NO178199B - Fremgangsmåte for fremstilling av et surt polycyklisk eter-antibiotikum med antikokkidial og vekstfremmende aktivitet - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt surt polycyklisk eter-antibiotikum med formel:

hvor Me=CH3, som har den viste absolutte stereokonfigurasjon; farmasøytisk akseptable kationiske salter derav. Det kan anvendes i forsammensetninger for fjærfe, storfe eller svin; som antikokkidiale midler i fjærfehold ved behandling eller forebyggelse av svinedysenteri, eller som vekstfremmende middel i storfe eller svin. Ved fermenteringsmetoden for fremstilling av dette, anvendes en Actinomadura sp. mikroorganisme som produserer nevnte antibiotikum under den nevnte fermentering.

Forbindelse (I) er en ny forbindelse innen gruppen av sure polycykliske eter-antibiotika. Denne familie innbefatter slike velkjente midler som monensin (Merck Index, 10.th. Ed., Merck and Co., Inc., Rahway, N.J., 1983, monograf nr. 6100), nigericin (loe. eit., monograf nr. 6390) , narasin (loe. eit., monograf nr. 6271), lasalocid (loe. eit., monograf nr.5204) og salinomycin (loe. eit., monograf nr. 8193) . Emnet er gjennomgått av Westley "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol., vol, 22., pp. 177-223 (1977). Nærmest beslektet strukturelt til foreliggende oppfinnelse er portmicin, et antibiotikum som er beskrevet uavhengig av hverandre av Hamill et al., US-patent 4.582.822 og av Kusakabe et al., Europeisk patentsøknad 158.179; Tetrahedron Letters, vol. 28,

pp. 3357-3360 (1987); J. Antibiotics, vol. 40, pp. 237-238 (1987).

Sistnevnte forbindelse har et alfa-hydrogen på tetrahydrofuran B-ringen, mens foreliggende forbindelse har en alfa-metylgruppe. Disse forbindelsene er generelt kjent som kokkidiostatika, som vekstfremmende fortilsetninger og/eller midler egnet mot svinedysenteri.

Sammenfatning av oppfinnelsen

En kultur av Actinomadura sp., ATCC 53708 produserer når den fermenteres under aerobe betingelser i vandige media, et nytt surt polycyklisk eter-antibiotikum, en forbindelse som har den ovenfor angitte formel (I).

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte forbindelse med formel (I), innbefattet farma-søytisk akseptable kationiske salter derav, og består i fermentering av nevnte Actinomadura sp. ATCC 53708 i et vandig næringsmedium som omfatter en assimilerbar karbon- og nitrogenkilde, inntil det er dannet en utnyttbar mengde av forbindelsen med formel (I), under submerse aerobe betingelser. Forbindelsen (I) adskilles fra fermenteringsvæsken ved konvensjonelle metoder og isoleres normalt i tilnærmet ren form, men benyttes alternativt i rå form.

De nevnte farmasøytisk akseptable kationiske salter innbefatter, men er ikke begrenset til, salter av natrium, kalium, kalsium, ammonium, N,N'-dibenzyletylen-diamin, N-metylglukamin (meglumine) og dietanolamin. Foretrukne kationiske salter er kalium- og natriumsalter.

Forbindelsen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse fortilsetninger, den ene for storfe eller svin som omfatter forbindelsen med formel (I) i en mengde som er effektiv for å fremme vekst og/eller forbedre forutnyttelsen hos storfe eller svin, eller til å forhindre eller behandle svinedysenteri; og den andre for fjærfe som omfatter forbindelsen med formel (I) i en effektiv mengde for kontroll av kokkidiale infeksjoner i fjærfeet.

Forbindelsen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan således benyttes for å fremme vekst og/eller øke forutnyttelsen hos svin eller storfe, ved å gi svin eller storfe en vekstfremmende eller forstoffutnyttelsesfremmende mengde av forbindelsen med formel (I) , spesielt i form av en forblanding; for å forhindre eller behandle dysenteri hos svin, ved å gi svin en forbindelse med formel (I) i en mengde som er effektiv til å hindre eller behandle svinedysenteri; og for å kontrollere kokkidiale infeksjoner i fjærfe, ved å gi fjærfeet en antikokkidialt effektiv mengde av forbindelsen med formel (I), spesielt i form av et forstoffpreparat.

