AT393136B

AT393136B - Verfahren zur herstellung von beta-hydroxybuttersaeurederivaten

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Publication number: AT393136B
Application number: AT4237/83A
Authority: AT
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-05
Publication date: 1991-08-26
Also published as: IL70352A0; GB8332359D0; CH661498A5; JPH0767674A; CA1225956A; DE3344085A1; FI834419A0; FI81115B; FI81115C; AU2175883A; SE455501B; DE3344085C2; DK163917C; GB2132614A; NO159291C; ES527807A0; GB2132614B; IE832732L; DK163917B; DK559283D0

Description

AT 393 136 B

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter ß-Hydroxybuttersäurederivate, welche leicht in L-Camitinchlorid übergeführt werden können.

Camitin (ß-Hydroxy-y-trimethylaminobuttersäure) enthält bekanntlich ein asymmetrisches Zentrum und daher kommt Camitin in zwei stereoisomeren Formen, der D- und der L-Form, vor. L-Camitin ist üblicherweise im Körper vorhanden, wo es die Funktion eines Trägers für aktivierte langkettige freie Fettsäuren beim Transport durch die mitochondriale Membran hat. Da die mitochondriale Membran für Acyl-CoA-Derivate undurchlässig ist, können langkettige freie Fettsäuren nur dann hindurchtreten, wenn eine Veresterung mit L-Camitin stattgefunden hat. Die Trägerfunktion von L-Camitin wird sowohl beim Transport von aktiven langkettigen Fettsäuren von den Stellen ihrer Biosynthese, z. B. den Mikrosomen, zu den Mitochondrien ausgeübt, wo sie oxydiert werden, als auch beim Transport von Acetyl-CoA von den Mitochondrien, wo es gebildet wird, zu den extramitochondrialen Stellen, wo die Synthese der langkettigen Fettsäuren stattfindet, beispielsweise in die Mikrosomen, wo Acetyl-CoA für die Synthese von Cholesterol und Fettsäuren verwendet werden kann. Während festgestellt wurde, daß das linksdrehende Isomer (L-Camitin) ausschließlich die biologische Form ist (D-Camitin wurde bisher in Geweben von Säugetieren nicht gefunden), wurde das DJ^-Camitinracemat seit mehreren Jahren bei verschiedenen Indikationen verwendet. Beispielsweise wird D,L-Camitin in Europa als Appetitstimulanz verkauft, und es wurde berichtet, daß das Material einen Einfluß auf die Wachstumsgeschwindigkeit bei Kindern hat; siehe z. B. Bomiche et al., Clinica Chemica Acta, 5, 171-176, 1960 und Alexander et al., "Protides in the Biological Fluids", 6th Colloquium, Bruges, 1958,306-310. In der US-PS 3,830,931 wird die Verbesserung der Myocardkontraktibilität und des systolischen Rhythmus bei kongestiven Herzfehlern beschrieben, die oft durch Verabreichung von DJL-Carnitin erzielt werden kann. Die US-PS 3,968,241 offenbart die Verwendung von DJL-Camitin bei der Behandlung der Fettsucht.

In jüngster Zeit hat sich jedoch ein steigendes Interesse an der Wichtigkeit der ausschließlichen Verwendung von linksdrehendem Isomer von Camitin zumindest für einige therapeutische Anwendungen gezeigt. Es wurde gezeigt, daß D-Camitin ein konkurrenzfähiger Inhibitor von camitingebundenen Enzymen, wie Camilinacetyltransferasc (CAT) und Carnitinpalmityltransferase (PTC) ist. Außerdem deuten jüngste Untersuchungen darauf hin, daß D-Camitin das L-Camitin aus dem Herzgewebe entfernen kann. Es ist daher wesentlich, daß ausschließlich L-Camitin bei der medizinischen Behandlung von Herzkrankheiten oder bei der Senkung der Blutlipide Patienten verabreicht wird.

Es wurden bereits mehrere Verfahren zur Herstellung von Camitin im industriellen Maßstab vorgeschlagen. Die chemische Synthese von Camitin führt jedoch unabwendbar zu einem racemischen Gemisch von D- und L-Isomeren. Dementsprechend mußten Trennmethoden verwendet werden, um die einzelnen optischen Antipoden aus dem Racemat zu erhalten. Diese Trennmethoden sind jedoch beschwerlich und aufwendig.

Es ist Ziel dieser Erfindung, L-Camitin in guter Ausbeute durch Kombination von mikrobiologischen und chemischen Verfahren hersteilen zu können, wobei die Synthese von L-Camitin aus leicht zugänglichen, niedrige Kosten ergebenden Rohmaterialien ermöglicht werden soll.

Gegenstand der Erfindung ist die Offenbarung eines Verfahrens zur Herstellung von brauchbaren optisch aktiven Zwischenprodukten für die Synthese von L-Camitin und seinen Salzen und Estern.

Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden detaillierten Beschreibung klarwerden.

