MXPA06012594A

MXPA06012594A - Receptores mutantes y su uso en un sistema de expresion genetica inducible a base del receptor nuclear.

Info

Publication number: MXPA06012594A
Application number: MXPA06012594A
Authority: MX
Inventors: Subba Reddy Palli; Mohan Basavaraju Kumar
Original assignee: Rheogene Inc
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2006-12-15
Also published as: US20120185954A1; CN1964622A; EP2292088A1; EP1744619B1; CA2563521C; CN1964622B; BR122015016288B1; WO2005108617A3; WO2005108617A2; JP2008505616A; US20140322812A1; US20170342440A1; EP3219204A1; CN105018509B; US9163256B2; CN102776218A; DK3000317T3; US20050266457A1; AU2005241051A1; HK1094521A1

Abstract

Esta invencion se refiere al campo de la biotecnologia o diseno genetico. Especificamente, esta invencion se refiere al campo de la expresion genetica. Mas especificamente, esta invencion se refiere nuevos receptores mutantes de sustitucion y su uso en un sistema de expresion genetica inducible en base a un receptor nuclear y metodos para modular la expresion de un gen en una celula huesped para aplicaciones tales como terapia genetica, produccion a gran escala de proteinas y anticuerpos, analizais de deteccion sistematica de alto rendimiento a base de celulas, genomicos funcionales y la regulacion de caracteristicas en organismos transgenicos.

Description

para estudiar, manipular y controlar el desarrollo de otros procesos fisiológicos. La expresión genética es un proceso biológico complejo que involucra varias interacciones especificas de proteina-proteina . A fin de activar la expresión gética, de manera que produzca el ARN necesario como la primera etapa en la síntesis de proteína, un activador transcripcional debe conducir a la proximidad de un promotor que controla la transcripción de gen. Típicamente, el activador transcripcional por sí mismo se asocia con una proteína que tiene al menos un dominio de unión ADN que une a los sitios de unión ADN presentes en las regiones promotoras de los genes. Así, para que ocurra la expresión genética, una proteína que comprende un dominio de unión ADN y un dominio de transactivación ubicado a una distancia apropiada del dominio de unión ADN debe conducirse hacia la posición correcta en la región promotora del gen. El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor específico tipo célula para dirigir la expresión de un transgen diseñado. Una construcción de ADN que contiene el transgen se incorpora primero en un genoma huésped. Cuando se activa mediante un activador transcripcional, la expresión del transgen ocurre en una tipo de célula dada. Otros medios para regular la expresión genéticaes extraños en células es a través de promotores inducibles . Ejemplos del uso de tales promotores inducibles incluyen el promotor PRl-a, sistemas procarióticos de represor-operador, sistemas de inmunofilina inmunosupresivos y sistemas de activación de transcripción eucariótica mayores tales como sistemas del receptor de hormona ecdisteroides y los que se describen abajo. El promotor PRl-a a partir del tabaco se induce ' durante la respuesta de resistencia sistémica adquirida después del ataque patógeno. El uso de PRl-a puede limitarse debido a que con frecuencia responde a los materiales endógenos y factores externos tales como patógenos, radiación ÜV-B y contaminantes. Los sistemas de regulación genética se basan en los promotores inducidos mediante choque térmico, interferón y metales pesados que se han descrito (Wurn et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; Arnheiter et al., 1990, Cell 62:51-61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 27550-27560) . Sin embargo, estos sistemas tienen limitaciones debido a su efecto en la expresión genéticaes no objetivo. Estos sistemas también son permeables . Los sistemas procarióticos de represor-operador utilizan proteínas represoras bacteriales y las secuencias de ADN de operador únicas a las cuales se unen. Tanto los sistemas represor-operador de tetraciclina ("Tet") como de lactosa ("Lac") a partir de la bacteria Escherichia coli se han utilizado en plantas y animales para controlar la expresión genética. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteina de represor TetR, resultando en un cambio conformacional que libera la proteina represora del operador el cual como un resultado permite que ocurra la transcripción. En el sistema Lac, un operon lac se activa en respuesta a la presencia de lactosa o análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactosidasa .

Desafortunadamente, el uso de tales sistemas se restringe mediante la química insetable de los ligandos, i.e., tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural o sus niveles relativamente altos requeridos para la inducción o represión. Por razones similares, es limitada la utilidad de tales sistemas en animales. Las moléculas inmunosupresivas tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A pueden unirse a inmunofolinas FKBP12, ciclofilina, etc. Utilizando esta información, se ha planeado un estrategia general para traer juntas cualquiera de las dos proteínas simplemente al colocar FK506 en cada una de las dos proteínas o al colocar FK506 sobre una y ciclosporina A sobre la otra. Un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto que resulta de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) puede entonces utilizarse para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al., 1993, Science 262:1019-24; Belshaw et al., 1996 Proc Nati Acad Sci USA 93: 4604-7). El dominio de unión a ADN Gal4 fusionado con el dominio activador FKBP12 y VP16 fusionado con ciclofilina, y el compuesto FECSA se utilizaron para mostrar la heterodimerización y la activación de un gen informador bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que tienen efectos laterales no buscados, limita su uso para varias aplicaciones de conmutación de genes de mamífero. También se han empleado los sistemas de activación de transcripción eucariótica mayores tales como sistemas de receptor de hormona esteroide. Los receptores de hormona esteróte son miembros de la superfamilia del receptor nuclear y se encuentran en células de vertebrados e invertebrados . Desafortunadamente, el uso de compuestos esferoidales que activan los receptores para la regulación de la expresión genética, particularmente en plantas y mamíferos, se limita debido a su envolvimiento en muchas otras trayectorias biológicas naturales en tales organismos. A fin de superar tales dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo utilizando receptores de ecdisona de insecto (EcR) . El crecimiento, muda y desarrollo en insectos se regulan mediante la hormona esteroide de ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, et al., 1998, Annu. Rev. Entomol . 43: 545-569) . El objetivo molecular para la ecdisona en insectos consiste de al menos un receptor de ecdisona (EcR) y la proteina ultraespiráculo (USP) . EcR es un miembro de la superfamilia del receptor esteroide nuclear que se caracteriza mediante la identificación ADN y los dominios de unión a ligando y un dominio de activación (Koelle et al., 1991, Cell, 67:59-77) . Los receptores EcR son responsables de un número de compuestos ecdiesteroidales tales como ponasterona A y muristerona. Recientemente, se han descrito los compuestos no esferoidales con actividad agonista ecdiesteroide, incluyendo los insecticidas comercialmente disponibles tebufenocida y metoxifenocida que se comercian ampliamente en el mundo por Rohm and Haas Company (ver la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/EP96/00686 y la Patente de Eü 5,530,028) . Ambos análogos tienen perfiles excepcionales seguros para otros organismos. Las heterodimericinas del receptor de ecdisona de insecto (EcR) con Ultraespiráculo (ÜSP) , el homólogo de insecto del RXR de mamífero y las uniones de ecdiesteroides y los elementos de respuesta del receptor de ecdisona y activan la transcripción de los genes que responden a la ecdisona (Riddiford et al., 2000) . Los complejos EcR/USP/ligando juegan roles importantes durante el desarrollo y reproducción del insecto. El EcR es un miembro de la superfamilia del receptor de hormona esteoride y tiene cinco dominios modulares, dominios A/B (transactivación) , C (unión a ADN, heterodimerización) , D (Articulación, heterodimerización) , E (unión a ligando, heterodimerización y transactivación) y F (transactivación) . Algunos de estos dominios tales como A/B, C y E retienen su función cuando se fusionan con otras proteínas . Los sistemas de expresión genética inducibles estrechamente regulados o "conmutaciones genéticas" son útiles para varias aplicaciones tales como terapia genética, producción a gran escala de proteínas en células, ensayos de detección sistemática de alta producción a base de células, genómicos funcionales y regulación de rasgos en plantas y animales transgénicos . La primera versión de la conmutación genética en base a EcR utilizó EcR de Drosophila melanogaster (DmEcR) y Mus musculus RXR (MmRXR) y mostró que estos receptores en la presencia de ecdiesteroide, ponasterona A, genes informadores transactivazos en líneas celulares de mamíferos y ratones transgénicos (Chirstopherson et al., 1992; No et al., 1996) . Later, Sur et al., 1998 mostró que ningún agonista de ecdisona ecdiesteroidal, tebufenocida, indujo alto nivel de transactivación de los genes reporteros en células de mamífero a través de EcR Bombix mori (BmEcR) en la ausencia de la pareja de heterodimero exógeno. Las Solicitudes de Patente Internacional No. PCT/US98/05330 (WO 97/38117) y PCT/US99/08381 (WO 99/58155) describen los métodos para modular la expresión de un gen exógeno en el cual una construcción de ADN comprende el gen exógeno y un elemento de respuesta a ecdxsona que se activa mediante una segunda construcción de ADN que comprende un receptor de ecdxsona que, en la presencia de un ligando por lo tanto y opcionalmente en la presencia de un receptor capaz de actuar como un pareja silenciosa, se une al elemento de respuesta de ecdxsona para inducir la expresión genética. El receptor de ecdxsona de selección se aisló de Drosophila melanogaster. Típicamente, tales sistemas requieren la presencia de la pareja silenciosa, preferentemente el receptor retinoide X (RXR) , a fin de proporcionar activación óptima. En las células de mamífero, el receptor de ecdxsona de insecto (EcR) se heterodimeriza con el receptor retinoide X (RXR) y regula la expresión de los genes de objetivo en una forma dependiente del ligando. La Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US98/14215 (WO 99/02683) describe que el receptor de ecdxsona se aisla a partir del gusano de seda Bombyx mor! que es funcional en sistemas de mamífero sin la necesidad para una pareja de dímero exógena. La Patente de E.ü. No. 6,265, 173 Bl describe que varios miembros de la superfamilia esteroide/tiroide de los receptores pueden combinarse con el receptor de ultraespiráculo Drosophila melanogaster (ÜSP) o fragmentos de los mismos que comprenden al menos el dominio de dimerización de USP para utilizarse en un sistema de expresión genética.

La Patente de E.U. No. 5,880,033 describe un EcR Drosophila melanogaster y sistema de heterodímero de ultraespiráculo (USP) utilizado en plantas en las cuales el dominio de transactivación y el dominio de unión a ADN se colocan en dos diferentes proteínas híbridas. Desafortunadamente, estos sistemas en base a ÜSP se constituyen en células animales y por lo tanto no son efectivas para regular la expresión genética del informador. En cada uno de estos casos, el dominio de transactivación y el dominio de unión a ADN (ya sea como EcR nativo como en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US98/14215 o como EcR modificado como en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US97/05330) se incorporaron en una sola molécula y las otras parejas heterodiméricas, ya sea USO o RXR, que se utilizaron en su estado nativo. Las desventajas de los sistemas de regulación de gen en base a EcR antes descritos incluyen una actividad de fondo considerable en la ausencia de ligandos y sin aplicabilidad en estos sistemas para utilizarse tanto en plantas como animales (ver Patente de E.ü. No. 5,880,333) . Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica para sistemas en base a EcR mejorados para modular de manera precisa la expresión de los genes exógenos tanto en plantas como en animales. Tales sistemas mejorados pueden ser útiles para aplicaciones tales como terapia de gen, producción a gran escala de proteínas y anticuerpos, ensayos de detección sistemática de alta producción a base de células, genómicos funcionales y regulación de rasgos en plantas y animales transgénicos . Para ciertas aplicaciones tales como terapia de gen, puede ser deseable tener un sistema de expresión genética inducible que responda bien a sintéticos sin ligandos ecdiesteroides y en el mismo es insensible a los ecdiesteroides naturales. Así, los sistemas mejorados son simples, compactos y dependen de los ligandos que son relativamente económicos, fácilmente disponibles y de baja toxicidad para el huésped pueden probar utilidad para regular los sistemas biológicos. Previamente, los Solicitantes han mostrado que un sistema de expresión genética inducible a base del receptor de ecdisona en el cual la transactivación y los dominios de unión a ADN se separan entre sí al colocarlos sobre dos diferentes proteínas resultando en reducir grandemente la actividad de fondo en la ausencia de un ligando y la actividad significativamente incrementada sobre el segundo plano en la presencia de un ligando (solicitud pendiente PCT/US01/09050, incorporada en la presente en su totalidad mediante la referencia) . Este sistema de dos híbridos es un sistema de modulación de expresión genética inducible significativamente mejorado comparado con los dos sistemas descritos en las solicitudes PCT/ÜS9/05330 y PCT/US98/14215.

El sistema de dos híbridos promueven la capacidad de un par de proteínas de interacción para brindar el dominio de activación de transcripción hacia una posición más favorable con relación al dominio de unión de ADN por lo que cuando el dominio de unión a ADN se une la sitio de unión a ADN en el gen, el dominio de transactivación activa más efectivamente el promotor (ver, por ejemplo, Patente de E.ü. No. 5,283,173) . En breve, el sistema de expresión genética de dos híbridos comprende dos casetes de expresión genética; el primero codifica un dominio de unión a ADN fusionado a un polipéptido de receptor nuclear. En la presencia del ligando, la interacción del primer polipéptido con el segundo polipéptido ata efectivamente el dominio de unión a ADN con el dominio de transactivación. Ya que los dominios de unión a ADN y transactivación residen en dos moléculas diferentes, la actividad de fondo en la ausencia del ligando se reduce grandemente . Un sistema de dos híbridos también proporciona sensibilidad mejorada para ligandos no ecdiesteroidales por ejemplo, diacilhidracinas, cuando se comparan con ligandos ecdiesteroidales por ejemplo, ponasterona A ("PonA") o muristerona A ("MurA") . Es decir, cuando se comparan con ecdiesteroides, los ligandos no ecdiesteroidales proporcionan mayor actividad a concentración inferior. Además, ya que la transactivación se basa sobre conmutaciones de gen EcR es con frecuencia dependiente de la linea celular, esto es fácil para adaptar los sistemas de conmutación para obtener la capacidad de transactivación máxima para cada aplicación. Además, el sistema de dos híbridos evita algunos efectos laterales debido a la sobreexpresión de RXR que con frecuencia ocurre cuando se utiliza RXR no modificado como una pareja de conmutación. En un sistema de dos híbridos conocido, se elimina la unión a ADN nativa y los dominios de transactivación de EcR o RXR y como un resultado estas moléculas híbridas tienen menos oportunidad de interactuar con otros receptores de la hormona esteroide presentes en la célula dando como resultado efectos laterales reducidos. El EcR es un miembro de la superfamilia del receptor nuclear y clasificado en la subfamilia 1, grupo H (referido en la presente como "receptores nucleares del Grupo H") . Los miembros de cada grupo comparten 40-60% de identidad de aminoácido en el dominio E (unión a ligando9 (Laudet et al., A Unified Nomenclatura System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97:161-163), Además del receptor de ecdisona, otros miembros de esta subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo H incluyen: el receptor ubicuo (UR) , receptor 1 Orphan (OR-1) , receptor 1 nuclear de la hormona esteroide (NER-1) , proteína de interactuación RXR 15 (RIP-15) , receptor ß de hígado (LXRP) , receptor de la hormona esteroide similar a la proteína (RLD-1) , receptor de hígado x (LXR) , receptor a del hígado x (LXRa) , receptor farnesoide x (FXR) , proteína 14 que interactúa con el receptor (RIP-14) y receptor farnesol (HRR-1) . Para desarrollar un sistema de expresión genética mejorado inducible a base al receptor nuclear del Grupo H en el cual se modifica la unión al ligando o la especificidad del ligando, los Solicitantes crearon EcRs mutantes de sustitución que comprenden residuos de aminoácido sustituidos en el dominio de unión a ligando (LBD) . ün modelo de homología y enfoque de acoplamiento se utilizó para predecir los residuos críticos que median la unión de ecdiesteroides y no ecdiesteroides para el EcR LBD. Estos EcRs mutantes de sustitución se evaluaron en la unión a ligando y los ensayos de transactivación. Como se presenta aquí, los nuevos receptores nucleares mutantes de sustitución del Solicitante y su uso en un sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear proporcionan un sistema de expresión genética inducible mejorado tanto en las células huésped procarióticas como eucarióticas en las cuales la sensibilidad del ligando y magnitud de la transactivación pueden seleccionarse como se desee, dependiendo de la aplicación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los solicitantes describen en la presente la construcción de los receptores nucleares del Grupo H que comprenden mutaciones por sustitución (referidos en la presente como "imitantes de sustitución") en los residuos de aminoácido que se involucran en la unión a ligando para dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que afecta la sensibilidad del ligando y la magnitud de la inducción del receptor nuclear del Grupo H y la demostración que estos receptores nucleares mutantes de sustitución son útiles en los métodos de modulación de la expresión genética. Específicamente, los Solicitantes han desarrollado un nuevo sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear que comprende un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. Los Solicitantes han mostrado que el efecto de tal mutación por sustitución puede incrementar o reducir la actividad de unión a ligando o sensibilidad al ligando y el ligando puede ser ecdiesteroide o no ecdiesteroide específico. Así, la invención de los Solicitantes proporciona un sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear del Grupo H útil para modular la expresión de un gen de interés en una célula huésped. En una modalidad particularmente deseable, la invención de los Solicitantes proporciona un sistema de expresión genética en base al receptor de ecdisona que responde únicamente a ya sea ligandos ecdiesteroidales o ligandos no ecdiesteroidales. Además, la presente invención también proporciona un sistema de expresión genética mejorado inducible en base al receptor de ecdisona responsable del ligando no esferoidal. Asi, el nuevo sistema de expresión genética inducible de los Solicitantes y su uso en los métodos para modular la expresión genética en una célula huésped supera la limitación de los sistemas de expresión inducibles actualmente disponibles y proporciona al experto con medios efectivos para controlar la expresión genética. La presente invención es útil para aplicaciones tales como terapia genética, producción a gran escala de proteínas y anticuerpos, ensayos de selección de alto rendimiento en base a la célula, ensayos de selección de ligando ortogonal, genómicos funcionales, proteómicos, metabolónicos y regulación de rasgos en organismos transgénicos, en donde es deseable el control de los niveles de la expresión genética. Una ventaja de la invención de los Solicitantes es que proporciona un medio para regular la expresión genética y adaptar los niveles de expresión para ajustarse a los requerimientos del usuario. DEFINICIONES En esta descripción se utiliza un número de términos y abreviaturas. Las siguientes definiciones se proporcionan y deben ayudar al entendimiento del alcance y práctica de la presente invención. En una modalidad específica, el término "acerca" o "aproximadamente" se refiere a que se encuentra dentro del 20%, preferentemente dentro del 10%, más preferentemente dentro del 5% y aún más preferentemente dentro del 1% de un valor o rango dado. El término "sustancialmente libre" se refiere a una composición comprende "A" (en donde "A" es una sola proteína, molécula de ADN, vector, célula huésped recombinante, etc.) que es sustancialmente libre de "B" (en donde "B" comprende una o más proteínas recombinantes, moléculas de ADN, vectores, etc.) cuando al menos aproximadamente 75% por peso de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de especies a las cuales pertenecen A y B) en la composición es "A". Preferentemente "A" comprende al menos aproximadamente 90% por peso de las especies A+B en la composición, más preferentemente al menos aproximadamente 99% por peso. También se prefiere que una composición, que se encuentra sustancialmente libre de contaminación, contiene solo especies de un solo peso molecular que tienen la actividad o característica de las especies de interés. El término "aislado" para el propósito de la presente invención designa a un material biológico (ácido nucleico o proteína) que se ha removido de su ambiente natural (el ambiente en el cual es se encuentra presente de manera natural) . Por ejemplo, un polinucleótido presente en el estado natural en una planta o un animal no se aisla, sin embargo, el mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en el cual se encuentra presente de manera natural, se considera "aislado". El término "purificado" no requiere que esté presente el material en una forma que exhiba pureza absoluta, exclusivo de la presencia de otros compuestos. Es preferentemente una definición relativa . ün polinucleótido se encuentra en el estado "purificado" después de la purificación del material de inicio o del material natural por al menos un orden de magnitud, preferentemente 2 o 3 y preferentemente 5 o 5 órdenes de magnitud. Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico comprendido de subunidades enlazadas covalentemente llamadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye ácido poliribonucleico (ARN) y ácido polideoxiribonucleico (ADN) ambos de los cuales pueden ser de un solo filamento o bicatenarios . Los ADN incluyen pero no se limitan a ADNc, ADN genómico, ADN de plásmidos, ADN sintético y ADN semi-sintético. El ADN puede ser lineal, circular o superespiral . Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleótidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxiribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanaosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o calquier análogos de poliéster de los mismos, tales comofosforotioatos y tioésteres, en ya sea la forma de hélice de un solo filamento o bicatenario. Son posibles los ADN-ADN, ADN-ARN de un solo filamento y hélices de ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere solo a la estructura primaria o secundaria de la molécula y no se limita a cualquiera de sus formas terciarias particulares. Asi, este término incluye los ADN bicatenarios encontrados, ínter alia en moléculas de ADN lineales o circulares (e.g., fragmentos de restricció) , plásmidos y cromosomas. Al tratar la estructura de las moléculas de ADN bicatenarias particulares, las secuencias pueden describirse en la presente de acuerdo con la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo del filamento no transcrito de SDN (i.e., el filamento tiene un homólogo de secuencia para el ARNm) . üna "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que sufre una manipulación biológica molecular. El término "fragmento" que se entenderá que se refiere a una secuencia de nucleótido de longitud reducida con relación al ácido nucleico de referencia y que comprende sobre la porción común, una secuencia de nucleótido idéntica a la del ácido nucleico de referencia. Tal un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede, en donde sea apropiado, incluirse en un polinucleótido más grande del cual éste es un constituyente. Tales fragmentos comprenden o consisten alternativamente de oligonucléotidos que varían en longitud a partir de al menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como se utiliza en la presente, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es de filamento sencillo o bicatenario, conteniendo opcionalmente bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. ün fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede comprenderse de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. ün "gen" se refiere a un ensamblaje de nucleótidos que codifica un polipéptido e incluye ácidos nucleicos de ADNc y ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína o polipéptido específico, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificadas) y después (secuencias 3' no codificadas) a la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con su propia secuencia reguladora. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, comprendiendo secuencias reguladora y/o de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. De acuerdo con esto, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se derivan de la misma fuente, pero se disponen en una forma diferente que aquella encontrada en la naturaleza. Un gen quimérico puede comprender secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes y/o secuencias reguladoras derivadas de diferentes fuentes. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. ün gen "extraño" o gen "heterologo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido hacia el genoma mediante un procedimiento de transformación. ADN "heterólogos" se refiere a un ADN no naturalmente localizado en la célula o en un sitio cromosomal de la célula. Preferentemente, el ADN heterologo incluye un gen extraño para la célula. El término "genoma" incluye el ADN o ARN cromosomal asi como mitocondrial, de cloroplasto y viral. Una molécula de ácido nucleico es "hibridizable" hacia otra molécula de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN gene-mico o ARN cuando una forma de un solo filamento de la molécula de ácido nucleico puede fortalecer hacia la otra molécula de ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de temperatura y resistencia iónica a la solución (ver Sambrook et al., 1989 infra) . Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloninig: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989) , particularmente Capitulo 11 y Tabla 11.1 de esto (incorporada completamente en la presente mediante la referencia) . Las condiciones de temperatura y resistencia iónica determinan la "estringencia" de la hibridación. Las condiciones de estringencia pueden ajustarse para ocultar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos distantemente relacionados, para fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos cercanamente relacionados. Para examen preliminar para los ácidos nucleico homólogos, pueden utilizarse las condiciones de hibridación de baja estringencia, corresponden a un Tm de 55°, e.g., 5xSSC, 0.1% de SDS, 0.25% de leche y sin formamida; o 30% de formamida, 5xSSC, 0.5% de SDS) . Las condiciones de hibridación de estringencia moderadas corresponden a un mayor Tm e.g., 40% de formamida, con 5x o 6xSCC. Las condiciones de hibridación de estringencia altas corresponden al más alto Tm e.g., 50% de formamida, 5x o 6xSCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la estringencia de la hibridación, son posibles las desigualdades entre las bases. El término "complementario" se utiliza para describir la relación entre las bases de nucleótido que son capaces de hibridizarse entre si. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria para la timidita y la citosina es complementaria para la guanina. De acuerdo con esto, esta invención también incluye fragmentos de ácido nucleido aislados que son complementarios con las secuencias completas como se describen o utilizan en la presente asi como aquellas secuencias de ácido nucleico sustancilamente similares. En una modalidad especifica de la invención, los polinucleótidos se detectan al emplear las condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en Tm de 55 °C y utilizar condiciones como se establece arriba. En una modalidad preferida, el Tm es de 60 °C; en una modalidad más preferida el Tm es de 63 °C; y aún en una modalidad más preferida el Tm es de 65°C. Los lavados de post-hibridación también determinan las condiciones de estringencia. Un establecimiento de condiciones preferidas utiliza una serie de .lavados iniciando con 6X SSC, 0.5% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos (min) , después repetir con 2X SSC, 0.5% de SDS a 45°C durante 30 minutos y después repetir dos veces con 0.2X SSC, 0.5% de SDS a 50 °C durante 30 minutos. Un establecimiento más preferido de condiciones de estringencia utiliza temperaturas más altas en las cuales los lavados son idénticos a aquellos excepto por la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0.2X SSC, 0.5% de SDS que se incrementó a 60 °C. Otro establecimiento preferido de condiciones altamente astringentes utiliza dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1% de SDS a 65 °C. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos comprenden secuencias complementarias, aunque dependiendo de la estringencia de la hibridación, son posibles las desigualdades entre las bases. La estringencia apropiada para hibridizar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, las variables bien conocidas en la materia. Entre mayor sea el grado de similitud u homología entre las dos secuencias de nucleótido, mayor será el valor de Tra para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a mayor Tm) de hibridaciones de ácido nucleico disminuye ene. siguiente orden: AR : AR , AD : ARN, ADN: DN. Para los híbridos mayores a 100 nucleótidos de longitud, se han derivado las ecuaciones para calcular Tm (ver Sambrook et al., supra, 9.50-0.51) . Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, i.e., oligonucleótidos, la posición de las desigualdades se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Sambrook et al., supra 11.7-11.8) . En una modalidad especifica de la invención, los polinucleótidos se detectan al emplear condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en menos de 500 mM de sal y al menos 37 grados Celsius y una etapa de lavado en 2XSSPE a al menos 63 grados Celsius. En una modalidad preferida, las condiciones de hibridación comprenden menos de 200 mM de sal y al menos 37 grados Celsius para la etapa de hibridación. En una modalidad más preferida, las condiciones de hibridación comprenden 2XSSPE y 63 grados Celsius para ambas etapas de hibridación y de lavado . En una modalidad, la longitud para un ácido nucleico hibridizable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Se prefiere una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferentemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y más preferentemente la longitud es de al menos 30 nucleótidos. Además, el experto reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de solución de lavado puede ajustarse como sea necesario de acuerdo con los factores tales como longitud de la prueba. El término "prueba" se refiere a una molécula de ácido nucleico de un solo filamento que puede emparejar la base con un ácido nucleico dirigido de un solo filamento complementario para formar una molécula bicatenaria. Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 18 nucleótidos, que es hibridizable con una molécula de ADN genómica, una molécula ADNc, una molécula de ADN o una de ARNm de plásmido. Los oligonucleótidos pueden etiquetarse, e.g., con 32P-nucleótidos o nucleótidos a los cuales una etiqueta tal como biotina se han conjugado covalentamente . ün oligonucleótido etiquetado puede utilizarse como una prueba para detectar la presencia de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos (uno o ambos de los cuales pueden etiquetarse) pueden utilizarse como iniciadores PCR ya sea para clonación de longitud total o un fragmento de un ácido nucleico o para detectar la presencia de un ácido nucleico. Un oligonucleótido puede también utilizarse para formar un hélice triple con una molécula de ADN. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, preferentemente sobre un sintetizador de ácido nucleico. De acuerdo con esto, los oligonucleótidos pueden prepararse con uniones de análogo de fosfoéster que no ocurren nturalmente, tales como uniones de tioéster, etc. Un "iniciador" es un oligonucleótido que hibridiza a una secuencia de ácido nucleico de objetivo para crear una región de ácido nucleico bicatenaria que puede servir como un punto de iniciación para la síntesis de ADN bajo condiciones adecuadas. Tales iniciadores pueden utilizarse en una reacción en cadena de polimerasa. La "reacción en cadena de polimerasa" se abrevia PCR y se refiere a un método in vitro para amplificar enzimáticamente secuencias de ácido nucleico específicas. El PCR involucra un serie repetitiva de ciclos de temperatura con cada ciclo comprendiendo tres etapas: desnaturalización del templado de ácido nucleico para separar los filamentos de la molécula de objetivo, fortaleciendo un solo iniciador de PCR de un solo filamento para el templado de ácido nucleico y la extensión del (de los) iniciador (es) fortalecidos mediante polimerasa de ADN. PCR proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula de objetivo y bajo condiciones cuantitativas o semi-cuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula de objetivo dentro del agrupamiento de inicio de los ácidos nucleicos. La "reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa" se abrevia RT-PCR y se refiere a un método in vitro para producir enzimáticamente una molécula o moléculas de ADNc de objetivo a partir de una molécula o moléculas de ARN, seguido por la amplificación enzimática de una secuencia o secuencias de ácido nucleico especifica dentro de la molécula o moléculas de ADNc de objetivo como se describe arriba. RT-PCR también proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula de objetivo y bajo condiciones cuantitativas o semi-cuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula de objetivo dentro del agrupamxento de inicio de los ácidos nucleicos. Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que se transcribe y traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Las "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a secuencias de nucleótido ubicadas corriente arriba (secuencias 5' sin codificar) dentro o corriente abajo (secuencias 3' sin codificar) de una secuencia de codificación y que influyen la transcripción, el procesamiento o estabilidad de ARN o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, promotores, secuencias conductoras de traslación, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento de ARN, sitio de unión efector y estructura de ciclo germinal. Los limites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inicio en la terminal 5' (amino) y un codón de detención de traslación en la terminal 3' (carboxilo) . Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas , ADNc desde ARNm, secuencias de ADN genómico y aún secuencias de ADN sintético. Si las secuencias de codificación se intentan para la expresión de una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción usualmente se ubicarán en 3' para la secuencia de codificación . La "estructura de lectura abierta" se abrevia ORF y se refiere a la longitud de la secuencia de ácido nucleico, ya sea ADN, ADNc o ARN que comprende una señal de inicio de traslación o codón de iniciación, tal como un ATG o AÜG y un codón de terminación y puede traducirse potencialmente en una secuencia de polipéptido. El término "cabeza-con-cabeza" se utiliza en la presente para describir la orientación de dos secuencia de polinucleótido en relación entre si. Los dos polinucleótidos se colocan en una orientación cabeza-con-cabeza cuando el extremo 5' del filamento de codificación de un polinucleótido se encuentra adyacente al extremo 5' del filamento de codificación del otro polinucleótido, por medio del cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede lejos desde el extremo 5r del otro polinucleótido. El término "cabeza-con-cabeza puede abreviarse (5' ) -con- (5' ) y puede también indicarse por los símbolos (<— —>) o (3'<—5' 5'?3' ) . El término "cola-con-cola" se utiliza en la presente para describir la orientación de dos secuencia de polinucleótido en relación entre sí. Los dos polinucleótidos se colocan en una orientación cola-con-cola cuando el extremo 3' del filamento de codificación de un polinucleótido se encuentra adyacente al extremo 3' del filamento de codificación del otro polinucleótido, por medio del cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede hacia el otro polinucleótido. El término "cola-con-ccola puede abreviarse (3' ) -con- (3' ) y puede también indicarse por los símbolos (-» <-) o (5'?3' 3' -5') · El término "cabeza-con cola" se utiliza en la presente para describir la orientación de dos secuencias de polinculeótido en relación entre sí. Los dos polinucleótidos se colocan en una orientación "cabeza-con-cola" cuando el extremo 5' del filamento de codificación de un polinucleótido se encuentra adyacente al extremo 3' del filamento de codificación del otro polinucleótido, por medio del cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede en la misma dirección como aquella del otro polinucleótido. El término "cabeza-con-cola" puede abreviarse (5' ) -con- (3' ) y puede también indicarse por los símbolos (—» —») o (5'—>3' 5'?3') .