En kultur, særlig en biologisk ren kultur av Actinomadura sp. ATCC 53708 er i stand til å produsere forbindelsen med formel (I) i en isolerbar mengde etter fermentering i et vandig næringsmedium som omfatter assimilerbare karbon- og nitrogenkilder. Nevnte kultur kan også anvendes i frysetørket form.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Kulturen som er i stand til å produsere foreliggende polycykliske eter-antibiotikum med formel (I), er betegnet Actinomadura sp. og er deponert i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som type-kulturen under katalogiseringsnummeret ATCC 53708. Permanensen av denne kultur-deponering ved The American Type Culture Collection at Rockville, Maryland og lett offentlig tilgjengelighet til denne, er sikret gjennom patentets effektive varighet dersom patent gis. Adgang til kulturen mens søknaden verserer er mulig under 37 CFR 1.14 og 35 USC 122. Samtlige restriksjoner på offentlig tilgjengelighet til den deponerte kultur vil bli ugjenkallelig fjernet etter at patent er gitt.

Denne nye kultur ble oppnådd fra en jordprøve tatt i Tuzla, Istanbul, Tyrkia og identifisert i kultursamlingen til Pfizer Inc. som N 777-1. Beskrivelse og klassifikasjon ble foretatt av Dr. L. H. Huang. Kulturen ble funnet å danne smale dimensjoner av hyfer av actinomycetes, et luftmycel på hvilket det dannet seg korte sporekjeder, og et ufragmentert substratmycel. Resultatene av hel-celle-analysen indikerte videre at den tilhører genus Actinomadura.

En skråkultur av mikroorganismen ble utsådd i en ATCC 172 buljong og dyrket i 4 dager ved 28°C på en rystemaskin. Den ble deretter sentrifugert i 2 0 minutter, vasket tre ganger med sterilt destillert vann og utsådd på media som vanligvis benyttes for identifikasjon av arter av Actinomycetales.

Kulturene ble inkubert ved 28°C og resultatene avlest til ulike tider, men vanligst etter 14 dager. Farvene ble beskrevet etter vanlig terminologi, men eksakte farver ble bestemt ved sammenligning med farvestrimler fra The Color Harmony Manual, 4. utg. Metodene for hel-celle aminosyre- og sukkeranalyser var som beskrevet i henholdsvis Becker et al., Appl. Microbiol.

vol. 12, pp. 421-423 (1964) og i Staneck et al., Appl. Microbiol. vol. 29, pp. 226-231 (1974) og Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., vol. 71, pp. 934-944 (1968).

Kulturen ble identifisert som følger:

Giærekstrakt- maltekstrakt- agar (ISP #2 medium, Difco)

- Vekst god, kremgul (2 ca) med mørk grå til sorte (nær grå serie 5 ih, 5 ml) flekket, hevet, foldet; luftmycel intet til sparsomt, farveløst; bakside kremgul til blek gulaktig (2 ca, 2 ea) med sorte (nær grå serie 5 ml) flekket; intet oppløselig pigment.

Havremel- agar (ISP #3 medium, Difco) - Vekst moderat, kremgul (2 ca), svakt hevet, glatt; luftmycel intet til sparsomt, farve-løst; bakside kremgul (2 ca); oppløselig pigment kremgult (2 ca).

Uorganiske salter- stivelses- agar (ISP #4 medium, Difco)

- Vekst svak, kremgul (2 ca), tynt glatt: luftmycel intet til sparsomt, farveløst; bakside kremgul (2 ca), intet oppløselig pigment.

Glycerol- asparagin- agar (ISP #5 medium, Difco) - Vekst svak til moderat, kremgul (2 ca), tynn, glatt; intet luftmycel; bakside kremgul (2 ca), intet oppløselig pigment.

Czapek- sukrose- agar (Waksman, "The Actinomycetes", v. 2, medium #1, p. 328, 1961) - Vekst moderat til god, kremgul (2 ca), moderat hevet, glatt, intet luftmycel; bakside kremgul (2 ca), intet oppløselig pigment.

Glukose- asparagin- agar (ibid., medium #2) - Vekst moderat, kremgul (2 ca), svakt til moderat hevet, glatt til foldet, intet luftmycel; bakside kremgul (2 ca); intet oppløselig pigment.

Gordon and Smith' s Tyrosine agar (Gordon and Smith,

J. Bacteriol., 69:147-150, 1955) - Vekst moderat til god, kremgul (2 ca), svakt til moderat hevet, glatt til foldet, intet luftmycel; bakside kremgul (2 ca), oppløselig pigment svakt gulaktig (2 ea).

Kalsium- malat- agar (Waksman, Bacteriol. rev. 21, 1-2 9,

1957) - Vekst sparsom, kremgul (2 ca), tynn, glatt; intet luftmycel, bakside kremgul (2 ca), intet oppløselig pigment.

Kasein- agar (Gordon and Smith, ibid.) - Vekst god, kremgul

(2 ca), hevet, glatt til foldet, intet luftmycel; bakside svakt gulaktig (2 ea); med gulaktig (2 ga) oppløselig pigment.

Bennett' s agar (Waksman, loe. eit., medium #30, p. 331)

- Vekst god, kremgul (2 ca), hevet, foldet, intet luftmycel; bakside kremgul til blekgul (2 ca, 2 ea); oppløselig pigment svakt gulaktig (2 ea).

