DK163917B - Gamma-substituerede beta-hydroxybutansyrederivater og fremgangsmaade til fremstilling heraf - Google Patents

Description

DK 163917 B

Opfindelsen angår γ-substituerede 8-hydroxybutan-syre derivater, som er et mellemprodukt i fremstillingen af L-carnitin og en fremgangsmåde til mikrobiologisk reduktion af γ-substituerede aceteddikesyreestre eller 5 -amider til de respektive L-B-hydroxy-y-substituerede butansyrederivater, som nemt kan omdannes til L-carni-tinchlorid.

Som det er velkendt indeholder carnitin (β-hydroxy-γ-trimethylaminobutansyre) et asymetrisk centrum, og 10 derfor eksisterer carnitin på to stereoisomere former, D- og L-formen.

L-Carnitin er normalt til stede i den menneskelige organisme, hvor dets funktion er at transportere aktiverede, frie fedtsyrer med lange kæder over mito-15 chondriemembranen. Idet mitochondriemembranen er imper-meabel overfor acyl-CoA-derivater, kan frie fedtsyrer med lange kæder kun trænge ind, hvis en forestering med L-carnitin har fundet sted. Bærerfunktionen af L-carnitin anvendes både til at transportere aktiverede 20 fedtsyrer med lange kæder fra de steder, hvor de biosyntetiseres, f.eks. mikrosomerne, ind i mitochondrier-ne, hvor de oxideres, og til at transportere acetyl-CoA fra mitochondrierne, hvor det dannes, til de ekstra-mitochondrielle lokaliteter, hvor syntesen af fedtsyrer 25 med lange kæder foregår, f.eks. til mikrosomerne, i hvilke acetyl-CoA kan udnyttes ved syntetisering af cholesterol og fedtsyrer.

Mens det er fastslået at den biologiske form udelukkende er den venstredrejede isomer(L-carnitin) 30 (D-carnitin indtil nu ikke har kunnet påvises i væv fra pattedyr), er D,L-carnitinracemat i en årrække blevet anvendt til forskellige indikationer. D,L-Carnitin er f.eks. solgt i Europa som appetitstimulans, og det er rapporteret, at stoffet har indflydelse på børns 35 vækst, se. f.eks. Borniche et al., Clinica Chemia Acta, 5, 171-176, 1960 og Alexander et al., "Protides in the Biological Fluids", 6th Colloquim, Bruges, 1958, 306-

DK 163917 B

2 310. U.S. patentskrift nr. 3.830.931 beskriver, at forbedringer i myocardial sammentrækkelighed og i systolisk rytme ved kongestiv hjerteinsufficiens ofte kan opnås ved indgivelse af D,L-carnitin. U.S. patent-5 skrift nr. 3.968.241 beskriver anvendelsen af D,L-car-nitin ved kardial arrytmi. U.S. patentskrift nr.

3.810.994 beskriver anvendelsen af D,L-carnitin i behandlingen af fedme.

I den senere tid er der imidlertid lagt stigen-10 de vægt på vigtigheden af kun at anvende den venstredrej ende carnitinisomer, i det mindste ved nogle terapeutiske anvendelser. Det er endog vist, at D-carnitin virker som kompetitiv inhibitor af carnitinbundne enzymer såsom carnitin-acetyl-transferase (CAT) og carni-15 tin-palmityl-transferase. Endvidere har det for nylig vist sig, at D-carnitin kan sænke L-carnitinmængden i hjertevævet. Følgelig er det nødvendigt udelukkende at indgive L-carnitin hos patienter, der er under medicinsk behandling for hjerteinsufficiens eller for for-20 hø.jét indhold af lipider i blodet. ;

Der er foreslået adskillige fremgangsmåder til fremstilling af carnitin i industriel skala. Kemisk j syntese af carnitin fører imidlertid uundgåeligt til ! en racemisk blanding af D- og L-isomerer. Følgelig må 25 der anvendes adskillelsesmetoder til opnåelse af separate enantiomere forbindelser fra den racemiske blanding. Disse adskillelsesmetoder er imidlertid besværlige og dyre.

Det tilsigtes med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte, nyttige optisk aktive mellemprodukter i fremstillingen af L-carnitin og dets salte eller estere.

Det tilsigtes desuden med opfindelsen at tilvejebring' en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte optisk aktive mellemprodukter.

Det tilsigtede samt flere fordele af opfindelsen vil fremgå tydeligere længere fremme i beskrivelsen.

35 3

DK 163917 B

Opfindelsens fordele vil for en fagmand tydeligt fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse.

Det er kendt at β-ketogruppen i 3-stillingen i γ-substi tuerede aceteddikesyrederivater kan reduceres 5 ved hydrogenering over Pt/C (se f.eks. U.S. patentskrift nr. 3.969.406). Hydroxyforbindelsen, der opnås ved en sådan fremgangsmåde, findes imidlertid i en racemisk blanding. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan hydrogeneringen af oxo-gruppen i 3-stillingen 10 derimod udføres stereoselektivt, ved at anvende fermen-tativ indvirkning af en mikroorganisme, til opnåelse af optisk aktive γ-substituerede Ø-hydroxybutansyre-derivater.

Specielt opnås 3(R)- eller L-epimeren, i over-15 ensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved passende valg (som beskrevet nedenfor) af det substrat, der skal fermenteres. Denne epimer kræves til omdannelsen til naturligt forekommende L-carnitin.

I store træk omfatter opfindelsen anvendelsen 20 af det mikrobielle reduktaseenzym, L-f3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35], til at katalysere stereoselektiv hydrogenering af γ-substituerede aceteddikesyrederivater, som er defineret nedenfor.

