotider. Mikroemulsjoner har også vært effektive for transdermal administrering av aktive bestanddeler, både i kosmetiske og farmasøytiske anvendelser. Det forventes at mikroemulsjonssammensetningene og –formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse vil lette den forhøyede systemiske absorpsjonen av oligonukleotider og nukleinsyrer fra mage-tarmkanalen, så vel som forbedre det lokale cellulære opptak av oligonukleotider og nukleinsyrer i mage-tarmkanalen, vagina, munnhulen og andre områder for administrering.

Mikroemulsjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan også inneholde ytterligere bestanddeler og tilsetningsstoffer, slik som sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol og penetrasjonsfremmende midler, for å forbedre egenskapene til formuleringene og gi økt absorpsjon av oligonukleotidene og nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Penetrasjonsfremmende midler som anvendes i mikroemulsjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan klassifiseres som tilhørende én av fem brede kategorier – surfaktanter, fettsyrer, gallesalter, gelateringsmidler og ikke-gelaterende ikke-surfaktanter (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, s. 92). Alle disse klassene har blitt diskutert ovenfor.

I tillegg til mikroemulsjoner er det mange organiserte surfaktantstrukturer som har blitt undersøkt og anvendt for formuleringen av medikamenter. Disse inkluderer monolag, misceller, bilag og vesikler. Vesikler slik som liposomer, har tiltrukket seg stor interesse, grunnet den spesifisitet og varighet av virketiden som de tillater når det gjelder medikamentavlevering. Som anvendt i den foreliggende oppfinnelse betyr begrepet ”liposom” en vesikkel som består av amfifile lipider arrangert i ett kuleformede dobbeltlag eller flere dobbeltlag.

Liposomer er unilamellære eller multilamellære vesikler som har en membran dannet av et lipofilt materiale og et vandig indre. Den vandige delen inneholder sammensetningen som skal avleveres. Kationiske liposomer har den fordel at de kan fusjonere med celleveggen. Ikke-kationiske liposomer, selv om de ikke fusjonerer like effektivt til celleveggen, tas opp av makrofager in vivo.

For å kunne krysse intakt pattedyrshud må lipidvesikler passere gjennom en serie av fine porer, alle med en diameter på mindre enn 50 nm, under påvirkning av en egent transdermal gradient. Det er følgelig ønskelig å anvende et liposom som lett kan deformeres og som kan passere gjennom slike fine porer.

Andre fordeler med liposomer inkluderer: liposomer oppnådd fra naturlige fosoflipider er bioforenlige og biodegraderbare, liposomer kan inkorporere et bredt utvalg av vann- og lipidløselige medikamenter, liposomer kan beskytte innkapslede medikamenter i sine indre avdelinger mot metabolisme og degradering (Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger og Banker (red.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., bind 1, s. 245). Viktige betraktninger ved fremstilling av liposomformuleringer er lipidoverflateladningen, vesikkelstørrelsen og det vandige volumet av liposomene.

Liposomer er anvendbare for transport og avlevering av aktive bestanddeler til virkestedet. Siden liposommembranen strukturelt ligner biologiske membraner vil liposomene begynne å smelte sammen med cellemembranene når liposomene administreres til et vev. Etter hvert som sammensmeltningen mellom liposom og celle fortsetter tømmes liposominnholdet inn i cellen, hvor det aktive middel kan virke.

Liposomformuleringer har vært fokus for omfattende undersøkelser om avleveringsmåte for mange medikamenter. Det er økende bevis for at topisk administrering gir liposomer flere fordeler i forhold til andre formuleringer. Slike fordeler inkluderer reduserte bivirkninger forbundet med høy systemisk absorpsjon av det administrerte medikament, økt akkumulering av det administrerte medikamentet i det ønskede målet og evnen til å administrere et bredt utvalg av medikamenter, både hydrofile og hydrofobe, inn i huden.

Liposomer kan deles i to brede klasser. Kationiske liposomer er positivt ladde liposomer som interagerer med de negativt ladde DNA-molekylene og danner et stabilt kompleks. Det positivt ladede DNA/liposomkompleks bindes til den negativt ladede celleoverflate og internaliseres i et endosom. Grunnet den sure pH i endosomet brytes liposomene opp og frigjør innholdet til cellens cytoplasma (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Liposomer som er pH-følsomme eller negativt ladede innfanger DNA snarere enn å danne komplekser med det. Siden DNA og lipid har samme ladning opptrer en frastøtning snarere enn kompleksdannelse. Ikke desto mindre vil noe DNA innfanges i disse liposomenes vandige indre. pH-følsomme liposomer har blitt anvendt for administrering av DNA som koder for tymidinkinasegenet til encellelag i kultur. Ekspresjon av det eksogene gen ble påvist i målcellene (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

En hovedtype av liposomsammensetning inkluderer fosfolipider som ikke er naturlig-avledet fosfatidylcholin. Nøytrale liposomsammensetninger kan for eksempel dannes av dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC) eller dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC). Anioniske liposomsammensetninger dannes vanligvis av dimyristoylfosfatidylglyserol, mens anioniske, fysogene liposomer primært dannes fra dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE). En annen type av liposomsammensetning dannes av fosfatidylcholin (PC), slik som for eksempel soyabønne-PC og egg-PC. En annen type dannes av blandinger av fosfolipid og/eller fosfatidylcholin og/eller kolesterol.

Ikke-ioniske liposomsystemer har også blitt undersøkt for å bestemme deres nytteverdi ved avlevering av medikamenter til huden, nærmere bestemt systemer som omfatter en ikke-ionisk surfaktant og kolesterol. Ikke-ioniske liposomformuleringer som omfatter Novasome<TM >I (glyseryldilaurat/kolesterol/polyoksyetylen-10-stearyleter) og Novsome<TM >II (glyseryldistearat/kolesterol/polyoksyetylen-10-stearyleter) ble anvendt for administrering av syklosporin A inn i dermis i musehud. Resultatene viste at slike ikkeioniske liposomsystemer effektivt fremmet deponering av syklosporin A i forskjellige lag av huden (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).

Liposomer omfatter også ”sterisk stabiliserte” liposomer, et begrep som når det anvendes her viser til liposomer som omfatter ett eller flere spesialiserte liposomer som når de innføres i liposomer fører til forhøyet levetid i sirkulasjonen, sammenlignet med liposomer som mangler slike spesialiserte lipider. Eksempler på sterisk stabiliserte liposomer er liposomer hvor en del av den vesikkeldannende lipiddelen av liposomet (A) omfatter ett eller flere glykolipider, slik som monosialogangliosid GM1, eller (B) er derivatisert med én eller flere hydrofile polymerer, slik som en polyetylenglykol (PEG)-gruppe. Uten ønske om å være bundet til en gitt teori antas det innen faget at den forbedrede halveringstid i sirkulasjonen for disse sterisk stabiliserte liposomene, i det minste for sterisk stabiliserte liposomer som inneholder gangliosider, sfingomyelin eller PEG-derivatiserte lipider, skyldes et redusert opptak i celler i det retikuloendoteliale systemet (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42, Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Forskjellige liposomer som omfatter ett eller flere glykolipider er kjente innen faget. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) rapporterte evnen til monosialogangliosid GM1, galaktoserebrosidsulfat og fosfatidylinnositol til å forbedre halveringstiden i blod av liposomer. Disse funnene ble videre tolket av Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949). US patentskrift nr. 4 837 028 og WO 88/04924, begge tilhørende Allen et al., beskriver liposomer som omfatter (1) sfingomyelin og (2) gangliosidet GM1 eller en galaktoserebrosidsulfatester. US patentskrift nr. 5 543 152 (Webb et al.) beskriver liposomer som omfatter sfingomyelin. Liposomer som omfatter 1,2-sndimyristoylfosfatidylcholin beskrives i WO 97/13499 (Lim et al.).

Mange liposomer som omfatter lipider derivatisert med én eller flere hydrofile polymerer og fremgangsmåter for fremstilling derav er kjent innen faget. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) beskrev liposomer som omfattet en ikke-ionisk detergent, 2C12 15G, som inneholder en PEG-gruppe. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) bemerket at et hydrofilt belegg på polystyrenpartikler med polymere glykoler førte til signifikant forhøyet halveringstid i blodet. Syntetiske fosfolipider modifisert ved tilkobling av karboksylgrupper på polyalkylenglykoler (f.eks. PEG) beskrives av Sears (US patentskrifter nr. 4 426 330 og 4 534 899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) beskrev eksperimenter som viste at liposomer som omfattet fosfatidyletanolamin (PE) derivatisert med PEG eller PEG-stearat har signifikant forlenget halveringstid i blodsirkulasjonen. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) utvidet slike observasjoner til andre PEG-derivatiserte fosfolipider, f.eks. DSPE-PEG, dannet ved å kombinere distearoylfosfatidyletanolamin (DSPE) og PEG. Liposomer med kovalent bundne PEG-grupper på den ytre overflate beskrives i europeisk patentskrift EP 0 445 131 B1 og WO 90/04384, tilhørende Fischer. Liposomsammensetninger som inneholder 1-20 mol% av PE derivatisert med PEG og fremgangsmåter for anvendelse derav beskrives av Woodle et al. (US patentskrifter nr.

5 013 556 og 5 356 633) og av Martin et al. (US patentskrift nr. 5 213 804 og europeisk patentskrift EP 0 496 813 B1). Liposomer som omfatter et antall andre lipidpolymerkonjugater beskrives i WO 91/05545 og US patentskrift nr. 5 225 212 (begge til Martin et al.) og i WO 94/20073 (zalipsky et al.). Liposomer som omfatter PEG-modifiserte ceramidlipider beskrives i WO 96/10391 (Choi et al.). US patentskrifter nr. 5 540 935 (Miyazaki et al.) og 5 556 948 (Tagawa et al.) beskriver PEG-holdige liposomer som kan derivatiseres videre med funksjonelle grupper på overflaten.

Et begrenset antall av liposomer som omfatter nukleinsyrer er kjente innen faget. WO 96/40062 tilhørende Thierry et al. beskriver fremgangsmåter for innkapsling av høymolekylære nukleinsyrer i liposomer. US patentskrift nr. 5 264 221 tilhørende Tagawa et al. beskriver proteinbundne liposomer og hevder at innholdet i slike liposomer kan omfatte et ”antisens”-RNA. US patentskrift nr. 5 665 710 tilhørende Rahman et al. beskriver visse fremgangsmåter for innkapsling av oligodeoksynukleotider i liposomer. WO 97/04787 tilhørende Love et al. beskriver liposomer som omfatter ”antisens”-oligonukleotider rettet mot raf-genet.

Transfersomer er ytterligere en type av liposomer, og er svært deformerbare lipidaggregater som er tiltrekkende kandidater for medikament avleveringsbærere.

Transfersomer kan beskrives som lipiddråper som er så lett deformerbare at de lett kan penetrere gjennom porer som er mindre enn dråpen. Transfersomer kan tilpasses miljøet som de anvendes i, de er f.eks. selvoptimaliserende (tilpasses formen på porene i huden), selvreparerende, når ofte sine mål uten fragmentering og er ofte selvfyllende. For fremstilling av transfersomer er det mulig å tilsette overflatekantaktivatorer, vanligvis surfaktanter til et standard liposomsammensetning. Transfersomer har blitt anvendt for administrering av serumalbumin til huden. Transfersomformidlet avlevering av serumalbumin har blitt vist å være like effektivt som subkutan injeksjon av en løsning inneholdende serumalbumin.

Surfaktanter anvendes hyppig i formuleringer som emulsjoner (inkludert mikroemulsjoner) og liposomer. Den vanligste måte å klassifisere og rangere egenskapene til de mange forskjellige typene av surfaktanter, både naturlige og syntetiske, er ved å anvende den hydrofile/lipofile balanse (HLB). Egenskapene til den hydrofile gruppen (også betegnet ”hodet”) gir det mest anvendbare middel for kategorisering av de forskjellige surfaktantene som anvendes i formuleringer (Rieger, i Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, s. 285).

Dersom surfaktantmolekylet ikke er ionisert klassifiseres det som en ikke-ionisk surfaktant. Ikke-ioniske surfaktanter anvendes hyppig i farmasøytiske og kosmetiske produkter og kan anvendes over et bredt område av pH-verdier. Generelt varierer HLB-verdien fra 2 til tilnærmet 18, avhengig av strukturen. Ikke-ioniske surfaktanter inkluderer ikke-ioniske estere, slik som etylenglykolestere, propylenglykolestere, glyserylestere, polyglyserylestere, sorbitanestere, sukroseestere og etoksylerte estere. Ikke-ioniske alkanolamider og etere, slik som fettalkoholetoksylater, propoksylerte alkoholer og etoksylerte/propoksylerte blokkopolymerer, inngår også i denne klassen. Polyoksyetylensurfaktantene er de mest populære medlemmene av den ikke-ioniske surfaktantklassen.

Dersom surfaktantmolekylet bærer en negativ ladning når det er løst eller dispergert i vann, klassifiseres surfaktanten som anionisk. Anioniske surfaktanter inkluderer karboksylater som såper, acyllaktylater, acylamider av aminosyrer, estere av svovelsyre, slik som alkylsulfater og etoksylerte alkylsulfater, sulfonater, slik som alkylbenzensulfonater, acylisetionater, acyltaurater og sulfosuksinater, og fosfater. De viktigste medlemmene av den anioniske surfaktantklassen er alkylsulfatene og såpene.

Dersom surfaktantmolekylet bærer en positiv ladning når det er løst eller dispergert i vann klassifiseres surfaktanten som kationisk. Kationiske surfaktanter inkluderer kvaternære ammoniumsalter og etoksylerte aminer. De kvaternære ammoniumsaltene er de hyppigst anvendte medlemmene av denne klassen.

Dersom surfaktantmolekylet har evnen til å bære enten en positiv eller negativ ladning klassifiseres surfaktanten som amfotær. Amfotære surfaktanter inkluderer akrylsyrederivater, substituerte alkylamider, N-alkylbetainer og fosfatider.

Det foreligger en oversikt over anvendelsen av surfaktanten i medikamentprodukter, formuleringer og emulsjoner (Rieger, i Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, s. 285).