Emerson' s agar (ibid., medium #28, p. 331) - Vekst moderat, kremgul til svakt gulaktig (2 ca, 2 ea), hevet, foldet, intet luftmycel; bakside gulaktig (2 ic); intet oppløselig pigment.

Nærings- agar (ibid., medium #14, p. 3 30) - Vekst dårlig til moderat, kremgul (2 ca), tynt til lett hevet, intet luftmycel; bakside kremgul (2 ca); intet oppløselig pigment.

Gelatin- agar (Gordon and Mihm, J. Bacteriol. 73, 15-27, 1957) - Vekst god, kremgul (2 ca), hevet, foldet, intet luftmycel; bakside kremgul til blekgul (2 ca, 2 ea); oppløselig pigment blekt gulaktig (2 ea).

Stivelses- agar (ibid.) - Vekst god, kremgul (2 ca), hevet, foldet, intet luftmycel; bakside kremgul til blekgul (2 ca, 2 ea); intet oppløselig pigment.

Potet- gulrot- agar (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 71, 934-944, 1968, men benytt kun 30 g poteter, 2,5 g gulrot og 20 g agar) - Vekst dårlig til moderat, gråhvit (nær grå serier 2 ba), tynn, glatt; intet til sparsomt luftmycel, farveløst; bakside farveløs til kremgul (2 ca); intet oppløselig pigment.

Springvann- agar (2%) - Vekst dårlig, kremgul (2 ca), tynn, glatt; luftmycel intet til sparsomt, farveløst; bakside farveløs til kremgul (2 ca); intet oppløselig pigment.

Gauze' s Mineral Medium 1 (Gauze et al., Problems in the Classification of Antagonistic Actinomycetes, English Ed., p. 13, 1957) - Vekst dårlig til moderat, kremgul (2 ca), tynn, glatt; luftmycel intet til sparsomt, farveløst; bakside kremgul (2 ca); intet oppløselig pigment.

Gauze' s Organiske Medium 2 (ibid.) - Vekst god, kremgul

(2 ca), hevet, foldet, intet luftmycel; bakside kremgul til blekgul (2 ca, 2 ea); intet oppløselig pigment.

Morfologiske egenskaper - De morfologiske egenskapene ble observert etter tre ukers inkubering på uorganisk salt-stivelses-agar: luftmycel farveløst, hvitt til kremgult; sporekjeder rette, buede eller krokede, 2 til 9 sporer per sporekjede; spore globose, ovale til elliptiske, 0,8-1,4 mikron diameter eller 1,1-1,8 x 0,8-1,2 mikron; glatte ifølge skanderende elektronmikroskopi.

Biokjemiske egenskaper - Melanin ikke produsert; hydrogen-sulfid ikke produsert; gelatin smelting; stivelse ikke hydro-lysert; nitrat ikke redusert til nitritt; ingen vekst og ingen dekomponering hverken på Jensen<*>s eller Levine og Schoenlein<*>s cellulosebuljong; ingen koagulering og ingen peptonisering av melk; kasein-spaltning positiv; tyrosin-spaltning negativ; kalsium-malat-spaltning negativ. Karbohydrat-utnyttelse: glukose, arabinose, fruktose, mannitol, rhamnose, sukrose, xylose, adonitol, cellobiose, glycerol, maltose, ribose, stivelse, og trehalose utnyttet; inositol, raffinose, dulcitol, erytritol, galaktose, laktose, mannose, melezitose, melibiose, alfa-metyl-D-glukosid, salicin, sorbitol og sorbose ikke utnyttet.

De øvrige positive tester innbefattet utnyttelse av acetat og pyruvat; hydrolyse av esulin; og dekomponering av xantin og hypoxantin. Følgende tester var negative: utnyttelse av benzoat, citrat, dekstrin, laktat, malat, mukat, oksalat, fenol, propionat og succinat; dekomponering av adenin og tyrosin; og hydrolyse av hippurat.

Temperatur- relasj oner -

Hel- celle- analyse - Hel-celle hydrolysatene inneholdt mesodiaminopimelinsyre, glukose, galaktose, madurose, mannose og ribose.

Kulturen N777-1 karakteriseres ved det kremgule substratmycel; det korte, farveløse luftmycel; de korte sporekjedene som er rette, buede eller krokede; og sporene med en glatt overflate. Den utnytter glukose, arabinose, fruktose, mannitol, rhamnose, sukrose, xylose, adonitol, cellobiose, glycerol, maltose, ribose, stivelse, trehalose, acetat og pyruvat. Xantin, hypoxantin og esculin ble dekomponert. Hel-celle-hydrolysatene indikerer forekomst av mesodiaminopimelinsyre og madurose. Kulturen N777-1 tilhører således genus Actinomadura som definert av H. Lechevalier.