El término "corriente abajo" se refiere a una secuencia de nucleótido que se ubica en 3' para la secuencia de nucleótido de referencia. En particular, las secuencias de nucleótido corriente abajo generalmente se refieren a las secuencias que siguen la punto de inicio de transcipción . Por ejemplo, el codón de iniciación de traducción de un gen se ubica aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción. El término "corriente arriba" se refiere a una secuencia de nucleótido que se ubica 5' con la secuencia de nucleótido de referencia. En particular, las secuencias de nucléotido corriente arriba generalmente se refieren a secuencias que se ubican en el lado 5' de una secuencia de codificación o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se ubican corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Los términos "endonucleasa de restricción" y "enzima de restricción" se refiere que una enzima que se une y corta dentro de una secuencia de nucleótido específica dentro del ADN bicaternario . "Recombinación homologa" se refiere a la inserción de una secuencia de ADN extraña hacia otra molécula de ADN, e.g, inserción de un vector en un cromosoma. Preferentemente el vector dirige un sitio cromosomal específico para la recombinación homologa. Para la recombinación homologa específica, el vector contendrá regiones suficientemente grandes de homología para las secuencias del cromosoma para permitir la unión complementaria e incorporación del vector hacia el cromosoma. Las regiones de homología más grandes y grados mayores de similitud de secuencia pueden incrementar la eficiencia de la recombinación homologa. Pueden utilizarse varios métodos conocidos en la materia para propagar un polinucleótido de acuerdo con la invención. Una vez que se establecen un sistema huésped y condiciones de crecimiento adecuadas, los vectores de expresión recombinante pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se describe en la presente, los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen pero no se limitan a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humano o animal tales como virus de vacuna o adenovirus; virus de insecto tales como baculovirus ; vectores de lavadura; vectores bacteriófagos (e.g., lambda) y vectores de ADN de plásmido y cósmico, por nombrar algunos. Un "vector" es cualquier medio para la clonación de y/o la transferencia de un ácido nucleico en una célula huésped. Un vector puede ser un replicón al cual puede unirse otro segmento de ADN a fin de brindar aproximadamente la duplicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (e.g., plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de reproducción de ADN in vivo, i.e., capaz de la reproducción bao su propio control. El término "vector" incluye tanto medios virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. ün gran número de vectores conocidos en la materia pueden utilizarse para manipular los ácidos nucleicos, incorporar los elementos de respuesta y los promotores en los genes, etc. Los vectores posibles incluyen por ejemplo, plásmidos o virus modificados incluyendo por ejemplo bacteriófagos tales como derivados lambda o plásmidos tales como derivados de plásmido pBR322 o pUC o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN correspondientes con los elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado pueden llevarse a cabo mediante la ligación de los fragmentos de ADN apropiados en un vector seleccionado que tiene terminales cohesivas complementarias. Alternativamente, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente o cualquier sitio puede producirse mediante la ligación de las secuencias de nucleótido (enlazadores ) hacia la terminal de ADN. Tales vectores pueden elaborarse para contener genes marcadores seleccionables que se proporcionan para la selección de células que tienen incorporado el marcador en el genoma celular. Tales marcadores permiten la identificación y/o selección de las células huésped que incorporan y expresan las proteínas codificadas por el marcador.

Los vectores virales y particularmente vectores retrovirales, se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones de suministro genético en células, asi como sujetos animales vivientes. Los vectores virales pueden utilizarse incluyendo pero sin limitarse a retrovirus, virus adeno-asociado, sífilis, baculovirus, viruela vacunoide, herpes simple, Epstein-Barr, adenovirus, geminivirus y vectores caulimovirus . Los vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos eléctricamente cargados (citofectinas) , complejos de ADN-proteína y biopolímeros . Además para un ácido nucleico, un vector también puede comprender una o más regiones reguladoras y/o marcadores seleccionables útiles en la selección, medición y monitoreo de los resultados de transferencia de ácido nucleico (transferencia a los tejidos, duración de la expresión, etc . ) . El término "plásmido" se refiere a un elemento extra cromosomal con frecuencia llevado como un gen que no es parte del metabolismo central de la célula y usualmente en la forma de moléculas de ADN bicatenarias circulares . Tales elementos pueden ser secuencias de reproducción autónoma, secuencias de integración de genoma, secuencias de fago o de nucleótido, lineales, circulares o superenrolladas de un ADN o ARN de un solo filamento o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en el cual un número de secuencias de nucleótido se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado junto con la secuencia 3r no traducida apropiada en una célula. Un "vector de clonación" es un "replicón" que es una longitud de unidad de un ácido nucleico, preferentemente ADN, que reproduce secuencialmente y que comprende un origen de reproducción, tal como un plásmido, fago o cósmico al cual puede unirse otro segmento de ácido nucleico a fin de brindar aproximadamente la reproducción del segmento unido. Los vectores de clonación pueden ser capaces de la reproducción en un tipo de célula y la expresión en el otro ("vector de enlace") . Los vectores pueden introducirse en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la materia, e.g., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación de fosfato de calcio, lipofeccion (fusión de lisosoma) , uso de un arma genética o un transportador de vector de ADN (ver, e.g., Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; y Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense No. 2,012,311, presentada en Marzo 15 de 1990) . Un polinucleótido de acuerdo con la invención también puede introducirse in vivo mediante lipofeccion. La pasada década, se incrementó el uso de liposomas para encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lipidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y daños encontrados con la transfección mediada por liposoma pueden utilizarse para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413; Mackey, et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8027-8031; y Ulmer et al., ml993, Science 259:1745-1748) . El uso de lipidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos negativamente cargados y también promover la fusión con membranas celulares negativamente cargadas (Felgner and Ringold, 1989, Science 337:387-388) . Los compuestos de lipido particularmente útiles y composiciones para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en las Publicaciones de Patente Internacionales W095/18863 y W096/17823 y la Patente de E.ü. No. 5,459,127. El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección particular de cromosomas a las células específicas representan un área de beneficio. Es claro que dirigir la transfección para tipos celulares particulares puede preferirse particularmente en un tejido con heterogeneidad celular, tales como páncreas, hígado, riñon y el cerebro. Los lipidos pueden acoplarse químicamente hacia otras moléculas para el propósito de dirigir (Mackey, et al., 1988, supra) . Los péptidos dirigidos, e.g., hornnionas o neurotransmisores y proteínas tales como anticuerpos o moléculas sin péptido pueden acoplarse químicamente a los liposomas. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (e.g., WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (e.g., WO 96/25508) o un polímero catiónico (e.g., WO 95/21931) . También es posible introducir un vector in vivo como un plásmido de ADN puros (ver Patentes de E.ü. 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859) . Los enfoques del suministro de ADN mediado por el receptor también pueden utilizarse (Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147-154; y Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) . El término "transfección" se refiere a la absorción del ARN o ADN exógeno o heterologo mediante una célula. Una célula se ha "transfectado" mediante ARN o ADN exógeno o heterologo cuando tal ARN o ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula se ha "transformado" mediante ARN o ADN exógeno o heterologo cuando el ARN o ADN efectúa un cambio fenotípico. El ARN o ADN de transformación puede integrarse (enlazado covalentemente) en el ADN cromosomal integrando el genoma de la célula.

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, resultando en la herencia genéticamente estable. Los organismos huésped contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados que se prefieren como oganismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados". El término "región genética" se referirá a una región de una molécula de ácido nucleico o una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica un polipéptido. Además, el vector recombinante comprende un polinucleótido que de acuerdo con la invención puede incluir uno o más orígenes para la reproducción en los huéspedes celulares en los cuales se observa su amplificación o su expresión, marcadores o marcadores seleccionables . El término "marcador seleccionable" se refiere a un factor de identificación, usualmente un gen de resistencia antibiótica o química, que es capaz de seleccionarse para basarse del efecto del gen del marcador, i.e., resistencia a un antibiótico, resistencia a un herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes y lo similar, en donde el efecto se utiliza para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés y/o identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés. Ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos y utilizados en la materia incluyen: genes que proporcionan resistencia a la ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, bialafos, herbicida, sulfonamida y lo similar; y genes que se utilizan como marcadores fenotipicos, i.e., genes reguladores de antocianina, gen de isopentanil transferasa y lo similar. El término "gen informador" se refiere a un ácido nucleico que codifica un factor de identificación que es capaz de identificarse en base al efecto del gen informador, en donde el efecto se utiliza para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés, para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés y/o para medir la inducción o transcripción de la expresión genética. Ejemplos de genes informadores conocidos y que se utilizan en la materia incluyen: luciferasa (Luc) , proteina fluorescente verde (GFP) , cloramfenicol acetiltrans erasa (CAT) , ß-galactosidasa (LacZ) , ß-glucuronidasa (Gus) y lo similar. Los genes marcadores seleccionables también pueden considerarse genes informadores. "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, una secuencia de codificación se ubica en 3' para una secuencia de promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad a partir de un gen nativo o pueden componerse de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza o aún comprender segmentos de ADN sintéticos. Debe entenderse por el experto en la materia que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de célula o en diferentes etapas de desarrollo o en respuesta a diferentes ambientes o condiciones fisiológicas. Los promotores que provocan que se exprese un gen en los tipos de célula en la mayoría de las veces se refieren comúnmente como "promotores constitutivos". Los promotores que provocan que un gen se exprese en un tipo de célula específica se refieren comúnmente como "promotores específicos de la célula" o "promotores específicos del tejido". Los promotores que provocan que un gen se exprese en una etapa específica o desarrollo o diferenciación celular se refieren comúnmente como "promotores específicos del desarrollo" o "promotores específicos de la diferenciación celular". Los promotores que inducen y provocan que un gen se exprese después de la exposición o tratamiento de la célula con un agente, molécula biológica, químico, ligando, luz o lo similar, que induce que el promotor se refiera comúnmente como "promotores inducibles" o "promotores regulables". Se reconoce además ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3')· Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se una a su terminal 3' mediante el sitio de iniciación de transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5' ) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba del anterior. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (convenientemente definido por ejemplo, al delinear con nucleasa SI) así como los dominios de unión a la proteína (secuencias de consenso) responsables para la unión de ARN polimerasa. Una secuencia de codificación se encuentra "bajo el control" de las secuencias de control transcripcionales y de traducción en una célula cuando el ARN polimerasa transcribe la secuencia de codificación en un ARNm, que es entonces trans-ARN empalmado (si la secuencia de codificación contiene intrones) y se traduce hacia la proteína codificada por la secuencia de codificación. Las "secuencias de control transcripcionales y de traducción" son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, mejoradotes, terminadores y lo similar, que se proporcionan para la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped. En las células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control. El término "elemento de respuesta" se refiere a uno o más elementos de ADN de actuación cis que confieren sensibilidad en un promotor mediado a través de la interacción con los dominios de unión a ADN del primer gen quimérico. Este elemento de ADN puede ser ya sea palindrómico (perfecto o imperfecto) en su secuencia o compuesto de motivos de secuencia o sitios separados por la mitad mediante un número variable de nucleótidos . Los medios sitios pueden ser similares o idénticos y ordenarse ya sea en repeticiones directas o invertidas o como un sitio de una mitad o multimeros de mitades de sitios adyacentes en tándem. El elemento de respuesta puede comprender un promotor mínimo aislado a diferentes organismos dependiendo de la naturaleza de la célula u organismo en el cual el elemento de respuesta se incorporará. El dominio de unión a ADN de las primeras uniones de proteína híbrida, en la presencia o ausencia de un ligando, para la secuencia de ADN de un elemento de respuesta inicia o suprime la transcrición del (de los) gen (es) corriente abajo bajo la regulación de su elemento de respuesta. Ejemplos de secuencias de ADN para los elementos de respuesta del receptor de ecdisona natural incluyen: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (ver Chrbas L., et al., (1991), Genes Dev 5, 120-131); AGGTCAN(n)AGGTCA, en donde N(n) puede ser uno o más nucleótidos espaciadores (ver D'Avino PP., et al., (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9); y GGGTTGAATGAATTT (ver Antoniewski C., et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474) . El término "operablemente enlazado" se refiere a una asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico por lo que la función es una que se afecta por la otra. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado con una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia de codificación (i.e., aquella secuencia de codificación que se encuentra bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden operablemente enlazarse a las secuencias reguladoras en la orientación del sentido y antisentido . El término "expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable del ARN de sentido (ARNm) o de antisentido derivado a partir de un ácido nucleico o polinucleótido . La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en una proteina o polipéptido. Los términos "cásete", "cásete de expresión" y "cásete de expresión genética" se refiere a un segmentóte ADN que se inserta en un ácido nucleico o polinucleótido en los sitios de restricción especificos o mediante recombinación homologa. El segmento de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés y el cásete y sitios de restricción se diseñan para asegurar la inserción del cásete en la estructura de lectura adecuada para la transcripción y traducción. El "cásete de transformación" se refiere a un vector especifico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés y que tiene elementos además del polinucleótido que facilita la transformación de una célula huésped particular. Los casetes, casetes de expresión, casetes de expresión genética y casetes de transformación de la invención pueden también comprender elementos que se permiten para la expresión mejorada de un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés en una célula huésped. Estos elementos pueden incluir pero no se limitan a: un promotor, un promotor mínimo, un mejorador, un elemento de respuesta, una secuencia de terminación, una secuencia de poliadenilación y lo similar. Para propósitos de esta invención, el término "conmutación genética" se refiere a la combinación de un elemento de respuesta asociado con un promotor y u sistema en base a EcR, el cual en la presencia de uno o más ligando modula la expresión de un gen en el cual se incorporan el elemento de respuesta y el promotor. Los términos "modula" y "modulados" se refiere a que el ácido nucleico o expresión genética induce, reduce o inhibe, resultando en la inducción, reducción o inhibición respectiva de la producción de la proteína o polipéptido. Los plásmidos o vectores de acuerdo con la invención pueden comprender además al menos un promotor adecuado para dirigir la expresión de un gen en una célula huésped. El término "vector de expresión" se refiere a un vector, plásmido o vehículo designado para facilitar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés después de la transformación en la célula huésped. El gen clonado, i.e., la secuencia de ácido nucleico insertada, usualmente se coloca bajo el control de los elementos de control tales como promotor, un promotor mínimo, un mej orador o lo similar. Las regiones o promotores del control de iniciación, que son útiles para dirigir 1 expresión de un ácido nucleico en la célula huésped deseada son numerosos y familiares para los expertos en la materia. Virtualmente cualquier promotor capaz de dirigir estos genes es adecuado para la presente invención incluyendo pero sin limitarse a: promotores virales, promotores bacteriales, promotores animales, promotores de mamífero, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos del tejido, promotores específicos del desarrollo, promotores inducibles, promotores reguladores de luz; CYC1 , HIS3, GALl , GAL4 , GALIO, ADH1 r PGKr PH05, GAPDH, ADC1, TRP1 , ÜRA3, LEU2, ENO, TP1, promotores de fosfatasa alcalina (útiles para la expresión en Saccharomyces) ; promotor A0X1 (útil para la expresión en Pichia) ; ß-lactamasa, promotores lac, ara, tet, trp, IPLr IPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli) , virus de mosaico de coliflor 35S, CMC 35S mínimo regulado con luz, específico de la semilla, específico del polen, específico de ovario, de patogénesis o relacionado con la enfermedad, virus de mosaico de la yuca (CsVMV) , clorofila de unión de clorofila a/b, ribulosa 1, 5-bisfoafato carboxilasa, virus baciliforme de arroz de tungro específico de tiro, específico de raíz, quitinasa, inducible del estrés, super-promotor de planta, aminopeptidasa d eleusina de papa, nitrato reductasa, manopina sintasa, nopalina sintasa, ubiquitina, zein proteína y promtores de antocianina (útiles para la expresión en células de planta) ; promotores de animales y de mamífero conocidos en la materia incluyen pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (SV40e) , el promotor contenido en la repetición de terminal grande 3' (LTR) del virus Rous sarcoma (RSV) , los promotores de E1A o genes promotores tardíos principales (MLP) de adenovirus (ad) , el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) , el virus de herpes simple (HSV) , promotor de timidita cinasa (TK) , un promotor de baculovirus IE1, un promotor del factor de alargamiento 1 alfa (EF1) , un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) , un promotor de ubiquitina (Ubc) , un promotor de albúmina, las secuencias reguladoras del promotor de metalotioneina-L de ratón y regiones de control transcripcional, los promotores ubicuos (HPRT, vimetina, a-actina, tubulina y lo similar) , los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP y lo similar) , los promotores de genes terapéuticos (del MDR, CFTR o factor tipo VIII y lo similar) , patogénesis o promotores relacionados con la enfermedad y promotores que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos, tales como región de control del gen elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas; región de control del gen de insulina activo en células beta pancreáticas, región de control genético de inmunoglobulina activo en células linfoides; región de control del virus de tumor mamario de ratón activo en células testiculares, de seno, linfoides y mastocitos; gen de albúmina, regiones para controlar Apo AI y Apo AII activas en hígado, región de control genético de alfa-fetoproteína activo en hígado, región de control genético de alfa 1-antitripsina activo en el hígado, región de control genético beta-globina activo en células mieloides, región de control genético de proteína básica de mielina activo en células oligodendrocita en el cerebro, región de control genética de cadena-2 ligera de miosina activo en el músculo esqulético y región de control genética de la hormona de desprendimiento ganodotrípica activo en el hipotálamo, promotor de piruvato cinasa, promotor de vilina, promotor del ácido graso que une la proteina intestinal, promotor de la céluladel músculo suave -actina y lo similar. Además, estas secuencias de expresión pueden modificarse mediante la adición del mej orador o secuencias reguladoras y lo similar. Los mej oradores que pueden utilizarse en las modalidades de la invención incluyen pero no se limitan a: un mejorador SV40, un mejorador de citomegalovirus (CMV) , un factor 1 de alargamiento (EF1) , mejoradotes de levadura, mejoradotes de gen viral y lo similar. Las regiones de control de terminación, i.e., secuencias de terminación o de poliadenilación, pueden también derivarse de varios genes nativos de los huéspedes preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser sin embargo innecesario, este se prefiere más si se incluye. En una modalidad preferida de la invención, la región de control de terminación puede comprender o derivarse de una secuencia sintética, señal de poliadenilación sintética, una señal de poliadenilación tardía SV40, una señal de poliadenilación SV40, una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH) , secuencias de terminación virales o lo similar. Los términos "secuencias 3' sin codificación" o "región 3' no traducida (UTR) " se refiere a secuencias de ADN ubicadas corriente abajo (3' ) de una secuencia de codificación y puede comprender secuencias de reconocimiento de poliadenilación [poli (A) ] y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión genética. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de los tractos de ácido poliadenilico hacia el extremo 3' del precursor de ARNm. "Región reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico. Una región reguladora puede incluir secuencias que son naturalmente responsables para la expresión de un ácido nucleico particular (una región homologa) o puede incluir secuencias de un origen diferente que son responsables para la expresión de proteínas diferentes o aún proteínas sintéticas (una región heteróloga) . En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes procarióticos , eucarióticos o virales o secuencias derivadas que estimulan o reprimen la transcripción de un gen en una forma específica o no específica y en una forma inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen orígenes de reproducción, sitios de empalme de ADN, promotores, mejoradotes, secuencias de terminación transcripcional y secuencias de señal que dirigen al polipéptido hacia las trayectorias secretoras de la célula de objetivo. Una región reguladora a partir de una "fuente heteróloga" es una región reguladora que no se asocia naturalmente con el ácido nucleico expresado. Entras las que se incluyen, las regiones reguladoras heterólogas son regiones reguladoras a partir de unas regiones reguladoras de diferentes especies a partir de un gen diferente, secuencias reguladoras híbridas y secuencias reguladoras que no ocurren en la naturaleza pero que se designan por una que tiene el experto en la materia. "Transcripción ARN" se refiere al producto resultante a partir de la transcripción catalizada de polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción sw ARN es una copia complementariamente perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como a la transcripción principal o puede ser una secuencia de ARN derivada a partir del procesamiento post-transcripcional de la transcripción principal y se refiere como al ARN maduro. "ARN mensajero (ARNm) " se refiere al ARN que se encuentra sin nitrotes y puede trasladarse hacia la proteína mediante la célula. "ADNc" se refiere a un ADN bicatenario que es complementario y se deriva de ARNm. ARN de "sentido" se refiere a la transcripción de ARN que incluye el ARNm y así puede traducirse hacia la proteína mediante la célula. "ARN de antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementaria a toda o parte de la transcripción principal o ARNm y que bloquea la expresión de un gen de objetivo. La complementariedad de un ARN de antisentido puede estar con cualquier parte de la transcripción del gen especifico, i.e., en la secuencia 5' sin codificación, secuencia 3' sin codificación o la secuencia de codificación. "ARN funcional" se refiere al aRN de antisentido, ARN de ribocima u otro ARN que aún no se traduce que tiene un efecto sobre los procesos celulares . Un "polipéptido" es un compuesto polimérico comprendido de residuos de aminoácido covalentemente enlazados . Los aminoácidos tienen la siguiente estructura general : R—C—COOH I NH2 Los aminoácidos se clasifican en siete grupos sobre la base de la cadena lateral R: (1) cadenas laterales alifáticas, (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxilico (OH), (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre, (4) cadenas laterales que contienen un grupo acidico o amida, (5) cadenas laterales que contienen un grupo básico, (6) cadenas laterales que contienen un anillo aromático y (7) prolina, un aminoácido en el cual se fusiona la cadena lateral para el grupo amino. Un polipéptido de la invención preferentemente comprende al menos aproximadamente 14 aminoácidos. Una "proteína" es un polipéptido que lleva a cabo un papel estructural o funcional en una célula viviente. ün "polipéptido aislado" o "proteína aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra sustancialmente libre de aquellos compuestos que normalmente se asocian con el mismo en su estado natural (e.g., otras proteínas o polipéptidos , ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos) . "Aislado" no se refiere a que excluye las mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica y que pueden estar presentes por ejemplo, debido a la purificación incompleta, además de los estabilizadores o comprenderse en una preparación farmacéuticamente aceptable. ün "polipéptido mutante de sustitución" o un "mutante de sustitución" se entenderá a que se refiere a un polipéptido mutante que comprende una sustitución de al menos un (1) aminoiácido tipo silvestre o que ocurre naturalmente con un aminoácido diferente con relación al polipéptido tipo silvestre o que ocurre naturalmente. Un polipéptido mutante de sustitución puede comprender solo una (1) sustitución de aminoácido tipo silvestre o que ocurre naturalmente y puede referirse como a un polipéptido "mutante de punto" o un "mutante de un solo punto". Alternativamente, un polipéptido mutante de sustitución puede comprender una sustitución de dos (2) o más aminoácidos tipo silvestre o que ocurren naturalmente con 2 o más aminoácidos con relación al polipéptido tipo silvestre o que ocurre naturalmente. De acuerdo con la invención, un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al polipétido de dominio que comprende una mutación de sustitución comprende una sustitución de al menos un (1) aminoácido tipo silvestre o que ocurre naturalmente con un aminoácido diferente con relación al ligando del receptor nuclear del Grupo H tipo silvestre o que ocurre naturalmente que se une al polipéptido de dominio. En donde el polipéptido mutante de sustitución comprende una sustitución de dos (2) o más aminoácidos tipo silvestre o que ocurren naturalmente, esta sustitución puede comprender ya sea un número equivalente de aminoácidos tipo silvestre o que ocurren naturalmente suprimidos para la sustitución, i.e., 2 aminoácidos tipo silvestre o que ocurren naturalmente reemplazados con 2 aminoácidos que no son tipo silvestre o que no ocurren naturalmente o un número no equivalente de aminoácidos tipo silvestre suprimidos para la sustitución, i.e., 2 aminoácidos tipo silvestre reemplazados con 1 aminoácido no tipo silvestre (una mutación de sustitución+supresión) o 2 aminoácidos tipo silvestre reemplazados con 3 aminoácidos no tipo silvestre (una mutación de sustitución+inserción) . Los imitantes de sustitución pueden describirse utilizando un sistema de nomenclatura abreviada para indicar el residuo de aminoácido y el número reemplazado dentro de la secuencia de polipéptido de referencia y el nuevo residuo de aminoácido sustituido. Por ejemplo, un mutante de sustitución en el cual el veinteavo (20avo) residuo de aminoácido de un polipéptido sustituido puede abreviarse como "x20z", en donde "x" es el aminoácido a reemplazarse, "20" es la posición o número dentro del polipéptido del residuo de aminoácido y "z" es el nuevo aminoácido sustituido. Por lo tanto un mutante de sustitución abreviado de manera intercambiable como "E20A" o "Glu20Ala" indica que el mutante comprende un residuo de alanita (comúnmente abreviado en la técnica como ?" o "Ala") en lugar del ácido glutámico (comúnmente abreviado en la técnica como "E" o "Glu") en la posición 20 del polipéptido. Una mutación o mutante puede ser cualquier cambio incluyendo pero sin limitarse a sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de los mismos. Una mutación de sustitución puede hacerse mediante cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la materia, incluyendo pero sin limitarse a, mutagénesis in vitro dirigida al sitio (Hutchinson, C, et al., 1978, J. Biol . Chem. 253:6551; Zoller and Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:710), el uso de enlazadores TAB® (Pharmacia) , la restricción de la digestión de endonucleasa/supresión y sustitución de fragmento, mutagénesis mediada por PCR/dirigida al oligonucleótido y lo similar. Las técnicas en base a PCR se prefieren para la mutagénesis dirigida al sitio (ver Higuchi, 1989, "Utilizando PCR para la Construcción de ADN" en Technology: Principies and Applications for DNA Ampliication, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capitulo 6, pp. 61-70) . "Fragmento" de un polipéptido de acuerdo con la invención se entenderá que se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácido es más corta que aquella del polipéptido de referencia y que comprende sobre toda la porción con estos polipéptidos de referencia, una secuencia de aminoácido idéntica. Tales fragmentos pueden, en donde sea apropiado, incluirse en un polipéptido más grande del cual son una parte. Tales fragmentos de un polipéptido de acuerdo con la invención pueden tener una longitud de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 o 300 aminoácidos . Una "variante" de un polipéptido o proteina es cualquier análogo, fragmento, derivado o mutante que se deriva de un polipéptido o proteina y que retiene al menos una propiedad biológica del polipéptido o proteina. Pueden existir en la naturaleza diferentes variantes del polipéptido o proteína. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas mediante diferencias en las secuencias de nucleótidos del gen estructural que codifica para la proteína o pueden involucrar empalme diferencial o modificación de post-traducción . El experto puede producir variantes que tienen sustituciones sencillas o múltiples de sustituciones, supresiones, adiciones o reemplazos de aminoácido. Estas variantes pueden incluir, ínter alia: (a) variantes en las cuales uno o más residuos de aminoácido se sustituyen con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las cuales uno o más aminoácidos se agregan al polipéptido o proteína, (c) variantes en las cuales uno o más de los aminoácidos incluyen un grupo sustituyente y (d) variantes en las cuales el polipéptido o proteína se fusiona con otro polipéptido tal como albúmina de suero. Las técnicas para obtener estas variantes, incluyendo las técnicas genéticas (supresiones, omisiones, mutaciones, etc) , químicas y enzimáticas se conocen por las personas expertas en la materia. ün polipéptido variante preferentemente comprende al menos aproximadamente 14 aminoácidos. Una "proteína heteróloga" se refiere a una proteína no naturalmente producida en la célula. Una "proteína madura" se refiere a un polipéptido procesado en post-traducción; i.e., una desde la cual cualquier pre- o propéptido presente en el producto de traducción primario se ha removido. Proteina "precursora" se refiere al producto de traducción primario de ARNm; i.e., con pre- y propéptidos aún presentes . Los pre- y propéptidos pueden pero no se limitan a señales de localización intracelulares . El término "péptido de señal" se refiere a un' polipéptido de terminal amino que precede a la proteina madura secretada. El péptido de señal se divide de y por lo tanto no se encuentra presente en la proteina madura. Los péptidos de señal tienen la función de dirigir y transubicar las proteínas secretadas a través de las membranas celulares. El péptido de señal también se refiere como proteína de señal . Una "secuencia de señal" se incluye al inicio de la secuencia de codificación de una proteína a expresarse en la superficie de una célula. Esta secuencia codifica un péptido de señal, N-terminal para el polipéptido maduro, que dirige la célula huésped para transubicar el polipéptido. El término "transubicación de secuencia de señal" se utiliza en la presente para referirse a esta clase de secuencia de señal. La transubicación de la secuencia de señal puede encontrarse asociada con una variedad de proteínas nativas para eucariotes y procariotes y con frecuencia son funcionales en ambos tipos de organismos. El término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos residuos de polipéptido. La correspondencia entre la secuencia a partir de un residuo hacia otro puede determinarse mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas de polipéptido mediante el alineamiento de la información de secuencia y utilizando programas de computadora fácilmente disponibles. Alternativamente, la homología puede determinarse mediante hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman duplas estables entre las regiones homologas, después de la digestión con nucleasa (s) específica de un solo filamento y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos . Como se utiliza en la presente, el término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones de deletreo se refiere a la relación entre las proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo las proteínas de las superfamilias (e.g., la superfamilia de inmunoglobulina) y proteínas homologas de diferentes especies (e.g., cadena ligera de miosina, etc.) (Reeck et a., 1987, Cell 50:667) . Tales proteínas ( y sus genes que codifican) tienen homología de secuencia, como se refleja por su alto grado de similitud de secuencia. Sin embargo, en el uso compon y en la solicitud presente, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente" puede referirse a la similitud de secuencia y no al origen evolutivo común . De acuerdo con esto, el término "similitud de secuencia" en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácido de las proteínas que pueden o no pueden compartir un origen evolutivo común (ver Reeck et al. , 1987, Cell 50: 667) . En una modalidad específica, las dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares" cuando al menos aproximadamente 50% (preferentemente al menos aproximadamente 75% y más preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95%) de los nucleótidos se igualan sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas pueden identificarse al comparar las secuencias utilizando el software estándar disponible en los bancos de datos de secuencia o en experimento de hibridación Southern bajo por ejemplo, condiciones astringentes como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra con el experto en la materia. Ver e.g., Sambrook et al., 1989, supra . Como se utiliza en la presente, "sustancialmente similar" se refiere a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótido resulta en la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteina codificada por la secuencia de ADN. "Sustancialmente similar" también se refiere a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótido no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión genética mediante tecnología de antisentido o co-supresión . "Sustancialmente similar" también se refiere a las modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la invención presente tal como la omisión o inserción de una o más bases de nucleótido que no afectan sustancialmente las propiedades funcionales de la transcripción resultante. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra dentro de la rutina del experto en la materia, como es la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Además, el experto en la materia reconocerá que las secuencias sustancialmente similares abarcadas por esta invención también se definen por su capacidad de hibridizar, bajo condiciones astringentes (0.1X SSC, 0.1% de SDS, 65°C y lavado con 2X SSC, 0.1% de SDS seguido por 0. IX SSC, 0.1% de SDS), con las secuencias ejemplificadas en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares de la presente invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de · ADN son al menos 70% idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente preferidos de la presente invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son de al menos 80% idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico aún más preferidos son de al menos 95% idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Dos secuencias aminoácidos son "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares" cuando son mayores a aproximadamente 40% de los aminoácidos que son idénticos o mayores del 60% son similares (funcionalmente idénticos) . Preferentemente, las secuencias similares u homologas se identifican mediante alineamiento utilizando por ejemplo, el GCG (Genetic Computer Group, Program Manual para el Paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) , programa de apilamiento. El término "correspondiente a" se utiliza en la presente para referirse a secuencias similares u homologas, ya sea que la posición exacta sea idéntica o diferente a partir de la molécula con la cual se mide la similitud u homología. ün alineamiento de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácido incluye espacios. Así, el término "correspondiente a" se refiere a la similitud de secuencia y no a la numeración de los residuos de aminoácido o bases de nucleótido . üna "porción sustancial" de una secuencia de aminoácido o de nucleótido comprende suficiente de la secuencia de aminoácido de un polipéptido o de la secuencia de nucleótido de un gen para identificar putativamente aquel polipéptido o gen, ya sea mediante evaluación manual de la secuencia por el experto en la materia o mediante comparación e identificación de secuencia automatizada por computadora utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F . , et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver también www.ncbi.nlm.nih.ghov/BLAST/) . En general, una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos es necesaria a fin de identificar putativamente una secuencia de polipéptido o de ácido nucleico como homologa para una proteina o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótido, las pruebas de oligonucleótido especificas del gen comprenden 20-30 nucleótidos contiguos que pueden utilizarse en los métodos de identificación genética dependientes de la secuencia (e.g., hibridación Southern) y el aislamiento (e.g., hibridación in sítu de colonias bacteriales o placas de baceteriófago) . Además, los oligonucleótidos cortos de 12-15 bases pueden utilizarse como iniciadores de amplificación en PCR a fin de obtener un fragmentos de ácido nucleico particular que comprende los iniciadores. De acuerdo con esto, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótido comprende lo suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. El término "identidad de porcentaje", como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinuleótido, como se determinó al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso, como se determinó por la igualación entre las series de tales secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos, incluyendo pero sin limitarse a aquellos descritos en: Computacional Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford üniversity Press, New Cork (1988); Biocomputing: Informatic and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G. , eds . ) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. ed. ) Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991) . Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor igualación entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codfican en los programas de computadora públicamente disponibles. Los cálculos de alineamientos de secuencia e identidad de porcentaje pueden llevarse a cabo utilizando el programa Megalign de las computaciones bioinformáticas LASERGENE adecuadas (DNASTAR Inc., Madison, WI) . El alineamiento múltiple de las secuencias puede llevarse a cabo utilizando el método de alineamiento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153) con los parámetros por omisión (GAP PENALTY=10, GAP LENGHT PENALTY=10) . Pueden seleccionarse los parámetros por omisión para los alineamientos por parejas utilizando el método Clustal: KTÜPLE 1, GAP PENALTY=3 , INDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5. El término "software de análisis de secuencia" se refiere a cualquier algoritmo de computadora o programa de software que es útil para el análisis de las secuencias de nucleótido o de aminoácido. El "software de análisis de secuencia" puede estar comercialmente disponible o independientemente desarrollado. El software de análisis de secuencia típico incluirá pero no se limita al GCG adecuado de programas (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) y DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) .

