JPH0674B2

JPH0674B2 - 化合物ｕｋ−６１，６８９の製法及び該化合物産生菌

Info

Publication number: JPH0674B2
Application number: JP63270625A
Authority: JP
Inventors: エドワード・ジョゼフ・タイナン・ザ・ザード
Original assignee: Pfizer Corp Belgium
Current assignee: Pfizer Corp Belgium
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: EP0314330B1; HUT50360A; EP0314330A2; DK591388D0; CA1340204C; AU2432488A; AU598160B2; PL160804B1; US5679563A; CN1089652A; YU198888A; US5602012A; PL275509A1; ZA887926B; DK171880B1; HU201805B; PH26344A; DK591388A; DE3884741T2; IE61961B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、以前は化学的方法によってのみ入手した酸性
多環式エーテル抗コクシジウム抗生物質であるＵＫ−６
１，６８９を産生する微生物学的方法に関する。より詳
しくは、本発明は、アクチノマジュラ・ロセオルファ(A
ctinomadura roseorufa)ＡＴＣＣ５３，６６６；５３，
６６５；および５３，６７４を培養することによってＵ
Ｋ−６１，６８９を発酵的に産生させる方法に関する。

１９８６年１月２２日公告のＥＰ−0169011は、水性栄
養培地中深部好気条件下にアクチノマジュラ・ロセオル
ファ(Actinomadura roseorufa)フアン(Huang)新種(sp.n
ov.)ＡＴＣＣ39,697を培養することによって産生された
多環式エーテル抗生物質ＵＫ−５８，８５２を産生する
ことを記載している。

ＵＫ−６１，６８９、すなわちモノグリコン酸性多環式
エーテルは式（Ｉ）を有する。

ＵＫ−５８，８５２、すなわち式(II)を有するジグリコ
ン多環式エーテルの選択的酸加水分解によるＵＫ−６
１，６８９の製造方法は１９８６年８月１日付出願の英
国特許出願第8618844号に記載されている。

この出願に記載の方法は、ＵＫ−５８，８５２の酸加水
分解好ましくは、アセトニトリとの水の混合物中、室温
でｐ−トルエンスルホン酸とＵＫ−５８，８５２のナト
リウム塩とを１：１の当量比で使用することからなる。

ＵＫ−５８，８５２はそれ自体有効な抗生物質、特に抗
コクシジウム剤であるが、その製造方法は１９８６年１
月２２日付けヨーロッパ出願169011に記載されている。
この化合物は、アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actin
omadura roseorufa)フアン(Huang)新種(sp.nov)ＡＴＣ
Ｃ39,697を水性栄養培地中深部好気発酵によってつくら
れる。２つの関連する少量成分もＵＫ−58,852と共に生
成し、各々コクシジウム症を抑制するのに抗生物質的に
有効である。ＣＰ−７０，２２８およびＣＰ−７０．８
２８として示される２つの少量成分は上記(II)のうち、
ＲがＨでＲ^１がＣＨ_３；およびＲとＲ^１が各々ＣＨ_３で
あるものである。

本発明は、アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actinomad
ura roseorufa)ＡＴＣＣ53,666の突然変異を水性栄養培
地中深部好気条件下に培養することからなる、価値ある
酸性多環式エーテル抗生物質であり有効な抗コクシジウ
ム剤であるＵＫ−６１，６８９の微生物による製造方法
に関する。特に、アクチノマジュラ・ロセオルファ(Act
inomadura roseorufa)ＡＴＣＣ53,666から誘導された突
然変異菌株ＡＴＣＣ５３，６７４および５３，６６５に
関する。これらの菌株はＵＫ−６１，６８９とともにＵ
Ｋ−５８，８５２を生成する能力がある。またＡＴＣＣ
５３，６６５の突然変異菌株であるアクチノマジュラ・
ロセオルファ(Actinomadura roseorufa)ＡＴＣＣ53,664
は、実質的にＵＫ−５８，８５２を含まないＵＫ−６
１，６８９を生成する能力を特徴とする。

ＵＫ−６１，６８９およびＵＫ−５８，８５２産生微生
物は日本の熊本県やまえ村で集めた土壌サンプルから単
離された新しいアクチノマジュラ・ロセオルファ菌株で
ある。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジ
ン（ＮＴＧ）を突然変異剤として使用した。処理された
微生物の単一コロニーＵＫ−６１，６８９産生能につい
て検査した。一般的方法は、ＡＴＣＣ５３，６６６を水
性栄養培地中深部好気条件下に２８℃で振とう培養する
ことからなる。生育段階のための培地の選択は臨界的で
はない。セレロース(10.0g)、コーンスターチ(5.0g)、
コーンスティープリカー(5.0g)、ＮＺアミンＹＴＴ(5.0
g)（フムコ・シェフィールド・ケミカル社(Humko Sheff
ield Chemical Co.,Inc)のカゼイン酵素分解物の登録商
標）(5.0g)および塩化コバルト(0.002g)を水酸化ナトリ
ウムｐＨ7.0に調整した１リットルの水に懸濁し、フェ
ーンバッハ(Fernbach)フラスコに８００mlを入れた。
オートクレーブ滅菌後、フラスコに斜面生育懸濁物ある
いは凍結植物性菌糸を接種し、約２００回転／分、２８
℃で８日間振とう培養した。次いで５０mlずつとり出し
て、菌糸をテフロンペストル組織破砕器次いで超音波破
砕によりホモジナイズした。破砕された菌糸を次いで遠
心分離し、洗つて培地を除き、３００mlのエルレンマイ
ヤーフラスコ中の５０mlの新鮮な培地に再懸濁し、３２
℃で２時間振とうし、その後細胞を再び遠心分離し、滅
菌水で培地を洗い落し、pH9.0のトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−マレイン酸塩緩衝液５０mlに懸濁
した。この懸濁液を少量ずつ７５０mcg〜１５００mcg／
mlの濃度の突然変異剤で１時間回転水浴振とう器上で２
５０〜３００回転／分３４℃で処理した。処理後、細胞
を遠心分離し、突然変異剤を滅菌水で洗い落し、新しい
生育培地の入ったフラスコに懸濁し、３２℃でたて型振
とう器生育させた。３日後、菌糸生育物をホモジナイズ
し、超音波処理した。超音波処理物少量ずつを連続的に
希釈し、固体栄養培地上に塗布し、これらのプレートを
２８℃で、コロニー形成ユニットが斜面に移すに充分な
サイズになるまでインキュベートした。プレートおよび
斜面（スラント）に適した培地はＮ−ＺアミンタイプＡ
（Ｎ−ＺＡｍｉｎｅＴｙｐｅＡ）（フンコ・シェフィ
ールド・ケミカル社）を含有するＡＴＣＣメディアムN
o.１７２を1.0g/lに希釈したものである。植え付けたス
ラントを、実験の準備ができた時点から１０日から１４
日間２８℃で培養した。これは、適当な培地（例えば、
セルロース、45.0g；大豆粉末、10.0g；トウモロコシ浸
出液、15.0g；ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ，0.1g；ＭｇＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏ，0.1g；塩化コバルト、0.002g；炭酸カルシ
ウム、3.0g；を含む１リットルの水溶液で、培地のpHを
7.0に合わせたものなど）を２５ml含む３００mlエルレ
ンメイヤー(Frlenmeyer)フラスコに植えることによって
行なった。１２１℃、３０分間の圧熱滅菌による滅菌
後、フラスコに個々のスラント培養懸濁液を注入し、ニ
ユー・ブランスウィック・シェーカー(New brunswick s
haker)で２８℃で振とうしながら７日間インキュベート
した。