De kjente arter av Actinomadura som har tilsvarende kremgult substratmycel og/eller lignende biokjemiske egenskaper, innbefatter A. cremea subsp. rifamycini, A. madurae subsp. simaoensis, og A. routienii. Kulturen N777-1 avviker fra A. cremea subsp. rifamvcini i de glatte sporer, manglende evne til å redusere nitrat, manglende evne til å utnytte raffinose og utnyttelsen av arabinose og rhamnose.

Kulturen N777-1 avviker fra A. madurae subsp. simaoensis ved det kremgule fremfor farveløse til orangebrune substratmycel, det farveløse fremfor farveløse til rosa-hvite luftmycel, manglende evne til å redusere nitrat, manglende evne til å dekomponere tyrosin og evnen til å dekomponere xantin. Sammenlignet med A. routienii, avviker den gjennom sin mangel på pseudosporangier; manglende evne til å hydrolysere stivelse; manglende evne til å koagulere melk og evnen til å utnytte mannitol, fruktose og glycerol.

Kulturen N777-1 ligner A. albolutea i de fleste biokjemiske undersøkelser, men avviker fra sistnevnte ved den manglende evne til å hydrolysere stivelse, manglende evne til å koagulere melk, kremgult fremfor brunt til mørkebrunt substratmycel og korte fremfor lange sporekjeder.

På basis av de data som er angitt ovenfor, ansees kulturen N777-1 som en art av genus Actinomadura og betegnes Actinomadura sp. Den er deponert ved the American Type Culture Collection under klassifikasjonsnummer ATCC 53 708.

Den antibiotiske forbindelse (I) fremstilt i henhold til oppfinnelsen, produseres lett av foreliggende Actinomadura sp. ved dyrking fra ca. 24° til ca. 3 6°C under submerse betingelser ved bevegelse og lufting på media bestående av karbohydratkilder så som sukkere, stivelse, glycerol; organiske nitrogensubstanser, så som soyabønnemel, casaminosyrer, gjærekstrakt; vekststoffer så som "grain solubles", fiskemel, bomullsfrømel; mineralsalter inneholdende sporelementer som jern, kobolt, kobber, sink, etc. og kalsiumkarbonat eller fosfater som buffere. Etter avsluttet dyrking isoleres antibiotikumet lett ved å ekstrahere hele buljongen med et organisk opløsningsmiddel, så som n-butanol, metylisobutylketon eller kloroform ved pH som varierer fra 4,0 til 8,0; ved frafiltrering av myceliet, som inneholder det utfelte antibiotikum, hvorunder filtratet kasseres. Alternativt, ekstra-heres myceliet eller hele den tørkede buljong med ett av nevnte organiske oppløsningsmidler. Den rensede antibiotiske forbindelse isoleres fra det organiske ekstrakt etter standardmetoder for konsentrering, salt- eller fri syre-dannelse, kromatografi, utfelling og/eller krystallisasjon som angitt i eksempler nedenfor.

Ved den vanlige måte å utføre fermenteringen fremstilles først et inokulum ved å skrape vegetative celler som vokser på et egnet medium, fra skråkulturer eller Roux flasker som er inokulert. De resulterende vegetative celler benyttes i sin tur til å inokulere rysteflasker eller inokuleringstanker som også inneholder passende vekstmedia. Alternativt kan inokuleringstankene inokuleres fra rysteflaskene. Etter en passende vekst-periode (vanligvis 120 til 144 timer i rysteflasker og 168 til 196 timer i inokuleringstanker), inokuleres en fermentor som også inneholder egnede vekstmedia, under aseptiske betingelser med vegetativ buljong fra rysteflaskene eller inokuleringstankene. Etter at veksten er over (vanligvis ca. 120 til 196 timer), utvinnes den antibiotiske forbindelse i rå eller eventuelt i renset form, etter en av de fremgangsmåter som er generelt beskrevet ovenfor, eller etter spesifikke metoder som blir eksemplifisert senere.

Forbindelsen med formel (I) undersøkes med henblikk på in vitro antibakteriell aktivitet ved hjelp av standardmetoder, hvor den minimalt hemmende konsentrasjon (MIC) i /xg/ml måles mot én eller flere mikroorganismer. En slik fremgangsmåte er den som er anbefalt gjennom International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson and Sherris, Acta. Phatolo<g>ica et Microbiolo<g>ia Scandinav, Suppl. 217, Seksjon B: 64-68 [1971], og benytter BHI-agar (brain heart infusion) og en inokulum repliserende anordning. Vekstrør dyrket over natten fortynnes 100 ganger for bruk som standard-inokulum (20.000-100.000 celler i ca. 0,002 ml anbringes på agaroverflaten; 20 ml BHI-agar/skål). Tolv dobbelte fortynninger av testforbindelsen benyttes med en initial konsentrasjon av testmedikament på 2 00 /xg/ml. Enkelt-kolonier oversees når skålene avleses etter 18 timer ved 37°C. Susceptibiliteten (MIC) av testorganismen aksepteres som den laveste konsentrasjon av forbindelsen som er i stand til å gi fullstendig hemming av veksten ved vurdering med det blotte øye. Som andre polycykliske eter-antibiotika oppviser foreliggende forbindelse med formel (I) typisk gram-positiv antibakteriell aktivitet, så vel som aktivitet overfor Treponema hyodysenteriae, (årsaken til svinedysenteri) som illustrert i Tabell (I).

