NO159291B

NO159291B - Fremgangsmaate for fremstilling av gamma-substituerte 3(r)-hydroxysmoersyrederivater.

Info

Publication number: NO159291B
Application number: NO834461A
Authority: NO
Inventors: Charles J Sih
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-05
Publication date: 1988-09-05
Also published as: IL70352A0; AT393136B; GB8332359D0; CH661498A5; JPH0767674A; CA1225956A; DE3344085A1; FI834419A0; FI81115B; FI81115C; AU2175883A; SE455501B; DE3344085C2; DK163917C; GB2132614A; NO159291C; ES527807A0; GB2132614B; IE832732L; DK163917B

Abstract

Fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin som omfatter å underkaste Y-substituerte aceto-eddiksyreestere eller -amider den ferinentative enzymatiske virkning av en mikroorganisme som utvikler L-Ø-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35], det resulterende, optisk aktive tilsvarende y-substituerte-f}-hydroxysmørsyre-derivat gjenvinnes, og angitte derivat omdannes til L-carnitin. En forbedring ved fremgangsmåten er også beskrevet som omfatter omsetning av et 4-klor-3(R)-hydroxybutyrat med natriumjodid eller -bromid under dannelse av det tilsvarende 4-jod-eller 4-brom-3(R)-hydroxybutyrat, 4-jod- eller 4-brom-3(R)-hydroxybutyrat omdannes til tri-methylamlno-3(R)-hydroxybutyratsalt, hvoretter trimethylamino-3(R)-hydroxybutyratsalt omdannes til L-carnitin,indre salt. Nye kjemiske mellomprodukter fremstilt ved fremgangsmåtene, er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for mikrobiologisk redusering av -<y->substituerte acetoeddiksyre-estere eller amider til deres respektive L-|3-hydroxy-Y-substituerte smørsyrederivater, hvilke derivater lett kan omdannes til L-carnitinklorid.

Som kjent, inneholder carnitin (P-hydroxy-y-trimethyl-amino-smørsyre) et asymmetrisk senter, og carnitin fore-ligger derfor i to stereoisomere former, D- og L-formen.

L-carnitin er normalt tilstede i kroppen hvor det

bærer aktiverte langkjedede frie fettsyrer gjennom mitochondriemembranen. Da mitochondriemembranen er impermeabel overfor acyl CoA-derivater, kan langkjedede frie fettsyrer bare inntre når forestring med L-carnitin har funnet sted. Bærerfunksjonen av L-carnitin utøves både ved transport av aktive langkjedede fettsyrer fra setene for deres biosyntese, f.eks. mikrosomer, til mitochondria hvor de oxyderes, og ved transport av acetyl CoA fra mitochondria hvori det dannes,

til de ekstramitochondriske seter hvor syntesen av langkjedede fettsyrer finner sted, f.eks. i mikrosomene hvori acetyl CoA kan utnyttes for syntetisering av cholesterol og fettsyrer.

Selv om det er fastslått at den venstredreiende isomer (L-carnitin) utelukkende er den biologiske form (D-carnitin

er aldri hittil blitt påvist i pattedyrvev), har D,L-carnitinracemat vært anvendt i mange år for forskjellige indikasjoner. Eksempelvis selges D,L-carnitin i Europa som et appetittstimulerende middel, og det har vært angitt at materialet har en virkning på veksthastigheten av barn, se f.eks. Borniche et al., Clinica Chemica Acta, 5, 171-176,

1960 og Alexander et al., "Protides in the Biological Fluids", 6. kollokvium, Bruges, 1958, 306-310. US patentskrift

3 830 931 beskriver forbedringer i myocardialkontraktilitet

og systolisk rytme i kongestiv hjertesvikt som ofte kan erholdes ved administrering av D,L-carnitin. US patentskrift 3 968 241 beskriver anvendelse av D,L-carnitin i hjerte-arytmier. US patentskrift 3 810 994 beskriver anvendelse av D,L-carnitin ved behandling av fettsyke.

