MXPA06005993A - Proteinas secretadas inhibidoras de la apoptosis neuronal. - Google Patents

Abstract

Se identifico un nuevo neuroprotector por analisis de micromatrices que se expresa de forma diferente en la zona ventricular y la corteza del cerebro del feto y adulto humano. La proteina secretada antagoniza la accion de Wnt en embriones de Xenopus. Se describen metodos para modular la neurotoxicidad en radicales libres poniendo en contacto las celulas con la proteina, tratar enfermedades neuronales asociadas con la muerte celular mediada por radicales libres administrando la proteina, determinar objetivos genomicos neuroprotectores asociados con rutas de toxicidad de radicales libres seleccionadas mediante cribado con la proteina, y usar la proteina para identificar otros compuestos que modulan la actividad biologica de la proteina secretada y la maquinaria celular que reacciona con la proteina secretada.

Description

PROTEÍNAS SECRETADAS INHIBIDORAS DE LA APOPTOSIS NEURONAL Campo de la invención Esta invención está en el campo de la biología molecular y en particular se refiere a la identificación de un nuevo neuroprotector que es capaz de modular los efectos de la muerte celular mediada por radicales libres.

Antecedentes de la invención Las moléculas señalizadoras extracelulares tienen papeles esenciales como inductoras de la proliferación, migración, diferenciación y morfogénesis tisular celular, durante el desarrollo normal (Finch et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:6770-75). Además, dichas moléculas funcionan como reguladoras de la apoptosis, la muerte celular programada que juega un papel significativo en el desarrollo y funcionamiento normal de los organismos multicelulares. Cuando se desregulan, las moléculas señalizadoras y la apoptosis están implicados en la patogénesis de numerosas enfermedades, véase por ejemplo, Thompson, Science (1995) 267:1456-1462. La apoptosis está implicada en una variedad de sucesos biológicos normales y patógenos, y puede ser inducida por varios estímulos no relacionados. Estudios recientes de la apoptosis han sugerido que una ruta metabólica común que conduce a la muerte celular puede ser iniciada por una amplia variedad de señales, que incluyen hormonas, falta de factor de crecimiento en el suero, agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante e infección por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), (Wyllie, Nature (1980) 284:555-556; Kanter et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1984) 118:392-399; Duke & Cohén, Lymphokine Res. (1986) 5:289-299; Tomei et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1988) 155:324-331 ; Kruman et al., J. Cell. Physiol. (1991) 148:267-273; Ameisen & Capron, Immunol. Today (1991) 12:102-105; y Sheppard & Ascher, J. AIDS (1992) 5:143-147). Por lo tanto, los agentes que afectan al control biológico de la apoptosis tienen utilidad terapéutica en numerosas indicaciones clínicas.

Aunque recientemente se han identificado y clonado muchos genes y familias de genes que participan en diferentes etapas de la apoptosis, debido a que las rutas de la apoptosis todavía no se han trazado claramente, están a la espera de ser descubiertos muchos genes y productos génicos nuevos Un grupo de moléculas que se sabe que juega un papel significativo en la regulación del desarrollo celular son la familia de proteínas Wnt. Las Wnt son codificadas por una gran familia de genes, cuyos miembros se han encontrado en gusanos, insectos, peces cartilaginosos y vertebrados. Se cree que las Wnt funcionan en una variedad de procedimientos de desarrollo y fisiológicos, puesto que muchas especies diferentes tienen múltiples genes Wnt conservados (McMahon, Trends Genet. (1992) 8:236-242; y Nusse & Varmus, Cell (1992) 69:1073-1087). Los genes Wnt codifican glicoproteínas secretadas que se cree que funcionan como señales paracrinas o autocrinas activas en varios tipos de células primitivas (McMahon (1992) y Nusse & Varmus (1992), véase antes). La familia del factor de crecimiento Wnt incluye más de 10 genes en el ratón (Wnt-1 , 2, 3a, 3b, 4, 5a, 5b, 6, 7a 7b, 8a, 8b, 10b, 11 , 12) (véase, por ejemplo, Gavin et al., Genes Dev. (1990) 4: 2319-2332; Lee et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92:2268-2272; y Christiansen et al., Mech. Dev. (1995) 51 :341-350) y al menos 7 genes en el ser humano (Wnt-1 , 2, 3, 4, 5a, 7a y 7b) (véase, por ejemplo., Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol. (1984) 4:2532-2534). La identificación de los receptores de Wnt estaba dificultada por la insolubilidad relativa de las proteínas Wnt, que tienden a permanecer fuertemente unidas a las células o a la matriz extracelular.Sin embargo, ahora varias observaciones indican que miembros de la familia de moléculas Frizzled (FZ) pueden funcionar como receptores para las proteínas Wnt o como componentes de un complejo receptor de Wnt (He et al., Science (1997) 275:1652-1654). Cada miembro de la familia de genes de receptores FZ codifica una proteína de membrana integral con una parte extracelular grande, siete dominios transmembrana putativos y una cola citoplasmática, véase, por ejemplo, Wang et al., J. Biol. Chem. (1997) 271 :468-76). Cerca del extremo NH2 de la parte extracelular hay un dominio rico en cisteína (CRD) que está bien conservado entre otros miembros de la familia de FZ. El CRD, compuesto de aproximadamente 10 restos de aminoácidos, incluyendo 110 cisteínas invariantes, es el sitio de unión putativo para los ligandos Wnt (Bhanot et al., Nature (1996) 382:25-30). Hay 10 genes conocidos en la familia de receptores FZ. La mayoría de las señales de Wnt-Fz son mediadas por la inhibición de la glicógeno-sintasa-quinasa (GSK3 ß) y la acumulación de ß -catenina en el núcleo.

La ß -catenina activa al c-myc lo cual puede conducir a la apoptosis de algunas células. Por lo tanto, la señalización de Wnt a través de FZ1 y FZ2 y el mantenimiento de la ß -catenina, pueden conducir a la muerte celular, especialmente en células inmaduras en el cerebelo. Además, la sobreexpresión de FZ1 y FZ2, y de ?-catenina puede inducir a la apoptosis. Sin embargo, algunas rutas de señalización de Wnt-FZ son independientes de la /?-catenina. Finalmente, Wnt transmite su señal dejando que la /?-catenina se acumule en el citoplasma de la célula. Allí, la ß -catenina se une a miembros de la familia del factor de transcripción Tcf-Lef y se transloca al núcleo. Cuando Wnt está ausente, la ?-catenina en su lugar forma un complejo con GSK3 y con la proteína supresora de tumor adenomatous polyposis coli (APC). Esta interacción está asociada con la fosforilación de la .-catenina, que la marca para la ubiquitinación y degradación. Wnt permite la acumulación de ?-catenina por inhibición de la función de GSK3. La existencia de moléculas que tienen un CRD FZ pero carecen del patrón de siete dominios transmembranales y cola citoplasmática, sugería que había una familia de proteínas que funcionaban como reguladoras de la actividad de Wnt. Las proteínas relacionadas con frizzled solubles (SFRP), por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico con número de acceso AF056087, están relacionadas con las proteínas secretadas relacionadas con la apoptosis (SARP) y comprenden una familia de moléculas secretadas que contienen un dominio CRD altamente homogéneo con el CRD de FZ (Finch et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:6770-6775). Las SARP bloquean la señalización de Wnt interaccionando con Wnt o formando complejos homoméricos no funcionales con FZ unido a la membrana. Parece que la desregulación de las rutas de Wnt, es un factor tanto en el crecimiento como en el desarrollo aberrante. Dada la potencial complejidad de las interacciones entre los múltiples miembros de las familias de Wnt y FZ, deben existir mecanismos adicionales para modular los sucesos regulados por Wnt (por ejemplo, la apoptosis) durante periodos específicos del desarrollo, o en algunos tejidos durante el desarrollo/daño de la enfermedad. La identificación de dichos mecanismos, y en particular de los ejecutores de dichos mecanismos, es importante para entender y modular el procedimiento de la regulación celular. Neurotoxicidad de los radicales libres El óxido nítrico (NO) es una molécula mensajera biológica ampliamente extendida y multifuncional. El NO puede jugar un papel no sólo en funciones fisiológicas normales, tales como liberación de neurotransmisores, desarrollo neural, regeneración, plasticidad sináptica y regulación de la expresión génica, si no también una variedad de trastornos neurológicos en los que la producción excesiva de NO conduce al daño neuronal (Yun et al., Mol. Psychiatr. (1997) 2:300-310). El NO se forma cuando la L-arginina se oxida a cirulina por acción de la enzima óxido-nítrico-sinatasa (NOS). Aunque el propio NO es un radical libre que tiene un electrón desapareado, parece que no participa en ninguna reacción química significativamente dañina o dañina para sí mismo. Sin embargo, cuando reacciona con un anión superóxido, se forma el extremadamente reactivo y potente oxidante peroxinitrito (ONOO") (<www.gsdl.com/news/1999/1990302/index>, última visita, 12 de Noviembre de 2002). La neurotoxicidad mediada por el receptor del N-metil-D-aspartato (NMDA) puede depender, en parte, de la generación del peroxinitrito (OONO") a través del NO (Lipton et al., Nature (1993) 364(6438):626-632). Se cree que esta forma de neurotoxicidad contribuye a una ruta de daño común final en una amplia variedad de trastornos neurológicos agudos y crónicos, incluyendo la isquemia focal, trauma, epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, demencia en el SIDA, y otras enfermedades neurodegenerativas (Bonfoco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92:7162- 7166). Además, el peroxinitrito se ha implicado en una variedad de sucesos intraneuronales dañinos que incluyen roturas de cadenas de ADN, desaminación de ADN, nitración de proteínas incluyendo la superóxido-dismutasa y daño al complejo mitocondrial I (www.gsdl.com/news/1999/1990302/index, última visita el 12 de Noviembre de 2002). De hecho, se ha mostrado que el ONOO" produce muerte neuronal. Se ha propuesto que dicha muerte neuronal se produce en diferentes trastornos del SNC tales como isquemia cerebral, demencia asociada con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica etc. (Moro et al., Neuropharmacology (1998) 37(8): 1071-1079). Además, el exceso de glutamato que actúa a través de los receptores de NMDA media en la muerte celular en la isquemia cerebral focal (Yun et al. (1997), véase antes). La neurotoxicidad del glutamato también puede jugar un papel en las enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Huntington y enfermedad de Alzheimer (Yun et al. (1997) véase antes). Por lo tanto, dependiendo del absceso, el NMDA o el óxido nítrico/superóxido, puede dar como resultado el daño celular neuronal apoptótico. Se ha mostrado que la muerte mediada por el receptor de NMDA es potenciada por el cocultivo de células granulares cerebrales (CGC) con células de microglía inmunoestimuladas (Hewett et al., Neuron (1994) 13(2):487-494; Kim et al., J. Neurosci. Res. (1998) 54(1 ): 17-26), insinuando así que el NOS inducible juega un papel en este tipo de neurotoxicidad. Además, esta potenciación era mimetizada por el liberador de NO, la 3-morfolinosidnonimina (SIN-1 ). Además, dicha potenciación/intensificación de la neurotoxicidad del NMDA y la intensificación mimetizada por los generadores de NO (por ejemplo, la SIN-1 o S-nitroso-N-acetilpenicilamina: SNAP) parece que es bloqueada por la inhibición del NOS o antioxidantes (superóxido-dismutasa/catalasa) (Hewett et al. (1994) véase antes; Kim et al. (1998) véase antes). En contraste, el tratamiento de CGC con inhibidores de NOS no era capaz de rescatar dichas células después de exposición a la ceramida (Monti et al., Neurochem. Int. (2001 ) 39(1 ):11-18; Nagano et al., J. Neurochem. (2001) 77(6): 1486-1495). Además, la apoptosis observada por exposición a la ceramida no puede implicar la acción de receptores de NMDA (Centeno et al., Neuroreport (1998) 9(18):4199-4203; Moore et al., Br. J. Pharmacol. (2002) 135(4): 1069-1077).