Effektivitetsdata for forbindelsen med formel (I) og dens salter overfor kokkidiale infeksjoner i høns, oppnås gjennom følgende metode. Grupper på 3-5 ti dager gamle patogenfrie hvite italiener hanekyllinger ble foret med en oppmoset diett inneholdende (I) eller dens natrium- og/eller kaliumsalt jevnt dispergert i denne. Etter å ha vært på denne rasjon i 24 timer, ble hver kylling inokulert per os med oocyster av den spesielle art av Eimeria som skal testes. Andre grupper av 3-5 ti dager gamle kyllinger fores med en tilsvarende oppmoset diett uten forbindelse (I) eller dens salter. De infiseres også etter 24 timer og tjener som infiserte kontroller. En annen gruppe på 3-5 ti dager gamle kyllinger fores med den samme mos-diett uten antibiotikum og infiseres ikke med coccidia. Disse tjener som normale kontroller. Resultatene av behandlingen vurderes etter 5 dager for E. acervulina og etter 6 dager for alle øvrige organismer.

Kriteriene som benyttes for å måle antikokkidial aktivitet består av lesjonsgraderinger fra 0 til 4 for E. tenella etter J. E. Lynch, "A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res. , 22., 324-326, 1961;

og 0 til 3 for de øvrige arter basert på modifikasjoner av graderingssystemet utviklet av J. Johnson og W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit. , 28., 30-36, 1970. Aktiviteten måles ved å dividere lesjonsgraderingen for hver behandlet gruppe med lesjonsgraderingen for den infiserte kontrollgruppe. Ved denne undersøkelse oppviser forbindelsen (I) og dens katoniske salter, utmerket aktivitet mot Eimeria tenella, E. acervulina. E. maxima. E. brunetti og E. necatrix infeksjoner hos fjærfe ved inkorporering i oppmoset diett til kyllinger i nivåer på ca. 1,0 til 25 ppm. Mot en følsom E. tenella oppviste forbindelsen med formel (I) for eksempel 100% lesjonskontroll ved så lave doser som 5 ppm.

Foreliggende forbindelse med formel (I) er også generelt anvendelig i kombinasjon med visse andre kjente antikokkidiale midler, så som nicarbazin, 4,4'-dinitrokarbanilid eller et naftalenamin, i henhold til Hamill et al., US-patent 4.582.822, sitert ovenfor.

For å hindre eller kontrollere coccidiose i fjærfe, gis forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen oralt til fjærfe i et passende bæremiddel. Medikamenteringen kan hensiktsmessig skje gjennom drikkevannet i foret slik at en terapeutisk dose av midlet inntas med den daglige vann- eller forstoff-rasjon. Midlet kan måles direkte inn i drikkevannet, fortrinnsvis i form av et flytende konsentrat eller tilsettes direkte til foret som sådant, eller i form av en forblanding eller et konsentrat. En forblanding eller et konsentrat av det terapeutiske midlet i en bærer, benyttes vanligvis for inkludering av midlet i foret. Det terapeutiske midlet kan være i tilnærmet ren form (f.eks. den frie syre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav), i analysert rå form, så som fuktig eller tørt mycel eller tørket helbuljong. Egnede bæremidler er flytende eller faste, som vann eller forskjellige former av mel; for eksempel soyamel, linfrømel, maiskolbemel og mineralblandinger som vanligvis benyttes i for til fjærfe. Et spesielt effektivt bæremiddel er fjærfe-foret selv; det vil si en liten porsjon av fjærfe-for. Bæremidlet letter den jevne fordeling av virkestoffene i det ferdigstillede for som forblandingen blandes med. Dette er viktig i og med at det bare trengs små mengder av de foreliggende potente midler. Det er viktig at forbindelsen blandes grundig inn i forblandingen og senere i foret. I denne forbindelse kan midlet dispergeres eller oppløses i et passende oljeaktig bæremiddel så som soyaolje, maisolje, bomullsfrøolje og lignende, eller i et flyktig organisk oppløsningsmiddel og deretter blandes med bæremidlet. Innholdet av virkestoff i konsentratet kan selvsagt variere betydelig siden mengden av middel i det endelige for kan justeres ved å blande den passelige mengde av forblanding med foret for å oppnå et ønsket nivå av terapeutisk middel.