Das die ß-Ketofunktion in der 3-Stellung in den γ-substituierten Acetoessigsäurederivaten durch Hydrierung über Pt/C reduziert werden kann, ist bekannt (z. B. US-PS 3,969,406). Die mit dieser Methode erhaltene Hydroxy Verbindung ist jedoch racemisch. Im Gegensatz dazu kann durch Anwendung der fermentativen Wirkung eines Mikroorganismus in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Hydrierung der Oxofunktion in der 3-Stellung stereoselektiv ausgeführt werden, um optisch aktive γ-substituierte ß-Hydroxybuttersäurederivate zu erhalten.

Insbesondere wird nach geeigneter Auswahl (wie im folgenden beschrieben) des der fermentativen Wirkung des Mikroorganismus in Übereinstimung mit dem Verfahren dieser Erfindung unterworfenen Substraten die 3(R)-oder L-epimere Konfiguration erhalten. Diese Konfiguration ist für die Umsetzung in das natürliche L-Camitin erforderlich.

Ganz allgemein umfaßt die Erfindung die Verwendung des mikiobischen Reduktaseenzyms L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] zur katalytischen stereoselektiven Hydrierung von γ-substituierten Acetoessigsäurederivaten wie nachstehend definiert.

In Übereinstimmung mit seinem allgemeinsten Aspekt besteht daher das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter ß-Hydroxybuttersäurederivate mit der Formel

H

OH -2-

X

AT 393 136 B worin X CI, Br, J oder OH und R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Klasse, bestehend aus Alkyloxyresten mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen; Alkylaminoresten mit 5 bis 15 Kohlenstoffatomen, Cycloalkoxyresten und Cycloalkylaminoresten mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen; Phenoxy und Phenylalkoxyresten mit 7 bis 14 C-Atomen; Phenylamino- und Phenylalkylaminoresten mit den Formeln

Y YZ

I I I - Ν-0-Α und - N-CH-0-A , worin Y und Z für H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen, Phenyl- oder Benzyl und A H, CH^, CI oder Br ist, bedeuten, aus den entsprechenden γ-substituierten Acetoessigsäureestem oder -amiden darin, daß die γ-substituierten Acetoessigsäureester oder -amide der fermentativen enzymatischen Wirkung eines Mikroorganismus, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] erzeugt, unterworfen, und die gewünschten optisch aktiven γ-substituierten ß-Hydroxybuttersäurederivate gewonnen werden.

Insbesondere besteht das Verfahren zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter 3(R)· Hydroxybuttersäurederivate der Formel und 3(R)-Konfiguration

R worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, daß, wenn R ein Alkoxyrest ist, dieser 5 bis 15 C-Atome aufweist, darin, daß Verbindungen der Formel

O O

II II xch2-c-ch2-cr worin X und R die oben angegebene Bedeutung haben, der fermentativen enzymatischen Wirkung eines Mikroorganismus, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] erzeugt, unterworfen werden, und die gewünschten optisch aktiven 4-subsdtuierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate aus der fermentativen Reaktionsmischung gewonnen werden.

Es wurde gefunden, daß jeder Mikroorganismus, welcher das gewünschte Enzym produziert, geeignet ist, um die stereoselektive Reduktion zu katalysieren. Insbesondere geeignet sind die Mikroorganismen der Klasse Ascomycetes, der Ordnungen Endomycetales, Mucorales, Moniliales und Eurotiales und der Gattung Saccharomyces. Besonders bevorzugt ist Saccharomyces Cerevisiae.

Zur Herstellung optisch aktiver 4-substituierter 3(R)-Hydroxybuttersäureester, enthaltend 1-4 Kohlenstoffatomen, ist es notwendig, gereinigte L-ß-Hydroxyxyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35], wie z. B. jene vom Schweineherz zu verwenden, weil unversehrte Mikroorganismen störende Oxidoreduktasen mit entgegengesetzter Konfiguration besitzen. Die mikrobische Reduktion von z. B. 4-Chloracetoessigsäureestem mit 1-4 Kohlenstoffatomen ergibt daher 4-Chlor-3-hydroxybutyrate mit unbefriedigenden optischen Reinheiten.

Die vorliegende Erfindung schafft daher auch ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate mit der Formel und 3(R)-Konfiguration

X

R worin X die oben angegebene Bedeutung hat und R einenen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlstensloffatomen bedeutet, welches darin besteht, daß Verbindungen der Formel -3-

AT393 136 B Ο Ο

II II xch2-c-ch2-c-r , worin X und R die oben angegebene Bedeutung haben, der enzymatischen Wirkung von L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gereinigter Form unterworfen werden, und die gewünschten optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate aus der enzymatischen Reaktionsmischung gewonnen werden.

Die vorliegende Erfindung liefert so Verbindungen der Formel und 3(R)-Kortfiguration

R worin X CI, Br, J oder OH und R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Klasse bestehend aus Alkoxyresien mit 1 bis 15 C-Atomen, Alkylaminoresten mit 5 bis 15 C-Atomen, Cycloalkoxyresten und Cycloalkylaminoresten mit 5 bis 12 C-Atomen, Phenoxy- und Phenylalkoxyresten mit 7 bis 14 C-Atomen, Phenylamino- und Phenylalkylaminoresten der Formeln

Y YZ

I I I - Ν-0-Α und - N-CH-0-A , worin Y und Z für H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen Phenyl oder Benzyl und A H, CH·}, CI oder Br ist, bedeuten.