Dentro del contexto de esta solicitud se entenderá que cuando el software de análisis de secuencia se utiliza para análisis, que los resultados del análisis se basarán en los "valores por omisión" del programa referenciado, a menos que se especifique de otro modo. Como se utiliza en la presente "valores por omisión" se referirá a cualquier conjunto de valores o parámetros, que originalmente se cargan con el software cuando se inicializan primero. Los "genes sintéticos" pueden ensamblarse a partir de bloques de construcción de oligonucleótido que se sintetizan químicamente utilizando procedimientos conocidos por el experto en la materia. Estos bloques de construcción se alinean y recocen para formar segmentos genéticos que entonces se ensamblan enzimátreamente para construir el gen completo. "Químicamente sintetizados" a mediada que se relacionan con una secuencia de ADN, se refiere a que los nucleótidos de componente se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual de ADN puede llevarse a cabo utilizando procedimientos bien establecidos o síntesis química automatizada utilizando uno o más números de máquinas comercialmente disponibles. De acuerdo con esto, los genes pueden hacerse para la expresión genética óptima en base a la optimización de la secuencia de nucleótido para reflejar el codón inclinada hacia la célula huésped. El experto apreciará la probabilidad de la exitosa expresión genética si el uso del codón se inclina hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos puede basarse en un estudio de genes derivados de la célula huésped en donde se encuentra disponible la información de secuencia. Como se utiliza en la presente, dos o más sistemas de regulación genética individualmente operables se dicen que son "ortogonales" cuando; a) la modulación de cada uno de los sistemas dados por su ligando respectivo, a una concentración seleccionada, resulta en un cambio medible en la magnitud de la expresión del gen de ese sistema y b) el cambio es estadísticamente diferente de forma significativa que el cambio en la expresión de todos los otros sistemas simultáneamente operables en la célula, tejido u organismo, sin considerar la simultaneidad o secuencialidad de la modulación actual. Preferentemente, la modulación de cada sistema de regulación genética individualmente operable efectúa un cambio en la expresión genética al menos 2 veces mayor que todos los otros sistemas operables en la célula, tejido u organismo. Más preferentemente, el cambio es de al menos 5 veces mayor. Aún más preferentemente, el cambio es de al menos 10 veces mayor. Aún más preferentemente, el cambio es de al menos 100 veces mayor. Aún más preferentemente, el cambio es de al menos 500 veces mayor. Idealmente, la modulación de cada uno de los sistemas dados mediante su ligando respectivo a una concentración seleccionada resulta en un cambio medible en la magnitud de la expresión del gen de ese sistema y el cambio no medible en la expresión de todos los otros sistemas operables en la célula, tejido u organismo. En tales casos el sistema de regulación genética inducible múltiple se dice que es "completamente ortogonal". La presente invención es útil para la búsqueda de ligandos ortogonales y sistemas de ( expresión genética en base al receptor ortogonal, tales como aquellos descritos en la solicitd de E.ü. co-pendiente No. 09/965,697, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. SISTEMA DE MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA DE LA INVENCIÓN Los solicitantes han identificado en la presente residuos de aminoácido que se involucran en la unión a ligando para un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que afecta la sensibilidad del ligando y magnitud de la inducción en un sistema de expresión genética inducible en base al receptor de ecdisona. Los solicitantes describen en la presente la construcción de los receptores nucleares del Grupo H que comprende mutaciones por sustitución (referido en la presente como "mutantes de sustitución") en estos residuos críticos y la demostración de estos receptores nucleares mutantes de sustitución que son útiles en los métodos de modular la expresión genética. Como se presenta en la presente, los receptores nucleares imitantes de sustitución nuevos de los Solicitantes y su uso en un sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear proporciona un sistema de expresión genética inducible mejorado en tanto las células huésped procarióticas como eucarióticas en las cales la sensibilidad del ligando y magnitud de la transactivación pueden seleccionarse como se desee, dependiendo de la aplicación. Asi, la presente invención se refiere a un nuevo sistema de expresión genética inducible en base a un receptor nuclear, polinucleótidos y polipéptidos del receptor nuclear del Grupo H que comprende tales polinucleótidos y polipéptidos del receptor nuclear del Grupo H y métodos de modular la expresión de un gen dentro de una célula huésped tales como el sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear. En particular, la presente invención se refiere a un sistema de modulación de la expresión genética que comprende al menos un cásete de expresión genética que s capaz de expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. Preferentemente, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución se encuentra a partir de un receptor de ecdisona, un receptor oblicuo, un receptor 1 orfano, un NER-1, un receptor 1 nuclear de hormona esteroide, un receptor retinoide X que interactúa con la proteína 15, un receptor ß de hígado X, un receptor de hormona esteroide similar a la proteína, un receptor de hígado X, un receptor a de hígado X, un receptor farnesoide X, un receptor que interactúa con 1 proteína 14 y un receptor de farnesol. Más pre erentemente, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución se encuentra desde un receptor de ecdisona. En una modalidad específica, el sistema de modulación de expresión genética que comprende un cásete de expresión genética comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. El sistema de modulación de la expresión genética puede comprender además un segundo cásete de expresión genética que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del polipéptido codificado del primer cásete de expresión genética; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del polipéptido codificado del primer cásete de expresión genética; y iii) un gen cuya expresión se va a modular. En otra modalidad especifica, el sistema de modulación de expresión genética comprende; a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que compende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución y b) un segundo dominio de unión a ligando del receptor nuclear seleccionado del grupo que consiste de un dominio de unión a ligando del receptor del retinoide de vertebrado X, un dominio de unión a ligando del receptor del retinoide invertebrado X, un dominio de unión a ligando de la proteina de ultraespiráculo y un dominio de unión a ligando quimérico que comprende dos fragmentos de polipéptido, en donde el primer fragmento de polipéptido es a partir de un dominio de unión a ligando del receptor de retinoide de vertebrado X, un dominio de unión a ligando del receptor del retinoide de invertebrado X o un dominio de unión a ligando de la proteina de ultraespiráculo y el segundo fragmento de polipéptido se encuentra a partir de un diferente dominio de unión a ligando del receptor de retinoide de vertebrado X, un dominio de unión a ligando del receptor del retinoide de invertebrado X o un dominio de unión a ligando de la proteina de ultraespiráculo . El sistema de modulación de expresión genética puede comprender además un segundo cásete de expresión genética que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del polipéptido codificado del primer cásete de expresión genética; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del polipéptido codificado del primer cásete de expresión genética; y iii) un gen cuya expresión se va a modular. En otra modalidad especifica, el sistema de modulación de expresión genética comprende un primer cásete de expresión genética comprende un polinucléotido que codifica un primer polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular y un dominio de unión a ligando del receptor nuclear y un segundo cásete de expresión genética que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando del receptor nuclear, en donde uno de los dominios de unión a ligando del receptor nuclear es un dominio de ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución. En una modalidad preferida, el primer polipéptido se encuentra sustancialmente libre de un dominio de transactivación y el segundo polipéptido se encuentra sustancialmente libre de un dominio de unión a ADN. Para propósitos de la invención, "sustancialmente libre" se refiere que la proteina en cuestión no contiene una secuencia suficiente del dominio en cuestión para proporcionar la activación o actividad de unión. El sistema de modulación de la expresión genética puede comprender además un tercer cásete de expresión genética que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido del primer cásete de expresión genética; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido del segundo cásete de expresión genética; y iii) un gen cuya expresión va a modularse. En donde cuando solo un dominio de unión a ligando del recpeotr nuclear es un dominio de unión a ligando del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, el otro dominio de unión a ligando del Grupo H comprende la mutación por sustitución. Por ejemplo, cuando dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución, el otro dominio de unión a ligando del receptor nuclear ("pareja") puede ser desde un recetor de ecdisona, un receptor de retinoide de vertebrado X (RXR) , un RXR de invertebrado, una proteina de ultraespiráculo (ÜSP) o un receptor nuclear quimérico que comprende al menos dos diferentes fragmentos de polipéptido de dominio de unión a ligando del receptor nuclear seleccionados del grupo que consiste de un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado y un RXR (ver las solicitudes co-pendientes PCT/US01/09050, ÜS 60/294,814 y ÜS 60/294,819 incorporada en la presente mediante la referencia en su totalidad) . La "pareja" del dominio de unión a ligando del receptor nuclear puede comprender además una mutación por truncamiento, una mutación por supresión, una mutación por sustitución u otra modificación. Preferentemente, el dominio de unión a ligando RXR de vertebrado es desde un humano Homo sapiens, ratón Mus musculus, rata Rattus norvegicus, gallina Gallus gallus, cerdo Sus scrofa domestica, rana Xenopus lavéis, pez cebra Danio rerio, tunicado Polyandrocarpa misakiensis, o medusa Tripedalia cysophora RXR. Preferentemente, el dominio de unión a ligando RXR de invertebrado es desde un polipéptido RXR de langosta Locusta migratoria ("LmRXR") , un homólogo 1 de RXR de garrapata estrella solitaria Amblyomma americanum ("AmaRXRl") , un homólogo 2 de RXR de garrapata estrella solitaria Amblyomma americanum ( "AmaRXR2 " ) , un homólogo RXR de cangrejo de mar Celuca pugilator ("CpRXR") , un homólog RXR de escarabajo Tenebrio monitor ("TmRXR") , un homólogo RXR de abeja melífera Apis mellifera ("AmRXR") , un homólogo RXR de pulgón Myzus pe sicae ("MpRXR") o un homólogo RXR de no Diptero/no Lepidóptero. Preferentemente el dominio de unión a ligando RXR quimérico comprende al menos dos fragmentos de polipéptido seleccionados del grupo que consiste de un fragmento de polipéptido RXR de especies de vertebrados, un fragmento de polipéptido RXR de especies de invertebrados y un fragmento de polipéptido homólogo de RXR de especies de invertebrado no Diptero/no Lepidóptero. ün dominio de unión a ligando RXR quimérico para utilizarse en la presente invención puede comprender al menos dos especies diferentes de fragmentos de polipéptido RXR o cuando las especies son la misma, los dos o más fragmentos de polipéptido pueden estar desde dos o más diferentes isoformas de las especies del fragmento de polipéptido RXR. En una modalidad preferida, el dominio de unión a ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento de polipéptido RXR de especies de vertebrado y un fragmento de polipéptido RXR de especies de invertebrado. En una modalidad más preferida, el dominio de unión a ligando RXR quimérico comprende al menos un fragmento de polipéptido RXR de especies de vertebrado y un fragmento de polipéptido homólogo de RXR de especies de invertebrado no Diptero/no Lepidóptero. En una modalidad especifica, el gen cuya expresión se va a modular es un gen homólogo con respecto a la célula huésped. En otra modalidad especifica, es gen cuya expresión se va a modular en un gen heterologo con respecto a la célula huésped. Los ligando para utilizarse en la presente invención como se describe abajo, cuando se combinan con el dominio de unión a ligando del receptor nuclear, que a su vez se rodea por el elemento de respuesta enlazado a un gen, proporciona los medios para la regulación temporal externa de la expresión del gen. El mecanismo' de unión o el otro en el cual los diversos componentes de esta invención se unen entre si, es decir, por ejemplo, el ligando al dominio de unión a ligando, el dominio de unión a ADN al elemento de respuesta, el domininio de transactivación al promotor, etc, no es critico. En un ejemplo especifico, la unión del ligando del dominio de unión al ligando de un receptor nuclear del Grupo H un su pareja del dominio de unión al ligando del receptor nuclear facilita la expresión o supresión del gen. Este mecanismo no excluye el potencial para la unión al ligando para el receptor nuclear del Grupo H (GHNR) o su pareja y la formación resultante de los complejos de homodimero activos (e.g., GHNR + GHNR o pareja + pareja) . Prferentemente uno o más de los dominios receptores se varia produciendo una conmutación de gen híbrido. Típicamente, uno o más de los tres dominios, dominio DBD, LBD y de transactivación, pueden seleccionarse a partir de una fuente diferente que la fuente de los otros dominios por lo que los genes híbridos y las proteínas híbridas resultantes se optimizan en la célula u organismo huésped seleccionado para la actividad de transactivación, la unión complementaria del ligando y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el elemento de respuesta por sí mismo puede modificarse o sustituirse con los elementos de respuesta de otros dominios de proteína de unión a ADN tales como proteína GAL4 a partir de levadura (ver Sadowski, et al., (1988), Nature, 335:563-564) o proteína LexA a partir de Escherichia coli (ver Brent and Ptashne (1985), Cell 43: 729-736) o elementos de respuesta sintéticos específicos para las interacciones dirigidas con proteínas diseñadas, modificadas y seleccionadas para tales interacciones específicas (ver por ejemplo, Kim et al (1997), Proc. Nati. Acad. Scí. USA 94:3 616-3620) para acomodar los receptores híbridos. Otra ventaja de los sistemas de dos híbridos es que permiten la selección de un promotor utilizado para conducir la expresión genética de acuerdo con un resultado final deseado. Tal doble control puede ser particularmente importante en áreas de terapia genética, especialmente cuando se producen proteínas citotóxicas debido a que pueden controlarse tanto el tiempo de expresión así como las células en donde ocurre la expresión. Cuando los genes, operablemente enlazados a un promotor adecuado, se introducen en las células de un sujeto, la expresión de los genes exógenos se controla mediante la presencia del sistema de esta invención. Los promotores pueden regularse constitutiva o induciblemente o pueden ser especificas de tejido (es decir solo se expresan en un tipo de células particulares) o especificas para ciertas etapas de desarrollo del organismo. El receptor de ecdisona es un miembro de la superfamilia del receptor nuclear y se clasifica en la subfamilia I, grupo H (referido para la presente como "receptores nucleares del Grupo H") . Los miembros de cada grupo comparten 40-60% de identidad de aminoácido en el dominio E (unión a ligando) (Laudet et al., A UNIFE Nomenclatura System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163) . Además del receptor de ecdisona otros miembros de esta subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo H incluyen: receptor obicuo (ÜR) , receptor 1 orfan (OR-1) , receptor 1 nuclear de hormona esteroide (NER-1) , receptor retinoide X que interactúa con la proteina 15 (RIP-15), receptor ß de hígado X (LXRP) , receptor de hormona esteroide similar a la protepína (RLD-1) , receptor de hígado X (LXR) , receptor a de hígado X (LXRa) , receptor farnesoide X (FRX) , receptor que interactúa con la proteína 14 (RIP-14) y receptor de farnesol (HRR-1) .

Los solicitantes han desarrollado un modelo de homología CfEcR y han utilizado este modelo de homología junto con un modelo de homología del receptor de ecdisona publicado Chironomous tetans ("CtEcR") (Wurtz et al., 2000) para identificar residuos críticos involucrados en la unión a ecdiesteroides y no exdiesteroides . Los no ecdiestroides sintéticos, diacilhidracinas han mostrado unir EcRs de lepidopteran con alta afinidad e inducen la muda precoz incompleta en estos insectos (Wing et al., 1988) y varios de estos compuestos se mercadean actualmente como insecticidas. La actividad de unión a ligando o "cavidad" de EcRs se ha envuelto para fijar las grandes estructuras principales de ecdiesteroides tales como 20-hidroxiecdisona (20E) . Las diacilhidracinas tienen una estructura compacta comparada con los ecdiesteroides y ocupan solo a parte inferior del cavidad de unión de EcR. Esto deja unos cuantos residuos críticos en la parte superior del cavidad de unión que hacen contacto con los ecdiesteroides pero no con los no ecdiesteroides tales como bisacilhidracinas . Los solicitantes describen en la presente la construcción de receptores de ecdisona mutantes que comprenden una mutación por sustitución en estos residuos de cavidad de unión y se han identificado varias clases de receptores de ecdisona mutantes por sustitución con una unión a ligando modificada y características de transactivación. Dadas las relaciones cercanas del receptor de ecdisona con los otros receptores nucleares del Grupo H, las mutaciones por sustitución del dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona identificadas por los Solicitantes también se espera que trabajen cuando se introducen hacia la posición análoga del dominio de unión a ligando de los otros receptores nucleares del Grupo H para modificar su unión al ligando o su sensibilidad al ligando. ün experto en la materia puede identificar las posiciones de aminoácido mediante la secuencia y función utilizando métodos de rutina en la materia tales como análisis de secuencia, análisis del cavidad de unión a través de modelaje de homología y ensayos de unión. Los nuevos polinucleótidos y polipéptidos del receptor nuclear del Grupo H mutados por sustitución de los Solicitantes son útiles en un sistema de modulación genética inducible en base al receptor nuclear para varias aplicaciones incluyendo terapia genética, expresión de las proteínas de interés en células huésped, producción de organismos transgénicos y ensayos en base a la célula. En particular, los Solicitantes describen en la presente un nuevo sistema de modulación de la expresión genética que comprende un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. Este sistema de expresión genética puede ser un sistema de expresión genética en base a "una sola conmutación" en el cual el dominio de transactivación, dominio de unión a ADN y dominio de unión a ligando se encuentran sobre el polipéptido no codificado. De manera alternativa, el sistema de modulación de expresión genética puede ser un sistema de modulación de expresión genética en base a "conmutación dual" o de "dos híbridos" en el cual el dominio de transactivación y el dominio de unión a ADN se ubican sobre dos diferentes polipéptidos codificados. Los Solicitantes han demostrado por primera vez que un receptor nuclear mutado por sustitución puede utilizarse como un componente de un sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear para modificar la actividad de unión a ligando y/o especificidad de ligando en tanto las células procarióticas como eucarióticas . Como se trata en la presente, los descubrimientos de los Solicitantes ambos son inesperados y sorprendentes. Un sistema de modulación de expresión genética en base al receptor de ecdisona de la presente invención puede ser ya sea heterodimérico u homodimérico . Un complejo EcR funcional generalmente se refiere a un complejo de proteína heteridimérico que consiste de dos miembros de la familia del receptor de esferoide, una proteína del receptor de ecdisona obtenida de varios insectos y una proteína de ultraespiráculo (USP) o del homólogo de vertebrado de USP, proteína del receptor retinoide X (ver Yao et al., (1993) Nature 366: 476-479; Yao et al., (1992) Cell 71: 63-72) . Sin embargo, el complejo también puede ser un homodimero como se detalla abajo. El complejo del receptor de ecdiesteroide funcional también puede incluir proteína (s) adicional (es) tales como inmunofilinas . Los miembros adicionales de la familia del receptor de esferoide de las proteínas, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38 o betaFTZ-1) , también pueden ser parejas dependientes o independientes del ligando para EcR, USP y/o RXR. Adicionalmente, pueden requerirse otros cofactores tales como proteínas generalmente conocidas como coactivadores (también llamados adaptadores o mediadores) . Estas proteínas no se unen específicamente a la secuencia para ADN y no se involucran en la transcripción basal. Pueden ejercer su efecto en la activación por transcripción a través de varios mecanismos, incluyendo estimulación de la unión a ADN de los activadores, al afectar la estructura de cromatina o al mediar las interacciones del complejo de iniciación del activador. Ejemplos de tales coactivadores incluyen RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-l, TIF2/GRIP/NCOA-2, ACTR/AIBl/RAC3/pCIP así como la proteína de unión del elemento B de respuesta del coactivador mezclado, CBP/p300 (para revisar ver Glass et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 9: 222-232, 1997) . También, los cofactores de proteína generalmente conocidos como corepresores (también conocidos como represores, silenciadores o mediadores de silencio) pueden requerirse para inhibir de manera efectiva la activación transcripcional en la ausencia del ligando. Estos corepresores pueden interactuar con el receptor de ecdisona no ligado para silenciar la actividad en el elemento de respuesta. La evidencia actual sugiere que la unión del ligando cambia la conformación del receptor, lo cual resulta en la liberación del corepresor y el reclutamiento de los coactivadores arriba descritos, anulando por lo tanto su actividad silenciadora . Ejemplos de corepresores incluyen N-CoR y SMRT (para revisar, ver Horwitz et al., Mol Endocrinol 10:1167-1177, 1996) . Estos cofactores pueden ser ya sea endógenos dentro de la célula u organismo o pueden agregarse de manera exógena como transgenes para expresarse en ya sea una forma regulada o no regulada. Los complejos de homodimero de la proteina del receptor de ecdisona, ÜSP o RXR también pueden ser funcionales bajo algunas circunstancias. El complejo del receptor de ecdisona típicamente incluye proteínas que son miembros de la superfamilia del receptor nuclear en donde todos los miembros se caracterizan generalmente por la presencia de un dominio de transactivación de terminal amino, un dominio de unión a ADN ("DBD") y un dominio de unión a ligando ("LBD") separado del DBD mediante una región de articulación. Como se utiliza en la presente, el término "dominio de unión a ADN" comprende una secuencia de polipéptido mínima de una proteína de unión a ADN, hasta toda la longitud total de una proteína de unión a ADN, siempre que las funciones del dominio de unión de ADN se asocien con un elemento de respuesta particular. Los miembros de la superfamilia del receptor nuclear también se caracterizan por la presencia de cuatro o cinco dominios: A/B, C, D, E y algunos miembros F (ver la patente de E.U. 4,981,784 y Evans, Science 240: 889-895 (1988)) . El dominio "A/B" corresponde a la región de articulación y ??" corresponde al dominio de unión a ligando. Algunos miembros de la familia pueden también tener otro dominio de transactivación en el lado de la Terminal carboxi del LBD correspondiente con "F". El DBD se caracteriza por la presencia de dos indicadores de cisteina de zinc que son dos motivos de aminoácido, la caja P y la caja D, que confieren especificidad para los elementos de respuesta de ecdisona. Estos dominios pueden ser ya sea nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de las proteínas del receptor heterólogas. El receptor EcR, como un subconjunto de la familia del receptor esferoide, también posee regiones menos bien definidas responsables de las propiedades de heterodimerización . Debido a que los dominios de los receptores nucleares son modulares en la naturaleza, los dominios LBD, DBD y de transactivación pueden intercambiarse. Los sistemas de conmutación genética se conoce que incorporan los componentes a partir del complejo del receptor de ecdisona. Sin embargo, en estos sistemas conocidos, en donde sea que se utilice EcR este se asocia con dominios de unióna a ADN nativos o modificados y dominios de transactivación en la misma molécula. ÜSP o RXR se utilizan típicamente como parejas de silencio. Los Solicitantes han mostrado previamente que cuando los dominios de unión a ADN y los dominios de transactivación se encuentran sobre la misma molécula, la actividad antecedente en la ausencia del ligando es alta y esa actividad se reduce dramáticamente cuando los dominios de unión a ADN y los dominios de transactivación se encuentran sobre diferentes moléculas, es decir, en cada una de las dos parejas de un complejo heterodimérico u homodimérico (ver PCT/US01/09050 ) . CASETES DE EXPRESIÓN GENÉTICA DE LA INVENCIÓN El nuevo sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear de la invención comprenden al menos un cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en una célula huésped, en donde el cásete de expresión genética comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio. Asi, la invención de los Solicitantes también proporciona nuevos casetes de expresión genética para utilizarse en el sistema de expresión genética de la invención . En una modalidad especifica, el cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en una célula huésped comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipéptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN y un dominio de unión de ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución; b) un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución; y c) un polipéptido que comprende un dominio de transactivación y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. En otra modalidad específica, la presente invención proporciona un cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en una célula huésped, en donde el cásete de expresión genética comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN y un dominio de unión de ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución; b) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución; y c) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y un ligando del receptor nuclear del Grupo H que se une al dominio que comprende una mutación por sustitución. ün polipéptido híbrido de acuerdo con la invención que comprende al menos dos fragmentos de polipéptido, en donde cada fragmento de polipéptido es de una fuente diferente, i.e., un polipéptido diferente, un receptor nuclear diferente, una especie diferente, etc. El polipéptido híbrido de acuerdo con la invención que puede comprender al menos dos dominios de polipéptido, en donde cada dominio de polipéptido es a partir de una fuente diferente. En una modalidad específica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución de un receptor de ecdisona, un receptor oblicuo, un receptor 1 orfan, un NER-1, un receptor 1 nuclear de hormona esferoide, un receptor retinoide X que interactúa con la proteína 15, un receptor ß de hígado X, un receptor de hormona esferoide similar a la proteína, un receptor de hígado X, un receptor a de hígado X, un receptor farnesoide X, un receptor que interactúa con la proteína 14 y un receptor de farnesol. En una modalidad preferida, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se encuentra a partir de un receptor de ecdisona. Así, la presente invención también proporciona un cásete de expresión genética que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipéptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN y un dominio de unión de ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución; b) un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución; y c) un polipéptido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución. Preferentemente, el cásete de expresión genética comprende un polinucleótido que codifica un polipoéptido híbrido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN y un dominio de unión de ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución; b) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución; y e) un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución; en donde el polipéptido híbrido codificado comprende al menos dos fragmentos de polipéptido, en donde cada fragmento de polipéptido es desde una fuente diferente. El dominio de unión a ligando (LBD) del receptor de ecdisona (EcR) puede ser desde un EcR de invertebrado, seleccionado preferentemente de la clase EcR Artrópodo. Preferentemente el EcR se selecciona del grupo que consiste de un EcR Lepidóptero, un EcR Díptero, un EcR Ortrópodo, un EcR Homeóporo y un EcR Hemíptero. Más preferentemente, el dominio de unión a ligando EcR para utilizarse en la presente invención es desde un EcR budworn de abeto Choristoneura fumiferana ("CfEcR") , un EcR de escaraba o Tenebrio molitor ("TmEcR") , un EcR Manduca sexta ("MsEcR") , un EcR Heliothies virescens ("HvEcR") , un EcR de jején Chironomus tetans ("CtEcR") , un EcR de silk moth Bombix morí ("BmEcR") , un EcR de mariposa Bicyclus anynana ("BanEcR") , un EcR de castaño de indias Junonia coenia ("JcEcR") , un EcR de mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR") , un EcR de mosquito Aedes aegypti ("AaEcR") , un moscón Lucila capitata ("LcEcR") , un EcR de moscón Lucila cuprina ("LucEcR") , un EcR de moscón Calliphora vicinia ("CvEcR") , un EcR de mosca de la furta Mediterránea Ceratitis capitata ("CcEcR") , un EcR de langosta Locusta migratoria ("LmEcR") , un EcR de pulgón Myzus persicae ("MpEcR") , un EcR de cangrejo de mar Celuca pugilator ("CpEcR"), un EcR de garrapata estrella solitaria Amblyomma americanum ("AmaEcR") , un EcR de mosca blanca Bamecia argentifoli ("BaEcR") o un EcR de saltarilla Nephotetix cincticeps ("NcEcR") . Más preferentemente, el LBD es desde un CfEcR, un DmEcR o un AmaEcR.