I en spesiell utførelse kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres til et farmasøytisk aksepterbart sammensetning som omfatter forbindelsen løst i et ikkevandig løsemiddel som omfatter glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol eller kombinasjoner derav. Det antas at forbindelsene vil være stabile i slike farmasøytiske formuleringer, slik at de farmasøytiske formuleringene kan lagres over et lengre tidsrom før anvendelsen.

I dagens kliniske behandling med decitabin leveres decitabin som et frysetørket pulver for minimalisering av nedbrytningen av medikamentet, og rekonstitueres i en kald, vandig løsning hvor vann utgjør minst 40 % (vol/vol) av løsemidlet, slik som WFI, og fortynnet i kalde infusjonsvæsker før administreringen. En slik formulering og et slikt behandlingsskjema lider av noen ulemper. For det første blir avkjøling av decitabin i kald løsning avgjørende, noe som er besværlig når det gjelder håndtering og økonomisk mindre ønskelig enn en formulering som kan tåle lagring ved høyere temperaturer. For det andre kan den rekonstituerte decitabinløsningen kun tilføes i en pasient i maksimalt tre timer dersom løsningen ha blitt lagret i kjøleskap i mindre enn 7 timer, grunnet den hurtige nedbrytningen av decitabin i vandig løsning. I tillegg kan infusjon av kald væske føre til stort ubehag og smerte for pasienten, som gjør at pasienten motsetter seg slik behandling.

Ved å modifisere triazinringen og/eller riboseringen i decitabin og ved å formulere forbindelsen med ikke-vandig løsemiddel kan de farmasøytiske formuleringene unngå de ovenfor angitte problemer forbundet med dagens kliniske behandling med decitabin. Disse formuleringene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen antas å være mer kjemisk stabile enn decitabin formulert i vandige løsninger inneholdende minst 40 % (vol/vol) vann i løsemidlet.

I en foretrukket utførelse inneholder formuleringen ifølge oppfinnelsen mindre enn 40 % vann i løsemidlet, om ønskelig mindre enn 20 % vann i løsemidlet, om ønskelig mindre enn 10 % vann i løsemidlet eller om ønskelig mindre enn 1 % vann i løsemidlet. I én variant lagres den farmasøytiske formuleringen i i det vesentlige vannfri form. Om ønskelig kan et tørkemiddel tilsettes til den farmasøytiske formuleringen for å absorbere vann.

Grunnet den forbedrede stabilitet kan den inovative formuleringen lagres og transporteres ved romtemperatur, noe som i signifikant grad reduserer kostnadene forbundet med håndtering av medikamentet. Videre kan den inovative formuleringen enkelt lagres over et lengre tidsrom før administrering til pasienten. I tillegg kan den inovative formuleringen fortynnes med vanlig infusjonsvæske (uten avkjøling) og administreres til en pasient ved romtemperatur, slik at man unngår det ubehag for pasienten som er forbundet med infusjon av kald væske.

I en annen utførelse er den inovative forbindelsen løst i glyserol i forskjellige konsentrasjoner. Formuleringen kan for eksempel om ønskelig omfatte mellom 0,1 og 200, mellom 1 og 100, mellom 1 og 50, mellom 2 og 50, mellom 2 og 100, mellom 5 og 100, mellom 10 og 100 eller mellom 20 og 100 mg av den inovative forbindelsen pr. ml glyserol. Spesifikke eksempler på konsentrasjoner av den inovative forbindelsen i glyserol omfatter 2, 5, 10, 20, 22, 25, 30, 40 og 50 mg/ml.

Forskjellige renhetsgrader av glyserol (synonymer: 1,2,3-propandiol, glyserin, glykolalkohol, vannfri glyserol) kan anvendes for å fremstille formuleringene. Fortrinnsvis anvendes glyserol med en kjemisk renhet som er høyere enn 90 % for å fremstille formuleringene.

I en annen utførelse løses den inovative forbindelsen i propylenglykol i forskjellige konsentrasjoner. Formuleringen kan for eksempel om ønskelig omfatte mellom 0,1 og 200, mellom 0,1 og 100, mellom 0,1 og 50, mellom 2 og 50, mellom 2 og 100, mellom 5 og 100, mellom 10 og 100 eller mellom 20 og 100 mg av den inovative forbindelsen pr. ml propylenglykol. Spesifikke eksempler på konsentrasjoner av decitabin i propylenglykol omfatter 2, 5, 10, 20, 22, 25, 30, 40 og 50 mg/ml. I nok en utførelse er den inovative forbindelsen løst i et løsemiddel som er en blanding av glyserol og propylenglykol i forskjellige konsentrasjoner. Konsentrasjonen av propylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1-90 %, mellom 10-80 % eller mellom 50-70 %.

I nok en utførelse er den inovative forbindelsen løst i forskjellige konsentrasjoner i et løsemiddel som er en blanding av glyserol og polyetylenglykol (PEG), slik som PEG300, PEG400 og PEG1000. Konsentrasjonen av polyetylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1-90 %, mellom 10-80 % eller mellom 50-70 %.

I nok en utførelse er den inovative forbindelsen løst i forskjellige konsentrasjoner i et løsemiddel som er en blanding av propylenglykol, polyetylenglykol og glyserol.

Konsentrasjonen av propylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1-90 %, mellom 10-60 % eller mellom 20-40 %, og konsentrasjonen av polyetylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1-90 %, mellom 10-80 % eller mellom 50-70 %.

Det antas og er bevist eksperimentelt at tilsetning av propylenglykol ytterligere kan forbedre kjemiske stabilitet, redusere viskositeten av formmuleringen og fremme løsning av den inovative forbindelsen i løsemidlet.

Den farmasøytiske formulering kan videre omfatte et surgjøringsmiddel som er tilsatt til formuleringen i en andel som gjør at formuleringen har en pH på tilnærmet 4 og 8. Surgjøringsmidlet kan være en organisk syre. Eksempler på organiske syrer omfatter askorbinsyre, sitronsyre, vinsyre, melkesyre, oksalsyre, maursyre, benzensulfonsyre, benzosyre, maleinsyre, glutaminsyre, ravsyre, asparaginsyre, diatrizoinsyre og eddiksyre. Surgjøringsmidlet kan også være en uorganisk syre, slik som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre og salpetersyre.

Det antas at tilsetning av et surgjøringsmiddel til formuleringen for å oppnå en relativ nøytral pH (f.eks. mellom pH 4 og 8) letter løsningen av den inovative forbindelsen i løsemidlet og forbedrer formuleringens langtidsstabilitet. I alkalisk løsning skjer det en hurtig, reversibel nedbrytning av decitabin til N-(formylamidino)-N’- β-D-2-deoksyribofuranosyl-deoksyribofuranosylurea, som nedbrytes irreversibelt ved dannelse av 1- β-D-2’-deoksyribofuranosyl-3-guanylurea. Det første trinn i den hydrolytiske nedbrytningen omfatter dannelse av N-amidinium-N’-(2-deoksy- β-D-erytropentofuranosyl) ureaformat (AUF). Det andre trinn i nedbrytningen ved forhøyet temperatur omfatter dannelse av guanidin. I sur løsning dannes N-(formylamidino)-N’- β-D-2-deoksyribofuranosylurea og noen ikke identifiserte forbindelser. I sterkt sur løsning (ved pH < 2,2) dannes 5-aza-cytosin. Opprettholdelse av en relativt nøytral pH kan følgelig være fordelaktig for formuleringen som omfatter analogene og derivatene av decitabin.

I en variant er surgjøringsmidlet askorbinsyre i en konsentrasjon på 0,01-0,2 mg/ml løsemiddel, om ønskelig 0,04-0,1 mg/ml eller 0,03-0,07 mg/ml løsemiddel.

pH i den farmasøytiske formuleringen kan justeres til å ligge mellom pH 4 og pH 8, fortrinnsvis mellom pH 5 og pH 7 og mer foretrukket mellom pH 5,5 og pH 6,8.

Den farmasøytiske formuleringen er fortrinnsvis minst 80 %, 90 %, 95 % eller mer stabil ved lagring ved 25<o>C i 7, 14, 21, 28 eller flere dager. Den farmasøytiske formuleringen er også fortrinnsvis minst 80 %, 90 %, 95 % eller mer stabil ved lagring ved 40<o>C i 7, 14, 21, 28 eller flere dager.

I én utførelse fremstilles den farmasøytiske formulering ifølge foreliggende oppfinnelse ved å ta glyserol og løse den inovative forbindelsen i glyserolen. Dette kan for eksempel gjøres ved å tilsette den inovative forbindelsen til glyserolen eller ved å tilsette glyserolen til decitabin. Ved å blande disse sammen dannes den farmasøytiske formuleringen.

Om ønskelig omfatter fremgangsmåten videre ytterligere trinn for å forhøye hastigheten med hvilken den inovative forbindelsen solvateres av glyserolen. Eksempler på ytterligere trinn som kan utføres inkluderer omrysting, oppvarming, forlenget solveringsperiode og benyttelse av mikronisert inovative forbindelse, og kombinasjoner av disse.

I én variant benyttes omrysting. Eksempler på omrystning inkluderer mekanisk omrysting, ultralydbehandling, konvensjonell blanding, konvensjonell omrøring og kombinasjoner av disse. For eksempel kan formuleringene omrystes mekanisk ifølge produsentens fremgangsmåter i en Silverson homogenisator, fremstilt av Silverson Machines Inc., (East Longmeadow, MA).

I en annen variant kan varme administreres. Om ønskelig kan formuleringene oppvarmes i et vannbad. Temperaturen i de oppvarmede formuleringene kan fortrinnsvis være lavere enn 70<o>C, mer foretrukket mellom 25<o>C og 40<o>C. Som et eksempel kan formuleringene oppvarmes til 37<o>C.

I nok en variant solvateres den inovative forbindelsen i glyserol over en lengre periode.

I nok en variant kan en mikronisert form av den inovative forbindelsen også benyttes for å forbedre oppløsningskinetikken. Om ønskelig kan mikronisering utføres ved en maleprosess. Som et eksempel kan mikronisering utføres ved en maleprosess utført ved anvendelse av en Air Jet Mill, fremstilt av IncFluid Energy Aljet Inc. (Boise, IDTelford, PA).

Om ønskelig omfatter fremgangsmåten videre justering av pH i de farmasøytiske formuleringene ved alminnelig anvendte fremgangsmåter. I én variant justeres pH ved tilsetning av syre, slik som askorbinsyre, eller base, slik som natriumhydroksid. I en annen variant justeres og stabiliseres pH ved tilsetning av bufrede løsninger, slik som en løsning av (etylendinitrilo) tetraeddiksyre-dinatriumsalt (EDTA). Siden decitabin vites å være pH-sensitiv kan justering av pH i de farmasøytiske formuleringene til tilnærmet pH 7 forbedre stabiliteten av den terapeutiske komponenten.

Om ønskelig omfatter fremgangsmåten videre separasjon av ikke-oppløst inovative forbindelse fra de farmasøytiske formuleringene. Separasjonen kan utføres ved hvilken som helst egnet teknikk. En egnet separasjonsfremgangsmåte kan for eksempel inkludere én eller flere av filtrering, sedimentering og sentrifugering av de farmasøytiske formuleringene. Tilstopping grunnet ikke-oppløste partikler av den inovative forbindelsen kan være en hindring for administrering av de farmasøytiske formuleringene og en mulig fare for pasienten. Separasjon av ikke-oppløst inovative forbindelse fra de farmasøytiske forbindelsene kan forenkle administreringen og forbedre sikkerheten av det terapeutiske produkt.

Om ønskelig omfatter fremgangsmåten videre sterilisering av de farmasøytiske formuleringene. Sterilisering kan utføres ved hvilken som helst egnet teknikk. En egnet steriliseringsfremgangsmåte kan for eksempel inkludere én eller flere av sterilfiltrering, kjemisk sterilisering, bestråling, varme og tilsetning av et kjemisk desinfeksjonsmiddel til den farmasøytiske formuleringen.

Som bemerket er decitabin ustabil i vann, og det kan følgelig være ønskelig å redusere vanninnholdet i den glyserol som anvendes for formulering av den inovative forbindelsen. Før oppløsning- og/eller steriliseringstrinnet kan følgelig glyserolen tørkes. Slik tørking av glyserol eller løsningen av den inovative forbindelsen i glyserol kan oppnås ved tilsetning av et farmasøytisk aksepterbart tørkemiddel til glyserolen. Glyserolen eller de inovative formuleringene kan tørkes for eksempel ved filtrering gjennom et sjikt som omfatter et tørkemiddel.

Om ønskelig kan fremgangsmåten videre omfatte tilsetning av ett eller flere medlemmer av gruppen som består av tørkemidler, bufringsmidler, antioksidanter, stabilisatorer, antimikrobielle midler og farmasøytisk inaktive midler. I én variant kan antioksidanter som askorbinsyre, askorbatsalter og blandinger derav tilsettes. I en annen variant kan stabilisatorer som glykoler, tilsettes.

3. Beholdere eller sett som inneholder inovative forbindelser eller formuleringer De farmasøytiske formuleringene som beskrives i denne oppfinnelse kan foreligge i en sterilisert beholder, slik som en sprøyte, medisinflaske eller ampulle av forskjellig størrelse og rominnhold. Den steriliserte beholderen kan om ønskelig inneholde mellom 1 og 50 ml, 1-25 ml, 1-20 ml eller 1-10 ml av formuleringene. Steriliserte beholdere bevarer de farmasøytiske formuleringenes sterilitet, forenkler transport og lagring og muliggjør administrering av de farmasøytiske formuleringene uten et forutgående steriliseringstrinn.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et sett for administrering av den inovative forbindelsen til en vert med behov for dette. I én utførelse omfatter settet den inovative forbindelsen i fast form, fortrinnsvis pulverform, og et ikke-vandig fortynningsmiddel som omfatter glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol eller kombinasjoner av disse. Blanding av det faste decitabin og fortynningsmidlet fører fortrinnsvis til dannelsen av en farmasøytisk formulering ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan settet omfatte en første beholder som omfatter den inovative forbindelsen i fast form og en beholder som omfatter et fortynningsmiddel som omfatter glyserol, hvor tilsetning av fortynningsmidlet til den faste inovative forbindelsen fører til dannelsen av en farmasøytisk formulering for administrering av den inovative forbindelsen. Blanding av den inovative forbindelsen og fortynningsmidlet kan om ønskelig danne en farmasøytisk formulering som omfatter mellom 0,1 og 200 mg av den inovative forbindelsen pr. ml fortynningsmiddel, om ønskelig mellom 0,1 og 100, mellom 2 mg og 50 mg, mellom 5 mg og 30 mg eller mellom 10 mg og 25 mg pr. ml løsemiddel.

