PT89615B

PT89615B - Processo de preparacao de um antibiotico de eter policiclico acidico com actividade anticoccidica e promotora do crescimento

Info

Publication number: PT89615B
Application number: PT89615A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; John Philip Dirlam; Junsuke Tone; Walter Patrick Cullen
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1994-01-31
Also published as: HU881739D0; EP0328303A2; DE68905838D1; AU608688B2; PT89615A; PL159781B1; HUT53942A; DE68905838T2; YU28089A; CN1009278B; CA1337337C; NO903459D0; ATE87924T1; IL89148A; DK171135B1; IE62781B1; IL89148A0; JPH0730081B2; HU203789B; DK54889A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

Este invento relaciona-se com o processo para a preparação de um antibiótico de éter policíclico acídico, de fórmula (I):

PFIZER INC.

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE, UM ANTIBIÓTICO DE ÉTER POLICÍCLICO ACÍDICO COM ACTIVIDADE ANTICOCCÍDICA E PROMOTORA DO CRESCIMENTO

-2X

em que Me=CH^. tendo uma estrutura estabelecida por cristalografia de raio-X , e de seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis.0 processo de preparação do composto de fórmula (I) consiste na fermentação de um novo microorganismo, o Actinomadura s p. ATCC 53708, sob condições aeróbicas submersas num nutriente aguoso, gue compreende uma fonte assimilável de carbono e de azoto, até que uma quantidade recuperável do referido composto seja formada.

Este novo antibiótico é útil como um agente anticoccídico em galinhas, na preparação ou tratamento da disenteria em suínos e como promotor do crescimento em gado bovino e suíno

-3vo antibiótico de em

presente invento diz respeito com um noéter policíclico acídico de fórmula:

que Mc=CH tendo a absoluta catiónicos farmaceuticamente esteroquímica '

sais ; com com composições de alimento nutriente que compreendem rido antibiótico, para aves domésticas, gado ou porcos, com a sua utilização como um agente anticoccídico em aves domésticas, no tratamento ou na prevenção da disenteria, em porcos ou como um promotor do crescimento em gado ou em o método de fermentação para a sua preparação ; e organismo Actinomadura sp. que produz o fermentação.

ra no seus o refeporcos, com microcom o referido antibiótico referido método de composto (I) é um novo membro do qrupo éter policíclico acídico de antibióticos.

inclui esses agentes bem conhecidos como a monensina (The Merck índex, lOth Ed., Merk e Co., Inc.

monógrafo no. 6100),

6390 ) , da (loc.

de

Esta família a nigericina (loc. a narasina (loc. cit. , monógrafo cit., monógrafo no. 5204), e cit., monógrafo no. 8193).

, Rahway, N.J., 1983, cit., monógrafo no.

6271), lasalocisalinomicina (loc.

O assunto tem sido revisto por

Westley, Polyether Antibiotics, Adv. Appl. Microbiol., Vol . 22 pp. 177-223 (1977 ). Mais proximamente relacionado estruturalmente com o presente composto é a pontmicina, um antibiótico independentennte descrito por Hamill et al., Aplicação da Patente Europeia 158.179; Tetrahedron Letters, vol. 28, pp. 3357-3360 (1987'·; J. Antibiotics, vol. 40, pp. 237-238 (1987). O último composto possui um hidrogénio alfa no anel B da tetra-hidrofurano, onde o presente composto possui um grupo alfa-metilo. Estes compostos são geralmente conhecidos como coccidiostatos, como promotores do crescimento, aditivos do alimento, e/ou como agentes úteis contra a disenteria em porcos .

Uma cultura de Actinomadura sp.

53708, quando fermentada sob condições aeróbicas em antibiótico de éter policíclico fórmula (I), como especificado anteriorso, produz, um novo

ATCC meio aquoacídico, um compsoto tendo a mente .

O presente invento é dirigido ao referido composto de fórmula (I), incluindo os seus sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis, e a um processo para a sua preparação que compreende a fermentação do referido Actinomadura sp. ATCC 53708 num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte assimilável de carbono e azoto, até que uma quantidade recuperável do referido composto de fórmula (I) seja formada, preferêncialmente sob condições aeróbicas submersas. Para ser utilizado como um agente anticoccídico, na prevenção ou tratamento da disenteria em porcos, e/ou como um promotor do crescimento, o composto (I) não é necessáriamente separado da fermentação e isolado na forma substâncialmente pura, mas'e em alternativa, usado na forma bruta, tanto na forma precipitada misturada com o micélio (recuperado por filtração do meio de fermentação) ou em sólidos obtidos através de secagem por congelamento ou por pulverização do meio de fermentação total.

Os referidos sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, aos de

sódio , de potássio de cálcio, de amónia, de N,N'-dibenzil-etileno diamina, N-metilglucamina (meglumina) e de di-etanolanina. Os sais catiónicos preferidos são os de potássio e de sódio.

O presente invento é também dirigido a composiçoês de alimento nutriente, uma para gado ou porcos, gue compreende o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz, para promover o crescimento e/ou melhorar a utilização do alimento pelo referido gado ou porcos, ou para prevenir ou tratar a disenteria em porcos ; e a outra para aves domésticas , que compreende o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para controlar infecçoês coccídicas nas referidas aves domésticas.

presente invento é ainda dirigido a um método para a promoção do crescimento e/ou aumento da eficiência na utilização do alimento em porcos ou gado, que compreende a administração aos referidos porcos ou gado de um promotor do crescimento ou de uma quantidade promotora de eficiência na utilização do alimento do composto de fórmula (I), particularmente na forma de uma composição de alimento nutriente; a um método para a prevenção ou tratamento da disenteria em porcos, que compreende a administração ao referido porco, de um composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para a prevenção ou tratamento da referida disentria no referido porco; e a um método para o controle de infecçoês coccídicas em aves domésticas, que compreende a administração às referidas aves domésticas de uma quantidade eficaz de agente anticoccídico de composto de fórmula (I) particularmente na forma de uma composição de alimento nutriente.