En una modalidad especifica, el LBD es desde un polipéptido EcR truncado. La truncacion del polipéptido EcR resulta en una supresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 o 265 aminoácidos. Preferentemente, la truncacion del polipéptido EcR resulta en una supresión de al menos un dominio de polipéptido parcial. Más preferentemente, la truncacion del polipéptido EcR resulta en una supresión de al menos un dominio de polipéptido total. En una modalidad especifica, la truncacion del polipéptido EcR resulta en una supresión de al menos un dominio A/B, un dominio C, un dominio D, un dominio F, unos dominios A/B/C, unos dominios A/B/l/2, unos dominios A/B/C/D, unos dominios A/B/C/D/F, unos dominios A/B/F, unos dominios A/B/C/F, un dominio parcial E o un dominio parcial F. Puede también llevarse a cabo una combinación de varias supresiones de dominios completos y/o parciales . En una modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en una sustitución de a) el residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 o' 238 de la SEQ ID N0:1, b) residuos de aminoácido 96 y 119 de la SEQ ID NO:l, c) residuos de aminoácido 110 y 128 de la SEQ ID NO:l, d) residuos de aminoácido 52 y 110 de la SEQ ID NO:l, e) residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l o f) residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l. En otra modalidad, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende mutaciones de codón que resulta en la sustitución de residuos de aminoácido 107 y 127 y la inserción del aminoácido 259 de la SEQ ID NO:l. En una modalidad preferida, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor de ecdisona. En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en una sustitución de a) un residuo de aspargina, arginina, tirosina, triptofan, leucina o lisina en una posición equivalente al análogo para el residuo de aminoácido 48 de la SEQ ID NO:l, b) un residuo de metionina, asparginas o leucina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 51 de la SEQ ID NO:l, c) un residuo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina o ácido glutámico a una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l, d) un triptofano o treonina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 54 de la SEQ ID NO:l, e) una leucina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 92 de la SEQ ID NO: 1, f) un residuo de histidina, metionina o triptofano en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 95 de la SEQ ID N0:1, g) un residuo de leucina, serina, ácido glutámico o triptofano en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 96 de la SEQ ID NO:l, h) un residuo de triptofano, prolina, leucina, metionina o aspargina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 109 de la SEQ ID NO:l, i) un residuo de ácido glutámico, • triptofano o aspargina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, j) una fenilalanina en una- posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 119 de la SEQ ID NO:l, k) un triptofano o metionina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 120 de la SEQ ID NO:l, 1) un ácido glutámico, prolina, leucina, cisterna, triptofano, glicina, isoleucina, aspargina, serina, valina o arginina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 125 de la SEQ ID NO:l, m) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 128 de la SEQ ID NO:l, n) una metionina, aspargina, ácido glutámico, valina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 132 de la SEQ ID N0:1, o) un residuo de alanina, Usina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 219 de la SEQ ID N0:1, p) un residuo de lisina, arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 223 de la SEQ ID N0:1, q) una metionina, arginina, triptofano o isoleucina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 234 de la SEQ ID N0:1, r) una prolina, ácido glutámico, leucina, metionina o tirosina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 238 de la SEQ ID NO:l, s) un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 119 de la SEQ ID NO:l y una treonina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 96 de la SEQ ID NO:l, t) un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l y un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 128 de la SEQ ID NO:l, u) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l y un residuo de pralina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, v) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 107 de la SEQ ID NO:l, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de la SEQ ID NO:l y un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l o w) una isoleucina en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 107 de la SEQ ID NO:l, un ácido glutámico en una posición equivalente análoga al aminoácido 127 de la SEQ ID NO:l y una valina en la posición equivalente o análoga del aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l. En otra modalidad dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende mutaciones de codón que resultan en la sustitución de un residuo de leucina en la posición equivalente o análoga para el aminoácido 107 de la SEQ ID NO:l, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 127 de la SEQ ID ??:1 y la inserción de un residuo de glicina en la posición equivalente o análoga del aminoácido 259 de la SEQ ID NO:l. En una modalidad preferida, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor de ecdisona. En una modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste de la mutación por sustitución F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E , R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, AllOE, AllON, AllOW, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V y V1071/Y127E/A110P de la SEQ ID NO:l. En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en la mutación por sustitución V1071/Y127E de la SEQ ID NO:l, que comprende además la mutación por inserción G259 de la SEQ ID NO:l (V1071/Y127E/G259) . En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un polipéptido del dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido que hibridiza a un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en una mutación por sustitución del grupo que consiste de F48Y, F48 , F48L, F48N, F48R, F48K, 151 , 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, AllOE, AllON, AllOW, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W23 8L, N119F/V96T, V128 F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V y V1071/Y127E/A110P de la SEQ ID N0:1 bajo condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en menos de 500 mM de sal y al menos 37 grados Celsius y una etapa de lavado en 2XSSPE al menos 63 grados Celsius. En una modalidad preferida, las condiciones de hibridación comprenden menos de 200 mM de sal y al menos 37 grados Celsius para la etapa de hibridación. En otra modalidad preferida, las condiciones de hibridación comprenden 2XSSPE y 63 grados Celsius para ambas etapas de hibridación y de lavado. En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución en un posición equivalente o análoga para a) el residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 o 238 de la SEQ ID NO:l, b) el residuo de aminoácido 96 y 119 de la SEQ ID NO: 1, c) el residuo de aminoácido 110 y 128 de la SEQ ID NO: 1, d) los residuos de aminoácido 52 y 110 de la SEQ ID NO: 1, e) los residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO: 1, o f) el residuo de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende mutaciones por sustitución que resultan en la mutación por sustitución en una posición equivalente o análoga para los residuos de aminoácido 107 y 127 y la inserción del residuo de aminoácido 259 de la SEQ ID NO:l. En una modalidad preferida, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor de ecdisona. Preferentemente, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una sustitución de a) un residuo de aspargina, arginina, tirosina, triptofano, leucina o lisina en una posición equivalente a análoga para el residuo de aminoácido 48 de la SEQ ID NO:l, b) un residuo de metionina, aspargina o leucina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 51 de la SEQ ID NO:l, c) un residuo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l, d) un nresiduo de triptofano o treonina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 54 de la SEQ ID NO:l, e) un residuo de leucina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 92 de la SEQ ID N0:1, f) un residuo de histidina, metionina o triptofano en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 95 de la SEQ ID N0:1, g) un residuo de leucina, serina, ácido glutámico o triptofano en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 96 de la SEQ ID N0:1, h) un triptofano, prolina, leucina, metionina o aspargina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 109 de la SEQ ID NO:l, i) un residuo de ácido glutámico, triptofano o aspargina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, j) un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 119 de la SEQ ID NO:l, k) un residuo de triptofano o metionina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 120 de la SEQ ID NO:l, 1) un residuo de ácido glutámico, prolina, leucina, cisteina, triptofano, glicina, isoleucina, aspargina, serina, valina o arginina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 125 de la SEQ ID NO:l, m) un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 128 de la SEQ ID NO:l, n) un residuo de metionina, aspargina, ácido glutámico o valina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 132 de la SEQ ID N0:1, o) un residuo de alanina, lisina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 219 de la SEQ ID NO:l, p) un residuo de lisina, arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 223 de la SEQ ID N0:1, q) un residuo de metionina, arginina, triptofano o isoleucina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 234 de la SEQ ID N0:1, r) un residuo de prolina, ácido glutámico, leucina, metionina o tirosina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 238 de la SEQ ID N0:1, s) un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 119 de la SEQ ID N0:1 y un residuo de treonina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 96 de la SEQ ID NO:l, t) un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 110 de la SEQ ID NO: 1 y un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 128 de la SEQ ID NO: 1, u) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l y un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, v) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 107 de la SEQ ID N0:1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 127 de la SEQ ID NO:l y un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, o w) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 107 de la SEQ ID N0:1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 127 de la SEQ ID N0:1 y un residuo de valina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 52 de la SEQ ID N0:1. En otra modalidad, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una sustitución de un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 107 de la SEQ ID NO:l, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 127 de la SEQ ID NO:l y la inserción de un residuo de glicina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 259 de la SEQ ID NO:l. En una modalidad preferida, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor de ecdxsona. En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución es un ligando de receptor de ecdisona que se une al polipéptido de dominio que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución se selecciona del grupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125 , M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, T52V/A110P, V128F/A110P, V107I/Y127E/T52V y V107I/Y127E/A110P mutación por sustitución de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende a substititución mutación es un ligando del receptor de ecdisona que se une al polipéptido de dominio que comprende una mutación por sustitución V107I/Y127E de la SEQ ID NO:l, que comprende además la mutación por inserción G259 de la SEQ ID NO:l (V107I/Y127E/G259) . El dominio de unión a ADN puede ser cualquier Dominio de unión a ADN con un elemento de respuesta conocido, incluyendo dominios de unióna a ADN sintéticos y quiméricos o análogos, combinaciones o modificaciones de los mismos. Preferentemente, el DBD es un DBD GAL4 , un DBD Lex, un DBD de factor de transcripción, un DBD del miembro del receptor nuclear del Grupo H, un DBD del miembro de la superfamilia del receptor nuclear de la hormona esteroide/tiroide o un DBD LacZ bacterial. Más preferentemente, el DBD es un DBD EcR [SEQ ID NO: 4 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 5 (polipéptido)], un DBD GAL4 [SEQ ID NO: 6 (polinucleótido) o SEQ ID NO:7 (polipéptido)] o un DBD LexA [SEQ ID NO: 8 (polinucléótido) o SEQ ID NO:9 (polipéptido)] .

El dominio de transactivación (abreviado "AD" o "TA") puede ser cualquier AD del miembro del receptor nuclear del Grupo H, AD del receptor nuclear de la hormona esteroide/ tiroide, AD sintético o quimérico, AD de poliglutamina, AD de aminoácido básico o acidico, un AD VP16, un AD GAL4, un AD NF-??, un AD BP64, un dominio de activación acidico B42 (B42AD) , un dominio de transactivación p65 (p65AD) o un análogo, combinación o modificación del mismo. En una modalidad especifica, el AD es un AD sintético o quimérico o se obtiene a partir de un EcR, un receptor glucocorticoide, un AD de dominio de transactivación acidico VP16, GAL , NF-KB o B42. Preferentemente, el AD es un AD EcR [SEQ ID NO: 10 (polinucleótido) o SEQ ID NO:ll (polipéptido) ] , un AD VP16 [SEQ ID NO:12 (polinucleótido) o SEQ ID NO:13 (polipéptido)], un AD B42 [SEQ ID NO: 14 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 15 (polipéptido)] o un AD p65 [SEQ ID NO:16 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 17 (polipéptido)]. En una modalidad especifica, el cásete de expresión genética codifica un polipéptido híbrido que comprende ya sea a) un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 o b) un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16; y un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferentemente, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido de acuerdo con la invención. En otra modalidad especifica, el cásete de expresión genética codifica un polipéptido híbrido que comprende ya sea a) un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 o b) un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17; y un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. Preferentemente, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. La presente invención también proporciona un cásete de expresión genética que comprende: i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN; ii) un promotor que se activa por un polipéptido que comprende un dominio de transactivación; y iii) un gen cuya expresión se va a modular . El elemento de respuesta ("RE") puede ser cualquier elemento de respuesta con un dominio de unión a ADN conocido o un análogo, combinación o modificación del mismo. Puede emplearse un solo RE o múltiples Res, ya sea múltiples copias del mismo RE o dos o pueden utilizarse más diferentes REs en la presente invención. En una modalidad especifica, el RE es un RE a partir de GAL4 ("GAL4RE") , LexA, un RE deñ receptor nuclear del Grupo H, un RE del receptor nuclear de la hormona esteroide/tiroide o un RE sintético que reconoce un dominio de unión a ADN sintético. Preferentemente, el RE es un elemento de respuesta de ecdisona (EcRE) que comprende una secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 18, un GAL4RE que comprende una secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 19 o un RE LexA (operon "op") que comprende una secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO:20 ("2XlexAopRE") . ün dominio de unión a ADN del receptor nuclear de hormona esteroide/tiroide, dominio de activación o elemento de respuesta de acuerdo con la invención puede obtenerse a partir de un receptor nuclear de hormona esteroide/tiroide seleccionado del grupo que consiste del receptor a de hormona esferoide (TR ) , receptor 1 tiroide (c-erbA-1) , receptor ß de hormona tiroide (TR-ß) , receptor a de ácido retinóico (RARcc) , receptor ß de ácido retinóico (RAR , HAP) , receptor ? de ácido retinóico (RARy) , receptor de ácido retinóico similar a gama (RARD) , receptor activado por el proliferador de peroxisoma (PPARa) , receptor ß activado por el proliferador de peroxisoma (PPARP) , receptor d activado por el proliferador de peroxisoma (PPAR5, NÜC-1) , receptor relacionado con el activador del proliferador de peroxisoma (FFAR) , receptor ? activado por el proliferador de peroxisoma (PPARy) , receptor de orfano codificado por filamento sin codificar del receptor a de la hormona tiroide (REVERB ) , receptor relacionado con v-erb A (EAR-1) , receptor relacionado con v-erb (EAR-1A) , ?) , receptor de orfano codificado por el filamento sin codificar del receptor ß de hormona tiroide (REVERBp) , receptor relacionado con v-erb (EAR-?ß) , receptor BD73 nuclear orfano (BD73), receptor relacionado con rev-erbA (RVR) , proteina 126 de cursor de zinc (HZF2) , proteina E75 inducible de ecdisona (E75) , proteina E78 inducible de ecdisona (E78) , receptor 78 de Drosofila (DR-78), receptor a de orfano relacionado de retinoide (ROR ) , receptor a retinoide Z (RZR ) , receptor ß de orfano relacionado con retinoide (RORP) , receptor ß de retinoide Z (RZRß) , receptor yde orfano relacionado con retinoide (RORy) , receptor y de retinoide Z RZRy) , receptor orfano relacionado con retinoide (TOR) , receptor 3 de hormona (HR-3), receptor 3 de hormona de Drosophila (DHR-3) , receptor de la hormona de Manduca (MHR-3) , receptor 3 de la hormona Gallería (GHR-3), receptor nuclear 3 de C. elegans (CNR-3) , receptor 3 de la hormona Choristoneurea (CHR-3) , receptor nuclear 14 de C. elegans (CNR-14) , receptor de ecdisona (ECR) , receptor oblicuo (ÜR) , receptor nuclear de offano (OR-1) , NER-1, proteina 15 que interactúa con el receptor (RIP-15) , receptor ß de hígado X (LXRP) , receptor de hormona esteroide similar a la proteína (RLD-1) , receptor de hígado X (LXR) , receptor a de hígado X (LXRa) , receptor de farsenoide X (FXR), proteína 14 que interactúa con el receptor (RIP-14) , HRR-1, receptor de vitamina D (VDR) , receptor nuclear de orfano (ONR-1), receptor de pregnano X (PXR) , receptor esteroide y xenobiótico (SXR) , receptor de benzoato X (BXR) , receptor nuclear ( B-67) , receptor 1 de androstano constitutivo (CAR-1) , receptor a de androstano constitutivo (CARa) , receptor 2 de androstano constitutivo (CAR-2) , receptor ß de androstano constitutivo (CAR ) , receptor 96 de la hormona de Drosophila (DHR-96) , receptor 1 de hormona nuclear (NHR-1) , factor nuclear 4 de hepatocito (HNF-4) , factor nuclear 4G de hepatocito (HNF-4G) , factor nuclear 4B de hepatocito (HNF-4B) , factor nuclear 4D de hepatocito (HNF-4d, DHNF-4), receptor a de retinoide X (RXRa) , receptor ß de retinoide X (RXRP) , proteína de unión de la región II H-2 (H-2RIIBP) , co-regulador 1 del receptor nuclear (RcoR-1) , receptor ? de retinoide X (RXRy) , ültraespiráculo (ÜSP) , receptor nuclear 2C1, factor 1 de corion (CF-1) ,· receptor 2 testicular (TR-2), receptor 2-11 testicular (TR2-11) , receptor 4 testicular (TR4) , TAK-1, receptor de la hormona de Drosophila (DHR-78) , Sin Cola (TLL) , homólogo sin cola (TLX) , XTLL, factor de transcripción I del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COÜP-TFI) , factor de transcripción A del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COUP-TFA) , EAR-3, SVP-44, factor de transcripción II del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COUP-TFII) , factor de transcripción B del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COÜP-TFB) , ARP-1, SVP-40, SVP, factor de transcripción III del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COUP-TFIII), factor de transcripción G del promotor corriente arriba ovalbumina de pollo (COÜP-TFG) , SVP-46, EAR-2 , receptor a de estrógeno (ERa) , receptor ß de estrógeno (ER ) , receptor I relacionado con el estrógeno (ERRl) , receptor a relacionado con el estrógeno (ERRa) , receptor 2 relacionado con el estrógeno (ERR2) , receptor ß relacionado con el estrógeno (ERRP) , receptor glucocorticoide (GR) , receptor mineralocorticoide (MR), receptor de progesterona (PR) , receptor de andrógeno (AR) , gen B inducido por el factor de crecimiento del nervio (NGFI-B) , receptor nuclear similar a Nur-77 (TRS) , N10, receptor de Orfano (NUR-77), gen de respuesta temprana Humano (NAK-1) , factor 1 relacionado con Nurr (NURR-1) , gen de respuesta inmediata temprana humano (NOT) , receptor nuclear 1 de regeneración de hígado (RNR-1) , cursor 3 de zinc hemetopoyético (HZF-3), proteina 1 rekated con Nur (TINOR) , receptor 1 de orfano nuclear (NOR-1) , receptor relacionado con NOR-1 (MINOR) , receptor 38 de la hormona de Drosophila (DHR-38), receptor nuclear 8 de C. elegans (CNR-8), C48D5, factor 1 esteroidogénico (SFl) , péptido similar a endocepina (ELP) , factor 1 de fushi tarazu (FTZ-F1) , proteína de unión a adrena 4 (AD4BP) , homólogo del receptor de hígado (LRH-1) , receptor ? de orfano relacionado con Ftz-Fl (xFFrA) , receptor B de orfano relacionado con Ftz-Fl (xFFrB) , receptor nuclear relacionado con LRH-1 (FFLR) , receptor nuclear relacionado con LRH-1 (PHR) , factor de fetoprotein transcriptina (FTF) , factor nuclear de célula germinal (GCNFM) , receptor asociado con testículos relacionado con el receptor retinoide (RTR) , knirps (KNI) , relacionado con knirps (KNRL) , gónada erabriónica (EGON) , gen de Drosophila para el receptor nuclear dependiente del ligando (EAGLE) , receptor nuclear similar a tritorax (ODR7) , gen del cromosoma X de la región crítica congénita de hipoplasia adrenal inversa de sexo sensible a la dosis de Tritorax (DAX-1) , hipoplasia aderena lcongenita e hipogonadismo hipogonadrotrópico (AHCH) y pareja de heterodímero corto (SHP) . Para propósitos de esta invención, los receptores nucleares y los receptores nucleares del Grupo H también incluyen receptores nucleares y receotores nuclares del Grupo H sintéticos y quiméricos y sus homólogos. Los genes de interés para utilizarse en los casetes de expresión genética de los Solicitantes pueden ser genes endógenos o genes heterólogos . La información de secuencia del ácido nucleico o aminoácido para un gen o proteina deseado pueden ubicarse en una de muchas bases de datos de acceso públicas por ejemplo, GENBANK, EMBL, Swiss-Prot y PIR o en muchas publicaciones relacionadas con la biología. Así, aquel experto en la materia tiene acceso a la información de la secuencia de ácido nucleico para virtualmente conocer todos los genes. Tal información puede entonces utilizarse para construir las construcciones deseadas para la inserción del gen de interés dentro de los casetes de expresión genética utilizados en los métodos de los Solicitantes descritos en la presente. Ejemplos de genes de interés para utilizarse en los casetes de expresión genética de los Solicitantes incluyen pero no se limitan a: genes que codifican polipéptidos o productos terapéuticamente deseables que pueden utilizarse para tratar una condición, una enfermedad, un trastorno, una disfunción, un defecto genético, tales como anticuerpos monoclonales, enzimas, proteasas, citocinas, interferones, insulina, etropoyetina, factores de coagulación, otros factores o componentes sanguíneos, vectores virales para terapia genética, virus para vacunas, objetivos para descubrir drogas, genómicos funcionales y análisis y aplicaciones proteómicos y lo similar. POLINUCLEÓTIDOS DE LA INVENCIÓN El nuevo sistema de expresión genética inducible en base al receptor nuclear de la invención comprende al menos un cásete de expresión genética que comprende un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución. Estos casetes de expresión genética, los polinucleóttidos que comprenden y los polipéptidos que codifican son útiles como componentes de un sistema de expresión genética en base al receptor nuclear para modular la expresión de un gen dentro de la célula huésped. Así, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución. En una modalidad específica, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga para a) el residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 o 238 de la SEQ ID NO:l, b) los residuos de aminoácido 96 y 119 de la SEQ ID NO:l, c) los residuos de aminoácido 110 y 128 de la SEQ ID NO:l, d) los residuos de aminoácido 52 y 110 de la SEQ ID NO:l, e) los residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l o f) los residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l. En otra modalidad, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende mutaciones de codón que resulta en la sustitución de residuos de aminoácido en una posición equivalente o análoga para los residuos de aminoácido 107 y 127 y la inserción del aminoácido 259 de la SEQ ID NO:l. En una modalidad preferida el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor de ecdisona. En una modalidad especifica, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende una mutación de codón que resulta en una sustitución de a) un residuo de aspargina, arginina, tirosina, triptofano, leucina o lisina en una posición equivalente a análoga para el residuo de aminoácido 48 de la SEQ ID NO:l, b) un residuo de metionina, asparginas o leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 51 de la SEQ ID NO:l, c) un residuo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 52 de la SEQ ID NO:l, d) un triptofano o treonina en una posición equivalente o análoga del aminoácido 54 de la SEQ ID N0:1, e) una leucina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga del residuo de aminoácido 92 de la SEQ ID NO:l, f) un residuo de histidina, metionina o triptofano en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 95 de la SEQ ID NO:l, g) un residuo de leucina, serina, ácido glutámico o triptofano en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 96 de la SEQ ID NO:l, h) un triptofano, prolina, leucina, metionina o aspargina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 109 de la SEQ ID NO:l, i) un residuo de ácido glutámico, triptofano o aspargina en una posición equivalente o análoga para el residuo de aminoácido 110 de la SEQ ID NO:l, j) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga para el aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1 k) un triptofano o metionina ennuna posición equivalente o análoga al aminoácido 120 de SEQ ID NO: 1, 1) un ácido glutámico, prolina, leucina, cisteina, triptofano, glicina, isoleucina, asparagina, serina valina or arginina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, m) una phenylalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, n) una metionina, asparagina, ácido glutámico o valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, o) un residuo de alanina, lisina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, p) un residuo de lisina, arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1, q) una metionina, arginina, triptofano o isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, r) una prolina, ácido glutámico, leucina, metionina o tirosina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1, s) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 119 de SEQ. ID NO: 1 y una treonina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, t) una prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 y una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, u) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, v) una isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y una prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, o w) una isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y una valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica por un polinucleótido qué comprende mutaciones de codón que da como resultado sustitución de un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y la inserción de un residuo de glicina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es de un receptor de ecdisona. En otra modalidad especifica, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un ligando receptor de ecdisona dominio de unión que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste de la mutación por sustitución F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, AllOE, AllON, AllOW, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M1251, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, 219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L2341, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119FIV96T, V128F/A11 OP, T52V/A110P, V107/Y127E/T52V, . y V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un ligando receptor de ecdisona dominio de unión que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado la mutación por sustitución Vl071fY127E de SEQ ID NO: 1, que comprende además la mutación por inserción G259 de SEQ ID NO: 1 (V107JJY127E/G259) . En otra modalidad especifica, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un ligando receptor de ecdisona dominio de unión que comprende una mutación por sustitución codificada por un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, AllOE, AllON, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M1251, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L2341, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T , V128F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V, y V1071/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de hibridación que comprende una etapa de hibridación en sal menor de 500 mM y al menos 37 grados Celsius, y una etapa de lavado en 2XSSPE de al menos 63 grados Celsius. En una modalidad preferida, las condiciones de hibridación comprenden sal menor de 200 mM y al menos 37 grados Celsius para la etapa de hibridación. En otra modalidad preferida, las condiciones de hibridación comprenden 2XSSPE y 63 grados Celsius tanto para la etapa de hibridación como de lavado. La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipeptido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipeptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión al ADN, y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; b) un polipeptido que comprende un dominio de unión al ADN y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; y c) un polipeptido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. En una modalidad especifica, el polinucleótido aislado codifica un polipeptido híbrido seleccionado del grupo que consiste de a) un polipeptido híbrido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión al ADN, y una dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; b) un polipeptido híbrido que comprende un ADN dominio de unión y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; y c) un polipeptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y una dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención . La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución afecta la actividad de unión al ligando o sensibilidad al ligando del ligando del receptor nuclear del Grupo H dominio de unión. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución reduces actividad de unión a la diacilhidracina no ecdisteroide o sensibilidad de diacilhidracina no ecdisteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado un sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 o 238 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 o 109 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 51, 92, 96 o 238 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52, 92, 96, 125 o 238 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 54, 95, 96, 120, 219 o 234 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 51, 52, 120, 234 o 238 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de alanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, g) un residuo de lisina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48, 219 o 223 de SEQ ID NO: 1, h) un residuo de isoleucina, arginina o triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, i) un residuo de tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 o 238 de SEQ ID NO: 1, j) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, k) un residuo de glicina o glutamina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 o 1) an residuo de arginina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 o 223 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F48N, F48K, 151L, 151M, T52E, T52M, T52R, T52G, T52Q, M54W, M92L, M92E, R95W, V96W, V96E, V96L, F109N, Y120 , Y120W, M125E, M125V, M219A, M2191K M219W, M219Y, L223K, L223R, L234M, L234I, L234R, L234W, W238E, W238Y, W238L o W238M de SEQ ID NO: 1. Además, la presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora la actividad de unión al ligando o selectividad del ligando del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. En una modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general actividad de unión ecdiesteroide o sensibilidad ecdiesteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 o b) los residuos de aminoácidos 96 y 119 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de serina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 o b) un residuo de treonina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de V96T o N119F/V96T de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica a dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general la actividad de unión a la diacilhidracina no ecdisteroide o sensibilidad de discilhidracina no ecdiesteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 o 223 de SEQ ID NO: 1 o b) los residuos de aminoácidos 52 y 110 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de tirosina, triptofano, arginina o leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de treonina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 54 de SEQ ID NO: 1, d) residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de de residuo de prolina, ácido glutámico o asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de isoleucina, asparagina o glicina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, g) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, h) un residuo de tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1 o i) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F48Y, F48 , F48L, F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M1251, M125G, M125N, L132E, L223Y o T52V/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general la actividad de unión diacilhidracina no ecdiesteroide y tetrahidroquinolina no ecdiesteroide o sensibilidad diacilhidracina no ecdiesteroide y tetrahidroquinolina no ecdiesteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) los residuos de aminoácidos en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 107 y 127 de SEQ ID NO: 1 o b) los residuos de aminoácidos 107, 110 y 127 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 o b) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de V107I/Y127E o V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general tanto la actividad de unión ecdiesteroide o la sensibilidad ecdiesteroide y actividad de unión a la diacilhidracina no ecdisteroide o sensibilidad de diacilhidracina no ecdisteroide del dominio de unión del ligando del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 109, 132 o W238P de SEQ ID NO: 1, b) los residuos de aminoácidos 52, 107 y 127 de SEQ ID NO: l o e) residuos de aminoácidos 107 y 127 de SEQ ID NO: 1, y la inserción de aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de valina o metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 238 de SEQ ID NO: I d) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: l o e) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y la inserción de un residuo de glicina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F109W, L132M, L132V, W238P, V107I/Y127E/T52V o V107I/Y127E/259G de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado la mutación por sustitución V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1 que comprende además la mutación por inserción G259 de SEQ ID NO: 1 (V107I/Y127E/G259) . En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general la actividad de unión tetrahidroquinolina no ecdiesteroide o sensibilidad tetrahidroquinolina no ecdiesteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado a sustitución de a) el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 110 o 128 de SEQ ID NO: 1 o b) los residuos de aminoácidos en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 110 y 128 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado a sustitución de a) un residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, b) un residuos de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 128 de SEQ ID NO: l o e) un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: ' 1 y residuos de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución A110W, V128F o V128F/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución responde de manera diferencial a los ligandos de diacilhidracina no ecdiesteroide .

Preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 52, 95, 109, 125 o 132 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de histidina o residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 95 de SEQ ¦ ID NO: 1, c) un residuo de leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de leucina, triptofano, arginina, cisteina o prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: l o e) un residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución T52P, T52W, R95H, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P o L132M de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución responde de manera diferencial ligandos de diacilhidracina no ecdiesteroide . Más preferentemente el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de lisina o arginina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de glicina, glutamina, metionina, arginina o triptofano en ina posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de isoleucina, glicina, asparagina, serine o valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de lisina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1 o g) residuo de leucina o metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente el polinucleótido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución F48K, F48R, T52G, T52Q, T52M, T52R, T52W, M1251, M125G, M125N, M125S, M125V, L132E, M219K, M219W, M219Y, L223R, L223Y, W238L o W238M de SEQ ID NO: 1. Además, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención, enlazado de manera operativa a un elemento de regulación de transcripción. Preferentemente, el polxnucleótido que codifica un dominio de unión al ligando de receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución se enlaza operativamente con una secuencia de control de expresión que permite la expresión del dominio de unión al ligando de receptor nuclear en una célula huésped competente con la expresión. La secuencia de control de expresión puede comprender un promotor que es funcional en la célula huésped en la cual se desea la expresión. El vector puede ser un molécula de ADN de plásmido o un viral vector. Los vectores virales preferidos incluyen retrovirus, adenovirus, adenovirus asociados, herpes virus, y vaccinia virus. La invención se refiere además a un virus recombinante defectuoso de replicación que comprende en su genoma, el polinucleótido que codifica un dominio de unión al ligando de receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución como se describió anteriormente. Asi, la presente invención también se refiere a una célula huésped aislada que comprende tal vector de expresión, en donde el elemento de regulación de transcripción es operable en la célula huésped. La presente invención también se refiere a un polipeptido aislado codificado por un polinucleótido de acuerdo con la invención. POLIPÉPTIDOS DE LA INVENCIÓN El nuevo sistema de expresión genética inducible a base del receptor nuclear de la invención comprende al menos un cásete de expresión genética que comprende un polinucleótido que codifica un polipeptido que comprende a dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución. Asi, la presente invención también proporciona un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. En otra modalidad especifica, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, o 238 de SEQ ID NO: 1, b) residuos de aminoácido 96 y 119 de SEQ ID NO: 1, c) residuos de aminoácidos 110 y 128 de SEQ ID NO: 1, d) residuos de aminoácidos 52 y 110 de SEQ ID NO: 1, e) residuos de aminoácidos 107, 110, y 127 de SEQ ID NO: 1, o f) residuos de aminoácidos 52, 107 y 127 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una mutación por sustitución en posiciones equivalentes o análogas a los residuos de aminoácidos 107 y 127, y la inserción de aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es de un receptor de ecdisona. Preferentemente, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una sustitución de a) un residuo de asparagina, arginina, tirosina, triptofano, leucina o lisina en una posiciones equivalentes o análogas al residuo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de metionina, asparaginas o leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, d) un triptofano o treonina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 54 de SEQ ID NO: 1, e) una leucina o ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 92 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de histidina, metionina o triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 95 de SEQ ID NO: 1, g) un residuo de leucina, serina, ácido glutámico o triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, h) un triptofano, prolina, leucina, metionina o asparagina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, i) un residuo de ácido glutámico, triptofano o asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, j) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1, k) un triptofano o metionina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 120 de SEQ ID NO: 1, 1) un ácido glutámico, prolina, leucina, cisteina, triptofano, glicina, isoleucina, asparagina, serina, valina o arginina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, m) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, n) una metionina, asparagina, ácido glutámico o valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, o) un residuo de alanina, lisina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, p) un residuo de lisina, arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1, q) una metionina, arginina, triptofano o isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, r) una prolina, ácido glutámico, leucina, metionina o tirosina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1, s) una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1 y una treonina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, t) una prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 y una fenilalanina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, u) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, v) una isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y una prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, o w) una isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y una valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H comprende una sustitución de un residuo de isoleucina en la posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y la inserción de un residuo de glicina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es de un receptor de ecdisona. En otra modalidad especifica, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un ligando receptor de ecdisona que se une al polipéptido del dominio que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución se selecciona del grupo que consiste de la mutación por sustitución F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52 , T52G, T52Q, M54 , M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, 125G, M1251, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, 238E, W238Y, 238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, y V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución es un ligando receptor de ecdisona que se une al polipéptido del dominio que comprende una mutación por sustitución de V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1, que comprende además la mutación por inserción G259 de SEQ ID NO: 1 (V107I/Y127E/G259) . La presente invención también proporciona un polipeptido aislado seleccionado del grupo que consiste de a) un polipeptido aislado que comprende un dominio de transactivación, a dominio de unión a ADN, y una dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; b) un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión a ADN y una dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; y c) un polipeptido aislado que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. En una modalidad preferida, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es de un receptor de ecdisona. La presente invención también proporciona un polipeptido híbrido aislado seleccionado del grupo que consiste de a) un polipeptido híbrido aislado que comprende a dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN, y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; b) un polipeptido híbrido aislado que comprende una dominio de unión a ADN y una dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención; y c) un polipeptido híbrido aislado que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución de acuerdo con la invención. En una modalidad preferida, el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H es de un receptor de ecdisona. La presente invención también proporciona un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que afecta la actividad de unión al ligando o selectividad del ligando del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. En particular, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado del receptor del Grupo H que comprende un dominio de unión al ligando que comprende una mutación por sustitución que reduce la actividad de unión al ligando o selectividad del ligando del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que reduce la actividad de unión a la diacilhidracina no ecdisteroide o sensibilidad de diacilhidracina no ecdisteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 o 238 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipéptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 o 109 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de leucina en una posición equvalente o análoga al residuo de aminoácido 51, 92, 96 o 238 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52, 92, 96, 125 o 238 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 54, 95, 96, 120 o 219 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 51, 52, 120, 234 o 238 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de alanina en la posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, g) un residuo de lisina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48, 219 o 223 de SEQ ID NO: 1, h) un residuo de isoleucina, arginina o triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, i) un residuo de tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 o 238 de SEQ ID NO: 1, j) un residuo de arginina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 o 223 de SEQ ID NO: 1, k) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1 o 1) un residuo de glicina o glutaniine en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F48N, 151L, 151 , T52E, T52 , T52R, T52G, T52Q, 54 , M92L, 92E, R95W, V96W, V96E, V96L, F109N, Y120 , Y120W, M125E, M125V, M219A, M219K, M219 , M219Y, L223K, L223R, L234M, L2341, L234W, L234R, W238E, W238L, W238M o W238Y de SEQ ID NO: 1. Además, la presente invención también se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que mejora actividad de unión al ligando o selectividad del ligando del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. En una modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que mejora en general la actividad de unión ecdiesteroide o sensibilidad ecdisteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a a) el residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 o b) los residuos de aminoácidos 96 y 119 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de serina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 o b) un residuo de treonxna en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 y residuos de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de V96T o N119F/V96T de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando de receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que mejora en general la actividad de unión de diacilhidracina o sensibilidad de diacilhidracina del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 o 223 de SEQ ID NO: 1, o b) residuos de aminoácido 52 y 110 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de tirosina, triptofano, arginina o leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de treonina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 54 de SEQ ID NO: 1, e) residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de prolina, ácido glutámico o asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, g) un residuo de isoleucina, glicina o asparagina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, h) un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, i) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1 o j) un residuo de tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F48Y, F48W, F48L, F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M125I, M125G, M125N, L132E, L223Y o T52V/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución que mejora en general tanto la actividad de unión ecdiesteroide o la sensibilidad ecdiesteroide y la actividad de unión a la diacilhidracina no ecdisteroide o sensibilidad de diacilhidracina no ecdisteroide del dominio de unión del ligando del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga al a) residuo de aminoácido 109, 132 o W238P de SEQ ID NO: 1, b) residuos de aminoácidos 52, 107 y 127 de SEQ ID NO: l o e) residuos de aminoácidos 107 y 127 de SEQ ID NO: 1, y la inserción del aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de valina o metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1, d) an residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: l o e) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 y la inserción de un residuo de glicina en una posición equivalente o análoga al aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de F109W, L132M, L132V, W238P o V107I/Y127E/T52V de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado la mutación por sustitución de V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1, que comprende además la mutación por inserción G259 de SEQ ID NO: 1 (V107I/Y127E/G259) . En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por substitución mejora en general la actividad de unión de diacilhidracina y tetra idroquinolina o sensibilidad de diacilhidracina y tetrahidroquinolina del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación por sustitución que da como resultado una sustitución de a) residuos de aminoácidos en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 107 y 127 de SEQ ID NO: 1 o b) residuos de aminoácidos 107, 110 y 127 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 o b) un residuo de isoleucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución de V107I/Y127E o V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución mejora en general la actividad de unión de tetrahidroquinolina no ecdiesteroide o sensibilidad de tetrahidroquinolina no ecdiesteroide del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 110 o 128 de SEQ ID NO: 1 o b) residuos de aminoácidos en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 110 y 128 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) a residuo de triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, b) residuos de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1 o e) un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 y residuos de fenilalanina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución A110W, V128F o V128F/A110P de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución responde de manera diferencial a los ligandos de diacilhidracina no ecdiesteroide . Preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácidos 52, 95, 109, 125 o 132 de SEQ ID NO: 1. Más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de a) un residuo de prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de residuo de histidina o metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 95 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de leucina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de leucina, triptofano, arginina, cisteina o prolina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1 o e) a residuo de metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente, el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución T52P, R95H, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P o L132M de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad especifica, la presente invención se refiere a un polipeptido aislado que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación por sustitución, en donde la mutación por sustitución responde de manera diferencial a los ligandos de diacilhidracina no ecdisteroide . Más preferentemente el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado a sustitución de a) un residuo de lisina o arginina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) un residuo de glicina, glutamina, metionina, arginina o triptofano en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, c) un residuo de isoleucina, glicina, asparagina, serina o valina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, d) un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, e) un residuo de lisina, triptofano o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, f) un residuo de arginina o tirosina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1 o g) residuo de leucina o metionina en una posición equivalente o análoga al residuo de aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1. Aún más preferentemente el polipeptido aislado comprende una mutación de codón que da como resultado una mutación por sustitución F48K, F48R, T52G, T52Q, T52M, T52R, T52 , M125I, M125G, M125N, M125S, M125V, L132E, M219K, M219 , M219Y, L223R, L223Y, W238L o W238M de SEQ ID NO: 1. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipeptido aislado de acuerdo con la invención.