Ifølge den utførelsen er fortynningsmidlet en kombinasjon av propylenglykol og glyserol hvor konsentrasjonen av propylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1 og 90 %, mellom 10 og 60 % eller mellom 20 og 40 %.

Også ifølge den utførelsen er fortynningsmidlet en kombinasjon av polyetylenglykol og glyserol hvor konsentrasjonen av polyetylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99 %, om ønskelig mellom 1 og 90 %, mellom 10 og 60 % eller mellom 20 og 40 %.

Også ifølge denne utførelsen er fortynningsmidlet en kombinasjon av propylenglykol, polyetylenglykol og glyserol hvor konsentrasjonen av propylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1 og 90 %, mellom 10 og 60 % eller mellom 20 og 40 %, og konsentrasjonen av polyetylenglykol i løsemidlet er mellom 0,1 og 99,9 %, om ønskelig mellom 1 og 90 %, mellom 10 og 60 % eller mellom 20 og 40 %.

Fortynningsmidlet omfatter også om ønskelig 40 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2 % eller mindre vann. I én variant er fortynningsmidlet vannfritt og kan om ønskelig videre omfatte et tørkemiddel. Fortynningsmidlet kan også om ønskelig omfatte ett eller flere tørkemidler, én eller flere glykoler, én eller flere antioksidanter og/eller ett eller flere antimikrobielle midler.

Settet kan om ønskelig videre omfatte instruksjoner. Instruksjonene kan beskrive hvordan den faste inovative forbindelsen og fortynningsmidlet bør blandes for å danne en farmasøytisk formulering. Instruksjonene kan også beskrive hvordan man skal administrere den resulterende farmasøytiske formuleringen til en pasient. Det skal bemerkes at instruksjonene kan om ønskelig beskrive administreringsfremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fortynningsmidlet og den inovative forbindelsen kan foreligge i separate beholdere. Beholderne kan foreligge i forskjellige størrelser. Beholderen kan for eksempel omfatte mellom 1 og 50, 1 og 25, 1 og 20 eller 1 og 10 ml av fortynningsmidlet.

De farmasøytiske formuleringene som foreligger i beholdere eller sett kan foreligge i en form som er egnet for direkte administrering, eller i en konsentrert form som krever fortynning når det gjelder hva som administreres til pasienten. For eksempel kan farmasøytiske formuleringer som beskrives i den foreliggende oppfinnelse foreligge i en form som er egnet for direkte administrering ved infusjon.

Fremgangsmåtene og settene som beskrives her gir fleksibilitet, hvor stabiliteten og den terapeutiske effekten av de farmasøytiske formuleringene som omfatter den inovative forbindelsen kan ytterligere forbedres eller komplementeres.

4. Fremgangsmåter for administrering av inovative forbindelser/sammensetninger Forbindelsene/formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres via hvilken som helst vei, fortrinnsvis i form av en farmasøytisk sammensetning som er tilpasset en slik vei, som illustrert nedenfor, og avhenger av tilstanden som skal behandles.

Forbindelsene eller formuleringene kan for eksempel administreres oralt, parenteralt, topisk, intraperitonealt, intravenøst, intraarterielt, transdermalt, sublingualt, intramuskulært, rektalt, transbukalt, intranasalt, liposomalt, ved inhalering, vaginalt, intraokulært, ved lokal avlevering (for eksempel ved hjelp av et kateter eller stent), subkutant, intraadiposalt, intraartikulært eller intratekalt. Forbindelsene og/eller sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også administreres eller koadministreres i doseringsformer for langsom frigjøring.

Forbindelsene og/eller sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres eller koadministreres i hvilken som helst konvensjonell doseringsform.

Koadministrering i forbindelse med foreliggende oppfinnelse er definert til å bety administrering av mer enn ett terapeutisk middel i løpet av en koordinert behandling for å oppnå et forbedret klinisk utfall. Slik koadministrering kan også være koekspensiv, dvs. at den skjer i løpet av overlappende tidsrom.

Den inovative forbindelsen eller sammensetningen som inneholder den inovative forbindelsen kan administreres til en vert slik som en pasient, i en dose på 0,1-1000 mg/m<2>, om ønskelig 1-200 mg/m<2>, om ønskelig 1-50 mg/m<2>, om ønskelig 1-40 mg/m<2>, om ønskelig 1-30 mg/m<2>, om ønskelig 1-20 mg/m<2 >eller om ønskelig 5-30 mg/m<2>.

For eksempel kan forbindelsen/sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse leveres som et sterilt pulver for injeksjon sammen med bufrende salt slik som kaliumdihydrogen, og et pH-modifiserende middel slik som natriumhydroksid. Formuleringen lagres fortrinnsvis ved 28<o>C, noe som bør holde medikamentet stabilt i minst to år. Denne pulverformuleringen kan rekonstitueres med 10 ml sterilt injeksjonsvann. Denne løsningen kan videre fortynnes med infusjonsvæske som er kjent innen faget, slik som 0,9 % natriumklorid for injeksjon, 5 % dekstrose for injeksjon og Ringers injeksjonsløsning tilsatt laktat. Det foretrekkes at de rekonstituerte og fortynnede løsningene anvendes i løpet av 4-6 timer for avlevering av maksimal aktivitet.

I en foretrukket utførelse administreres den inovative forbindelsen/sammensetningen til en pasient ved injeksjon slik som subkutan injeksjon, intravenøs bolusinjeksjon, kontinuerlig intravenøs infusjon og intravenøs infusjon over et tidsrom på 1 time. Om ønskelig administreres den inovative forbindelsen/sammensetningen til en pasient ved hjelp av 1-24 timers intravenøs infusjon pr. dag over 3-5 dager pr. behandlingssyklus i en dose på 0,1-1000 mg/m<2 >pr. dag, om ønskelig i en dose på 1-100 mg/m<2 >pr. dag, om ønskelig i en dose på 2-50 mg/m<2 >pr. dag, om ønskelig i en dose på 10-30 mg/m<2 >pr. dag eller om ønskelig i en dose på 5-20 mg/m<2 >pr. dag.

For decitabin eller azacitidin anses doser under 50 mg/m<2 >som mye lavere enn hva som anvendes i konvensjonell kjemoterapi for kreft. Ved anvendelse av en slik lav dose av analogen/derivatet av decitabin eller azacitidin kan transkripsjonsaktiviteten av gener som er ”silenced” i kreftcellene ved unormal metylering aktiveres for utløsing av nedstrøms signaloverføring, noe som fører til stans av celleveksten, differensiering og apoptose, noe som til syvende og sist fører til at disse kreftcellene dør. Denne lave dosen bør imidlertid ha mindre systemisk cytotoksisk virkning på normale celler og følgelig ha færre bivirkninger i pasienten som behandles.

De farmasøytiske formuleringene kan koadministreres i hvilken som helst konvensjonell form sammen med ett eller flere medlemmer av gruppen som omfatter infusjonsvæsker, terapeutiske forbindelser, næringsvæsker, antimikrobielle væsker, bufringsmidler og stabiliseringsmidler.

Som beskrevet ovenfor kan de inovative forbindelsene formuleres i flytende form ved å løse den inovative forbindelsen i et ikke-vandig løsemiddel, slik som glyserol. De flytende farmasøytiske formuleringene har videre den fordel at de kan administreres direkte (f.eks. uten ytterligere fortynning), og således kan lagres i stabil form inntil de skal administreres. Siden glyserol lett kan blandes med vann kan videre formuleringene enkelt og lett fortynnes videre like før administreringen. For eksempel kan de farmasøytiske formuleringene fortynnes med vann 180, 60, 40, 30, 20, 10, 5, 2 eller 1 min. eller kortere tid før administrering til en pasient.

Pasientene kan motta de farmasøytiske formuleringene intravenøst. Den foretrukne administreringsvei er ved intravenøs infusjon. Om ønskelig kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse bli tilført direkte uten forutgående rekonstituering.

I én utførelse tilføres den farmasøytiske formuleringen gjennom et forbindelsesledd, slik som et Y-formet forbindelsesledd som har tre armer som hver er koblet til en slange. For eksempel kan Baxter<® >Y-forbindelsesledd av forskjellige størrelser anvendes. En beholder som inneholder den farmasøytiske formuleringen kobles til en slange, som videre er koblet til én arm av forbindelsesleddet. Infusjonsvæsker, slik som. 0,9 % natriumklorid, 5 % dekstrose, 5 % glukose eller Ringers løsning tilsatt laktat, tilføres gjennom en slange som er koblet til den andre armen av Y-forbindelsesleddet. Infusjonsvæskene og de farmasøytiske formuleringene blandes sammen i Y-forbindelsesleddet. Den resulterende blandingen tilføres til pasienten gjennom en slange som er koblet til Y-forbindelsesleddets tredje arm. Fordelen ved denne administreringsfremgangsmåten sammenlignet med teknikkens stand er at den inovative forbindelsen blandes med infusjonsvæsker like før den kommer inn i pasientens kropp, noe som reduserer tidsrommet hvor nedbrytning av den inovative forbindelsen kan skje grunnet kontakt med vann. Den inovative forbindelsen blandes for eksempel med vann mindre enn 10, 5, 2 eller 1 min. før den går inn i pasientens kropp.

Pasienter kan tilføres de farmasøytiske formuleringene i 1, 2, 3, 4, 5 eller flere timer som en følge av formuleringenes forbedrede stabilitet. Forlengede tilførselstid muliggjør fleksible tidsskjemaer for administrering av terapeutiske formuleringer.

Alternativt eller i tillegg kan infusjonens hastighet og volum reguleres ut fra pasientens behov. Reguleringen av infusjonen av de farmasøytiske formuleringene kan utføres ifølge foreliggende fremgangsmåter.

De farmasøytiske formuleringene kan kotilføres i hvilken som helst konvensjonell form sammen med ett eller flere medlemmer av gruppen som omfatter infusjonsvæsker, terapeutiske forbindelser, næringsvæsker, antimikrobielle væsker, bufringsmidler og stabiliseringsmidler. Om ønskelig kan terapeutiske bestanddeler, inkludert antineoplastiske midler, alkylerende midler, midler som er medlemmer av retinoidsuperfamilien, antibiotiske midler, hormonmidler, planteavledede midler, biologiske midler, interleukiner, interferoner, cytokiner, immunmodulerende midler og monoklonale antistoffer kotilføres med de inovative formuleringene.

Koinfusjon i forbindelse med foreliggende oppfinnelse er definert til å bety infusjon av mer enn ett terapeutisk middel i løpet av en koordinert behandling for å oppnå et forbedret klinisk utfall. Slik koinfusjon kan være samtidig, overlappende eller sekvensiell. I et spesielt eksempel kan koinfusjon av de farmasøytiske formuleringene og infusjonsvæsker utføres ved hjelp av et forbindelsesledd av Y-type.

Farmakokinetikken og metabolismen av intravenøst administrerte farmasøytiske formuleringer ligner farmakokinetikken og metabolismen av intravenøst administrert inovative forbindelser.

I mennesker viste decitabin en fordelingsfase med en halveringstid på 7 min. og en terminal halveringstid av størrelsesorden 10-35 min., målt ved bioanalyse. Fordelingsvolumet er tilnærmet 4,6 l/kg. Den korte halveringstiden i plasma skyldes hurtig inaktivering av decitabin ved deaminering ved cytidindeaminase i leveren. Clearance er høy hos mennesker, rundt 126 ml/min./kg. Det gjennomsnittelige areal under plasmakurven for i alt 5 pasienter var 408 µg/time/l, med en toppkonsentrasjon i plasma på 2,01 µm. I pasientene var decitabinkonsentrasjonen tilnærmet 0,4 µg/ml (2 µm) ved administrering i en dose på 100 mg/m<2 >som en 3 timers infusjon. Under en lengre infusjonstid (opptil 40 timer) var plasmakonsentrasjonen tilnærmet 0,1-0,4 µg/ml. Med infusjonstider på 40-60 timer og en infusjonshastighet på 1 mg/kg/time ble plasmakonsentrasjoner på 0,43-0,76 µg/ml oppnådd. Plasmakonsentrasjonen ved ”steady state” ved en infusjonshastighet på 1 mg/kg/time estimeres til 0,2-0,5 µg/ml. Halveringstiden etter avbrutt infusjon er 12-20 min. Plasmakonsentrasjonen av decitabin ved ”steady state” ble anslått til 0,31-0,39 µg/ml under en 6 timers infusjon av 100 mg/m<2>. Konsentrasjonsområdet under en infusjon av 600 mg/m<2 >var 0,41-16 µg/ml. Penetrasjonen av decitabin inn i cerebrospinalvæsken hos mennesker når 14-21 % av plasmakonsentrasjonen etter en 36 timers intravenøs infusjon. Utskillelsen av ikke-modifisert decitabin i urinen er lav og varierer fra mindre enn 0,01 % til 0,9 % av den totale dosen, og det er ingen sammenheng mellom utskilt mengde og dose eller medikamentnivå i plasma. En høy clearance-verdi og en total ekskresjon i urinen på mindre enn 1 % av den tilførte dosen tyder på at decitabin elimineres hurtig, hovedsakelig ved metabolske prosesser.

Grunnet den forbedrede stabilitet sammenlignet med decitabin kan de inovative forbindelsene/sammensetningene lagres i lengre tid, og man unngår problemer forbundet med klinisk anvendelse av decitabin. For eksempel kan de inovative forbindelsene leveres som et frysetørket pulver, om ønskelig med en eksipiens (f.eks. syklodekstrin), en syre (f.eks. askorbinsyre), en alkalisk forbindelse (natriumhydroksid) eller et buffersalt (monobasisk kaliumdihydrogenfosfat). Det frysetørkede pulveret kan rekonstitueres med sterilt vann for injeksjon, f.eks. intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært eller subkutant. Om ønskelig kan pulveret rekonstitueres med et vandig eller ikke-vandig løsemiddel som omfatter et løsemiddel som er blandbart med vann, slik som. glyserol, propylenglykol, etanol og PEG. Den resulterende løsningen kan administreres direkte til pasienten eller fortynnes videre med infusjonsvæske, slik som 0,9 % natriumklorid, 5 % dekstrose, 5 % glukose og Ringers infusjonsvæske tilsatt laktat.