Die optisch aktiven γ-substituierten L-ß-Hydroxybuttersäurederivate können dann mit Trimethylamin umgesetzt werden, um das entsprechende γ-Trimethylammonium-L-ß-hydroxybuttersäurederivat zu liefern, welches leicht in das L-Camitin durch Behandlung mit wässerigen Säuren übergeßihrt weiden kann. Im folgenden ist ein Schema der Reaktionsstufen dieses Verfahrens angeführt.

I

oder L-0-Hydroxyacyl-' CoA-dehydrogenase II

R

L-Camitin *

Es wurde gefunden, daß die oben angeführte Reaktion I —> II am leichtesten vor sich geht, wenn X=Chlor. Da jedoch die nachfolgende Reaktion II —> HI bessere Ausbeuten liefert, wenn X = Jod oder Brom ist, wird vorzugsweise zunächst das Cl-Derivat hergestellt und dann dieses in das entsprechende J- oder Br-Derivat übergeführt. -4- 5

AT 393 136 B

Aus Gründen der Einfachheit wird im folgenden auf das J-Derivat Bezug genommen. Das Jodhydrin (V) kann glatt mit Triethylamin bei Raumtemperatur umgesetzt werden, um VI zu liefern, welches leicht in das L-Camitin gemäß der folgenden Reaktionsfolge übergeführt wird:

HQ, H 0 "ναΛ ii R - H oder Ester 10

feOH Γ3 N-CH, I 3 15 20

.. Dowex-1 ^ harz OH“- form CH 3

Das obige, durch die Gleichung beispielsweise wiedergegebene Verfahren wird verschiedenen Abänderungen 25 unterworfen. Ungeachtet, welche Form dann zur Verfügung steht, wird der Ester mit Natriumjodid in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. 2-Butanon, Aceton, Butanol usw., umgesetzt. Die gewünschte Hauptreaktion an diesem Punkt der Reaktion mit Natriumjodid ist eine Austauschreaktion, welche das Jodhydrin (V) bildet, ohne Zerstörung des Chiralzentrums am benachbarten Kohlenstoffatom. Für diese Reaktion ist mindestens genug Natriumjodid erforderlich, um alles Chlorid aus II zu ersetzen. Allgemein wird ein leichter Überschuß an 30 Natriumjodid verwendet.

Die Reaktion von V mit Trimethylamin kann bei milden Temperaturen (z. B. 25 °C) (siehe S. G. Boots und M. R. Boots, J. Pharm. Sei., 64,1262, 1975) in einer Vielzahl von Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder Äthanol, enthaltend einen Überschuß an Trimethylamin, ausgeführt werden. Es ist beachtenswert, daß in Abhängigkeit von verwendetem alkoholischen Lösungsmittel ein Esteraustausch stattündet. Beispielsweise wird 35 bei Verwendung von Methanol als Lösungsmittel L-Camitinmethylester in der Reaktion erhalten. Diese Austauschreaktion ist vorteilhaft, weil es bekannt ist, daß Camitinmethylester direkt in die freie Basenform von L-Camitin durch Hindurchleiten durch eine Ionenaustauschersäule (OH*) [siehe E. Strack und J. Lorenz, J, Physiol. Chem. (1966) 344,276] übergeführt werden kann.

Aus der Beschreibung der vorhergehenden Verfahren ist ersichtlich, daß eine Anzahl von neuen und sehr 40 brauchbaren optisch aktiven Zwischenprodukten gebildet werden. Besonders brauchbar sind die 4-Jod-3(R)-hydroxybuttersäurealkylester, in welchen die Alkylgruppen je 6 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen. Der Öctylester ist besonders bevorzugt.

Mikroorganismen, welche die gewünschte oxidoreduktase Wirksamkeit haben, sind in der Mikrobiologie bekannt und jeder dieser Mikroorganismen kann bei Durchführung des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung 45 verwendet werden (siehe K. Kieslich, "Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds" (Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976)), wobei jede der hierin beschriebenen spezifischen Mikroorganismusgauungen besonders geeignet ist. Es wurde gefunden, daß die leicht zugänglichen und billigen Mikroorganismen der GaUung Saccharomyces, z. B. Bierhefe, Backhefe und Weinhefe (Saccharomyces vini) die L-ß-Hydroxylacyl-CoA-dehydrogenase [EL 1.1.1.35] produzieren und außergewöhnlich vorteilhaft bei der 50 Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung sind. Das Enzym ist von S. J. Wakil und E. M. Barnes Jr. in Comprehensive Biochemistry Vo. 185 (1971) S. 57-104, beschrieben.