Finalmente, o presente invento é dirigido a uma cultura biologicamente pura de Actinomadura sp. ATCC 53708, sendo a referida cultura capaz de produzir o composto de fórmula (I) numa quantidade recuperável, por fermentação num meio nutriente aquoso, que compreende fontes assimiláveis

-6de carbono e azoto; incluindo a referida cultura na forma seca por congelamento.

A cultura capaz de produzir o presente antibiótico de éter policíclico de fórmula (I) é designada por Actinomadura sp . , American Type Culture o tipo de cultura sob o seu número de acesso permanência do depósito desta cultura em The Culture Collection, em Rockville, Maryland e e tem vindo a ser depositado em The Collection, Rockville,

Maryland, como

ATCC 53708. A

American Type a sua acessibilidade rápida pelo público são permitidos na sua totalidade durante a vida efectiva da patente, na hipótese da patente ser concedida. O acesso à cultura está disponível durante a de pendência da aplicação sob a referência 37 CFR1, 14 e 35 USC 122. Todas as restrições na disponibilidade ao público da cultura depositada será irrevogavelmente removida por concessão da patente.

Esta nova cultura foi derivada de uma amostra do solo, recolhida em Tuzla, Istambul, Turquia, e identificada na colecção de culturas da Pfizer Inc., como N777-1. A sua descrição e classificação foram fornecidas pelo Dr. L. H. Huang.

descobriu-se que esta culturaproduz dimensões próximas do filamento dos actinomicetos, num mícelio gasoso através do qual cadeias de esporos de pequenas dimensões são produzidas, e um micélio de substrato não fragmentado. Os resultados das análises das células totais ainda indicam que pertecem ao género Actinomadura.

Uma cultura em plano inclinado do microorganismo foi plantada num caldo ATCC 172 e cresceu durante quatro dias a 28°C, num agitador. Foi depois centrifugada durante 20 minutos, lavada três vezes com água destilada estéril , e plantada em meio normalmente usado para a identificação dos membros de Actinomicelos.

-ΊAs culturas foram incubadas a 28 C e os resultados foram lidos a tempos variados, mas mais vulgarmente a quatorze dias. As cores foram descritas na terminologia comum, mas as cores exactas foram determinadas por comparações com amostras de cor de The Color Harmony Manual , quarta edição. Os métodos de análise do açúcar e do amino-ácido da célula total foram os descritos em Becker et al., Appl. Microbiol., vol. 12, pp. 421-423 (1964) e em Staneck et al., Appl Microbiol., vol. 28, pp. 226-231 (1974) e Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., Vol. 71, pp. 934-944 (1968), respectivamente .

A cultura foi identificada da maneira seguinte:

Agar de Extrato de Malte- Extrato de Levedura (meio ISP gçr com pontes cinzentos to 5 ih ,

2, Difco)-Bom crescimento, creme (séries perto do ; nenhum micélio escuros a pretos ml) , expandindo com vincos a escuro, incolor; de creme invertido 2 ca) com pontos pretos (séries perto hum pigmento solúvel.

a amarelado do cinzento cinzengasoso pálido 5 ml ) ;

(2 ca nenDifco) crescimento moderado, creme (2 ca), liso , tido (2 ca);

nenhum micélio gasoso a escasso, pigmento solúvel creme (2 t

expandido, creme inverAgar de amido-sais inorgânicos (meio fino, liso;

invertido

ISP4, Difco)-crescimento pobre, creme (2 ca) nenhum micélio gasoso a escasso, incolor;

creme (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Asparagina-Glicerol (meio ISP

5, Difco)-crescimento pobre a moderado, creme (2 ca), fino, liso, nenhum micélio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Sacarose- Czapela (waksman, The Actinomycetes , v. 2, meio^l, P· 328, 1961)- crescimento moderado a bom, creme (2 ca), moderadamente expandido, liso, nenhum micélio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel .

Agar de Asparagina-Glucose (ibid., meio ^V2)- crescimento moderado, creme (2 ca), fino a moderadamente expandido, liso a com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de tirosina de Smith e Gordon (Go r d o n and Smith, J. Bacteriol., 69:147-150, 1955)- crescimento moderado a bom, creme (2 ca), levemente a moderadamente expandido, liso a com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido (2 ca); pimento solúvel amarelado pálido (2 ca).

Agar de Malato de Cálcio (Waksman, Bacteriol. Rev. 21, 1-29, 1957)- crescimento escasso, creme (2 ca), fino, liso; nenhum micélio gasoso, creme invertido (2 ca) nenhum pigmento solúvel.

Agar de Caseína (Gordon e Smith, Bom crescimento, creme (2 ca), expandido, liso a com nenhum micélio gasoso; amarelado pálido invertido (2 com pigmento solúvel amarelado.

ibid.)rugas, ca) ;

Agar de Bennett (Waksman, loc. cit . , meio=^30, p. 331)- Bom crescimento creme (2 ca), expandido, com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido a amarelado pálido (2 ca, 2 ca); pigmento solúvel amarelado pálido (2 ca).