Considerados juntos, los datos sugieren que la acción de la ceramida no depende principalmente de la producción de NO, y que la ceramida y los generadores de NO tales como SIN-1 o SANP inducen la apoptosis por rutas separadas. Por lo tanto, dado el número de enfermedades asociadas con el NMDA/peroxinitrito (véase antes), serían valiosas moléculas selectivas para rescatar las células expuestas a SIN-1 , tal como neurotoxinas, como agentes antiapoptosis selectivos, y útiles en modalidades de tratamiento eficaces donde el NMDA/peroxinitrito están asociados con la enfermedad neurológica. Los autores de la invención han identificado una Proteína secretada inhibidora de la apoptosis neuronal (SNAIP) que es neuroprotectora y protege selectivamente frente a la toxicidad , por ejemplo, de SIN-1 , pero no de la ceramida C2.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un método para modular la apoptosis inducida por el peroxinitrito en células neuronales, que comprende poner en contacto dichas células con proteínas secretadas inhibidoras de la apoptosis neuronal (SNAIP). En un aspecto relacionado el método comprende la adición de heparina. En otro aspecto relacionado, el método modula la apoptosis inducida por glutamato/NMDA. La invención también se refiere a las rutas apoptóticas que comprenden la inducción de genes seleccionados incluyendo genes MAPK p38 y genes inducibles por parada del crecimiento y por daño en el ADN (es decir, GADD). Además, la presente ¡nvención se refiere a un método para proteger neuronas de la muerte celular mediada por radicales libres asociada al peroxinitrito, que comprende poner en contacto dichas células con SNAIP. Además, la invención se refiere a un método para determinar objetivos genómicos neuroprotectores asociados con la ruta de toxicidad del peroxinitrito. En un aspecto relacionado, dicho método puede incluir las etapas de poner en contacto células neuronales con o sin una SNAIP, poner en contacto dichas células con un inductor de peroxinitrito, determinar la modulación de la expresión génica en las células expuestas, e identificar los genes que son moduladores en presencia o ausencia de una SNAIP y el inductor. Dicho método se concibe para identificar genes y correlacionar dichos genes con la inhibición de la apoptosis inducida por las acciones del peroxinitrito inducido. En un aspecto relacionado, dicho método también comprende poner en contacto células con heparina. En un aspecto adicional relacionado, el inductor es SiN-1. La presente invención también se refiere a un método para tratar enfermedades neuronales asociadas con la muerte celular mediada por radicales libres, que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de una SNAIP, cuando la muerte celular es la apoptosis. En un aspecto relacionado, entre las enfermedades asociadas con la apoptosis se incluyen la enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, isquemia cerebral focal, demencia asociada con SIDA, esclerosis lateral amiotrófica, daño en la médula espinal, daño cerebral traumático, ataque de apoplejía y enfermedad de Alzheimer. En un aspecto relacionado, la modalidad de tratamiento incluye la administración de heparina. En otro aspecto de la ¡nvención, se describen métodos terapéuticos para modular la expresión de SNAIP, que incluyen la administración de péptidos, agonistas, antagonistas, agonistas inversos y/o anticuerpos, a un paciente que lo necesite. También, se puede usar una SNAIP para identificar moléculas que se unen a FZ. Esas moléculas pueden ser agonistas, antagonistas, simplemente acoplarse a FZ, pero preferiblemente un antagonista para minimizar la señalización de Wnt para evitar la apoptosis. En otro aspecto de la invención, se describen métodos para identificar moduladores de una SNAIP, que comprende las etapas de proporcionar un resto químico, que proporciona una célula que expresa una SNAIP o una SNAIP purificada, y determinar si el resto químico se une a una SNAIP. En un aspecto relacionado, entre los restos químicos se pueden incluir, pero no se limitan, péptidos, anticuerpos y moléculas pequeñas. Otro aspecto de la ¡nvención incluye composiciones terapéuticas, donde dichas composiciones incluyen ácidos nucleicos, anticuerpos, polipéptidos, agonistas, agonistas inversos y antagonistas. Además, los métodos de la invención también incluye métodos para tratar estados patológicos administrando dichas composiciones terapéuticas a un paciente que lo necesite. El agente activo puede ser una molécula identificada usando una SNAIP o la propia SNAIP. Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Además, en esta memoria se presentan varias referencias, que describen con más detalle algunos procedimientos o composiciones. Cada una de esas referencias se incorpora en su totalidad en la presente memoria como referencia, como si se indicara la incorporación individual de cada una de ellas.

Descripción detallada de la invención La proteína de la presente invención es aproximadamente 60% idéntica por homología con una familia de proteínas llamada proteínas secretadas relacionadas con la apoptosis (SARP, por sus siglas en inglés). Los autores de la invención han localizado la expresión de la molécula en el cerebro donde aparece con mayor abundancia en el cerebro fetal que en el adulto. La proteína se ha identificado en el cerebro anterior y cerebro medio y en la región posterior de los ojos en el adulto, pero no en la zona donde se descubrió, la zona ventricular. No ha habido una asociación detallada entre la proteína y ningún tipo de célula dada. Parece que la proteína es antiapoptótica. La SNAIP protege a las neuronas de la muerte celular mediada por radicales libres. Por lo tanto, en una realización, una SNAIP y su regulación, son los objetivos para el descubrimiento de fármacos para la intervención terapéutica en enfermedades neurodegenerativas que incluyen, pero no se limitan, la enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, isquemia cerebral focal, demencia asociada con SIDA, esclerosis lateral amiotrófica, daño en la médula espinal, daño cerebral traumático, ataque de apoplejía, y enfermedad de Alzheimer. La generación desregulada de exceso de NO puede iniciar una cascada neurotóxica. Según parece, el NO mata las neuronas a través del peroxinitrito. Se cree que este poderoso oxidante está implicado en la mayor parte de la neurotoxicidad mediada por el NO. Además el peroxinitrito se puede descomponer en radicales hidroxilo y dióxido de nitrógeno, que también son muy reactivos y biológicamente destructores, y conducen a una variedad de trastornos neurológicos que vienen de la producción excesiva de NO. Por ejemplo, el NO derivado de las neuronas juega un papel importante en la mediación de la muerte celular neuronal después de isquemia focal. En las últimas etapas de la isquemia cerebral (>6h), la inflamación postisquémica induce la expresión de ¡NOS, y la generación sostenida de grandes cantidades de NO conduce al daño neuronal retrasado (Yun et al. (1997) véase antes). En un aspecto relacionado, la 3-nitrotirosina (3-NT) es un marcador específico de la nitración de proteínas por el peroxinitrito (ONOO") producido a partir de NO y superóxido. Se describió el aumento de prote+na que contenía 3-NT (proteína 3-NT) en cerebros de pacientes con algunos trastornos neurodegenerativos (Yamamoto et al., J. Neural. Transm. (2002) 109(1 ): 1-13). Por lo tanto, en una realización, se usa la 3-NT como marcador para identificar las rutas asociadas con una SNAIP. En un aspecto relacionado adicional, la activación de una ruta de proteína-quinasa activada por mitógeno (MAPK) por el NO, puede ser una clave de como el NO regula el crecimiento, diferenciación, supervivencia y muerte neuronal. Puesto que las rutas señalizadoras de las MAPK juegan un papel central en la respuesta al factor de crecimiento (ERK)o respuesta al estrés (JNK, MAPK p38) en el sistema nervioso, la señalización de NO-MAPK puede ser la base del papel del NO en la supervivencia, diferenciación y muerte celular neuronal apoptótica durante el desarrollo neuronal y enfermedad/daño (Yun et al. (1997) véase antes). Se encontró que un generador de peroxinitrito, la 3-morfolinosidonimina (SIN-1 ), inducía la expresión de tres ARNm diferentes inducibles por parada de crecimiento y daño al ADN (GADD), GADD34, GADD45, y GADD153, en la fase temprana durante la muerte celular en células de neuroblastoma humano SH- SY5Y. El peroxinitrito también activa la MAPK p38. La expresión de los tres genes GADD y también la fosforilación por la MAPK p38, fueron suprimidos por el tratamiento con depuradores de radicales, superóxido-dismutasa más catalasa, y glutatión (Ohashi et al., Free Radie. Biol. Med. (2001) 30(2):213-221). Por lo tanto, en una realización, la ruta de interés comprende GADD34, GADD45, GADD153 y MAPK p38. La SNAIP es neuroprotectora y protege selectivamente frente a la toxicidad por SIN-1 , pero no por ceramida C-2. La SNAIP es liberada por las células en el medio, particularmente en presencia de heparina. En un aspecto relacionado, los generadores de NO, tales como SIN-1 o SANP y ceramida, inducen la apoptosis por rutas separadas. En una realización preferida, la SNAIP protege selectivamente frente a la apoptosis inducida por NMDA. La presencia de una SNAIP en esos y otros tejidos sugiere que la SNAIP está implicada en una variedad de estados patológicos del sistema nervioso que implican diferentes trastornos neurodegenerativos. La identificación de una SNAIP en esos tejidos y la clonación del gen que codifica una SNAIP proporciona una variedad de enfoques terapéuticos para regular la expresión y actividad de la SNAIP, para proporcionar así enfoques terapéuticos para tratar enfermedades que implican a la SNAIP.

La SNAIP humana sólo tiene 60% de los aminoácidos idénticos a, y no está relacionada con, la familia de moléculas de proteínas secretadas relacionadas con la apoptosis (SARP) que tienen ciertas características estructurales y funcionales conservadas. El término "familia", cuando se refiere a las moléculas de proteína y ácidos nucleico de la invención, se pretende que signifique dos o más moléculas de proteínas o ácidos nucleicos que tienen un dominio estructural común en conjunto y que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos suficiente como se define en la presente memoria. Dichos miembros de la familia pueden ser naturales y pueden ser de la misma o de diferentes especies. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano y un homólogo de dicha proteína de origen murino, así como una segunda proteína distinta de origen humano y un homólogo murino de esta proteína. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes. La expresión "restos de aminoácidos equivalentes" en la presente memoria significa que los aminoácidos ocupan sustancialmente la misma posición dentro de la secuencia de una proteína, cuando se alinean dos o más secuencias para analizarlas. La expresión "suficientemente idénticas" se usa en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número mínimo o suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (es decir, con una cadena lateral similar) que una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio estructural común que son aproximadamente 75% idénticas, preferiblemente 80% idénticas, más preferiblemente 85%, 95% o 98% idénticas, se definen en la presente memoria como suficientemente idénticas. Tal como se usa en la presente memoria de forma intercambiable, una "actividad de SNAIP", "actividad biológica de SNAIP" o "actividad funcional de SNAIP", se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de SNAIP, en una célula sensible a la SNAIP de acuerdo con técnicas patrón o como se enseña en la presente memoria. Una actividad de SNAIP puede ser una actividad directa, tal como una asociación con una segunda proteína, o una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción de una proteína SNAIP con una segunda proteína. En una realización preferida, una actividad de SNAIP incluye al menos una o más de las siguientes actividades: (i) la capacidad para interaccionar con proteínas en la ruta de señalización de Wnt/FZ; (¡i) la capacidad para interaccionar con un receptor de SNAIP (por ejemplo, FZ); (iii) la capacidad para interaccionar con una proteína intracelular objetivo; y (¡v) la capacidad de inducir una manifestación biológica de SNAIP. Por ejemplo, una actividad o manifestación de SNAIP incluye, pero no se limita, inhibir la unión de Wnt a FZ, determinado por medios conocidos en la técnica. De acuerdo con esto, otra realización de la invención presenta proteínas y polipéptidos de SNAIP aislados que tienen una actividad de SNAIP. En las siguientes subsecciones se describen diferentes aspectos de la invención con mayor detalle.