Nylig har det imidlertid vært en økende forståelse for betydningen av utelukkende anvendelse av den venstredreiende carnitinisomer i det minste for enkelte terapeutiske anvend-elser. Det er blitt vist at D-carnitin er en konkurrerende inhibitor av carnitin-kjedede enzymer slik som carnitin-acetyl-transferase (CAT) og carnitin-palmityl-transferase (PTC). Ennvidere er det nylig fastslått at D-carnitin kan fortrenge L-carnitin fra hjertevevet. Følgelig er det vesentlig at L-carnitin utelukkende administreres til pasi-enter under medisinsk behandling for hjertesykdommer eller for nedsettelse av blodlipider.

Flere prosesser er blitt foreslått for fremstilling

av carnitin i industriell målestokk. Den kjemiske syntese av carnitin leder imidlertid ufravikelig til en racemisk blanding av D- og L-isomerene. Følgelig har oppløsnings-metoder vært anvendt for å oppnå de separate optiske anti-poder fra racematet. Disse oppløsningsmetoder er imidlertid arbeidskrevende og kostbare.

At p-ketofunksjonen i 3-stillingen i y-substituerte-acetoeddiksyrederivater kan reduseres ved hydrogener-ing over Pt/C er kjent (se f.eks. US patentskrift 3 969 406). Imidlertid er den hydroxyforbindelse som erholdes ved en slik metode, racemisk. Ved anvendelse av den fermentative virkning av en mikroorganisme i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan derimot: hydrogener-

ingen av oxo-funksjonen ved 3-stillingen utføres stereo-selektivt under dannelse av optisk aktive y-substituerte 3-hydroxysmørsyrederivater.

Ved egnet valg (som senere beskrevet) av det substrat som skal utsettes for den fermentative virkning av mikro-organismene i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan 3 (R)- eller den L-epimere konfigurasjon erholdes. Denne konfigurasjon er nødvendig for omdannelsen til naturlig L-carnitin.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av ^-substituerte 3(R)-hydroxysmørsyre-derivater av generell formel:

hvori X er valgt fra Cl, Br, I og OH, og

R er en alkoxygruppe med 1 til 15 carbonatomer;

fenoxy eller fenylalkoxy med fra 7 til 14 carbonatomer eller fenylamino, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at forbindelser av formel

hvori X og R har de ovenfor angitte betydninger,

a) underkastes den fermentative, enzymatiske virkning av en mikroorganisme valgt fra klassen Ascomycetes,

ordrene Endomycetales, Mucorales, Moniliales eller Eurotiales, slekten Saccharomyces, fortrinnsvis Saccharomyces cerevisiae, som utvikler L-|3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35], eller

b) underkastes den enzymatiske virkning av L-(3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] i renset form

isolert fra svinehjerte.

Det er funnet at enhver mikroorganisme som produserer det ønskede enzym, er i stand til å katalysere den stereo-selektive reduksjon. Særlig egnet er de mikroorganismer av klassen Ascomycetes, ordenene Endomycetales, Mucorales, Moniliales og Eurotiales, og slektene Saccharomyces. Særlig foretrukket er Saccharomyces cerevisiae.

For å fremstille optisk aktive 4-substituerte 3 (R) - hydroxybutyratestere inneholdende 1-4 carbonatomer, er det nødvendig å anvende renset L-Ø-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] slik som det fra svinehjerte, fordi intakte mikroorganismer utviser interfererende oxido-reduktaser med motsatt konfigurasjon. Således gir mikrobiell reduksjon av f.eks. 4-kloracetoeddikestere med 1-4 carbonatomer 4-klor-3-hydroxybutyrater med utilfredsstillende optisk renhet.

De optisk aktive Y-substituerte-L-p-hydroxysmørsyre-derivater kan deretter omsettes med trimethylamin under dannelse av det tilsvarende Y-trimethylamminium-L-3-hydroxy-smørsyrederivat som lett kan omdannes til L-carnitin ved behandling med vandige syrer. I det etterfølgende er angitt skjematisk reaksjonstrinnene ved denne prosess.