Agar de Emerson (ibid; meio^28, p. 331) crescimento moderado, creme a amarelado pálido (2 ca, 2 ca); expandido com rugas, nenhum micélio gasoso; amarelado invertido (2 ic); nenhum pigmento solúvel.

Agar Nutriente (ibid., meio4|^14, p. 330 )- Crescimento pobre a moderado, creme (2 ca), fino a expandidc ligeiro; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

teriol.

15-27 ,

Agar de Gelatina (Gordon and

1957)- Bom crescimento, creme

Mihm, J .Bac(2 ca ) , expandido, com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido a amarelado pálido (2 ca, 2 ca); pigmento solúvel amarelado pálido (2 ca).

Agar de Amido (ibid)- Bom crescimento, creme (2 ca), expandido, com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido a amarelado pálido (2 ca, 2 ca); nenhum pigmento solúvel .

Agar de cenoura batata (Lechevalier,

Lab. Clin . Med . ,

71, 934-944,

1968, mas usar unicamente 30g.

de batatas, 2,5g de cenouras e 20g de agar)crescimento pobre a moderado sem branco fino, liso, nenhum micélio gasoso a escasso.

incolor ; incolor invertido a creme (2 ca) ; nenhum pigmento solúvel.

Agar de Água da torneira (2%)- Crescimento pobre creme (2 ca), fino, liso nenhum micélio gasoso a escasso, incolor solúvel.

incolor invertido a creme nenhum pigmento

Meio Mineral 1 de

Gauze (Gauze et

Problems in the

English Ed., p. me (2 ca), fino color ; creme

Classification of Antagonistic 1957)- Crescimento pobre a nenhum micélio gasoso a nenhum pigmento

13, liso ;

al · ,

Actinomycetes, moderado, cref invertido (2 ca);

escasso, insolúvel .

Meio Orgânico 2 de Gauze (ibid.)- Bom crescimento; creme (2 ca), expandido, com rugas, nenhum micélio gasoso; creme invertido a amarelado pálido (2 ca, 2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Propriedades Morfológicas- As propriedades morfológicas foram observadas depois de três semanas de incubação em agar de amido com sais orgânicos; micélio gasoso incolor, branco a creme; cadeias de esporos lineares, curvadas ou enganchadas com dois a nove esporos por cadeia de esporo; esporos esféricos, ovais a elípticos, com diâmetro de 0,8-1,4 micron ou 1,1-1,8xO , 8-1,2 microns; liso como revelado por análise em microscopia electronica.

Propriedades Bioquímicas- A melanina não foi produzida; o sulfito de hidrogénio não foi produzido, a gelatina foi liquidificada; o amido não foi hidrolizado; o nitrato não foi reduzido a nitrito; nenhum crescimento e nenhuma decomposição em ambos caldos de celulose de Jensen ou coagulação e nenhuma caséina foi positiva a digestão do malato a glucose, pede Levine e de Schoenlecn; nenhuma ptonização do leite;

digestão da tirosina cálcio foi negativa, a arabinose, a frutose, o manitol, a ramnose, a sacarose; a filose, a adonitol, a celobiose, o glicerol, a maltose, a ribose, o amido, e a tre-halose foram utilizadas;

a rafinose, o dulcitol, o eritrol, a galactose , a lactose, a malezitose, a melibiose, o alfa-metil-D-glucosía digestão da foi negativa;

Utilização de carbo-hidrato: o manitol, /

de o inositol , a manose, deo, a solicina, o sorbitol e a sorbose não foram utilizados .

Os outros testes positivos incluíram a utilização de acetato e piruvato; hidróli composição de xantina e hipoxantina. Os foram negativos: utilização de benzoato, lactato, malato, mucato, oxalato, fenol, se de esulina , e detestes seguintes citrato, dextrina, propionato e succinato, decomposição da adenina e da tirosina; e hidrólise do hipurato.

Relações de temperatura

21°C 28°C 37°C 45°C

Bom

Crescimento Crescimento

Bom

Crescimento

Bom

Crescimento

Análise da Célula total- Os hidrolisatos da célula

total continham ácido meso-diaminopimélico, glucose galactose, madurose, manose e ribose.

A cultura N777-1 é caracterizada por o micélio de substrato creme; por o micélio gasoso incolor, em pequena quantidade ; por cadeias dos esporos terem uma superfície lisa. Foi utilizado glucose, arabinose, frutose, manitol , ramnose, sacarose maltose, xantina, hidrolisatos da célula ribose, amido a hipoxantina xilose , adonitol, celobiose, glicerol tre-halose, acetato, e piruvato. e a esculina foram decompostas.

total indicam a presença de madurose.

ácido

Os

-diaminopimélico e género pertence no valier .

Deste modo, a cultura N777-1

Actinomadura, como definido por H. LechAs espécies conhecidas de Actinomadura que mostram micélio de substrato creme idêntico e/ou propriedades bioquímicas idênticas incluem _A. cremea subsp. rifamycini, A_. madurae subsp. simaoensis , and A_. routienii: A cultura N777-1 difere da A., cremea subsp. rifamycini nos esporos lisos, no falhanço de reduzir o nitrato, no falhanço de utilização da rafinose, e na utilização da arebinose e da ramnose .

