NL8901623A - Mitomycine-fosfaatderivaten. - Google Patents

Description

Mitomycine-fosfaatderivaten.

Terrein van de uitvinding 7

De onderhavige uitvinding betreft mitomycine-N -alkylfosfaatderivaten een toepassing als antitumormiddelen en bevattende farmaceutische preparaten.

Mitomycinen en porfiromycinen vormen een groep van nauw verwante antitumor-antibiotica. Mitomycine C (la) wordt tegenwoordig in de handel gebracht in de Verenigde Staten van Amerika onder het handelsmerk Mutamycin® voor de therapie van uitgezaaid adenocarcinoom van de maag of pancreas in geteste combinaties met andere goedgekeurde chemothera-peutische middelen. De structuurformules mitomycine C en A (lb), porfiromycine (lc) en N^a-methyl-mitomycine A (ld) zijn afgebeeld op het formuleblad met de nummering van het ringgedeelte van de moleculen.

7

In de beschrijving heeft N - betrekking op het op de 7-plaats gebonden stikstofatoom, en N - op de aziridinestik-stof. Het gedeelte omgeven door de stippellijnen wordt in het vak aangeduid als mitosan.

Een groot aantal mitomycine-analoga werd bereid met het doel een verbinding met gunstigere therapeutische eigenschappen te vinden, zoals een sterkere antitumorwerking en/of minder myelosuppressief zijn dan mitomycine C. Van de literatuurplaatsen en octrooischriften betreffende mitomycine-derivaten worden de volgende geacht relevant te zijn ten aanzien van de onderhavige uitvinding.

Iyengar et al. beschrijven verbindingen 2a-2c in J. Med. Chem., 1981, 24:975-981 en J. Med. Chem., 1983, 26:16-20, welke zijn aangegeven op het formuleblad.

Kaneko et al. beschrijven in US-A-4.642.352 mitomycine-derivaten met de formule 3 van het formuleblad, waarin 1 7 7 R wordt gekozen uit H, C^_g-alkyl en R en R o.a.

(Rb0)2P(X)- en (Ra)2P(X)- voorstelt, waarbij Ra bijvoorbeeld H, alkyl, cycloalkyl, aryl en Rb bijvoorbeeld alkyl, aryl, aralkyl voorstelt.

Verbindingen volgens de onderhavige uitvinding zijn fosfaatderivaten van verbindingen met formule 2; zij hebben een goede antitumorwerking en geringere toxiciteit vergeleken met de hydroxyverbinding waarvan zij zijn afgeleid.

Het concept van fosfaten als potentiële "Prodrugs" (biologisch omkeerbare geneesmiddelderivaten) wordt kort besproken in het overzichtsartikel getiteld: "Rational for Design of Biologically Reversible Drug Derivatives: Prodrugs" (Sinkula en Yalkowsky, J. Pharm. Sci., 1975, 64: 181-210, pag. 189-191). Voorbeelden van fosfaten van bekende anti-tumormiddelen omvatten camptothecin (Japan Kokai 21-95.394 en 21-95.393, Derwent Abst. No. 87-281016 resp. 87-281015) en daunofubicin (US-A-4.185.111).

De onderhavige uitvinding verschaft verbindingen met de formule 4 van het formuleblad, waarin X en Y onafhankelijk van elkaar zuurstof of zwavel voorstellen, alk een al of niet vertakte koolstofketen met twee tot acht koolstofatomen voorstelt, en R^ waterstof of methyl voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan. Farmaceutisch aanvaardbare zouten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, alkalimetaal- en aardalkalimetaalzouten en zouten van organische, stikstofbevattende zouten.

Een voorkeursuitvoeringsvorm verschaft verbindingen met formule 4, waarin Y zuurstof voorstelt. Een andere voorkeursuitvoeringsvorm verschaft verbindingen met formule 4, waarin alk (C^)2 of (CH2)3 voorstelt. Weer een andere voorkeursuitvoeringsvorm verschaft verbindingen met formule 4 waarin R^ H voorstelt.

Fig. 1 van de bijgevoegde tekening laat de uitwerking van verbinding 5 en 2a op de groei van H2981-tumoren in naakte muizen zien. De pijlen geven de dagen aan, waarop het geneesmiddel werd toegediend.

Fig. 2 laat de cytotoxische uitwerking van mitomycine C, verbindingen 2a en 5 en die van vooraf met alkalische fosfatase behandelde verbinding 5 zien.

