NO315261B1

NO315261B1 - Stabile v¶skeblandinger inneholdende uratoksydase og lyofiliserte blandinger for fremstilling av disse

Info

Publication number: NO315261B1
Application number: NO19961915A
Authority: NO
Inventors: Claude Aleman; Alain Bayol; Thierry Breul; Patrice Dupin
Original assignee: Sanofi Synthelabo
Priority date: 1995-05-11
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 2003-08-11
Also published as: CA2175971A1; PL184135B1; HUP9601241A3; PL314147A1; ATE183925T1; CZ290799B6; DK0742013T3; DE69604009D1; BR1100337A; ZA963683B; ES2137635T3; CZ135096A3; NO961915D0; FR2733914B1; IL118171A; HU9601241D0; AU5213996A; JP2950775B2; US5811096A; IL118171A0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk akseptabel væske-formulering inneholdende uratoksydase som fremskaffes i form av en løsning som er stabil ved 25 °C og som er klar etter røring.

Denne løsningen kan også oppnås ved oppløsning av et lyofilisat inneholdende uratoksydase i et løsningsmiddel.

Uratoksydase (urat oksygen oksidoreduktase, EC 1.7.3.3, Uox), et protein enzym oppnådd fra Aspergillus flavus som oksyderer urinsyre tit allantoin, benyttes i forebyggelse eller behandling av hyperuricaemia under kjemoterapeutiske behandlinger, fordi allantoin er ti ganger mer løselig enn urinsyre og lett kan fjernes via nyrene (Laboureur P. Et al., Bull.Soc.Chim. Biol., 1968, 50, 811-825; Kissel P. Et al., The Lancet, 1975, J25, 229).

Uratoksydase er et tetramer enzym sammensatt av fire identiske enheter med en molekylvekt på 34 152. Hver monomere enhet dannet fra en enkelt polypeptidkjede inneholdende 301 aminosyrer, er acetylert ved den N-terminale enden og har ikke disulfidbroer. Den optimale pH for stabilitet av enzymaktiviteten til uratoksydase i løsning er pH=8 (Bayol A. et al., akseptert for trykning Biophys. Chem., 1995 (54), 229-35).

cDNA'en som koder for dette proteinet har blitt klonet og uttrykt i E. Coli (Legoux R. Et al., J. Biol. Chem., 1992, 267 (12), 8565-8570), i Aflavus (Chevalet L. Et al., Curr.Genet., 1992, 21, 447-453) og i S. cerevisiae ( Leplatois P. Et al., Gene, 1992, 122, 139-145). De beste utbytter oppnådd fra S. cerevisiae, gjorde valget av denne gjæren foretrukket for produksjon av rekombinant uratoksydase (re-Uox). Det rekombinante enzymet, akkumulert i det intracellulære rommet i en løselig og aktiv form, ekstraheres og renses til det oppnås en farmasøytisk renhet.

For å fremskaffe en formulering som kan administreres til menneske, må uratoksydasen fremstilles i form av en farmasøytisk blanding. Slike blandinger må bibeholde den enzymatiske aktiviteten til uratoksydase over tid. Vanligvis benyttes en lyofilisert form for å bibeholde den biokjemiske integriteten og den biologiske aktiviteten til enzymene under de mest varierende lagringsbetingelser. Det er velkjent at frysetørkede preparater bibeholder disse egenskapene bedre enn de tilsvarende væskepreparatene.

Frysetørkede preparater må fortynnes i et farmasøytisk akseptabelt løsningsmiddel før administrering til menneske via den parenterale veien. En væskeblanding inneholdende enzymet ville imidlertid være foretrukket fordi det kunne administreres raskere, forutsatt imidlertid at den er fysikalsk og kjemisk stabil.