A cultura N777-1 difere da A. madurae subsp. simaoensis no micélio de substrato creme em vez do micélio de substrato castanho laranjado a incolor, no micélio gasoso incolor em vez do micélio gasoso branco rosado a incolor, no falhanço para reduzir o nitrato, no falhanço da decomposição da tirosina, e na capacidade de decomposição de xantina. Em comparação com A^. routienii, difere na sua ausência de pseudosporangia; no falhanço para hidrolizar o amido; no falhanço de coagular o leite; e na capacidade para utilizar o manitol, a frutose, e o glicerol.

A cultura

N777-1 é na maior parte dos testes bioquímicos, idêntica à _A. albolutea mas difere da última

no seu falhanço para hidrolizar o amido, no falhanço para coagular o leite, no micélio de substrato creme em vez de micélio de substrato castanho escuro, e nas cadeias de esporos pequenas em vez de longas.

Na base dos dados apresentados atrás, a cultura N777-1 é considerada como um menbro do género Actinomadura SP: Tem vindo a ser depositada em Type culture Collection sob o número de acesso ATCC 53708.

do presente

O composto antibiótico (I) invento é rapidamente produzido pelo presente Actinomadura sp. através do crescimento a desde cerca de 24° até cerca de 36°C, sob condiçoês submersas, com agitação e aregamento do meio, que consiste em fontes de carbo-hidratos como açucares , amidos glicerol; substancias de azoto orgânico como farinha de feijão de soja, ácidos casamino, extrato de levedura; substâncias de crescimento como grãos solúveis; farinha de peixe; farinha de semente de algodão; sais rios como ferro cobalto, de cálcio como agentes tampão, sido completo, o antibiótico é extração do caldo total tanol, metil-isobutilo, pH desde 4,0 a 8,0; por antibiótico precipitado simplesmente através de verização do caldo total.

caldo seco total é extractado com um dos minerais contendo elementos zinco etc. e carbonatos ou vestigiátosfatos com um cetona

Depois do crescimento ter rapidamente recuperado por solvente orgânico, como n-buou clorofórmio, na gama da f

filtração do micélio, que contem o , sendo o filtrado descarregado , ou secagem por congelação ou por pulEm alternativa, o micélio ou o referidos solventes

O composto antibiótico purificado, se isso for é isolado do extracto orgânico por métodos padrão orgânicos.

desejado, de concentração, de formação de ácido livre ou de sal, tograf ia, abaixo .

cromoprecipitação e/ou cristalização, como exemplificado

Num modo usual de realização da fermentação um inoculo é em primeito lugar, preparado por raspagem de células vegetais, e crescimento num meio adequado, a par-13-

tir de garrafas com plano inclinado ou de Roux , que foi inoculadas com Actinomadura sp. ATCC 53708. As células vegetais resultantes são, por sua vez, usadas para inocular frascos de agitação ou tangues de inoculo, também contendo meio de crescimento adeguado. Em alternativa, os tangues de inoculo são inoculados a partir dos frascos de agitação, a seguir a nm período de crescimento adequado (geralmente de 120 a 144 horas em frascos de agitação e de 168 a 196 horas em tanques de inóculò), um fermentador, também contendo meio de crescimento adequado, é inoculado sob condiçoês asépticas com o caldo vegetal dos frascos de agitação ou dos tangues de inoculo.

Depois de completo o crescimento (geralmente de cerca de 120-196 horas), o composto antibiótico é recuperado na forma bruta ou pura, como desejado, por um ou outro dos métodos na generalidade descritos acima, ou por métodos específicos que estão exemplefiçados abaixo.

O composto de fórmula (I) é testado para a actividade antibactericina in vitro, por método padrão nos quais as concentrações inibitórias mínimas (CIM) em meg/ml contra um ou mais microorganismos é medida. Um desse procedimento é o recomendado por International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson and Sherris, ACta.

Pathologica et Microbiologia Scandinav, Supp. 217, Section B: 64-68 (1971) ), e emprega agar de infusão coração célebro (ICC) e um dispositivo de replicação do inoculo. Tubos de crescimento, durante a noite, foram diluídos 100 vezes serem utilizados como o inoculo padrão (20.000-100.000 0,002ml são colocadas na superfície ICC/prato). Doze diluições 2 empregues, com a concentração 200 mcg/ml. Colónias simples em aproximadamente agar; 20ml de agar composto teste são droga teste ser de zadas quando da leitura dos pratos, depois de 18 37°C.

vezes para células do do inicial da são desprehoras , a

A susceptibilidade (CIM) do organismo teste é aceitado como a concentração mais baixa de composto capaz de produzir

inibição completa do crescimento, julgado a olho nu. Como nos outros antibióticos de éter policíclico, o presente invento de fórmula (I) tipicamente mostra actividade antibacteriana Gram positiva, assim como actividade contra a treponema hyodysenteriae,(o agente causador da disentria em porcos), como ilustrado no guadro (I).