Verbindingen volgens de onderhavige uitvinding worden bereid uit mitomycine A (1b) of ΒΠ -methyl-mitomycine A (ld) door omzetting met een aminoalkylfosfaat met de formule (HO)2Ρ(χ)“Y-alk-N^» waarin alk de vorenvermelde betekenis heeft. De reactie wordt over het algemeen uitgevoerd in een geschikt oplosmiddel, zoals methanol, of een mengsel van oplosmiddelen, zoals water en methanol, bij kamertemperatuur.

Een tertiaire aminebase, zoals triëthylamine, kan worden opgenomen in het reactiemengsel. Het produkt kan worden omgezet in een zout door behandeling met een base; zo levert bijvoorbeeld behandeling met natriumbicarbonaat het dina- 7 triumzout van mitomycine-N -alkylfosfaten met formule 4 op. 2-Aminoëthyldiwaterstoffosfaat is een in de handel verkrijgbaar produkt en voorschriften voor de bereiding van andere aminoalkylfosfaten of aminoalkylthiofosfaten kan men aantreffen in bijvoorbeeld Helv. Chim. Act., 1956:39:1455;

Helv. Chim. Acta, 1958, 44:1168; Acta Chim. Scand., 1959, 13:1479 en US-A-3.501.557.

Naar keuze kunnen de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding worden bereid door behandeling van mitomycine A of zijn N^a-gemethyleerde derivaat met een amino- 7 alkanol of een aminoalkylthiol ter vorming van N -hydroxy- 7 alkyl- of N -thioalkyl-mitomycine C als tussenprodukten die vervolgens worden gefosforyleerd of gethiofosforyleerd onder toepassing van in de techniek bekende gebruikelijke methoden. Deze route kan echter niet geschikt zijn voor 7 de bereiding van fosfaatderivaten van N -thiomercaptoethyl-mitomycine C, daar dit geen stabiele verbinding is (Senter et al., 1988, J. Antibiotics, 41:199-201). Wanneer mitomycine A het uitgangsmateriaal is, is het wenselijk de stikstof van de aziridinering te beschermen voorafgaand aan de fosforyleringsreactie. De bescherming kan worden verkregen volgens bekende methoden, zoals acylering, vorming van ureum- of urethanderivaten en dergelijke. Methoden voor het blokkeren en deblokkeren van een amine worden beschreven in handboeken zoals "Protective Groups in Organic Chemistry" J.F.W. McOmie, Ed., Plenum Press, 1973. Fosforyle- ring of thiofosforylering typisch geschiedt door behandeling van 7 7 ...

een N -hydroxyalkyl- of N -thioalkyl-mitomycine-denvaten met fosforyl- of thiofosforylchloride gevolgd door hydro- lyse en zonodig verwijdering van de bescherming van de aziridinestikstof, en indien de hydrolyse wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een base, dan wordt het zout verkregen.

7 7

Naar keuze kunnen de N -hydroxyalkyl- of N -thioalkyl-mitomycine-derivaten reageren met een verbinding met de formule (G-0)2?(χ)“L, waarin G een fosfaat-beschermende groep, en L een uittredende groep, bijvoorbeeld Cl, voorstelt; verwijdering van de fosfaat-beschermende groep en de stikstof-beschermende groep, indien deze aanwezig is, levert verbindingen volgens de onderhavige uitvinding op.

Biologische activiteit

Antitumoractiviteit van de verbinding uit voorbeeld I (5) werd beoordeeld bij Balb C nu/nu-wijfjesmuizen (4-6 weken oud, betrokken van Life Sciences, St. Petersburg, Fl), die subcutaan waren geïmplanteerd met een xenoënting van menselijke longtumor H2981 in de rechter achterflank. Verbinding 2a diende als positieve vergelijkingsverbinding. De behandeling met geneesmiddel begon op dag 15 (dag 0 is de dag van de tumorimplantatie), toen de tumoren een volume van ca. 100 mm3 hadden. 0,2 ml van de proefverbindingen (1 mg/ml voor 2a en 3 mg/ml voor 5 in met fosfaat-gebufferde zoutoplossing) werden intraperitoneaal geïnjecteerd op de dagen 15, 21, 31 en 37. De resultaten worden grafisch voorgesteld in fig. 1 en geven aan, dat de voor het bereiken van een gemiddeld tumorvolume van 750 mm3 vereiste duur 45 dagen was bij muizen behandeld met _2a, 63 dagen bij muizen behandeld met _5 en 27 dagen bij de niet behandelde vergelijkingsgroep. De gefosforyleerde verbinding vertoonde dus een krachtiger antitumoreffect dan de overeenkomstige alcohol.