突然変異体培養液ＦＤ−28454（ＡＴＣＣ53,674）は、
展開した薄層クロマトグラフィー板（シリカゲル）にバ
ニリン試薬を噴霧し、１００℃で５分間熱した後、回収
した全培地のメチルイソブチルケトン抽出物を調べるこ
とにより検出した。展開系は９容のクロロホルムと、１
容のメタノールからなり、ＵＫ−６１，６８９に対して
は〜0.3、ＵＫ−58.852に対しては〜0.65のＲｆ値を与
える。上記のように得られた突然変異体培養液は、ＵＫ
−61,689およびＵＫ−58,852の混合物を産生する。ＵＫ
−61,689／ＵＫ−58,852の比は、発酵の条件に多少依存
して変動するようである。上記のように得られた突然変
異体の形態学的および培養上の性質は、実質的にここで
Ａ．ロセオルファＡＴＣＣ53,666に関して述べたものと
同様である。この変異体の特有の性質は、ＵＫ−61,689
とＵＫ−58,852の混合物を産生する能力であり、ここで
ＵＫ−61,689が主産物である。変異体の培養と抗生物質
ＵＫ−61,689の単離は、ポリエーテル抗生物質を得る既
存の発酵で用いられたものと同様の条件下で実施し得
る。例えば、米国特許第４，３６１，６４９号参照。培
養は、２４℃から３６℃の温度で攪拌しながら、望まし
くは水中好気条件下で、液体培養培地で行なうことが望
ましい。培養に有用な栄養培地は、糖、スターチ、およ
びグリセロールなどの消化可能な炭素源；カゼイン、酵
素で切断したカゼイン、大豆粗挽粉、綿種粗挽粉、ピー
ナツ粗挽粉、小麦グルテン、肉粗挽き、魚粗挽きなどの
有機窒素源を含んでいる。穀物可溶物、魚粗挽き、綿種
粗挽粉、酵母抽出物などの増殖物質源、および、塩化ナ
トリウムや炭酸カルシウムなどの金属塩、鉄、マグネシ
ウム、銅、亜鉛、コバルト、およびマンガンなどの微量
元素も、使用すると良好な結果が得られる。発酵時に過
剰の泡が生じた場合には、植物油ありはシリコンなどの
抗発泡剤を発酵培地に添加してもよい。水中増殖のため
の容器中の培地の通気は、一分あたり発酵培地単位体積
あたり1/2から２倍量の割合で滅菌した空気を散布器を
通して培地中に導入することが望ましい。振とうは、発
酵の分野の技術に熟達したものには一般になじみのある
振とう器によって維持することができる。振とうの速度
は用いる振とう器の型に依存す。発酵器は通常３００か
ら１７００回転毎分で稼働しているのに対して、振とう
フラスコは通常１５０から３００回転毎分で使用する。
無菌状態はもちろん生物体の転移およびその増殖の間、
維持されなければならない。

本発明の抗生物質の調製のための接種物は、培養液のス
ラント、あるいは培養液を植えたルー(Roux)ボトル、あ
るいは培養液の解凍した菌糸からの培養を行なうことに
よって得られる。スラントおよびルー・ボトルの該生物
の最初の培養に適した固体培地は、ＡＴＣＣ培地No.１
７２である。突然変異体の研究に関して上で述べた液体
培地は、凍結に先立つ生長菌糸の調製に適当である。培
養したものは、振とうフラスコあるいは注入容器に植え
付けることができ、あるいは、注入容器は振とうフラス
コが植え継いでもよい。振とうフラスコでの最大増殖に
は、通常４日から８日で到達し、水に浸した注入容器に
注入した場合には、通常４日から５日で最も望ましい状
態となる。

発酵の際の抗生物質産生の進展は、上述のバニリン試薬
を噴霧することによって可視化したのち薄層クロマトグ
ラフィーによつて質的に追跡することが可能であり、ま
た、展開した板をバチルス・サブティリス(Bacillus su
btilis)を植えた脳心臓浸出液寒天て上塗りし、１６時
間３７℃でインキュベートすることによって抗生物質を
可視化する事ができる。薄層クロマトグラフィーはま
た、発酵培地からの粗抽出物および精製した抽出物の組
成解析に有効な手段である。１０cm×4.6cmマイクロボ
アＣ−１８カラム、４０／２００／７６０0.01M炭酸ア
ンモニウム／アセトニトリル／メタノール展開相を用い
るＨＰＬＣ法は、屈折指標検出器を用いて発酵培地中の
ＵＫ−61,689および、ともに産生されるＵＫ−58,852の
定量に用いられる。