Quadro

Actividade antibacteriana in vitro do composto de fórmula (I)

Organismo	Estirpe N9	CIM, mcg
Clostridium perfringens	10A006	0.39
	10A009	0.20
Actinomyces pyogens	14D002	0.39
	14D008	0.39
	14D011	0.39
Treponema hyodysenteriae	94A001	0.20
	94A002	0.20
	94A007	0.20

Dados de eficiência para o composto de fórmula (I) e para os seus saiç contra infecçoês coccídicas em galinhas, são obtidas pelo método seguinte. Grupos de 3-5 pintainhos galispo de variedade branca, livres de pato genes, com dez dias de idade são alimentados com uma dieta estarem nesta culado per os

Eimeria a ser de mistura contendo o composto (I) ou os seus sais de potássio e/ou sódio, uniformemente dispersos nela. Depois de ração durante 24 horas, cada pintainho é inocom oocistos das espécies particulares de testados. Outros grupos de 3-5 pintainhos com dez dias de idade são alimentados com uma dieta de mistura idêntica, sem o composto (I) ou seus sais. São também infectados depois de 24 horas e servem como controles infectados. Ainda outro grupo de 3-5 pintainhos com dez dias de idade

são alimentados com a mesma dieta de mistura sem antibiótico e não são infectados com coccídico. Estes servem como controles normais. Os resultados do tratamento são avaliados depois de cinco dias no caso do £. acervulina, e de seis dias para todos os outros desafios.

O critério usado para a medição da actividade anticocídica consiste numa escala de lesão de 0 a 4 para E. tenella segundo J. E. Lynch, A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity, Am. J. Vet. Res . , 22, 324-326, 1961 ; e de 0 a 3 para as outras espécies basiadas na modificação do sistema de escala devido a Johnson e W. H. Reid, Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks, Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. A actividade é medida por divisão da escala de lesão de cada grupo tratado pela escala de lesão do controle infectado. Neste teste, o composto (I) e seus sais catiónicos exibem actividade excelente contra infecçoês de Eimeria tenella , E. acervulina, E. maxima, E. brunetti e E. necatrix , em aves domésticas, quando incorporadas na dieta de mistura de galinhas a níveis de cerca de 1,0 a 25 ppm. Por exemplo, contra um E. tenella sensível, o composto da fórmula (I) mostrou um controle em 100% das lesoês em doses tão baixas como 5 ppm.

O presente composto de fórmula (I) é também geralmente útil em combinação com alguns outros agentes anticoccídicos conhecidos, como a nicarbazina, a 4,4'-dinitrocarbonileto ou uma naftalenamina, como definido por Hamill et al . , na Patente N:A. 4.582.822, citada acima.

Para a prevenção ou controle de coccidiose em aves domésticas, o composto deste invento é administrado oralmente a aves domésticas num suporte adequado. Convenientemente, a medicação é simplesmente realizada na água de beber ou no alimento das aves domésticas, de modo a que a dosagem terapêutica do agente seja ingerida com a água ou com a ração

O agente pode ser directamente preferencialmente na forma de um ou adicionado directamente no alimento diárias, das aves domésticas, metido na água de beber, concentrado líquido, tal qual, ou na forma de uma prémistura ou concentrado. Uma pré-mistura ou concentrado do agente terapêutico num suporte, é normalmente empregue para a inclusão do agente no alimento.

terapeútico pode estar na forma substancialmente o áido livre, ou ensaiadora forma

O agente pura (e . g. , aceitável), do ou caldo totalmente seco.

um seu sal farmaceuticamente bruta como micélio seco ou húmiou sólidos, exemplo, linhaça, como farinha farinha adequados são líquidos farinhas variadas; por soja, farinha de óleo e misturas minerais como aves doSuporte desejado, como água, de óleo de feijão de de espiga de milho, os que são normalmente empregues em alimentos para mésticas. Um suporte particularmente eficaz é ele mesmo o alimento das aves domésticas;

aves domésticas.

alimento das uma pequena suporte facilita activos no alimento isto é, porção do a distriacabado com buição uniforme dos materiais o qual a pré-mistura é misturado. Isto é importante porque somente pequenas proporçoês dos presentes agentes potentes são necessários. É importante que o composto seja totalmente misturado na pré-mistura e, subsequentemente, no alimento. A este respeito, veículo oleoso milho , óleo de vente orgânico o agente pode ser disperso ou dissolvido num adequado como óleo de feijão de soja, óleo de semente de algodão, e semelhante, ou num solvolátil e depois misturado como suporte. È de apreciar que as proporçoês do material activo no concentrado são capazes de grande variação desde que a quantidade de agente no alimento acabado possa ser ajustado por mistura da proporção apropriada de pré-mistura com o alimento para obter um nível desejado do agente terapêutico.

Concentrados de elevada potência são misturados pelo o preparador do alimento com um suporte de proteína como, farinha de óleo de feijão de soja e outras farinhas, como descrito anteriormente para produzir suplementos concentrados que são adequados para alimentação directa às

aves domésticas. Nesses casos, as aves domésticas são permitidas consumir a dieta usual. Em alternativa, esses suplementos concentrados são adicionados directamente ao alimento das aves domésticas, para produzir um nível terapeuticamente éficaz de um ou mais dos compostos deste invento. As misturas são totalmente misturadas por procedimentos padrão, como num misturador de duas pás curvadas, para assegurar homogeneidade.

Para ser utilizada em aves domésticas, os níveis usados do composto descrito nesta memória descrita variarão sob circunstâncias diferentes. A medicação a baixo nível, contínua durante o período de crescimento; isto é, durante as primeiras 5 a 12 semanas para galinhas , é uma medida profilática eficaz. No tratamento de infecçoês estabelecidas, níveis mais elevados podem ser necessários para ultrapassar a infecção. 0 nível usado de composto (I) no alimento estára geralmente na gama de cerca de 1,0 a 25 ppm, preferencialmente na gama de cerca de 2,5 a 12,5 ppm, guardo administração na água de beber, o nível será aquele que deve fornecer a mesma dose diária de medicação dividida pela razão do peso do consumo diário de alimento, pelo consumo médio diário de água.