Opfindelsen tilvejebringer således forbindelser 25 med følgende formel, hvoraf bl.a. 3(R)-konfigurationen fremgår, x Xf. ? : 30 i hvilken X betegner Cl, Br, I eller OH og R betegner en alkoxygruppe med mellem 1 og 1 5 carbonatomer, phenoxy- eller phenylalkoxygruppe med mellem 7 og 14 carbonatomer eller en phenyl-35 aminogruppe.

Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive γ-substituerede β-hydroxy- 4

DK 163917 B

butansyrederivater med formlen °\ H ? X «

R

5 i hvilken X er Cl, Br, I eller OH og R betegner en alkoxygruppe, der har mellem 1 og 15 carbonatomer, phenoxy- eller phenylalkoxygruppe med mellem 7 og 14 carbonatomer eller en phenylamino-10 gruppe ud fra de tilsvarende γ-substituerede aceteddikesyre-esteré eller -amider, som udsættes for fermentativ enzymatisk indvirkning af mikroorganismer, der danner L-β-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35], og udvin-15 ding af de ønskede optisk aktive γ-substituerede β-hy-;droxybutansyrederivater.

I særdeleshed omfatter fremgangsmåden, til fremstilling af optisk aktive γ-substitueret 3(R)-hydroxy-butansyrederivater med følgende formel, af hvilken bl.a.

20 3(R)-konfigurationen fremgår, OH „ 0 25 at forbindelser med formlen 0 0- XCH -C-CH.CR 2 2 30 hvor X og R har de ovenfor fastlagte betydninger, hvor R har mellem 5 og ca. 15 carbonatomer, hvis den betegner en alkoxygruppe, udsættes for fermentativ enzy-ratisk indvirkning af mikroorganismer, der danner L-β-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35], og udvin-35 ding af de ønskede optisk aktive 4-substituerede 3(R)-hydroxybutansyrederivater fra reaktionsblandingen.

DK 163917B

5

Det har vist sig, at en hvilken som helst mikroorganisme, der danner det ønskede enzym, er i stand til at katalysere den stereoselektive reduktion. Særligt egnede er mikroorganismer af klassen Ascomycetes, fami-5 lierne Endomycetales, Mucorales, Moniliales og Eurotia-les, samt slægten Saccharomyces. Særligt foretrukne er Saccharomyces cerevisiae.

Til fremstilling af optisk aktive 4-substitue-rede 3(R)-hydroxybutansyreestere indeholdende 1-4 carlo bonatomer, er det nødvendigt at anvende oprenset L-β-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] f.eks. fra svinehjerter, fordi intakte mikroorganismer indeholder interfererende oxido-reduktaser,der giver den modsatte konfiguration. Således giver mikrobiel reduktion af 15 f.eks. 4-chloraceteddikesyreestere med 1-4 carbonatomer 4-chlor-3-hydroxybutyrater med en utilfredsstillelnde optisk renhed.

Opfindelsen tilvejebringer derfor også en fremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive γ-substitue-20 rede 3(R)-hydroxybutansyrederivater med følgende formel, hvoraf bl.a. 3(R)-konfigurationen fremgår OH „ 0 ! 25 R .

i hvilken X betegner Cl, Br, I eller OH, og R betegner en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer, hvilken omfatter at en forbindelse med formlen 30 -00

I I

XCH-C-CHC-R 2 2 i hvilken X og R har de ovenfor bestemte betydninger 35 udsættes for enzymatisk indvirkning af L-3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] på oprenset form, samt 6

DK 163917 B

udvinding af de ønskede optisk aktive γ-substituerede 3(R)-hydroxybutansyrederivater fra enzymreaktionsblandingen .

De optisk aktive γ-sub stituerede L-B-hydroxybu-<. tansyrederivater kan omsættes med trimethyl- amin til opnåelse af de korresponderende γ-trimethyl-ammonium-L-3-hydroxybutansyrederivater, som let kan omdannes til L-carnitin ved behandling med vandig syre. Nedenstående reaktionsskema viser reaktionens enkelte io trin*

OH

go ' h o x Ιί II Micro- r 'Z li organisme ^ or L-&-hydroxyacyl

^ I CoA dehydrogenase II

X=C1, Br, I,' OH CH

I 3 ch3 Ψ 20

CH3 OH _ OH

I 3 ;.a I * J* 9 b3c*T<r— x" æ3 x ch3

IV III

25 . .

L-Carmtm

Det har vist sig, at reaktionen I I forløber

lettest, hvis X = Cl. Da den efterfølgende reaktion II

III imidlertid giver bedst udbytte, når X = iod eller brom, foretrækkes det først at fremstille Cl-derivatet 30 og derefter omdanne det til det korresponderende I-eller Br-derivat.

En forbedret fremgangsmåde er først at omdanne 4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreester til det korresponderende 4-iod- eller 4-brom-3 (R)-hydroxybutyrat. For nemheds skyld 35 refereres nedenfor til iodderivatet. lodforbindelsen (V) kan omsætter glat med trimethylamin ved stuetemperatur til opnpelse af VI, der let kan omdannes til L-carnitin

DK 163917B

7 i overensstemmelse med det følgende reaktionsskema: HO H 0 HO, M 0 ν(Λ -*ΐ- OCA.

II V

5 R * H eller ester CH, I 3

MeOH N-CH, I 3 ch3 10 CH« AU n

In? - 4 i. CH« OH Η n *Sr-

CH, OH form I“CH

3 3 VI

L-camitin 15

De før omtalte reaktioner, som eksemplificeret ved reaktionsligningerne, kan udsættes for talrige variationer. Uanset hvilken form, der således fremstilles, 20 omsættes esteren med natriumiodid i et passende opløsningsmiddel, såsom 2-butanon, acetone butanol, osv.