ここで述べた変異体の発酵によって産生される抗生物質
ＵＫ−61,689は菌糸内および培地内に蓄積し、ろ過して
いない全発酵培地、すなわち全培地を、クロロホルム、
酢酸エチル、メチルイソブチルケトンあるいはブタノー
ルなどの有機溶媒を用い、通常効果があるpHで抽出する
ことにより、分離し、回収することができる。もしく
は、深刻な乳濁をさけるため、菌糸を分離し、該菌糸
と、抽出し透明になった培地を独立に有機溶媒で分離す
る。溶媒抽出液を薄いシロップに濃縮し、純粋なＵＫ−
61,689をクロマトグラフィーによって得る。

抗生物質の典型的な分離法および回収法を以下に示す：
変異体を発酵させた全培地をメチルイソブチルケトンで
抽出した。真空内で抽出物を蒸発濃縮し、赤色の油を
得、酢酸エチルに溶解してシリカゲルのカラムに注い
だ。酢酸エチルでシリカゲルカラムから溶出し、溶出物
を薄相クロマトグラフィーで解析した。ＵＫ−61,689を
含む画分を混合し、蒸発濃縮して乾燥させた。以上のよ
うにして得られたＵＫ−61,689は、イソプロピルエーテ
ルからの結晶化によってさらに精製することできる。

ＵＫ−61,689は、噴霧乾燥を含む既知の方法によって全
培地の蒸発濃縮によって、あるいは、ろ過あるいは遠心
によって培地から菌糸を分離することによって、菌糸と
結合して、発酵液から回収することができる。上記のよ
うに得られた菌糸産物は、菌糸表面およびその間隙にＵ
Ｋ−61,689を含み、菌糸をＵＫ−61,689の有用なキャリ
アにしている。

ＦＤ−28474で表される、上記変異体ＦＤ−28454（ＡＴ
ＣＣ53,674）の単一コロニーを、上記ＦＤ−28454の調
製で述べた方法により、ＮＴＧによって突然変異を誘導
した。この方法により形態学的および培養上の性質は、
アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actinomadura roseor
ufa)ＡＴＣＣ53,666および、当初最初に作成された変異
体と同じである、さらなる変異体（ＦＤ−28499）を得
た。しかし、この変異体（ＦＤ−28499）は、実質的に
ＵＫ−58,852なしに（すなわち、＜１％）ＵＫ−61,689
を産生する点で、変異体ＦＤ−28454と異なっている。
変異体ＦＤ−28499は、第一に記述した変異体（ＦＤ−2
8454）と同様に培養し、上記のように発酵液からＵＫ−
61,689を回収した。

ファイザー社の培養液コレクションでＦＤ−２８４９９
として同定された、この最後の変異体；変異体ＦＤ−２
８４５４；およびＦＤ−２８４７４；および元となった
微生物ＦＤ−２７６８４は、ブダペスト条約の規定に従
い、寄託物の永久の保存が可能であると承認された預託
施設であり、本明細書の特許が承認された場合には、一
般の要請によって容易に入手可能となる米国メリーラン
ド州ロックビル，アメリカン・タイプカルチャー・コレ
クションに寄託された。それぞれ、アクチノマジュラ・
ロセオルファＡＴＣＣ５３，６６４；ＡＴＣＣ５３，６
７４；ＡＴＣＣ５３，６６５；およびＡＴＣＣ５３，６
６６の略号で与えられた。３７ＣＦＲ1.14および３５Ｕ
ＳＣ１２２、本明細書の対応物、あるいは、その子孫が
提出されている国の外国特許法に従って、寄託物は、本
明細書の手続き中は、米国特許および商標局長官にその
権利を与えると決定された者は、入手可能である。寄託
された微生物の一般からの入手に関する全ての制限は、
特許の承認に従い、最終的に解除されるであろう。

ＦＤ−27684、ＦＤ−28474、およびＦＤ−28499の分類
学的な観察がＬ．Ｈ．ファン（Ｌ．Ｈ．Huang）によっ
てなされ、以下の所見を得た。

それぞれの培養液は、ＡＴＣＣ no.１７２培地へスラ
トンから植え継ぎ、振とう器で４日間２８℃で培養し
た。次に、２０分間遠心し、滅菌蒸留水で３回洗浄し、
アクチノミセス目のものの同定に通常使用される培地上
にまいた。

培養液を２８℃でインキュベートし、結果を様々な時
間、最も普通には１４日目に見た。色は、通常の用語法
で記述したが、正確な色は、カラー・ハーモニー・マニ
ュアル、第４版のカラーチップと比較して決定した。完
全細胞アミノ酸分析法は、ベッカー(Becker)ら、Appl.M
icrobiol.,１２，４２１−４２３，１９６４に示された
ものである。完全細胞の糖は、レチェバリヤー(Lecheva
lier),I.Lab.Clin.Men.,７１，９３４−９４４，１９６
８；および、スタネック(Staneck)とロバーツ(Robert
s),Appl.Microbiol.２８，２２６−２３１，１９７４に
示された方法で分析した。比較のために、アクチノマジ
ュラ・ロセオルファＡＴＣＣ39,697のタイプ・カルチャ
ーを用いた。