A actividade do composto de fórmula (I) e de seus sais na promoção do crescimento e/ou aumento de eficiência na utilização do alimento em porcos ou em gado, pode ser medido directamente com o alimentar de grupos teste de animais a níveis variados do composto (I) ou de um sal, no alimento. Em alternativa, a Especificação da Patente Britânica No. 1.197.826 descreve um método de penaceia in vitro para a avaliação dos antibióticos nos alimento.

Para ser utilizado na prevenção ou tratamento da disentria em porcos, ou na promoção do crescimento e/ou aumento da eficiência na utilização do alimento em gado ou em porcos, o composto de fórmula (I) ou um sal é preferencialmente administrado como um aditivo no alimento. Os ali-18mentos são preparados de acordo com métodos totalmente aná-

logos aqueles descritos acima para a preparação de alimento em aves domesticas, com a mesma preocupação para a produção de alimentos nos quais o agente terapeútico está uniformemente disperso. O nível usado do composto de fórmula (I) no alimento de gado ou de porcos estará geralmente na gama de cerca de 0,25 a 25 ppm. Em ruminantes o composto de fórmula (I) pode também ser administrado oralmente na forma de uma pírula grande que é metida no saco rumenoreticular, sendo a libertação do agente terapeútico a uma velocidade substancialmente constante , durante um período de semanas, fornecendo uma dose tempo prolongado, e. g., 4-8 equivalente àquela da dose diária anterior no alimento, i. e.:

dose diária média em miligramas (0.25 a 25) ppm consumo de alimento diário x

médio em Kg

Exemplos destas pírulas grandes de libertação controlada são os de cardinal, da Patente N. A. 4.601. 893 .

O presente invento é ilustrado pelos exemplos seguintes. Contudo, deve ser entendido que o invento não está limitado aos detalhes específicos destes exemplos .

Exemplo 1

Fermentação do Actinomadura sp. ATCC 53708

Isolamento do composto (I) na forma de sal de sódio

O Actinomadura sp. cresceu inicialmente por inoculação do meio sólido em garrafas com planos inclinados ou de Roux. com a cultura ATCC 53708, usando meio ATCC No. 172, preparado e com a composição que se segue.

Glucose

Amido solúvel

Gramas/litro

Extrato de Levedura

Hidrolisato enzimático de caseína

Carbonato de cálcio

Agua destilada até

100 ml ;

pH até 7,0 com KOH;

Agar adicionado

Entretanto, frascos agitados foram preparados usando um ou outro dos meios seguintes:

c	grama/ litro	JDYTT	Grama/ litro
Cerelose	10	Cerelose	10
Farinha de soja	10	Amido de milho	5
Milho	5	Licor precipitado de
		milho	5
	Sólidos	de Fermentação
Amido de milho	10	Hidrolisado Enzimático
Cloreto de sódio	5	de caseína	5
Cloreto de Cobalto	0,002	Cloreto de Cobalto	0,002
Carbonato de Cálcio	1	Carbonato de Cálcio	3

Com ml do meio foram distribuídos em frascos agitados de 300ml e esterilizados a 120° C, e a 1.10^ Pa (15 psi) durante 30 minutos. Depois de arrefecimento, o meio foi inoculado com uma suspenção de células vegetais obtidas por raspagem da anterior cultura em plano inclinado do Actinomadura sp. Os frascos foram depois agitados, a 28° C, num

agitador tendo um deslocamento de 3,81 cm (1,5) a 6,35 cm (2,5 polegadas) e 150 a 200 círculos por minuto (CPM), durante cinco a sete dias.

Entretanto, vasos de fermentação de 5 litros foram preparados, contendo 3 litros de um dos meios 0' ou JDYTT anteriores ou o meio seguinte:

U KT - 2 Gramas/litro

Cerelose45

Farinha de soja10

Licor precipitado de milho10

Cloreto de cobalto0,002

Sulfato de magnésio0,10

Carbonato de cálcio3

Sulfato de Manganésio0,10

Sulfato Ferrico0,10

Um agente anti-formador de espuma (1 ml de poli-propilenoglicol, P2000, que contém 10% de óxido de etileno em peso) foi adicionado, e os vasos foram selados e esterilizados a 120°C GI.10^ Pa (15 psi), durante 45 minutos. Os vasos foram depois inoculados com um frasco agitado (Ca 3% de inoculo), fermentado durante 120 a 168 horas a 30°C, agitação até 1700 revoluções por minuto (RPM) com uma velocidade de ar de um volume de ar por volume de líquido por minuto.

Quando a fermentação foi completada (basiados num ensaio em disco antibiótico versus B. subtilís ATCC 6633) os fermentadores foram parados e filtrados pH natural com a ajuda de uma terra de diatomáceas. O bolo do filtro foi transformado numa lama em metanol, concentrado in vacuo, diluído com 2-3 volumes de água depois extractado 2x com 1/3 a 1/2 do volume ou de metil-isobutilcetona ou de n-butanol. A camada de solvente foi separada da fase aguosa por aspiração ou por centrifugação, tornada em espuma e concentrada in vacuo,

para originar o antibiótico de fórmula (I) na forma bruta, como um óleo viscoso.