Das 4-substituierte-Acetoessigsäure-Substrat kann in ein Nährmedium mit Standardzusammensetzung, in welchem solche Organismen kultiviert werden, eingebracht werden, und die üblichen Fermentationsbedingungen können dann angewendet werden, um die reduktive Umformung zu bewirken. Alternativ kann der wirksame 55 Grundbestandteil aus der wachsenden Kultur des Mikroorganismus entfernt werden, z. B. durch Lysis der Zellen, um die Enzyme freizugeben, oder durch Suspension der Ruhezellen in einem frischen wässerigen System. Bei jeder dieser Methoden wird die ß-Ketofunktion selektiv reduziert, solange das durch die Mikroorganismen erzeugte wirksame Enzym in dem Medium gegenwärtig ist. Natürlich sind die Temperaturen-, Zeit- und Druckbedingungen, unter welchen der Kontakt des 4-substituierten-Acetoessigsäurederivates mit dem 60 reduzierenden Enzym erfolgt, voneinander abhängig, wie dies dem Fachkundigen einleuchtend sein wird. Beispielsweise wird bei mäßigem Erwärmen und bei atmosphärischem Druck die erforderliche Zeit für die -5-

AT 393 136 B reduktive Umsetzung geringer sein, als wenn sie bei Raumtemperatur unter sonst gleichen Bedingungen erfolgt. Natürlich sollte weder die Temperatur noch der Druck noch die Zeit so groß sein, daß sich ein Abbau des Substrates ergibt. Wo eine wachsende Kultur des Organismus verwendet wird, sollten auch die Verfahrensbedingungen genügend milde sein, so daß der Organismus nicht getötet wird, bevor er genügend hydrolytische Enzyme erzeugt hat, um die Ausführung der Reaktion zu gewährleisten. Im allgemeinen kann bei atmosphärischem Druck die Temperatur im Bereich von etwa 10 °C bis etwa 35 °C und die Zeit im Bereich von etwa 12 h bis etwa 10 Tagen liegen.

In den folgenden Beispielen, welche der Erläuterung der Erfindung dienen, ohne sie zu beschränken, werden die γ-Halogenacetoessigsäurederivatsubstrate, die der mikrobiologischen Reduktion unterworfen werden, aus dem Diketen gemäß der allgemeinen Methode von C. D. Hurd und H. L. Abemethy (J. Am. Chem. Soc., 62,1147, 1940) für die γ-Chloracetoessigsäurederivate und von F. Chick, N. T. M. Wilsmore [J. Chem. Soc., 1978 (1910)] für die γ-Bromacetocssigsäuredcrivate über die folgende Rcaktionsfolge hergestellt:

XCH2C-CH2CX xch2c=h2cob

V OR 0

I worin X = CI oder Br Y = H oder Alkyl R = wie vorher definiert.

Wenn gewünscht, können die γ-Halogenacetoessigsäurederivate alternativ aus den γ-Halogenessigestem über eine herkömmliche Grignard-Reaktion hergestellt werden. Beispielsweise wurde der γ-Chloracetoessigsäureoctylester leicht durch Erhitzen von γ-Chloroctylester mit zwei Äquivalenten Magnesium in Äther während 48 h am Rückfluß hergestellt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Acetoessigsäureoctylester in etwa 70%iger Ausbeute gewonnen.

Die γ-Hydroxyacetoessigsäurederivate wurden aus ihren entsprechenden γ-Bromacetoessigsäurederivaten durch Rühren bei 25 °C während 12 h in einer Dioxan-Wasser (l:l)-Lösung enthaltend CaCO^ hergestellt.

Jedes der in den folgenden Beispielen hergestellten Produkte wurde durch Anwendung der kemmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR), Infrarotspektren und Dünnschichtchromatographie in seiner Struktur identifiziert. Die optische Reinheit und die absolute Konfiguration der Produkte wurde durch ihre Überführung in das L-Camitin sowie durch Überführung in ihre Ester festgestellt, welche leicht durch NMR-Spektrometrie und optische Drehung analysiert werden.

Beispiel 1 (Hefen!: (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde wie folgt hergestellt:

qp h Q :-> ®C8H17 oC8H17 A. Fermentation! Das Oberflächenprodukt eines eine Woche alten Schräg-Agar von Candida keyfir. NRRL Y> 329, gewachsen auf Agar der folgenden Zusammensetzung: -6-

AT 393 136 B g Agar..................................................................... 20 Glukose............................................................... 10 Hefeextrakt........................................................... 2,5 k2hpo4............................................................... 1 destilliertes Wasser, q.s. 11 (sterilisiert 15 min bei 1,4 bar) wurde in 5 ml einer 0,85%igen Salzlösung suspendiert. Ein ml Portionen dieser Suspension wurden verwendet, um einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben (F-l Stufe) enthaltend 50 ml des folgenden Mediums (Vogel's Medium) zu beimpfen: g

Hefeextrakt............................................................ 5

Casaminosäuren..................................................... 5

Dextrose............................................................... 40

Naj-citrat-S 1/2 H20........... 3 g KH2P04............................................................... 5 g NH4N03.............................................................. 2 g

CaCl2.2H20....................................................... 0,1 g

MgS04.7H20..................................................... 0,2 g

Spurenelementlösung.............................................. 0,1 ml destilliertes Wasser, q. s. 11 pH 5,6 (sterilisiert während 15 min bei 2,1 bar)

Spurenelementlösung.............................................. g/100 ml

Zitronensäure-1H20................................................ 5

ZnS04.7H20...................................................... 7

Fe(NH4)2(S04)2.6H20......................................... 1

CuS04.5%0...................................................... 0,25

MnS04.1H20..................................................... 0,05 H3BO3................................................................. 0,05