培養液の解析のために用いた同定培地、および、それら
の組成に関する参考文献を以下に示す：１．トリプトン−酵母抽出物培地−（ＩＳＰ＃１培地，
ディフコ社）。

２．酵母抽出物−マルト抽出物寒天−（ＩＳＰ＃２培
地，ディフコ社）。

３．オートミル−寒天−（ＩＳＰ＃３培地，ディフコ
社）。

４．無機塩−スターチ寒天−（ＩＳＰ＃４培地，ディフ
コ社）。

５．グリセロール−アスパラギン寒天−（ＩＳＰ＃５培
地，ディフコ社）。

６．ペプトン−酵母抽出物銑寒天−（ＩＳＰ＃６培地，
ディフコ社）。

７．チャペック(Czapek)−蔗糖寒天−Ｓ．Ａ．ワックス
マン（Ｗａｋｓｍａｎ），The Actinomycetes,Ｖｏｌ．
２，培地no.、１p.３２８，１９６１。

８．グルコース−アスパラギン寒天−同上，培地no.
２，p.３２８。

９．ベネット寒天(Bennett's Agar)−同上，培地no.３
０，p.３３１。

１０．エマーソン寒天(Emerson's Agar)−同上，培地n
o.１８，p.３３０。

１１．栄養寒天−同上、倍地no. １４，p. ３３０。

１２．ゴードン(Gordon)とスミス(Smith)のチロシン寒
天−Ｒ．Ｅ．ゴードンとＭ．Ｍ．スミス、Ｊ．Bacterio
l.６９：１４７−１５０，１９５５。

１３．カセイン寒天−同上。

１４．リンゴ酸カルシウム寒天−Ｓ．Ａ．ワックスマ
ン、Bacteriol.Rev.２１：１−２９，１９５７。

１５．ゼラチン−Ｒ．Ｅ．ゴードン(Gordon)とＪ．Ｍ．
ミーム(Mihm),Ｊ．Bateriol.７３：１５−２７，１０５
７。

１６．スターチ−同上。

１７．有機硝酸塩培地−同上。

１８．ブドウ糖硝酸塩培地−Ｓ．Ａ．ワックスマン、Th
e Actinomycetes,Vol.２，培地no.１，p.３２８，１９
６１、３gブドウ糖を３０g蔗糖の代わりに用い、寒天を
省いたもの。

１９．バレイショ・ニンジン寒天−Ｍ．Ｐ．レチエバリ
ヤー(Lechevalie),J.Lab.and Clinica;Med.７１：９３
４−９４４，１９６８，ただし、３０ｇバレイショ2.5g
ニンジン、および、２０g寒天のみを使用する。

２０．２％水道水寒天。

２１．ガウゼ(Gauze)＃１金属寒天−Ｇ．Ｆ．ガウゼほ
か、Problems in the Classification of Antagtonisti
c Actinomycetes,English.Ed.,p.１３，１９５７。

２２．ガウゼ＃２有機寒天−同上。

２３．スキムミルク−ディフコ社。

２４．セルロース利用− (a)Ｈ．Ｌ．ジエンセン(Jensen),Proc.Linn.Soc.Ｎ．
Ｓ．Ｗ．５５：２３１−２４８，１９３０。

(b)Ｍ．レビン(Levine)とＨ．Ｗシヨーンライン(Schone
nlein)、A Compilation of Culture Media,培地no.２５
１１，１９３０。

２５．有機酸の利用−Ｒ．Ｅ．ゴードン(Gordon)ほか、
Int.J.Syst.Bacteriol.２４：５４−６３，１９７４。

２６．炭水化物からの酸生成−同上。

２７．馬尿酸（Ｈｉｐｐｕｒａｔｅ）とエスキュリンの
加水分解−同上。

２８．アデニン、ヒポキサンチン、キサンチン、および
尿素の分解−同上。

２９．リゾチームに対する耐性−同上。

３０．炭水化物の利用−Ｃ−２培地，Ｈ．ノノムラと
Ｙ．オハラ、Ｊ．Ferment.Technol.４９：８８７−８９
４，１９７１。

３１．温度範囲−ＡＴＣＣ培地１７２，ＡＴＣＣカルチ
ャー・コレクション・カタログ、１５版，p.６０８，１
９８２。

ＦＤ−27684培養菌の説明酵母抽出物−マルト抽出物寒天−増殖良、桃赤から赤
色、（６1/2ia,7ia,6ia）、隆起、皺がある、白色の空
気中の菌糸を持つ；裏面赤色（７ia）；可溶性色素な
し。

オートミル寒天−増殖普通、クリーム色（２ca）、わず
かに隆起、なめらか、あるいは分離されたコロニーのよ
うに見える；空気中の菌糸は皆無から散在、白色；裏面
クリーム色（２ca）；可溶性色素なし。

無期塩−スターチ寒天−増殖悪から普通、無色からクリ
ーム色（２ca）、薄い、なめらか；空気中菌糸は皆無か
ら散在、白色；裏面は表面と同じ；可溶性色素なし。

グリセロール−アスパラギン寒天−増殖悪から普通、ク
リーム色（２ca）、桃色から赤色の斑点あり（６ea,６1
/2ga）；空気中菌糸皆無から散在、白色；裏面無色から
クリーム色（２ca）、赤色の斑点あり；可溶性色素無
し。

チャペック−蔗糖寒天−増殖悪から普通、クリーム色
（２ca）；桃色から赤色の斑点有り（５eg,６1/2ia）；
空気中菌糸皆無から散在、白色；裏面無色からクリーム
色（２ca）；可溶性色素なし。

ブドウ糖−アクパラギン寒天−増殖普通から良、桃色か
ら赤色（６1/2ga，６1/2na）、隆起；なめらか、顆粒状
から皺あり；空気中菌糸白色から薄桃色（６ea）：裏面
は赤色（６1/2ga，６1/2na）；可溶性色素薄黄色（３c
a）。

ゴードン・スミスチロシン寒天−増殖普通から良、桃
−橙色（５ea）、普通程度に隆起、皺あり；空気中菌糸
皆無から散在、白色；裏面は表面と同じ；可溶性色素黄
色がかかっている（２lc）。

リンゴ酸カルシウム寒天−増殖貧弱、無色、薄い、なめ
らか、空気中菌糸なし；裏面無色；可溶性色素なし。

カゼイン寒天−増殖普通から良、桃−橙色から橙色（４
ia，５ia）、普通程度に隆起、皺あり、空気中菌糸な
し；裏面は黄色から薄桃（３ga，５ea）；茶色（３lc）
の可溶性色素。