Den kjente farmasøytiske formulering inneholdende uratoksydase (Uricozyme) er et lyofilisert injiserbart preparat som krever et rekonstituerende løsningsmiddel. Den frysetørkede formen av Uricozyme-blandingen er som følger:

-uratoksydase 1000 enheter

- 8-aza-2,6-dioxopurinmonohydrat

- nøytral vannfri natriumkarbonat

- dinatrium tetraoematdihydrat 0.37 mg

- laktose

Sammensetningen til det rekonstituerende løsningsmiddelet er som følger:

- dibasisk kaliumfosfat

- monobasisk kaliumfosfat

- glukose

- vann for injeksjon q.s. for 1 ml (Vidal ordbok, Paris, 61 rste utgave, side 1552,1985).

Uratoksydase løsningen som oppnås etter oppløsning av lyofilisatet i det rekonstituerende løsningsmiddelet kan ses å øke i turbiditet med lagringstiden ved 25 °C til et filamentært proteinpresipitat opptrer. Dannelsen av dette proteinpresipitatet i løsning akselererer overtid og med graden av røring av løsningen. Løsningen som oppnås er fysikalsk ustabil.

De løseliggjørende egenskapene av ikke-ioniske overflateaktive molekyler er velkjente for fagfolk innen faget, men interaksjonene mellom proteiner og ikke-ioniske overflateaktive midler er mer spesiell og er beskrevet i litteraturen.

Patent EP 211 601 beskriver bruken av visse blokk-kopolymerer, som er ikke-ioniske overflateaktive molekyler, i stabiliseringen av injiserbare veksthormon-formuleringer. Veksthormonet er stabilisert i en gelmatriks dannet av en blokk-kopolymer inneholdende polyoksyetylen og polyoksypropylen enheter med en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 1100 til 40 000.

US patent 4 783 441 beskriver en fremgangsmåte for forebyggelse av denatureringen av proteiner slik som insulin i vandig løsning ved tilsetning av en mengde som kan variere opp til 500 ppm av overflateaktive molekyler sammensatt av alternerende svakt hydrofile og svakt hydrofobe grupper, i løsninger med en pH på mellom 6.8 og 8.

US patent 5 096 885 beskriver blandingen av en løsning som skal lyofiliseres inneholdende human veksthormon, glycin, mannitol, et ikke-ionisk overflateaktivt middel og en buffer.

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er en farmasøytisk akseptabel væskeblanding av en uratoksydase-løsning inneholdende mellom 0.1 mg/ml og 10 mg/ml av en blokk-kopolymer av etylenoksid og av propylenoksid, Poloxamer 188, i et bufret vandig medium. Denne blandingen er klar og fysikalsk - og kjemisk stabil etter kraftig røring eller etter lagring i minst 48 timer og opp til ett år ved 25 °C.

Fordelene ved denne formen er større enkelhet ved klinisk bruk, som henger sammen med muligheten for direkte administrasjon og ved å kunne lagres direkte i den administrative form over lang tid.

En annen fordel ligger i fraværet av spesifikke instruksjoner om forholdsregler for håndtering som vanligvis er nødvendig for å hindre presipitasjon av protein- filamenter i løsningen som skal injiseres, fordi sammensetningen i henhold til oppfinnelsen har den egenskapen at presipitasjon av proteinfilamenter i løsningen unngås.

Den vandige væskeblandingen ifølge oppfinnelsen er klar, stabil, steril og farmasøytisk forlikelig og kan injiseres i menneske eller dyr ved subkutan, intravenøs eller på intramuskulær måte.

I den foreliggende oppfinnelse må det forstås at uttrykket uratoksydase betegner proteinet som oppnås ved fermentering av en naturlig stamme eller av en stamme som har blitt mutert ved genteknikk. Enzymet produseres derfor ved ekstraksjon fra en naturlig kilde eller fra cellekulturer. Uratoksydasen benyttet i formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan oppnås for eksempel i henhold til publikasjonene US 3 810 820, DD 284 689, DD 296 804, DD 300 781, DE 2 164 018, DE 1 517 742, FR 2 664 286, GB 2 221 910, JP 76-007749, JP-75-030137, JP-84-023987, JP-73-018473, JP-47-029575, SU 565 935, US 4 062 731 eller EP 545 688 eller ifølge EP 435 776.