MÉTODO PARA MODULAR LA EXPRESIÓN GENÉTICA DE LA INVENCIÓN La invención de los solicitantes también se refiere a métodos para modular la expresión genética en una célula huésped utilizando un sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la invención. La invención de los solicitantes proporciona un método para modular la expresión de un gen en una célula huésped gue comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la invención; y b) introducir en la célula huésped un ligando; en donde el gen a modularse es un componente de un cásete de expresión genética que comprende: i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el ADN dominio de unión del sistema de expresión genética; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del sistema de expresión genética; y iii) un gen cuya expresión se va a modular, mediante lo cual a la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen. La invención también proporciona un método para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en una célula huésped un sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la invención; b) introducir en una célula huésped un cásete de expresión genética de acuerdo con la invención, en donde el cásete de expresión genética comprende i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión al ADN a partir del sistema de expresión genética; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del sistema de expresión genética; y iii) un gen cuya expresión se va a modular; y c) introducir en la célula huésped un ligando; mediante los cual a la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión de gen. La invención de los solicitantes también proporciona un método para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende un cásete de expresión genética que comprende un elemento de respuesta que comprende un dominio al cual se une el dominio de unión al ADN a partir del primer polipeptido híbrido del sistema de modulación de expresión genética; un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipeptido híbrido del sistema de modulación de expresión genética; y un gen cuya expresión se va a modular; en donde el método comprende las etapas de: a) introducir en una célula huésped un sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la invención; y b) introducir en una célula huésped un ligando; mediante los cual a la introducción del ligando en el huésped, se modula la expresión del gen. Los genes de interés para la expresión en una célula huésped utilizando los métodos de los solicitantes pueden ser genes endógenos o genes heterólogos. La información de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos para un gen o proteina deseada puede ubicarse en una de muchas bases de datos de acceso público, por ejemplo, GENBANK, EMBL, SwissProt, y PIR, o en muchas publicaciones de revistas relacionadas a la biología. Asi, aquellos de experiencia en la materia tendrán acceso a la información de secuencia de ácidos nucleicos para virtualmente todos los genes conocidos. Tal información puede entonces utilizarse para construer las construcciones deseadas para la inserción del gen de interés dentro de los casetes de expresión genética utilizados en los métodos de los solicitantes descritos arriba. Los ejemplos de genes de interés para la expresión en una célula huésped utilizando los métodos de los solicitantes incluyen, pero no se limitan a: antigenos producidos en plantas como vacunas, enzimas como alfa-milasa, fitasa, glucanos, xilasa y xilanasa, genes para la resistencia contra insectos, nemátodos, hongos, bacterias, virus, y fuerzas abióticas, productos nutricéuticos , productos farmacéuticos, vitaminas, genes para modificar el contenido de aminoácidos, resitencia herbicida, frió, sequía, y tolerancia al calor, productos industriales, aceites, proteínas, carbohidrátos, antioxidants, plantas macho estériles, flores, combustibles, otros rasgos de producción, genes que codifican los polipéptidos o productos terapéuticamente deseables que pueden utilizarse para tratar una condición, una enfermedad, un trastorno, una disfunción, un defecto genético, tales como anticuerpos monoclonales, enzimas, proteasas, citocinas, interferones, insulina, eritropoyetina, factores de aglutinación, otros factores o componentes sanguíneos, vectores virales para trapia genética, virus para vacunas, objetivos para descubrimiento de drogas, genómicos funcionales, y análisis proteómicos y aplicaciones y lo similar. Los ligandos aceptables son cualquiera que module la expresión del gen cuando la unión del dominio de unión al ADN del sistema de expresión genética de acuerdo con la invención al elemento de respuesta en la presencia del ligando da como resultado la activación o supresión de la expresión genética. Los ligandos preferidos incluyen un ecdisteroide, tal como ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, y lo similar, ácido 9-cis-retinoico, análogos sintéticos del ácido retinoico, ?,?'-diacilhidracinas tal como los decritos en Patentes de E.U. No. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; 5,378,726; y Solicitud de Patente de E.U. Nos. 10/775,883 y 10/787,906; dibenzoilalquil cianohidracinas tal como las descritas en la Solicitud Europea No. 461,809; N-alquil-N, ' -diaroilhidracinas tal como las descritas en la Patente de E.ü. No.5, 225, 443; N-acil-N-alquilcarbonilhidracinas tal como las descritas en la Solicitud Europea No. 234,994; N-aroil-N-alquil-N' -aroilhidracinas tal como las descritas en la Patente de E.ü. No. 4,985,461; tetrahidroquinolinas tal como las descritas en la Solicitud Internacional No. PCT/US03/00915; cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia y otros materiales similares incluyendo 3, 5-di-ter-butil-4- hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-0-acetilharpagida, oxisteroles, 22 (R) hidroxicolesterol, 24 (S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS) , 7-cetocolesterol-3-sulfato, farnesol, ácidos biliares, 1,1-bifosfonato ésteres, Hormona juvenil III, y lo similar. En una modalidad preferida, el ligando para uso en el Método de los solicitantes para modular la expresión del gene es un compuesto de la fórmula: en donde : E es un alquilo (C -Ci2) ramificado o alquenilo (C4-Ci2) ramificado que contiene un carbono terciario o un ciano alquil (C3-C12) que contiene un carbono terciario ; R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, fomilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C°CH, 1-propinilo, 2- propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN, o SCHF2 R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, fomilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C°CH, 1-propinilo, 2- propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHcN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o unidos con R3 y los carnonos fenilo a lo cuales R2 y R3 se unen para formar un etilenedioxi, un anillo de dihidrofurilo con el oxigeno adyacente al carbono fenilo, o un anillo de dihidropirilo con el oxigeno adyacente al carbono fenilo; R3 es H, Et, o unidos con R2 y los carbonos fenilo a los cuales R2 y R3 se unen para formar un etilenedioxi, un anillo de dihidrofurilo con el oxigeno adyacente al carbono fenilo, o un anillo dihidropirilo con el oxigeno adyacente al carbono fenilo; F F y R6 son independientemente H, Me, Et, F, Cl, Br, fomilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CN, C°CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe, o Set. En otra modalidad preferida, el ligando para utilizarse en el método de los solicitantes para modular la expresión del gen es un compuesto de la fórmula: en donde : En otra modalidad preferida, el ligando para utilizarse en el método de los solicitantes para modular la expresión del gen es un compuesto de la fórmula: En donde En otra modalidad adicionalmente preferida, el ligando para utilizarse en el método de los solicitantes para modular la expresión del gen es un compuesto de la fórmula: en donde En otra modalidad preferida, el ligando para utilizarse en el método de los solicitantes para modular la expresión del gen es una ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, un oxisterol, un 22 (R) hidroxicolesterol, 24 (S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS) , 7-cetocolesterol-3-sulfato, farnesol, ácidos biliares, 1,1 -bifosfonato ésteres, o Hormona juvenil III. En otra modalidad preferida, un segundo ligando puede utilizarse en adición al primer ligando tratado anteriormente en el método de los solicitantes para modular la expresión del gen. Preferentemente, este segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético del ácido retinoico .

CÉLULA HUÉSPEDES Y ORGANISMOS NO HUMANOS DE LA INVENCIÓN Como se describió anteriormente, el sistema de modulación de expresión genética de la presente invención puede utilizarse para modular la expresión genética en una célula huésped. La expresión en células huésped transgénicas puede ser útil para la expresión de varios genes de interés. La invención de los solicitantes se proporciona para la modulación de la expresión genética en células huésped procarióticas y eucarióticas . La expresión en células huésped transgénicas es útil para la expresión de varios polipéptidos de interés incluyendo pero sin limitarse a antigenos producidos en plants como vacunas, enzimas similares a alfa-amilasa, fitasa, glucanos, xilasa y xilanasa, genes para la resistencia contra insectos, nemátodos, hongos, bacterias, virus, y fuerzas abióticas, antigenos, productos nutricéuticos, productos farmacéuticos, vitaminas, genes para modificar el contendo de aminoácidos, resitencia herbicida, frió, sequía, y tolerancia al calor, productos industriales, aceites, proteínas, carbohidrátos, antioxidants , plantas macho estériles, flores, combustibles, otros rasgos de producción, polipéptidos terapéuticos, intermediarios de trayectoria; para la modulación de las trayectorias ya existentes en el huésped para la síntesis de nuevos productos hasta ahora no es posible utilizar el huésped; células basadas en ensayos; ensayos genómicos funcionales, producción de enzimas bioterapéuticas , ensayos proteómicos, y lo similar. Adicionalmente los productos genéticos pueden ser útiles para conferir mayores rendimientos de crecimiento del huésped o para permitir utilizar un modo de crecimiento alternativo. Así, la invención de los solicitantes proporciona una célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión genética de acuerdo con la invención. La presente invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende un cásete de expresión genética de acuerdo con la invención. La invención de los solicitantes también proporciona una célula huésped aislada que comprende un polinucleótido o un polipeptido de acuerdo con la invención. La presente invención también se refiere a un célula huésped transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la invención. La célula huésped puede ser un célula bacterial, una célula fungal, una célula de nemátodo, una célula de insecto, una célula de pez, una célula de planta, una célula de ave, una célula animal, o una célula de mamífero. En aún otra modalidad, la invención se refiere a un método para producir un dominio de unión al ligando de receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución, en donde el método comprende cultivar la célula huésped como se describió arriba en medio de cultivo bajo condiciones que permutan la expresión de un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ligando de receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución, y aislar el dominio de unión al ligando de receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución a partir del culture. En una modalidad especifica, la célula huésped aislada es una célula huésped procariótica o una célula huésped eucariótica. En otra modalidad especifica, la célula huésped aislada es una célula huésped de invertebrado o una célula huésped de vertebrado. Preferentemente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula bacterial, a célula fungal, célula de levadura, célula de nemátodo, célula de insecto, célula de pez, célula de planta, célula de ave, célula animal, y célula de mamífero. Más preferentemente, la célula huésped es célula de levadura, célula de nemátodo, una célula de insecto , célula de planta, una célula de pez cebra , una célula de pollo , célula de hámster , una célula de ratón, una célula de rata , una célula de conejo , una célula de gato, una célula de perro, una célula de bovino, una célula de cabra, una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de caballo, una célula de oveja, una célula de simio, una célula de mono, una célula de chimpancé, o una célula de humano. Los ejemplos de células huésped preferidas incluyen, pero no se limitan a, especies fúngales o de levadura tal como Aspergillus , Trichoderma , Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, o especies bacterianas tales como las del género Synechocystis, Synechococcus, Salmonella , Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptornyces, Escherichia , Pseudomonas , Methylomonas , Methylobacter, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillusr Methanobacteriurn y Klebsiella ; especies vegetales seleccionadas del grupo que consiste de una manzana, Arabidopsis, bajra, plátano, cebada, frijoles, remolacha, blackgram, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, maiz, sandia, mijo, mungbean, avena, quingombó, Panicum, papaya, cacahuate, chícharo, pimienta, pigeonpea, ananá, Phaseolus, papa, calabaza, arroz, sorgo, frijol de soya, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, camote, té, tomate, tabaco, melón, y trigo; animal; y células huésped de mamífero. En una modalidad específica, la célula huésped es una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste de una célula huésped de Saccharomyces, Pichia, y Candida. En otra modalidad específica, la célula huésped es una célula de nematodo Caenorhabdus elegans. En otra modalidad específica, la célula huésped es una célula de insecto. En otra modalidad espcífica, la célula huésped es una célula de planta seleccionada del grupo que consiste de una manzana, Arabidopsis, bajra, plátano, cebada, frijoles, remolacha, blackgram, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, maíz, sandia, mijo, mungbean, avena, quingombó, Panicum, papaya, cacahuate, chícharo, pimienta, pigeonpea, ananá, Phaseolus, papa, calabaza, arroz, sorgo, frijol de soya, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, camote, té, tomate, tabaco, melón, y trigo; animal; y células huésped de mamífero. En otra modalidad específica, la célula huésped es una célula de pez cebra. En otra modalidad específica, la célula huésped es una célula de pollo. En otra modalidad específica, la célula huésped es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste de célula de hámster, una célula de ratón, una célula de rata , una célula de conejo , una célula de gato, una célula de perro, una célula de bovino, una célula de cabra, una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de caballo, una célula de oveja, una célula de simio, una célula de mono, una célula de chimpancé, o una célula de humano La transformación de la célula huésped se conoce bien en la materia y puede lograrase mediante una variedad de métodos incluyendo pero sin limitarse a electroporatión, infección viral, transfección de plasmido/vector , transfección no viral mediada por vector, transformación mediada por Agrobacteriurn, bombrdeo de partículas, y lo similar. La expresión del producto genético deseado involucra cultivar las células huésped transformadas bajo condiciones adecuadas e inducir la expresión del gen transformado. Los protocolos de condiciones de cultivo y expresión genética en células procarióticas y eucarioticas se conocen bien en la materia (ver sección de Métodos Generales de los Ejemplos) . Las célula spueden cosecharse en productos genéticos aislados de cuaredo con protocolos específicos para el producto genético. Además, una célula huésped puede seleccionarse que module la expresión del polinucleótido insertado, o modifique y procese el producto del polipeptido en la forma específica deseada. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para la traslación y post-translación de procesamiento y modificación [e.g., glicosilación, desdoblmiento (e.g., de secuencia de señal)] de proteínas. Las líneas de células apropiuadas o sistemas de huéspedpueden seleccionarse para asegurar la modificación y procesamiento deseada de las proteínas externas expresadas. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacterial úede producir un producto de poriteína no glicosilado. Sin embargo, un polipeptido expresado en bacterias puede desdoblarse apropiadamente. La expresión en levadura puede producir un producto de glicosilación . L expresión in células eucarióticas puede incrementar la probabilidad de glicosilación y desdoblamiento "nativo" de las proteínas heterologas. Además, la expresión en células de mamífero proporciona una herramienta parareconstituir . 0 construir la actividad del polipéptido. Además, diferentes sistemas de vector/expresión pueden afectar las reacciones de procesamiento, tal como desdoblamiento proteolítico, a un fifernete grado. La invención de los solicitantes también se refiere a un organismo no humano que comprende una célula huésped aislada de acuerdo con la invención. En una modalidad específica, el organismo no humano es un prganismo eucariótico o un organismo procariótici . En otra modalidad específica, el organismo no humano es un organismo invertebrado o un organismo vertebrado. Preferentemente, el organismo no humano se selecciona del grupo que consiste de una bacteria, un hongo, una levadura, un nemátodo, un insecto, un pez, una planta yn pájaro, un animal, y un mámífero. Más preferentemente, el el organismo no humano es una levadura, un nematodo, un insecto, una planta, un pez cebra, un pollo, un hámster, un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, , un bovino, una cabra, una vaca, un cerdo, una caballo una oveja, un simio, un mono o un chmpancé .

En una modalidad especifica, el organismo no humano es una levadura seleccionada del grupo que consiste de Saccharomyces , Pichia, y Candida. En otra modalidad especifica, el organismo no humano es un nemátodo Caenorhabdus elegans . En otra modalidad especifica, el organismo no humano es una planta seleccionada del grupo que consiste de una manzana, Arabidopsis, bajra, plátano, cebada, frijoles, remolacha, blackgram, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, piña, Phaseolus, papa, pumpkin, arroz, sorgo, frijol de soya, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, camote, té, tomate, tabaco, melón, y trigo. En otra modalidad especifica, el organismo no humano es un ratón Mus musculus . MEDICIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA/TRANSCRIPCIÓN Una medición útil de los métodos de los solicitantes de la invención es el del estado transcripcional de la célula incluyendo las identidades y abundancia del RNA, preferentemente especies de RNAm. Tales mediciones se conducen convenientemente al medir la abundancia de ADcN por cualquiera de las tecnologías de expresión genética existentes . La tecnología de arreglo de ácidos nucleicos es una técnica útil para determinar la expresión del RNAm diferencial. Tales tecnologías incluyen, por ejemplo, trocitos de oligonucleotide y micro-arreglos de ADN. Estas técnicas se encuentran en loa fragmentos de ADN u oligonucleotidos que corresponden a diferntes genes o cADNs que se inmovilizan en un soporte sólido e hibridan a sondas preparadas de grupos de mRNA total extraídos de células, tejidos, u organismos completos y convertirse a cADN. Los fragmentos de oligonucleotido son arreglos de oligonucleotidos sintetizados sobre un substrato utilizando técnicas fotolitográficas . Los trocitos que se han producido pueden analizar a 1700 genes. Loa icroarreglos de ADN son arreglos de muestras de ADN, típicamente productos de PCR que se imprimen de manera robótica sobre un portaobjeto de microporo. Cada gene se analiza por una secuencia de ADN objetivo o de longitud parcial. Los microarreglos con hasta 10,000 genes se preparan ahora comencialmente de manera rutinaria. La diferencia principal entre estas dos técnicas es que los trocitos de oligonucleotide típicamente utilizan oligonucleotidos de 25-mer que permiten la fracción de moléculas de ADN cortas considerando que los objetivos de ADN mayores de los microarreglos, de aproximadamente 1000 pares de bases, pueden proporcionar más sensibilidad ien las mezclas de ADn complejos fraccionados. Otra medición útil de los métodos métodos de los solicitantes de la invención es la determinar el estado de traslación de la célula al medir la abundancia de las especies de proteínas constituyente presentes en la célula utilizando procesos muy conocidos en la técnica. Cuando se desea la identificación de los genes asociados con las diversas funciones fsiológicas, puede emplearse un arreglo que cambie en tales funciones a medida que la célula crece, se mide la apoptosis, senescencia, diferenciación, adhesión, unión a una molécula específica, unión a otra célula, organización celular, organogénesis, transporte intracelular, facilitación de transporte, conversión de energía, metabolismo, miogénesis, neurogénesis, y/o hematopoyesis. Además, el marcador selecionable o informador de la expresión genética puede utilizarse para medir la modulación de la expresión genética utilizando la invención de los solicitantes. Otros métodos para detectar los productos de expresión genética se conocen bien en la materia e incluyen análisis inminoanálisis Southern (detección de ADN) , de punto o o de raura (ADN, RNA) , inmunoanálisis northern (RNA) , RT-PCR (RNA) , inmunoanálisis western (detección de polipeptido) , y ELISA (polipéptido) . Aunque menos preferidas, las proteínas etiquetadas pueden utilizarse para detectar secuencias particulares de ácidos nucleicos a los cuales se híbrida . En algunos casos es necesario amplificar la cantidad de una secuencia de ácidos nucleicos. Esto puede llevarse a cabo utilizando ono o más de los diversos métodos incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa ("PCR") , reacción en cadena de ligasa ("LCR") , amplificación de desplazmiento estándar ("SDA") , amplificación a base de trasncripción, y lo similar. PCR se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas en las cuales, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico se trata en lahe presencia de una polimerasa de ADN termo estable, bajo condiciones de hibridación, con un par de iniciadores d epolinucléotido, con un iniciador que hibridiza a un filamento strand (modelóte la secuencia especifica a detectarse. Los iniciadores son suficientemente complementarios a cada filamento modelo de la secuencia especifica para hibridizarse con ellos. Un producto de extensión de cada iniciador se sintetiza y es complementario al filamento modelo de ácido nucleico al cual se hibridad. El producto de extensión sintetizado de cada iniciador también puede servir como un modelo para síntesis adicional deñ los productos de extensión utilizando los mismos iniciadores. Después de un número suficiente de rondas de síntesis de productos de extensión, la muestra puede analizarse como se describe arriba para valorar si la secuencia o secuencias a detectarse se encuentra presente. ANÁLISIS DE DETECCIÓN SISTEMÁTICA DE LIGANDO La presente invención también se refiere a métodos de detección sistemática para un compuesto que incluye o representa la trasactivación de un dominio de unión al ligando del receptor nuclear que comprende una mutación por sustitución en una célula al poner en contacto un dominio de unión al ligando del receptor nuclear con una molécula candidato y detectar la actividad del gen informador en la presencia del ligando. Los compuestos candidato pueden se agonistas o antagor stas del dominio de unión al ligando de receptor nuclear. En una modalidad preferida, se mide el dominio de unión al ligando de receptor nuclear se expresa a partir de un polinucleótido en la célula y la actividad de transactivación (i.e., expresión o represión del gen informador) o actividad del compuesto de unión. De acuerdo con lo anterior, además del diseño racional de los agonistas y antagonistas con base en la estructura de un dominio de unión al ligando de receptor nuclear, la presente invención contempla un método alternativo para identificar los ligandos específicos de un dominio de unión al ligando de receptor nuclear utilizando diversos arreglos de detección sistemática conocidos en la materia . Cualquier técnica de detección sistemática conocida en la técnivca puede utilizarse para detectar los agonistas o antagonists de dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H. Por ejemplo, una línea celular adecuada que comprende un sistema de expresión genética con base en el receptor nuclear de acuerdo con la invención puede transíectarse con un cásete de expresión genética que codifica un marcador genético operablemente enlazado a un promotor inducible o represible. Las células transfectada se exponen entonces a una solución de prueba que comprende un compuesto agonista o antagonista candidato, y después se ensaya para la expresión genética o represión del marcador. La presencia de más expresión genética del marcador con relación a las células de control que no se exponen a la solución de prueba es una indicación de la presencia de un compuesto agonista en la solución de prueba. De manera inversa, la presencia de menos expresión genética del marcador con relación a las células control no se exponen a la soución de prueba es una indicación de la presencia de un compuesto antagonista en esa solución. La presente invención contempla detecciones sistemáticas para ligandos de moléculas pequeñas o análogos o miméticos de ligandos, asi como detecciones para ligandos naturales que se unen a un agonista o antagonista de un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H de acuerdo con la invención in vivo. Por ejemplo, las bibliotecas de productos naturales pueden detectarse utilizando ensayos de la invención para molecules que agonizan o antagonizan la actividad del sistema de expresión genética con base en el receptor nuclear. La identificatión y detección sistemática de antagonistas se facilita además al determinar las características estructurales de las proteínas, e.g., utilizando rayos-X cristalografía, difracción de neutrón, espectrometría de resonancia magnética nuclear, y otras técnicas para la determinación estructural. Estas técnicas proporcionan el diseño racional o identificación de los agonistas y antagonistas. Otro procedimiento utiliza bacteriófago recombinante para producir grandes bibliotecas. Utilizando el "método de fago [Scott y Smith, 1990, Science 249: 3 86-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 87: 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)], pueden construise muchas grandes bibliotecas (106-108 entidades químicas) . Un segundo procedimiento utiliza métodos principalmente químicosde los cuales el método Geysen [Geysen et al., Molecular Immunology 23: 709-7 15 (1986); Geysen et al. J Irnmunologic Método 102: 259-274 (1987)] y el método de Fodor et al. - [Science 251: 767-773 (1991)] son ejemplos. Furka et aL [J4th International Congress of Biochenmstry, Volumen 5, Sumario FR:013 (1988); Furka, et al Peptide Proteínas Res. 37:487-493 (1991)], Houghton [Patente de E.U. No. 4,631,211, expedida en Diciembre de 1986] y Rutter et al. [Patente de E.U. No. 5,010,175, expedida en Abril 23, 1991] describe los métodos para producir una mezcla de peptidos que pueden probarse como agonistas o antagonists. En otro aspecto, las bibliotecas sintéticas [Needels et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. ÜSA 90: 10922-10926 (1993); Larn et al., Publicación de Patente Internacional No. WO 92/00252; Kocis et al., Publicación de Patente Internacional No. WO 9428028, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad] , y lo similar puede utilizarse para detectar los ligandos candidato de acuerdo con la presente invención. La detección sistemática puede realizarse con células recombinantes que expresan un dominio de unión al ligando de receptor nuclear de acuerdo con la invención, o alternativamente, utilizando proteínas purificadas, e.g, producidos recombinantemente, como se describe arriba. Por ejemplo, pueden utilizarse etiquetado, dominios de unión al ligando de receptor nuclear soluble para detectar las bibliotecas, como se describe en las referencias anteriores. En otra modalidad, un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H de acuerdo con la invención puede etiquetarse directamente. En otra modalidadpuede utilizarse un reactivo etiquetado secundario para detectar la unión de un dominio de unión al ligando de receptor nuclear de la invención a una molécula de interés, e.g., una molécula unida a un soporte de fase sólida. La unión puede detectarse por formación in situ de un cromóforo de interés medinte una etiqueta de enzima. Las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante. En una modalidad adicional, puede utilizarse un ensayo de dos colores, utilizando dos sustratos cormogénicos con dos etiquetas de enzima de diferentes moléculas aceptoras de interés . Los ligandos de reacción cruzaday de una sola reacción puden identificarse con un ensayo de dos colores. Otras etiquetas de uso en la invención incluyen perlas de látex coloreadas, etiquetas fluorescentes (e.g., isotiocianato fluorescente (FITC) , ficoeritrina (PB) , rojo Texas (TR) , rodamina, sales en serie de lantano libres o queladas, especialmente Eu3, por nombrar unos cuantos fluoróforos) , moléculas quimioluminiscentes, radioisótopos, o etiquetas de imagen de resonancia magnética. Pueden realizarzse dos ensayos de colores con dos o más perlas de látex, o fluorófores que emiten diferentes longitudes de onda. Las moléculas o células etiquetadas pueden detectarse visualmente o por medios mecánicos/ópticos. Los medios mecánicos/ópticos incluyen detección activada por fluorescencia, i.e., análogos a FACS, y medios de retiro de micromanipulador . La presente invención puede entenderse mejor mediante la referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ejemplos de la invención EJEMPLOS Los solicitantes han desarrollado un modelo de homologia CfEcR y han utilizado este modelo de homología junto con un modelo de homologia del receptor de ecdisona Chironomous tetans ("CtEcR") publicado (Wurtz et al., 2000) para identificar los residuos críticos involucrados en la unión a ecdisteroides y no ecdisteroides. Las diacilhidracinas sintéticas no esteroides, han mostrado unirse al EcRs de lepidoptero con alta eficiencia e inducir fusiones incompletas precoces en estos insectos (Wing et al., 1988) y varios de estso compuestos se comercializan actualmente como insecticidas. La cavidad de unión al ligando de EcRs ha involucrado ajusfar la estructura larga del esqueleto de ecdisteroides tal como 20E. Las diacilhidracinas tienen una estructura compacta comparada a ecdisteroides y ocupan solo la parte inferior de la cavidad de unión a EcR. Esto deja unos cuantos residuos críticos en la parte superior del la cavidad de unión que hacen contacto con ecdisteroides pero no con los no ecdisteroides tal como diacilhidracinas. Loa solicitantes hacen la mutación por sustitución de los residuos que hacen contacto con ecdisteroides y/o no ecdisteroides y y determinan el efecto mutacional sobre la unión del ligando. Los solicitantes describen en la presente la mutación por sustitucións en varios de estso residuos y han identificado varias clases de receptores mutantes de substitución con base en sus características de unión y transactivación. Los nuevos polinucleótidos y polipéptidos del receptor nuclear mutado de sustitución de los solicitantes son útiles en un sistema de modulación genética inducible a base del receptor para varias aplicaciones incluyendo terapia gnética, expresión de proteínas de interés en células huésped, producción de organismos transgénicos, y ensayos a base de células. MÉTODOS GENERALES Las técnicas de AND recombinante estándar y clonación molecular utilizadas en la presente se conocen bien en la materia y se describen por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) (Maniatis) y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocois en Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987) . Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y desarrollo de los cultivos bacteriale se conocen bien en la técnica. Las técnicas adecuadas para el uso en los siguientes ejemplos pueden encontrasrse como se establece en Manual of Methods fox General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds) , American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotecnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) . Todos los reactivos, enzimas de restricción y materials utilizados para el desarrollo y mantenimiento de las células huésped se obtuvieron de Aldrich Chemicais (Mil aukee, WI) , DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a mneos que se especifique de otra manera. Las manipulaciones desecuencias genéticas pueden realizarse utilizando elprograma disponibl a partir de Genetics Computer Grupo Inc. (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, WI) . En donde se utiliza el programa GCG "Pileup" puede utilizarse el valor predeterminado de creación de espacio 12, y el valor predeterminado de extensión de espacio 4. En donde se utiliza el programa CGC "Espacio" o "Mejor Ajuste" puede utilizarse la pena de creación de espacio predeterminado de 50 y la pena de extensión de espacio predeterminado de 3. En cualquier cadso en donde se utilice el para 'metro de programa GCG, en estos o en cualquier otro programa GCG program, se utilizan los valores predeterminados.