ベネット寒天−増殖良、赤色から暗赤色（６1/2ne，６1
/2ng）、隆起、皺あり；空気中菌糸白色から桃色（６e
a）；裏面は赤色（６1/2lc；茶色（３ne）の可溶性色
素。

エマーソン寒天−増殖良から優、橙色（５la，５na）、
隆起、皺あり、白色の空気中菌糸あり；裏面橙色（５i
c）；可溶性色素なし。

栄養寒天−増殖普通、薄橙色（５ea，５ga）、わずかに
隆起、なめらか、あるいは分離されたコロニーのように
見える、空気中菌糸なし；裏面薄橙色（５ga）；可溶性
色素なし。

ゼラチン寒天−増殖普通から良、薄橙色（４ga）、普通
程度に隆起、なめらかから皺あり；空気中菌糸散在、白
色；裏面薄橙色（４ga）；可溶性色素なし。

スターチ寒天−増殖普通から良、薄橙色（５ga）、普通
程度に隆起、なめらかから皺あり；空気中菌糸散在、白
色；裏面は表面と同じ；可溶性色素なし。

バレイショ・ニンジン寒天−増殖悪から普通、クリーム
色から薄桃色（２ca，４ca）、平板からわずかに隆起；
空気中菌糸散在、白色；裏面クリーム色から薄桃色（４
ca）；可溶性色素なし。

水道水寒天−増殖悪、無色からクリーム色（11/2ca）、
平板、なめらか；空気中菌糸散在、白色；裏面は表面と
同じ；可溶性色素なし。

ガウゼ金属培地１−増殖普通、桃色から赤色（５ca，６
la）、赤色斑点あり（６lc）、わずかに隆起、なめら
か；空気中菌糸皆無から散在、白色；裏面は表面と同
じ；可溶性色素なし。

ガウゼ金属培地２−増殖普通から良、桃−橙色（５g
a）、普通程度に隆起、わずかに皺あり；空気中菌糸散
在、白色；裏面は表面と同じ；可溶性色素なし。

形態学的性質−７日間のインキュベーション後、使用し
たいずれの培地でも胞子は見られなかった。バレイショ
・ニンジン培地では、しかしながら、菌糸の隆起が末
端、他方、あるいは中間に作られ；また、単一で、なめ
らかであった。隆起は球形、卵形から楕円形で、直径1.
2-2.5μｍあるいは1.2-2.2×0.9-1.8μｍであっつ。同
様の構造は、酵母抽出物−マルト抽出物寒天、オートミ
ール寒天、水道水寒天、ゼラチン寒天、チャペック−蔗
糖寒天、およびガウゼ金属培地１でも観察された。

生化学的性質−メラニンを産生しない；硫化水素を産生
しない；ゼラチンが液化される；スターチが加水分解さ
れない；硝酸塩が還元されて亜硝酸塩になる；ジェンセ
ン・セルロース培地ではわずかに増殖するが、レビン・
ショーンライン・セロルース培地では増殖しない；双方
のセルロース培地で崩壊しない；ミルクで凝結およびペ
プトン化される；リンゴ酸カルシウムの消化は陰性；チ
ロシン消化陽性；カゼイン消化陽性。

炭水化物利用；グルコース、ラムノース、および蔗糖は
利用される；アラビノース、フルクトース、イノシトー
ル、マンニトール、ラフィノース、およびキシロースは
利用されない。

陽性を示した試験：酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸の
利用：グルコース、ラムノース、マルトース、およびト
レハロースからの酸合成。

以下の試験は陰性であった：アデニン、キサンチン、ヒ
ポキサンチン、および尿素の分解；エスキュリンおよび
馬尿酸の加水分解；リゾチームに対する耐性；安息香
酸、クエン酸、デキストリン、酪酸、リンゴ酸、ムチン
酸、シュウ酸、フェノール、およびコハク酸の利用；ア
ラビノース、フルクトース、イノシトール、マンニトー
ル、ラフィノース、蔗糖、キシロース、アドニトール、
セロビオース、ダルシトール、エリトリトール、ガラク
トース、グリセロール、ラクトース、マンノース、メレ
ジトース、マリビオース、アルファ−メチル−Ｄ−グル
コシド、リボース、サリチン、ソルビトール、ソルボー
ス、およびスターチからの酸合成。

完全細胞分析−完全細胞加水分解物は、メソジアミノピ
メリニン酸、ガラストース、グルコース、マズロース、
リボース、およびラムノースを含む。

温度の関連− ２１℃ ２８℃ ３７℃ ４５℃ 増殖普通増殖良増殖普通増殖しない培養菌ＦＤ−27684は、メラニン産生不能；桃色、桃−
橙色、橙色から赤色の基質菌糸；および、完全細胞構成
物質と同様のメソ−ジアミノピメリン酸とマズロースの
存在によって特徴付けられる。７週間までの長期のイン
キュベーションにも関わらず、培養菌は、いくつかの培
地では菌糸の隆起を示したが、胞子を形成しなかった。
これは、アクチノマジュラ属に帰される。

培養菌ＦＤ−27684は、ほとんどの培養上の性質、およ
びほとんど全ての生化学的性質に関して、アクチノマジ
ュラ・ロセオルファファン(Huang)ＡＴＣＣ39,697
（ヨーロッパ特許出願１６９００１参照）と類似してい
る。ゼラチン寒天とスターチ寒天上では、ＦＤ−27684
のコロニーは、薄クリーム色というよりは、薄橙色であ
る。チロシン寒天およびエマーソン寒天上では、茶色よ
りは橙色気味であった。ＦＤ−27684培養菌は、Ａ．ロ
セオルファとは異なり、ミルクを凝結させた。これらの
相違点は小さなものであり、したがって培養菌ＦＤ−27
684は、Ａ．ロセオルファの新しい株としてみなされて
いる。