NaH2Mo04.2H20................................................ 0,05

Der Kolben wurde bei 25 °C auf einem Drehrüttler (250 Umdr/min 5 cm Radius) während 24 h im Brutschrank gehalten, wonach eine Überführung von 10 Vol-% in einen anderen 250 nü-Erlenmeyerkolben (F-2 Stufe), enthaltend 50 ml des Vogel's Mediums, vorgenommen wurde. Nach 24 h Bebrütung auf einem Drehrüttler wurden 150 mg γ-Chloracetoessigsäureoctylester in 0,01 ml 10%igem Tween 80 zugefügt

Der F-2 Stufen-Kolben wurde dann während zusätzlich 24 h unter den bei der Bebrütung der F-l Stufen-Kolben verwendeten Bedingungen bebrütet. B. Isolation. 24 h nach dem Zusatz des γ-Chloracetoessigsäureoctylesters wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. Das Überstehende wurde 3 mal mit 50 ml Äthylacetat ausziehend extrahiert. Das Äthylacetat wurde über Na2S04 getrocknet und eingedampft, um einen öligen Rückstand (186 mg) zu liefern. Der Rückstand wurde in 0,5 ml der mobilen Phase gelöst und auf eine Säule (1 x 25 cm) aus Silikagel (MN-Kieselgel 60) aufgebracht. Die Säule wurde mit Skelly B : Äthylenacetat (8 : 1) eluiert und 14 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 6 und 7, enthaltend das gewünschte Produkt, wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 120 mg kristalliner Rückstand erhalten wurden. Die Umkristallisation aus Äthylacetat/Hexan lieferte 107 mg 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester, [a]^ + 13,3° (c, 4,45) (CHCI3); pmr (5CDC13) 0,88 [3H, tr. distortional, CH3-(CH2)n-]; 1,28 [10H, s, -(CH2)5-]; 1,65 (2H, m, -CH2-CH2-CH20-C-); 2,62 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-£H2-COOR);

II I

O OH 3,22 (1H, br., -OH); 3,60 (2H, d, J = 6 Hz, C1CH2-CH-R);

I

OH -7-

AT393 136 B 4,20 (3H, -CH2-CH2-CH2 und *C-0-CH2CH2).

I II OH 0

Anal, berechnet für ^2^3()30: c, 57,47; H, 9,25. Gefunden: C, 57,52; H, 9,07. [TLC Rf - 0,5, Bringmann Silicagel-Platte, 0,25 cm EM; Skelly B: Äthylacetat (5:1).]

Beispiel 2: Ruhende Zellen. 100 g handelsüblicher frischer Backhefe Saccharomyces cerevisiae (Red Star) wurden in 250 ml Leitungswasser suspendiert und 10 g Sucrose und 3,6 g γ-Chloracetoessigsäureoctylester wurden zugefügt. Nachdem der Inhalt bei 25 °C auf einem Drehrüttler (250 Umdr/min - 5 cm Radius) während 24 h bebrütet worden war, wurden zusätzlich 10 g Sucrose dem Kolben zugegeben und die Reaktion für weitere 24 h forlgeführt. Die Zellen wurden dann durch Filtration durch eine Schicht aus Celite entfernt. Die Zellen wurden mit Wasser und Äthylacetat gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit dem Filtrat vereinigt und ausziehend mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde über MgS04 getrocknet und eingeengt, wobei sich ein öliger Rückstand ergab, welcher über eine Silikagelsäule Chromatographien wurde und 2,52 g 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester als niedrigschmelzenden Feststoff lieferte; [a]^ +13,2° (c, 4,0, CHCI3).

Beispiel 3: (+) 4-Chlor-3(R)hydroxybuttersäurebenzylester wurde wie folgt hergestellt:

$>C1 ,>a. OCH20 A. Fermentation. Das Oberflächenprodukt eines eine Woche alten Schrägagar von Gliocladium virens ATCC 13362, gewachsen auf Agar der folgenden Zusammensetzung: g

Malzextrakt........................................................... 20 Glucose................................................................ 20 Pepton.................................................................. 1 Agar.................................................................... 20 destilliertes Wasser, q.s. 11 (sterilisiert 15 min bei 1,4 bar) wurde in 5 ml einer 0,85%igen Salzlösung suspendiert. Ein ml Portionen dieser Suspension wurden verwendet, um einen 250 ml Erlenmeyerkolben (F-l Stufe), enthaltend 50 ml des folgenden Mediums (Sojabohne-Dextrosemedium) zu beimpfen:

Sojabohnenmehl..................................................... 5 g Dextrose............................................................... 20 g NaCl.................................................................... 5 g KH2HP04............................................................ 5 g Hefe..................................................................... 5 g Wasser................................................................. 1 g pH eingestellt auf 7,0 im Autoklav gehalten bei 1 bar während 15 min

Der Kolben wurde auf einen Drehrüttler (250 Umdr/min - 5 cm Radius) bei 25 °C während 24 h bebrütet, wonach eine Überführung von 10 Vol-% in einen anderen 250 ml Erlenmeyer-Kolben (F-2 Stufe), enthaltend 50 ml Sojabohnendextrosemedium, vorgenommen wurde. Nach 24 h Bebrütung auf einem Drehrüttler wurden 150 mg γ-Chloracetoessigsäurebenzylester in 0,1 ml I0%igem Tween 80 zugefügt. Der F-2 Stufen-Kolben wurde dann für weitere 24 h unter den in der Bebrütung der F-l Stufen-Kolben angewendeten Bedingungen -8-