Uttrykket farmasøytisk effektiv mengde betegner enhver mengde av uratoksydase som produserer en terapeutisk effekt.

Løsningene som svarer til oppfinnelsen inneholder en farmasøytisk effektiv mengde av uratoksydase. Disse løsningene inneholder foretrukket mellom 0.1 mg/ml og 50 mg/ml av uratoksydase avhengig av den ønskede dose. Konsentrasjonsområdet til uratoksydase er ikke kritisk for oppfinnelsen og kan variere i henhold til preparatene.

Løsningene i henhold til oppfinnelsen inneholder et ikke-ionisk overflateaktivt middel av en blokk-kopolymer av polyoksyetylen og av polyoksypropylen type kjent som Poloxamer 188 og som tilsvarer formelen HO{CH2CH20)75(CH(CH3)CH20)3o(CH2 CH20)75H. Dette produktet markedsføres av firmaet I.Cl. under navnet Synperonic F 68 og av firmaet B.A.S.F. under navnet Pluronic F 68. Mengdene av Poloxamer 188 som er nødvendige for å oppnå fysikalsk stabile uratoksydase-løsninger er mellom 0.1 mg/ml og 10 mg/ml og fortrinnsvis mellom 0.5 mg/ml og 5 mg/ml.

Løsningen har foretrukket en pH mellom 7.5 og 8.5. Når pH=8, er uratoksydasen spesielt kjemisk stabil i løsning.

Foretrukket anvendes vanligvis en natriumfosfatbuffer for å bufre mediet. Konsentrasjonen av bufferen er foretrukket fra 5 mM til 100 mM.

Bufferen som foretrekkes benyttet er en natriumfosfatbuffer med pH=8 ved en konsentrasjon mellom 5 mM og 100 mM.

Væskeblandingen i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis isotonisk og fordelaktig omfattes eksipienter nødvendige for oppnåelse av av en isotonisk løsning, slik som mannitol eller alanin.

Løsningen kan spesielt inneholde mannitol, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på mellom 1 mg/ml og 50 mg/ml.

Løsningen kan spesielt spesielt inneholde alanin, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på mellom 1 mg/ml og 50 mg/ml.

Løsningen inneholder foretrukket mannitol og alanin i et hvilket som helst forhold som opprettholder isotonisiteten til løsningen, fortrinnsvis fra 1 til 50 mg/ ml av mannitol og fra 1 til 50 mg/ml av alanin.

Løsningen inneholder fordelaktig cirka 10,6 mg/ml av mannitol og cirka 15,9 mg/ml av alanin.

Væskeblandingen ifølge oppfinnelsen omfatter fordelaktig konserveringsstoffer som er nødvendige for bakteriell preservering av løsningen, slik som spesielt benzylalkohol, fenol, meta-kresol, metylparaben, propyl-paraben, et benzalkoniumklorid eller benzethoniumklorid.

Løsingen kan oppnås direkte ved oppløsning av bestanddelene i vann, eller etter rekonstituering av et lyofilisat inneholdende uratoksydasen i et vandig løsningsmiddel inneholdende Poloxamer 188, eller etter rekonstituering av et lyofilisat inneholdende uratoksydasen og Poloxamer 188 i et vandig løsningsmiddel.

I dette henseende er et annet trekk ved foreliggende oppfinnelse en lyofilisert blanding for oppløsning i et vandig løsningsmiddel, inneholdende uratoksydase og Poloxamer 188 hvor vektforholdet mellom Poloxamer 188 til uratoksydase er fra 0,01 til 50.

Den lyofiliserte blandingen kan i tillegg fordelaktig omfatte en buffer, som indikert over for løsningen.

Den kan også fordelaktig omfatte eksipienter som tilveiebringer isotonisiteten til den vandige løsningen oppnådd ved oppløsning av lyofilisiatet i et vandig løsningsmiddel, slik som for eksempel alanin eller mannitol, i mengder som varierer i henhold til rekonstituerende løsningsmiddel som skal benyttes.