親培養菌ＦＤ−27684と比較して、変異体ＦＤ−28474
は、酵母抽出物−マルト抽出物寒天、ベネット寒天、ガ
ウゼ有機培地２、ゼラチン寒天、およびスターチ培地上
で、より少しの空気中菌糸しか形成しない。変異体のコ
ロニーは、エマーソン培地上で、橙色というよりはクリ
ーム色であり、バレイショ・ニンジン培地上では、クリ
ーム色から薄桃色というよりは薄桃色であった。変異体
は、親株とは異なり、硫化水素を産生した。その他の培
養上の性質および生化学的性質は同一であった。以上の
ように、変異体ＦＤ−27474はアクチノマジュラ・ロセ
オルファの新しい株であると考えられる。

変異体のＦＤ−28499は、それが由来する培養菌ＦＤ−2
8474と比較して、ほとんど全ての培養上の性質、およ
び、全ての生化学的性質は共通であった。酵母抽出物−
マルト抽出物寒天上で、暗赤色のコロニーではなく、暗
褐色であること、および、ガウゼ有機培地２上でいくつ
かの桃色の斑点が生じることのみが、変異体がＶＤ−28
474培養菌と異なっているところである。したがって、
変異体ＦＤ−28499は、アクチノマジュラ・ロセオルフ
ァの新しい株として考えられる。

ＦＤ−28454は分類学的研究は行なわなかった。しか
し、ＦＤ−28454はアクチノマジュラ・ロセオルファの
株の一つに由来しており、突然変異によってアクチヨマ
ジュラ・ロセルファの株ば得られているので、アクチノ
マジュラ・ロセルファの一株であると考えられている。

抗生物質ＵＫ−61,689は、多数のグラム陽性微生物の増
殖に対いて阻害的な効果を示す。以下に示す表１に、in
vitro試験の結果を要約した。

この試験のために、それぞれの有機体を、栄養培地と抗
生物質ＵＫ−61,689をさまざまな濃度で含んでいる一連
の試験管に植え、２４時間で有機体の増殖を阻害する最
小の化合物濃度をμg/mlで決定した（ＭＩＣ）。

ＵＫ−61,689およびその塩のチキンのコクシジウム感染
に対する効率のデータは、以下のようにして得られた。
３０−５０日齢の、病原菌に感染していないホワイトグ
ホンのオスのヒヨコのグループに、ＵＫ−61,689あるい
はナトリウムおよび／あるいはカリウム塩を均一に含ん
でいるつぶした餌を与えた。この餌を２４時間与えた
後、それぞれのヒヨコに試される特定の種のエイメリア
(Eimera)の接合子嚢を経口的に感染させた。別の３０−
５０齢のヒヨコのグループは、抗生物質ＵＫ−61,689あ
るいはその塩を含まないような同様のつぶした食物を与
えた。それらも２４時間後に感染させ、感染したコント
ロールとした。さらに別の３０−５０齢のヒヨコのグル
ープには、抗生物質ＵＫ−61,689を含まないような同様
のつぶした食物を与え、コクシジウムを感染させなかっ
た。これは正常なコントロールとした。処理の結果は、
Ｅ．アセルブリナ（Ｅ．acervulina）の場合には５日
後、その他の全ての場合には６日後に評価した。

抗コクシジウム活性の測定を用いた基準は、Ｊ．Ｅ．リ
ンチ(Lynch),"A New Method for the Primary Evaluati
on of Anticoccidila Activity",Am.J.Vet.Res.,２２，
３２４−３２６，１９６１に従い、Ｅ．テネラ（Ｅ．Te
nera）の場合には０から４の障害スコアを、その他の種
の場合は、Ｊ．ジョンソン(Johnson)およびＷ．Ｈ．リ
ード(Reid)，“Anticoccidial Drugs.Lesion Scoring T
echnigues in battery and Floor Pne Experiments in
Chicks",Exp.Parasit,.２８，３０−３６，１９７０に
よつて発案されたスコア系の修飾法に基づいて、０−３
の障害スコアを用いた。感染したコントロールの障害ス
コアでそれぞれ処理したグループの障害スコアを割るこ
とにより、一定の比が得られた。

ＵＫ−61,689およびその陽イオン塩は、食用飼鳥類への
コクシジウム感染に対して優れた効果を示した。１５か
ら１２０ppmのレベルでチキンの餌に混入させた場合に
は、これらの化合物は、エイメリア・テネラ(Eimeria t
enella)、Ｅ．アセルブリナ(E.acervulina)、Ｅ．マキ
シマ(E.maxima)、Ｅ．ブルネッティ(E.brunetti)およ
び、Ｅ．ネカトリックス(E.necatrix)による感染の防止
に効果的であった。