AT393 136 B bebrütet. B. Isolation. 24 h nach Zusatz des γ-Chloracetoessigsäurebenzylesters wurde das Mycelium durch Filtration entfernt Das Filtrat wurde ausziehend mit 50 ml Äthylacetat 3 mal extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde über MgSC>4 getrocknet und im Vakuum eingeengt, wobei sich ein Rückstand (160 mg) ergab. Der Rückstand wurde über eine Silicagel-(MN-Kieselgel 60) Säule (1 x 25 cm) Chromatographien. Die Säule wurde mit Skelly B und Äthylacetat (10:1) eluiert und 12 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 11 bis 16, enthaltend das gewünschte Produkt, wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei sich 115 mg des 4-Chlor-3(R)- hydroxybuttersäurebenzylesters ergaben, [a]D^ +8,7° (c, 5,26; CHCI3); pmr (6 CDCI3) 2,65 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-CH2-coor)· 3,20 (1H, br, -OH);

I

OH 3,54 (2H, d, J = 6 Hz, Cl-CHjCH); 4,20 (1H, m, -CH2-CH-CH2-),

I I

OH OH 5,12 (2H, s, -C-O-CI^CgHj); 7,31 (5H, s, fünf aromatische Protonen).

II

O

Anal. ber. für CUH1303C1: C, 57,77; H, 5,73. Gefunden: C, 57,64; H, 5,67. [TLC Silicagel EM Brinkmann-Platte, 0,25 cm, Rf = 0,43, Skelly B-Äthylacetat (5:1).]

Beispiele 4 bis 23: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit jedem der in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Chloracetoessigsäureoctylester mit einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde erhalten. Die Verfahren dieser Beispiele wurden wiederholt durch kontinuierlichen Zusatz des Substrates zu den Hefemedien. Das Gew.-Verhältnis von Substrat zu Hefe war etwa 1:1,5 mit ausgezeichneter Umwandlung in das gewünschte Produkt

Beispiele 24 bis 48: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit jedem der in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Chloracetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Die Umwandlung zu der gewünschten Verbindung (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybutlersäureoctylester wurde erhalten.

Beispiele 49 bis 68: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit jedem der in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Chloracetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester wurde erhalten.

Beispiele 69 bis 93: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit jedem der in Tabelle 2 angeführten Organismen unter Verwendung von γ-Chloracetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat. Die Umwandlung zu der gewünschten Verbindung (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäurebcnzylester wurde erhalten.

Beispiel 94: (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß 4-Chloracetoacetanilid mit einer Konzentration von 1 mg/ml

H N0 als das Substrat für die Umwandlung in das gewünschte optisch aktive Produkt verwendet wurde, hergestellt.

O

Fp. 110-111°C, [<x]23 +17,5° (c, 3,0, CHCI3); pmr (δ CD3CCD3) 2,67 (2H, d, J = 6 Hz, -HOHCH2- -9-

AT 393 136 B

CONHR), 3,66 (2H, d, J - 6 Hz, C1CH2CH0H-R), 4,43 (1H, m, -CH2-CHOH-CH2-), 7,03-7,44 (3H, m, aromatische Protonen, meta und para), 7,69 (2H, d, J = 6 Hz, aromatische Protonen, ortho), 9,24 (1H, br, -ΟΝΟ). II

O

Anal. her. für C10H12NO2Cl: C, 56,21; H, 5,66. Gefunden: C, 56,17; H, 5,47.

Beispiele 95 bis 114: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit jedem der in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Chloracetoacetanilid mit einer Konzentration von 1 mg/ml zugefügt wurde. In allen Fällen wurde die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureanilid erhalten.

Beispiele 115 bis 139: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen. γ-Chloracetoacetanilid wurde mit einer Konzentration von 1 mg/ml eingeführt

In diesen Fällen wurde die Umwandlung zu dem gewünschten (+) 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureanilid erreicht

Beispiele 140 bis 159: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit den in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Bromacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Brom-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde erhalten.

Beispiele 160 bis 184; Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Bromacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Brom-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde erhalten.

Beispiele 185 bis 204: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit den in Tabelle 1 angeführten Organismen mit der Ausnahme, daß γ-Bromacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Brom-3(R)-hydroxybutlersäurebenzylester wurde «halten.

Beispiele 205 bis 229: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Bromacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten Produkt (+) 4-Brom-3 (R)-hydroxybuttersäurebenzylester wurde «halten.

Beispiele 230 bis 249: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit den in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Brom-Acetanilid (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten (+) 4-Brom-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde «halten.

Beispiele 250 bis 274: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Bromacetanilid (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten (+) 4-Brom-3(R>hydroxybuttersäureanilid wurde «halten.

Beispiele 275 bis 294: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit den in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Hydroxyacetoessigsäureoctylestor (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde erhalten.

Beispiele 295 bis 319: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Hydroxyacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde «halten.

Beispiele 320 bis 339: Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit den in Tabelle 1 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde erhalten.