Høypotente konsentrater blandes av forprodusenten med

proteinholdige bæremidler, så som soyabønnemel og andre mel nevnt ovenfor, for å gi konsentrerte supplement egnet for direkte foring til fjærfe. I så fall gis dyrene anledning til å innta den vanlige diett. Alternativt, tilsettes slike konsentrerte supplementer direkte til hønseforet for å gi et næringsmessig balansert, ferdig for som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av én eller

o

flere av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen. Blandingene homogeniseres grundig etter vanlige fremgangsmåter, så som i en V-blander.

For bruk i fjærfehold vil bruksnivåene av de her beskrevne forbindelser variere med omstendighetene. Kontinuerlig lavnivå-medikamentering under oppvekstperioden, det vil si under kyllingenes første 5 til 12 leveuker, er en effektivt profylaktisk forholdsregel. Ved behandling av etablerte infeksjoner kan høyere nivåer være nødvendig for å overvinne infeksjonen. Bruksnivået av forbindelse (I) i for vil generelt ligge i området fra ca. 1,0 til 25 ppm, fortrinnsvis i området fra ca. 2,5 til 12,5 ppm. Administrert i drikkevann, vil nivået tilsvare det som vil gi den samme daglige medikamentdose multiplisert med vektforholdet mellom et gjennomsnittlig daglig forinntak og det gjennomsnittlige daglige vanninntak.

Aktiviteten av forbindelsen med formel (I) og dens salter ved å fremme vekst og/eller øke effektiviteten av forutnyttelsen i svin eller storfe, kan måles direkte ved å fore grupper av forsøksdyr med ulike nivåer av forbindelse (I) eller et salt derav i foret. Alternativt, gir Britisk patent 1.197.82 6 en detaljert beskrivelse av en in vitro vom-undersøkelsesmetode for antibiotika i forstoffer.

Ved bruk for å hindre eller behandle svinedysenteri, eller for å fremme vekst og/eller øke forutnyttelseseffekten i storfe eller svin, gis forbindelsen med formel (I) eller et salt, fortrinnsvis som fortilsetning. Forblandingene fremstilles etter fremgangsmåter som er helt analoge med de som tidligere er utførlig beskrevet for fremstilling av fjærfefor og under iakttagelse av de samme regler for å fremstille for, hvor det terapeutiske midlet er jevnt dispergert. Bruksnivået av forbindelse (I) i storfe- eller svinefor vil i alminnelighet ligge i området fra ca. 0,25 til 25 ppm. I drøvtyggere kan forbindelsen med formel (I) også administreres oralt i form av en bolus som holdes igjen i vomma, hvorunder det terapeutiske middel frigjøres med tilnærmet konstant hastighet over et lengre tidsrom, f.eks. 4-8 uker, for å gi en dose tilsvarende den ovenfor omtalte daglige dose i foret, dvs.:

Eksempel på en slik kontrollert bolusfrigjøring er den angitt av Cardinal, US-patent 4.601.893.

Foreliggende oppfinnelse er illustrert gjennom de etter-følgende eksempler. Det er imidlertid underforstått at oppfinnelsen ikke er begrenset til spesifikke detaljer i disse eksemplene.

EKSEMPEL 1

Fermentering av Actinomadura sp. ATCC 53708

Isolering av forbindelse ( I) som natriumsaltet

Actinomadura sp. ble først dyrket ved inokulering av faste medier på skråkulturer eller Roux flasker med ATCC 53708 kulturen, ved bruk av ATCC medium nr. 172, fremstillet og med sammensetning som følger:

I mellomtiden ble rystekolber forberedt ved å benytte ett av følgende medier:

100 ml av mediet ble fordelt på 300 ml rystekolber og sterilisert ved 120°C ved 1 kg/cm<2> i 30 minutter. Etter avkjøling ble mediet inokulert med en vegetativ cellesuspensjon avskrapet fra den ovennevnte Actinomadura sp. skråkultur. Kolbene ble ristet ved 28°C på en ristemaskin med en forskyvning på 4-6 cm og 150-200 cpm (cycles per minute) i 5 til 7 dager.

I mellomtiden ble det klargjort 5 liters fermenteringsbeholdere som inneholdt 3 liter av en av ovennevnte C eller JDYTT medier eller det følgende medium:

Et antiskum-middel (polypropylenglykol, P2000, inneholdende 10 vekt% etylenoksyd, 1 ml) ble tilsatt og beholderne forseglet og sterilisert ved 120°C under 1 kg/cm<2> i 45 minutter. Beholderne ble deretter inokulert med en rysteflaske (ca. 3% inokulum), fermentert i 120 til 168 timer ved 30°C under omrøring med 1700 omdreininger per minutt (RPM) med en volumdel luft per volumdel væske per minutt.