食用飼鳥類のコクシジウム症の治療に用いるためには、
本発明の化合物を適当なキャリアを用いて経口的に投与
する。投薬を単純に、飼料水あるいは飼鳥の餌に混ぜ、
治療用投薬量の日常の水や、飼鳥の食物とともに摂取す
るようにすることが便利である。薬剤は、望ましくは液
体で、水溶性濃縮液の状態で直接飲用水に計り入れる
か、上述のように、あるいは前もって混合したものある
いは濃縮液の形態で直接餌に添加することもできる。治
療用薬剤のキャリア中の前混合液あるいは濃縮液は、通
常、餌内へ試薬を含有させるために用いられる。適当な
キャリアは、液体あるいは固体、望ましくは、水、多様
なミール；例えば、大豆油ミール、亜麻仁油ミール、ト
ウモロコシミール、および通常飼鳥類に用いられるよう
な金属混合液である。特に効果的なキャリアは、飼鳥類
の餌そのものである；すなわち、飼鳥類食物のほんど一
部である。さらに、菌糸をキャリアとして用いることが
可能である。キャリアは、前混合液を混ぜた最終の餌中
に活性のある物質を均一に行き渡るようにする。存在す
る潜在的な薬剤の微少な一部分が必要とされるので必要
である。化合物が前混合液中で、また結果的には餌の中
で十分に混合されていることが重要である。この観点か
ら、薬剤は、大豆油、コーン油、綿種油などの適当な油
性のキャイアあるいは、揮発性の有機溶媒に分散あるい
は溶解させ、キャリアと混合する。最終の餌に含まれる
薬剤量は、適当な比率の前混合液と餌を混合することに
よって望みのレベルの治療用薬剤を得ることができるた
め、濃縮液の活性のある物質の比率は広い多様性を持た
せられることは、理解されるであろう。有効性の高い濃
縮物は、上述のような、大豆油ミールなどのミールのよ
うなタンパク質性のキャリアと、餌製造者によって混合
され、直接に飼鳥類に与えるのに適当な、濃縮添加剤が
作成される。そのような場合には、飼鳥類は通常の餌を
消費することが可能である。あるいは、上記のような濃
縮された添加剤を、直接、飼鳥類の餌に添加し、本発明
の化合物を治療上効果的なレベルで含んでいる、栄養的
にバランスのとれた最終的な餌を調製する。混合物は均
質性を確かなものにするため、ツイン・シェル・ブレン
ダーなどによる、標準的な方法で、完全に混合する。

もちろん、ここで述べた化合物の使用レベルが、異なる
環境下では変動するのであろうことは、本分野の通常の
技術に熟達した者には明かであろう。成長期；すなわ
ち、ニワトリの最初の６から１２週間の、連続的な低レ
ベルの投薬は、効果的な予防手段である。確立された感
染の治療に於いては、高レベルが感染の克服に必要であ
る。餌中の使用レベルは、一般に、１５から１２０ppm
の範囲である。飲用水で投与する場合には、餌の平均消
費量の、平均水消費量に対する重量比によって分配し
て、日常の投与量、すなわち、１５から１２０ppm、が
同レベルになるようにする。

本発明を以下の実施例によって説明する。しかし、本発
明は、これらの実施例の特異的な詳細によって制限され
ないことは、理解されるべきである。

実施例１Ａ．接種材料の調製以下の組成を持つ滅菌した液体培地を調製した。

内容物グラム／リットルセルロース 10.0 コーンスターチ 5.0 コーン浸出液 5.0 ＮＺアミンＹＴＴ^＊ 5.0 塩化コバルト 0.002 ＊（カゼインの酵素分解物の登録商標、フムコ・シェフ
ィールド・ケミカル社）pHを7.0に合わせた後、培地
（８００ml）を２８００mlのフェルンバッハ・フラスコ
に移し、綿栓／紙の蓋をして１２１℃で６０分間滅菌し
た（１５p.s.i.）。冷却後、ＦＤ−28454（ＡＴＣＣ53,
647）のスラントから栄養増殖細胞懸濁液を培地に加え
た。フラスコを、１1/2から２1/2インチ変動するロータ
リー・シエイカーで、１５０から２００回転毎分で６日
間２８℃で振とうした。

Ｂ．発酵とＵＫ−61,689の分離８００mlの培養液を含むフェルンバッハ・フラスコを、
以下の組成の滅菌した培地を８リットル含み、４mlのシ
リコン抗発泡剤を加えてある１４リットルの発酵容器へ
の接種に使用した：内容物グラム／リットルセルロース 45.0 大豆細粉 10.0 トウモロコシ浸出液 15.0 血液ミール 5.0 トウモロコシ粉 5.0 ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ 0.1 ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ 0.1 ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ 0.002 炭酸カルシウム 3.0 pHを6.9-7.0に合わせる発酵は、５００回転毎分で振とうしながら、0.75容の空
気毎培地体積毎分でエアレーションしながら、３０℃
で、実質的な活性が産生されるまで行なった。培地中の
ＵＫ−61,689／ＵＫ−58,852および回収の流れは、９：
１クロロホルム：メタノールからなる系で展開されるシ
リカゲル薄層クロマトグラフィー板を用いて可視可し
た。板にバニリン試薬（１００mlエタノールおよび３％
硫酸中、６gバニリン）を吹き付け、１００℃で５分間
熱した。ＵＫ−61,689は、赤がかった青い点として現わ
れる。あるいは、板をＢ．サブティリスを植えた0.4ml
の２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−塩化テトラゾリウ
ムを加えてある寒天で覆い、３７℃で１６時間インキュ
ベートして、赤色のバックに対して無色の部分として抗
生物質を可視化した。

次に、全培地をメチルイソブチルケトンで抽出し、溶媒
を濃縮して14.4gの残渣を得た。この物質を、酢酸エチ
ル中、カラムグレードのシリカゲルＧ（７０−２３０メ
ッシュ、ウェルム）でパックした６×１００cmのカラム
上でクロマトグラムを行なった。カラムは、酢酸エチル
で流速約２０ml／minで展開した。１０mlづつの画分を
とった。

画分は、９ＣＨＣｌ_３：１ＭｅＯＨで展開するアナル
テク・シリカゲルＧＦ板上で薄層クロマトグラフィーを
行い、バニリン試薬を吹き付け、熱することによって可
視化した。