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Uratoksydase løsning fremstilt ved oppløsning av bestanddeler i vann :

Eksempel 2

Uratoksydase løsning fremstilt fra et uratoksydase lyofilisat rekonstituert med et vandig rekonstituerende løsningsmiddel inneholdende Poloxamer 188.

Sammensetning av lyofilisatet:

Sammensetning av det rekonstituerende løsningsmiddel:

Eksempel 3

Uratoksydase løsning fremstilt fra et uratoksydase lyofilisat inneholdende Poloxamer 188 rekonstituert med vann.

Sammensetning av lyofilisiatet:

Sammensetning av rekonstituerende løsningsmiddel:

Fordelene med blandingene ifølge oppfinnelsen vil nå bli demonstrert ved sammenligning av egenskapene til forskjellige blandinger basert på uratoksydase, hvilken sammenligning er oppsummert i tabell I og i de vedlagte figurer.

Fremstilling av blandingene

Uratoksydase blandingene ifølge oppfinnelsen kan oppnås på ulike måter, for eksempel: - Ved å blande en konsentrert vandig uratoksydase løsning inneholdende en natriumfosfatbuffer med pH=8 med en vandig løsning inneholdende Poloxamer 188 og valgfritt eksipienter som tilveiebringer isotonisiteten av den blandete løsningen og eventuelt konserveringsmidler.

■ Ved oppløsning av et lyofilisat inneholdende uratoksydase, en natriumfosfatbuffer ved pH=8 og ballast-hjelpestoffer som tilveiebringer isotonisiteten slik som mannitol og alanin i et vandig løsningsmiddel

inneholdende Poloxamer 188 og valgfritt konserveringsmidler.

■ Ved oppløsning av et lyofilisat inneholdende uratoksydase, en natriumfosfatbuffer ved pH=8, ballast-hjelpestoffer, slik som alanin og mannitol, og Poloxamer 188 i et vandig løsningsmiddel valgfritt inneholdende konserveringsmidler.

Løsningene som oppnås ved disse tre fremgangsmåter kan sterilfiltreres.

De beholder sin fysikalske stabilitet så vel som den kjemiske stabilitet og den enzymatiske aktivitet av uratoksydasen i 1 måned ved 25°C.

Ulike analytiske metoder har blitt benyttet å måle ulike parametre, slik som turbiditet eller kvantitative bestemmelser av enzymatisk aktivitet.

1. Måling av turbiditet:

Turbiditeten av uratoksydase løsningene bestemmes med et Ratio Hach turbidimeter. Turbiditetsresultatene utrykkes i Nefelometer Turbiditet Enheter (NTU) definert av: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater of the American Public Health Association. Turbiditetsmålingene indikerer graden av aggregering av uratoksydase i løsning.

2. Kvantitativ bestemmelse av enzymatisk aktivitet av uratoksydase:

Enzymatisk aktivitet av uratoksydase bestemmes ved spektrofotometri i en termostatisk-kontrollert celle ved 30 °C ved overvåkning av forsvinningen av urinsyre ved 292 nm (Legoux R., et al., J. Biol. Chem., 1992, 267 (12) 8565-8570).

Tester på stabiliteten av den vandige løsning rekonstituert ifølge eksempel 2 ble utført ved 25 °C. Stabiliteten av vandige løsninger rekonstituert ved oppløsning med vann og med løsningsmidler inneholdende henholdsvis Polysorbate 80 (Tween 80) eller 1 mg av Poloxamer 188 ifølge oppfinnelsen, med en tilstrekkelig mengde av vann for å fremstille et volum av vandig løsning på 1 ml, er vist i tabell I under.

Utseende (opalesens) av løsningene bestemmes i overensstemmelse med fremgangsmåten i the European Pharmacopoeia (II) V. 6 ved sammenligning av prøven som skal analyseres med en kontrollsuspensjon.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 viser forandringen i turbiditet i NTU over 24 timer, etter omrøring i

1 minutt med en vortex, av fem uratoksydase løsninger som tilsvarer eller ikke tilsvarer oppfinnelsen, som en funksjon av deres innhold av ikke-ionisk overflateaktive midler.