Etter at fermenteringen var fullført (basert på en antibiotisk platebestemmelse overfor B. subtilis ATCC 6633) ble fermenteringen stanset og fermentorinnholdet filtrert ved nøytral pH ved hjelp av kiselgur. Filterkaken ble oppslemmet i metanol, konsentrert i vakuum, fortynnet med 2-3 volumer vann og deretter ekstrahert 2 x med 1/3 til 1/2 volum enten av metylisobutylketon eller n-butanol. Oppløsningsmiddel-laget ble fraskilt fra den vandige fase ved avsugning eller sentrifugering, "sparkled" og konsentrert i vakuum for å gi antibiotikumet med formel (I) i rå form som en viskøs olje.

Bioaktiviteten i buljongen og senere påfølgende gjenvinnings-strømmer kan følges ved bruk av en følsom stamme av Bacillus subtilis ATCC 6633 eller Staphylococcus aureus ATCC 6538. Komponentene i buljongen og gjenvinningsstrømmer kan visualiseres ved bruk av Analtech silikagel GF plater ved bruk av etylacetat som eluent. De utviklede plater påsprøytes vanillinreagens (3 g vanillin i 75 ml etanol og 25 ml 85% fosforsyre) og oppvarmes til 80°C. Antibiotikaproduktet med formel (I) fremkommer som en purpurfarvet flekk. Den utviklede tlc-plate kan også gis et topp-lag med agar podet med S. aureus eller B. subtilis som er blitt tilsatt 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid-monohydrat og inkubert ved 37°C i 16 timer for fremkalle antibiotikaet (hvite flekker mot rosa bakgrunn).

Oppskalering til store fermenteringsbeholdere ble foretatt ved å fremstille rystekulturflasker inneholdende 0,7 liter C eller JDYTT medium. Rysteflaske-inokulatet ble fermentert i 5 til 7 dager ved 28°C og benyttet til inokulering av en 200 eller en 6000 liter fermenteringsbeholder inneholdende henholdsvis 100 eller 4000 liter UK1-2 medium. Ca. 1 liter inokulum ble benyttet for hver tank. Etter gjæring i 7 til 10 dager, ble fermentorene høstet.

Hele fermenteringsvæsken fra den minste fermentor ble ekstrahert med 50 liter metylisobutylketon ved nøytral pH. Det organiske ekstrakt ble konsentrert under vakuum på en "cyclone still and rotary evaporator" til en olje. Oljen ble kromatografert to ganger på 500 g silikagel av kromatografikvalitet oppslemmet i heksan. Den første kolonnen ble eluert med etylacetat og den andre med 1:1 CHC13:aceton. Produktholdige fraksjoner ble påvist ved tic ved bruk av den ovenfor beskrevne metode. Virksomme fraksjoner fra den andre silikagelkolonnen ble tilslutt kromatografert på florisil ved bruk av CHC13:CH30H 19:1 som eluent. Produkt-fraksjoner ble kombinert, ristet med fortynnet H3P04 og deretter med dibasisk natriumfosfat-buffer for å danne natriumsaltet, tørket over Na2S04, avdrevet og residuet krystallisert fra eter for å isolere natriumsaltet av forbindelsen med formel (I),

915 mg; smp. 245-249°C,

[a]D<25> =-19,0° (c = 1, CH30H) .

Analyse beregnet for C^H^O^Na:

C, 62,47; H, 8,97.

Funnet: C, 62,89 ; H, 9,22.

C-13 NMR [kjemiske skift (ppm) i CDC13 med hydrogenantallet i parentes]: 182,8 (0), 110,0 (0), 106,0 (0), 99,1 (1), 87,2 (1), 86,9 (0), 86,2 (1), 86,2 (0), 84,8 (1), 83,4 (0), 82,6 (1),

80.2 (1), 78,5 (1), 75,2 (1), 74,8 (1), 74,6 (1) 66,4 (1),

60.3 (3), 57,9 (3), 56,9 (3), 44,5 (1), 39,0 (1), 36,9 (1),

36,8 (2), 35,9 (2), 35,4 (2), 35,2 (2), 35,1 (1), 35,0 (1),

31,3 (2), 30,9 (2), 30,5 (1), 28,2 (3), 27,1 (2), 26,1 (2),

25.0 (3), 21,0 (3), 18,3 (3), 16,7 (3), 15,3 (3), 13,4 (3),

13.1 (3), 11,2 (3), 10,7 (3) og 10,6 (3).