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la SNAIP o sus partes biológicamente activas; así como a moléculas de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican la SNAIP (por ejemplo, ARNm de SNAIP), y a fragmentos para usar como cebadores para la PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de la SNAIP. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de ácido nucleico" se pretende que incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" no tiene secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteína) que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se obtiene el ácido nucleico. Por ejemplo, en diferentes realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la SNAIP pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se obtiene el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede no tener sustancialmente otro material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes, o no tener sustancialmente precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención o un complemento de cualquiera de esas secuencias de nucleótidos, se puede aislar usando técnicas patrón de biología molecular (por ejemplo, como describen Sambrook et al., eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen SNAIP humano permite generar sondas y cebadores diseñados para usar para identificar y/o clonar homólogos de la SNAIP en otros tipos de células, por ejemplo, de otros tejidos, así como homólogos de la SNAIP de otros mamíferos. La sonda/cebador típicamente comprende oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia homosentido o antisentido de la SNAIP o de un mutante natural de la SNAIP. Las sondas basadas en la secuencia de nucleótidos de la SNAIP humana se pueden usar para detectar transcritos y secuencias genómicas que codifican proteínas similares o idénticas. La sonda puede comprender un grupo de mareaje unido a ella, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como parte de un kit de ensayo para diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan incorrectamente una proteína SNAIP, tal como midiendo los niveles de ácidos nucleicos que codifican la SNAIP en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de SNAIP o determinando si un gen SNAIP genómico ha mutado o ha sido suprimido. Se puede preparar un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa de la SNAIP" aislando un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de SNAIP (por ejemplo, inhibidora de la apoptosis), expresando la parte codificada de la proteína SNAIP (por ejemplo, por expresión recombinante), y evaluando la actividad de la parte de SNAIP codificada. Alternativamente, el fragmento se puede unir a un anticuerpo conocido para neutralizar la actividad de la SNAIP. Un experto en la técnica entenderá que dentro de una población (por ejemplo, la población humana) pueden existir polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de la SNAIP.

Dicho polimorfismo genético en el gen SNAIP puede existir entre individuos dentro de una población, debido a la variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que se encuentran de forma alternativa en un locus genético dado. Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína SNAIP, preferiblemente una proteína SNAIP de mamífero. Tal como se usa en la presente memoria, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra en un locus de la SNAIP, o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, en el que el nucleótido o polipéptido no es la forma predominante que se encuentra en una población dada. Se pueden identificar alelos alternativos por secuenciación del gen de interés en una serie de individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una variedad de individuos. Se pretende que cualquiera y todas dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones de SNAIP que son el resultado de la variación alélica natural, y que no alteran la actividad funcional de la SNAIP, estén dentro del alcance de la ¡nvención. Además, se pretende que las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas SNAIP de otras especies (homólogos de SNAIP), que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la de una SNAIP humana, estén dentro del alcance de la invención. Se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las variantes alélicas naturales y homólogos del ADNc de la SNAIP de la invención, basándose en la identidad con los ácidos nucleicos de la SNAIP humana descritos en la presente memoria, usando los ADNc humanos, o una de sus partes, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación patrón en condiciones de hibridación restrictivas. De acuerdo con esto, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la ¡nvención tiene al menos 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000 ó 1100 nucleótidos de longitud, e híbrida en condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico con actividad de SNAIP. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "híbrida en condiciones restrictivas" se pretende que describa las condiciones para la hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos que son al menos 60% (65%, 70% y preferiblemente 75% o más) idénticas entre sí, típicamente permanecen hibridadas entre sí. Dichas condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido y no limitante, de condiciones de hibridación restrictivas, es la hibridación en 6 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1%, a 50-65° C. Tal como se usa en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). Además, de las variantes alélicas naturales de la secuencia de SNAIP que pueden existir en la población, un experto en la técnica entenderá además que se pueden introducir cambios por mutación conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína SNAIP codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteína SNAIP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos "no esenciales". Un resto de aminoácido "no esencial", es un resto que se puede alterar de la secuencia salvaje de la SNAIP sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que no son conservados o son sólo semiconservados entre los SNAIP de diferentes especies, pueden no ser esenciales para la actividad, y por lo tanto serían objetivos probables para alterar. Alternativamente, los restos de aminoácidos que son conservados entre las proteínas de SNAIP de diferentes especies pueden ser esenciales para la actividad, y por lo tanto no serían objetivos probables para alterar. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas SNAIP que contienen cambios en los restos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. En una realización, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 87% idéntica, 90%, 93%, 95%, 98% o 99% idéntica a un polipéptido con actividad de SNAIP.

Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína SNAIP que tiene una secuencia variante, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de una SNAIP natural, de modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir por técnicas patrón, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones de aminoácidos conservadas en uno o más restos de aminoácidos que se prevé que no son esenciales. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Esas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, e histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido que se prevé no esencial en la SNAIP se sustituye preferiblemente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de una secuencia que codifica la SNAIP, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden cribar según su actividad biológica de SNAIP para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar de forma recombinante, y se puede determinar la actividad de la proteína. En una realización preferida, se puede ensayar en una proteína SNAIP mutante: (1 ) la capacidad para formar una proteína: las interacciones de la proteína con proteínas en la ruta de señalización de SNAIP (2) la capacidad para unirse a un receptor de SNAIP (por ejemplo, FZ); o (3) la capacidad para unirse a una proteína intracelular objetivo. Todavía en otra realización preferida, se puede ensayar en una SNAIP mutante la capacidad para modular la proliferación celular o diferenciación celular. La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias de un ácido nucleico homosentido que codifica una proteína, por ejemplo, complementarias de la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenaria, o complementaria a una secuencia de ARNm. De acuerdo con esto, un ácido nucleico antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con un ácido nucleico homosentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una cadena entera que codifica la SNAIP, o de sólo una de sus partes, por ejemplo, toda o parte de la región que codifica la proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido respecto a una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica la SNAIP. Las regiones no codificantes ("regiones 5' o 3' no traducidas o flanqueadoras") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante y que no son traducidas a aminoácidos. Una molécula antisentido se puede usar, por ejemplo, para inhibir la expresión de FZ. Un oligonucleótido antisentido, puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la ¡nvención, se puede construir usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimáticas usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido), usando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diferentes formas, diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física de la pareja formada entre los ácidos nucleicos antisentido y homosentido, por ejemplo, se pueden usar derivados de fosforotioato, derivados de fosfonato y nucleótidos sustituidos con acridina.

La presente invención también contempla otras moléculas de ARN inhibidoras, tales como moléculas de ARNi. Se configuran y usan ARN bicatenarios o en horquilla para modular la producción de SNAIP. Entre los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos antisentido y otros, se incluyen 5-fluorouracilo, 5- bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 1-metilguanina, 5-carboximet¡Iaminometil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, /?-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3 -metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, ?-D-manosilqueos¡na, 5- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, butoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxiprop¡l)-uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido respecto al ácido nucleico objetivo de interés, descrito con más detalle en la siguiente subsección).

Un ácido nucleico antisentido u otra molécula de ácido nucleico de la invención, puede ser una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico s-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario, en los que las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:6625-6641 ). El ácido nucleico antisentido u otra molécula de ácido nucleico también puede comprender un metilribonucleótido (Inoue et al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., FEBS Lett. (1987) 215:327-330). La ¡nvención también abarca ribozimas. Los ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el cual tienen una región complementaria. Por lo tanto, los ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritos por Haselhoffet al., Nature (1988) 334:585-591 )) se pueden usar para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm de SNAIP para inhibir de esta forma la traducción del ARNm de la SNAIP. Se puede diseñar un ribozima que tenga especificidad por un ácido nucleico que codifica la SNAIP, basándose en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de la SNAIP natural. Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de IVS Tetrahymena L-19 en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se va a escindir en un ARNm que codifica la SNAIP, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 4.987.071 , Cech et al.; y patente de EE.UU. No. 5.116.742, Cech et al. Alternativamente, el ARNm de la SNAIP se puede usar para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de un grupo de moléculas de ARN, véase, por ejemplo, Bartel et al., Science (1993) 261 :1411-1418. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que forman estructuras de triple hélice. Por ejemplo, La expresión del gen SNAIP se puede inhibir dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora del SNAIP (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores de SNAIP) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen SNAIP en las células objetivo, véase en general Helene, Anticancer Drug Dis. (1991 ) 6(6):569; Helene, Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992) 660:27; y Maher, Bioassays (1992) 14(12):807. En realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico de la ¡nvención se pueden modificar en el resto de base, resto de azúcar o cadena principal de fosfato, para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, se puede modificar la cadena principal de desoxirribosa-fosfato de los ácidos nucleicos para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase, Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5). Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "ácidos nucleicos peptídicos " o "PNA" se refieren a miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, miméticos de ADN, en los que la cadena principal de desoxiribosa-fosfato se sustituye por una cadena principal de pseudonucleótidos y sólo se retiene las cuatro nucleobases naturales. Se ha mostrado que la cadena principal neutra de los PNA permite la hibridación específica al ADN y ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA se puede llevar a cabo usando protocolos patrón de síntesis de péptidos en fase sólida, como describen Hyrup et al. (1996) véase antes; Perry-O'Keefe et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93:14670. Los PNA de la SNAIP se pueden usar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden usar PNA como agentes antisentido o antígenos para modular la expresión génica específica de secuencia, por ejemplo, induciendo la parada de la transcripción o traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA de SNAIP también se pueden usar, por ejemplo, en el análisis de mutaciones puntuales de pares de bases en un gen, por ejemplo, PCR limitante dirigida por PNA; como enzimas de restricción artificiales cuando se usan combinados con otras enzimas, por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup (1996) véase antes), o como sondas o cebadores para la secuencia e hibridación del ADN (Hyrup (1996) véase antes; Perry-O'Keefe et al. (1996) véase antes). En otra realización, los PNA de una SNAIP se pueden modificar, por ejemplo, para potenciar la estabilidad, especificidad o absorción celular, uniendo grupos lipófilos u otros grupos que ayudan al PNA, mediante la formación de PNA-ADN quiméricos, o usando liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocidas en la técnica. La síntesis de los PNA-ADN quiméricos se puede llevar a cabo como describen Hyrup (1996), véase antes; Finn et al., Nucleic Acids Res. (1996) 24(17):3357-63; Mag et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17:5973; y Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. (1975) 5:1119.