Beispiele 340 bis 364: Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit den in Tabelle 2 angeführten Organismen, mit der Ausnahme, daß γ-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als das Substrat verwendet wurde. Die Umwandlung zu dem gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde erhalten. -10-

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Beispiel 365: Methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII)

Methyl-4-chloracetoacetat (VII) (100 mg) wurde mit 29 Einheiten Schweineherz (EC 1.1.1.35), ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (Sigma, H4626) und 1,36 g NADH (Sigma, 90 %) in 30 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, beimpft.

Nach 30 h bei 25 °C wurde die Reaktionsmischung 4 mal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand (90 mg) wurde über eine Silicagel (12 g)-Säule (1,3 x 34 cm) Chromatographien. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem, enthaltend Skelly B-Äthylacetat (8 : 1) eluiert und 20 ml Fraktionen wurden gesammelt Die Fraktionen 9-11, enthaltend das gewünschte durch die Dünnschichtchromatographie als solches erkannte Methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) wurden vereinigt [a]^ +23,5® (c, 5,2 CHClj).

Beispiel 366: Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt unter Verwendung von Äthyl-4-chloracetoacetat als das Substrat, wobei Äthyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, [a]ß^ +22,7° (c, 4,7 CHClß), erhalten wurde.

Beispiel 367: Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt von n-Propyl-4-chloracetoacetat als das Substrat, wobei n-Propyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat [a]jj^ +21,5° (c, 5,0, CHCI3), wurde.

Beispiel 368: Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt unter Verwendung von n-Butyl-4-chloracetoacetat als das Substrat, wobei n-Butyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat [a]D^ +20,1® (c, 3,1, CHCI3), erhalten wurde.

Allgemeines Verfahren für die Umwandlung von 4-HaIogen-3(R)-hydroxybuttersäureestem und -amiden in L-Camitin. VORSCHRIFT 1: Eine Mischung von 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester (1,5 g), Äthanol (3 ml) und Trimethylamin (25 gew.-%ige Lösung) in Wasser (3 ml) wurde bei 80-90 ®C während etwa 2 h erhitzt. Die Lösungsmittel und der Uberschuß an Trimethylamin wurden in Vakuum zur Trockene abgedampft, wobei 1,8 g Rohprodukt erhalten wurden. Das Rohprodukt (1 g) wurde bei 80-90 ®C in einer Lösung von 10%iger HCl (7 ml) während 1,5 h erhitzt. Nach Verdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wurde das Rohprodukt zweimal mit absolutem Äthanol (10 ml) extrahiert und der Äthanol wurde in Vakuum abgedampfL Der kristalline Rückstand wurde in einer kleinen Menge Äthanol gelöst und das L-Camitinchlorid wurde durch Zusatz von Äther in guter Ausbeute (320 mg) ausgefällt, Fp. 142® (Zers.); [a] - 23,7® (c, 4,5, HjO).

Das L-Camitinchlorid kann wie bekannt leicht in das pharmazeutisch bevorzugte innere Salz des L-Camitin durch Ionenaustauschmittel übeigeführt werden. VORSCHRIFT: Octyl-4-jod-3(R)-hydroxybutarat (IX)

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Eine Mischung aus Octyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (II) (1,426 g) und wasserfreiem NaJ (1,2 g) in 15 ml Methyläthylketon wurden während 24 h am Rückfluß erhitzt. Die Mischung wurde im Rotationsverdampfer eingedampft und mit Äther (100 ml) und Wasser (50 ml) versetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 10%iger Natriumthiosulfatlösung (150 ml) und Salzlösung (150 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 1,762 g IX als ein hellgelbes öl erhalten wurden; IR (Dünnfilm) 3460 cm*^ (OH) und 1730 cm'^ (Ester C=0); PMR(CDC13) 3,93 - 4,27 (m, 3H), 3,17 (d, 2H), 2,50 (d, 2H), 1,50 - 1,87 (m, 2H), 1,30 (bs, 12H), 0,93 (m, 3H).

Umwandlung von Octyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat (IX) in L-Camitin.

OH

IX OC H 8 17

L-Camitin

Zu einer Lösung von IX (1,593 g) in Methanol (15 ml) wurde eine 25%ige wässerige Lösung von Trimethylamin (8 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 27 °C während 20 h gerührt Die Lösungsmittel und der Überschuß an Trimethylamin wurde unter vermindertem Druck abgedampft wobei ein halbkristalliner Feststoff, X, erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde mit kleinen Mengen Ether gewaschen, um den Octanol zu entfernen und dann in Wasser gelöst und über eine Dowex l-x4 [OH'-Form - 0,30-0,15 mm]-Säule (2,5 x 15 cm) geleitet Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum aus den ersten 200 ml des Eluates ergab L-Camitin als einen weißen kristallinen Feststoff (490 mg, 65 % Ausbeute) [a]D23 - 29,2° (c, 6.5 H20). VORSCHRIFT 3: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von Hexyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um Hexyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. VORSCHRIFT 4: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von Heptyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um Heptyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. VORSCHRIFT 5: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von Decyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um Decyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. VORSCHRIFT 6: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von Methyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat (VIII), um Methyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. VORSCHRIFT 7: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von Äthyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um Äthyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. -12- 5

AT 393 136 B VORSCHRIFT 8: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von n-Propyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um n-PropyI-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camidn umgewandelt wurde. VORSCHRIFT 9: Das Verfahren von Vorschrift 1 wurde wiederholt unter Verwendung von n-Butyl-4-chlor-3(R)-hydroxybutyrat, um n-Butyl-4-jod-3(R)-hydroxybutyrat zu erhalten, welches dann in das L-Camitin umgewandelt wurde. 10

Vertreter von Hefen, welche das gewünschte Enzym erzeugen, sind in Tabelle 1 und Vertreter von Pilzen sind in Tabelle 2 angeführt.