Det er funnet a.t den foregående reaksjon I >II finner lettere sted hvis X = Cl. Da imidlertid den etter-følgende reaksjon II > III finner sted med bedre utbytter når X = jod eller brom, foretrekkes det først å fremstille Cl-derivatet og deretter omdanne dette til det tilsvarende I- eller Br-derivat.

En fordelaktig fremgangsmåte omfatter først omdannelse av 4-klor-3(R)-hydroxybutyratester til de tilsvarende 4-jod- eller 4-brom-3(R)-hydroxybutyrater. For enkelhets skyld henvises det heretter til I-derivatet. Jodhydrinet (V) kan omsettes glatt med trimethylamin ved romtemperatur under dannelse av VI som lett omdannes til L-carnitin etter følgende reak-sjonsskjerna:

Den foregående prosess som eksemplifisert ved lig-ningen, er gjenstand til utallige variasjoner. Uten hensyn til hvilken form som derved gjøres tilgjengelig, omsettes esteren med natriumjodid i et egnet løsningsmiddel slik som 2-butanon, aceton, butanol, etc. Den prinsipielle reaksjon som ønskes ved dette punkt i reaksjonen med natriumjodid,

er en fortrengningsreaksjon som danner jodhydrinet V uten å forstyrre det chirale senter på det tilstøtende carbonatom. For denne reaksjon er i det minste tilstrekkelig natriumjodid for å fortrenge alt klorid fra II nødvendig. Generelt anvendes et svakt overskudd av natriumjodid.

Reaksjonen av V med trimethylamin kan utføres ved lav temperatur (f.eks. 25°C) (se S. G. Boots and M. R. Boots,

J. Pharm. Sei., 64_, 1262, 1974) i et utall av løsningsmidler slik som methanol eller ethanol inneholdende et overskudd av trimethylamin. Det er å merke seg at avhengig av det an-vendte alkoholiske løsningsmiddel finner det sted en ester-utbytning. Når f.eks. methanol anvendes som løsningsmiddel, erholdes L-carnitinmethylester ved reaksjonen. Denne om-bygningsreaksjon er fordelaktig fordi det er kjent at L-carnitinmethylester kan omdannes direkte til den frie baseform av L-carnitin ved å føres gjennom en ionebytterkolonne (OH ), [se E. Strack og J. Lorenz, J. Physiol. Chem. (1966), 344, 276] .

Det kan sees fra beskrivelsen av foregående prosesser at et utall av nye og meget anvendbare mellomprodukter dannes. Spesielt anvendbare er 4-jod-3(R)-hydroxysmørsyre-alkylestere hvori alkylgruppene har fra 6 til 10 carbonatomer hver. Octylesteren er særlig foretrukket.

Mikroorganismer som har den ønskede oxido-reduktase-aktivitet, er velkjente innen det mikrobiologiske fag, og enhver slik mikroorganisme kan anvendes ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (se K. Kieslich, "Micro-bial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds"

(Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976)) og hvor enhver av de slekter av mikroorganismer som spesielt er beskrevet her, er særlig anvendbare. Lett tilgjengelige og billige mikroorganismer av slekten Saccharomyces, f.eks. ølgjær, brød-gjær og vingjær (Saccharomyces vini) er blitt funnet å produsere L-fJ-hydroxylacyl CoA dehydrogenase [EL 1.1.1.35] og å være særlig fordelaktig ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Enzymet er beskrevet av S. J. Wakil og E. M. Barnes Jr. i Comprehensive Biochemistry bind 185 (1971, s. 57-104.

Det 4-substituerte-acetoeddiksyresubstrat kan innar-beides i et næringsmedium av standard sammensetning hvori slike organismer dyrkes, og vanlige fermenteringsbetingelser kan anvendes for å utføre den reduktive omforming. Alterna-tivt kan den aktive bestanddel fjernes fra den voksende kultur av mikroorganismen, f.eks. ved lyse av cellene for å frigi enzymene, eller ved suspendering av hvilecellene i friskt, vandig system. I en hvilken som helst av disse teknikker vil Ø-ketofunksjonen bli selektivt redusert så lenge som det aktive enzym utviklet av mikroorganismen, er tilstede i mediet. Selvsagt vil temperaturen, tiden og trykkbetingelsene under hvilke kontakten av det 4-substituerte-acetoeddiksyrederivat og det reduktive enzym utføres, være avhengige av hverandre, hvilket vil være kjent for fag-mannen. Med f.eks. forsiktig oppvarming og ved atmosfæretrykk vil den tid som er nødvendig for å bevirke den reduktive omdannelse, være mindre enn om den forløper ved romtemperatur under de samme betingelser. Selvsagt må hverken temperatur, trykk eller tid være slik at dette fører til at substratet nedbrytes. Hvor en voksende kultur av organismen anvendes, må prosessbetingelsene også være tilstrekkelig forsiktige til at organismen ikke drepes før den utvikler tilstrekkelig hydrolytiske enzymer for å muliggjøre at reaksjonen forløper. Ved atmosfæretrykk kan temperaturen generelt være fra 10 til 35°C, og tiden fra 12 timer til 10 dager.

I de etterfølgende eksempler som illustrerer oppfinnelsen, ble Y-haloaceto-

eddiksyrederivatsubstratene som underkastes den mikrobielle reduksjon, fremstilt fra diketen etter den generelle metode beskrevet av C. D. Hurd og H. L. Abernethy (J. Am. Chem. Soc., 62, 1147, 1940) for y-klor-acetoeddiksyrederivatene og F. Chick, N. T. M. Wilsmore [J. Chem. Soc, 1978 (1910)] for Y-brom-acetoeddiksyrederivatene via følgende reaksjonsrekke:

Om ønsket, kan alternativt 7-haloacetoeddiksyre-derivatene fremstilles fra Y-halo-eddikestere via en kon-vensjonell Grignard-reaksjon. F.eks. ble Y-klor-acetoeddiksyre-octylester lett fremstilt ved kokning av y-klor-octylester under tilbakeløpskjøling med 2 ekvivalenter mag-nesium i ether i 48 timer. Etter fjerning av løsningsmidlet ble acetoeddiksyre-octylesteren gjenvunnet i 70% utbytte.

Y-hydroxy-acetoeddiksyrederivater ble fremstilt fra deres tilsvarende Y~brom-acetoeddiksyrederivater ved omrør-ing i en dioxan-vann (1:1) løsning inneholdende CaCO^ ved 25°C i 12 timer.

Hvert av produktene fremstilt i henhold til de etter-følgende eksempler, ble identifisert når det gjelder struktur ved anvendelse av kjernemagnetisk resonnansspekter (NMR), infrarødt spekter og ved tynnskiktskromatografi. Den optiske renhet og den absolutte konfigurasjon av produktene ble fastslått ved deres omdannelse til L-carnitin såvel som omdannelse i deres estere som lett kan analyseres ved NMR-spektro-metri og optisk rotasjon.

Eksempel 1 ( gjær)

(+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-octylester ble fremstilt som følger:

A. Fermentering. Overflatevekst fra en 1 uker gammel skråagar av Candida keyfr. NRRL Y-329 dyrket på agar med følgende sammensetning:

ble suspendert i 5 ml av en 0/85%-ig saltvannløsning. 1 ml porsjoner av denne suspensjon ble anvendt for å inokulere en 250 ml Erlenmeyerkolbe (F-l trinn) inneholdende 50 ml av følgende medium (Vogels medium):

Kolben ble inkubert ved 25°C på en rotasjonsrister

(250 sykluser/min. - 5,08 cm radius) i 24 timer, hvoretter en 10 volum%-ig overføring ble foretatt til en annen 250 ml Erlenmeyerkolbe (F-2 trinn) inneholdende 50 ml Vogels medium. Etter 24 timers inkubering på en rotasjonsrister ble 150 mg Y-kloracetoeddiksyre-octylester i 0,1 ml 10% Tween<®> 80 tilsatt. Kolben i F-2-trinnet ble deretter inkubert i ytterligere 24 timer under de betingelser som ble anvendt ved inkubering av kolbene i F-l-trinnet.