II. Proteínas SNAIP aisladas y anticuerpos anti-SNAIP Un aspecto de la invención se refiere a proteínas SNAIP aisladas, y sus partes biológicamente activas, así como a fragmentos de polipéptidos adecuados, para usar, por ejemplo, como inmunógenos para aumentar los anticuerpos anti- SNAIP. En una realización, se pueden aislar proteínas SNAIP nativas de células o fuentes de tejidos por un esquema de purificación adecuado usando técnicas patrón de purificación de proteínas . En otra realización, las proteínas SNAIP se producen por técnicas de ADN recombinante. Alternativamente a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente una proteína o polipéptido SNA1P usando técnicas patrón de síntesis de péptidos. Una proteína "aislada" o "purificada" o sus partes biológicamente activas, no tiene sustancialmente material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido del cual se obtiene proteína SNAIP, o no tiene sustancialmente precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetiza químicamente. La expresión "no tiene sustancialmente material celular" incluye preparaciones de proteína SNAIP en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aisla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, la proteína SNAIP que no tiene sustancialmente material celular, incluye preparaciones de SNAIP que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína que no es SNAIP (denominada también en lo sucesivo una "proteína contaminante"). Cuando la proteína SNAIP o su parte biológicamente activa se produce de forma recombinante, preferiblemente tampoco tiene sustancialmente medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20% , 10% o 5% del volumen total de la preparación de proteína. Cuando la proteína SNAIP se produce por síntesis química, preferiblemente no tiene sustancialmente precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. De acuerdo con esto, dichas preparaciones de proteína SNAIP, tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son SNAIP.

Las partes biológicamente activas de una proteína SNAIP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácido suficientemente idénticas, o que derivan de la secuencia de aminoácidos de la proteína SNAIP, que incluyen menos aminoácidos que la longitud completa de las proteínas SNAIP, y presentan al menos una actividad de una proteína SNAIP. Típicamente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o patrón con al menos una actividad de la proteína SNAIP. Una parte biológicamente activa de una proteína SNAIP puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Los polipéptidos biológicamente activos preferidos incluyen uno o más dominios estructurales de la SNAIP, identificados, por ejemplo, uno o más de sus dominios extracelulares. Además, se pueden preparar otras partes biológicamente activas, en las que se eliminen otras regiones de la proteína, por técnicas recombinantes, y evaluar una o más de las actividades funcionales de una proteína SNAIP nativa. De acuerdo con esto, una proteína SNAIP útil, es una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 88%, preferiblemente 90%, 93%, 95% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SNAIP natural, y retiene la actividad funcional de SNAIP. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con el propósito de hacer una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico).

Después se comparan los restos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótidos que en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tiene la misma longitud. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitante, de un algoritmo matemático usado para comparar dos secuencias, es el algoritmo de Karlin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87:2264, modificado tal como por Karlin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., J. Mol. Bio. (1990) 215:403. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, por ejemplo, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico de SNAIP de la invención. Las búsquedas de proteínas en BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, por ejemplo, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína SNAIP de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con el propósito de llevar a cabo la comparación, se puede usar Gapped BLAST como describen Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda iterativa que detecte relaciones lejanas entre moléculas. Altschul et al., (1997) véase antes. Cuando se usan los programas BLAST Gapped BLAST, y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST), véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido, no limitante, de un algoritmo matemático usado para comparar secuencias, es el algoritmo de Myers et al., CABIOS (1988) 4:11-17. Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de pesos de restos PAM 120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden determinar usando técnicas similares a las descritas antes, permitiendo o sin permitir huecos. Cuando se calcula el porcentaje de identidad, sólo se cuentan las correspondencias exactas. En una realización preferida, se produce la parte de unión a Wnt de interés.