De relatieve toxiciteit van 2a en 5^ werden bepaald bij Balb C nu/nu-muizen. Wanneer de geneesmiddelen intra- peritoneaal werden toegediend in twee gelijke doses met een tussenpoos van 4 dagen, werden LD^-waarden van 45 en 90 mg/kg lichaamsgewicht verkregen voor 2a resp. _5. Ook werd gevonden, dat aanmerkelijk meer geneesmiddel kon worden toegediend onder gebruikmaking van kleinere doses gedurende een langere periode. Totale hoeveelheden van tot 40 mg/kg van 2a en 100 mg/kg van 5 werden verdragen, indien wij werden toegediend in vier gelijke doses in de loop van een periode van 25 dagen. Uit deze onderzoeken bleek, dat aanmerkelijk meer "prodrug” werd verdragen dankzij zijn verminderde toxiciteit.

De cytotoxiciteit van verbindingen 5, 2a en mito-mycine C werd bepaald onder gebruikmaking van menselijke longtumorcellen van de lijn H2981. Zo werd een suspensie van H2981-cellen in medium van Iscove (IMDM) bevattend 10% feutaal kalfsserum verdeeld in microtiterplaten met 96 uithollingen (10.000 cellen/uitholling). Na 1 uur werd het medium verwijderd, een oplossing van het geneesmiddel in met fosfaat gebufferde zoutoplossing met pH 7,2 werd toegevoegd en begonnen werd met incubatie bij 37°C van 1 uur.

De cellen werden vervolgens tweemaal uitgewassen en de incubatie werd verdere 17 uur voortgezet, gevolgd door een puls 3 van 6 uur met H-Thy (1,0^uCi/uitholling). De platen werden bevroren bij -70°C om de cellen los te maken en de cellen werden geoogst op glasvezelschijven. De filters werden geteld op een Beekman 3701-scintillatieteller. Inhibitie van 3 de opneming van H-Thy werd gebruikt als indicator voor cytotoxische effecten. De resultaten worden weergegeven in fig. 2. Zowel mitomycine C als 2a waren sterk cytotoxisch en hadden IC^Q-waarden nabij 1 yam. Een kleine mate van cytotoxische activiteit werd waargenomen voor de fosfaat 5, maar behandeling vooraf van 5 met alkalische fosfatase resulteerde in een cytotoxiciteit die vergelijkbaar was met die·van 2a en mitomycine C.

Aldus verschaft de onderhavige uitvinding in een ander aspect een methode voor de inhibitie van tumoren, omvattend toediening van een antitumoraal doeltreffende hoeveelheid van een verbinding met formule 4 aan een tumor-dragende gastheer. Voor dit doel kan het geneesmiddel langs gebruikelijke wegen worden toegediend, waaronder, maar niet beperkt tot, intraveneus, intramusculair, intratumoraal., intraarterieel, intralymfatisch en oraal. Optimale doseringen en doseringsschema's voor een gegeven zoogdier als gastheer kunnen gemakkelijk worden vastgesteld door de terzake deskundige. Het zal vanzelfsprekend duidelijk zijn, dat de in werkelijkheid gebruikte dosis varieert al naargelang welk preparaat in het bijzonder wordt geformuleerd, welke bepaalde verbinding wordt gebruikt, de wijze van toediening en de bepaalde plaats, gastheer en ziekte die wordt behandeld. Met vele factoren, die de werking van het geneesmiddel modificeren, moet rekening worden gehouden, daaronder leeftijd, gewicht, geslacht, dieet, tijdstip van toediening, toedieningsweg, excretiesnelheid, toestand van de patiënt, geneesmiddelcombinaties, gevoeligheden wat reactie betreft en de ernst van de ziekte.

In een verder aspect van de onderhavige uitvinding verschaft deze een farmaceutisch preparaat bevattend een verbinding met formule 4 en een farmaceutisch aanvaardbare drager. Het antitumorpreparaat kan in iedere farmaceutische vorm worden gebracht, die geschikt is voor de gewenste toedieningsweg. Voorbeelden van dergelijke preparaten omvatten vaste preparaten voor orale toediening, zoals tabletten, capsules, pillen, poeders en korrels, vloeibare preparaten voor orale toediening, zoals oplossingen, suspensies, stropen of elixers, en preparaten voor parenterale toediening, zoals steriele oplossingen, suspensies of emulsies.