B. Isolering. 24 timer etter tilsetning av y-kloracetoeddiksyre-octylesteren ble cellene fjernet ved sentrifuger-ing. Supernatanten ble grundig ekstrahert med 50 ml ethylacetat tre ganger. Ethylacetatet ble tørket over Na2S04 og fordampet under dannelse av 186 mg av et oljeaktig residuum. Residuet ble oppløst i 0,5 ml av den mobile fase og ble tilsatt til en kolonne (1 x 25 cm) av silicagel (MN-kiselgel 60). Kolonnen ble eluert med Skelly B:ethylacetat (8:1), og 14 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjon 6 og 7 inneholdende det ønskede produkt, ble oppsamlet og konsentrert til tørrhet under dannelse av 120 mg krystallinsk residuum. Omkrystal-lisering fra ethylacetat-hexan ga 107 mg 4-klor-3(R)-hydroxy-smørsyre-octylester, [a]<23> +13,3° (c, 4,45) (CHC13);

PMR (6CDC13) 0,88 [3H, omvandl, forvrengn. CH3~ (CH2) -] ; 1,28

[10H, s, ~(CH2)5-]; 1,65 (2H, m,

2,62 (2H, d, J = 6 Hz,

3,22 (1H, br., -0H); 3,60

(2H, d, J = 6 Hz,

Anal. beregnet for C12H2303C1: C 57,47; H 9,25.

Funnet: C 57,52; H 9,07

[TLC Rf - 0,5, Brinkmann silicagelplate, 0,25 cm EM;

Skelly B:ethylacetat (5:1).

Eksempel 2

Hvlleceller. 100 g kommersiell, frisk brødgjær Saccharomyces cerevisiae (Red Star) ble suspendert i 250 ml kranvann til hvilket det var tilsatt 10 g sucrose og 3,6 g y-kloracetoeddiksyre-octylester. Etter at innholdet var inkubert ved 25°C på en rotasjonsrister (250 sykluser/min. - 5,08 cm radius) i 24 timer ble ytterligere 10 g sucrose tilsatt til kolben, og reaksjonen fikk forløpe i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter fjernet ved filtrering gjennom en celittpute. Cellene ble vasket med vann og ethylacetat. Vaskevannene ble kombinert med filtratet og bis grundig ekstrahert med ethylacetat. Ethylacetatlaget ble tørket over MgSO^ og fordampet under dannelse av et oljeaktig residuum som ble kromatografert over en silicagelkolonne under dannelse av 2,52 g 4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-octylester som et lavtsmeltende, fast materiale, [a]<23> +13,2° (c, 4,0, CHC13).

Eksempel 3

(+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester ble fremstilt som følger:

A. Fermentering. Overflatevekst fra en 1 uker gammel skråagar av Gliocladium virens ATCC 13362, dyrket på agar med følgende sammensetning: ble suspendert i 5 ml av en 0,85%-ig saltløsning. 1 ml porsjoner av denne suspensjon ble anvendt for å inokulere en 250 ml Erlenmeyerkolbe (F-l-trinn) inneholdende 50 ml av følgende medium (soyabønne-dextrosemedium):

Kolben ble inkubert ved 2 5°C på en rotasjonsrister

(250 sykluser/min. - 5,08 cm radius) i 24 timer, hvoretter en 10 volum%-ig overføring ble foretatt til en annen 250 ml Erlenmeyerkolbe (F-2-trinn) inneholdende 50 ml soyabønne-dextrosemedium. Etter 24 timers inkubering på en rotasjonsrister ble 150 mg Y-kloracetoeddiksyre-benzylester i 0,1 ml 10% Tween<®>80 tilsatt. F-2-trinn-kolben ble deretter inkubert i ytterligere 24 timer under de betingelser som ble anvendt ved inkubering av F-l-kolbene.