Den ønskede hovedreaktion med natriumiodid på dette sted i reaktionen er en substitutionsreaktion, som danner iodforbindelsen (V), uden at forstyrre det 25 chirale centrum ved carbonatomet i nabostilling. Til denne reaktion kræves mindst tilstrækkeligt natriumiodid til at erstatte alt chlor i II. Generelt sagt anvendes et lille overskud af natriumiodid.

Omsætningen af V med trimethylamin kan gennem-30 føres ved en moderat temperatur f.eks. ved 25°C (se S.

G. Boots og M.R. Boots, J. Pharm, Sci., 64, 1262, 1975) i en række forskellige opløsningsmidler såsom methanol eller ethanol, der indeholder trimethylamin i overskud.

Det er værd at lægge mærke til, at der afhængigt af 35 hvilken alkohol der anvendes som opløsningsmiddel, sker en omesterificering. F.eks. dannes L-carnitinmethyl-ester ved reaktionen, når methanol anvendes som opløs- 8

DK 163917 B

ningsmiddel. Denne omesterificering er fordelagtig, idet at L-carnitinmethylester som bekendt kan omdannes direkte til L-carnitin på fri baseform ved passage gennem en ionbytterkolonne (OH ) (se E. Strack og J. Lorenz, 5 J. Physiol. Chem (1966) 344, 276).

Det kan ses af beskrivelsen af de ovenstående processer, at der dannes flere forskellige hidtil ukendte og meget nyttige optisk aktive mellemprodukter.

Specielt nyttig er 4-iod-3(R)-hydroxybutansyrealkyΙ-ΙΟ estere, hvor alkylgruppen indeholder mellem 6 og 10 carbonatomer. Octylesteren er særligt foretrukken.

Mikroorganismer med den ønskede oxido-reduktase-aktivitet er velkendte indenfor mikrobiologien, og en vilkårlig af disse mikroorganismer kan anvendes ved 15 gennemførsel af processen ifølge opfindelsen (se K.

Kieslich, "Microbial Transformations of Non-Stereoid Cyclic Compounds" (George Thime Publishers, Stuttgart, 1976)) med slægterne af mikroorganismer, der specielt er beskrevet heri som særligt egnede. Let tilgængelige 20 og billige mikroorganismer af slægten Saccharomyces, f.eks. ølgær, bagegær eller vingær (Saccharomyces vini) har vist sig at producere L-p-hydroxyacyl—CoA-dehydro-genase (EC 1.1.1.35] og at være særdeles fordelagtige ved gennemførsel af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

25 Enzymet er beskrevet af S.J. Wakil og E.M. Barnes Jr. in Comprehensive Biochemistry Vo. 185(1971) side 57-104.

4-Substitueret aceteddikesyresubstrat kan inkorporeres i et næringsmedium med standardsammensætning, i hvilket disse mikroorganismer dyrkes ved sædvanlige 30 fermenteringsbetingelser, for at fremkalde den reduktive omsætning. Alternativt kan den aktive bestanddel fjernes fra den dyrkede kultur af mikroorganismer, f.eks. ved opløsning af cellerne for at frigøre enzymer, eller ved suspension af hvilende celler i et friskt vandigt 35 system. Ved en vilkårlig af disse metoder vil β-keto-gruppen blive reduceret selektivt, så længe det af mikroorganismerne dannede aktive system er til stede i mediet. Som det vil stå klart for en sagkyndig vil reak- 9

DK 163917 B

tionstiden selvfølgelig være afhængig under hvilke temperatur- og trykforhold kontakten af 4-substitueret aceteddikesyrederivat med aktivt enzym finder sted.

F.eks. vil det tid, der er nødvendig til at forårsage 5 den reduktive omsætning, være mindre ved let opvarmning og atmosfæretryk end hvis reaktionen alt andet lige forløber ved stuetemperatur. Selvfølgelig må hverken tryk eller temperatur være så høj eller tiden så lang, at det resulterer i, at substratet nedbrydes. I de 10 tilfælde, der anvendes en organismekultur i vækst, skal reaktionsbetingelserne være så milde, at organismerne ikke dræbes inden de har produceret tilstrækkeligt hydrolytisk enzym til at reaktionen er i stand til at forløbe. Generelt kan temperaturen variere fra ca. 10°C 15 til ca. 35°C, og reaktionstiden fra ca. 12 timer til ca.

10 dage ved atmosfæretryk.

I de følgende eksempler, i hvilke opfindelsen belyses nærmere, var γ-halogenaceteddikesyrederivat-substraterne, der blev udsat for mikrobiel reduktion, 20 fremstillet ud fra diketen i overensstemmelse med den generelle metode af C.D. Hurd og H.L. Abernethly (J. Am.

Cher.. So., 62, 1147, 1940) for γ-chloraceteddikesyre-derivater og F. Chick, N.T.M. Wilsmore (J. Chem. Soc., 1978 (1910)) for γ-bromaceteddikesyrederivaterne via 25 det følgende reaktionsskema:

X2 \\ I

H2C^-<jS2 -XCH-C-CELCX

0-C=O

30 diketen ^RNH OR

1 ^ i I

XCH2CCH2C-NR XCH2CCH2C0R

35 hvor X = Cl eller Br Y - H eller alkyl R = som beskrevet tidligere 10

DK 163917 B

Alternativt kan γ-halogenaceteddikesyrederiva-terne, hvis det ønskes, fremstilles ud fra γ-halogened-dikesyreestere ved almindelig Grignard reaktion. F.eks. blev γ-chloraceteddikesyreoctylester let fremstillet 5 ved at koge γ-chloroctylesteren med to ækvivalenter magnesium under tilbagesvaling i 48 timer. Efter, fjernelse af opløsningsmidlet blev aceteddikesyreoctyl-esteren udvundet med 70% udbytte.