A biocapacidade do caldo e as correntes de recuperação subsequentes podem ser seguidas por utilização de uma estirpe de Bacillus subtilis ATCC 6633 ou S taphylococcus aureus ATCC 6538. Os componentes no caldo e nes correntes de recuperação podem ser visualizados através da utilização de pratos GF de sílica Gel Analtech, empregando acetato de etilo como eluente. Os pratos desenvolvidos são pulverizados com reagentes de vanilina (3 g de vanilina em 75 ml de etanol e 25 ml de ácido fosfórico a 85%) e foram aguecidas a 80°C. O produto antibiótico da fórmula (I) aparece como uma mancha púrpura. O prato C.C.F. desenvolvido pode também ser recoberto om agar semeado ou com .S. aureus ou com B. subtilis no qual foi adicionado cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólico e incubado a 37°C, durante 16 horas, para visualizar o antibiótico (manchas brancas contra um fundo cor de rosa ) .

O modo de realização em vasos de realizada por preparação de

C* ou JDYTT.

durante 5 a 7 fermenagitafrascos

O inoculo dos dias a 2 8°C, de uns 200 a tação grandes foi dos contendo 0,7 litros do meio frascos agitados foi fermentado e usados para inocular um vaso de fermentação uns 6000 litros contendo 100 ou 4000 litros do meio UK1-2, respectivamente. Aproximadamente um litro de inoculo foi usado em cada tanque.

procedimento durante 7

Os produtos a 10 dias.

da fermentação, depois de foram colhidos.

O caldo total de realização do fermentador mais pequeno foi extractado com 50 litros de metil-isobutil-cetona, a pH natural. O extracto orgânico foi concentrado sob vacuo num destilador ciclone e num evaporador rotatório, até um óleo. Este óleo foi cromatografado duas vezes em 500 g de uma coluna com uma lama sílica gel de quantidade em hexano . A primeira coluna foi desenvolvida com

acetato de etilo e a segunda com CHCl^: acetona a 1:1. Os produtos contendo fracções foram identificados por C.C.F. usando o método descrito acima. As fracçoês activas da segunda coluna de sílica gel foram finalmente cromotografadas em florisil, usando CHCl^: CH^OH a 19:1 como eluente. As fracçoês do produto foram combinadas, agitadas com H^PO^ diluído e depois com tampão de fosfato de sódio dibásico, para formar o sal de sódio, seco sobre ^280^, separado, e o resíduo foi cristalizado a partir de éter para isolar o sal de sódio do composto de fórmula (I), 915 mg; p.f. 245-249°C., /^_alfa7^= =19,0° (c=l, CH₃OH).

Análise calculada para C._rH__O. .Na: C.

77 14

62,47; H. 8,97. encontrada C. 62,89; H. 9,22.

RMN C—13 /desvio químico (ppm) em CDCl^ com núme-

ro de nidrogénio entre parentises?	: 182,8 (0)7 110,0
(o);	106,0	(0);	99,1	(1) 7 87,2	d):	86,9	(0)7 86,2 (1) ¹
86,2	(o):	84,8	(1)7	83,4 (0)',	82,6	(1)7	80,2 (1)7 78,5
(1)7	75,2	(1)7	74,8	(1) : 74,6	(D 7	66,4	(1)7 60,3 (3)7
57,9	(3):	56,9	(3)7	44,5 (1);	39,0	(1)7	36,9 (1)7 36,8
(2) ;	35,9	(2) ;	35,4	(2) / 35,2	(2) ;	35,1	(1)7 35,0 (1)7
31,3	(2) ;	30,9	(2) ;	30,5 (1);	28,2	(3)7	27,1 (2)7 26,1
(2)7	25,0	(3)7	21,0	(3)', 18,3	(3)7	16,7	(3) ; 15,3 (3) 7
13,4	(3);	13,1	(3)7	11,2 (3)7	10,7	(3) 7	and 10,6 (3) ’.

-23O trabalho em tanques de fermentação grandes do caldo total foi realizada por extracção de aproximadamente de

4000 litros de caldo total com 1800 litros de metil-isobatilcetona pela separação do solvente num extractor Podbielnak e vacuo.

pela concentração do solvente a um triturado 2 vezes concentrado foi de volume de metanol puro, separado do óleo pe.

e o metanol triturado, foi concentrado O último foi extractado 2x com foi extractado com acetonitrilo. O xarope fino, in com um volume igual insolúvel em metain vacuo a um xarohexano e o hexano combinado acetonitrilo foi guardado para ser recuperado futuramente. O hexano foi depois concentrado in vacuo, depois cromatografado em descontínuo em sílica gel. A sílica gel foi desorbida num fúnil de filtração, primeiro, com hexano, depois com cloreto de metileno, acetato de etilo e finalmente com acetona. As fracções activas, que esta vam em eluatos de e de acetato de etilo, foram concentrados, dissolvidos em hexano e lavados com água acidulada, depois extractados com N-metil-D-glucamina a 1% em água. A fase aquosa foi salgada com cloreto de sódio e extractado 2x com um volume igual de acetato de etilo. As fases orgânicas foram combinadas tratadas com carvão activado, filtradas.

lavadas com tampão sulfato de sódio de fosfato de concentradas originar tir de eter para produto da fermentação em sódio a pH in vacuo e

9,0, secas sobre cristalizadas a par50,8g de sal de sódio: idêntico ao escala menor.

Exemplo 2

Composto (I) na forma de Ácido Livre

A forma de ácido livre do antibiótico de fórmula (I) foi preparada por agitação vigorosa de uma solução de clorofórmio do sal de sódio com um volume igual de ácido clorídrico a pH 2 num funil de separação. As fases foram separadas, e a camada de cloroformio foi lavada com água e depois evaporada sob vacuo para dar o ácido livre: P.F. 87-90°C; /ãlfa7p^= -6,9° (c=l, metanol).