El significado de las abreviaturas es como sigue: "h" significa horas (s) , "mm" significa minutos (s), "sec" significa segundo(s), "d" significa día (s) , "µ?" significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro (s), "µ?" significa micromolar, "mM" significa milimolar, " g" significa microgramo (s) , "mg" significa miligramo (s) , "A" significa adenina o adenosina, "T" significa timina o timidina, "G" significa guanina o guanosina, "C" significa citidina o citosina, "x q" significa veces de gravedad, "nt" significa nucleotido (s) , "aa" significa aminoácido (s) , "bp" significa pares de base(s), "kb" significa kilobase(s), "k" significa kilo, "µ" significa micro, y "°C" significa grados Celsius . EJEMPLO 1 Este Ejemplo describe la construcción de varios casetes de expresión genética que comprenden nuevos polinucleótidos y polipéptidos del receptor nuclear del Grupo H de mutación por sustitución de la invención para uso en un sstema inducible a base del receptor nuclear de expresión genética. Los solicitantes construyeron casetes de expresión genética a base del EcR del gusano del abeto Choristoneura funiferana ("CfEcR) . La construcción del receptor preparado comprende un dominio de unión al ligando de ya sea un EcR o una quimera de Homo sapiens RXRp-LmRXR; y un dominio de unión ADN GATA (DBD) o un dominio de transactivación VP16 (AD) . La construcción informadora incluye el gen informador luciferase operativamente enlazado a una construcción de promotor sintético que comprende un elemento de respuesta GAL4 al cual se une el Gal4 DBD. Se construyeron varias combinaciones de este receptor y construcciones informadoras en células de mamífero como se describe en los Ejemplos 2-5 infra. Casetes de Expresión Genética: El receptor del cásete de expresión genética a base de ecdisona (conmutación) se construyó como sigue, utilizando métodos de clonación estándar disponibles en la técnica. Lo siguiente es una breve descripción de la preparación y composición de cada cambio utilizado en los Ejemplos descritos en la presente. 1. l-GAL4-CfEcR-DEF/VP16-Brxref-LmRXREF: Los dominios D, E, y F tipo silvestre del EcR del gusano del abeto Choristoneura fumiferana ( "CfEcR-DEF" ; SEQ ID NO: 21) se fusionó al dominio de unión de ADN GAL4 ("Gal4ADNBD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 6) y se colocó bajo el control de un promotor CMV (SEQ ID NO: 2) . Las hélices 1 a 8 de los dominios EF de Homo sapiens RXR ("HsRXR -EF"; nucleotidos 1-465 de SEQ ID NO: 3) y hélices 9 a 12 de los dominios EF de Proteínas ültraspiráculo de Locusta migratoria ( "LmRXR-EF"; nucleotides 403-630 de SEQ ID NO: 23) se fusionarona al dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 12) y se colocaron bajo el control de un promotor SV40e (SEQ ID NO: 22) . Cinco sitios de unión al elemento de respuesta GAL4 de concenso ("5XGAL4RE"; que comprende 5 coipias de un GAL4RE que comprende SEQ ID NO: 19) se fusionaron a un promotor mínimo TATA sintético (SEQ ID NO: 24) y se colocó corriente arriba del gen informador de luciferase (SEQ ID NO: 25) . 1.2-GAL4/mutanteCfEcR-DEF/VP16-RXPEF-£fflRXRBF: Esta construcción se preparó en la misma forma como en la conmutación 1.1 de arriba excepto el CfEcR-DEF tipo silvestre se colocó con el CfEcR-DEF mutante que comprende un dominio de unión al ligando que comprende una mutación por sustitución seleccionada de la Tabla 1 de abajo. Tabla 1. Mutantes por sustitución del Dominio de ünión al Ligando del Receptor de Ecdisona Choristoneura fumiferana ("CfEcR") (LBD) .

Mutatción Sustitución de Aminoácido Aminoácido CfEcR LBD "WT a utant" Resultante correspondiente CfEcR (SEQ ID NO: 26) de longitud total F48Y Fenilalanina (F) a Tirosina (Y) 331 F48W Fenilalanina (F) a Triptofano (W) 331 F48L Fenilalanina (F) a Leucina (L) 331 F48N Fenilalanina (F) a Asparagina (N) 331 F48R Fenilalanina (F) a Arginina (R) 331 F48K Fenilalanina CF) a Lisina (K) 331 151N Isoleucina (1) a Asparagina (N) 334 151L Isoleucina (1) a Leucina (L) 334 151M Isoleucina (I a Metionina (M) 334 T52M Treonina (T) a Metionina (M) 335 T52R Treonína (T) a Arginina (R) 335 T52 Tbreonine (T) a Triptofano (W) 335 T52G Treonina (T) a Glicina (G) 335 T52Q Treonina (T) a Glutamina (Q) 335 T52E Treonina (T) a Ácido glutámico (E) 335 T52P Treonina (T) a Prolina (P) 335 M54 Metionina (M) a Triptofano (W) 337 M54T Metionina (M) a Treonina (T) 337 M92L Metionina (M) a Leucina (L) 375 M92E Metionina (M) a Ácido glutámico (E) 375 R95H Arginina (R) a Histidina (H) 378 R95M Arginina (R) a Metionina (M) 378 R95W Arginina (R) a Triptofano (W) 378 V96L Valina (Y) a Leucina (L) 379 V96W Valina (Y) a Triptofano (W) 379 V96S Valina (V) a Serina (S) 379 V96E Valina (y) a Ácido glutámico (E) 379 V1071 Valina (V) a Isoleucina (1) 390 F109L Phenlyalanina (F) a Leucina (L) 392 F109P Fenilalanina (F) a Prolina (P) 392 F10 Fenilalanina (F) a Triptofano (W) 392 F109M Fenilalanina (F) a Metionina (M) 392 F109N Fenilalanina (F) a Asparagina (N) 392 AllOE Alanina (A) a Ácido glutámico (E) 393 AlION Alanina (A) a Asparagina (N) 393 AllOW Alanina (A) a Triptofano ( ) 393 N119F Asparagina (N) a Fenilalanina (F) 402 Y120W Tirosina (Y) a Triptofano (W) 403 Y120M Tirosina (Y) a Methionine (M) 403 125E Metionina (M) a Ácido glutámico (E) 408 M125P Metionina (M) a Prolina (P) 408 M125R Metionina (M) a Arginina (R) 408 M125L Metionina ( ) a Leucina (L) 408 M125C Metionina (M) a Cisteina (C) 408 M125W Metionina (M) a Triptofano (W) 408 M125G Metionina (M) a Glicina (G) 408 M1251 Metionina (M) a Isoleucina (1) 408 M125N Metionina (M) a Asparagina (N) 408 M125S Metionina (M) a Serina (S) 408 M125V Metionina (M) a Valina (y) 408 V128F Valina (V) a Fenilalanina (F) 411 L132 Leucina (L) a Metionina (M) 415 L132N Leucina (L) a Asparagina (N) 415 L132V Leucina (L) a Valina (V) 415 L132E Leucina (L) a Ácido glutámico (E) 415 R175E Arginina (R) a Ácido glutámico (E) 458 M219K Metionina (M) a Lisina (K) 502 M219W Metionina (M) a Triptofano (W) 502 M219Y Metionina (M) a Tirosina (Y) 502 M219A Metionina (M) a Alanina (A) 502 L223K Leucina (L) a Lisina (K) 506 L223R Leucina (L) a Arginina (R) 506 L223Y Leucina (L) a Tirosina (Y) 506 L23 Leucina (L) a Metionina (M) 517 L2341 Leucina (L) a Isoleucina (1) 517 L234R Leucina (L) a Arginina (R) 517 L234W Leucina (L) a Triptofano (W) 517 W238P Triptofano (W) a Prolina (P) 521 W238E Triptofano (W) a Ácido glutámico (E) 521 W238Y Triptofano ( ) a Tirosina (Y) 521 W238L Triptofano ( ) a Leucina (L) 521 W238 Triptofano (W) a Metionina (M) 521 T52V y Treonina (T) a Valina (V) y Alanina 335 y 393, Mutación Sustitución de Aminoácido "WT a aminoácido CfEcR LBD Mutante" Resultante Correspondiente a CfEcR (SEQ ID NO: 26) N119F y V96T Asparagina (N) a 402 y 379, doble mutante Fenialalanina (F) y Valina (V) a respectivamente Treonina (T) , respectivamente V128 y AllOP Valina (V) a Fenilalanina (F) y 411 y 393, doble mutante Alanina (A) a Prolina (P) , respectivamente respectivamente T52V, V107I y Treonina (T) a Valina (V) , 335, 390 y 458, R175E triple Valina (V) a Isoleucina (I) y respectivamente mutante Arginina (R) a Ácido Glutamico (E) , respectivamente T52V, V107I y Treonina (T) a Alanina (A) , 335, 390 y 458, R175E triple Valina (V) a Isoleucina (I) y respectivamente mutante Arginina (R) a Ácido Glutamico (E) , respectivamente V96A, V1071 y Valina (V) a Alanina (A) , 379, 390 y 458, R175E triple Valina (V) a Isoleucina (I) y respectivamente mutante Arginina (R) a Ácido Glutamico (E) , respectivamente V96T, V107I y Valina (V) a Treonina (T) , 379, 390 y 458, R175E triple Valina (V) a Isoleucina (I) y respectivamente mutante Arginina (R) a Ácido Glutamico (E) , respectivamente V107I, Y127E Valina (V) a Isoleucina (I), 390, 410 y 458, y AllOP Tirocina (Y) a Ácido Glutamico respectivamente triple (E) y Alanina (A) a Prolina mutante (P), respectivamente V107I, Y127E Valina (V) a Isoleucina (I) , 390, 410 y 458, y R175E Tirocina (Y) a Acido Glutamico respectivamente triple (E) y Arginina (R) a Ácido mutante Glutamico (E) , respectivamente V107I, A110P Valina (V) a Isoleucina (1) , 390, 393 y 458, y R175E Alanina (A) a Prolina (P) y respectivamente triple Arginina (R) a Ácido Glutamico mutante (E) , respectivamente V107I, Y127E, Valina (V) a Isoleucina (I), 390, 410 y 335, T52V triple Tirocina (Y) a Ácido Glutamico respectivamente mutante (E) y Treonina (T) a Valina (V) V107I/Y127E/G Valina (V) a Isoleucina (I), 390, 410 y 542, Tirocina (Y) Ácido Glutamico respectivamente (E) , y Glicina, respectivamente Construcción del Dominio de Unión del Ligando Receptor de Ecd sona que Comprende una Mutación por Sustitución: En un esfuerzo por modificar la unión del ligando EcR los residuos dentro de los dominios de unión al ligando EcR que se predijeron como importantes para la unión al ligando en base a un análisis de modelación molecular, se imitaron en EcRs a partir de tres diferentes clases de organismos. La Tabla 1 indica los residuos de aminoácidos dentro del dominio de unión al ligando de CfEcR (EcR de Lepidóptero) (SEQ ID NO: 1) que se mutó y e examinó para la modificación de la unión ecdisteroide y no ecdisteroide . Cada una de las mutaciones por sustitución de aminoácido listadas en la Tabla 1 se construyeron en un ADN de EcRc mediante mutgénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Además de las muchas mutaciones de puntos de mutación únicos hechas, también se hicieron dos diferentes CfEcRs mutantes de punto doble: una comprendiendo ambas sustituciones V128F y A110P (V128F/A110P) , y una segunda comprendiendo ambas sustituciones la N119F y V96T (N119F/V96T) . También se hicieron tres diferentes CfEcRs mutantes de triple punto: uno comprendiendo las sustituciones V107I, Y127E y A110P (V107I/Y127E/A110P) , la segunda comprendiendo las sustituciones V107I, Y127E y T52V (V107I/Y127E/T52V) , y la tercera comprendiendo las sustituciones V107I y Y127E y una inserción de glicina (G) (V107I/Y127E/259G) (SEQ ID NO: 1). Se realize la mutagenesis dirigida al sitio de PCR utilizando el equipo de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando las condiciones de reacción y los parámetros de ciclaje como sigue. Se realize la mutagenesis dirigida al sitio de PCR utilizando un amortiguador de reacción (suministrado por el fabricante) , 50 ng del modelo de ADdsN, 125 ng de iniciador de avance (FP) , 125 ng de iniciador complementario inverso (RCP) , y 1 µ? de mezcla de dNTP (suministrado por el fabricante) en un volumen de reacción final de 50 µ? . El iniciador de avance y el iniciador complementario inverso utilizados para producer cada mutante de EcR se presentan en la Tabla 2. Los parámetros de ciclaje utilizaron consistieron de un ciclo de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, seguido por 16 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durnte 1 minuto, y extendiéndose a 68 °C durante 22 minutos. Tabla 2 Iniciadores de PCR para Construcción de Dominio de Unión al Ligando CfEcR de Mutante por Sustitución MUTANTE INICIADOR (SEQ ID NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTDJOS DE INICIADOR (5' A 3') F48Y FP (SEQ ID NO:27) gtcggacactccctaccgccagatcacag F48Y RCP (SEQ ID NO: 28) ctgtgatctggcggtagggagtgtccgac F48W FP (SEQ ID NO: 29) gtcggacactccctggcgccagatcacagag F48W RCP (SEQ ID NO: 30) ctctgtgatctggcgccagggagtgtccgac F48L FP (SEQ ID NO: 31) gtcggacactcccttgcgccagatcacag F48L RCP (SEQ ID NO: 32) ctgtgatctggcgcaagggagtgtccgac F48N FP (SEQ ID NO: 33) gaggctgacactcccaaccgccagatcacagag F48N RCP (SEQ ID NO: 34) ctctgtgatctggcggttgggagtgtcagcctc F48R FP (SEQ ID NO: 35) gtcggacactccccgccgccagatcacag F48R RCP (SEQ ID NO: 36) ctgtgatctggcggcggggagtgtccgac F48K FP (SEQ ID NO: 37) gtcggacactcccaagcgccagatcacag F48K RCP (SEQ ID NO: 38) ctgtgatctggcgcttgggagtgtccgac 151N FP (SEQ ID NO: 39) ctcccttccgccagaacacagagatgactatc 151N RCP(SEQ ID O:40) gatagtcatctctgtgttctggcggaagggag 151L FP (SEQ ID NO: 41) ctcccttccgccagctcacagagatgac 151L RCP (SEQ ID NO: 42) gtcatctctgtgagctggcggaagggag 151M FP (SEQ ID NO: 43) cactcccttccgccagatgacagagatgac 151M RCP (SEQ ID NO: 44) gtcatctctgtcatctggcggaagggagtg MUTANTE INICIADOR (SEQ ?) NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTDJOS DE INICIADOR (5? 3') T52M FP (SEQ ID O: 45) cccttccgccagatcatggagatgactatcctcac T52M RCP (SEQ ID NO: 46) gtgaggatagtcatctccatgatctggcggaaggg T52R FP(SEQ ID O: 47) cttccgccagatcagagagatgactatcctcac T52R RCP (SEQ ID NO: 48) gtgaggatagtcatctctctgatctggcggaag T52W FP(SEQ ID NO: 49) ctcccttccgccagatctgggagatgactatcctcac T52W RCP (SEQ ID NO: 50) gtgaggatagtcatctcccagatctggcggaagggag T52L FP (SEQ ID NO: 51) cccttccgccagatcctagagatgactatcctcac T52L RCP (SEQ ID NO: 52) gtgaggatagtcatctctaggatctggcggaaggg T52E FP (SEQ ID NO: 53) ctcccttccgccagatcgaggagatgactatcctcac T52E RCP (SBQ ID NO: 54) gtgaggatagtcatctcctcgatctggcggaagggag T52P FP (SEQ ID NO: 55) cttccgccagatcccagagatgactatcctc T52P RCP (SEQ ID NO: 56) gaggatagtcatctctgggatctggcggaag T52G FP (SEQ ID NO: 57) cttccgccagatcggagagatgactatcctcac T52G RCP (SEQ ID NO: 58) gtgaggatagtcatctctccgatctggcggaag T52Q FP (SEQ ID NO: 59) cttccgccagatccaagagatgactatcctcac T52Q RCP (SEQ ID NO: 60) gtgaggaíagtcatctctíggatctggcggaag T52V FP (SEQ ID NO: 61) cccttccgccagatcgtagagatgactatcctcac T52V RCP (SBQ ID NO: 62) gtgaggatagtcatctctacgatctggcggaaggg M54W FP (SEQ ID NO: 63) cgccagatcacagagtggactatcctcacggtc M54W RCP (SEQ ID NO: 64) gaccgtgaggatagtccactctgtgatctggcg M54T FP (SEQ ID NO: 65) ccagatcacagagacgactatcctcacggtc M54T RCP (SEQ ID O:66) gaccgtgaggatagtcgtctctgtgatctgg M92L FP (SEQ ID NO: 67) gctcaagtgaggtactgatgctccgagtcg M92L RCP (SEQ ID NO: 68) cgactcggagcatcagtacctcacttgagc M92E FP (SEQ ID NO: 69) gctcaagtgaggtagagatgctccgagtcgcg M92E RCP (SEQ ID NO: 70) cgcgactcggagcatctctacctcacttgagc R95H FP (SEQ ID NO: 71) gaggtaatgatgctccacgtcgcgcgacgatac R95H RCP (SEQ ID NO: 72) gtatcgtcgcgcgacgtggagcatcattacctc R95M FP (SEQ ID NO: 73) gtgaggtaatgatgctcatggtcgcgcgacgatacgatg MUTANTE INICIADOR (SEQ ID NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE INICIADOR (5? 3') R95M RCP (SEQ ID NO: 74) catcgtatcgtcgcgcgaccatgagcatcattacctcac R95W FP (SEQ ID NO: 75) gtgaggtaatgatgctctgggtcgcgcgacgatacg R 5W RCP (SEQ ID NO: 76) cgtatcgtcgcgcgacccagagcatcattaectcac V96L FP (SEQ ID NO: 77) gtaatgatgctccgactcgcgcgacgatac V96L RCP (SEQ ID NO: 78) gtatcgtcgcgcgagtcggagcatcattac V96W FP (SEQ ID NO: 79) gaggtaatgatgctccgatgggcgcgacgatacgatg V96W RCP (SEQ ID NO: 80) catcgtatcgtcgcgcccatcggagcatcattacctc V96S FP (SEQ ID NO: 81) ggtaatgatgctccgatccgcgcgacgatacg V96S RCP (SEQ ID NO: 82) cgtatcgtcgcgcggatcggagcatcaítacc V96E FP (SEQ ID NO: 83) ggtaatgatgctccgagaggcgcgacgatacg V96E RCP(SEQ ID NO:84) cgtatcgtcgcgcctctcggagcatcattacc V96T FP (SEQ ID NO: 85) ggtaatgatgctccgaaccgcgcgacgatacg V96T RCP (SEQ ID NO: 86) cgtatcgtcgcgcggttcggagcatcattacc V107I FP (SEQ ID NO: 87) gcggcctcagacagtattctgttcgcgaac VI 071 RCP (SEQ ID NO: 88) gttcgcgaacagaatactgtctgaggccgc F109W FP (SEQ ID NO: 89) ctcagacagtgttctgtgggcgaacaaccaagcg F109W RCP (SEQ ID NO: 90) cgcttggttgttcgcccacagaacactgtctgag F109P FP (SEQ.IDNO:91) ctcagacagtgttctgcccgcgaacaaccaagc F109P RCP (SEQ ID NO: 92) gcttggttgttcgcgggcagaacactgtctgag F109L FP (SEQ ID NO: 93) cagacagtgttctgttggcgaacaaccaagcg F109L · RCP (SEQ ID NO: 94) cgcttggttgttcgccaacagaacactgtctg F109M FP (SEQ ID NO: 95) cctcagacagtgttctgatggcgaacaaccaagcg F109M RCP (SEQ ID NO: 96) cgcttggttgttcgccatcagaacactgtctgagg F109N FP (SEQ ID NO: 97) cctcagacagtgttctgaacgcgaacaaccaagcg F109N RCP (SEQ ID NO: 98) cgcttggttgttcgcgttcagaacactgtctgagg AllOP FP (SEQ ID NO: 99) cagacagtgttctgttcccgaacaaccaagcg Al 10P RCP (SEQ ID NO:100) cgcttggttgttcgggaacagaacactgtctg A110E FP (SEQ ID NO: 101) gacagtgttctgttcgagaacaaccaagcgtacac A110E RCP (SEQ ID NO: 102) gtgtacgcttggttgttctcgaacagaacactgtc MUTANTE INICIADOR (SEQ II) NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTDDOS DE INICIADOR (5' A 3') Al ION FP (SEQ ID NO: 103) cagacagtgttctgttcaacaacaaccaagcgtacactcgcg Al ION RCP (SEQ ID NO: 104) cgcgagtgtacgcttggttgttgttgaacagaacactgtctg Al lOW FP (SEQ ID NO:105) cagacagtgttctgttctggaacaaccaagcgtacactc AllOW RCP (SEQ ID O:106) gagtgtacgcttggttgttccagaacagaacactgtctg N119n FP ALEATORIO (SEQ ID gcgtacactcgcgacmmtaccgcaaggctggcatgg NO: 107) N119n RCP ALEATORIO (SEQ ID ccatgccagccttgcggtannngtcgcgagtgtacgc NO:108) Y120W FP(SEQ ID NO: 109) cactcgcgacaactggcgcaaggctggcatg Y120W RCP (SEQ ID NO: 110) catgccagccttgcgccagttgtcgcgagtg Y120M FP (SEQ ID NO: 111) cactcgcgacaacatgcgcaaggctggcatggcc Y120M RCP (SEQ ID NO: 112) ggccatgccagccttgcgcatgttgtcgcgagtg M125P FP (SEQ ID NO: 113) caaggctggcccggcctacgtcatcgag M125P RCP (SEQ ID NO: 114) ctcgatgacgtaggccgggccagccttg M125R FP (SEQ ID NO: 115) caaggctggcagggcctacgtcatcg M125R RCP (SEQ ID NO: 116) cgatgacgtaggccctgccagccttg M125E FP (SEQ ID NO: 117) gcaaggctggcgaggcctacgtcatcgag M125E RCP (SEQ ID NO: 118) ctcgatgacgtaggcctcgccagccttgc M125L FP (SEQ ID NO: 119) caaggctggcctggcctacgtcatcg M125L RCP (SEQ ID NO: 120) cgatgacgtaggccaggccagccttg M125C FP (SEQ ID NO: 121) ccgcaaggctggctgcgcctacgtcatcgagg M125C RCP (SEQ ID NO: 122) cctcgatgacgtaggcgcagccagccttgcgg M125G FP (SEQ ID NO: 123) ccgcaaggctggcggggcctacgtcatcg M125G RCP (SEQ ID NO: 124) cgatgacgtaggccccgccagccttgcgg M125I FP (SBQIDNO: 125) ccgcaaggctggcatagcctacgtcatcg M125I RCP (SEQ ID NO: 126) cgatgacgtaggctatgccagccttgcgg M125V FP (SEQ ID NO: 127) gcaaggctggcgtggcctacgtcatcg M125V RCP (SEQ ID NO: 128) cgatgacgtaggccacgccagccttgc M125W FP (SEQ ID NO: 129) gcaaggctggctgggcctacgtcatcgag MUTANTE INICIADOR (SEQ ID NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTD30S DE INICIADOR (5? 3') M125W RCP (SEQ ID NO: 130) ctcgatgacgtaggcccagccagccttgc Y127E FP (SEQ ID NO: 131) caaggctggcatggccgaggtcaícgagg Y127E RCP (SEQ ID NO: 132) cctcgatgacctcggccatgccagccttg V128F FP (SEQ ID NO: 133) ggctggcatggcctacimnatcgaggatctactgcacttc V128F RCP (SEQ ID NO: 134) gaagtgcagtagatcctcgatnnngtaggccatgccagcc L132M FP (SEQ ID NO: 135) gcctacgtcatcgaggatatgctgcacttctgccgg L132M RCP (SEQ ID NO: 136) ccggcagaagtgcagcatatcctcgatgacgtaggc L132N FP (SEQ ID NO: 137) gcctacgtcatcgaggataacctgcacttctgccgg L132N RCP (SEQ ID NO: 138) ccggcagaagtgcaggttatcctcgatgacgtaggc L132V FP (SEQ ID NO: 139) cgtcatcgaggatgtactgcacttctgccg L132V RCP (SEQ ID NO: 140) cggcagaagtgcagtacatcctcgatgacg L132E FP (SEQ ID NO: 141) gcctacgtcatcgaggatgaactgcacttctgcc L132E RCP (SEQ ID NO: 142) ggcagaagtgcagttcatcctcgatgacgtaggc M219K FP (SEQ ID NO: 143) gcatgcaaaactccaacaagtgcatctccctcaag M219K RCP (SEQ ID NO: 144) cttgagggagatgcacttgttggagttttgcatgc M219W FP (SEQ ID NO: 145) gcatgcaaaactccaactggtgcatctccctcaagct M219W RCP (SEQ ID NO: 146) agcttgagggagatgcaccagttggagttttgcatgc M219Y FP (SEQ ID NO: 147) ctcggcatgcaaaactccaactattgcatctccctcaagctcaag M219Y RCP (SEQ ID NO: 148) cttgagcttgagggagatgcaatagttggagttttgcatgccgag M219A FP (SEQ ID NO: 149) catgcaaaactccaacgcgtgcatctccctcaag M219A RCP (SEQ ID NO: 150) cttgagggagatgcacgcgttggagttttgcatg L223K FP (SEQ ID NO: 151) ctccaacatgtgcatctccaagaagctcaagaacag L223K RCP (SEQ ID NO: 152) ctgttcttgagcttcttggagatgcacatgttggag L223R FP (SEQ ID NO: 153) ctccaacatgtgcatctcccgcaagctcaagaacag L223R RCP (SEQ ID NO: 154) ctgttcttgagcttgcgggagatgcacatgttggag L223Y FP (SEQ ID NO: 155) ctccaacatgtgcatctcctacaagctcaagaacag L223Y RCP (SEQ ID NO: 156) ctgttcttgagcttgtaggagatgcacatgttggag L234M FP (SEQ ID NO: 157) gctgccgcctttcatggaggagatctgggatg L234M RCP (SEQ ID NO: 158) catcccagatctcctccatgaaaggcggcagc MUTANTE INICIADOR (SEQ ID NO:) SECUENCIA DE NUCLEOTEDOS DE INICIADOR (5' A 3') L234I FP (SEQ ID NO: 159) gctgccgcctttcattgaggagatctgggatgtg L234I RCP (SEQ ID NO: 160) cacatcccagatctcctcaatgaaaggcggcagc L234R FP (SEQ ID NO: 161) ctgccgcctttccgagaggagatctgggatg L234R RCP (SEQ ID NO: 162) catcccagatctcctctcggaaaggcggcag L234W FP (SEQ ID NO: 163) gctgccgcctttcígggaggagatctgggatgíg L234W RCP (SEQ ID NO: 164) cacatcccagatctcctcccagaaaggcggcagc W23 8P FP ((SEQ ID NO: 165) ctcgaggagatcccggatgtggcaggacatg W238P RCP (SEQ ID NO: 166) catgtcctgccacatccgggatctcctcgag W238E FP (SEQ ID NO: 167) cctcgaggagatcgaggatgtggcaggacatg W238E RCP (SEQ ID NO: 168) catgtcctgccacatcctcgatctcctcgagg W23 8L FP (SEQ ID NO: 169) ctcgaggagatcttggatgtggcaggacatg W238L RCP (SEQ ID NO: 170) catgtcctgccacatccaagatctcctcgag W23 8M FP (SEQ ID NO: 171) cctcgaggagatcatggatgtggcaggacatgtc W238M RCP (SEQ ID NO: 172) gacatgtcctgccacatccatgatctcctcgagg W23 8Y FP (SEQ ID NO: 173) cctcgaggagatctacgatgtggcaggacatgtc W23 8Y RCP (SEQ ID NO: 174) gacatgtccígccacatcgtagatctcctcgagg Los ' productos de ' cido nucleico de la PCR resultantes que codifican el dominio de unión al ligando EcR mutant se fusionaron entonces cada uno a un dominio de unión de ADN GAL4 como se describe en el Ej emplo 1 . 2 de arriba . Las construcciones del receptor de EcR GAL /imitante se probaron para su actividad al trasf ectarlos en células NIH3T3 ¦ j unto con V P 16 / ß RXRE F- LmRXRE F y pFRLuc en la presencia de varios ligandos . Se creó el mutante Gal 4-CfEcR-DEF (VYG ) al inserter una glicina extra en el extremo C-terminal del mutante por sustitución V107I/Y127E [CfECR(VY)] mediante PCR. Esencialmente, esto se hizo en dos etapas: PCR-amplificación de CfEcR-DEF (VYG) y sustitución de CfEcR(VY) en el vector GAL4- CfEcR DEF(VY) pBIND 1-9 con el CfEcR-DEF (VYG) PCR-amplificado. La región de CfEcR-DEF (con la glicina extra) se amplificó al utilizar el vector GAL4-CfEcR DEF(VY) pBIND 1-9 como modelo y los siguientes iniciadores de PCR: 5EcR- t GGAATTCCCGGGGATCCGGCCTGAGTGCGTAGTACCC (SEQ ID NO: 175) 3EcR-gly CTCTCTGCGGCCGCCTATCCGAGATTCGTGGGGGACTCGAGGATAG (SEQ ID NO: 176) El producto de PCR se aisló y se digirió con Not 1 (cortes en el extremo 3'; incluido en el 3' del iniciador de PCR) y Xma 1 (cortes en el extremo 5' ; presente en el iniciador de PCR 5') . Este producto se ligó al vector preparado de la siguiente manera: GAL4-CfEcR DEF(VY) pBIND 1-9 se digirió con Xma I y Not I (la digestión retira el CfEcR-DEF (VY) a partir del vector) . Los fragmentos se separaron en gel de agarosa al 1% y el ADN del vector que migró ligeramente se purificó. Después de la ligación entre el vector y el fragmento CfEcR-DEF (VYG) descrito arriba, la reacción de ligación se transformó en las bacterias . Las colonias positivas se seleccionaron por colonias PCR utilizando los iniciadores anteriormente mencionados. Las mutaciones VYG en el clón seleccionado se confirmaron mediante secuenciación . EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la identificación del ligando CfEcR de respuesta ecdisteroide dominio de unión de mutantes de sustitución que exhiben actividad incrementada en respuesta al ligando ecdisteroidal . En un esfuerzo para identificar la mutación por sustitucións en el CfEcR que incrementa la actividad del ligando ecdisteroidal, los Aolicitantes mutaron residuos de aminoácidos predichos para ser críticos para la unión de ecdisteroide y crearon Casetes de expresión genética de GAL /mutantCfEcR-DEF cADN como se describe eb el Ejemplo 1 anterior utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Los cADNs mutados y WT correspondientes a las diversas construcciones de cambio delineadas en lo anterior en el Ejemplo se elaboraron y probaron en un análisis de informador de luciferasa conduciddo en GAL4 como se describió anteriormente . Transfecciones : Los ADNs se transfirieron hacia células NIH3T3 de ratón (ATCC) como sigue. Se siguieron método estándar para cultivo y mantenimiento de las células. Las células se cosecharon y se colocaron en placas de 96-pozos a 2,500 células por pozo, en 50 µ? de medio de crecimiento conteniendo 10% de suero de bovino fetal (FBS) .