抗生物質ＵＫ−61,689を含む画分を集め（全体積約２０
０ml）、〜２ｇグルコＧ６０とともに１５分間攪拌し
た。ろ過によってカーボンを除いた後、ろ過液（酢酸エ
チル）をリン酸二ナトリウム、１ＮＮａＯＨでpH10.0に
合わせた５％緩衝液で洗浄した。分離後、酢酸エチル層
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で蒸発濃縮
した。蒸発濃縮後に残った粘性のある油を、小量のヘプ
タンに溶解したところ、結晶化が起きた。結晶をろ過に
よって集め、真空下で乾燥させ、1.4gのＵＫ−61,689を
ナトリウム塩として得た；m.p.１６７℃；Ｃ１３ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ_３），ppmで：179.16，107,54，103.21，97,
80，97.01，87.02，84.65，84.28，82.39，82.10，80.9
2，80.28，79.96，77.62，77.11，76.60，74.91，74.6
5，73.15，70.19，67.74，66.94，59.07，56.84，45.4
9，39.92，39.00，36.55，33.88，33.79，33.63，33.5
1，33.21，32.51，32.33，30.63，27.64，26.98，26.9
1，26.16，23.25，18.43，17.53，17.00，12.13，11.0
5，10.47．ＵＫ−58.852を含む画分を集め、〜２gのダルコＧ６０
で上記のように処理し、濃縮した。残渣をヘキサンに懸
濁し、ろ過じょうご上のシリカゲルでバッチ処理をし
た。結合体をヘキサンで洗浄し、クロロホルムと酢酸エ
チルで溶出した。酢酸エチル画分は、濃縮し、残査をシ
リカ上で再度クロマトグラフにけ、生成物をヘプタンで
結晶化させ、抗生物質ＵＫ−58,852を白色の固体として
得た。

実施例２ＦＤ−28454（ＡＴＣＣ53.674）代わりにＦＤ−28499を
用いて、実施例１と同様のことを行なった。全培地のメ
チルイソブチルケトン抽出物のＨＰＬＣにより、ＵＫ−
61,689を実質的に、ＵＫ−58,852を除く（＜１％）こと
が出来た。そのＴＬＣの挙動は、ＵＫ−61,689に関して
実施例１で報告されたものと同一であった。

ＵＫ−61,689の酸型は、ナトリウム塩のクロロホルム溶
液を等量の水と攪拌し、リン酸でpHを3.0とした。層を
分離し、真空下でクロロホルム蒸発濃縮を行い、抗生物
質ＵＫ−61,689を遊離酸として得た。

実施例３発酵培地がトウモロコシ浸出液あるいは血液ミールを含
まない点を除いて、実施例１の方法でＦＤ−28474（Ａ
ＴＣＣ53.665）を発酵させた。上記の発酵容器４本から
全培地を集め、ろ過した。ろ過液と菌糸をそれぞれメチ
ルイソブチルケトン（３×２００ml）で抽出した。抽出
物を合わせ、減圧下で油になるまで濃縮した。(18.5
g)。油をアセトンに溶かし（２００ml）、溶液を等量に
二分した（ＩおよびII）。

ＩのpHを水酸化ナトリウム（２０％）水溶液を加えるこ
とにより、１２に合わせた。このアルカリ溶液をろ過
し、減圧下で油となるまで濃縮した。アセトン（１０m
l）、ヘプタン（７９ml）、および水（３９ml）を油に
加え、暗褐色の結晶を形成させた。結晶をヘプタンで再
懸濁し、ＨＰＬＣ分析より、７５％ＵＫ−61,689およ
び、５％ＵＫ−58,852を含む、暗褐色の結晶（２ｇ）を
得た。

IIは、減圧下で油となるまで濃縮し、油を酢酸エチル
（１００ml）に懸濁した。それを次に、酢酸エチルを溶
出試薬として用いて、シリカゲル（５００ｇ）のカラム
クロマトグラフィーにかけた。ＵＫ−61,689を豊富に含
む画分を集め、油となるまで濃縮した。油をアセトン
（１０ml）−ヘプタン（１１０ml）に移し、得られたＵ
Ｋ−61,689の結晶をろ過し、乾燥させた(1.2g)。ＵＫ−
58,852は回収されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:03）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＡＴＣＣ53,665、ＡＴＣＣ53,674あるいは
ＡＴＣＣ53,664の同定特性を有するアクチノマジュラ・
ロセオルファ(Actinomadura roseorufa)を、炭素、窒素
および無機塩の資化性源を含有する水性栄養培地中で深
部好気発酵条件下に充分量の下記化合物が全ブロス中に
蓄積するまで発酵せしめることからなる式（Ｉ）：の化合物ＵＫ−６１，６８９の製造方法。
【請求項２】化合物ＵＫ−６１，６８９；が回収される請求項１に記載の方法。
【請求項３】化合物ＵＫ−６１，６８９；が菌糸とともに発酵ブロスにより回収される請求項２に
記載の方法。
【請求項４】アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actinom
adura roseorufa)ＡＴＣＣ53,665またはＡＴＣＣ53,674
を培養することからなる請求項２の方法。
【請求項５】アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actinom
adura roseorufa)ＡＴＣＣ53,664を培養することからな
る請求項２の方法。
【請求項６】ＡＴＣＣ53,665またはＡＴＣＣ53,674の同
定特性を有するアクチノマジュラ・ロセオルファ(Actin
omadura roseorufa)。
【請求項７】ＡＴＣＣ53,664の同定特性を有するアクチ
ノマジュラ・ロセオルファ(Actinomadura roseorufa)。
【請求項８】深部好気発酵条件下に、炭素、窒素および
無機塩の資化性源を含有する水性栄養培地中で培養した
場合化合物ＵＫ−５８，８５２；を実質的に含まない、化合物ＵＫ−６１，６８９；を産生する能力を特徴とするアクチノマジュラ・ロセオ
ルファ(Actinomadura roseorufa)。
【請求項９】アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actinom
adura roseorufa)ＡＴＣＣ53,666を突然変異させること
によって得られ、好気発酵条件下に炭素、窒素および無
機塩の資化性源を含む水性栄養培地中で発酵させると化
合物ＵＫ−61,689；を産生する、アクチノマジュラ(Actinomadura)属に属す
る新規菌株。
【請求項１０】アクチノマジュラ・ロセオルファ(Actin
omadura roseorufa)ＡＴＣＣ53,665を突然変異させるこ
とによって得られ、好気発酵条件下に炭素、窒素および
無機塩の資化性源を含む水性栄養培地中で発酵させると
化合物ＵＫ−58,852；を実質的に含まない、化合物ＵＫ−６１，６８９；を産生するアクチノマジュラ(Actinomadura)属に属する
新規菌株。