Zij kunnen ook worden bereid in de vorm van steriele vaste preparaten die kunnen worden opgelost in steriel water, fysiologische zoutoplossing of een ander steriel, injecteer-baar milieu, onmiddellijk vöor het gebruik.

De volgende voorbeelden dienen slechts ter toelichting en mogen niet worden geacht een beperking te vormen voor het kader van de uitvinding die uitsluitend door de aan deze aanvrage gehechte conclusies wordt omschreven.

Voorbeeld I

9a-Methoxy-7- [[ (fosfonodxy)ethyl] amino] mitosan-dinatriumzout (formule 5 van het formuleblad)

Een oplossing van 2-aminoethyl-diwaterstoffosfaat (56 mg, 0,4 mmol) in water (0,35 ml) en triëthylamine (0,3 ml, 2 mmol) werd toegevoegd aan mitomycine A (140 mg, 0,4 mmol) in methanol (6 ml). Men liet de reactie gedurende de nacht bij kamertemperatuur voortschrijden, 1,4 ml verzadigd waterig natriumbicarbonaat werd toegevoegd en de oplossing werd verdeeld tussen water en methyleenchloride.

De waterige fase werd drooggedampt en verschillende porties methanol werden toegevoegd en verdampt. Het residu werd opgenomen in methanol, gefiltreerd en aangebracht op een silicakolom C-18 (omkeerfase) van 2x10 cm. Het produkt werd geëlueerd met water en al het vluchtige materiaal werd verdampt. Methanol werd toegevoegd en verdampt zoals eerder en het residu werd 24 uur gedroogd onder een sterk vacuüm in een exsiccator met fosforpentoxide. De in de titel genoemde verbinding werd verkregen als een fijn blauw poeder (190 mg, 97%).

360 MHz ^H-NMR (D20) Ó 1,94 (s, 3H, CH3), 2,9-3,1 (m, 4H), 3,20 (s, 3H, 0CH3), 3,28 (s, 1H), 3,36 (s, 1H), 3,5-3,65 (m, 4H), 4,1-4,25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, 1H, 10-H).

Massaspectrum M+ 503.0912 (berekend voor C17H21N4°9PNa2 503·0920)·

Voorbeeld II

Het algemene voorschrift uit voorbeeld I wordt herhaald onder gebruikmaking van N*a-methyl-mitomycine A in plaats van mitomycine A om 9a-methoxy-la-methyl-7-[[(fosfo-noöxy)ethyl]amino]mitosan-dinatriumzout te verkrijgen.

Voorbeeld III

Het algemene voorschrift uit voorbeeld I werd herhaald onder gebruikmaking van 2-aminoethyl-diwaterstof-thiofosfaat in plaats van 2-aminoethyl-diwaterstoffosfaat om 9a-methoxy-7-[[ (fosfonothio)ethyl]amino] mitosan-dinatrium-zout te verkrijgen.

Claims (9)

1. Verbinding met de formule 4 van het formuleblad, waarin X en Y onafhankelijk van elkaar zuurstof of zwavel voorstellen; alk een al of niet vertakte koolwaterstofketen met 2-8 koolstofatomen; en R H of methyl voorstelt; of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

2. Verbinding volgens conclusie 1, waarbij Y zuurstof voorstelt.

3. Verbinding volgens conclusie 1, waarbij R H voorstelt.

4. Verbinding volgens conclusie 1, waarbij alk (C^) 2 of (CI^)^ voorstelt.

5. Verbinding volgens conclusie 1, waarbij het farmaceutisch aanvaardbare zout het natriumzout is.

6. Verbinding volgens conclusie 1 met formule 4 van het formuleblad of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

7. Het dinatriumzout van de verbinding volgens conclusie 6.

8. Werkwijze voor de inhibitie van tumorgroei bij een zoogdier als gastheer, omvattend het toedienen aan deze gastheer van een tumor-inhiberende hoeveelheid van een verbinding volgens conclusie 1.

9. Farmaceutisch preparaat dat een tumor-inhiberende hoeveelheid van een verbinding volgens conclusie 1 en een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat.