DK168293B1 - Mitomycin-N7-alkylphosphatderivater og farmaceutiske præparater indeholdende disse samt anvendelsen af derivaterne til fremstilling af lægemidler - Google Patents

Description

DK 168293 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte mitomycin N^-alkylphosphatderivater med den almene formel 5 x o f, <HO)Jp-Y-*lk-NH^ /-OCNHg Ύ iTV0CH3 chmTl>'1 10 hvor X og Y hver især er oxygen eller svovl, alk er en uforgrenet eller forgrenet carbonkæde med 2-8 carbonatomer, og R1 er H eller methyl, 15 eller farmaceutisk acceptable salte deraf, og farmaceutiske præparater indeholdende disse derivater samt anvendelse af derivaterne til fremstilling af lægemidler til inhibering af tumorer.

Mitomyciner og porfiromycin er en gruppe nært beslægtede antitumorantibiotika. Mitomycin C (la) sælges for tiden i USA under navnet 20 "Mutamycin" til terapi ved dissemineret adenocarcinoma i mave eller pankreas i afprøvede kombinationer med andre godkendte kemoterapeutiske midler. Strukturen af mitomycin C og A (Ib), porfiromycin (Ic) og Nla-methyl-mitomycin A (Id) er vist nedenfor med nummerering af ringdelen i molekylerne.

25 ! η o i

«J A yr—ta* I

......jfiTTi·2 3 4** .

i -"Ttfei I...............................j

a: X=NHgj ZSH

2

35 bs X=0CH3j Z=H

3 c: X=NHai Z*CH3 4 ds X=0.CH3; Z=CH3 DK 168293 B1 2 I det foreliggende henviser N7- til det nitrogenatom, der er knyttet til 13 7-stillingen, og N - henviser til aziridinnitrogenatomet. Den del, der er omsluttet af den punkterede linie, benævnes i teknikken mitosan.

Et stort antal mitomycinanal oger er blevet fremstillet med den 5 hensigt at tilvejebringe en forbindelse med gunstigere terapeutiske egenskaber, såsom højere antitumor aktivitet og/eller forbindelser, som er mindre myelosuppressive end mitomycin C. Blandt litteraturreferencer og patentskrifter, der omhandler mitomycinderivater betragtes de følgende som relevante i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

10 Iyengar et al. beskriver forbindelser Ila - Ile i J. Med. Chem., 1981, 24:975-981 og J. Med. Chem., 1983, 26:16-20.

0 u /-OCHHg

II as n«2; R^H; R**OH

bi n«3j R1»«} R*«OH c: n«3; R1««,; *e«0H

20

I US-patentskrift nr. 4.642.352 beskrives mitomycinderivater med formel III

'VxTjr' CHj hvor 30 R1 er valgt blandt H, Cj_g-alkyl og R^, og R7 bl.a. er (R^OJgPCX)- og (Ra)2P(X)-, hvor Ra f.eks. er H, alkyl, cycloalkyl eller aryl, og Rb f.eks. er al kyl, aryl eller aralkyl.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er phosphatderi-vater af forbindelser med formel II, og de udviser kraftigere antitumor 35 aktivitet og lavere toksicitet end stamhydroxyforbindel sen. Konceptet med phosphater som potentielle pro-lægemidler er kort beskrevet i tidsskriftartiklen benævnt "Rational for Design of Biologically DK 168293 Bl 3

Reversible Drug Derivatives: Prodrugs" (Sinkula og Yalkowsky, J. Pharm. Sci., 1975, 64:181-210, især 189-191). Eksempler på phosphater af kendte antitumor midler omfatter camptothecin (Japan Kokai 21-95, 394 og 21-95, 393, Derwent Abst. nr. 87-281016 hhv. 87-281015) og daunorubicin (US 5 patentskrift nr. 4.185.111).

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte mitomycinderivater, der er ejendommelige ved, at de har den almene formel IV

10 i1! M « (HOJgP-Y-alk-NH^ / 0CNH8 jf jT-]^0™3 CH/yiDw-Rl 15 hvor X og Y uafhængigt er oxygen eller svovl, alk er en uforgrenet eller forgrenet carbonkæde med 2-8 carbonatomer, og R1 er H eller methyl, 20 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Farmaceutisk acceptable salte omfatter, men er ikke begrænset til alkalimetalsalte, jordal kalimetal salte samt organiske nitrogenhol dige basesalte.