Opparbeidning av innholdet av den store fermenteringstanken ble foretatt ved å ekstrahere de ca. 4000 liter helbuljong med 1800 liter metylisobutylketon, fraskille oppløsningsmidlet på en Podbielniak-ekstraktor og konsentrere oppløsningsmidlet til en tynn sirup i vakuum. Konsentratet ble triturert to ganger med et like stort volum ren metanol, separert fra den metanol-uoppløselige olje og metanol-trituratet konsentrert i vakuum til en sirup. Sistnevnte ble ekstrahert 2 x med heksan og de kombinerte heksan-ekstraktene ekstrahert med acetonitril. Acetonitrilet ble holdt tilbake for senere gjenvinning. Heksanoppløsningen ble deretter konsentrert i vakuum og deretter satsvis kromatografert på silikagel. Silikagelen ble desorbert på en filtertrakt, først med heksan og deretter med metylenklorid, etylacetat og tilslutt med aceton. Virksomme fraksjoner som befant seg i CH2C12 og etylacetat eluatene, ble konsentrert, oppløst i heksan og vasket med surt vann, deretter ekstrahert med 1% N-metyl-D-glukamin i vann. Den vandige fase ble utsaltet med natriumklorid og ekstrahert to ganger med et like stort volum etylacetat. De organiske lag ble kombinert, behandlet med aktivkull, filtrert, vasket med pH 9,0 natriumfosfat-buffer, tørket over natriumsulfat, konsentrert i vakuum og krystallisert fra eter for å gi 50,8 g av natriumsaltet som var identisk med produktet fra fermentering i den mindre skala.

EKSEMPEL 2

Forbindelse ( I) i fri s<y>reform

Den frie syreform av antibiotikaet med formel (I) ble fremstillet ved kraftig risting av en kloroformoppløsning av natriumsaltet med et like stort volum saltsyre ved pH 2 i en skilletrakt. Fasene ble separert og kloroformlaget ble vasket med vann og deretter inndampet under vakuum for å gi den frie syre: smp. 87-90°C; [a]D<25> = -6,9° (c = 1, metanol).

Analyse beregnet for C45<H>78014 . 0,5 H20:

C, 63,43; H, 9,34

Funnet: C, 63,35; H, 9,53.

EKSEMPEL 3

Natriumsaltet av forbindelse ( I)

Den frie syren fra foregående eksempel (45 mg) ble oppløst i 100 ml kloroform. En oppløsning av natriumkarbonat (0,5 g) i vann (100 ml) ble tilsatt og den rsulterende blanding deretter anbragt i en skilletrakt og ristet kraftig i flere minutter. Kloroformlaget ble fraskilt og det vandige lag vasket med frisk kloroform. De kombinerte kloroformekstraktene ble tørket over natriumsulfat, filtrert og inndampet for å gi 41 mg av natriumsaltet;

smp. 230-235°C.

Analyse beregnet for C45H77<0>14Na:

C, 62,47; H, 8,97

Funnet: C, 62,20; H, 9,14.

EKSEMPEL 4

Rubidiumsaltet av forbindelse ( I)

For å fremstille rubidiumsaltet av forbindelse med formel (I) ble den frie syre (30 mg) oppløst i 50 ml kloroform. Ribidium-karbonat (35 mg i 25 ml vann) ble tilsatt til kloroformen, hvorpå blandingen ble omrørt i 2 timer. Den organiske fase ble fraskilt og det vandige lag ekstrahert med et like stort volum kloroform. De kombinerte kloroformekstrakter ble inndampet for å gi et hvitt faststoff. Rubidiumsaltet ble omkrystallisert ved langsom inn-dampning fra eter, og røntgen-strukturen ble bestemt på de resulterende krystaller av Dr. J. Bordner.

EKSEMPEL 5

Kalsiumsaltet av forbindelse ( I)

For å fremstille kalsiumsaltet av den antibiotiske forbindelse med formel (I), ble 13 0 mg av den frie syre oppløst i 100 ml kloroform. K2C03 (100 mg) i 100 ml H20 ble tilsatt og den resulterende blanding omrørt i flere minutter og deretter anbragt i en skilletrakt og kraftig ristet i flere minutter. Den organiske fase ble fraskilt og inndampet under vakuum for å gi forbindelsen (I) som et hvitt pulver; smp. 255-260°C,

[a]D<25> = -19,6° (c = 1, kloroform).

Analyse beregnet for C45H77014K:

C, 61,34; H, 8,81

Funnet: C, 60,91; H, 8,83.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel hvor Me=CH3, eller et farmasøytisk akseptabelt kationisk salt derav, karakterisert ved fermentering av Actinomadura sp. ATCC 537 08 under submerse aerobe betingelser i et vandig næringsmedium omfattende en assimilerbar karbon- og nitrogenkilde inntil en isolerbar mengde av den nevnte forbindelse er dannet, og forbindelsen separeres fra fermenteringsmediet ved konvensjonelle metoder.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen isoleres i form av sitt natrium- eller kaliumsalt.