Veinticuatro horas después, las células se trataron con 35 µ? de medio de crecimiento libre de suero conteniendo ya sea dimetilsulfóxido (DMSO; control) o una solución de ligando DMSO. Las células se transfectaron entonces utilizando el reactivo de transfección SuperfectTM (Qiagen Inc.) - Para cada pozo, se mezclo 0.625 µ? de SuperfectTM con 14.2 µ? de medio de crecimiento libre de suero. Se agregaron 0.16 µ? de construcción informadora y 0.04 µ? de cada construcción receptora a la mezcla de reactivo de construcción. Los contenidos déla mezcla de transfección se mezclaron en un mezclador de vórtex y se dejaron asentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, se agregaron 15 µ? de mezcla de transfección a las células. Las células se mantuvieron a 37 °C y 5% de C02 durante 48 horas en 5% deFBS. Ligandos : Los la ponasterona A de ligandos ecdisteroideales y 20-hidroxiecdisona se adquirieron de Sigma Chemical Company e Invitrogen. El ligando non-ecdisteroideal de diacilhidrazina N- (2-etil-3-metoxibenzoil) -N' -(3,5-dimetilbenzoil) -N' -ter-butilhidrazina (RG-102240, GS®- ligando E) es un ligando ecdiecdiesteroide sintético estable que se sintetizó en Rohm y Haas Company. Los ligandos no ecdisteroideales, diacilhidrazina RG-101691, RG-102362, RG-1 15840, RG-115853, RG-115855, RG-115859 y RG-115898 se sintetizaron por RheoGene Inc. La síntesis de RG-101691, RO-102362, RG-115840, RG-115859 y RG-115898 se describe más adelante. La síntesis de RG-115853 y RG-115855 se describe en la Solicitud co-pendiente de Patente de E.ü. No. 10/775,883. Los ligandos no ecdisteroideales tetrahidroquinolina RG-120499 y RG-120500 se sintetizaron por RheoGene, Inc. y se describen en la Solicitud co-pending de Patente de E.ü. No. 10/460,820. Todos los ligandos se disolvieron en DMSO. Síntesis de Ligandos : Preparación de Ácid 3 , 5-dimetil-benzóico-N-ter-butil-N - (3-etil-2-metil-benzoil) -hidrazida (RG-101691 Se calentó a reflujo ácido 3-amino-2-metilbenzóico (6.16 g) durante 30 minutos en HBr concentrado. La mezcla se enfrió a 0 °C y se trató con una solución de NaN02 a 0°C (2.8 g en 5.6 mi H20) . La solución de sal de diasonio resultante se agregó lentamente a una solución precalentada (60-70 °C) de CuBr (3.8 g) en 3.2 mi de HBr concentrado. Después de la adición, la mezcla se agitó durante la noche a temperature ambienbte y se filtró. La pasta de filtro recuperada se lavó primero con agua y después con 10% de HC1, y se secó en aire para producir 6.93 g de ácid 3-bromo-2-metilbenzóico como un sólido en polvo púrpura claro. Este material se disolvió en etil acetato, se lavó dos veces con 5% HC1, se secó sobre Na2S04, y se recristalizó a partir de 4:1 hexanos:etil acetato primero a temperatura ambiente y después bajo refrigeración. XH NMR (DMSO, 200 MHz) , d (ppm) : 7.72 (dd, 2H) , 7.2 (t, 1H) , 2.5 Se refluyó ácido 3-brorno-2-metilbenzóico (7.03 g, 32.7 mmol) en 10 mi de S0C12 (98 mnol) y una gota de DMF durante 3 horas. Se retiró el exceso de socL2 in vacuo. El residuo se disolvió en 20 mi de CH2CI2 y se agregó a una solución enfriada en hielo de 2-amino-2-metil-propan-l-ol (8.74 g, 9.36 mi) en 20 mi de CH2C12. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y el solvente se retiró in vacuo para dejar un residuo oleoso. Se agregó S0C12 (7.4 mi, 100 mi, 3 eq. ) a este residuo durante un periodo de una hora, la mezcla se agitó 30 min adicionales, y después se vació en 150 mi de éter. Se formó una fase miscible en aceite y el éter se desecho. El aceite se mezcló con 100 mi de 20% NaOH, y se extrajo con 3 x 150 mi porciones de éter. Los extractos de éter se combinaron, se secaron sobre MgS04, y el solvente se retiró in vacuo para producir un aceite amarillo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando 4:1 hexáno: éter como eluyente produjo 4.87 g de 2-(3-bromo-2-metil-fenil) - , 4-dimetil-4 , 5-dihidro-oxazol como un aceite incoloro. (Rf= 0.25 (4:1 hexáno: éter) . xñ NMR (CDC13, 200 MHz) , d (ppm) : 7.62 (m, 2H) , 7.1 (t, 1H) , 4.1 (s, 2H) , 2.6 (s, 3H) , 1.4 (s, 6H) .

Se disolvió 2- (3-bromo-2-metil-fenil) -4, -dimetil-4, 5-dihidro-oxazol (3.4 g, 12.7 mmol) en 30 mi de etil éter bajo atmósfera de nitrógeno en un matráz de forndo redondo de 100 mi equipado con agitación magnética, termómetro, y condensador de reflujo. Se agregó Ni(dppp)Cl2 (100 mg) y la mezcla se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. Se agregó bromuro de etil magnesium (5.5 mi, 3M en éter), la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 30 minutos, a temperatura ambiente duranre 21/2 horas, y finalmente a reflujo durante 2 horas. La mezcla se agitó entonces a 0°C, se enfrió con NH4C1 saturado acuoso. Se retiró la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo con éter. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron sobre MgS04. El solvente se retiró in vacuo para dar 2.84 g 2- (3-etil-2-metil- fenil)-4,4-dimetil-4, 5-dihidro-oxazol, 1H NMR (CDC13, 200 MHz), d (ppm) : 7.5 (d, 2H) , 7.2 (m, 2H) , 4.1 (s, 2H) , 2.7 (m, 2H) , 2.45 (s, 3H) , 1.4 (s, 6H) , 1.2 (t, 3H) , Rf 0.25 (4:1 hexáno : éter) , conteniendo ca. 5% bromuro de arylo original. La oxazolina se suspendió en 100 mi de 6N HCl y se refluyó durante 5 horas con agitación vigorosa. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente, después de lo cual el ácid 3-etil-2-metil-benzóico se cristalizó: 1.74 g, m.p. 96-98 °C, ½ NMR (CDC13, 200 MHz), d (ppm) : 7.85 (d, 1H) , 7.4 (d, 1H) , 7.22 (t, 1H) , 2.7 (q, 2H) , 2.6 (s, 3H) , 1.21 (t, 3H) . Se recuperó un adicional de 110 mg mediante la extracción de éter de la fase acuosa.

Se refluyó ácido 3-etil-2-metil-benzóico (0.5 17 g) en 3 mi de tionil cloruro con una gota de DMF por varias horas. Se retiró el tionil cloruro in vacuo para producir 0.89 g (4.48 mmol) de 3-etil-2-metil-benzoil cloruro. El cloruro ácido se disolvió en 5 mi de CH2CI2 y se agregó lentamente y simultáneamente pero de manera seprada con 5 mi de NaOH acuoso (0.30 g, 7.5 mmol) a una solución de ácido 3, 5-dimetil-benzóico N-ter-butil-hidrazida (0.96 g, 4.36 mmol) disuelto en 10 mi de CH2C12 preenfriado a —5 °C.

Durante la adición, la temperatura se mantuvo por debajo de 5 °C. La mezcla se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se retiró la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con CH2C12. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron, y el solvente se retiró in vacuo para dar 1.5 g de producto crudo. Este residuo se extrajo con 100 mi de hexanos bajo reflujo, y el extracto caliente se decató a partoir de un residuo oleoso y se dejó enfriar a temperatura ambiente, después de lo cual el ácido 3, 5-dimetil-benzóico N-ter-butil-N' - (3-etil-2-metil-benzoil) -hidrazida se cristalizó (0.56 g, m.p. 167-169 °C, ^NMRtCDCls, 200 MHz), d (ppm) : 7.43 (s, 1H) , 7.18 (m, 1H) , 7.1 (s, 2H) , 7.03 (s, 1H) , 7.0 (m, 1H) , 6.35 (d, 1H) , 2.58 (q, 2H), 2.3 (s, 6H) , 1.95 (s, 3H) , 1.6 (s, 9H) , 1.15 (t, 3H) . La disolución del residuo oleoso y la cristalización produjeron un segundo cultivo de matetrial menos puro, 0.21g. Preparación de ácido 3 , 5-dimeil-benzóico N-ter-butil-N' - (3-isopropyl-2-metil-benzoil) -hidrazida (RG-102362) Un matráz de fondo redondo seco de 3-cuellos de 250 mi equipado con agitación magnética y mantenido bajo una atmósfera de nitrógeno se cargó con 5.0 g 2- (3-bromo-2-metil-fenil) -4, 4-dimetil-4, 5-dihidro-oxazol, 60 mi THF anhidro, y 100 mg Ni(dppp)Cl2- La mezcla se enfrió a 15 °C, y se agregó cloruro de isopropil magnesio (11 mi, 2M en etil éter) . Tuvo lugar una exotermia moderada, y la mezcla se oscurecióligeramente . La reacción se agitó durante la nocñe a temperatura ambiente, en cuyo punto 1H NMR indicó 50% de terminación. La adición de ca 75 mg Ni(dppp)Cl2 y reflujo durante 3 horas dio como resultado la no progresión adicional de la reacción. La mezcla se enfrió a 15 °C, y se agregó un adicional de 13 mi de cloruro de isopropil magnesio (2M en etil éter) y 100 mg de catalizador de niquel y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se enfrió con NH4C1 saturado acuoso, se retiró la capa orgánica, se extrajo la capa acuosa, y las fases orgánias se combinaron y se secaron. El solvente se retiró in vacuo para producir 3.84 g producto crudo como un aceite amarillo. La cromatografía de columna sobre gel de sílice utilizando 4:1 hexanos : éter as eluyente produjo 0.79 g de 2- (3-isopropyl-2-metil-fenil) -4, 4-dimetil-4, 5-dihidro-oxazol como un aceite incoloro. ½ NMR (CDC13, 200 MHz), d (ppm) : 7.5 (d, 1H) , 7.37 (d, 1H) , 7.22 (t, 1H) , 4.13 (s, 211), 3.23 (m, 1H) , 2.5 (s, 3H) , 1.45 (s, 6H) , 1.22 (d, 6H) . La oxazolina se suspendió en 34 mi de 6N HCl y se refluyó en un baño de aceite durante 6 horas. La mezcla se enfrió y se extrajo con CH2C12. El extracto se secó sobre a2SC>4 y se evaporó para producir 0.76 g de ácido 3-isopropil-2-metil-benzóico, adecuadamente puro para la siguiente etapa. XH NMR (CDC13, 300 MHz) , d (ppm) : 7.8 (d, 1H) , 7.48 (d, 1H) , 7.3 (t, 1H) , 3.3 (m, 1H) , 2.55 (s, 3H) , 1.2 (d, 6H) .

Se refluyó ácido 3-isopropyl-2-metil-benzóico (0.75 g) en ca . 3 mi de tionil cloruro con una gota de DMF durante varias horas y se retiró el tionil cloruro in vacuo para producir 3-isoproil-2-metil-benzoil cloruro. El cloruro ácido se disolvió en 5 mi de CH2CI2 y se agregó lentamente y de manera simultánea pero por separado con 5 mi de NaOH acuoso (0.265 g, 6.6 mmol) a una solución de ácido 3,5-dimetil-benzóico N-ter-butil-hidrazida (0.973 g, 4.4 mmol ) disuelto en 10 mi de CH2CI2 preenfriado a —5 °C. Durante la adición, la temperatura se mantuvo por debajo de 5 °C. La mezcla se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se retiró la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo con H2C12. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron, y se retiró el solvent . in vacuo para dar 1.61 g de producto crudo como un aceite amarillo. Este material se cromatografió sobre gel de sílice utilizando 4:1 hexanos : etil acetato como eleuyente, y subsecuentemente se trituró a partir de 1:1 hexáno: éterproduciendo ácido 3 ,5-dimetil-benzóico N-ter-butil-N' - (3-isoproil-2-metil-benzoil) -hidrazida, después de difíciles retiros de éter en un horno de vacío a 60°c (0.35 g, m.p. 182.5 °C. -""HNMR (CDCI3, 200 MHz) , 6(ppm) : 7.6 (s, 1H) , 7.25 (d, 1H) , 7.1 (s, 2H) , 7.05 (s, 1H) , 7.0 (m, 1H) , 6.3 (d, 1H) , 3.1 (m, 1H) , 2.3 (s, 6H) , 1.95 (sf 3H) , 1.6 (s, 9H) , 1.18 (m, 6H) . Preparación de ácido 3, 5-dimetil-benzoico N' - (5-etil-2 , 3-dihidro-benzo [1 , 4] dioxina-6-carbonil) -N- (l-etil-2 ,2-dimetil-propyl) -hidrazida (RG-115858) Se disolvieron 2.38 g (18 mmol) de t-butil carbazato en 50 mi de CH2C12 en un matráz de fondo redondo de 250 mi y se enfrió a 0°C. Se preparó una solución acuosa de 2CO3 (4.15 g K2C03 /35 mi H20) y se agregó a la mezcla de reacción que de nuevo se enfrió a 0°C. Se disolvieron 3.63 g (16 mmol) de 5-etil-2,3- dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-carbonil cloruro en 40 mi de CH2CI2 y se agregaron a partir de un embudo, a gotas durante 15 min. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla reacción se transfirió a un embudo separador con CH2C12 y H20. La fase de agua se extrajo completamente con CH2CI2. El extracto de CH2C12 se extrajo después con 0.5N HC1, se secó y se evaporó. El residuo se secó adicionalmente en un hrono al vacio para producir 5.15 g de un sólido tostado de N'-(5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1,4] dioxina-6-carbonil) - ácido idracinocarboxilico tert butil éster. TLC (1:1 etil acetal :hexano) dio ua sola mancha de Rf=0.43 y NMR indicó un producto muy puro. 1H NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 7.5 (br, 1H), 7.0 (br, 1H) , 6.75 (d, 2H) , 4.28 (br, 4H) , 2.76 (m, 2H) , 1.5 (s, 9H) , 1.18 (t, 3H) .

Se agregaron 5.15 g (16 mmol) de ' - (5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1,4] dioxina-6-carbonil) -ácido hidracinacarboxilico tert-butil éster a 200 mi de un frasco de fondo redondo. Se agregó aproximadamente 20 mi de ácido trifluoroacético y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Entonces se agregó aproximadamente 40 mi de agua, seguido por la adición lenta de 10% de NaOH/H20 frió, con agitación, hasta que se neutralizó el ácido (pH~14) . La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de separación y se extrajo con etil acetato mediante agitación suave (precaución: evolución del gas) . El extracto de etil acetato se secó y evaporó para producir 5.51 g de un semi-sólido viscoso amarillo pálido. El material se colocó entonces en un horno al vacio de 50°C por aproximadamente 1 hora para producir 4.62 g de 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico hidrazida. La división t-Boc se llevó a cabo mejor con un ácido trifluoroacético puro; el uso de solventes adjuntos siempre resultó en muchas producciones inferiores. 2H NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 7.0 (br, 1H) , 6.83 (m, 1H) , 6.71 (m, 1H) , 4.28 (br s, 4H), 2.76 (m, 2H) , 1.6 (br, 2H) , 1.17 (t, 3H) .

Se refluyeron 1.12 g (5.1 mmol) de 5~etil-2,3-dihidro-benzo [1 , 4 ) dioxina-6-ácido carboxilico hidrazida, 1.37 g (12 mmol) de 2,2 dimetil pentanona-3, 30 mi de etanol y 20 gotas de ácido acético glacial durante 6 horas para generar 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico (1-etil-2, 2-dimetil-propilideno) -hidrazida, que se utilizó in situ. Para la mezcla de reacción enfriada, se agregó 3 mi de ácido acético glacial y 0.63 g (10 mmol) de NaCNBH3. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se agregó 25 mi de agua y la mayoría del alcohol se retiró en un evaporador giratorio. Después se agregó 10% de NaOH/H20 hasta que la mezcla de reacción fue básica. El producto se extrajo con etil acetato, el cual se secó entonces y se evaporó para dar 1.61 g del residuo. Se obtuvo 5-etil-2,3-dihidro-benzo [1, ] dioxina-6-ácido carboxilico N' - (l-etil-2 , 2-dimetil-propil) -hidrazida puro (ca. 0.77 g) mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice, eluyendo con 25% de etil acetato/hexano . TLC:Rf=0.53, 1:1 etil acetato : hexano) . ? NMR (CDC13, 500 MHz) 5 (ppm) : 7.1 (br s, 1H) , 6.8 (df 1H) , 6.7 (d, 1H) , 4.27 (m, 4H) , 2.8 (ra, 2H) , 2.4 (m, 1H) , 1.7 (m, 1H) , 1.3 (m, 1H) , 1.2 (t, 3H) , 1.15 (t, 3H) , 0.97 (s, 9H) .

RG-115858 Se agregó 0.214 g (0.70 mmol) de 5-etil-2,3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico N' - (l-etil-2 , 2-dimetil-propil) -hidrazida, 151 mg (0.9 mmol) de 3,5 dimetilbenzoil cloruro, 7 mi de 25% de K2C03/H20 y 7 mi de CH2CI2 a 20 mi del frasco y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se transfirió para un embudo de separación y se diluyó NaHC03 y se agregó CH2C12. La capa de CH2C12 se separó y la capa de agua se extrajo dos veces con CH2C12. Los extractos de CH2CI2 se secaron sobre MgS0 y se evaporaron para producir 0.59 g de un residuo blanco. La purificación mediante cromatografxa de columna y la elusión con 15 mi de 20% de etil acetato/hexano produjeron aproximadamente 350 mg de 3, 5-dimetil-ácido benzoico N'-(5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, ] dioxina-6-carbonil) -N- (l-etil-2, 2-dmetil-propil) -hidrazida (95% puro mediante TLC:Rf=0.56, 1:1 etil acetato :hexano) . ¾ NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 7.05 (s, 1H), 7.0 (s, 2H), 6.6 (d, 1H) , 6.27 (d, 1H) , 4.65 (d, 1H), 4.25 (s, 4H) , 2.9 (m, 1H) , 2.3 (s, 6H) , 2.0 (m, 1H) , 1.55-1.7 (m, .2H) , 1.25 (m, 3H) , 0.9-1.2 (3s, 9H) , 0.9 (t, 3H) . Preparación de 3 , 5-dimetoxi-4-me il-ácido benzoico N- (1-tert-butil-3 , 4 , 4-trimetil-pent-2-enil) -N' - (5-etil-2 , 3-dihidro-benzo[l, 4] dioxina-6-carbonil) -hidrazida ( G115898) Se disolvió 2.38 g (18 mmol) de t-butil carbazato en 50 mi de CH2C12 en un frasco de fondo redondo de 250 mi y se enfrió a 0°C. Una solución acuosa de K2CO3 se preparó (4.15 g de K2CO3/35 mi de H2O) y se agregó a la mezcla de reacción con gas de nuevo enfriada a 0°C. Se disolvió 3.63 g (16 mmol) de 5-etil-2, 3-dihidro-benzo- [1, 4] dioxina-6-carbonil cloruro en 40 mi de CH2CI2 y se agregó a partir de un embudo de separación a gotas durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 dias . La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de separación con CH2C12 y H20. La fase de agua se extrajo completamente con CH2C12. El extracto de CH2C12 se extrajo entonces con 0.5N de HC1, se secó y se evaporó. El residuo se secó además en un horno al vacio para producir 5.15 g de un sólido tostado de N' - (5-etil-2 , 3-dihidro-benzo [ 1, 4 ] dioxina-6-carbonil) -ácido hidrazinacarboxilico tert-butil éster. TLC (1:1 etil acetato :hexano) dio una sola mancha a Rf=0.43 y NMR indicó un producto muy puro; ñ NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 7.5 (br, 1H), 7.0 (br, 1H) , 6.75 (d, 2H) , 4.28 (br, 4H) , 2.76 (m, 2H) , 1.5 (s, 9H), 1.18 (t, 3H) .

Se agregó 5.15 g (16 mmol) de N' - (5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-carbonil) -ácido hidracinocarboxilico tert-butil éster a un frasco de fondo redondo de 200 mi. Se agregó aproximadamente 20 mi de ácido trifluoroacético y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Después se agregó aproximadamente 40 mi de agua, seguido por la adición lenta de 10% de NaOH/H20 frió, con agitación, hasta que se neutralizó el ácido (pH~14) . La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de separación y se extrajo con etil acetato mediante agitación suave (precaución: evolución del gas) . El extracto de etil acetato se secó y evaporó para producir 5.51 g de un semi-sólido viscoso amarillo pálido. El material se colocó entonces en un horno al vacio de 50°C por aproximadamente 1 hora para producir 4.62 g de 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico hidrazida. La división t-Boc se llevó a cabo mejor con un ácido trifluoroacético puro; el uso de solventes adjuntos siempre resultó en muchas producciones inferiores. ¾ NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 7.0 (br, 1H) , 6.83 (m, 1H) , 6.71 (m, 1H) , 4.28 (br s, 4H) , 2.76 (m, 2H) , 1.6 (br, 2H) , 1.17 (t, 3H) .

Se disolvió 2, 2, 5, 6, 6-Pentametil-hept~4-en-3-ona (1.48 g, 8.1 mmol) en n-butil alcohol (20 mi) . Entonces se agregaron 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico hidrazida (1.80 g, 8.1 mmol) y 10 gotas de ácido acético glacial. La mezcla de reacción se refluyó durante 20 horas (requeridas para completar la reacción) y se monitoreó por TLC. A una solución de 5-etil-2 , 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico (l-tert-butil-3, 4, 4-trimetil-pnet-2-enilideno) -hidrazida intermedio se agregó 1.8 mi de ácido acético glacial y 1.02 g (16.2 mmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla de reacción se refluyó durante tres horas. La reacción se enfrió y se agregaron 50 mi de agua y 10% de NaOH acuoso hasta que la reacción fue básica (Ph=ca.l4). La mayoría del alcohol se etiró en un evaporador giratorio y el residuo se extrajo con EtOAc. El extracto acuoso se ecó y se concentró a un peso constante, produciendo 4 g de material viscoso. Se obtuvo 2.3 g de 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico N'-(l-tert-butil-3, 4, 4-timetil-pent-2-enil) -hidrazida puro (aceite amarillo, Rf=0.30 en 25% de EtOAc en n-Hexano, produjo 73%) mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice. 1H NMR (400 MHz, CDC13) d (ppm) : 7.42 (br, 1H) , 6.80 (d J=8.4 Hz, 1H) , 6.17 (br, 1H) , 5.30 (dd, J=0.8, 10 Hz, 1H) , 4.33-4.29 (m, 4H) , 3.68 (d, J=10 Hz, 1H) , 2.80 (m, 2H) , 1.72 (s, 3H) , 1.21 (s, 3H) , 1.12 (s, 9H) , 1.05 (s, 9H) .

Se disolvieron 5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1, 4] dioxina-6-ácido carboxilico N' - (l-tert-butil-3, 4, 4-timetil-pent-2-enil) -hidrazida (150 mg, 0.39 mmol) y 3, 5-dimetoxi-4-metilbenzoil cloruro (83 mg, 0.39 mmol) en 5 mi de CH2C12. Se agregó 5 ml de 25% de K2C03 y la mezclade reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se monitoreó mediante TLC. Las fases se separaron, agregando CH2C12 adicional y/o agua según se necesite a ayudar al manejo. La capa de CH2C12 se secó y se retiró el solvente in vacuo para proporcionar 210 mg del producto crudo. Este material se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice, eluyendo con una etapa de gradiente de 10-25% de etil acetato en hexano produciendo 3, 5~dimetoxi-4-metil~ácido benzoico N- (l-tert-butil-3, 4, -trimetil-pent-2-enil) -N' - (5-etil-2, 3-dihidro-benzo [1,4] dioxina-6-carbonil) -hidrazida RG115898 (83 mg, Rf=0.19 en 25% de etil acetato en n-hexano, produciendo 38%) . ½ NMR (400 MHz, DMSO-d ) d (ppm) : 10.19 (s, 1H) , 6.75 (d J=8.04 Hz, 1H) , 6.69 (s, 2H) , 6.61 (d, J=8.0 Hz, 1H) , 5.43 (d, J=10.0 Hz, 1H) , 5.41 (d, 14.4 Hz, 1H) , 4.30-4.20 (m, 4H) , 3.80 (s, 6H) , 2.21.15 (m, 1H) , 2.01 (s, 3H), 1.81 (m, 1H), 1.76-1.64 (m, 1H) , 1.06 (s, 9H) , 1.00 (s, 9H), 0.70 (t. J=7.6 Hz, 3H) . Preparación de ácido 3 , 5-dimetil-benzóico N- (1-tert-butil-pentil) -N' - (4-etil-benzoil) -hidrazida (RG-115840) Se disolvieron 2 , 2-dimetil-heptan-3-ol (0.23 mol) en 350 mi de CH2C12 en un matraz de fondo redondo de 500 mi con una barra agitadora magnética. El matraz se enfrió parcialmente con hielo. Se agregó 76.6 g (0.355 mol) de clorocromato de piridinio, mientras se agitó vigorosamente. La reacción se volvió negra y se calentó ligeramente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución se decantó a partir de la pasta negra, la cual se enjuagó con hexano. Los extractos orgánicos se combinaron y se cromatografiaron directamente sobre gel de sílice. (Nota: solo se encontró sílice para atrapar y retirar los compuestos de cromo sin reaccionar reducidos) . El producto 2, 2-dimetil-heptan-3-ona, se eluyó con CH2Cl2/hexano y en una fracción de 10% de etil acetato/hexano subsecuente produco 29.19 g de producto a 88% de rendimiento. 1H NMR (CDC13, 500 MHz) d (ppm) : 2.48 (t, 2H) , 1.54 (m, 2H) , 1.28 (m, 2H) , 1.13 (s, 9H) , 0.90 (m, 3H) . Preparación de ácido 4-etil-benzóico N' - (1-tert-butil- Se disolvieron ácido 4-etil-benzóico hidrazida (1.64 g, 10 mmol) en 12.5 mi de metanol. Se agregó entonces una gota de ácido acético, seguido por 1.55 g de 2,2-dimetil-heptan-3-ona . La mezcla se agitó a temperatura ambiente por varios días, en cuyo tiempo se agregó 2.1 mi de ácido acético y 667 mg de NaBH3CN. Después de agitar durante ca.7 horas, se reitró el metanol in vacuo. El producto residual se diluyó con ca. 20 mi de agua y se extrajo con cloruro de metileno. Los extractos se secaron sobre MgS04, se filtraron de los sólidos y se retiró el solvente in vacuo para proporcionar 1.8 g de producto crudo. Este material se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice, se eluyó con un 100% de hexanos-100% de gradiente de etil éter. Se recuperó ácido 4-etil-benzóico N'-(l-tert-butil-pentil) -hidrazida en 45% de rendimiento (1.32 g) .