De inovative forbindelsene /sammensetningene kan lagres ved romtemperatur eller i et kontrollert miljø, slik som i kjøleskap (2-8<o>C, 36-46<o>F). Grunnet den overlegne stabiliteten sammenlignet med decitabin kan de inovative forbindelsene/sammensetningene lagres ved romtemperatur, rekonstitueres med injeksjonsvæske og administreres til pasienten uten forutgående avkjøling av medikamentløsningen.

Grunnet den forbedrede kjemiske stabilitet bør de inovative forbindelsene/-sammensetningene videre ha en lenger halveringstid i plasma enn decitabin. De inovative forbindelsene/sammensetningene kan følgelig administreres til en pasient i en lavere dose og/eller mindre hyppig enn hva som gjelder for decitabin.

5. Kombinasjonsbehandling med inovative farmasøytiske sammensetninger Forbindelsene eller de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes sammen med inhibitorer av histondeacetylase (HDAC) for ytterligere å modulere transkripsjonen av gener, f.eks. for gjenetablering av transkripsjon av gener som er ”silenced” ved hypermetylering og acetylering av histoner, på en synergistisk måte.

HDAC spiller viktige roller når det gjelder transkripsjons-”silencing” av gener.

Graden av acetylering av histonene kontrolleres av de motsatt virkende aktivitetene til to typer av enzymer, histonacetyltransferaser (HAT) og histondeacetylaser (HDAC).

Substratene for disse enzymene omfatter ε-aminogrupper i lysinrester som er plassert i de aminoterminale halene til histonene H3, H4, H2A og H2B. Disse aminosyrerestene acetyleres av HAT og deacetyleres av HDAC. Når acetylgruppene fjernes fra lysin i histonet ved HDAC gjendannes en positiv ladning på lysinresen, noe som fører til kondensering av nukleosomstrukturen og ”silencing” av genene som foreligger i denne. For aktivering av gener som er ”silenced” ved deacetylering av histoner bør følgelig aktiviteten av HDAC inhiberes. Ved inhibering av HDAC acetyleres histonene, og det DNA som er tett pakket rundt en deacetylert histonkjerne relakseres. Åpningen av DNA-konformasjonen fører til ekspresjon av spesifikke gener.

I tillegg til deacetylering av histoner kan HDAC også regulere genekspresjon ved deacetylering av transkripsjonsfaktorer, slik som p53 (et tumorsupressorgen), GATA-1, TFIIE og TFIIF. Gu og Roeder (1997) Cell 90:595-606 (p53), og Boyes et al. (1998) Nature 396:594-598 (GATA-1). HDAC deltar også i regulering av cellesyklus, for eksempel ved transkripsjonsrepresjon som formidles av RB-tumorsupressorproteiner som rekrutterer HDAC. Brehm et al. (1998) Nature 391:597-601. Inhibering av HDAC bør følgelig aktivere ekspresjonen av tumorsupressorgener som p53 og RB og som et resultat fremme cellevekstarrest, differensiering og apoptose som induseres av disse genene.

Som beskrevet ovenfor er unormal transkripsjons-”silencing” av en rekke gener, slik som tumorsupressorgener, direkte forbundet med sykdomsutviklingen av kreft og andre sykdommer. Metylering av cytosinrester i DNA og fjerning av acetylgrupper fra histoner er de to hovedmekanismene for gen-”silencing”. Grunnet metylering og/eller histondeacetylase av kreftrelaterte gener undertrykkes ekspresjonen av disse genene eller blir fullstendig ”silenced”. Ekspresjon av disse genene er imidlertid nødvendig for induksjon av vekstarrest, differensiering og/eller apoptotisk celledød av tranformerte celler. Manglende aktivitet av disse genene i de transformerte cellene fører til ukontrollert proliferasjon av disse cellene, noe som til syvende og sist fører til kreft.

Ved å kombinere de inovative forbindelsene/sammensetningene med HDAC-inhibitorer kan gener som er nødvendige for induksjon av vekstarrest, differensiering og celledød av transformerte celler effektivt reaktiveres. De inovative forbindelsene/-sammensetningene inhiberer metylering av DNA for disse genene, særlig i det regulatoriske området, noe som fører til aktivering av transkripsjon av genet. Videre inhiberer HDAC-inhibitorer deacetylering av histonene i genets nukleosomkjerne, noe som fører til en netto økning av acetyleringen av histoner, noe som i sin tur aktiverer transkripsjon av genet. Ved å utnytte disse to komplementære mekanismene kan kombinasjonsbehandlingen mer effektivt reetablere gentranskripsjonen, og ideelt på en synergistisk måte. En kombinasjonsbehandling med synergistiske virkninger bør kreve en mindre mengde av hver inhibitor enn når disse anvendes alene, noe som reduserer de mulige bivirkningene som er forbundet med systemisk administrering av høye doser av inhibitorene og forbedrer den terapeutiske indeks.

Mange antikreftmidler utøver sin antikreftvirkning ved å utløse signaloverføringskaskader som omfatter proteiner som kodes av disse tumorsupressorgenene. Ved utilstrekkelig ekspresjon av disse genene i kreftceller kan anti-kreftvirkningene av disse antineoplastiske midlene i alvorlig grad reduseres eller fullstendig fjernes. Ved reaktivering eller reekspresjon av disse genene som er epigenetisk ”silenced” ved DNA-metylering og histondeacetylase mobiliseres kroppens iboende forsvarsmekanismer for bekjempelse av sykdommen ved tilbakeføring av de tumorsuprimerende funksjonene til kreftceller som respons på signaler som sendes av det tilførte antikreftmiddel. Slik stimulering av kroppens iboende tumorsuprimerende funksjoner bør føre til et behov for lavere doser av antikreftmidlet, noe som fører til en høyere terapeutisk indeks (dvs. høyere effektivitet og lavere toksisitet) for midlet.

Inhibitorer av HDAC inkluderer følgende strukturklasser: 1) hydroksaminsyrer, 2) sykliske peptider, 3) benzamider og 4) kortkjedede fettsyrer.

Eksempler på hydroksaminsyrer og hydroksaminsyrederivater inkluderer trikostatin A (TSA), suberoylanilidhydroksaminsyre (SAHA), oksamflatin, suberin-bishydroksaminsyre (SBHA), m-karboksykanelsyre-bishydroksaminsyre (CBHA) og pyroksamid. TSA ble isolert som et antifungalt antibiotikum (Tsuji et al. (1976) J. Antibiot (Tokyo) 29:1-6) og ble vist å være en kraftig inhibitor av HDAC i pattedyr (Yoshida et al. (1990) J. Biol. Chem.

265:17174-17179). Det funn at TSA-resistente cellelinjer har en endret HDAC viser at dette enzymet er et viktig mål for TSA. Andre hydroksaminsyrebaserte HDAC-inhibitorer, SAHA, SBHA og CBHA, er syntetiske forbindelser som kan inhibere HDAC i mikromolar konsentrasjon eller lavere in vitro eller in vivo. Glick et al. (1999) Cancer Res. 59:4392-4399. Disse hydroksaminsyrebaserte HDAC-inhibitorene har alle en essensiell strukturell egenskap: en polar hydroksaminende koblet via en hydrofob metylenkjede (f.eks. med lengde 6 karbonatomer) til et annet polart sete, som er koblet til en hydrofob endegruppe (f.eks. en benzenring). Utviklede forbindelser med slike essensielle egenskaper omfattes også av hydroksaminsyrene som kan anvendes som HDAC-inhibitorer.

Sykliske peptider som anvendes som HDAC-inhibitorer er hovedsakelig sykliske tetrapeptider. Eksempler på sykliske peptider inkluderer trapoksin A, apicidin og FR901228. Trapoksin A er et syklisk tetrapeptid som inneholder en 2-amino-8-okso-9,10-epoksydekanoyl (AOE)-gruppe. Kijima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22429-22435. Apicidin er en soppmetabolitt som viser kraftig, bredspektret antiprotozoaktiviet og inhiberer HDAC-aktivitet i nanomolare konsentrasjoner. Darkin-Rattray et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13143-13147. FR901228 er et depsipeptid some r isolert fra Chromobacterium violaceum, og som har blitt vist å inhibere HDAC-aktivitet i mikromolare konsentrasjoner.

Eksempler på benzamider inkluderer MS-27-275. Saito et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:4592-4597. Eksempler på kortkjedede fettsyrer inkluderer butyrater (f.eks. smørsyre, argininbutyrat og fenylbutyrat (PB)). Newmark et al. (1994) Cancer lett.

78:1-5, og Carducci et al. (1997) Anticancer Res. 17:3972-3973. I tillegg faller depudecin, som har blitt vist å inhibere HDAC i mikromolare konsentrasjoner (Kwon et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:3356-3361), også innenfor begrepet histondeacetylaceinhibitor ifølge foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsene eller de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i forbindelse med andre terapeutiske bestanddeler, inkludert antineoplastiske midler, alkylerende midler, midler som er medlemmer av retinoid-superfamilien, antibiotiske midler, hormonmidler, planteavledede midler, biologiske midler, interleukiner, interferoner, cytokiner, immunmodulerende midler og monoklonale antistoffer.

I én utførelse anvendes et alkylerende middel i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen. Eksempler på alkylerende midler inkluderer biskloretylaminer (nitrogenmustarder, f.eks. klorambucil, syklofosfamid, ifosfamid, mekloretamin, melfalan, uracilmustard), aziridiner (f.eks. tiotepa), alkylalkonsulfonater (f.eks. busulfan), nitrozoureaer (f.eks. karmustin, lomustin, streptozosin), ikke-klassiske alkyleringsmidler (altretamin, dakarbazin og prokarbazin) og platinaforbindelser (karboplastin og cisplatin).

I en annen utførelse anvendes cisplatin, karboplatin eller syklofosfamid i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen.

I en annen utførelse anvendes et medlem av retinoidsuperfamilien i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen. Retinoider er en familie av strukturelt og funksjonelt beslektede molekyler som er avledet av eller beslektet med vitamin A (all-trans-retinol). Eksempler på retinoider inkluderer all-trans-retinol, all-transretinsyre (tretinoin), 13-cis-retinsyre (isotretinoin) og 9-cis-retinsyre.

I ytterligere en utførelse anvendes et hormonmiddel i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen. Eksempler på slike hormonmidler er syntetiske østrogener (f.eks. dietylstibøstrol), antiøstrogener (f.eks. tamoksifen, toremifen, fluoksymestrol og raloksyfen), antiandrogene midler (bikalutamid, nilutamid, flutamid), aromataseinhibitorer (f.eks. aminoglutetimid, anastrozol og tetrazol), ketokonazol, goserelinacetat, leuprolid, megestrolacetat og mifepriston.

I ytterligere en utførelse anvendes et planteavledet middel i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen. Eksempler på planteavledede midler inkluderer vinkaalkaloider (f.eks. vinkristin, vinblastin, vindecin, vinsolidin og vinorelbin), kamptotecin (20(S)-kamptotecin, 9-nitro-20(S)-kamptotecin og 9-amino-20(S)-kamptotecin), podofyllotoksiner (f.eks. etoposid (VP-16) og teniposid (VM-26)), og taksaner (f.eks. paklitaksel og docetaksel).

I nok en utførelse anvendes et biologisk middel i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen, slik som immunmodulerende proteiner som cytokiner, monoklonale antistoffer mot tumorantigener, tumorsupressorgener og kreftvaksiner.

Eksempler på interleukiner som kan anvendes i kombinasjon med og/eller tilsettes til den inovative forbindelsen/formuleringen inkluderer interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4) og interleukin 12 (IL-12). Eksempler på interferoner som kan anvendes i forbindelse med decitabin-glyserolformuleringer inkluderer interferon- α, interferon- β (fibroblastinterferon) og interferon- γ (fibroblastinterferon). Eksempler på slike cytokiner inkluderer erytropoietin (epoietin), granulocytt-CSF (filgrastim) og granulocytt-makrofag-CSF (sagramostim).

Immunmodulerende midler bortsett fra cytokiner inkluderer bacillus Calmette-Guerin, levamisol og oktreotid.

Eksempler på monoklonale antistoffer mot tumorantigener som kan anvendes i forbindelse med de inovative formuleringene inkluderer HERCEPTIN<® >(trastuzumab), RITUXAN<® >(rituximab), MYLOTARG<® >(anti-CD33) og CAMPATH<® >(anti-CD52).

6. Indikasjoner for forbindelser eller farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse

De farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling av et bredt utvalg av sykdommer som er følsomme for behandling med decitabin.

Foretrukne indikasjoner som kan behandles ved anvendelse av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer indikasjoner som inkluderer uønsket eller ukontrollert celleproliferasjon. Slike indikasjoner inkluderer godartede tumorer, forskjellige typer av kreft, slik som primærtumorer og tumormetastase, restenose (f.eks. kransarterielesjoner, halsarterielesjoner og cerebrale lesjoner), hematologiske forstyrrelser, unormal stimulering av endotelceller (aterosklerose), skader på kroppsvev grunnet kirurgisk behandling, unormal sårheling, unormal angiogenese, sykdommer som gir fibrose av vev, forstyrrelser med gjentatte bevegelser, forstyrrelser i vev som ikke er kraftig vaskulariserte og proliferative responser forbundet med organtransplantasjoner.

Vanligvis bevarer celler i en godartet tumor sine differensierte egenskaper og deler seg ikke på en fullstendig ukontrollert måte. En godartet tumor er vanligvis lokalisert og ikke-metastatisk. Spesifikke typer av godartede tumorer som kan behandles ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer hemangiomer, hepatocellulært adenom, kabernøst hemangiom, fokal nodulær hyperplasi, akustikusnevrinomer, nevrofibrom, gallegangadenom, gallegangcystanom, fibrom, lipomer, leiomyomer, mesoteliomer, keratomer, myksomer, nodulær regenerativ hyperplasi, trakomer og pyogene granulomer.