Ifølge en foretrukken udførelsesform tilvejebringes forbindelser 25 med formel IV, hvor Y er oxygen. Ifølge en anden foretrukken udførelsesform tilvejebringes forbindelser med formel IV, hvor alk er (CH2)2 eller (CHgJj. Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform tilvejebringes forbindelser med formel IV, hvor R* er H.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ud is 30 fra mitomycin A (Ib) eller N -methyl-mitomycin A (Id) ved omsætning med et aminoalkylphoshat med formlen (H0)2P(X)-Y-alk-NH2, hvor alk har den ovenfor angivne betydning. Omsætningen udføres almindeligvis i et egnet opløsningsmiddel, såsom methanol, eller en blanding af opløsningsmidler, såsom vand og methanol, ved omgivelsestemperatur. En tertiær aminbase, 35 såsom triethylamin, kan anvendes i reaktionsblandingen. Produktet kan omdannes til et salt ved behandling med en base, idet f.eks. behandling med natriumbicarbonat tilvejebringer dinatriumsaltet af mitomycin N^- DK 168293 B1 4 alkylphosphater med formel IV. 2-aminoethyl-dihydrogenphosphat er et kommercielt tilgængeligt produkt og fremgangsmåder til fremstilling af andre aminoalkylphosphater eller aminoalkylthiophosphater er beskrevet i f.eks. Helv. Chim. Act., 1956:39:1455, Helv. Chim. Acta, 1958, 44:1168, 5 Acta Chim. Scand., 1959, 13:1479 samt US patentskrift nr. 3.501.557.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan alternativt fremstilles ved behandling af mitomycin A eller det N*a-methylerede derivat deraf med en aminoalkanol eller aminoalkylthiol til tilvejebringelse af N7-hydroxyalkyl- eller N7-thioal kyl-mitomycin C-mellemproduk-10 ter, som derefter phosphoryleres eller thiophosphoryleres under anvendelse af i teknikken kendte, konventionelle metoder. Denne reaktionsvej er imidlertid ikke egnet til fremstilling af phosphatderivater af N7-mercaptoethyl-mitomycin C, idet den ikke er en stabil forbindelse (Senter et al., 1988, J. Antibiotics, 41:199-201). Når mitomycin A 15 anvendes som udgangsmateriale, er det ønskværdigt at beskytte nitrogen-atomet i aziridinringen før phosphoryleringsreaktionen. Beskyttelse kan opnås ved kendte metoder, såsom acylering, dannelse af urinstof- eller urethanderivater eller lignende. Fremgangsmåder til blokering og afblokering af aminer er beskrevet i litteraturen, såsom "Protective Groups 20 in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, Ed., Plenum Press, 1973. Phospho-rylering eller thiophosphorylering udføres typisk ved behandling af et N -hydroxyal kyl- eller N -thioal kyl-mitomycinderivat med phosporyl-eller thiophosphorylchlorid efterfulgt af hydrolyse og, om nødvendigt, afbeskyttelse af aziridinnitrogenatomet. Hvis hydrolysen er udført i 25 nærvær af en base, opnås et salt. N7-hydroxyal kyl- eller N7-thioalkyl-mitomycinderivaterne kan alternativt omsættes med en forbindelse med formlen (G-OJgPtXJ-L, hvor G er en phosphatbeskyttende gruppe, og L er en fraspaltelig gruppe, f.eks. Cl, idet fjernelse af den phosphatbeskyttende gruppe og den nitrogenbeskyttende gruppe, hvis den er til stede, 30 tilvejebringer forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse.

Antitumor aktivitet af forbindelsen i eksempel 1 (V) bedømtes i Balb C nu/nu hunmus (4-6 uger gamle, opnået fra Life Sciences, St. Petersburg, Fl) implanteret subkutant med et xenotransplantat af human lungetumor H2981 i højre bagflanke. Forbindelse IIA tjente som positiv 35 kontrol. Lægemiddelbehandling indledtes på dag 15 (dag 0 er dagen for tumorimplentering), hvor tumorerne havde et volumen på ca. 100 mm . 0,2 ml af forsøgsforbindelserne (1 mg/ml Ila og 3 mg/ml V i phosphat-puffer- 5 DK 168293 B1 indstillet saltvand) injiceredes intraperitonealt på dag 15, 21, 31 og 37. Resultaterne er angivet grafisk i fig. 1 og antyder, at det tidsrum, der var nødvendigt til opnåelse af et gennemsnitligt tumorvolumen på 750 3 mm , var 45 dage for mus behandlet med Ila, 63 dage for mus behandlet 5 med V og 27 dage for den ubehandlede kontrolgruppe. Den phosphorylerede forbindelse udviste således kraftigere antitumor virkning end den tilsvarende alkohol.

Den relative toksicitet af Ila og V bestemtes i Balb C nu/nu mus.

Ved intraperitoneal administrering af lægemidlerne i to lige store doser 10 med 4 dages mellemrum, opnåedes LDgQ-værdier på hhv. 45 og 90 mg/kg legemsvægt for forbindelse Ila og V. Det har endvidere vist sig, at en betragtelig større mængde lægemiddel kan administreres under anvendelse af mindre doser over et længere tidsrum. Samlede mængder på op til 40 mg/kg Ila og 100 mg/kg V tolereredes, hvis de administreredes i 4 lige 15 store doser i løbet af 25 dage. Disse undersøgelser antyder, at signifikant mere pro-lægemiddel blev tolereret på grund af den reducerede toksicitet.

Cytotoksicitet af forbindelse V, Ila og mitomycin C bestemtes under anvendelse af human lungetumor-cellelinie H2981. En suspension af H2981-20 celler i Iscove's medium (IMDM) indeholdende 10% føtalt kalveserum anbragtes således i mi krotiterplader med 96 brønde (10.000 celler/brønd). Efter 1 time fjernedes mediet, en phosphatpufferindstillet saltvandsopløsning (PBS), pH 7,2, af lægemidlet tilsattes og inkubation ved 37°C fortsattes i 1 time. Derefter vaskedes cellerne to gange og inkubationen 25 fortsattes i yderligere 17 timer efterfulgt af 6 timers radioisotopbe- 3 handling med H-Thy (1,0 /iCi/brønd). Pladerne blev nedfrosset ved -70°C for at løsgøre cellerne, og cellerne høstedes på glasfiberskiver. Filtrene taltes på en "Beckman 3701" scintillationstæller. Inhibering af 3 H-Thy-inkorporering anvendtes som indikator for cytotoksiske virknin-30 ger. Resultaterne er vist i fig. 2. Både mitomycin C og Ila var stærkt cytotoksiske og havde ICgQ-værdier nær 1 μΜ. En lille grad af cytotok-sisk aktivitet kunne iagttages for phosphat V, mens forudgående behandling af V med alkalisk phosphatase resulterede i cytotoksicitet, der var sammenlignelig med cytotoksiciteten af Ila og mitomycin C.

35 Fig. 1 viser virkningen af forbindelse V og Ila på væksten af H2981-tumorer i nøgne mus. Pilene angiver de dage, hvor lægemidler administreres.

DK 168293 B1 6

Fig. 2 viser cytotoksiske virkninger af mitomycin C, forbindelse Ila og V samt forbindelse V efter forudgående behandling med alkalisk phosphatase.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan således 5 anvendes til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering af tumorer. Til dette formål kan de farmaceutiske præparater administreres til en tumorbærende vært ad konventionel vej, herunder, men ikke begrænset til intravenøs, intramuskulær, intratumoral, intraarteriel, intra-lymphatisk eller oral vej. Optimale dosismængder og doseringsmønster for 10 en given mammal vært kan let bestemmes af fagmanden. Det er åbenbart, at den faktiske anvendt dosis vil variere i overensstemmelse med sammensætningen af det særlige præparat, den særlige forbindelse, der anvendes, administreringsmåden, samt det særlige sted, den vært og den sygdom, der skal behandles. Mange faktorer, der kan modificere lægemidlets virkning, 15 må tages i betragtning, herunder patientens alder, vægt, køn og diæt admi nistreri ngsti dspunkt, admi ni streringsvej, udski11 el seshastighed, patientens tilstand, lægemiddelkombinationer, reaktionsfølsomhed samt sygdommens alvor.