γ-Hydroxyaceteddikesyrederivater blev fremstil-10 let ud fra deres korresponderende γ-bromaceteddikesyre-derivater ved omrøring i dioxan-vandopløsning (1:1) indeholdende CaCO^ ved 25°C i 12 timer.

Hvert af de i overensstemmelse med de følgende eksempler fremstillede stoffer, blev identificeret med 15 hensyn til struktur ved brug af kernemagnetisk resonance (nmr) og indfrarød spektroskop! samt ved tyndtlags-chromatografi (TLC). Den optiske renhed og den absolutte konfiguration af produkterne blev fastlagt såvel ved deres omdannelse til L-carnitin som ved deres omdan-20 nelse til estere. Disse analysereslet ved hjælp af nmr-spektroskopi og optisk drejning.

Eksempel 1 (gær) (+)4-Chlor-3(R)-hydroxybutansyreoctylester blev 25 fremstillet som følger: ^XXx,—-> c'StX.

OC8H17 oc8h17 30 A. Fermentering. Overfladevækst af en ugegammel agerkultur af Candida keyfr. NRRL Y-329, dyrket på en agar med følgende sammensætning: 35

DK 163917B

11

Agar 20 g

Glucose 10 g Gærekstrakt 2,5 g K2HP04 1 g 5 Destilleret vand, q.s. 1 liter (Steriliseret 15 min. ved 20 p.s.i.) blev suspenderet i 5 ml 0,85% saltopløsning. En portion på 1 ml af denne suspension blev brugt til at inoculere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (F-l trin) indeholdende 50 ml 10 af det følgende medium (Vogel's medium): Gærekstrakt 5 g

Casaminosyrer 5 g

Dextrose 40 g

Na^-citrat x 5,5 E^O 3 g 15 KH2P04 5 5 NH4N03 2 g

CaCl2 x 2H20 0,1 g

MgS04 x 7H20 0,2 g

Sporelementopløsning 0,1 ml 20 Destilleret vand, q.s. 1 liter pH 5,6 (steriliseret i 15 min. ved 30 p.s.i.)

Sporelementopløsning_g/100 ml 25 Citronsyre x 1H20 5

ZnS04 x 7H20 7

Fe(NH4)2(S04)2 x 6H20 1

CuS04 x 5H20 0,25

MgS04 x 1H20 0,05 30 H3B03 0,05

NaH2Mo04 x 2H20 0,05

Kolben blev inkuberet på en rotationsryster (250 cycler pr. min-2" radius) i 24 timer ved 25°C, herefter 35 overførtes 10 volumen% af flaskens indhold til en anden 250 ml Erlenmeyerkolbe (F-2 trin) indeholdende 50 ml af Vocel's medium. Efter 24 timers inkubation på en rotationsryster blev 150 mg γ-chloraceteddikesyreoctylester 12

DK 163917 B

i 0,1 ml 10% "Tween 80" tilsat. F-2 trin-flasken blev herefter inkuberet i endnu 24 timer under de samme betingelser som anvendt ved inkuberingen af F-l trinflasken.

5 B. Isolation. 24 Timer efter tilsætningen af γ-chloraceteddikesyreoctylester, blev cellerne fjernet ved centrifugering. Væskefasen blev ekstraheret med 50 ml ethylacetat tre gange. Ethylacetatopløsningen blev tørret over Na2S0^ og inddampet til opnåelse af 10 olieagtig remanens (186 g). Remanensen blev opløst i 0,5 ml af den mobile fase og ført gennem en kolonne (1 x 25 cm) med silicagel (MN-kiselgel 60). Kolonnen blev elueret med "Skelly B":ethylacetat (8:1) og fraktioner af 14 ml blev opsamlet. Fraktion 6 og 7 indeholdt 15 det ønskede produkt og blev forenet og inddampet til tørhed, hvorved der fremkom 120 mg af en krystallinsk remanens. Omkrystallisation i ethylacetat-hexan gav 23 107 mg 4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreoctylester [a] +13,3° (c, 4,45) (CHC13)j pmr (5CDC13) 0,88 [3H, tr.

20 forvredet, CH3~(CH2)n~]? 1,28 [10H, s, -(CH2)5-]; 1,65 (2H, m, -CH2-CH2-CH2-0-C-); 2,62 (2H, d, J = 6 Hz,

O

-CH-CH^-COOR); 3,22 (IH, br., -OH); 3,60 (2H, d, J = 6 I Δ ~

OH

13

DK 163917 B

reaktionen forløbet i endnu 24 timer. Cellerne blev derefter fjernet ved filtrering gennem celiteskive.

Cellerne blev vasket med vand og med ethylacetat. Vaske-væskerne blev forenet med filtratet og fuldstændigt eks-5 traheret med ethylacetat. Ethylacetatfasen blev tørret over MgSO^ og inddampet til en olieagtig remanens, som blev chromatograferet i en silicagelkolonne til opnåelse af 2,52 g 4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreoctylester, som et fast stof med lavt smeltepunkt, [a]23 +13,2° 10 (c, 4,0, CHC13).