I en ondartet tumor blir cellene ikke-differensierte, de responderer ikke på kroppens vekstkontrollsignaler og deler seg på en ukontrollert måte. Den ondartede tumoren er invassiv og kan spre seg til fjerntliggende seter (metastase). Ondartede tumorer deles vanligvis i to grupper: primære og sekundære. Primærtumorer oppstår direkte fra det vev som de finnes i. En sekundær tumor eller metastase er en tumor som har sitt opphav et annet sted i kroppen, men som nå har spredt seg til et fjerntliggende organ. De vanligste metastaseveiene er direkte innvekst i nabostrukturer, spredning via karsystemet eller lymfesystemet og vandring langs vevsplan og i kroppsrom (peritonealvæske, serebrospinalvæske, osv.).

Spesifikke typer av kreft eller ondartede tumorer, både primære og sekundære, som kan behandles ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter brystkreft, hudkreft, beinkreft, prostatakreft, leverkreft, lungekreft, hjernekreft, strupekreft, galleblærekreft, bukspyttkjertelkreft, rektumkreft, paratyroidkreft, skjoldkjertelkreft, binyrekreft, kreft i nervevev, kreft i hode og hals, kolonkreft, magekreft, kreft i bronkiene, nyrekreft, basalcellekarsinom, plateepitelcellekarsinom av både ulserøs og papillær type, metastatisk hudkarsinom, osteosarkom, Ewings sarkom, retikulosarkom, myelom, kjempecelletumor, småcellet lungetumor, gallestein, øycelletumor, primær hjernetumor, akutte og kroniske lymfocytt- og granulocyttumorer, hårcelletumor, adenom, hyperplasi, medulært karsinom, feokromocytom, mukosale nevromer, intestinale ganglionevromer, hyperplastisk korneanervetumor, marfanoid habitustumor, Wilms tumor, seminom, ovarietumor, leiomyomatertumor, cerviksdysplasi og karsinom in situ, nevroblastom, retinoblastom, sarkom i mykt vev, ondartet karsinoid, topisk hudlesjon, mycosuis fungoide, rabdomyosarkom, Kaposis sarkom, osteogent sarkom og andre sarkomer, ondartet hyperkalsemi, nyrecelletumor, polycytemia vera, adenokarsinom, glioblastoma multiforma, leukemier, lymfomer, ondartede melanomer, epidermoide karsinomer og andre karsinomer og sarkomer.

Hematologiske forstyrrelser inkluderer unormal vekst av blodkar som kan føre til dysplastiske endringer i blodceller og hematologiske ondartede tilstander, f.eks. forskjellige leukemier. Eksempler på hematologiske forstyrrelser inkluderer akutt myeloid leukemi, akutt promyelocyttleukemi, akutt lymfoblastleukemi, kronisk myelogen leukemi, dimyelodysplastiske syndromene og sigdcelleanemi.

Akutt myeloid leukemi (AML) er den vanligste form for akutt leukemi som opptrer hos voksne. Forskjellige arvelige genetiske forstyrrelser og immunsvikttilstander er forbundet med forhøyet risiko for AML. Disse inkluderer forstyrrelser med defekter i DNA-stabilitet, noe som fører til tilfeldige kromosombrudd, f.eks. Blooms syndrom, Fanconis anemi, Li-Freumeni-syndromet, ataxia-telangiectasia og X-bundet agammaglobulinemi.

Akutt promyelocyttleukemi (APML) utgjør en distinkt undergruppe av AML. Denne undergruppen særpreges ved promyelocyttblaster som inneholder 15; 17-kromosomtranslokasjonen. Denne translokasjonen fører til dannelse av et fusjonstranskript som består av retinsyrereseptoren og en sekvens PML.

Akutt lymfoblastleukemi (ALL) er en heterogen sykdom hvor de forskjellige undertypene viser distinkte kliniske egenskaper. Tilbakevendende cytogenetiske unormaliteter har blitt påvist i ALL. Den vanligste cytogenetiske unormalitet er 9:22-translokasjonen. Det resulterande Philadelphia-kromosom betyr dårlig prognose for pasienten.

Kronisk myelogen leukemi (CML) er en klonal, myeloproliferativ forstyrrelse i en pluripotent stamcelle. CML særpreges ved en spesifikk kromosomal unormalitet som omfatter translokasjon mellom kromosom 9 og 22, noe som fører til dannelse av Philadelphia-kromosomet. Ioniserende stråling er forbundet med utvikling av CML.

De myelodysplastiske syndromene (MDS) er heterogene, klonale forstyrrelser i det hematopoietiske stamcellene som grupperes sammen grunnet forekomsten av dysplastiske endringer i én eller flere av de hematopoietiske cellelinjene, inkludert dysplastiske endringer i den myeloide serie, den erytroide serie og megakaryocyttserien. Disse endringene fører til cytopenier i én eller flere av de tre cellelinjene. Pasienter som lider av MDS utvikler typisk komplikasjoner forbundet med anemi, nøytropeni (infeksjoner) eller trombocyttopeni (blødning). Generelt utvikler fra tilnærmet 10 % til tilnærmet 70 % av pasienter med MDS akutt leukemi.

Behandling av unormal celleproliferasjon grunnet skader på kroppsvev under kirurgisk behandling kan være mulig for en rekke forskjellige kirurgiske behandlingsformer, inkludert kirurgisk behandling av ledd og tarm og teloid arrdannelse. Sykdommer som danner fibrotisk vev omfatter emfysem. Forstyrrelser med gjentatte bevegelser som kan behandles med anvendelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter karpaltunnelsyndromet. Et eksempel på celleproliferative forstyrrelser som kan behandles ved anvendelse av oppfinnelsen er en beintumor.

De proliferative responsene som er forbundet med organtransplantasjon som kan behandles ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse omfatter de proliferative responsene som bidrar til mulig organavvisning eller medfølgende komplikasjoner. Nærmere bestemt kan disse proliferative responsene opptre under transplantasjon av hjerte, lunge, lever, nyre og andre kroppsorganer eller organsystemer.

Unormal angiogenese som kan behandles ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse omfatter unormal angiogenese forbundet med reumatoid artritt, ischemireperfusjonsrelatert hjerneødem og hjerneskade, kortikal ischemi, ovariehyperplasi og -hypervaskularitet (polycystisk ovariesyndrom), endometriose, psoriasis, diabetisk retinopati og andre okulære, angiogene sykdommer, f.eks. retinopati hos for tidlig fødte (retrolental fibroplasi), muskeldegenerasjon, hornhinnetransplantatavvisning, nevroskulært glaukom og Oster Webbers syndrom.

Sykdommer forbundet med unormal angiogenese krever eller induserer karvekst. For eksempel omfatter angiogenese i hornhinnen tre faser: en prevaskulær latenstid, aktiv neovaskularisering og karmodning og –regresjon. Identiteten til og mekanismen for forskjellige angiogene faktorer, inkludert elementer i betennelsesresponsen som leukocytter, blodplater, cytokiner og eikosanoider, eller ikke-identifiserte plasmabestanddeler har fortsatt ikke blitt funnet.

I en annen utførelse kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for behandling av sykdommer forbundet med uønsket eller unormal angiogenese. Fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient som lider av uønsket eller unormal angiogenese av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse, alene eller i kombinasjon med et antineoplastisk middel hvis aktivitet som et antineoplastisk middel in vivo på uheldig måte påvirkes av et høyt DNA-metyleringsnivå. Den spesielle dosen av disse midlene som er nødvendig for inhibering av angiogenese og/eller angiogene sykdommer kan avhenge av tilstandens omfang, administreringsveien og beslektede faktorer som kan vurderes av den behandlende lege. Vanligvis er aksepterte og effektive daglige doser den mengde som effektivt inhiberer angiogenese og/eller angiogene sykdommer.

Ifølge denne utførelsen kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for behandling av en rekke forskjellige sykdommer som er forbundet med uønsket angiogenese, slik som neovaskularisering i retina/årehinnen og neovaskularisering i hornhinnen. Eksempler på neovaskularisering i retina/årehinnen inkluderer Bests sykdommer, nærsynthet, groper i synsnerven, Stargarts sykdommer, Pagets sykdom, veneoklusjon, arterieoklusjon, sigdcelleanemi, sarkoid, syfilis, pseudoxantoma elasticum, sykdommer med obstruksjon av halspulsåren, kronisk uveitt/vitritt, myobakterieinfeksjoner, Lymes sykdom, systemisk lupus erytematosus, retinopati hos for tidlig fødte, Eales sykdom, diabetisk retinopati, makuladegenerasjon, Bechets sykdommer, infeksjoner som fører til retinitt eller kroiditt, antatt okulær histoplasmose, Parrs planitis, kronisk retinaløsning, hyperviskositetssyndormer, toksoplasmose, traume og komplikasjoner etter laserbehandling, sykdommer forbundet med rubeosis (neovaskularisering i øyevinkelen) og sykdommer som skyldes unormal proliferasjon av fibrovskulært eller fibrøst vev, inkludert alle former for proliferativ vitreoretinopati. Eksempler på neovaskularisering i hornhinnen inkluderer epidemisk keratokonjunktivitt, vitamin A-mangel, overbruk av kontaktlinser, atopisk keratitt, superior limbisk keratitt, pterygium keratitis sicca, Sjøgrens syndorm, akne roseasea, fyllektenulose, diabetisk retinopati, retinopati for for tidlig fødte, hornhinnetransplantatavvisning, Morens ulkus, Tariens marginale degenerasjon, marginal keratolyse, polyartritt, Wegeners sarkoidose, skleritt, perifigoid radial keratotomi, neovaskulært glaukom og retrolental fibroplasi, syfilis, mykobakterieinfeksjoner, lipiddegenerasjon, kjemiske brannsår, bakterielle ulcere, soppulcere, herpes simplex-infeksjoner, herpes-soster-infeksjoner, protozoinfeksjoner og Kaposis sarkom.

I ytterligere en utførelse kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for behandling av kroniske betennelsessykdommer forbundet med unormal angiogenese. Fremgangsmåten omfatter administrering til en pasient som lider av en kronisk betennelsessykdom forbundet med unormal angiogenese av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse, alene eller i kombinasjon med et antineoplastisk middel hvis aktivitet som antineoplastisk middel in vivo påvirkes på uheldig måte av et høyt DNA-metyleringsnivå. Den kroniske betennelsen er avhengig av kontinuerlig dannelse av kapillære forgreninger for opprettholdelse av en innstrømming av inflammatoriske celler. Innstrømming og nærvær av de inflammatoriske cellene fører til dannelse av granulomer, noe som bevarer den kroniske betennelsestilstanden. Inhibering av angiogenese ved anvendelse av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan forhindre dannelsen av granulomer og derved lindre sykdommen. Eksempler på kroniske betennelsessykdommer inkluderer inflammatoriske tarmsykdommer som Crohns sykdom og ulserøs kolitt, psoriasis, sarkoidose og reumatoid artritt.

Inflammatoriske tarmsykdommer som Crohns sykdom og ulserøs kolitt særpreges ved kronisk betennelse og angiogenese i forskjellige deler av mage-tarmkanalen. F.eks. opptrer Crohns sykdom som en kronisk transmural betennelsessykdom som vanligvis rammer den distale ileum og kolon, men som også kan opptre i hvilken som helst del av mage-tarmkanalen fra munn til anus og det perianale området. Pasienter med Crohns sykdom har generelt kronisk diaré forbundet med buksmerter, feber, anoreksi, vekttap og oppsvelling av buken. Ulserøs kolitt er også en kronisk uspesifikk, ulserøs betennelsessykdom som oppstår i slimhinnene i kolon og som særpreges ved nærvær av blodig diaré. Disse inflammatoriske tarmsykdommene skyldes generelt kronisk, granulomatøs betennelse gjennom hele mage-tarmkanalen og omfatter utsending av nye kapillærer som omgis av en sylinder av inflammatoriske celler. Inhibering av angiogenese ved de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse bør inhibere dannelsen av utskuddene og forhindre dannelsen av granulomer. De inflammatoriske tarmsykdommene manifesterer seg også utenfor tarmen, f.eks. ved hudlesjoner. Slike lesjoner særpreges ved betennelse og angiogenese og kan opptre i mange seter bortsett fra mage-tarmkanalen. Inhibering av angiogenese med de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse bør redusere innstrømmingen av inflammatoriske celler og forhindre dannelsen av lesjonen.

Sarkoidose, en annen kronisk betennelsessykdom, viser seg som en granulomatøs forstyrrelse i flere systemer. Granulomene i denne sykdommen kan dannes hvor som helst i kroppen, og symptomene avhenger følgelig av granulomenes plassering og hvorvidt sykdommen er aktiv. Granulomene dannes av de angiogene kapillærutsendelsene, som gir en konstant administrering av inflammatoriske celler. Ved anvendelse av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse for inhibering av angiogenese kan slik dannelse av granulomer inhiberes. Psoriasis, som også er en kronisk og tilbakevendende betennelsessykdom, særpreges ved papuler og plakk av forskjellig størrelse. Behandling ved anvendelse av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse bør forhindre den dannelse av nye blodkar som er nødvendig for å opprettholde de karakteristiske lesjonene og gi pasienten lindring fra symptomene.

Reumatoid artritt (RA) er også en kronisk betennelsessykdom som særpreges ved uspesifikk betennelse i de perifere ledd. Det antas at blodkarene i leddenes synovialhinne gjennomgår angiogenese. I tillegg til at det dannes nye vaskulære nettverk frigjør endotelcellene faktorer og reaktive oksygenmolekyler som fører til pannusvekst og ødeleggelse av brusk. Faktorene som deltar i angiogenesen kan aktivt bidra til å opprettholde den kroniske betennelsestilstand forbundet med reumatoid artritt. Behandling ved anvendelse av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller i forbindelse med andre anti-RA-midler, kan forhindre dannelse av nye blodkar som er nødvendig for å opprettholde den kroniske betennelsen og gi RA-pasienten lindring fra symptomene.

I ytterligere en utførelse kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for behandling av sykdommer forbundet med unormal hemoglobinsyntese. Fremgangsmåten omfatter administrering av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse til en pasient som lider av en sykdom forbundet med unormal hemoglobinsyntese. Decitabinholdige formuleringer stimulerer syntesen av føtalt hemoglobin, siden mekanismen for inkorporering i DNA er forbundet med DNA-hypometylering. Eksempler på sykdommer forbundet med unormal hemoglobinsyntese inkluderer sigdcelleanemi og β-talassemi.