Ifølge et yderligere aspekt ved den foreliggende opfindelse tilve-20 jebringes et farmaceutisk præparat, der er ejendommeligt ved, at det omfatter en tumor-inhiberende mængde af en forbindelse med formel IV samt en farmaceutisk acceptabel bærer. Antitumor-præparatet kan tildeles en vilkårlig farmaceutisk form, der er egnet til den ønskede administreringsmåde. Eksempler på sådanne præparater omfatter faste præparater til 25 oral administrering, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administrering, såsom opløsninger, suspensioner, sirupper eller eliksirer, samt præparater til parenteral administrering, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsio ner. De kan også fremstilles i form af sterile, faste præparater, som .30 kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvand eller et andet sterilt, injicerbart medium umiddelbart før anvendelse.

De følgende eksempler belyser den foreliggende opfindelse nærmere.

_ „_______^ DK 168293 B1 7

Eksempel 1 9a-methoxy-7-rfphosphonooxy)eth,ynamino]nritosan-dinatriumsalt (V) 5 o ,1 ?.

<»,0),p'oCH,CH,»H^ A /-0CHHs Ύ O'"' 10

En opløsning af 2-aminoethyldihydrogenphosphat (56 mg, 0,4 mmol) i vand (0,35 ml) og triethylamin (0,3 ml, 2 mmol) sattes til mitomycin A (140 mg, 0,4 mmol) i methanol (6 ml). Omsætningen gennemførtes ved stuetemperatur natten over, 1,4 ml mættet, vandigt natriumbicarbonat til sat-15 tes og opløsningen deltes mellem vand og methylenchlorid. Den vandige fase koncentreredes til tørhed, og flere portioner methanol tilsattes og afdampedes. Remanensen optoges i methanol, filtreredes og overførtes til en 2x10 cm C-18 (reversfase) silicagelsøjle. Produktet elueredes med vand, og alt flygtigt materiale afdampedes. Methanol tilsattes og afdam-20 pedes som ovenfor, og remanensen tørredes i 24 timer under højvakuum i en ekssikkator med phosphorpentoxid. Titel forbindel sen opnåedes som et fint, blåt pulver (190 mg, 97%).

360 MHz ^-NMR (D20) 6: 1,94 (s, 3H, CH3), 2,9-3,1 (m, 4H), 3,20 (s, 3H, OCH3), 3,28 (s, IH), 3,36 (s, IH), 3,5-3,65 (m, 4H), 4,1-4,25 25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, IH, 10-H).

Massespektrum M+ 503.0912 (beregnet for C17H21N^0gPNa2 503.0920).

Eksempel 2

Den almene fremgangsmåde i eksempel 1 gentoges under anvendelse af la 30 N -methyl-mitomycin A i stedet for mitomycin A til tilvejebringelse af 9a-methoxy-la-methyl-7-[[(phosphonooxy)ethyl]amino]mitosan-dinatrium-salt.

35 DK 168293 B1 8

Eksempel 3

Den almene fremgangsmåde i eksempel 1 gentoges under anvendelse af 2-aminoethyl-dihydrogen-thiophosphat i stedet for 2-aminoethyl-dihydro-gen-phosphat til tilvejebringelse af 9a-methoxy-7-[[(phosphonothio)-5 ethyl]amino]mi tosan-di natri umsalt.

Claims (9)

9 DK 168293 B1

1. Mitomycin N7-al kylphosphatderi vat, KENDETEGNET ved, at det har den almene formel II fi '' 1 in^· <iv> CHa II i Γν-r1 10 y ^ hvor X og Y hver især er oxygen eller svovl, alk er en uforgrenet eller forgrenet carbonkæde med 2-8 carbonatomer, og 15 R1 er H eller methyl, eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at Y er oxygen.

3. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at R* er H.

4, Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at alk er (CHg)2 eller (CH2)3.

5. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det farmaceutisk acceptable salt er natriumsaltet.

6. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den har formlen 30 o o H 1 lir0C“3 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 35 DK 168293 B1 10

7. Forbindelse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at den er dinatriumsaltet.

8. Anvendelse af et mitomycin N^-alkylphosphatderivat med formlen 5 (IV) ifølge krav krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering af tumorer.

9. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det omfatter en tumor-inhi berende mængde af en forbindelse ifølge krav 1 og en farmaceu- 10 tisk acceptabel bærer. 15 20