Løsning nr. 1 : 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 2 :15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 10 mg av Polysorbate 80 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 4 (ifølge oppfinnelsen): 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat,

10 mg av Poloxamer 188 og 10 ml vann for injeksjon.

Løsning nr. 3 : 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 100 mg Polysorbate 80

og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 5 (ifølge oppfinnelsen): 15 mg uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 100 mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Figur nr. 2 viser forandringen i turbiditet i NTU over 24 timer, etter omrøring i

1 minutt med en vortex, av seks uratoksydase løsninger inneholdende Poloxamer 188

i henhold til oppfinnelsen, som en funksjon av deres Poloxamer 188 innhold.

Løsning nr. 5 : 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 100 mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 4 : 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 10 mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 6 :15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 7,5mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 7 :15 mg av uratosydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 5 mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 8 :15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 2,5 mg av Poloxamer 188 og 10 ml av vann for injeksjon.

Løsning nr. 9 : 15 mg av uratoksydase, 106 mg av mannitol, 159 mg av L-alanin, 143,2 mg av dibasisk natriumfosfatdodecahydrat, 1 mg av Poloxamer 188

og 10 ml av vann for injeksjon.

Claims

1. Fysikalsk stabil, farmasøytisk akseptabel væskeblanding karakterisert ved at den inneholder uratoksydase og fra 0,1 mg/ml til 10 mg/ml av Poloxamer 188 i et bufret vandig medium.

2. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder mellom 0,5 mg/ml og 5 mg/ml av Poloxamer 188.

3. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den i tillegg inneholder alanin.

4. Blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at mengden av alanin er mellom 1 mg/ml og 50 mg/ml.

5. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den i tillegg inneholder mannitol.

6. Blanding ifølge krav 5, karakterisert ved at mengden av mannitol er mellom 1 mg/ml og 50 mg/ml.

7. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den i tillegg inneholder alanin og mannitol.

8. Blanding ifølge krav 7, karakterisert ved at den inneholder fra 1 til 50 mg/ml av alanin og fra 1 til 50 mg/ml av mannitol.

9. Blanding ifølge 8, karakterisert ved at den inneholder 15,9 mg/ml av alanin og 10,6 mg/ml mannitol.

10. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den er isotonisk.

11. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder en natriumfosfatbuffer.

12. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av bufferen er mellom 5 mM og 100 mM.

13. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er på mellom 7,5 og 8,5.

14. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder en eller flere konserveringsmidler valgt fra fenol, benzylalkohol, meta-kresol, metylparaben, propylparaben, et benzalkoniumklorid eller benzethoniumklorid.

15. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at det er oppnådd ved å oppløse et lyofilisat i et vandig løsningsmiddel.

16. Blanding ifølge kravl, karakterisert ved at den er steril og injiserbar i menneske eller dyr via den subkutane, intravenøse eller intramuskulære veien.

17. Injiserbar blanding ifølge krav 15 og krav 16, karakterisert ved at sammensetningen av lyofilisatet er: 1,5 mg uratoksydase, 10,6 mg mannitol, 15,9 mg L-alanin, 14,32 mg dibasisk natriumfosfatdodecahydrat og sammensetningen til det vandige rekonstituerende løsningsmiddelet er 1 mg Poloxamer 188, q.s. for 1 ml vann for injeksjon.

18. Lyofilisert blanding til oppløsning i et vandig løsningsmiddel, karakterisert ved at den inneholder uratoksydase og Poloxamer 188 i et vektforhold av Poloxamer 188 til uratoksydase på fra 0,01 til 50.

19. Lyofilisert blanding ifølge krav 18, karakterisert ved at den i tillegg inneholder en buffer.

20. Lyofilisert blanding ifølge krav 18, karakterisert ved at den i tillegg inneholder hjelpestoffer som tilveiebringer isotonisitet i den vandige løsning oppnådd ved oppløsning av lyofilisatet i et vandig løsningsmiddel.