Esta parte de la SNAIP se puede usar sola o fusionada con otra molécula, tal como una molécula indicadora, usando técnicas y reactivos conocidos en la técnica. De este modo, se puede usar la SNAIP soluble para regular negativamente FZ para capturar Wnt antes de que Wnt se una a FZ. En algunas células hospedantes (por ejemplo, en células hospedantes de mamíferos), se puede aumentar la expresión y/o secreción de SNAIP mediante el uso de una secuencia señal heteróloga. Por ejemplo, se puede usar la secuencia secretora gp6® de la proteína de la envuelta del baculovirus como una secuencia señal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). Entre otros ejemplos de secuencias señal heterólogas se incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California). Todavía en otro ejemplo, entre las secuencias señal heterólogas de procariotas, se incluyen la señal secretora phoA (Sambrook et al., véase antes) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey). Preferiblemente, se produce una proteína SNAIP quimérica o de fusión de la ¡nvención, por técnicas patrón de ADN recombinante. Por ejemplo, se ligan entre sí en el marco fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo usando extremos romos o extremos escalonados para el ligamiento, enzimas de restricción para proporcionar los extremos adecuados, sellado de extremos cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable o ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación por la PCR de los fragmentos génicos, usando cebadores para el anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos, que posteriormente se pueden reasociar y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase por ejemplo, Ausubel et al., véase antes). Además, en el comercio están disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican una región de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica SNAIP en dicho vector de expresión, de modo que la región de fusión esté unida en el marco a la proteína SNAIP. La presente invención también se refiere a variantes de proteínas SNAIP (es decir, proteínas que tienen una secuencia que difiere de la secuencia de aminoácidos del alelo de SNAIP natural, predominante. Dichas variantes pueden funcionar como miméticos de SNAIP. Las variantes de la proteína SNAIP se pueden generar por mutagénesis, por ejemplo, por mutación puntual discreta o por truncamiento de la proteína SNAIP. Un agonista o mimético de una proteína SNAIP retiene sustancialmente las mismas, o un subgrupo, de las actividades biológicas de la forma natural de la proteína SNAIP. Por lo tanto, se pueden incitar los efectos biológicos específicos por tratamiento de una variante de función limitada o potenciada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subgrupo de actividades biológicas de la forma natural de la proteína, puede tener menores efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma natural de las proteínas SNAIP. Se pueden identificar variantes de la proteína SNAIP mediante cribado de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes truncados, de la proteína SNAIP según la actividad de proteína SNAIP. En una realización, se genera una biblioteca variegada de variantes de SNAIP por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y es codificada por una biblioteca génica variegada. Se puede producir una biblioteca variegada de variantes de SNAIP, por ejemplo, mediante ligamiento enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas, de modo que un grupo degenerado de potenciales secuencias de SNAIP se pueda expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un grupo de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, expuestas en fagos) que contienen en él el grupo de secuencias de SNAIP. Hay una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de potenciales variantes de SNAIP a partir de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automático, y después se puede ligar el gen sintético en un vector de expresión adecuado. El uso de un grupo degenerado de genes permite suministrar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el grupo deseado de potenciales secuencias de SNAIP. En la técnica se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (Véase, por ejemplo, Narang, Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. (1984) 53:323; Itakura et al., Science (1984) 198:1056; Ike et al., Nucleic Acid Res. (1983) 11 :477). Además, las bibliotecas de fragmentos de la secuencia que codifica la proteína SNAIP se pueden usar para generar una población variegada de fragmentos de SNAIP, para cribar y posteriormente seleccionar variantes de una proteína SNAIP. En una realización, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencias codificantes, por tratamiento de un fragmento bicatenario de la PCR de una secuencia que codifica la SNAIP con una nucleasa en condiciones en las que la formación de mella sólo se produce una vez por molécula, desnaturalización del ADN bicatenario, renaturalización del ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir parejas homosentido/antisentido de diferentes productos con mella, separación de las partes monocatenarias de los dúplex vueltos a formar por tratamiento con nucleasa S1 , y ligamiento de la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, se puede obtener una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diferentes tamaños de una proteína SNAIP. Se conocen varias técnicas para el cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para el cribado de bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Dichas técnicas se pueden adaptar para el cribado rápido de bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de proteínas SNAIP. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles de análisis de alta producción, para cribar bibliotecas génicas grandes, típicamente incluyen la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformación de células adecuadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Se puede usar la mutagénesis conjunta recurrente (REM, por sus siglas en inglés), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, combinada con ensayos de cribado para identificar variantes de SNAIP (Arkin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering (1993) 6(3):327-331 ). Una proteína SNAIP, o una de sus partes o fragmentos, se puede usar como un ¡nmunógeno para generar anticuerpos que se unen a la SNAIP, usando técnicas patrón para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. La proteína SNAIP de longitud completa se puede usar, o alternativamente, la invención proporciona fragmentos peptídicos antígenos de la SNAIP, para usar como inmunógenos. El péptido antígeno de la SNAIP comprende al menos 8 (preferiblemente 10, 15, 20, ó 30) restos de aminoácidos de la SNAIP, y abarca un epítopo de la SNAIP, tal que un anticuerpo enfrentado al péptido forma un inmunocomplejo específico con la SNAIP. El epítopo se puede unir a una molécula vehículo, tal como albúmina. Típicamente, se usa un inmunógeno de SNAIP para preparar anticuerpos mediante inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el ¡nmunógeno. Una preparación inmunógena adecuada puede contener, por ejemplo, una proteína SNAIP expresada de forma recombinante o un polipéptido de SNAIP sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente ¡nmunoestimulante similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de SNAIP inmunógena induce una respuesta de anticuerpo anti-SNAIP policlonal. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-SNAIP. El término "anticuerpo" tal como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que tienen un sitio de unión del antígeno, que se unen específicamente a la SNAIP. Una molécula que se une específicamente a la SNAIP, es una molécula que se une a la SNAIP pero no se une sustancialmente a otras moléculas en la muestra, por ejemplo, una muestra biológica que contiene SNAIP de forma natural. Entre los ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina se incluyen fragmentos F(ab) y F(at>')2 que se pueden generar por tratamiento del anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a la SNAIP. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en esta memoria, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienen sólo una especie de un sitio de unión de antígeno capaz de reacción inmunológica con un epítopo particular de la SNAIP. Por lo tanto, una composición de anticuerpo monoclonal típicamente presenta una sola afinidad de unión para una proteína SNAIP particular con la cual reacciona inmunológicamente. Los anticuerpos anti-SNAIP policlonales se pueden preparar como se ha descrito antes, mediante inmunización de un sujeto adecuado con un inmunógeno de SNAIP. La valoración del anticuerpo anti-SNAIP en el sujeto inmunizado se puede seguir en el tiempo por técnicas patrón, tales como con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) usando SNAIP inmovilizada. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra la SNAIP se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre), y después purificar por técnicas conocidas, tales como cromatografía con proteína A para obtener la fracción de IgG. En un momento adecuado después de la inmunización, por ejemplo, cuando la valoración de anticuerpo anti-SNAIP es más alta, se pueden obtener células productoras de anticuerpos del sujeto, y usarlas para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas patrón, tales como la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler et al., Nature (1975) 256:495-497, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kohler et al., Immunol. Today (1983) 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal—Antibodies and Cáncer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es conocida (véase en general Current Protocols in Immunoloqy (1994) Coligan et al., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Brevemente, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de SNAIP como se ha descrito antes, y los líquidos sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se criban para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a SNAIP. Se puede aplicar cualquier de los muchos protocolos conocidos para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortales, con el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-SNAIP (véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunoloqy, véase antes; Galfre et al., Nature (1977) 266:550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Bioloaical Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); and Lerner, Yale J. Biol. Med. (1981) 54:387-402). Además, los expertos en la técnica observarán que hay muchas variaciones de dichos métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se obtiene de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden preparar hibridomas murinos por fusión de linfocitos de una ratón inmunizado con una preparación de inmunógeno de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de mieloma que sea sensible al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"). Se puede usar cualquiera de varias líneas celulares como una pareja de fusión de acuerdo con técnicas patrón, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1 , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en ATCC. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Después, las células de hibridoma que resultan de la fusión se seleccionan usando medio HAT, el cual mata las células de mieloma no fusionadas y las fusionadas de forma improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la ¡nvención se detectan cribando en los líquidos sobrenadantes del cultivo de hibridoma, los anticuerpos que se unen a SNAIP, por ejemplo, usando un ensayo ELISA patrón. Alternativamente a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo anti-SNAIP monoclonal mediante cribado de una biblioteca combinatoria de inmunoglobulina recombinante (por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos expuesta en fagos) con una SNAIP, para aislar así miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen a SNAIP. En el comercio se encuentran kits para generar y cribar bibliotecas expuestas en fagos (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n° de catálogo 27-9400-01; y Stratagene SurfZAPTPhage Display Kit, n° de catálogo 240612). Adicionalmente, se pueden encontrar ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para usar para generar y cribar bibliotecas de exposición de anticuerpos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 5.223.409; Publicación PCT n° WO 92/18619; Publicación PCT n° WO 91/17271 ; Publicación PCT n° WO 92/20791 ; Publicación PCT n° WO 92/15679; Publicación PCT n° WO 93/01288; Publicación PCT n° WO 92/01047; Publicación PCT n° WO 92/09690; Publicación PCT n° WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybrídomas (1992) 3:81-85; Huse et al., Science (1989) 246:1275-1281; y Griffiths et al., EMBO J. (1993) 25 12:725-734. Adicionalmente, los anticuerpos anti-SNAIP recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto partes humanas como no humanas, que se pueden preparar usando técnicas patrón de ADN recombinante, están dentro del alcance de la invención. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, se pueden producir por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en la Publicación PCT n° WO 87/02671 ; Publicación de patente Europea n° 184.187; Publicación de patente Europea n° 171.496 Publicación de patente Europea n° 173.494; Publicación PCT n° WO 86/01533 Patente de EE.UU. n° 4.816.567; Publicación de patente Europea n° 125.023 Better et al., Science (1988) 240:1041-1043; Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1987) 84:3439-3443; Lin et al., J. Immunol. (1987) 139:3521-3526; Sun et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1987) 84:214-218; Nishimura et al., Canc. Res. (1987) 47:999-1005; Wood et al., Nature (1985) 314:446-449; Shaw et al., J. Nati. Cáncer. Inst. (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi et al., Bio/Techniques (1986) 4:214; Patente de EE.UU. n° 5,225,539; Jones et al., Nature (1986) 321 :552-525; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534; y Beidler et al., J. Immunol. (1988) 141 :4053-4060. Son particularmente convenientes los anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Dichos anticuerpos se pueden producir usando ratones transgénicos que no pueden expresar los genes de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan de la forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o parte de la SNAIP. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno, usando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos, durante la diferenciación de linfocitos B se reordenan, y posteriormente experimentan mutación por cambio de clase y somática. Por lo tanto, usando dicho epítopo, se identifica, por ejemplo, un anticuerpo que inhibe la actividad de la SNAIP. La cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo no humano se clonan y se usan para crear fragmentos Fab expuestos en fagos. Por ejemplo, el gen de la cadena pesada se puede clonar en un vector plasmídico, de modo que la cadena pesada pueda ser secretada por bacterias. El gen de la cadena ligera se puede clonar en un gen de proteína de revestimiento de fago, de modo que la cadena ligera pueda ser expresada en la superficie del fago. Se puede usar un repertorio (colección aleatoria) de cadenas ligeras humanas fusionadas con fago, para infectar las bacterias que expresan la cadena pesada no humana. Los fagos progenie resultantes exponen anticuerpos híbridos (cadena ligera humana/cadena pesada no humana). El antígeno seleccionado se usa en un cribado para seleccionar el fago que se une al antígeno seleccionado. Puede ser necesario llevar a cabo varias veces la selección para identificar dicho fago. Después, se aislan los genes de la cadena ligera humana del fago seleccionado que se une al antígeno seleccionado. Estos genes de la cadena ligera humana seleccionados se usan después para guiar la selección de los genes de la cadena pesada humana como sigue. Los genes de la cadena ligera humana seleccionados se insertan en vectores para la expresión en bacterias. Las bacterias que expresan las cadenas ligeras humanas son infectadas por un repertorio de cadenas pesadas humanas fusionadas a fagos. Los fagos progenie resultantes exponen anticuerpos humanos (cadena ligera humana/cadena pesada no humana). Después, el antígeno seleccionado se usa en un cribado con batea para seleccionar el fago que se une al antígeno seleccionado. El fago seleccionado en esta etapa expone un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal no humano seleccionado original. Los genes que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras se aislan fácilmente, y se pueden manipular posteriormente para producir anticuerpos humanos. La tecnología es descrita por Jespers et al. (Bio/Technology (1994) 12:899-903). Se puede usar un anticuerpo anti-SNAIP (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar la SNAIP por técnicas patrón, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-SNAlP puede facilitar la purificación de la SNAIP natural de las células y de la SNAIP producida de forma recombinante y expresada en células hospedantes. Además, un anticuerpo anti- SNAIP se puede usar para detectar la proteína SNAIP (por ejemplo, en un lisato celular o líquido sobrenadante celular) para evaluar la abundancia o el patrón de expresión de la proteína SNAIP. Los anticuerpos anti-SNAIP se pueden usar para diagnóstico para seguir los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Entre los ejemplos de sustancias detectables se incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales biolum?niscentes y materiales radiactivos. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, galactosidasa o acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de complejos de grupos prostéticos se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados se incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo, una proteína fluorescente dada o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol; entre los ejemplos de materiales bioluminiscentes se incluyen luciferasa, luciferina, y ecuorina, y entre los ejemplos de materiales radiactivos adecuados se incluyen 125l, 131l, 35S o 3H. Las moléculas de SNAIP se pueden analizar, por ejemplo, por cristalografía de rayos X, para apreciar la estructura, por ejemplo, de la parte que se une a Wnt. Con esta información estructural, el experto puede construir moléculas sintéticas que se unen a Wnt. Dichas moléculas miméticas de SNAIP se pueden preparar a partir de cualquiera de una variedad de unidades estructurales, incluyendo aminoácido, nucleótidos, azúcares, moléculas orgánicas y similares, y sus combinaciones. Las moléculas de SNAIP también se pueden usar como inmunógenos para aumentar los anticuerpos que tienen conformaciones que mimetizan Wnt. Dichos anticuerpos, al igual que los anticuerpos aumentados directamente con FZ, se unirán a FZ e impedirán que Wnt se una a FZ. Preferiblemente, dichos anticuerpos no incitan la activación de FZ. lll. Vectores de expresión recombinante y células hospedantes Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica la SNAIP (o una de sus partes). Tal como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular, en el que se pueden unir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden unir segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico, debido a la mayor capacidad de un genoma vírico. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedante cuando se introducen en la célula hospedante, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedante. Además, algunos vectores, vectores de expresión, pueden dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de modo operativo. En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante, con frecuencia están en forma de plásmidos (vectores) Sin embargo, la invención se pretende que incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados que tienen funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante. Esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a usar para la expresión, que están unidas de forma operativa al ácido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresión recombinante, "unido de forma operativa" se pretende que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vivo, o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión "secuencia reguladora" se pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, por Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzvmoloqy, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de la secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica entenderán que el diseño del vector de expresión puede depender de muchos factores tales como la elección de la célula hospedantes que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la ¡nvención se pueden introducir en células hospedantes para producir así proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria (por ejemplo, proteínas SNAIP, formas mutantes de SNAIP, proteínas de fusión, etc.). Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de SNAIP en células procariotas o eucariotas, por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células hospedantes adecuadas son discutidas con más detalle por Goeddel, véase antes. Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, usando, por ejemplo, secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. La expresión de proteínas en procariotas, se lleva a cabo con más frecuencia en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión tienen típicamente tres propósitos: 1 ) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación de afinidad. Con frecuencia, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante, para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posteriormente a la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimientos cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Entre los vectores de expresión de fusión típicos se incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith et al., Gene (1988) 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión-5-transferasa (GST), proteína E de unión a la matosa o proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante objetivo. Entre los ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión, inducibles, adecuados, se incluyen pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzvmoloqy, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:60-89). La expresión del gen objetivo del vector pTrc se basa en la transcripción de la ARN-polimerasa del hospedante a partir de un promotor de fusión híbrido trp-Iac. La expresión del gen objetivo del vector pET 11d, se basa en la transcripción de un promotor de fusión gnl-lac T7 mediada por una ARN-polimerasa vírica coexpresada (T7 gnl). Esta polimerasa vírica es suministrada por las cepas del hospedante BL21 (DE3) o HMS 174(DE3) de un profago ? residente que alberga un gen T7 gal bajo control transcripcional del promotor lacUV 5. Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli, es expresar la proteína en una bacteria hospedante con una capacidad reducida para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión, de forma que los codones individuales para cada aminoácido sean los usados preferiblemente por E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118). Dicha alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se puede llevar a cabo por técnicas patrón de síntesis de ADN. En otra realización, el vector de expresión de SNAIP es un vector de expresión de levadura. Entre los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae se incluyen pYepSecl (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229- 234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Alternativamente, la SNAIP se puede expresar en células de insecto usando vectores de expresión baculovirus. Entre los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf9) se incluyen las series pAc (Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165) y las series pVL (Luckiow et al., Virology (1989) 170:31-39). Todavía en otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Entre los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos se incluyen pCDMd (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195). Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión con frecuencia son proporcionadas por elementos reguladores víricos.

Por ejemplo, los promotores usados normalmente se obtienen del virus del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simio. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, véase los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., véase antes.