Eksempel 3 (+)4-Chlor-3(R)-hydroxybutansyrebenzylester blev fremstillet som følger: A. Fermentering. Overfladevækst af en ugegammel agar-20 kultur af Gliocladium virens ATCC 13362, dyrket på en agar med følgende sammensætning:

Maltekstrakt 20 g

Glucose 20 g

Pepton 1 g 25 Agar 20 g

Destilleret vand, q.s. 1 liter (steriliseret 15 min. ved 20 p.s.i.) blev suspenderet i 5 ml 0,85% saltopløsning. En portion på 1 ml af denne suspension blev brugt til at inoculere 30 en 250 ml Erlenmeyer-kolbe (F-l trin) indeholdende 50 ml af den følgende medium (Sojabønne-dextrosemedium):

Sojamel 5 g

Dextrose 20 g

NaCl 5 g 35 KH2P04 5 9 Gær 5 g

Vand 1 liter pH justeret til 7,0 14

DK 163917 B

Autoklaveret ved 15 p.s.i. i 15 minutter Kolben bleb inkuberet på en rotationsryster (250 cycler/min - 2" radius) i 24 timer ved 25°C, hvorefter 10 volumen% af indholdet blev overført til en 5 anden 250 ml Erlenmeyer-kolbe (F-2 trin) indeholdende 50 ml sojabønne-dextrosemedium. Efter inkubation i 24 timer på en rotationsryster, blev 150 mg γ-chloracet-eddikesyrebenzylester i 0,1 ml 10% "Tween 80" tilsat.

F-2 trin-kolben blev herefter inkuberet i endnu 24 timer 10 under de samme betingelser, der blev anvendt ved inku-bering af F-l trin-kolben.

B. Isolation. 24 Timer efter tilsætningen af γ-chlor-aceteddikesyrebenzylester, blev myceliet fjernet ved filtrering. Filtratet blev ekstraheret med 50 ml ethyl-15 acetat tre gange. Ethylacetatfasen blev tørret over MgSO^ og under vakuum inddampet til en rest på 160 mg.

Denne rest blev chromatograferet i en silicagelkolonne (MN-kiselgel 60 j 1 x 25 cm). Kolonnen blev elueret med "Skelly B” og ethylacetat (10:1), og fraktioner 20 af 12 ml blev opsamlet. Fraktionerne 11-16 indeholdt det ønskede produkt og blev forenet og inddampet til tørhed, hvorved der fremkom 115 mg 4-chlor-3(R)-hydroxy-butansyrebenzylester, [a]^ + 8,7° (c, 5,26; CHC13); pmr (6CDC13) 2,65 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-CH2-COOR);

25 OH

3.20 (IH, br, -OH)} 3,54 (2H, d, J = 6 Hz, C1-CH,-CH);

OH

4.20 (IH, m, -CH2-CH-CH2-); 5,12 (2H, s, -C-0-CH2C6H5);

OH O

30 7,31 (5H, s. fem aromatiske protoner). Analyseberegning for C11H1303Cli C 57,77, H 5,73. Fundet: C 57,64, H 5,67. TLC silicagel EM Brinkmannplade, 0,25 cm, = 0,43, "Skelly B"-ethylacetat (5:1).

35 Eksemplerne 4-23

Den samme fremgangsmåde i i eksempel 1 blev gentaget med hver af organismerne opstillet i tabel 1, med 15

DK 163917 B

den undtagelse, at γ-chloraceteddikesyreoctylesteren blev tilsat til en koncentration på 1 mg/ml. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-chlor-3(R)-hydroxybutan-syreoctylester fandt sted. Fremgangsmåden i disse ek-5 sempler blev gentaget med kontinuert tilsætning af substratet til gærmediet. Vægtforholdet substrat/gær var ca. 1:1,5 med fremragende omsætning til det ønskede produkt.

10 Eksemplerne 24-48

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev gentaget med enhver af organismerne opstillet i tabel 2, med den undtagelse, at γ-chloraceteddikesyreoctylester (1 mg/ml) blev anvendt. Omsætning til dem ønskede for-15 bindelse, (+)4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreoctylester fandt sted.

Eksempelerne 49-68

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev 20 gentaget med enhver af organismer opstillet i tabel 1 med den undtagelse, at γ-chloraceteddikesyrebenzyl-ester (1 mg/ml) blev anvendt som substrat. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-chlor-3(R)-hydroxybutan-syrebenzylester fandt sted.

25

Eksemplerne 69-93

Den samme fremgangsmåde i eksempel 3 blev gentaget med enhver af organismerne opstillet i tabel 2 med brug af γ-chloraceteddikesyrebenzylester som substrat 30 (1 mg/ml). Omdannelse til det ønskede produkt (+)4-chlor- 3(R)-hydroxybutansyrebenzylester fandt sted.

Eksempel 94 (+)4-Chlor-3(R)-hydroxybutansyreanilid blev 35 fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 2, bortset fra at 4-chloracetoacetanilid blev brugt ved en koncentration på 1 mg/ml

DK 163917B

16 XNØ 5 soir. substrat for omsætningen til det ønskede optisk aktive produkt, snip. 110-111°C; [a]^ +17,5° (c, 3,0 CHC13)j pmr (6CD3CCD3) 2,67 (2H, d, J = 6 Hz,

O

-HOCHCH2-CONHR); 3,66 ]2H, d, J = 6 Hz, C1CH2CH0H-R); 10 4,43 (IH, m, -CH2-CHOH-CH2-) ; 7,03-7,44 (3H, m, aroma tiske protoner i meta- og parastilling); 7,69 (2H, d, J = 6 Hz, aromatiske protoner i orthostilling); 9,24 (IH, br, -C-HN-Ø). Analyseberegning for C^qH^2N02C1: C 56,21; H 5,66. Fundet: C 56,17; H 5,47.