B. Isolering. 24 timer etter tilsetning av y-kloracetoeddiksyre-benzylesteren ble mycelet fjernet ved filtrering. Filtratet ble grundig ekstrahert med 50 ml ethylacetat tre ganger. Ethylacetatlaget ble tørket over MgSO^ og ble konsentrert i vakuum under dannelse av 160 mg av et residuum. Residuet ble kromatografert over silicagelkolonne (MN-kiselgel 60) (1 x 25 cm). Kolonnen ble eluert med Skelly B og ethylacetat (10:1), og 12 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjon 11-16 inneholdende det ønskede produkt, ble oppsamlet og konsentrert til tørrhet under dannelse av 115 mg 4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester,

[a]Q<3>*8.7° (c, 5.26; CHClj); pmr (6 CDC13) 2.65 (2H, ;d, J * 6 Hz,

3.20 (1H, br, -0H); 3.54 (2H, d, J » 6 Hz, 4.20 (1H, m, 5.12 (2H, «,

7.31 (5H, s, fem aromatiske

protoner).

Anal. beregn, for C^H^O^l: C 57,77; H 5,73.

Funnet: C 57,64; H 5,67.

[TLC silicagel EM Brinkmann plate, 0,25 cm, Rf = 0,43, Skelly B-ethylacetat (5:1).]

Eksempel 4- 2 3

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med hver av de organismer som er oppført i. tabell 1 med det unntak at y-kloracetoeddiksyre-octylester ble tilsatt til en konsentrasjon på 1 mg/ml. Omdannelse til det ønskede produkt, (+) -4-klor-3 (R) -hydroxy smør syre-oc tyles ter; ble oppnådd. Prosedyrene i disse eksempler ble gjentatt ved kontinuerlig tilsetning av substrat til gjærmediet. Vektforhold substrat/gjær var ca. 1:1,5 med glimrende omdannelse til det ønskede produkt.

Eksempel 24- 48

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med hver av de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at ^-kloracetoeddiksyre-octylester (1 mg/ml) ble anvendt. Overføring til den ønskede forbindelse (+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-octylester ble erholdt.

Eksempel 49- 68

Prosedyren beskrevet 1 eksempel 1, ble gjentatt med hver av de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at y-kloracetoeddiksyre-benzylester (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede produkt (+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester ble oppnådd.

Eksempel 69- 93

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med hver av de organismer som er oppført i tabell 2 under anvendelse av Y-kloracetoeddiksyre-benzylester (1 mg/ml) som substrat. Overføring til den ønskede forbindelse (+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester ble oppnådd.

Eksempel 94

(+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyreanilid ble fremstilt i henhold til prosedyren beskrevet i eksempel 2 med unntak at 4-kloracetoacetanilid ble anvendt i en konsentrasjon på

1 mg/ml.

som substrat for omdannelsen til det ønskede, optisk aktive produkt, smp. 110-111°C? [a]<23> +17,5° (c, 3.0, CHCl-j); pmr (5 ) 2.67 (2H, d, J = 6 Hz, -H0HCH2-C0NHR), 3.66 (2H, d, J ■ 6 Hz, CICHjCHOH-R), 4.43 (1H, m, -CHj-CHOH-CHj-), 7.03-7.44 (3H, m, aromatiske protoner, meta og para), 7.69 (2H, d, J = 6 Hz, aromatiske protoner, ortho), 9.24 (1H, br,

Anal. beregn, for C10H12N02C1: C 56,21; H 5,66. Funnet: C 56,17; H 5,47.

Eksempel 95- 114

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med hver av de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at y-kloracetoacetanilid ble tilsatt til en konsentrasjon på 1 mg/ml. I alle tilfeller ble det oppnådd en omdannelse til det ønskede produkt, (+)-4-klor-3(R)-hydroxy-smørsyreanilid.

Eksempel 115- 139

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 2. y-kloracetoacetanilid ble innført til en konsentrasjon på 1 mg/ml. I disse tilfeller ble det oppnådd omdannelse til det ønskede (+)-4-klor-3(R)-hydroxysmørsyreanilid.

Eksempel 140- 159

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med

de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at Y-bromacetoeddiksyre-octylester (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede produkt, (+)-4-brom- j 3 (R) -hydroxysmørsyre-octylester, ble oppnådd.