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico de manera preferente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). En la técnica se conocen elementos reguladores específicos de tejido. Entre los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados se incluyen el promotor de la albúmina (específico del hígado; Pinkert et al., Genes Dev. (1987) 1 :268-277), promotores específicos linfoides (Caíame et al., Adv. Immunol. (1988) 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto et al., EMBO J. (1989) 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al., Cell (1983) 33:729-740; Queen et al., Cell (1983) 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, los promotores de neurofilamentos; Byrne et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al., Science (1985) 230:912-916) y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor del suero de la leche; patente de EE.UU. n° 4.873.316 y publicación EPO n° 264.166). También están abarcados los promotores regulados en su desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel et al., Science (1990) 249:374-379) y el promotor de la -fetoproteína (Campes et al., Genes Dev. (1989) 3:537-546). La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la ¡nvención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está unida de forma operativa a una secuencia reguladora de una forma que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido respecto al ARNm de la SNAIP. Las secuencias reguladoras unidas de forma operativa a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido, se pueden elegir para que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo, promotores y/o potenciadores víricos, o las secuencias reguladores se pueden elegir para que dirijan la expresión constitutiva específica de tejido o específica de tipo de célula del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado, en el que se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad se puede determinar por el tipo de célula en la que se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión de genes usando genes antisentido, véase Weintraub et al. (Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1)1986). Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedantes en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se usan en esta memoria de forma intercambiable. Se entiende que dichos términos no se refieren sólo a la presente célula particular sino a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Debido a que se pueden producir algunas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, de hecho, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula madre, pero también se incluyen en el alcance del término como se usa en la presente memoria. Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, la proteína SNAIP se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamífero (tal como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la técnica conocen otras células hospedantes adecuadas. El ADN vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas por técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usa en esta memoria, los términos "transformación" y "transfección" se pretende que se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedante, que incluyen coprecipitación con fosfato calcico o cloruro calcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, sólo pueden integrar el ADN extraño en el genoma una pequeña fracción de las células. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a antibióticos) en las células hospedantes junto con el gen de interés. Entre los marcadores seleccionables preferidos se incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedante en el mismo vector que el que codifica la SNAIP, o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar por selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán). Se puede usar una célula hospedante de la invención, tal como una célula hospedante procariota o eucariota en cultivo, para producir (es decir, expresar) la proteína SNAIP. De acuerdo con esto, la invención proporciona además métodos para producir proteína SNAIP usando las células hospedante de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedante de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica la SNAIP) en un medio adecuado, tal que se produzca proteína SNAIP. En otra realización, el método comprende además, aislar la SNAIP del medio en la célula hospedante. Las células hospedantes de la invención también se pueden usar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedante de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embrionaria en la que se han introducido secuencias que codifican la SNAIP. Después, dichas células hospedantes se pueden usar para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido secuencias de SNAIP exógena en el genoma, o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado las secuencias de SNAIP endógena. Dichos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de la SNAIP, y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de la SNAIP. Tal como se usa en la presente memoria, un "animal transgénico" preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente, un roedor tal como una rata o ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico, y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta forma la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Tal como se usa en la presente memoria, un "animal recombinante homólogo" preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente, un ratón, en el que se ha alterado un gen SNAIP endógeno por recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal. Un animal transgénico de la invención se puede crear introduciendo ácido nucleico que codifica la SNAIP en el pronúcleo del macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microínyección, infección retrovírica, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal hembra de acogida seudopreñado. La secuencia de ADNc de la SNAIP, por ejemplo, la del SEQ ID NO: 1 , se puede introducir como un transgén en el genoma de un animal no humano. Alternativamente, se puede aislar un homólogo no humano del gen SNAIP humano, tal como un gen SNAIP de ratón, basándose en la hibridación al ADNc de la SNAIP humana, y usado como un transgén. También se pueden incluir en el transgén secuencias intrónicas y señales de poliadenilación, para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Se puede unir de forma operativa una secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejido al transgén de la SNAIP para dirigir la expresión de la proteína SNAIP a células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos por manipulación embrionaria y microinyección, particularmente animales tales como ratones, son convencionales en la técnica y se describen por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 4.736.866 y 4.870.009, patente de EE.UU. 4.873.191 y por Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se usan métodos similares para producir otros animales transgénicos. Después, un animal transgénico constituyente se puede usar para engendrar animales adicionales que llevan el transgén. Además, los animales transgénicos que llevan un transgén que codifica la SNAIP se pueden cruzar con otros animales que llevan otros transgenes. Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un gen SNAIP (por ejemplo, un homólogo humano o no humano del gen SNAIP, por ejemplo, un gen SNAIP murino), en que se ha introducido eliminación, adición o sustitución para alterar así, por ejemplo, alterar funcionalmente, el gen SNAIP. En una realización preferida, se diseña el vector de modo que en la recombinación homologa, el gen SNAIP endógeno está alterado funcionalmente (es decir, ya no codifica una proteína funcional; denominado también animal knockout). Alternativamente, se puede diseñar el vector de modo que en la recombinación homologa, el gen SNAIP endógeno esté mutado o alterado de otra forma, pero que todavía codifique la proteína funcional (por ejemplo, se puede alterar la región reguladora corriente arriba, para alterar así la expresión de la proteína SNAIP endógena). En el vector recombinante homólogo, la parte alterada del gen SNAIP está flanqueada en los extremos 5' y 3" por ácidos nucleicos adicionales del gen SNAIP, para permitir que se produzca la recombinación homologa entre el gen SNAIP exógeno que lleva el vector y un gen SNAIP endógeno en la célula madre embrionaria. El ácido nucleico flanqueador adicional de la SNAIP, tiene suficiente longitud para la recombinación homologa satisfactoria con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector ADN flanqueadores de varios kilobases (tanto en el extremo 5' como 3') (véase, por ejemplo, Thomas et al., Cell (1987) 51 :503 para una descripción de vectores de recombinación homologa). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación), y se recogen las células en las que el gen SNAIP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen SNAIP endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., Cell (1992) 69:915). Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113-152). Después se puede implantar un embrión quimérico en un animal hembra de acogida seudopreñado adecuado, y conducir el embrión hasta el final. La progenie que lleva el ADN recombinado homólogamente en células germinales, se puede usar para engendrar animales en los que todas las células del animal contengan ei ADN recombinado homólogamente, por transmisión del transgén por la línea germinal. Se describen con más detalle métodos para construir vectores de recombinación homologa y animales recombinantes homólogos en Current Opinión in Bio/Technology (1991) 2:823-829 de Bradley, y en las publicaciones PCT n°. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968 y WO 93/04169. En otra realización, se pueden producir animales transgénicos no humanos que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de dicho sistema es el sistema de la recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema de la recombinasa cre/loxP, véase, por ejemplo, Lakso et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:6232-6236.

Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa FLP de S. cerevisiae (O'Gorrnan et al., Science (1991) 251 :1351-1355). Si se usa un sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgén, son necesarios animales que contengan los transgenes que codifican tanto la recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Dichos animales se pueden proporcionar mediante la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, emparejando dos animales transgénicos, uno que contenga un transgén que codifica una proteína seleccionada, y otro que contenga un transgén que codifica una recombinasa. Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en la presente memoria, también se pueden producir de acuerdo con métodos descritos por Wilmut et al., Nature (1997) 385:810-813 y en las publicaciones PCT n° WO 97/07668 y WO 97/07669. Brevemente, se puede aislar una célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico e inducirla para que salga del ciclo de crecimiento y entre en la fase Go. Después, la célula estable se puede fusionar, por ejemplo, usando pulsos eléctricos, con un oocito enucleado de un animal de la misma especie de la cual se ha aislado la célula estable. Después, el oocito reconstruido se desarrolla a mórula o blastocito, y después se transfiere a un animal hembra de acogida seudopreñado. La prole nacida de este animal de acogida hembra será un clon del animal del cual se ha aislado la célula, por ejemplo, la célula somática.

IV. Composiciones farmacéuticas Las proteínas SNAIP, anticuerpos anti-SNAIP y moléculas de unión a SNAIP (también denominados en la presente memoria, "compuestos activos") de la invención, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administrar. Dichas composiciones típicamente comprenden la proteína o anticuerpo y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en esta memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se pretende que incluya cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes ¡sotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Se contempla su uso en las composiciones excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con la vía de administración pretendida. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol o disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil-parabenes; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. La acidez (pH) se puede ajustar con ácidos o bases, tales como HCl o NaOH. La preparación parenteral se pueden encerrar en ampollas, jeringas desechables, o viales de dosis múltiple de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, entre los vehículos adecuados se incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril, y debe ser fluida en la medida que se pueda inyectar con jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe proteger frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) y sus mezclas adecuadas. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, usando un revestimiento tal como lecitina, para el mantenimiento del tamaño de partículas necesario en el caso de la dispersión, y usando tensioactivos. La protección frente a la acción de microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes ¡sotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables, se puede llevar a cabo incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones estériles inyectables se pueden preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una proteína SNAIP o anticuerpo anti-SNAIP) en la cantidad requerida, en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes antes enumerados, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados antes. En el caso de polvos estériles para preparar soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de la preparación son secado con vacío y liofilización, que dan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de su solución previamente esterilizada por filtración. Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para usar como elixir bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral, se agita y expectora o traga. Se pueden incluir como parte de la composición agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, pildoras, cápsulas, pastillas y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato magnésico o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente de sabor tal como menta, salicilato de metilo o sabor de naranja. Para administrar por inhalación, los compuestos se suministran en forma de un pulverizador de aerosol de un envase presurizado o dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes adecuados para la barrera que se va a penetrar. En general dichos penetrantes son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración por vía transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración por vía transmucosa se puede llevar a cabo mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración por vía transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica. Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal. En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los materiales también se pueden obtener en el comercio en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos víricos) Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.522.811. Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y para la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad, una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculado para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el vehículo farmacéutico necesario. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial para administrar al paciente, es de aproximadamente 1 g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 a 20 mg/kg) de anticuerpo, sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de la terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales, Se describe un régimen de dosificación de ejemplo, en el documento WO 94/04188. La especificación de las formas de unidades de dosificación de la invención, vienen dadas y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica para componer dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden insertar en vectores y usar como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica se pueden suministrar a un sujeto, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local (patente de EE.UU. n° 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994) 91 :3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de la terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta, en la que está embebido el vehículo de suministro del gen. Alternativamente, cuando se puede preparar el vector de suministro dei gen completo intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro del gen. Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un envase, paquete o dispensador, junto con instrucciones para la administración V. Usos y métodos de la invención Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, moléculas de unión a la SNAIP y anticuerpos descritos en esta memoria, se pueden usar en uno o más de lo siguientes métodos: a) ensayos de cribado; b) ensayos de detección (por ejemplo, cartografía de cromosomas, tipificación de tejidos, biología forense); c) medicina predictiva (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, seguimiento de ensayos clínicos y farmacogenómica); y d) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y profiláctico). Una proteína SNAIP interacciona con otras proteínas celulares, y por lo tanto se puede usar para regular la proliferación celular; (ii) regular la diferenciación celular; y (iii) regular la supervivencia celular. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención, se pueden usar para expresar la proteína SNAIP (por ejemplo, por un vector de expresión recombinante en una célula hospedante en aplicaciones de terapia génica), para detectar ARNm de la SNAIP (por ejemplo, una muestra biológica) o una lesión genética en un gen SNAIP, y para modular la actividad de la SNAIP (por ejemplo, por tecnologías de ARNi y antisentido). Además, las proteínas SNAIP se pueden usar para cribar fármacos o compuestos que modulan o mimetizan la actividad o expresión de la SNAIP, así como para tratar trastornos caracterizados por la producción o función de la proteína SNAIP insuficiente o excesiva o producción de formas de proteína SNAIP que tienen actividad menor o aberrante comparadas con la proteína SNAIP salvaje. Además, los anticuerpos anti-SNAIP de la invención se pueden usar para detectar y aislar proteínas SNAIP y para modular la actividad de la SNAIP. La invención además se refiere a nuevos agentes identificados por los ensayos de cribado antes descritos, y a sus usos para tratamientos, como se describe en la presente memoria.