15

Eksemplerne 95-114

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev gentaget med enhver af organismerne opstillet i tabel 1 bortset fra at γ-chlor-acetoacetanilid blev tilsat til 20 en koncentration på 1 mg/ml. I alle tilfælde fandt omsætning til det ønskede produkt (+)4-chlor-3(R)-hy-droxybutansyreanilid sted.

Eksemplerne 115-139 25 Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev aentaget med enhver af organismerne opstillet i tabel 2. γ-Chloracetoacetanilid blev tilsat til en koncentration på 1 mg/ml. I disse tilfælde blev omsætning til det ønskede (+)4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreanilid 3 0 opnået.

Eksemplerne 140-159

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 1, bortset 35 fra at γ-bromaceteddikesyreoctylester (1 mg/ml) blev anvendt som substrat. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-brom-3(R)-hydroxybutansyreoctylester blev opnået.

DK 163917B

17

Eksemplerne 160-184

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 2 med den undtagelse, at γ-bromaceteddikesyreoctylester (1 mg/ml) 5 blev anvendt. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-brom-3(R)-hydroxybutansyreoctylester fandt sted.

Eksemplerne 185-204

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev 10 gentaget med organismerne opstillet i tabel 1 med den undtagelse, at γ-bromaceteddikesyrebenzylester (1 mg/ml) blev anvendt som substrat. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-brom-3(R)-hydroxybutansyrebenzylester fandt sted.

15

Eksemplerne 205-229

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 2 med den forskel, at γ-bromaceteddikesyrebenzylester (1 mg/ml) 20 blev anvendt. Omsætning til det ønskede produkt (+)4-brom-3(R)-hydroxybutansyrebenzylester blev opnået.

Eksemplerne 230-249

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev 25 gentaget med organismerne opstillet i tabel 1 med den forskel, at γ-bromacetoacetanilid (1 mg/ml) blev brugt som substrat. Omsætning til det ønskede (+)4-brom-3(R)-hydroxybutansyreanilid blev opnået.

30 Eksemplerne 250-274

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 2 med den forskel, at "γ-bromacetoacetanilid (1 mg/ml) blev brugt som substrat. Omsætning til det ønskede (+)4-brom-35 3(R)-hydroxybutansyreanilid blev opnået.

18

DK 163917 B

Eksemplerne 275-294

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 1 med den forskel, at γ-hydroxyaceteddikesyreoctylester (1 mg/ml) 5 blev brugt som substrat. Omsætning til det ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxybutansyreoctylester fandt sted.

Eksemplerne 295-319

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev 10 gentaget med organismerne opstillet i tabel 2 med den forskel, at γ-hydroxyaceteddikesyreoctylester (1 mg/ml) blev brugt som substrat. Omsætning til det ønskede 4-hydroxy-3(R)-hydroxybutansyreoctylester fandt sted.

15 Eksemplerne 320-339

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 1 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 1 med den forskel, at γ-hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) blev brugt som substrat. Omsætning til det ønskede 4-hydroxy-20 3(R)-hydroxybutansyreanilid blev opnået.

Eksemplerne 340-364

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev gentaget med organismerne opstillet i tabel 2 med den 25 forskel, at γ-hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) blev anvendt som substrat. Omsætning til det ønskede 4-hy-droxy-3(R)-hydroxybutansyreanilid blev opnået.

Eksempel 365 30 Methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) =00.,., θα.,, 35

VII VIII

DK 163917B

19

Methyl-4-chloracetoacetat (VII) (100 mg), 29 enheder svinehjerte (EC 1.1.1.35), |3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (Sigma, H4626) og 1,36 g NADH (Sigma, 90%) bleb inkuberet i 30 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH 5 6,5.

Efter henstand i 30 timer ved 25UC blev reaktion sblandingen ekstraheret fire gange med 30 ml ethyl-acetat. Det organiske fase blev tørret over natriumsulfat og inddampet til tørhed under reduceret tryk.

10 Remanensen blev chromatograferet gennem en silicagel-kolonne (12 g silicagel, 1,3 x 34 cm). Kolonnen blev elueret med en opløsningsmiddelblanding bestående af "Skelly B"-ethylacetat (8:1), og fraktioner å 20 ml blev opsamlet. Frationerne 9-11, som indeholdt det 15 ønskede methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) iden- 2 3 tificeret ved TLC analyse og med [cy +23,5° (c, 5,2 CHC13), blev forenet.

Eksempel 366 20 Den samme fremgangsmåde som i eksempel 365 blev gentaget med brug af ethyl-4-chloracetoacetat som substrat til dannelse af ethyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, [a]jp +22,7° (c, 4,7, CHC13).

25 Eksempel 367

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 365 blev gentaget med brug af n-propyl-4-chloracetoacetat som substrat til dannelse af n-propyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, [a]33 +21,5° (c, 5,0, CHC13).

30

Eksempel 368

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 365 blev gentaget med brug af n-butyl-4-chloracetoacetat som substrat til dannelse af n-butyl-4-chlor-3(R)-hydroxy- 35 butyrat, [a]^3 +20,1° (c, 3,1, CHC13).

Generel fremgangsmåde til omdannelse af 4-halo-gen-3(R)-hydroxybutansyreestere og -amider til L-carni-tin.