Se disolvió ácido 4-etil-benzóico N' - (1-tert-butil-pentil) -hidrazida (145.2 mg, 0.5 mmol) en 5 mi de cloruro de metileno y se agregó 1.5 mmol de PS-NMM (804 mg, una resina de poliestireno funcionarizada de -S02NH (CH2) 3-morfolina disponible de Argonaut Technologies, San Carlos, CA) . La mezcla se diluyó con 3 mi de cloruro de metileno para generar una suspensión agitable. Se agregó 3, 5-dimetilbenzoil cloruro (0.5 mmol, 74 mi) y la mezcla se agitó durante la noche. ?1 siguiente día, se agregó 1 mmol (775 mg) de resina AP-NCO (resina funcionarizada de isocianato disponible de Argonaut Technologies, San Carlos, CA) y 1 mmol (401.6 mg) Teresina de AP-trisamina (poliestireno-CH2NHCH2CH2NH (CH2CH2NH2) 2 disponible de Argonaut Technologies, San Carlos CA) con 3 mi de cloruro de metileno para depurar el material de inicioi restante. La mezcla se agitó durante 4 horas, las resinas se filtraron y el filtrado se secó para proporcionar 191 mg de producto crudo que indicó una mancha mediante elanálisis de TLC. El material se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice utilizando un gradiente de 100% de haxano-100% de etil éter. Producción: 50 mg (ca.23%) ácido 3, 5-dimetil-benzóico N- (1-tert-butiñ-pentil) -NO- ( 4-etil-benzoil) -hidrazida . XH NMR (CDCI3, 400 Hz) 5 (ppm) : 7.8+7.5 (br/br, 1H) , 7.4-6.9 (m, 7H) , 4.7+3.6 (m/m, 1H), 2.65 (m, 2H) , 2.38+2.28 (s/s, 6H) , 1.9+1.75 (br, 2H) , 1.4-1.2 (br, m, 7H) , 1.1 (br s, 9H) , 0.95 (br s, 3H) . Ensayo del Informador : Se cosecharon células 40 horas después de la adición de ligandos . Se agregó 125 µ? de amortiguador de lisis pasiva (parte del sistema del ensayo del informador de Dual-luciferase™ de Promega Corporation) a cada pozo de la placa de 24 pozos. Las placas se colocaron sobre un agitador giratorio durante 15 minutos. Se ensayaron veinte µ? de lisado. Se midió la actividad de luciferasa utilizando el sistema del ensayo del informador de Dual-luciferase™ de Promega Corporation siguiendo las instrucciones del fabricante. Se calcularon las actividades de inducción de repetición (FI) al dividir las unidades de luz relativa ("RLU") en células tratadas con ligando con RLÜ en células tratadas con DMSO (control no tratado) . EJEMPLO 3 Este Ejemplo describe la identificación de mutantes de sustitución del dominio de unión a ligando CfEcR que son generalmente responsables del ecdiesteroide que exhibe actividad incrementada en respuesta a los ecdiesteroides . En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que incrementa la actividad deñ ecdiesteroide, los Solicitantes mutaron residuos de aminoácido y crearon casetes de expresión genética de ADNc de GAL /CfEcR-DEF mutante como se describe en el Ejemplo 1 de arriba utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Los ADNcs imitados y el T correspondientes a las diversas construcciones de cambio delineadas arriba en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se elaboraron y probaron en un ensayo del informador de luciferasa conducido por GAL4 como se describe en el Ejemplo 2. Los residuos de aminoácido específicos se identificaron que, cuando se sustituyen producen un receptor de ecdisona mutante que exhibe actividad incrementada en respuesta a un ligando ecdiesteroide. El efecto de una sustitución de aminoácido en el reisudo de aminoácido 119 de la SEQ ID NO:l sobre la actividad del receptor CfEcR-DEF mutado se representa en la Tabla 3a como un incremento de veces sobre la actividad de cambio CfEcR-DEF (WT) tipo silvestre/GAL . El efecto de una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 96 de la SEQ ID NO:l y la doble sustitución de aminoácido en los residuos amino 96 y 119 sobre la actividad del receptor CfEcR-DEF mutado se representa en la Tabla 3b como EC50 y la inducción de veces máxima relativa. EC50s se calcularon a partir de los datos de respuesta a la dosis utilizando un modelo logistico de tres parámetros . Se determinó Max FI relativo como la inducción de veces máxima del ligando probado (una modalidad de la invención) observada a cualquier concentración relativa a la inducciónde veces máxima del ligando GS®-E (RG-102240; ácido 3 , 5-dimetil-benzóico N-tert-butil-N' - ( 2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) observado a cualquier concentración. Tabla 3a . Mutante cfEcR-DEF que muestra actividad ecdiesteroide incrementada Veces de incremento sobre WT N119F ligando 1.6 nM GS®-E (RG-102240) 1-22 ligando 8 nM GS®-E (RG-102240) 0.73 ligando 40 nM GS®-E (RG-102240) 0.06 ligando 200 nM GS®-E (RG-102240) 0.01 ligando 1 µ? GS®-E (RG-102240) 0.08 ligando 5 µ? GS®-E (RG-102240) 0.59 1.6 nM PonA 1.33 8 nM PonA 1.7 40 nM PonA 9.,42 200 nM PonA 6.50 1 µ? PonA 3·°0 Tabla 3b . Mutantes CfEcR-DEF que muestran actividad ecdiesteroide incrementada DAH DAH DAH THQ THQ ECD KCD RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 101691 102362 120499 120500 20E PonA EC50 V96S (µ?) 1.14 0.87 2.07 >33 >33 >33 -2 Reí Max V96S FI 1 0.9 0.57 0 0 0.02 0.92 EC50 N119F/V96T (µ?) ~8 3.63 -10 -20 >33 ~8 ~3 Reí Max N119F/V96T FI 1 0.13 0.19 0.1 0.02 0.46 2.02 Como se observa en las Tablas 3a y 3b, la actividad de ecdiesteroides se incrementó significativamente cuando el dominio de unión a ligando CfEcR se mutó en los residuos de aminoácido 96 o 119 de 1s SEQ ID NO:l y se mutó doble en los residuos de aminoácido 96 y 119 de la SEQ ID NO.l, indicando que estos residuos son residuos importantes en el cavidad de unión a ligando del CfEcR. EJEMPLO 4 Este Ejemplo describe la identificación de los mutantes de sustitución del dominio de unión a ligando CfEcR adicionales que generalmente driacilhidracina no esferoide responsable de que exhibe actividad incrementada en respuesta a los ligandos de diacilhidracina. En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que incrementa la actividad del ligando de diacilhidracina de los Solicitantes imitaron residuos de aminoácido predichos para ser críticos para la unión al ecdiesteroide y crearon los casetes de expresión genética de ADNc GAL4/CfEcR-DEF mutante como se describe en el Ejemplo 1 de arriba utilizando equipo de mutagénesis dirigido al sitio mediado por PCR. Los ADNcs mutado y WT correspondiente para las diversas construcciones de cambio antes delineados en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en ensayor de reprotador de luciferasa dirigidos por GAL4 como se describe en el Ejemplo 2. Los residuos de aminoácidos específicos se identificaron que, cuando se sustituyeron, produjeron receptores de ecdisona mutantes que exhiben actividad incrementada en respuesta a los ligandos de diacilhidracina no esteroides. El efecto de una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 48, 52, 54,1 09, 110, 125, 132 y 233 de la SEQ ID N0:1 y una doble sustitución en los residuos 52 y 110 de la SEQ ID NO:l en la actividad del receptor CfEcR-DEF mutado se presentó en las Tablas 4a y 4b como EC50 y la inducción de veces máxima relativa. EC5os se calcularon de los datos de respuesta de dosis utilizando un modelo logístico de tres parámetros. El Max FI relativo se determinó en la inducción de veces máxima del ligando probado (una modalidad de la invención) observada en cualquier concentración relativa con la inducción de veces máxima del ligando GS®-E (3, 5-dimetil-ácido benzoico N-tert-butil-N' - (2-etil-3-metoxi-benzoil) -hidrazida) observado en cualquie concentración . Tabla 4a. Mutantes CfEcR que muestran actividad del ligand de diacilhidracina incrementada DAH DAH DAH THQ THQ ECD ECD Mutante RG- RG- RG- RG- RG- 102240 101691 102362 120499 120500 20E PonA A110E EC50 (µ?) 0.59 0. .85 1. .02 >33 >33 >33 -10 A110E RelMaxFI 1 1. .03 0. .78 0 0.01 0 1.09 A110N EC50 (µ ) 1.41 0. .88 0. .72 >33 >33 >33 >33 A11QN RelMaxFI 1 0. .99 0. ,86 0 0 0 0 F109 EC50 (µ?) 0.66 0. 65 0. 82 >33 -20 >33 -20 F109M RelMaxFI 1 0. 75 0 .6 0.04 0.05 0 0.16 A110P EC50 (µ?) 0.55 0. 67 0. 77 >33 >33 >33 >33 A110P RelMaxFI 1 0. 89 0. 64 0 0 0 0 F48Y EC50 <µ?) 1.27 0. 93 0. 59 >33 >33 >33 -10 F48Y RelMaxFI 1 0. 69 0. .48 0 0 0 0.33 F48W EC50 (µ?) ~1 1. .53 0. 77 >33 >33 >33 -10 F48W RelMaxFI 1 0. .74 0. .51 0 0 0 0.65 F48L EC50 (µ?) 0.46 0 .3 0. .56 >33 >33 >33 -10 F48L RelMaxFI 1 0. .81 0. 53 0 0 0 0.59 M54T EC50 (µ?) 0.08 0. .03 0. .05 >33 >33 >33 9.46 54T RelMaxFI 1 0. .71 0. .66 0 0 0 0.5 552L EC50 (µ?) -0.5 0. .21 0. .33 >33 >33 >33 5.03 T52L RelMaxFI 1 0. .74 0. .61 0 0 0 0.54 T52V/A110P EC50 (µ?) 0.33 0. .24 0. .32 >33 >33 >33 >33 T52V/A110P RelMaxFI 1 0. .66 0. .94 0 0 0 0 Tabla 4b. Mutantes CfEcR que muestran actividad de ligando de diacilhidracina incrementada Mutante RG-102240 RG-115840 RG-115853 RG-115855 RG-115859 RG-115898 EC50 F48R (µ?) 7.23 3. .58 0.1 5.18 9.41 >33 Reí Max F 8R FI 1 2. .65 5.71 1.02 1.25 0 EC50 L132E (µ?) 0.41 1. .67 1.54 0.45 0.08 2.15 Reí Max L132E FI 1 1. .56 1.12 1.15 0.51 0.34 EC50 M125I (µ?) 1.36 3. .02 1.53 2 0.28 >33 Reí Max M125I FI 1 0.45 0.54 0.69 0.76 0 EC50 L223Y (µ?) 3.15 0.58 0.65 0.3 1.27 0.33 Reí Max L223Y FI 1 1.42 0.77 1.6 0.79 0.2 EC50 M125G (µ ) 14.17 2.97 0.14 0.08 5 0.08 Reí Max M125G FI 1 47.96 39.41 46.54 3.14 28.81 EC50 M125N (µ?) 9.88 3.3 0.5 0>33 8 0.94 Reí Max M125N FI 1 22.56 11.64 25.3 4.11 11.57 Como se onserva en las Tablas 4a y 4b, la actividad de las diacilhidracinas se incrementó significativamente cuando el dominio de unión a ligando CfEcR se mutó en los residuos de aminoácido 48, 52, 54, 109, 125, 132 y 223 de la SEQ ID NO.l y se mutó doble en los residuos de aminoácido 52 y 110 de la SEQ ID NO:l, indicando que estos residuos son residuos importantes en el cavidad de unión a ligando de CfEcR. EJEMPLO 5 Este Ejemplo describe la identificación de los imitantes por sustitución del dominio de unión a ligando de CfEcR adicionales que son generalmente diacilhidracina y ecdiesteroide responsables de que exhiben actividad incrementada en la respuesta al ligando y esteroide de diacilhidracina. En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que incrementa la actividad del ligando de diacilhidracina y la actividad del ligando ecdiesteroide, los Solicitantes imitaron los residuos de aminoácido y crearon casetes de expresión genética de ADNc GAL4 /CfEcR-DEF mutante como se describen en el Ejemplo 1 de arriba utilizando equipo de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Los ADNcs mutado y WT correspondiente con las diversas construcciones de cambio definidas arriba en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en los ensayos del informador de luciferasa dirigido por GAL4 como se describió en el Ejemplo 2. El efecto de una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 109, 132, 238 de la SEQ ID NO:l o la sustitución de los residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l p 107, 127 y la adición de una glicina en el extremo de la SEQ ID NO: 1 en la actividad del receptor de CfEcR-DEF mutado se presenta en la Tabla 5. Tabla 5. Mutantes CfEcR que muestran actividad de diacilhidracina y ecdiesteroide incrementada DAH DAH DAH THQ THQ ECD ECD RG- RG- RG- RG- RG- utante 102240 101691 102362 120499 120500 20E PonA F109W EC50 (µ?) 0.61 0. .49 1. 41 >33 >33 >33 4.06 F109W Reí Max FI 1 0. .79 0 .7 0.01 0.01 0 0.08 V107I/Y127E/T EC50 52V (µ?) 0.06 0. .02 <0 .01 >33 >33 >33 ~1 V107I/Y127E/T Reí Max 52V FI 1 0. .88 0. 73 0 0 0.04 0.67 V107I/Y127E/G EC50 (µ?) 0.17 0. .02 0. 06 >33 >33 >33 1.65 Reí Max V107I/Y127E/G FI 1 0, .85 0. .81 0 0 0.03 0.67 EC50 L132M (µ?) 0.77 0. .51 0. .13 >33 >33 >33 5.47 Reí Max L132M FI 1 0. .77 0. .66 0.01 0.04 0 0.57 EC50 L132V (µ?) 2.32 0. .66 0. 29 >33 >33 >33 6.56 Reí Max L132V FI 1 0. .77 0. .74 0.01 0.04 0 0.57 EC50 W238P (µ?) ~4 0. .65 0. 29 >33 >33 >33 -3.3 Reí Max 238P FI 1 0. .91 0 .4 0.01 0.01 0 0.73 Como se observa en la Tabla 5 tanto 1as actividades de diacilhidracina como ecdiesteroide se incrementaron cuando el dominio de unión a ligando de CfEcR se mutó en los residuos de aminoácido 48, 51, 52, 54, 96, 120, 125, 128, 132, 234 y 238, indicando que estos residuos son residuos importantes en el cavidad de unión a ligando de CfEcR. EJEMPLO 6 Este Ejemplo describe la identificación de los mutantes por sustitución del dominio de unión a ligando de CfEcR adicionales que son generalmente diacilhidracina y tetrahidroquinolina responsables de que exhiben actividad incrementada en la respuesta de los ligandos diacilhidracina y tetrahidroquinolina. En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que incrementa la actividad del ligando de diacilhidracina y la actividad del ligando de tetrahidroquinolina, los Solicitantes mutaron residuos de aminoácido predichos y crearon los casetes de expresión genética de ADNc GAL4/CfEcR-DEF mutante como se describen en el Ejemplo 1 utilizan equipo de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Los ADNcs mutado y WT correspondiente con las diversas construcciones de cambio definidas arriba en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en los ensayos del informador de luciferasa dirigido por GAL4 como se describió en el Ejemplo 2. El efecto de mutaciones triples en los residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l y las mutaciones dobles en 107, 127 de la SEQ ID NO:l en la actividad del receptor de CfEcR-DEF mutado se presenta en la Tabla 6. Tabla 6. Mutantes CfEcR que muestran actividad de diacilhidracina y tetrahidroquinolina incrementada 1 2 3 4 5 6 7 DAH DAH DAH THQ THQ ECD ECD RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 101691 102362 120499 120500 2DE PonA V107I/Y127E/A110P EC50 (µ?) 0.30 0.34 0.10 -20 3.71 >33 >33 V107I/Y127E/A110P RelMaxFI 1.0 0.96 0.63 0.08 0.16 0.00 0.01 V128F/A110P EC50 (µ?) ~8 ~5 0.45 0.28 >33 >33 V128F/A110P RelMaxFI 1.00 0.08 0.51 0.68 0.00 0.00 Como se observa en la Tabla 6 ambas actividades de diacilhidracina como tetrahidroquinolina no ecdiesteroides se incrementaron cuando el dominio de unión a ligando de CfEcR se imitó en los residuos de aminoácido 107, 110 y 127 y 107 y 127, indicandoq ue estos residuos son residuos importantes en el cavidad de unión a ligando de CfEcR. EJEMPLO 7 La Tabla 7 describe el efecto del ligando GS™-E de diacilhidracina versus control de DMSO en varias concentraciones en la inducción de vez máxima de varios mutantes CfEcR. Tabla 7. Efectos del ligando GS™-E v. control de DMSO en la inducción de vez máxima de los mutantes CfEcR. Mutante ligando GS™-E Concentración max FI (relativo (mM) en FI max Con DMSO) A110E 4926 10.00 AlION 1678 10.00 A110 5207 10.00 F109W 3063 10.00 F109P 1 10.00 F109L 20 33.30 F109M 1475 3.3 F109N 1506 33.3 F 8Y 1355 33.3 F48W 1638 33.3 EJEMPLO 8 Este Ejemplo describe la identificación de los imitantes por sustitución del dominio de unión a ligando de CfEcR adicionales que exhiben actividad decrementada en respuesta a los ligandos de diacilhidracina . En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que decrementa la actividad del ligando de diacilhidracina, los Solicitantes mutaron los residuos de aminoácido predichos para ser críticos en una unión de diacilhidracina y creraron casetes de expresión genética de ADNc GAL4/CfEcR-DEF mutante en el Ejemplo 1 utilizando equipo de mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Los ADNcs mutado y WT correspondiente con las diversas construcciones de cambio definidas arriba en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en los ensayos del informador de luciferasa dirigido por GAL4 como se describió en el Ejemplo 2. El efecto de mutaciones triples en los residuos de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 o 238 de la SEQ ID NO:l en la actividad del receptor de CfEcR-DEF mutado se presenta en las Tablas 8a y 8b. Tabla 8a. utantes CfEcR que muestran actividad de diacilhidracina decrementada DAH DAH DAH THQ THQ EC ECD RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 101691 102362 120499 120500 20E PonA EC50 M92L (µ?) -8 9.9 -20 >33 >33 >33 >33 Reí Max 92L FI 1 0.41 0.05 0 0 0 0 M92E EC50 -8 -20 >33 >33 >33 >33 >33 (µ?) Reí Max 92E FI 1 0.08 0.04 0 0 0 0.01 EC50 R95 (µ?) -7 -10 -8 >33 >33 >33 >33 Reí Max R95W FI 1 0.37 0.25 0 0 0 0 EC50 T52E (µ?) ~7 -7 7.16 >33 >33 >33 >33 Reí Max T52E FI 1 0.57 0.34 0 0 0 0 EC50 W238E (µ?) -6 -8 3.45 >33 >33 >33 >33 Reí Max W238E FI 1 0.71 0.45 0 0 0 0 EC50 Y120M (µ?) ~4 -10 -10 >33 >33 >33 >33 Reí Max Y120M FI 1 0.3 0.13 0 0 0 0.04 EC50 I51L (µ?) 3.2 2.28 3.35 >33 >33 >33 -8 Reí Max I51L FI 1 0.88 0.53 0 0 0 0.66 EC50 V96W (µ?) ~1 3.61 3.26 >33 >33 >33 -3.3 Reí Max V96W FI 1 0.75 0.38 0 0.01 0 0.83 EC50 Y120W (µ?) 4.21 9.76 4.96 >33 >33 >33 -10 Reí Max Y120W FI 1 0.89 0.67 0.02 0.01 0 0.69 EC50 238Y (µ?) -13 >33 >33 >33 >33 >33 >33 Reí Max W238Y FI 1 0.3 0.06 0.13 0.1 0.18 0.07 EC50 F109M (µ?) 2.7 3.95 1.85 >33 >33 >33 >33 Reí Max F109N FI 1 0.85 0.4 0 0 0 0 EC50 L234M (µ?) 1.43 1.79 2.04 >33 >33 >33 >33 Reí Max L234M FI 1 0.77 0.43 0 0 0 0.02 EC50 M125E (µ?) ~2 0.98 0.83 >33 >33 >33 >33 Reí Max M125E FI 1 0.53 0.4 0 0 0 0 EC50 V96E (µ?) ~2 1.62 1.86 >33 >33 >33 >33 Reí Max V96E FI 1 0.81 0.48 0 0 0 0.02 EC50 F48H (µ?) 0.75 1.73 1.68 >33 >33 >33 -20 Reí Max F48N FI 1 0.88 0.66 0 0 0 0.17 EC50 L234I (µ?) 0.77 0.94 2.46 >33 >33 >33 -7 L234I Reí Max 1 0.73 0.44 0 0.01 0 0.56 FI EC50 M54W (µ?) 1.17 1.63 1.24 >33 >33 >33 -10 Reí Max M54W FI 1 0.75 0.44 0.01 0.01 0 0.46 EC50 V96L (µ?) ~1 1.68 2.67 >33 >33 >33 7.49 Reí Max V96L FI 1 0.62 0.58 0 0 0 0.49 Tabla Mutantes CfEcR que muestran actividad diacilhidracina decrementada RG- RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 115840 115853 115855 115859 115898 EC50 I51M (µ?) 3.94 4.13 2.94 1.33 2 >33 Reí Max FI 1 0.27 0.46 0.84 1.07 0.02 EC50 L234R (µ?) 17.1 20 >33 >33 20 >33 Reí Max FI 1 2.24 0.2 0.21 3.8 0.58 EC50 L234W (µ?) 11.48 >33 >33 6 5 >33 Reí Max FI 1 0.06 0.07 0.44 0.42 0.02 EC50 M219A (µ?) 2.9 2.87 3.65 1.44 3.18 1 Reí Max FI 1 0.6 0.79 0.86 0.85 0.05 EC50 L223K (µ?) 3.93 1 2.5 1.23 0.38 0.28 Reí Max FI 1 40.93 0.54 0.87 0.9 0.18 EC50 M125V (µ?) I.64 3.79 1.72 2 1 >33 Reí Max FI 1 0.47 0.5 0.74 0.87 0.01 EC50 M219 (µ?) 2.9 >33 3.31 1.93 5 >33 Reí Max FI 1 0.01 0.22 0.34 0.66 0 EC50 M219W (µ?) 3.35 2.33 -20 2 4 >33 Reí Max FI 1 0.39 0.12 0.34 0.46 O EC50 219Y (µ?) 0.82 1 -20 2 2 >33 Reí Max FI 1 0.68 0.05 0.32 0.51 0.01 EC50 T52M (µ?) 6.74 5 1.36 10 3.56 >33 Reí Max FI 1 0.15 0.32 0.66 1.08 0.01 EC50 T52R (µ?) 6.69 >33 5 3.31 6.14 >33 Reí Max FI 1 0.02 0.06 0.1 0.41 O EC50 W238L (µ?) II.13 2 >33 2 5 >33 Reí Max FI 1 0.41 0.02 0.09 1.08 O EC50 W238M (µ?) 10.47 2 >33 2 1.85 >33 Reí Max FI 1 0.41 0.05 0.72 16.07 0.03 EC50 F48K (µ?) 11.09 3.76 4.42 2.45 >33 >33 Reí Max FI 1 0.18 0.71 4.78 0.02 0.08 EC50 T52G (µ?) 3.52 3.61 3.35 2 6.49 >33 Reí Max FI 1 0.23 0.28 0.31 0..44 0.01 EC50 T52Q (µ?) 2.95 2 >33 0.56 1. .11 20 Reí Max FI 1 0 .34 0.04 0.39 1. .02 0.08 EC50 I.223R (µ?) 8.69 2 2 1.2 5. ,19 >33 Reí Max FI 1 0 .25 0.09 1.35 0. .61 0.01 Como se o serva en las Tablas í 3a y 8b, la £ de diacilhidracinas se disminuyó significativamente cuando el dominio de unión a ligando CfEcR se mutó en los residuos de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234, o 238 de la SEQ ID NO: 1, indicando que estos residuos son residuos importantes en la cavidad de unión a ligando de CfEcR. EJEMPLO 9 Este Ejemplo describe la identificación de mutantes por sustitución del dominio de unión a ligando de CfEcR que generalmente son tetrahidroquinolina responsables de que exhiben actividad incrementada en respeusta a los ligandos de tetrahidraquinolina . En un esfuerzo para identificar las mutaciones por sustitución en el CfEcR que incrementa la actividad del ligando de tetrahidroquinolina, los solicitantes mutaron los residuos de aminoácidos específicos y crearon casetes de expresión genética de ADNc de GAL4/CfEcR-DEF imitante como se describen en el Ejemplo 1 utilizando equipo de mutagénesis dirigido al sitio mediado por PCR. El mutado y los ADNcs WT correspondientes con varias construcciones de cambio definidas arriba en el Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en los ensayos del informador de luciferasa dirigido por GAL4 como se describe en el Ejemplo 2. El efecto de una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 110 o 128 de la SEQ ID NO: 1 o de la doble sustitución de aminoácido en los residuos de aminoácido 110 y 128 de la SEQ ID NO: 1 en la actividad del receptor CfEcR-DEF mutado se presenta en la Tabla 9. Tabla 9. Mutantes CfEcR que muestran actividad de tetrahidroquinolina incrementada DAH DAH THQ THQ ECD ECD RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 11691 102362 120499 120500 20E PonA EC50 A110W (µ?) 1.37 1.06 2.39 -10 ~5 >33 >33 Reí Max A110W FI 1 0.8 0.55 0.06 0.07 0 0.01 EC50 V128F (µ?) >33 -8.3, 5.4 >33 >33 -10 -10 >33 Reí Max V128F FI 0 0.04 3.24 0.05 1 0.02 0.03 V128F/AU0 EC50 P (µ?) ~8 ~5 0.45 0.28 >33 >33 V128F/A110 Reí Max P FI 1 0.08 0.51 0.68 0 0 Como se observa en la Tabla 9, la actividad de las tetrahidroquinolinas se incremento significativamente cuando el dominio de unión a ligando de CfEcR se muto en los residuos de aminoácido 110 o 128 de la SEQ ID NO: 1 o se muto doble en los residuos de aminoácido 110 y 128 de la SEQ ID NO: 1, indicando que estos residuos son residuos importantes en la cavidad de unión a ligando de CfEcR. EJEMPLO 10 Este Ejemplo describe la identificación de mutantes por sustitución de dominio de unión a ligando de CfEcR adicionales que son diferencialmente responsables con los ligandos de diacilhidracina . Estos mutantes exhiben un decremento general en la actividad de dicilhidracina; sin embargo son responsblaes de manera selectiva para un ligando de diacilhidracina especifico. En un esfuerzo por identificar utaciones por sustitución en el CfEcR, los solicitantes mutaron los residuos de aminoácido específicos y crearon casetes de expresión genética de ADNc de GAL4/CfEcR-DEF mutante orno se describe en el Ejemplo 1 utiliza equipo de mutagenesis dirigido al sitio mediada por PCR. El mutado y los ADNcsWT correspondientes con las diversas construcciones de cambio delineadas arriba en e Ejemplo 1.1 y 1.2 se hicieron y probaron en los ensayos del informador de los luciferasa dirigidos por GAL4 como se describe en el Ejemplo 2. El efecto de una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 52, 95, 109, 125, o 132 de la SEQ ID NO: 1 en la actividad del receptor CfEcR DEF mutado se presentan en las Tablas 10a y 10b. Tabla 10a. Mutantes CfEcR que muestran actividad de diacilhidracina decrementada y actividad incrementada en respuesta a la diacilhidracina RG-115855 RG- B.G- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 101691 102362 115855 120499 120500 20E PonA EC50 F109L (µ ) -2 2.34 -2.5 1.73 >33 >33 >33 >33 Reí Max F109L FI 1 0.68 0.? 1.01 0.03 0.02 0.09 0.03 EC50 L132M (µ?) -12 -20 >33 0.39 >33 >33 >33 >33 Reí Max L132M FI 1 0.08 0.01 0.90 0 0 0.01 0.01 EC50 R95H (µ?) 1.58 3.9 3.49 0.78 >33 >33 >33 >33 Reí Max R95H El 1 0.96 0.62 .0. 68 0 0 0 0.03 EC50 R95 (µ?) 2.76 3.3 4.28 3. 74 >33 >33 >33 >33 Reí Max R95M FI 1 0.57 0.27 0. 33 0 0.01 0 0 EC50 M125L (µ?) -10 >33 >33 0. 16 >33 >33 >33 >33 Reí Max M125L FI 1 0 0.01 2. 15 0 0 0 0 EC50 T52P <µ?) -10 >33 -6 3. 87 >33 >33 >33 >33 Reí Max T52P FI 1 0.02 0.11 1. 93 0.03 0.03 0.02 0.03 EC50 M125W <µ ) 3.49 4.94 3.5 0. 03 >33 >33 >33 >33 Reí Max M125 FI 1 0.74 0.44 1. 24 0 0 0 0 EC50 125R (µ?) 3.7 -10 10.38 0. 02 >33 >33 >33 -8 Reí Max M125R FI 0 0.01 0 1. 39 0 0.01 0 EC50 125C (µ?) -8, >33 33 33 0. 58 33 33 33 33 Reí Max M125C FI 1 0.62 0.15 876.58 0.27 0.14 0.22 0.28 EC50 M125P (µ?) >33 >33 >33 0. 45 >33 >33 >33 >33 Reí Max M125P FI 1 5.25 0.78 38C 1.86 0.65 1.3 1.29 0.7 Tabla 10b.. Mutantes CfEcR que muestran actividad de diacilhidracina RG-102240 decrementada y actividad incrementada en respuesta a otras diacilhidracinas RG- RG- RG- RG- RG- RG- Mutante 102240 115840 115853 115859 120499 115898 EC50 M125S (µ?) 12.33 1.4 0.98 0.11 7.26 0.33 Reí Max FI 1 22.73 15.97 25.22 6.39 16.98 EC50 T52 (µ?) 18.33 4.07 2 0.96 7 0.18 Reí Max FI 1 30.59 89.32 49.21 2.81 4.24 Como se observa en las Tablas 10a y 10b, la actividad de las diacilhidracinas se afectó diferencialmente cuando el dominio de unión a ligando de CfEcR se muto en los residuos de aminoácido 52, 95, 109, 125 o 132 de la SEQ ID NO: 1, indicando que estos residuos osn residuos importantes en la cavidad de unión a ligando de CfEcR.

La presente invención no ¦ se limita al alcance de las modalidades especificas descritas en la presente. Efectivamente, varias modificaciones de la invención demás de aquellas descritas en la presente se volverán aparentes para los expertos en la materia a partir de la descripción en curso y las Figuras acompañantes. Tales modificaciones se intentan para caer dentro del alcance de las reivindicaciones reivindicadas . También debe entenderse que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácido y todos los pesos moleculares o valores de masa molecular dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para la descrpción.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un sistema de modulación de expresión genética que comprende un cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en una célula huésped, comprendiendo el cásete de expresión genética un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende : i) un dominio de transactivación; ii) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y iii) un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende al menos una mutación, en donde la mutación se encuentra en una posición equivalente o análoga a los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: a) al menos uno de 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 y 238 de la SEQ ID NO: 1, d) tanto 52 y 110 de la SEQ ID HO:l, e) tanto 107, 110 como 127 de la SEQ ID NO:l, f) tanto 52, 107 como 127 de la SEQ ID NO:l y g) tanto 107, 127 como 259 de la SEQ ID NO:l o cualquier combinación de los mismos. 2. El sistema de modulación de expresión gene 'tica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un segundo dominio de unión a ligando del receptor nuclear del grupo que consiste de un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de invertebrado, un dominio de unión a ligando de la proteina de espiráculo y un dominio de unión a ligando quimérico que comprende dos fragmentos de polipéptido, en donde el primer fragmento de polipéptido es desde un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de invertebrado o un dominio de unión a ligando de la proteina de ultraespiráculo y el segundo fragmento de polipéptido es desde un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando del receptor retinoide X de invertebrado o o un dominio de unión a ligando de la proteina de ultraespiráculos diferentes . 3. Un sistema de modulación de expresión genética qe comprende : a) un primer cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende : i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y ii) un dominio de unión a ligando del receptor nuclear; y b) un segundo cásete de expresión genética que es capaz de expresarse en la célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende : i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando del receptor nuclear en donde uno de los dominios de unión a lugando del receptor nuclear es un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende al menos una mutación, en donde la mutación se encuentra en una posición equivalente a o análoga a los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: a) al menos uno de 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 y 238 de la SEQ ID N0:1, b) tanto 96 como 119 de la SEQ ID NO:l, c) tanto 110 como 128 de la SEQ ID NO:l, d) tanto 52 como 110 de la SEQ ID NO:l, e) todos los tres de 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l, f) todos los tres de 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l h g) todos los tres de 107, 127 y 259 de la SEQ ID NO:l o cualquier combinación de los mismos. 4. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H es desde un receptor nuclear del Grupo H del grupo que consiste de un receptor de ecdisona, , un receptor oblicuo, un receptor 1 orfano, un receptor 1 nuclear de la hormona esteroide, un receptor retinoide X que interactúa con la proteina 15, un receptor ß de hígado X, un receptor de hormona esteroide similar a la proteina, un receptor de hígado X, un receptor a de hígado X, un receptor franesoide X, un receptor que interactúa con la proteína 14 y un receptor de farnesol. 5. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H se codifica mediante un polinucleótido que comprende al menos una mutación que resulta en al menos una mutación de un residuo de aminoácido, en donde el residuo de aminoácido se encuentra al menos en una posición equivalente a o análoga : a) al menos un residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 9G, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 y 238 de la SEQ ID NO:l, b) tanto los residuos de aminoácido 96 como 119 de la SEQ ID NO:l, c) tanto los residuos de aminoácido 110 como 128 de la SEQ ID N0:1, d) tanto los residuos de aminoácido 52 como 110 de la SEQ ID NO:l, e) todos los tres residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l, f) todos los tres residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO: 1 o g) todos los tres residuos de aminoácido 107, 127 y 259 de la SEQ ID NO:l o cualquier combinación de los mismos. 6. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H compreden una mutación por sustitución que es un dominio de unión de ligando del receptor de ecdisona. 7. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la mutación se selecciona del grupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N,

F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P,
T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M,
R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M,
F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P,
M125R, M125E, M125L, M125C, M125 , M125G, M125I, M125N,
M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K,
M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I,
L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 y V1071/Y127E/A110P de la SEQ ID NO:l. 8. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde el dominio de unión a ADN se selecciona del grupo que consiste de un dominio de unión a ADN del receptor de ecdisona, un dominio de unión a ADN de GAL4 u un dominio de unión a ADN de LexA.
9. El sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde el dominio de transactivación se selecciona del grupo que consiste de un dominio de transactivación del receptor de ecdisona, un dominio de transactivación de VP16, un dominio de transactivación del activador B42 acidico y un dominio de transactivación p65.
10. ün polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende al menos una mutación, cuando el polinucleótido aislado comprende al menos una mutación que resulta en al menos una mutación de un residuo de aminoácido en una posición equivalente a o análoga a a) al menos un residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 y 238 de la SEQ ID NO:l, b) tanto los residuos de aminoácido 96 como 119 de la SEQ ID NO:l, c) tanto los residuos de aminoácido 110 como 128 de la SEQ ID NO:l, d) tanto los residuos de aminoácido 52 como 110 de la SEQ ID NO:l, e) todos los tres residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l, f) todos los tres residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l o g) todos los tres residuos de aminoácido 107, 127 y 259 de la SEQ ID NO:l o cualquier combinación de los mismos.
11. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la mutación resulta en una mutación seleccionada del grupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, 54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96 , V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, 125G, M125I, M125N, 125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 y V1071/Y127E/A110P de la SEQ ID NO:l.
12. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 10 enlazado de manera operativa a un elemento regulador de transcripción.
13. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12, en donde el elemento regulador de transcripción es operativo en la célula huésped.
14. Un polipéptido aislado codificado porel polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10.
15. Un polipéptido aislado que comprende un dominio de unión a ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende al menos una mutación, en donde la mutación se encuentra a una posición equivalente a o análoga a a) al menos un residuo de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 y 238 de la SEQ ID NO:l, b) tanto los residuos de aminoácido 96 como 119 de la SEQ ID NO:l, c) tanto los residuos de aminoácido 110 como 128 de la SEQ ID NO:l, d) tanto los residuos de aminoácido 52 como 110 de la SEQ ID NO:l, e) todos los tres residuos de aminoácido 107, 110 y 127 de la SEQ ID NO:l," f) todos los tres residuos de aminoácido 52, 107 y 127 de la SEQ ID NO:l o g) todos los tres residuos de aminoácido' 107, 127 y 259 de la SEQ ID NO:l o cualquier combinación de los mismos.
16. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la mutación se selecciona delgrupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, 151M, 151N, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52 , T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95 , V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, 125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, 219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, 238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V1071/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 y V1071/Y127E/A110P de la SEQ ID NO:l.
17. Un método para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión genética de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3; y b) introducir en la célula huésped un ligando; en donde el gen a modularse es un componente de un cásete de expresión genética que comprende : i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN; ii) un pomotor que se activa por el dominio de transactivación; y iii) un gen cuya expresión se va a modular; por medio de lo cual en la introducción del ligando en la célula huésped, la expresión del gen de b)iii) se modula.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste de: a) un compuesto de la fórmula: en donde : E es un alquilo (C4-C12) ramificado o alquenilo (C4-C12) ramificado que contiene un carbono terciario o un ciano alquilo (C3-C12) que contiene un carbono terciario; R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C°CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2; R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C°CH, 1-propinilo, 2- propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, Net2 SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN o unidos con R3 y los carbonos fenilo a los cuales R2 y R3 se unen para formar un etilenodioxi, un anillo de dihidrofurilo con el oxigeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo de dihidropirilo con el oxigeno adyacente a un carbono de fenilo; R3 es H, Et o unido con R2 y los carbonos de fenilo a los cuales R2 y R3 se unen para formar un etilenodioxi, un anillo de dihidrofurilo con el oxigeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo de dihidropirilo con el oxigeno adyacente a un carbono de fenilo; R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, Cl, Br, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CN, C°CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o Set; b) un compuesto de la fórmula: en donde : Rl es CH2CH3, CH3 o CH3; R2 es OCH3, CH2CH3 o i-Pr; y R3 y R4 son CH3; c) un compuesto de la fórmula en donde: Rl y R2 son F; y R3 es 3-F-4-CH3-Ph o 3-CH3-4-Ph; y d) una ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponastrona ?, muristerona A, un oxiesterol, un 22® hidroxicolesterol, 24 (S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato, 7-quenocolesterol-3-sulfato, farnesol, un ácido biliar, un 1, 1-bifosfonato éster o una hormona III Juvenil.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en donde el segundo ligando es ácido 9-cis-retinóico o un análogo sintético de un ácido retinóico.
20. Una célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de expresión genética de acuerdo con la reivindicaión 1 o la reivindicación 3.
21. Un organismo no humano que comprende la célula huésped de la reivindicación 20.