I nok en utførelse kan de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for kontroll intracellulær genekspresjon. Fremgangsmåten omfatter administrering av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse til en pasient som lider av en sykdom som er forbundet med unormalt nivå av genekspresjon. DNA-metylering er forbundet med kontroll av genekspresjon. Nærmere bestemt inhiberer metylering i eller nær promotere transkripsjon, mens demetylering gir gjenvunent ekspresjon. Eksempler på mulige anvendelser av de her beskrevne mekanismer inkluderer terapeutisk modulert vekstinhibering, induksjon av apoptose og celledifferensiering.

Genaktivering fremmet av de farmasøytiske formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan indusere differensiering av celler for terapeutiske formål. Celledifferensiering induseres via hypometyleringsmekanismen. Eksempler på morfologisk og funksjonell differensiering inkluderer differensiering mot dannelse av muskelceller, myotubuli og celler fra den erytroide og lymfoide linje.

EKSEMPLER

1. Syntese av fosforamidittbyggesteiner og 3’-O-blokkerte derivater

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også effektive kjemiske fremgangsmåter for syntese av følgende nye fosforamidittbyggesteiner (figur 2A).

4-aminogruppen i 1a kan beskyttes ved innføring av forskjellige beskyttelsesgrupper (R1), slik som karbamater med metyl, etyl, 9-fluorenylmetyl, 9-(2-sulfo)fluorenylmetyl, 9-(2,7-dibrom)fluorenylmetyl, 17-tetrabenzo[a,c,g,i]fluorenylmetyl, 2-klor-3-indenylmetyl, benz[f]inden-3-ylmetyl, 2,7-di-tert-[9-(10,10-diokso-10,10,10,10-tetrahyrotioksantyl)metyl, 1,1-dioksobenzo[b]tiofen-2-ylmetyl, 2,2,2,2-trikloretyl, 2-trimetylsilyletyl, 2-fenyletyl, 1-(1-adamantyl)-1-metyletyl, 2-kloretyl, 1,1-dimetyl-2-haloetyl, 1,1-dimetyl-2,2-dibrometyl, 1,1-dimetyl-2,2,2-trikloretyl, 1-metyl-1-(4-bifenylyl)etyl, (1-(3,5-di-tert-butylfenyl)-1-metyletyl, 2-(2’- og 4’-pyridyl)etyl, 2,2-bis(4’-nitrofenyl)etyl, N-(2-pivaloylamino)-1,1-dimetyletyl, 2-[(2-nitrofenyl)ditio]-1-fenyletyl, 2-(N,N-disykloheksylkarboksamido)etyl, t-butyl, 1-adamantyl, 2-adamantyl, vinyl, allyl, 1-isopropylallyl, cinnayl, 4-nitrocinnamyl, 3-(3’-pyridyl)prop-2-enyl, 8-kinolyl, N-hydroksypiperidinyl, alkylditio, benzyl,

p-metoksybenzyl, p-nitrobenzyl, p-brombenzyl, p-klorbenzyl, 2,4-diklorbenzyl,

4-metylsulfinylbenzyl, 9-antrylmetyl, difenylmetyl, 2-metyltioetyl, 2-metylsulfonyletyl, 2-(p-toluensulfonyl)etyl, [2-(1,3-ditianyl)]metyl, 4-metyltifenyl, 2,4-dimetyltifenyl,

2-fosfonioetyl, 1-metyl-1-(trifenylfosfoniuo)etyl, 1,1-dimetyl-2-cyanoetyl, 2-dansyletyl, 4-fenylacetoksybenzyl, 4-azieobenzyl, 4-azidometoksybenzyl, m-klor-p-acyloksybenzyl, p-(dihydroksyboryl)benzyl, 5-benzisosazolylmetyl, 2-(trifluoretyl)-6-kromonylmetyl, m-nitrofenyl, 3,5-dimetoksybenzyl, 1-metyl-1-(3,5-dimetoksyfenyl)etyl, α-metylnitropiperonyl, o-nirofenyl, 3,4-dimetoksy-6-nitrobenzyl, fenyl(o-nitrofenyl)etyl,

2-(2-nitrofenyl)etyl, 6-nitroveratryl, 4-metoksyfenacyl, 3’,5’-dimetoksybenzoin, t-amyl, S-benzyltio, butynyl, p-cyanobenzyl, sykloheksyl, syklopentyl, syklopropylmetyl,

p-desykloksybenzyl, diisopropylmetyl, 2,2-dimetoksykarbonylvinyl, o-(N,N-dimetylkarboksamido)benzyl, 1,1-dimetyl-3-(N,N-dimetylkarboksamido)propyl, 1,1-dimetylpropynyl, 2-furanylmetyl, 2-jodetyl, isobornyl, isobutyl, isonikotinyl, p-(p’-metoksyfenylazo)benzyl, 1-metylsyklobutyl, 1-metylsykloheksyl, 1-metyl-1-syklopropylmetyl, 1-metyl-1-(p-fenylazofenyl)etyl, 1-metyl-1-fenyletyl, 1-metyl-1-(4’-pyridyl)etyl, fenyl, p-(fenylazo)benzyl, 2,4,6-tri-t-butylfenyl, 4-(trimetylammonium)benzyl, 2,4,6-trimetylbenzyl, ureaer med fenotiazinyl-(10)-karbonyl, N’-ptoluensulfinylaminokarbonyl, N’-fenylaminotiokarbonyl, amider, f.eks. formamid, acetamid, fenoksyacetamid, trikloracetamid, trifluoracetamid, fenyacetamid, 3-fenylpropamid, pent-4-amid, o-nitrofenylacetamid, o-nitrofenoksyacetamid, 3-(o-nitrofenyl)propanamid, 2-metyl-2-(o-nitrofenoksy)propanamid, 3-metyl-3-nitrobutanamid, o-nitrocinnamid, 3-(4-t-butyl-2,6-dinitrofenyl)-2,2-dimetylpropanamid, o-(benzoyloksymetyl)benzamid, 2-[(t-butyldifenylsiloksy)metyl)metyl]benzamid, 3-(3’,6’-diokso-2’,4’,5’-trimetylsykloheksa-1’,4’-dien)-3,3-dimetylpropionamid, o-hydroksy-trans-cinnamid, acetoacetamid, p-toluensulfonamid og benzesulfonamid. 4-O-metoksy (1b)- og 4-S-metyltio (1c)-analogene av decitabin kan erholdes ved å modifisere den publiserte fremgangsmåten for syntese av decitabin ved å separere α- og β-anomeren av 1-(2-deoksy-3,5-di-o-p-klorbenzoyl- eller benzoyl-D-ribofuranosyl)-4-metoksy- eller metyltio-1,3,5-triazin-2(H)-on og fjerne 3,5beskyttelsesgruppene uten behandling med ammoniakk i metanol. Priml og Sorm (1964) Collect. Czech. Chem. Commun. 29:2576-2577, Piskala og Sorm (1978) Nucleic Acid Chemistry (av Townsend og Tipson, Wiley, 1978) s. 443-449.

Beskyttelse av 5’-OH oppnås ved å løse 4-aminobeskyttet decitabin og 4-metoksyog 4-metyltioanalogene (1b, 1c) i vannfritt pyridin (5 ml/mmol) før tilsetning av dimetoksytritylklorid (1,1 ekvivalenter).

For eksempel ble decitabin (1,2 g) destillert to ganger sammen med vannfritt pyridin og løst i 20 ml vannfri DMF. Heksametyldisilasan (2,8 ml) ble tilsatt. Løsningen ble omrørt og inkubert over natten. Løsemidlet ble avdampet under vakuum og det gjenværende restmateriale ble løst i toluen og inndampet to ganger. 3’,5’-di-trimetylsilyl-5-aza-2’-deoksycytidin (Rf = 0,67, 4:1 diklormetan/metanol) ble destillert to ganger sammen med vannfritt pyridin (� 10 ml) og oppløst i vannfritt pyridin (20 ml). Fenoksyeddiksyreanhydrid (1,5 g) ble tilsatt, og den resulterende løsningen ble omrørt i 1 time. Ytterligere 0,18 g fenoksyeddiksyreanhydrid (0,18 g) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i ytterligere 1 time. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet under vakuum og destillert tre ganger sammen med toluen. Restmaterialet ble løst i diklormetan (� 50 ml) og ekstrahert med 1 M vandig NaHCO3-løsning (� 50 ml), som ble reekstrahert med diklormetan (� 20 ml). De sammenslåtte organiske faser ble tørket over natriumsulfat og redusert under vakuum for erholdelse av urent 3’,5’-di-trimetylsilyl-N-fenoksyacetyl-5-aza-2’-deoksycytidin (3 g, Rf = 0,82, 9:1 diklormetan/metanol). Råmaterialet ble løst i vannfri DMF (20 ml) og overført til et 50 ml Falcon-rør av plast, og TAS-F (2,4 g) ble tilsatt (under gassutvikling). Reaksjonen fikk forløpe i 4 timer ved 22<o>C (røret var ikke fullstendig lukket, slik at trykkdannelse ble forhindret). DMF ble avdampet under vakuum, og restmaterialet ble behandlet ved kolonnekromatografi (30 g kiselgel, 2,5 cm kolonne, 99:1 til 9:1 diklormetan/metanol). Et hvitt fast N-fenoksyacetyl-5-aza-2’-deoksycytidin (0,81 g, Rf = 0,26, 9:1 diklormetan/metanol) ble erholdt. Denne forbindelsen (0,6 g) ble destillert to ganger sammen med vannfritt pyridin og oppløst i vannfritt pyridin (20 ml) før tilsetning av dimetoksytritylklorid (0,9 g) og omrøring i 2 timer ved 22<o>C. Løsemidlene ble fjernet under vakuum og restmaterialet destillert tre ganger sammen med toluen. Restmaterialet ble løst i diklormetan (50 ml) og ekstrahert med 1 M vandig NaHCO3-løsning (� 50 ml), som ble reekstrahert med diklormetan (� 20 ml). De sammenslåtte organiske fasene ble tørket over natriumsulfat og inndampet under vakuum. Restmaterialet ble behandlet ved kiselgelkromatografi (100 % diklormetan til 95:5 diklormetan/metanol), noe som ga 5’-dimetoksytrityp-N-fenoksyacetyl-5-aza-2’-deoksycytidin (0,35 g, 0,53 mmol, 32 %, Rf = 0,49, 9:1 diklormetan/metanol). Dette intermediat (0,3 g) ble løst i vannfri acetonitril (2 ml) før tilsetning av 0,3 M benzyltiotetrazol (0,9 ml) i vannfri acetonitril og cyanoetyltetraisopropylfosforoamiditt (0,17 ml). Blandingen ble omrørt ved 22<o>C i 1,5 timer. TLC (2:1 etylacetat/heksaner pluss 2 % TEA) viste en diastereoisomer blanding med Rf = 0,27 og 0,36. Løsemidlet ble fjernet under vakuum og restmaterialet behandlet ved kolonnekromatografi (20 g kiselgel, 2,5 cm kolonne, 9:1 heksaner/etylacetat pluss 2 % TEA (500 ml), 1:1 heksaner/etylacetat pluss 1 % TEA (200 ml), 1:2 heksaner/etylacetat pluss 0 % TEA (250 ml). Decitabin-fosforamidittbyggestein (1d), hvor R1 = fenoksyacetyl (0,297 g, 0,34 mmol, 76 %) ble eluert med 1:2 heksaner/etylacetat. ESI-MS for 1d (beregnet nøyaktig masse for C46H53N5O9P er 864,36) viste m/z 864,1 og 966,4 [M+NEt3+H<+>]<+>, <31>PØ NMR (CDCl3, 500 MHz) viste 149,17 og 149,0 ppm, <1>H NMR (CDCl3, 500 MHz) viste kjemiske skift (ppm) 8,63 & 8,59 (1h, dublett, H-6), 7,4-6,6 (18H, multiplett, aromatisk DMTr/Pac), 6,05 (1H, triplett, H-1’), 4,79 (2H, singlett, CH2 i Pac), 4,59 (1H, singlett, H-4’), 4,25 til 4,20 (1H, dublett, H-3’), 3,8-3,7 (1H, multiplett, P-O-CH2), 3,70 (3H, singlett, CH3O i DMTr), 3,68 (3H, singlett, CH3O i DMTr), 3,6-3,48 (3H, multiplett, to CH i isopropyl og en P-O-CH2), 3,36-3,27 (2H, multiplett, H-5’), 2,80 (1H, singlett, H-2’), 2,53 (1H, singlett, H-2’), 2,40 (2H, multiplett, CH2CN), 1,1 (12H, CH3 i isopropyl).

I tillegg gir mindre modifikasjoner av publiserte fremgangsmåter tilgang til 3’- og 5’-O-blokkerte derivater (figur 3A, 1g, 1i, 1j, ik, 1l) (Bagnall, Bell og Pearson (1978) J. of Fluorine Chem. 11: 93-107), hvor den blokkerende gruppe kan være alkylgrupper, estere og fettsyreestere, glykolderivater, f.eks. etylen- og propylenglykoler, og beskyttet decitabin 3’-bundet til et støttemiddel bestående av glass med kontrollert porestørrelse (figur 3B, 1m, 1n, 1o). Alul, Singman, Zhan og Letsinger (1991) 19: 1527-1432.

Andre decitabinderivater har 3’-OH-gruppen beskyttet med estere (som inkluderer, men ikke er begrenset til, acetyl, benzoyl halobenzoyl og fettsyrer) og etere (som inkluderer p-nitrofenyletyl, metoksymetyl, metyltiometyl, (fenyldimetylsilyl)metoksymetyl, benzyloksymetyl, p-metoksybenzyloksymetyl, p-nitrobenzyloksymetyl, o-nitrobenzyloksymetyl, (4-metoksyfenoksy)metyl, t-butoksymetyl, 4-pentenyloksymetyl, siloksymetyl, 2-metoksyetoksymetyl, 2,2,2-trikloretoksymetyl, bis(2-kloretoksy)metyl, 2-(trimetylsilyl)-etoksymetyl, metoksymetyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrofuranyl og 1-(2-fluorfenyl)-4-metoksypiperidin-4-yl), glykolderivater, f.eks. etylen- og propylenglykoler, som vist i figur 4.