Eksempel 160- 184

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med

de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at Y-bromacetoeddiksyre-octylester (1 mg/ml) ble anvendt. Omdannelse til det ønskede produkt, (+)-4-brom-3(R)-hydroxy-smørsyre-octylester, ble oppnådd.

Eksempel 185- 204

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at y-bromacetoeddiksyre-benzylester (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede produkt, (+)-4-brom-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester, ble oppnådd.

Eksempel 205- 229

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at y-bromacetoeddiksyre-benzylester (1 mg/ml) ble anvendt. Omdannelse til det ønskede produkt, (+)-4-brom-3(R)-hydroxysmørsyre-benzylester, ble oppnådd.

Eksempel 230- 249

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at y-bromacetanilid (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede (+)-4-brom-3(R)-hydroxysmørsyreanilid ble oppnådd.

Eksempel 250- 274

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at y-bromacetanilid (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede (+)~4-brom-3(R)-hydroxysmørsyreanilid ble oppnådd.

Eksempel 275- 294

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at y-hydroxyacetoeddiksyre-octylester (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til den ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxy-smørsyre-octylester ble oppnådd.

Eksempel 295- 319

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med

de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at y-hydroxyacetoeddiksyre-octylester (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til den ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxy-smørsyre-octylester ble oppnådd.

Eksempel 320- 339

Prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 1, med det unntak at Y-hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxysmørsyre-anilid ble oppnådd.

Eksempel 340- 364

Prosedyren beskrevet i eksempel 3, ble gjentatt med de organismer som er oppført i tabell 2, med det unntak at Y-hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) ble anvendt som substrat. Omdannelse til det ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxysmørsyre-anilid ble oppnådd.

Eksempel 365

Methyl- 4- klor- 3( R)- hydroxybutyrat ( VIII)

100 mg methyl-4-kloracetoacetat (VII) ble inkubert med 29 enheter av svinehjerte (EC 1.1.1.35), Ø-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (Sigma, H4626), og 1,36 g NADH (Sigma, 90%) i

30 ml 0,1 M natriumfosfatpuffer, pH 6,5.

Etter 30 timer ved 25°C ble reaksjonsblandingen ekstrahert fire ganger med 30 ml ethylacetat. Det organiske lag ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet under redusert trykk. Residuet (90 mg) ble kromatografert over en silicagelkolonne (12 g) (1,3 x 34 cm). Kolonnen ble eluert med et løsningsmiddelsystem bestående av Skelly B-ethylacetat (8:1), og 20 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjon 9-11 inneholdt det ønskede methyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) som fastslått ved TLC, [a]<23> +23,5° (c, 5,2 CHC13) og ble oppsamlet.

Eksempel 366

Prosedyren beskrevet i eksempel 365, ble gjentatt under anvendelse av ethyl-4-kloracetoacetat som substrat under dannelse av ethyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat,

[a]<23> +22,7° (c, 4,7, CHC13)

Eksempel 367

Prosedyren beskrevet i eksempel 365, ble gjentatt under anvendelse av n-propyl-4-kloracetoacetat som substrat under dannelse av n-propyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat,

[a]<23> +21,5° (c, 5,0, CHC13).

Eksempel 368

Prosedyren beskrevet i eksempel 365, ble gjentatt under anvendelse av n-butyl-4-kloracetoacetat som substrat under dannelse av n-butyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat,

[a]<23> +20,1° (c, 3,1, CHC13).

Generell prosedyre for omdannelse av 4- halo- 3( R)- hydroxy-smørsyreestere og amider til L- carriitin

Eksempel 369

En blanding av 1,5 g 4-klor-3(R)-hydroxysmørsyre-octylester, 3 ml ethanol og trimethylamin (25 vekt% løsning) i 3 ml vann ble oppvarmet til 80-90°C i 2 timer. Løsnings-midlene og overskudd av trimethylamin ble fordampet til tørr-het i vakuum under dannelse av 1,8 g urent residuum. 1 g urent produkt ble oppvarmet til 80-90°C i en løsning av 7 ml 10%-ig HC1 i 1,5 timer. Etter fordampning av løsnings-midlene under redusert trykk ble det urene produkt ekstrahert to ganger med absolutt ethanol (10 ml), og ethanolen ble fordampet i vakuum. Det krystallinske residuum ble oppløst i en liten mengde ethanol, og L-carnitinkloridet ble utfelt ved tilsetning av ether i godt utbytte (320 mg), smp. 142°

(spaltn.); [a] -23,7° (c, 4,5, H20).