A. Ensayos de cribado La invención proporciona un método (denominado también en lo sucesivo "método de cribado") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a proteínas SNAP o tienen un efecto estimulante o inhibidor, por ejemplo, en la expresión de la SNAIP o actividad de la SNAIP, o mimetizan la SNAIP que se une a Wnt o FZ, e impide la unión de Wnt a FZ e impiden la apoptosis. En una realización, la invención proporciona ensayos para cribar compuestos candidatos o de ensayo que se unen, modulan o mimetizan, la actividad de una proteína o polipéptido SNAIP o sus partes biológicamente activas. Los compuestos de ensayo de la presente invención se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques de métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas paralelas en fase sólida o fase de solución direccionables en el espacio; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución; bibliotecas de productos naturales; método de bibliotecas de "una perla, un compuesto"; y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de la biblioteca biológica está limitado a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques se pueden aplicar a bibliotecas de compuestos peptídicos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, Anticancer Drug Des. (1997) 12:145). En la técnica se pueden encontrar ejemplos de métodos para sintetizar bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:6909; Erb et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994) 91:11422; Zuckermann et al., J. Med. Chem. (1994) 37:2678; Cho et al., Science (1993) 261 :1303; Carrell et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (1994) 33:2059; Carell et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (1994) 33:2061 ; y Gallop et al., J. Med. Chem. (1994) 37:1233. Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques (1992) 13:412-421), o en perlas (Lam, Nature (1991 ) 354:82-84), chips (Fodor, Nature (1993) 364:555-556), bacterias (Patente de EE.UU. n° 5.223.409), esporas (Patente de EE.UU. n° 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), plásmidos (Culi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:1865- 1869) o fagos (Scott et al., Science (1990) 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87:6378-6382; y Felici, J. Mol. Biol. (1991) 222:301-310). Debido a que la SNAIP es un ligando, se puede investigar la SNAIP para determinar que parte particular se une, por ejemplo a FZ o Wnt, llevando a la práctica métodos conocidos. Esa región particular se puede sintetizar llevando a la práctica métodos biosintéticos conocidos, por ejemplo, combinando síntesis de carbohidratos y reacciones enzimáticas. Esta parte de la SNAIP es equivalente a un "epítopo". El epítopo de la SNAIP se puede modificar usando otros monómeros o restos de no carbohidrato, para dar estructuras que llevan el epítopo modificado con mejores propiedades, tales como semivida en el suero, constante de unión con FZ/Wnt y similares. La adecuabilidad de cualquier variante de epítopo se puede determinar llevando a la práctica los ensayos de unión y cribado enseñados en la presente memoria. En una realización, un ensayo es un ensayo basado en célula, en el que se pone en contacto una célula que expresa una forma de FZ unida a membrana, o una de sus partes biológicamente activa, en la superficie celular, con un compuesto de ensayo, y se puede determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse competitivamente a FZ en presencia de la proteína SNAIP. La célula puede ser, por ejemplo, una célula de levadura o una célula de origen mamífero. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a FZ se puede llevar a cabo, por ejemplo, por acoplamiento del compuesto de ensayo con un marcador radioisótopo o enzimático, de modo que la unión del compuesto de ensayo a FZ o su parte biológicamente activa se puede determinar detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de ensayo se pueden marcar con 125l, 35S, 1 C o 3H, directamente o indirectamente, y el radioisótopo se puede detectar por recuento directo de la radioemisión o por recuento de centelleo. Alternativamente, los compuestos de ensayo se pueden marcar enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimático se puede detectar determinando la conversión de un sustrato adecuado en producto. En una realización preferida, el ensayo comprende poner en contacto una célula que expresa una forma de FZ unida a membrana, o una de sus partes biológicamente activa, en la superficie celular con un compuesto conocido que se une a FZ para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una FZ, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una FZ en presencia de SNAIP, comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para punirse preferiblemente a FZ o a una de sus partes biológicamente activa , comparado con la SNAIP. Todavía en otra realización, un ensayo de la presente invención es un ensayo de célula libre que comprende poner en contacto una proteína SNAIP o su parte biológicamente activa con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la proteína SNAIP o su parte biológicamente activa. La unión del compuesto de ensayo a la proteína SNAIP se puede determinar directamente o indirectamente como se ha descrito antes. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína SNAIP o su parte biológicamente activa con un compuesto conocido que se une a SNAIP, para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína SNAP, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína SNAIP comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferiblemente a la SNAIP o una de sus partes biológicamente activa, comparado con el compuesto conocido. En otra realización, un ensayo es un ensayo sin células que comprende poner en contacto una proteína SNAIP o su parte biológicamente activa con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína SNAIP o su parte biológicamente activa. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de la SNAIP se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína SNAIP para unirse a una molécula objetivo de SNAIP por uno de los métodos descritos antes para determinar la unión directa. En una realización alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de la SNAIP se puede llevar a cabo determinando la capacidad de la proteína SNAIP para modular además una molécula objetivo de SNAIP. Por ejemplo, se puede determinar la actividad catalítica/enzimática de la molécula objetivo en un sustrato adecuado, como se ha descrito previamente. Todavía en otra realización, el ensayo sin células comprende poner en contacto la proteína SNAIP o su parte biológicamente activa con un compuesto conocido que se une a SNAIP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína SNAIP, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína SNAIP comprende determinar la capacidad de la proteína SNAIP para unirse con preferencia o modular la actividad de una molécula objetivo de SNAIP. En más de una realización de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser conveniente inmovilizar la SNAIP o Wnt para facilitar la separación de las formas complejadas de las no complejadas de una o ambas proteínas, así como adaptar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a la SNAIP, o la interacción de la SNAIP con Wnt en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para poner en contacto los reactivos. Entre los ejemplos de dichos recipientes se incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutatión-S- transferasa/SNAIP o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/Wnt se pueden adsorber en perlas de glutatión-Sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo, o el compuesto de ensayo y Wnt o proteína SNAIP no adsorbidos, e incubar la mezcla en condiciones que conducen a la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH.

Después de la incubación, las perlas o pocilios de la placa de microvaloración se lavan para eliminar cualesquiera componentes no unidos y se mide la formación de complejo directa o indirectamente, por ejemplo como se ha descrito antes.

Alternativamente, se pueden disociar los complejos de la matriz, y determinar el nivel de actividad o unión de SNAIP usando técnicas patrón. También se pueden usar otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices en los ensayos de cribado de la invención. Por ejemplo, se puede inmovilizar la SNAIP o Wnt usando conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas objetivo o de SNAIP biotiniladas se pueden preparar a partir de biotina- NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotiniliación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizando en pocilios de placas de 96 pocilios revestidas con estreptavidina (Pierce Chemicals). Alternativamente, se pueden unir a los pocilios de la placa anticuerpos reactivos con SNAIP o Wnt pero que no interfieren en la unión de la proteína SNAIP a una Wnt, y atrapar la Wnt no unida o SNAIP en los pocilios por conjugación con el anticuerpo. Entre los métodos para detectar dichos complejos, además de los descritos antes para los complejos inmovilizados en GST, se incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la SNAIP o molécula objetivo, así como ensayos con enzimas ligadas que se basan en detectar la actividad enzimática asociada con la SNAIP o molécula objetivo. En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de SNAIP en un método en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato, y se determina la expresión del ARNm de la SNAIP o proteína en la célula. Se compara el nivel de expresión del ARNm de la SNAIP o proteína en presencia del compuesto candidato, con el nivel de expresión del ARN de la SNAIP o proteína en ausencia del compuesto candidato. Después, el compuesto candidato se puede identificar como un modulador de la expresión de la SNAIP basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm de la SNAIP o proteína es mayor (estadísticamente significativamente mayor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulante de la expresión del ARNm de la SNAIP o proteína. El nivel de expresión del ARNm de la SNAIP o proteína en las células se puede determinar por métodos descritos en la presente memoria para detectar el ARNm de la SNAIP o proteína Todavía en otro aspecto de la invención, las proteínas SNAIP se pueden usar como "proteínas cebo" en un ensayo de doble híbrido o ensayo de triple híbrido (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.283.317; Zervos et al., Cell (1993) 72:223-232; Madura et al., J. Biol. Chem. (1993) 268:12046-12054; Bartel et al., Bio/Techniques (1993) 14:920-924; Iwabuchi et al., Oncogene (1993) 8:1693-1696; y publicación PCT n° WO 94/10300), para identificar otras proteínas, que se unen o interaccionan con la SNAIP ("proteínas de unión a SNAIP" o "SNAIP-bp") y modular la actividad de la SNAIP. También es probable que dichas proteínas de unión a SNAIP estén implicadas en la propagación de señales por las proteínas de SNAIP, tales como por ejemplo, elementos corriente arriba o corriente abajo en la ruta del SNAIP. Todavía en otra realización, la biblioteca se criba para identificar moléculas de tipo SNAIP, usando, por ejemplo, un anticuerpo de SNAIP o una molécula que se une a SNAIP, tal como Wnt. Después se ensaya la actividad de SNAIP de una molécula que se une a ella, usando, por ejemplo, un método como se ensaña en la presente memoria. Dicho método de cribado pone de manifiesto moléculas de tipo SNAIP que son agonistas, agonistas inversos o antagonistas de la SNAIP. La invención además se refiere a nuevos agentes identificados por los ensayos de cribado antes descritos, y a sus usos para tratamientos, como se describe en esta memoria.

B. Ensayos de detección Se pueden usar partes o fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas en la presente memoria ( y las correspondientes secuencias génicas completas) de muchas formas como reactivos polinucleótidos. Por ejemplo, las secuencias se pueden usar para: (i) cartografiar los genes respectivos en un cromosoma, y por lo tanto, localizar las regiones de genes asociadas con la enfermedad genética;; (ii) identificar un individuo a partir de una muestra mínima biológica (tipificación de tejido); y (iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar para detectar la SNAIP o FZ.

C. Medicina predictiva La presente invención también se refiere al campo de la medicina predictiva, en la que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, farmacogenómica y seguimiento de ensayos clínicos, para propósitos de pronóstico (predictivo), para el tratamiento profiláctico de un individuo. De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de la proteína y/o ácido nucleico de SNAIP, así como la actividad de la SNAIP, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, orina, heces, suero, células, tejido), para determinar de ese modo si un individuo padece una enfermedad o trastorno, o tiene riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la expresión o actividad aberrante o reducida de la SNAIP.