2. Syntese av DpG- og GpD-dinukleotider og –tetranukleotider på fast støttemiddel DpG- og GpD-dinukleotidene og –tetranukleotidene kan syntetiseres ved standardfremgangsmåter (figur 5) med en viss modifikasjon for forlenget koblingstid (> 2 min.). Beaucage og Caruthers (1981) Tet. Lett. 22:1859-1862, McBride og Caruthers (1983) Tet. Lett. 24: 245-248. Syntese av GpD-dinukleotid 2a og DpGpGpD-tetranukleotid 3a kan innledes ved kobling av 1m, 1n eller 1o til på tilsvarende måte beskyttet 5’-O-DMTr2’-deoksyguanosin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosoramiditt og 5’-O-DMTr2’-deoksy-5-azacytidin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditter (1d, 1e elelr 1f), som vist i figur 6A. Påfølgende frigjøring fra det faste støttemiddel (f.eks. glass med kontrollert porestørrelse, CpG) og fjerning av karbamatbeskyttelsesgrupper med baser som DBU/pyridin (eller acetonitril) og ammoniakk i metanol for fjerning av 4-O-metoksy- og 4-O-metyltiobeskyttelsesgruppene gir de ønskede oligonukleotidene med den siste DMTr-gruppen på eller av. DpGpGpD (3b) kan erholdes på tilsvarende måte (figur 7).

For eksempel (figur 6A og 6B) blir et Amersham ÄKTA Oligopilot 10-system ladet med et fast CPG-støttemiddel med tilkoblet beskyttet decitabin 1m (hvor R1 = fenoksyacetyl), som kobles til 2-2,5 ekvivalenter tert-butylfenoksyacetyl-2’-deoksyguanosinfosforamiditt i nærvær av 60 % 0,3 M benzyltiotetrazolaktivater (i acetonitril) i 2,5 min. Det faste CPG-støttemiddel som inneholder beskyttet GpD-dinukleotid behandles med 20 ml 50 mM K2CO3 i metanol i 1 time og 20 min. Det koblede produkt oksideres med 2 M tert-butylhydroperoksid i vannfri acetonitril (fremstilt ved å løse tert-butylhydroperoksid i 80 % tertbutylperoksid) i 5 min. Dimetoksytritylbeskyttelsesgruppen fjernes med 3 % dikloreddiksyre i toluen. Det faste CPG-støttemiddel vaskes med vannfri metanol, og filtratet nøytraliseres ved tilsetning av 2 ml 1 M eddiksyre i metanol. Løsningen oppkonsentreres ved inndamping under rotasjon, og restmaterialet løses i 200 mM trietylammoniumacetat (pH 6,9), vaskes med acetonitril (500 µl av 50 % vandig acetonitril) og filtreres gjennom et sprøytefilter. GPD-dinukleotidet renses så ved ÄKTA Explorer 100-HPLC med en Gemini c18 preparativ kolonne (Phenomenex), 250 x 21,2 mm, 10 µm med beskyttelseskolonne (Phenomenex), 50 x 21,2 mm, 10 µm, med 50 mM trietylammoniumacetat (pH 7) i MilliQ-vann (mobil fase A) og 80 % acetonitril i MilliQ-vann (mobil fase B), med 2 % til 20/25 % mobil fase B i kolonnevolumer. ESI-MS (-ve) for GPD-dinukleotid 2a, hvor X<+ >= trietylammonium (beregnet eksakt masse for den nøytrale forbindelsen C18H24N9O10P er 557,14) ga m/z = 556,1 [M-H]- og 1113,1 for [2M-H]- (se massespektrum i figur 30).

Dersom syklusen gjentas tre ganger med 2-2,5 ekvivalenter av tert-butylfenoksyacetyl-2’-deoksyguanosin- eller fenoksyacetyl-5-aza-2’-deoksycytidin-fosforamiditt i nærvær av 60 % 0,3 M benzyltiotetrazolaktivator (i acetonitril) i 2,5 min. henholdsvis 10 min. (figur 6B og 7) erholdes DpGpGpD-tetranukleotidet 3b, hvor X<+ >= trietylammonium (beregent eksakt masse for den nøytrale forbindelse C36H47N18O22P3 er 1176,23) viste m/z 587,2 for [M-2H]<2- >og 1175,2 [M-H]<- >(figur 32).

I tillegg kan DPG-dinukleotid 2b og GpDpGpD 3c syntetiseres ved å koble 1s (hvor R1 = karbamatbeskyttelsesgruppe) til fosforamidittbyggestenene 1d, 1e eller 1f (figur 8). GpDpDpG og GpDpG (3c’) kan erholdes på tilsvarende måte (figur 9).

Dersom for eksempel et fast CPG-støttemiddel med tilkoblet beskyttet 2’-deoksyguanosin 1s (hvor R1 = tert-butylfenoksyacetyl) kobles til 2-2,5 ekvivalenter fenoksyacetyl-decitabin-fosforamiditt (figur 2a, 1d hvor R1 = fenoksyacetyl, se massespektrum i figur 38) i nærvær av 60 % 0,3 M benzyltiotetrazolaktivator (i acetonitril) i 10 min. Det faset CPG-støttemiddel inneholdende beskyttet DpG-dinukleotid behandles med 20 ml 50 mM K2CO3 i metanol i 1 time og 20 min. Det koblede produkt oksideres, beskyttelsesgruppen fjernes, og produktet vaskes, filtreres og renses som beskrevet for GpD-dinukleotid. ESI-MS (-ve) for DpG-dinukleptid 2b, hvor X<+ >= trietylammonium (beregnet eksakt masse for den nøytrale forbindelse C18H24N9O10P er 557,14) viste m/z 556,1 [M-H]- og 1113,1 for [2M-H]- (se massespektrum i figur 31). DpG-dinukleotid 2b, hvor X<+ >= natrium, erholdes ved å løse trietylammoniumsaltet i 4 ml vann og 0,2 ml 2 M NaClO4-løsning. Ved tilsetning av 36 ml aceton utfelles dinukleotidet. Løsningen inkuberes ved -20<o>C i flere timer og sentrifugeres ved 4000 rpm i 20 min. Supernatanten fjernes og det faste stoff vaskes med 30 ml aceton, fulgt av nok en sentrifugering ved 4000 rpm i 20 min. Det utfelte materialet løses i vann og frysetørkes, og viste m/z = 556,0 [M-H]- (se massespektrum i figur 36).

Ved gjentakelse av syklusen to ganger med 2-2,5 ekvivalenter tert-butylfenoksyacetyl-2’-deoksyguanosin- eller fenoksyacetyl-5-aza-2’-deoksycytidin-fosforamiditt i nærvær av 60 % 0,3 M benzyltiotetrazolaktivator (i acetonitril) i 2,5 min. henholdsvis 10 min. erholdes GpDpD-trinukleotidet 3c’, hvor X<+ >= trietylammonium (beregnet eksakt masse for den nøytrale forbindelse C28H36N14O16P2 er 886,2), som viste m/z = 885,16 [M-H]<- >(se massespektrum i figur 33).

Dersom syklusen gjentas tre ganger erholdes DpGpDpG-tetranukleotidet (3c) hvor X<+ >= trietylammonium (beregent eksakt masse for den nøytrale forbindelse C36H47N8O22P3 er 1176,23) som viste m/z = 587,4 for [M-2H]<2- >og 1175,4 [M-H]<- >(se massespektrum i figur 34).

Dersom fosfittriesteren, nylig dannet under koblingstrinnet, omdannes til den tilsvarende fosforotioattriester med 5 % fenylacetyldisulfid (PADS) i dikloretan/sym-kollidin 4/1 (vol/vol), 4,3 ml løsning (3,6 kolonnevolumer), elueringshastighet 50 cm/time (kontakttid 3 kolonnevolumer) kan fosforotioatderivatet av 2b erholdes. Svoveltilsetningen fullføres i løpet av 3 min., hvoretter overskudd av reagens fjernes fra reaksjonskaret ved vask med acetonitril. Påfølgende avbeskyttelse og rensing som beskrevet for 2a gir fosforotioat-DpG (Sp & Rp, figur 13, 2e), hvor X<+ >= trietlammonium (beregnet eksakt masse for den nøytrale forbindelse C18H24N9O9PS er 573,12), som viste m/z = 571,9 for [M-H]<- >(se massespektrum i figur 35).

Dersom syklusen gjentas én gang med DMT-heksaetylenglykol-fosforamiditt (60 % aktivator, 7 min. koblingstid), fulgt av standard oksidasjon og rensing som beskrevet for 2a, erholdes HEG-DpG-dinukleotid 2d (figur 12), hvor X<+ >= trietylammonium og Cap = heksaetylenglykolfosfat (beregnet eksakt masse for den nøytrale forbindelse C30H49N98O19P2 er 901,71), som viste m/z = 900,4 [M-H]- (se massespektrum i figur 37).

3. Inhibering av DNA-metylering med DpG- og GpD-di-, tri- og tetranukleotider Den demetylerende aktivitet av DpG- og GpD-di-, tri- og tetranukleotider ble analsyert i en cellebasert GFP (grønt fluorescerende protein)-analyse. Denne analysen, som er vist skjematisk i figur 25, har et GFP-gen regulert av CMV-promoteren og er følsom for metylering av CPG-seter i promoteren. Redusert metylering som følge av behandling med en metyleringsinhibitor fører til GFP-ekspresjon og kan lett måles. Nærmere bestemt ble cellelinjen CMV-EE210, som inneholder det epigenetisk avskrudde GFP-transgen, anvendt for analyse av reaktivering av GFP-ekspresjonen med væskestrømscytometri. CMV-EE210 ble fremstilt ved å transfektere NIH 3T3-celler med plasmid P-UF/UF1/UF2 (Zolotuhin et al., 1996), som består av pBS(+) (Stratagene, Inc.) inneholdende en cytomegalovirus (CMV)-promoter som styrer et humanisert GFP-gen tilpasset ekspresjon i pattedyrsceller. Etter transfeksjonen ble celler som uttrykte GFP i høyt nivå i utgangspunktet selektert ved FACS-analyse og sortert ved anvendelse av et MoFlo-cytometer (Cytomation, Inc.). Decitabin, en kraftig inhibitor av DNMT1 hos pattedyr, ble anvendt som positiv kontroll. For analyse av reaktivering av CMV-EE210 ble decitabin (i en konsentrasjon på 1 µm) eller analyseforbindelse (i en konsentrasjon på 30-50 µm) tilsatt til komplett medium (DMEM uten fenolrødt) Gibco, Life Technologies) tilsatt 10 % føtalt bovint serum (Hyclone)). Cellene ble så utsådd til 30 % konfluens (� 5000 celler/brønn) i en 96-brønners plate tilsatt analyseforbindelsene og dyrket i 3 dager ved 37<o>C og 5 % CO2. Platene ble undersøkt under fluorescensmikroskop ved anvendelse av et 450-490 eksitasjonsfilter (I3-filterkube, Leica, Deerfield IL). Brønnene ble ansett som G1-positive dersom (10 %) av de levende cellene uttrykker GFP, g2-positive dersom 30 % av de levende cellene uttrykker GFP og g3 dersom > 75 % av de levende cellene uttrykker GFP. GFP 50 er den konsentrasjon av en inhibitor som (i likhet med IC50) som gjør at GFP-ekspresjonsnivået går fra g3 til g1/2). Tabell 1 opplister resultatene av analysen av decitabin, DpG, GpD, GpDpG, DpGpGpD og DpGpDpG som DNA-metyleringsinhibitorer. Som vist i tabell 1 var alle de 5 analyserte oligonukleotidanalogene i stand til effektivt å inhibere DNA-metylering i lave konsentrasjoner, noe som førte til reaktivering av transkripsjonen av GFP-genet.

Tabell 1: Foreløpig analyse av demetylerende aktivitet

4. Syntese av DpG- og GpD-dinukleotider og –tetranukleotider i løsning

For syntese av disse oligonukleotidene i stor skala er det ønskelig med anvendelse av løselige polymere støttemidler. Bayer og Mutter, (1972) Nature 237: 512-513, Bonora (1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54: 3-17. Det polymere støttemiddel poly (etylenglykol) eller PEG gjør det mulig å utføre synteseprosessen i homogen fase og sikrer et enkelt intermediært rensetrinn ved enkle utfellings- og filtreringsfremgangsmåter Harris Poly(ethylene glycol) Chemistry. Biotechnical and biomedical Applications, J.M. Harris (red.), Plenum Press, New York (USA), 1992, s. 1-14. [Sitering av bok]. F.eks. kan 3’-tilkoblede derivater som 1t, 1u eller 1v (figur 10) lett tilpasses den standard fosforamidittbaserte kjemi som benyttes i de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene i fast fase for erholdelse av DpG- og GpD-di- og –tetranukleotidene 2a, 2b, 3a, 3b, 3c og 3d.

Alternativt kan det nye DpG-dinukleotid 2a fremstilles i løsning ved å koble derivat 1t, 1q eller 1r til tilsvarende beskyttet 5’-O-DMTr-2’-deoksyguanosin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt og GpD ved kobling av på tilsvarende måte 3’-beskyttet 2’-deoksyguanosin til 5’-O-DMTr-2’-deoksy-5-aza-cytidin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditter (1d, 1e eller 1f) i acetonitril og/eller diklormetan, fulgt av oksidasjon med jod/vann, fjerning av de basebeskyttende gruppene og fjerning av DMTrgruppen (som i standardsyklusen for oligonukleotidsyntese).

I tillegg kan det nye DpG (2c)-dinukleotid med 3’-OH- og 5’-OH-enden blokkert med en metylgruppe fremstilles ved å koble 3’-O-metylderivat 1g, 1h eller 1i til et 5’-O-metylderivat av 2’-deoksyguanosin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt 1w (figur 11), fulgt av oksidasjon med jod/vann, fjerning av de basebeskyttende gruppene og fjerning av DMTr-gruppen (som i standardsyklusen for oligonukleotidsyntese9. Dinukøeotid GpD (2d) kan likeså fremstilles ved å koble 3’-O-metyl-2’-deoksyguanosinderivat 1x til 5’-O-metylderivatet av 2’-5-aza-cytidin-3’-O-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt 1j, 1k elelr 1l (figur 12).