DK 163917 B

20

Eksempel 369

En blanding af 4-chlor-3(R)-hydroxybutansyreoc-tylester (1,5 g), ethanol (3 ml) og trimethylamin (25 vægt% opløsning) i vand (3 ml) blev opvarmet til 5 80-90°C i ca. 2 timer. Blandingen inddampes til tørhed under vakuum til opnåelse af 1,8 g råprodukt. Det rå produkt (1 g) blev opvarmet til 80-90°C i en 10% HC1-opløsning (7 ml) i 1,5 timer. Efter afdrivning af opløsningsmidlet under reduceret tryk, blev råproduktet 10 ekstraheret to gange med absolut ethanol (10 ml), og ethanolen blev afdrevet under vakuum. Den krystallinske remanens blev opløst i en lille mængde ethanol og L-car-nitinchlorid, smp. 142°C (dek.); [a] -23,7° (c, 4,5, H2O), blev udfældet i godt udbytte (320 mg) ved til-15 sætning af ether.

L-Carnitinchlorid kan let omdannes til det farmaceutisk foretrukne indre L-carnitinsalt ved velkendte ionbytningsmetoder.

20 Eksempel 370

Octyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat (IX) ® 0 OH 0 . : 11 ‘ ix

En blanding af octyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (II) (1,426 g) og vandfrit Nal (1,2 g) i 15 ml methyl-30 ethylketon blev kogt under tilbagesvaling i 24 timer. Blandingen blev rotationsinddampet og omsat med ether (100 ml) og vand (50 ml). Den organiske fase blev skilt fra og vasket med en 10% natriumsulfatopløsning (150 ml) samt med en saltvandsopløsning (150 ml) og tøret over 35 vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet blev afdrevet under reduceret tryk, hvorved der fremkom 1,762 g af IX som en lys, gul olie. IR (tynd film) 3460 cm”1 (OH) og 1730 cm”1 (ester C=0). PMR (CDC13) 3,93-4,27 (m, 3H), 21

DK 163917 B

3,17 (d, 2H), 2,50 (d, 2H), 1,50-1,87 (m 2H), 1,30 (bs, 12H), 0,93 (m 3H).

Omdannelse af octyl-4~iod-3(R)-hydroxybutyrat(IX) til 5 L-carnitin.

f 3 2H O N—CH3

i>Sl «3 _ f3 OB nO

10 CT30H> i" ca3 oca3

« X

15 9®3 OH

arfJ*X

CH3 o- L-Camitin 20

En 25% opløsning af trimethylamin i vand (8 ml) blev tilsat til en opløsning af IX (1,593 g) i methanol (15 ml). Blandingen henstod under omrøring i 20 timer ved 27°C. Opløsningsmidlerne og overskuddet af trime-25 thylamin blev afdrevet under reduceret tryk, hvorved der fremkom et semikrystallinsk, fast stof, X. Denne remanens blev vasket med små mængder ether for at fjerne octanol og derefter opløst i vand og ført gennem "Dowex l-x4 kolonne [OH form, 50-100 mesh., kolonnevolumen 30 2,5 x 15 cm]. Kolonnen blev vasket med destilleret vand.

Fjernelse under vakuum af opløsningsmidlet fra de første 200 ml eluat gav L-carnitin som et hvidt krystallinsk, fast stof (490 mg, 65% udbytte) [a]^ -29,2° (c, 6,5 H20).

35

Eksempel 371

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af hexyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat 22

DK 163917 B

til opnåelse af hexyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, som derefter blev omdannet til L-carnitin.

Eksempel 372 5 Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af heptyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat til opnåelse af heptyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, som derefter blev omdannet til L-carnitin.

10 Eksempel 373

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af decyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat til opnåelse af decyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, som derefter blev omdannet til L-carnitin.

15

Eksempel 374

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) til opnåelse af methyl-4-iod-3(R)-hydroxybuty-20 rat, som derefter blev omdannet til L-carnitin.

Eksempel 375

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af ethyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat 25 til opnåelse af ethyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, som derefter blev omdannet til L-carnitin.

Eksempel 376

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev 30 gentaget med brug af n-propyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat til opnåelse af n-propyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, som efterefter blev omdannet til L-carnitin.

Eksempel 377 35 Den samme fremgangsmåde som i eksempel 370 blev gentaget med brug af n-butyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat til opnåelse af n-butyl-4-iod-3(R)-hydroxybutyrat, scm derefter blev omdannet til L-carnitin.

DK 163917B

23

Repræsentative gær og fungi, der danner det ønskede enzym, er opstillet i henholdsvis tabel 1 og tabel 2.

5 Tabel 1 (Gær) 1. Candida lipolytica NRRL Y-1095 2. Candida pseudotropjcalis NRRL Y-1264 3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615 10 4· Torala lactosa NRRL Y-329 5. Geotrichum candidun NRRL Y-552 6. Hansenula anomala NRRL Y-366 7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683 8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026 15 S ac charomvc esc e revi s i ae NRRL Y-12,632 10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140 11- Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12,624 12.

12. Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253 13. Kloeckera corticis ATCC 20109 2o 14. Cryptococus mascerans' ATCC 24194 15. Rhodotorula sp. ATCC 20254 15. Candida albicans .ATCC 752 17. Dipodascus albidus ATCC 12934 18. Saccharomyces c'erevisiae (commercial Red Star) 25 19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592 20. Oosoora lactis ATCC 14318 NRRL --Northern Regional Research Lab. at Peoria,

Illinois.