Tabelle 1 (Hefen! 1. Candida lipolytica NRRL Y-1095 2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264 15 3.MycodermacerevisiaeNRRL Y-1615 4. Torula lactosa NRRL Y-329 5. Geotrichum candidum NRRL Y-552 6. Hansenula anomala NRRL Y-366 7. Hansenula subpelliculosaNRRL Y-1683 20 8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026 9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12,632 10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140 11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12,624 12. Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253 25 13. Kloeckera corticis ATCC 20109 14. Cryptococus mascerans ATCC 24194 15. Rhodotorula sp. ATCC 20254 16. Candida albicans ATCC 752 17. Dipodascus albidus ATCC 12934 30 18. Saccharomyces cerevisiae (handelsüblich Red Star) 19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592 20. Oospora lactis ATCC 14318 NRRL · Northern Regional Research Lab. in Peoria, Illinois. 35 ATCC - American Type Culture Collection in Rockville, Maryland.

Tabelle 2 (Pilze) 40 1. Gliocladium virens ATCC 13362 2. Caldariomyces fumago ATCC 16373 3. Linderina pennisopora ATCC 12442 4. Aspergillus ochraceus NRRL 405 5. Trichodermalignorum ATCC 8678 45 6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328 7. Entomophthora coronata NRRL 1912 8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860 9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743 10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157 50 11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286 12. Penicillium thomii NRRL 2077 13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088 14. Byssochlamys nivea ATCC 12550 15. Penicillium patulum NRRL 1952 55 16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942 17. Penicillium islandicum ATCC 10127 18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a 19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a 20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907 60 21. Aspergillus amstelodami NRRL 90 22. Gliocladium roseum ATCC 10521 -13-

Claims

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23. Aspergillus giganteus ATCC 10059

24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b

25. Penicillium roqueforti NRRL 849a PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter ß-Hydroxybuttersäurederivate mit der Formel OH H 0 X R worin X CI, Br, J oder OH und R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Klasse, bestehend aus Alkoxyresten mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen; Alkylaminoresten mit 5 bis 15 Kohlenstoffatomen; Cycloalkoxyresten und Cycloalkylaminoresten mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen; Phenoxy- und Phenylalkoxyresten mit 7 bis 14 Kohlenstoffatomen; Phenylamino- und Phenylalkylaminoresten der Formeln Y YZ I I I - Ν-0-Α und - N-CH-0-A , worin Y und Z für H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl stehen, und A H, CH3, CI oder Br ist, bedeuten, aus den entsprechenden γ-substituierten Acetoessigsäureestern oder -amiden, dadurch gekennzeichnet, daß die γ-substituierten Acetoessigsäurester oder -amide der fermentativen enzymatischen Wirkung eines Mikroorganismus, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] erzeugt, unterworfen und die gewünschten optisch aktiven γ-substituierten-ß-Hydroxybuttersäurederivate gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter
3(R)-Hydroxybuttersäurederivate mit der Formel und 3(R)-Konfiguration X
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus den Ordnungen Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurotiales ausgewählt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Art Saccharomyces ausgewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als der fermentativen enzymatischen Wirkung unterworfenes γ-substituiertes Acetoessigsäurederival γ-Chloracetoessigsäureoctylester eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als der fermentativen enzymatischen Wirkung unterworfenes γ-substituiertes Acetoessigsäurederivat γ-ChIoracetoessigsäurcbcnzylester eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß als der fermentativen enzymatischen Wirkung unterworfenes γ-substituiertes Acetoessigsäurederivat γ-Chloracctoacetanilid eingesetzt wird.

9 R worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, daß, wenn R ein Alkoxyrest ist, dieser 5 bis 15 Kohlenstoffatome aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel O O II II XCH2-C-CH2-CR, worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, der fermentativen enzymatischen Wirkung eines Mikroorganismus, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] erzeugt, unterworfen werden, und -14- AT 393 136 B die gewünschten optisch aktiven 4-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate aus der fermentativen Reaktionsmischung gewonnen werden. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Klasse Ascomycetes ausgewählt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung optisch aktiver γ-substituierter 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate mit der Formel und 3(R)-Konfiguration

R worin X die oben angegebenen Bedeutungen hat und R einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel O O II II xch2-c-ch2-c-r , worin X und R die oben angegebene Bedeutung haben, der enzymatischen Wirkung von L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gereinigter Form unterworfen werden, und die gewünschten optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate aus der enzymatischen Reaktionsmischung gewonnen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gereinigter Form jene aus Schweineherz isolierte eingesetzt wird.
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