L-carnitinkloridet kan lett omdannes til det farmasøyt-isk foretrukne L-carnitin indre salt ved ionebytting, som vel kjent innen faget. Eksempel 370 Octyl- 4- jod- 3 ( R)- hydroxybutyrat __( IX)

En blanding av 1,4 26 g octyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat (II) og 1,2 g vannfritt Nal i 15 ml methylethylketon ble kokt under tilbakeløpskjøling i 24 timer. Blandingen ble rotasjonsfordampet og omsatt med 100 ml ether og 50 ml vann. Den organiske fase ble fraskilt og vasket med 150 ml 10%-ig natriumthiosulfatløsning, 150 ml saltvann og tørket over vannfritt natriumsulfat. Løsningsmidlet ble fordampet under redusert trykk under dannelse av 1,762 g IX som en lysegul olje, IR (tynn film) 3460 cm<-1> (OH) og 1730 cm<-1 >(ester C=0); PMR (CDClg) 3,93-4,27 (m, 3H), 3,17 (d, 2H), 2,50 (d, 2H), 1,50-1,87 (m, 2H), 1,30 (bs, 12H), 0,93 (m, 3H).

Overføring av octyl- 4- jod- 3( R)- hydroxybutyrat ( IX) til L- carnitin

Til en løsning av 1,593 g IX i 15 ml methanol ble tilsatt 8 ml av en 25%-ig løsning av vandig trimethylamin. Blandingen ble omrørt ved 27°C i 20 timer. Løsningsmidlene og overskudd av trimethylamin ble fordampet under redusert trykk under dannelse av et halvkrystallinsk, fast materiale, X. Dette residuum ble vasket med små mengder ether for å fjerne octanolen og ble deretter oppløst i vann og ført over en Dowex® l-x4 kolonne (0H~ form - 50-100 mesh, 2,5 x 15 cm). Kolonnen ble vasket med destillert vann. Fjerning av løs-ningsmidlet i vakuum fra de første 200 ml av eluatet ga L-carnitin som et hvitt, krystallinsk, fast materiale (490 mg, 65% utbytte) [a]<23> -29,2° (c, 6,5 H2<0>).

Eksempel 371

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av hexyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat under dannelse av hexyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 372

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av heptyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat under dannelse av heptyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 373

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av decyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat under dannelse av decyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 374

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av methyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) under dannelse av methyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 375

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av ethyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat under dannelse av ethyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 37ji

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble gjentatt under anvendelse av n-propyl-4-^klor-3 (R) -hydroxubutyrat under dannelse av n-propyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Eksempel 377

Prosedyren beskrevet i eksempel 370, ble anvendt under anvendelse av n-butyl-4-klor-3(R)-hydroxybutyrat under dannelse av n-butyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat som deretter ble omdannet til L-carnitin.

Representative gjærarter som gir det ønskede enzym, er oppført i tabell 1, og representative fungi er oppført i tabell 2.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av Y-substituerte 3(R)-hydroxysmørsyrederivater av generell formel:

hvori X er valgt fra Cl, Br, I og OH, og R er en alkoxygruppe med 1 til 15 carbonatomer; fenoxy eller fenylalkoxy med fra 7 til 14 carbonatomer eller fenylamino,

karakterisert ved at forbindelser av formel

hvori X og R har de ovenfor angitte betydninger, a) underkastes den fermentative, enzymatiske virkning av en mikroorganisme valgt fra klassen Ascomycetes, ordrene Endomycetales, Mucorales, Moniliales eller Eurotiales, slekten Saccharomyces, fortrinnsvis Saccharomyces cerevisiae, som utvikler L-(3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35], eller b) underkastes den enzymatiske virkning av L-(3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] i renset form isolert fra svinehjerte.