30 ATCC - American Type Culture Collection at Rockville, Maryland.

DK 163917B

24

Tabel 2 (Fungi) 1. Gliocladium virens ATCC 13362 2. Caldariomyces fumago ATCC 16373 5 3- Linderina pennisopora ATCC 12442 4. Aspergillus ochraceus NRRL 405 5. Trichoderma lignormn ATCC 8678 6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328 7. Entomophthora coronata NRRL 1912 10 8* Scopulariopsis constantini NRRL 1860 9. Zygorhvnchus heterogamus ATCC 6743 10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157 11. ·Rhizopus arrhizus NRRL 2286 12. Penicillium thomii NRRL 2077 15 13. Wucor hieaali3 (-) NRRL 4088 14. Byssochlaays nivea ATCC 12550 15. Penicillium patulum NRRL 1952 16. Metarrhizium anisooliae ATCC 24942 17. Penicillium islandicum ATCC 10127 20 18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a 19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a 20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907 21. Aspergillus amstelodami NRRL 90 22. Gliocladium roseum ATCC 10521 25 23. Aspergillus gjqanteus ATCC 10059 24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b 25. Penicillium rocueforti NRRL 849a

Claims (24)

1. Forbindelser med følgende formler, hvoraf bl.a. 3(R) konfigrationen fremgår 5 \/ ί i hvilken X betegner Cl, Br, I eller OH og R betegner en alkoxygruppe med mellem 1 og 15 carbonatomer, phenoxy- eller phenylalkoxygruppe med mellem 7 og 14 carbonatomer eller en phenylaminogruppe.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendeteg- 15 net ved, at R betegner en ligekædet alkoxygruppe med mellem 1 og 10 carbonatomer.

3. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner 0C]_qh2i*

4. Forbindelse ifølge krav 2, kendeteg- 2Q net ved, at R betegner OCgH^.

5 OH. .H 0 xOOkR i hvilken X har den ovenfor fastlagte betydning, og R 10 betegner en alkoxygruppe med mellem 1 og 4 carbonatomer, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen 0 0 xch2-c-ch2I-r 15 i hvilken X og R har de ovenfor fastlagte betydninger udsættes for enzymatisk påvirkning af L-3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase[EC 1.1.1.35]i oprenset form, og udvinding af de Ønskede optisk aktive γ-substituerede 20 3(R)-hydroxybutansyrederivater fra den enzymatiske reaktionsblanding .

5. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner OC^H^g.

6. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner OCgH^g. 2g

7. Forbindelse ifølge krav 2, kendeteg net ved, at R betegner en alkoxygruppe med mellem 1 og 4 carbonatomer.

8. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R betegner en phenoxy- eller phenyl- 3Q alkoxygruppe, substitueret med en halogen-, nitro-eller lavere alkylgruppe.

9. Forbindelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at R betegner benzyloxygruppen, og X betegner Cl eller Br.

10. Forbindelse ifølge krav 1, kendeteg net ved, at R betegner phenylaminogruppen, og X betegner Cl eller Br. DK 163917B

11. Fremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive γ-substituerede (3-hydroxybutansyrederivater med formlen °H H 0 R i hvilken X betegner Cl, Br, I eller OH, og R betegner en alkoxygruppe med mellem 1 og 15.-10 carbonatomer, phenoxy- eller phenylalkoxygruppe med mellem 7 og 14 carbonatomer eller en phenylami-nogruppe ud fra de tilsvarende γ-substituerede aceteddikesyre--|5 estere eller -amider, kendetegnet ved, at de γ-substituerede aceteddikesyreestere eller -amider udsættes for fermentativ enzymatisk behandling med en mikroorganisme, der danner L-3-hydroxyacyl-CoA-dehydro-genase (EC 1.1.1.3¾ og udvinding af det ønskede optisk 2Q aktive γ-substituerede β-hydroxybutansyrederivat.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11.til fremstilling af optisk aktive γ-substituerede 3(R)-hydroxy-butansyrederivater med følgende formel, hvoraf bl.a. 3(R) konfigurationen fremgå!

25 OH « 0 i hvilken X og R har de ovenfor fastlagte betydninger, 30 hvor R indeholder mellem 5 og ca. 15 carbonatomer, hvis det betegner en alkoxygruppe, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen 0 0 35 ' !· ! XCH -C-CH CR 2 2 i hvilken X og R har de ovenfor fastlagte betydninger, udsættes for fermentativ enzymatisk påvirkning af en DK 163917 B mikroorganisme, der danner L-f3-hydroxyacyl-CoA-dehydro-genase (EC 1.1.1.35), og de ønskede optisk aktive 4-sub-stituerede 3 (R)-hydroxybutansyrederivater fra den fermentative reaktionsblanding udvindes. 5

-13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kende tegnet ved, at mikroorganismen er valgt fra klassen Ascomycetes.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt fra en af fa- 10 milierne Endomycetales, Mucorales, Moniliales eller Eurotiales.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt fra familien af Saccharomyces.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kende tegnet ved, at mikroorganismen er Saccharomyces cerevisiae.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det γ-substituerede aceteddike- 20 syrederivat, der udsættes for fermentativ enzymatisk påvirkning er γ-chloraceteddikesyreoctylester.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det γ-substituerede aceteddike-syrederivat, der udsættes for fermentativ enzymatisk 25 påvirkning, er γ-chloraceteddikesyrebenzylester.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det γ-substituerede aceteddikesyre-derivat, der udsættes for fermentativ enzymatisk påvirkning, er γ-chloracetoacetanlid.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kende tegnet ved, at mikroorganismen er Saccharomyces cerevisiae.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Saccharomyces 35 cerevisiae.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Saccharomyces cerevisiae. DK 163917 B

23. Fremgangsmåde ifølge krav 11 til fremstilling af optisk aktive γ-substituerede 3(R)-hydroxybutansyre-derivater med følgende formel, hvoraf bl.a. 3(R) konfigurationen fremgår

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at L-3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenasen [EC 1.1.1.35]på oprenset form er isoleret fra svine- 25 hjerter.