5. Syntese av DpG- og GpD-oligonukleotider som er resistente overfor cytidindeaminaser og nukleaser

Vanligvis er oligonukleotider i biologiske væsker utsatt for nukleasedegradering. Stein og Cheng (1993) Science 261: 1004-1012, Cohen (1994) Adv. Pharmacol. 25: 319-339. For å forbedre stabiliteten og resistensen overfor nukleasedegradering fremstilles også fosfotioatdinukleotid- og –tetranukleotidderivater som 2e, 2f, 3e, 3f, 3g og 3h (figur 13, 14 og 15), hvor det ikke-brodannende internukleotidoksygen er erstattet med svovel. Standard fosforamidittfremgangsmåter anvendes, bortsett fra at bis(O,O-diisopropoksyfosfinotioyl)-disulfid (S-tetra) anvendes i stedet for jod under oksideringstrinnet. Zon og Stec (1991) i Eckstein, F. (red.), ”Phosphorotioat Analogues’ in Oligonucleotides and Their Analogs: A Practical Approach, IRL Press, s. 87-108, Zon, G. (1990) i Hancock, W.S. (red.) High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology. Wiley, New York, kap. 14, s. 310-397 [boksiteringer], Stec, Uznanski, Wilk, Hirschbein, Fearon og Bergot (1993) Tet. Lett.

34:5317-5320, Iyer, Phillips, Egan, Regan og Baucage (1990) J. Org. Chem. 55: 4693-4699.

En annen mulig hindring for anvendelsen av disse oligonukleotidene som farmasøytiske midler er den alle steds nærværende cytidindeaminase (CDA), siden deaminering av decitabin fører til fullstendig tap av aktivitet. Momparler, Cote og Elipoulos (1997) Leukemia 11 (Suppl. 1): 1-6, Chabot, Bouchard og Momparler (1983) Biochem.

Pharmacol. 32: 1327-1328, Laliberte, Marquez og Momparler (1992) Cancer Chemother.

Pharmacol. 30: 7-11. For å lose dette problemet erstattes oligonukleotidene som inneholder decitabinderivater med 4-NH2 med 4-NR3R4 (hvor R3 og R4 kan være alkyl, alkylamin og alkylalkohol) for erholdelse av derivater som 2g, 2h, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 2n, 3i, 3j, 3k, 3l, 3m, 3n, 3o og 3p (figur 16, 17, 18, 19, 20 og 21). Standard fosforamidittfremgangsmåter anvendes, bortsett fra at alkylaminer, alkyldiaminer og hydroksylaminer anvendes i stedet for ammoniakk i metanol under fjerningen av 4-metoksy og 4-metyltio. Siden sekundære og tertiære aminer, diaminer og hydroksylaminer er dårligere forlatende grupper enn ammoniakk er disse derivatene vanskeligere å deaminere.

6. Syntese av DpG- og GpD-rike oligonukleotider basert på CpG-øyene i promoterregionene til kreftrelaterte gener som P15 (CDKN2B), BRCA1 og P16 (CDKN2A)

Det kan fremstilles oligonukleotidanaloger som er rike på DpG- og GpD-øyer og som varierer i lengde fra 5-100 baser, hvor D kan være decitabin eller decitabinanaloger. I motsetning til de ovenfor beskrevne DpG- og GpD-dinukleotidene og –tetranukleotidene fungerer disse relativt lengre DpG- og GpD-rike oligonukleotidanalogene ikke bare restriktivt innenfor CPG-øyene i promoterregionene, men er spesifikke for et segment i promoterområdesekvensen for kreftrelaterte gener som P15 (CDKN2B), P16 (CDKN2A) og BRAC1. F.eks. kan 8-mere, 10-mere og 12-mere DpG- og GpD-rike oligonukleotidanaloger (figur 26) som bygger på promoterområdesekvensene til P15, P16 og BRCA1 (figur 27, 28 henholdvis 29) fremstilles ved anvendelse av fosforamidittbyggestein 1d, 1e eller 1f i en standard oligonukleotidsyntese i fast fase. Flere eksempler på oligonukleotider som kan modifiseres ved innføring av 5-aza-cytosin er opplistet i figur 27, 28 og 29. Disse oligonukleotidanalogene kan fungere som primere og inkorporeres i replikerende DNA, men kun i det spesifikke segment i promoterområdesekvensen til P15, P16 eller BRAC1, slik at metylering av promoterområdet effektivt og selektivt inhiberes.

Claims (37)

1. Patentkrav 1. Isolert eller syntetisk oligonukleotidanalog eller et salt eller en ester derav, k a r a k t e r i s e r t v e d at den har den generelle formelen 5’-DpG-3’ eller 5’-GpD-3’ hvor D er decitabin, p er en fosfolinker, og G er 2’-deoksyguanosin.
2. 2. Oligonukleotidanalog ifølge krav 1, hvor oligonukleotidanalog er 5’-DpG-3’.
3. 3. Oligonukleotidanalog ifølge krav 1, hvor oligonukleotidanalog er 5’-GpD-3’.
4. 4. Oligonukleotidanalog ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 som er i form av et salt.
5. 5. Oligonukleotidanalog ifølge krav 1, som er en forbindelse med formel:

   hvor X<+ >er et mot-ion.
6. 6. Oligonukleotidanalog ifølge krav 5, hvor X<+ >er Na<+>
7. 7. Oligonukleotidanalog ifølge ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 hvor saltet er dannet med en syre valgt fra gruppen som består av saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre, fosforsyre, karboksyl-, sulfon-, sulfo- eller fosforsyrer, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, ravsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre, metylmaleinsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, melkesyre, oksalsyre, glukonsyre, glukarsyre, glukuronsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, salisylsyre, 4-aminosalisylsyre, 2-fenoksybenzosyre, 2-acetoksybenzosyre, embonsyre, nikotinsyre, isonikotinsyre, aminosyre, glutaminsyre, asparaginsyre, fenyleddiksyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, 2-hydroksyetansulfonsyre, etan-1,2-disulfonsyre, benzensulfonsyre, 4-metylbenzensulfonsyre, naftalen-2-sulfonsyre, naftalen1,5-disulfonsyre, 2- eller 3-fosfoglyserat, glukose-6-fosfat, N-sykloheksylsulfaminsyre og askorbinsyre.
8. 8. Oligonukleotidanalog ifølge krav 1, hvor saltet er hydroklorid, mesylat, EDTA, sulfitt, L-aspartat, maleat, fosfat, L-glutamat, (+)-L-tartrat, sitrat, L-laktat, suksinat, acetat, heksanoat, butyrat eller propionat salt.
9. 9. Oligonukleotidanalog ifølge krav 1, hvor saltet er et natrium-, kalsium-, litium-, kalium-, ammonium- eller trialkylammoniumsalt.
10. 10. Oligonukleotidanalog ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor hydroksylgruppen i den 5’- eller 3’-ende av oligonukleotidanalogen er substituert med en ikke-hydroksyl-beskyttelsesgruppe.
11. 11. Oligonukleotidanalog ifølge krav 10, hvor den ikke-hydroksylbeskyttelsesgruppen er valgt fra gruppen som består av dimetoksytritoksyl (DMTr-O), O-metyl (OMe), etylenglykol, tetraetylenglykol, heksaetylenglykol og heksaetylenglykolfosfat.
12. 12. Farmasøytisk sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter en oligonukleotidanalog ifølge et hvilket som helst av de foregående krav eller dets farmasøytisk aksepterbare salt eller ester, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff.
13. 13. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 12, hvor det farmasøytisk aksepterbare bærestoffet er en løsning som inneholder mindre enn 5 % vann, som består av etanol, glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol eller en kombinasjon derav.
14. 14. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 13, hvor det farmasøytisk aksepterbare bærestoffet omfatter en kombinasjon av propylenglykol og glyserol.
15. 15. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 14 som har mindre enn 1 % vann.
16. 16. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 15 hvor konsentrasjonen av propylenglykol i det farmasøytisk aksepterbare bærestoffet er mellom 10 og 80 %.
17. 17. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 16 hvor konsentrasjonen av propylenglykol i det farmasøytisk aksepterbare bærestoffet er mellom 50 og 70 %.
18. 18. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 17 for administrering ved injeksjon.
19. 19. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 18 for administrering ved subkutan injeksjon.
20. 20. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 19 som omfatter mellom 0,1 og 200 mg av oligonukleotidanalogen per ml av farmasøytisk aksepterbart bærestoff.
21. 21. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 20 som omfatter mellom 0,1 og 100 mg av oligonukleotidanalogen per ml av farmasøytisk aksepterbart bærestoff.
22. 22. Farmasøytisk kombinasjon som omfatter: i. en isolert eller syntetisk oligonukleotidanalog, salt eller ester som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 11 eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21; og ii. en terapeutisk komponent som er et anti-neoplastisk middel, et alkylerende midler, et middel som er et medlem av retinoid-superfamilien, et antibiotisk middel, et hormonelt middel, et planteavledet middel, et biologisk middel, et interleukin, et interferon, et cytokin, et immunmodulerende middel, et monoklonalt antistoff, en inhibitor av histon-deacylase eller en platinum forbindelse.
23. 23. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 22, hvor den terapeutiske komponenten omfatter en inhibitor av histon-deacylase valgt fra en hydroksaminsyre, et syklisk peptid, et benzamid, en kortkjedet fettsyre, trikostatin A, suberoylanilid hydroksamsyre, oxamflatin, suberisk bishydroksaminsyre, m-karboksy-kanelsyre bishydroxaminsyre, pyroksamid, trapoksin A, apicidin, FR901228, MS-27-275, smørsyre, argininbutyrat og fenylbutyrat.
24. 24. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 23, hvor den terapeutiske komponenten er MS-27-275.
25. 25. Farmasøytisk kombinasjon ifølge krav 22, hvor den terapeutiske komponenten omfatter en platinum forbindelse valgt fra cisplatin og karboplatin.
26. 26. Oligonukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eller en farmasøytisk kombinasjon ifølge et av kravene 22 til 25, for anvendelse i behandling en pasient som lider av en sykdom assosiert med avvikende DNA-metylering.
27. 27. Oligonukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eller en farmasøytisk kombinasjon ifølge et av kravene 22 til 25, for anvendelse i henhold til krav 26 hvor sykdommen som er forbundet med unormal DNA-metylering er valgt fra gruppen som består av hematologiske forstyrrelser, godartede tumorer og kreft.
28. 28. Oligonukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eller en farmasøytisk kombinasjon ifølge et av kravene 22 til 25, for anvendelse i henhold til krav 27 hvor den hematologiske forstyrrelsen er valgt fra gruppen som består av akutt myeloid leukemi, akutt promyelocyttleukemi, akutt lymfoblastleukemi, kronisk myelogen leukemi, myelodysplastiske syndromer og sigdcelleanemi.
29. 29. Oligonukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eller en farmasøytisk kombinasjon ifølge et av kravene 22 til 25, for anvendelse i henhold til krav 27 hvor kreftformen er valgt fra gruppen som består av brystkreft, hudkreft, beinkreft, prostatakreft, leverkreft, lungekreft, ikke-småcellet lungekreft, hjernekreft, strupekreft, galleblærekreft, bukspyttkjertelkreft, rektumkreft, paratyroidkreft, skjoldkjertelkreft, binyrekreft, kreft i nervevev, kreft i hode og hals, kolonkreft, magekreft, kreft i bronkiene, nyrekreft, basalcellekarsinom, plateepitelcellekarsinom av både ulserøs og papillær type, metastatisk hudkarsinom, osteosarkom, Ewings sarkom, retikulosarkom, myelom, kjempecelletumor, småcellet lungetumor, gallestein, øycelletumor, primær hjernetumor, akutte og kroniske lymfocytt- og granulocyttumorer, hårcelletumor, adenom, hyperplasi, medulært karsinom, feokromocytom, mukosale nevromer, intestinale ganglionevromer, hyperplastisk korneanervetumor, marfanoid habitustumor, Wilms tumor, seminom, ovarietumor, leiomyomatertumor, cerviksdysplasi og karsinom in situ, nevroblastom, retinoblastom, sarkom i mykt vev, ondartet karsinoid, topisk hudlesjon, mycosuis fungoide, rabdomyosarkom, Kaposis sarkom, osteogent sarkom, ondartet hyperkalsemi, nyrecelletumor, polycytemia vera, adenokarsinom, glioblastoma multiforma, leukemier, lymfomer, ondartede melanomer, epidermoide karsinomer.
30. 30. Oligonukleotid ifølge et av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et av kravene 12 til 21, for anvendelse i behandling av en sykdom assosiert med unormal hemoglobinsyntese.
31. 31. Oligonukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, eller et salt eller ester derav, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, for anvendelse ifølge krav 30, hvor sykdommen assosiert med unormal hemoglobinsyntese er valgt fra sigdcelleanemi og B-talassemi.
32. 32. Anvendelse av: a) en isolert eller syntetisk oligonukleotidanalog, salt eller ester som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 11; eller b) den farmasøytiske sammensetningen ifølge ethvert av kravene 12 til 21; ved fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom som definert i et hvilket som helst av kravene 26 til 31.
33. 33. Den isolerte eller syntetiske oligonukleotidanalogen, saltet eller esteren som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 11, den farmasøytiske sammensetningen ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 21, eller den farmasøytiske kombinasjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 25, for bruk i terapi.
34. 34. Sett, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter: i. en første beholder som omfatter en isolert eller syntetisk oligonukleotidanalog, salt eller ester som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 11 i fast form; og ii. en andre beholder som omfatter et fortynningsmiddel som omfatter glyserol. 81. Sett ifølge krav 80, k a r a k t e r i s e r t v e d at det videre omfatter skriftlige instruksjoner som beskriver hvordan oligonukleotidanalogen, saltet eller esteren derav skal administreres til en vert med behov for dette.
35. 35. Sett ifølge krav 34, hvor fortynningsmidlet er en kombinasjon av propylenglykol og glyserin, hvor konsentrasjonen av propylenglykol i fortynningsmidlet er mellom 1-90 %.
36. 36. Sett ifølge krav 34, som videre omfatter instruksjoner for administrering ved injeksjon.
37. 37. Sett ifølge krav 34, som videre omfatter instruksjoner for administrering ved subkutan injeksjon.