Análise calculada para ^C45^7g°i4- θ,δί^Ο: C. 63,43; H. 9,34 Encontrada: C. 63,35; H. 9,53.

Exemplo 3

O Sal de Sódio do Composto (I) ácido livre do Exemplo precedente (45mg) foi dissolvido em lOOml de clorofórmio. Uma solução de carbonato de sódio (0,5g) em água (lOOml) foi adicionada e a misture resultante foi depois colocada num funil de separação e vigorosamente agitada durante vários minutos. A camada de clorofórmio foi separada e a camada aquosa foi lavada com clorofórmio fresco. Os extractos de clorofórmio combinados, foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados, e evaporados para obter 41mg do sal de sódio; P.F. 230-235°C.

Análise calculada para C^^H^^O^^Na: C. 62,47; H. 8,97 Encontrada C. 62,20; H. 9,14.

Exemplo 4

Sal de Rubídio do Composto (I)

Para preparar o sal de rubídio do composto de fórmula (I), o ácido livre (30mg) foi dissolvido em 50ml de clorofórmio. O carbonato de rubídio (35mg em 25ml de água) fo:. adicionado ao clorofórmio e a mistura foi deixada a agitar durante 2 horas. A fase orgânica foi separada e a camada aquosa foi extractada com um volume igual de clorofórmio. Os extractos de clorofórmio combinados foram evaporados para obter um sólido branco. O sal de rubídio foi recristalizado por evaporação lenta a partir do éter e a estrutura a raio-X foi determinada nos cristais resultantes por Dr. J. Bordner.

Exemplo 5

O Sal de Potássio do Composto (I)

Para preparar o sal de potássio do compos to antibiótico de fórmula (I), o ácido livre (130mg) foi dissolvido em lOOml de clorofórmio. I^CO^ (lOOmg) em lOOml de I^O foi adicionado e a mistura resultante foi agitada durante vários minutos e foi depois colocada num funil de separação e foi vigorosamente agitada durante vários minutos. A fase or-25-

gânica foi separada e evaporada sob vácuo para (I) na forma de um pó branco; P.F. 255-260°C., (c=l, clorofórmio).

Analise calculada para ^C45^H77°p4^K: 0. 61,34; Encontrada: C. 60,91;

obter o composto

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ .

composto de fórmula

Processo para a preparação de um em que M=CH aceitável, ou de um seu sal catiónico caracterizado por compreender farmacêuticamente a fermentação de

Actinomadura sp. ATCC 53708, sob condições aeróbicas submer sas num meio nutriente aquoso, que compreende uma fonte assimlável de carbono e de azoto, até que uma quantidade recuperável do referido composto seja formada.
2â.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto de fórmula (I) estar na forma dos seus sais de potássio ou de sódio.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o refaddo composto ser separado do meio de fermentação.
4â. 2 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto na forma precipitada ser recuperado como uma mistura que compreende micé-27lio, por dicação rado na filtração do meio de fermentação.
5â.

1, caracterizado forma bruta, verização do meio de composição alimentar caracterizado por se posto de fórmula (I) ou tratamento a promoção do alimento pelo

Processo de acordo com a reivinpor o referido composto ser por secagem por congelação ou por fermentação total.
6ã. - Processo para nutriente para gado incluir na referida recupepulde uma a preparação bovino ou suíno, composição um comnuma quantidade eficaz para a prevenção da disenteria no referido gado suíno, ou para crescimento e/ou melhoramento na utilização do referido gado bovino ou suíno.
7a.

Método para a promoção do crescimento e/ou aumento da eficácia na utilização do alimento em ou bovino caracterizado por compreender a adminisreferido gado suino ou bovino de uma quantidade do crescimento ou promotora da eficácia da utilialimentos, de um composto de de uma composição alimentar nutriente, ppm de composto activo.

gado suino tração ao promotora zação dos contendo de 0,25 a 25
8θ. - Método para tamento da disenteria em suínos, caracterizado por compreender a administração aos referidos suínos de um composto de (I) numa quantidade eficaz para a prevenção e tratareferida disenteria nos referidos suinos.

f órmula mento da a preparação ou tra9a. - Método de acordo com a reivindicação forma

8 , de a 25 ppm caracterizado por o composto ser administrado na uma composição alimentar nutriente, contendo de composto activo.

de

0,25 composição alimentar lOê. - Método para a preparação nutriente para aves domésticas, de uma carac- terizado por se incluir na referida composição um composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para o controlo de infecções coccídicas nas referidas aves domésticas.

llâ. - Método para o controlo de infecções coccídicas em aves domésticas, caracterizado por compreender a administração às referidas aves domésticas de uma quantidade eficazmente anticoccídica de um composto de fórmula (I) .
12^. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o composto ser administrado às referidas aves domésticas na forma de uma composição nutrien-

te, contendo de 1,0 a 25 ppm de composto activo. 13a. _ Cultura biologicamente pura de Actinomadura sp. ATCC 53708, caracterizado por ser capaz de

produzir o composto de fórmula (I) numa quantidade recuperável por fermentação num meio nutriente aquoso, que compreende fontes assimiláveis de carbono e azoto.
14θ. - Cultura de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se apresentar na forma seca por congelação.

-29_
15â. - Microorganismo caracterizado por ser Actinomadura sp ATCC 53708.