Por ejemplo, las SNAIP se ven in vivo en zonas de neuronas o fotorreceptores que sobreviven después de lesión. La invención también proporciona ensayos de pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo tiene riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la proteína SNAIP, expresión del ácido nucleico o la actividad. Por ejemplo, en una muestra biológica se pueden ensayar las mutaciones en un gen SNAIP. Dichos ensayos se pueden usar para propósitos de pronóstico o predictivo para tratar profilácticamente a un individuo antes de la aparición de un trastorno caracterizado o asociado con la proteína SNAIP, expresión del ácido nucleico o actividad. Otro aspecto de la invención proporciona métodos para determinar la proteína SNAIP, expresión del ácido nucleico o actividad de la SNAIP en un individuo para seleccionar de ese modo agentes terapéuticos o profilácticos adecuados para ese individuo (denominado en lo sucesivo "farmacogenómica"). La farmacogenómica permite seleccionar agentes (por ejemplo, fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo, basándose en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo examinado para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente particular). Todavía otro aspecto de la invención se refiere al seguimiento de la influencia de los agentes (fármacos u otros compuestos) en la expresión o actividad de la SNAIP en ensayos clínicos.

D. Métodos de tratamiento La presente invención proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto que tenga riesgo (o sea susceptible) de padecer un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o reducida de la SNAIP en el sistema nervioso, y particularmente, el sistema nervioso central. Entre dichos trastornos se incluyen, pero no se limitan, enfermedad de Alzheimer y esquizofrenia.

I. Métodos profilácticos En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un sujeto una enfermedad o estado asociado con la expresión o actividad aberrante o reducida de la SNAIP, administrando al sujeto un agente que modula la expresión de la SNAIP o al menos una actividad de la SNAIP. Los sujetos que tienen riesgo de padecer una enfermedad causada o en la que interviene la expresión o actividad aberrante o reducida de la SNAIP, se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en la presente memoria. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de que se manifiesten los síntomas característicos de la aberración de la SNAIP, de modo que se prevenga, o alternativamente, se retrase el avance de una enfermedad o trastorno.

II. Métodos terapéuticos Otro aspecto de la ¡nvención se refiere a métodos para modular la expresión o actividad de la SNAIP con propósitos terapéuticos. El método de modulación de la ¡nvención, implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la proteína SNAIP asociada con la célula. El agente puede ser un agente mimético de la SNAIP. El agente mimético puede ser un polinucleótido, polipéptido, polisacárido, molécula orgánica, molécula inorgánica o sus combinaciones, siempre que el agente mimético tenga una actividad de la SNAIP como se define en la presente memoria. La actividad de la SNAIP puede ser cualquiera de las conocidas, por ejemplo, la unión a una molécula particular de Wnt, inducción de una respuesta particular en una célula, tal como inhibición de la apoptosis, y similares. Por lo tanto, un agente que modula la actividad de la proteína SNAIP puede ser un agente como se describe en la presente memoria, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado natural de una proteína SNAIP, un péptido, un peptidomimético de la SNAIP u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más actividades biológicas de la proteína SNAIP. Entre los ejemplos de dichos agentes estimulantes se incluyen la proteína SNAIP activa, y una molécula de ácido nucleico que codifica la SNAIP que se ha introducido en la célula. Los métodos de modulación se pueden llevar a cabo in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente), o alternativamente in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o actividad aberrante o reducida de una proteína SNAIP o molécula de ácido nucleico. En una realización, el método implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de cribado descrito en la presente memoria) o una combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regulan positiva o negativamente) la expresión o actividad de la SNAIP. En otra realización, el método implica administrar una proteína SNAIP o molécula de ácido nucleico como terapia para compensar la expresión o actividad aberrante o reducida de la SNAIP. La estimulación de la actividad de la SNAIP es conveniente en situaciones en las que la SNAIP está anormalmente regulada negativamente y/o en las que la actividad de la SNAIP es menor. Inversamente, la inhibición de la actividad de la SNAIP es menor. La invención se ilustra con más detalle con los siguientes ejemplos que no se deben considerar limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de la presente solicitud se incorporan en ésta como referencia.

EJEMPLOS Extracción de ARN: Se llevó a cabo la lisis de células o tejidos cultivados en 1 ,5 ml de Trizol (Gibco, Cat. No. 15596) por placa de 10 cm o 50 mg de tejido homogeneizado, respectivamente. El lisato se pasó por una pipeta varias veces para homogenizar el lisato (el lisato de células posteriormente se transfirió a un tubo). Después de homogeneizar, el lisato se incubó durante 5 minutos a 30°C para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.

Después de incubar, se añadieron al lisato 0,2 ml de cloroformo (Sigma, Catálogo No. C53 12) por 1 ml de reactivo Trizol, y el tubo se agitó vigorosamente durante 15 segundos. Después, el lisato se incubó a 30°C durante 3 minutos. Después de incubar, el lisato se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos a 4°C. Después de centrifugar, se separó el líquido sobrenadante y el sedimento de ARN que quedaba se aclaró con etanol al 70%. Después, la muestra aclarada se centrifugó a 7500 x g durante 10 minutos a 4°C, y se descartó el líquido sobrenadante resultante. Después, el sedimento de ARN que quedaba se secó y se volvió a suspender en agua sin ARNasa (Life Technologies, Catálogo No. 10977-015). Tratamiento con ADNasa: El ARN total se trató con ADNasa I (Gibco) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Expresión diferencial: Se sintetizó la primera cadena de ADNc a partir del ARN tratado con ADNasa usando el kit para RT por PCR Advantage de Clontech.

Se usaron 2 µg de ARN total por reacción. El producto del ADNc se diluyó 1 :10 y 1 :100 y se usó 1 µ\ de cada dilución para la reacción de la PCR con cebadores arbitrarios. Se usaron cebadores de Hieroglyph y kits de cebadores Fluoro DD (Beckman). Los cebadores contienen oligodT o secuencias arbitrarias fusionadas con partes de M13 o T7. Un primer grupo de cebadores se marcó con un indicador fluorescente. Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo usando el kit de Advantage cDNA PCR (Clontech) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Los productos de la PCR fluorescentes se separaron en geles de acrilamida HR-1000 (Beckman) usando un Secuenciador de ADN GenomyxLR (Beckman). Las muestras de diferentes variantes experimentales se ensayaron al menos por duplicado y se compararon con las muestras de los testigos. Los experimentos en los geles se llevaron a cabo a 1600 V durante 6 h, se secaron en la placa de vidrio, se lavaron varias veces para separar los cristales de urea, y se exploraron usando el escáner GenomyxSC. Las imágenes se analizaron usando Adobe Photoshop y se determinaron las coordenadas de las bandas expresadas de forma diferente. Usando las coordenadas, se localizaron las bandas expresadas de forma diferente en los geles secos. Las bandas se cortaron, se sumergieron en 100 µ\ de agua y se centrifugaron. Se usaron 5 µl de líquido sobrenadante para volver a amplificar la banda en una reacción de PCR usando la mezcla de polimerasa de Advantage y los cebadores de T7/M13 (Clontech). Las bandas reamplificadas se secuenciaron directamente usando los cebadores de T7/M13 o se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO de Invitrogen y después se secuenciaron. Transcripción inversa: La reacción se llevó a cabo usando el kit de RT para la PCR de Clontech (Cat. No. K1402-1). Se aisló 1 µg de ARN y se trató con ADNasa como se ha descrito antes, y después se mezcló con 20 pmoles de cebador oligodT en un volumen total de 13,5 µl. La mezcla se incubó a 70°C durante 2 min y se enfrió a 4°C para la reasociación del cebador. Después de la reasociación, se añadieron 6,5 µl de mezcla de reacción, que contenía tampón de reacción, mezcla de dNTP, inhibidor de ARNasa y transcriptasa inversa MMLV del kit de RT para la PCR, y la reacción de PCR se llevó a cabo en un GeneAmp PCR System 9700 Perkin Elmer como se describe en los protocolos del fabricante. El producto de ADNc resultante se almacenó a 20°C hasta que fuera necesario. PCR en tiempo real: TaqMan® o la RT-PCR en tiempo real, es una herramienta poderosa para detectar ARN mensajero en muestras. La tecnología explota la actividad de la 5-nucleasa de la ADN-polimerasa AmpliTaq Gold® para escindir una sonda TaqMan® durante la PCT. La sonda TaqMan® contiene un colorante indicador (en los experimentos: 6-FAM (6-carboxifluoresceína)) en el extremo 5' de la sonda, y un colorante atenuador (en los experimentos: TAMRA (6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametilrodamina)) en el extremo 3' de la sonda. Las sondas TaqMan® están específicamente diseñadas para hibridar con el ADNc objetivo de interés entre los sitios del cebador directo y del inverso. Cuando la sonda está intacta, el colorante atenuador del extremo 3' suprime la fluorescencia del colorante indicador del extremo 5'. Durante la PCR, la actividad 5'-3' de la ADN-polimerasa AmpliTaq Gold® da como resultado la escisión de la sonda entre el colorante indicador del extremo 5' y el colorante atenuador del extremo 3', dando como resultado el desplazamiento del colorante indicador. Una vez desplazado, la fluorescencia del colorante indicador ya no es suprimida por el colorante atenuador. Por lo tanto, la acumulación de productos de PCT hechos a partir del molde de ADNc objetivo se detecta siguiendo el aumento de la fluorescencia del colorante indicador. Se usó un sistema de detección de secuencia ABI Prism de Perkin Elmer Applied Biosystems (Model No. ABI7700) para seguir el aumento de la fluorescencia del indicador durante la PCR. La señal del indicador se normaliza respecto a la emisión de una referencia pasiva. La reacción RT-PCR obtenida como se ha descrito antes, y diluida 1:100 con agua, se usó como molde en el ensayo con TaqMan®. Los cebadores se diseñaron usando el software Primer Express (Perkin Elmer) y fueron sintetizados por Sigma Genosys. Las reacciones de PCR con cada pareja de cebadores se llevaron a cabo en un gel de agarosa al 4% para confirmar la presencia de una sola banda. Se encontró que la concentración de cebador final en las reacciones era 0,2 µm para la mayoría de las parejas de cebadores. El ensayo con TaqMan® se llevó a cabo en una placa óptica MicroAmp placa de 96 pocilios (Perkin Elmer, Catálogo No. N801-0560). Se pusieron en cada pocilio una mezcla de reacción que comprendía 25 µl de mezcla de PCR de TaqMan® CybrGreen (Perkin Elmer, Catálogo No. 4309155), 2 µl de cebador directo, 2 µl de cebador inverso, 5 µl de ADNc y 17 µl de agua. Después la placa se tapa con tiras de 8 tapones ópticos MicroAmp (Perkin Elmer, Catálogo No. N801-0935). Se llevó a cabo una reacción con Taqman por separado usando cebadores para un gen patrón arbitrario (por ejemplo, beta-actina, Perkin Elmer Cat. No. N801-0935) para cada muestra experimental, para permitir normalizar los resultados. Las reacciones de la PCR en tiempo real se llevaron a cabo en el detector de secuencias ABI Prizm System 7700 (Perkin-Elmer). Mareaje de ARN e hibridación en chip Affymetrix: El mareaje del ARN e hibridación en chip, se llevaron a cabo usando procedimientos patrón de Affymetrix.

Análisis de los datos de la micromatriz: El análisis de los datos de la micromatriz se llevaron a cabo usando el software de análisis de chip de Gecko (Aventis) y GeneSpring (Silicon Genetics). Ensayo de neuroprotección usando SNAIP humana: Se sembraron las líneas celulares de neuroblastoma humano SK N-SH y SY5Y en placas de 96 pocilios y se dejó que se adhirieran durante toda la noche. Los agentes se ensayaron por triplicado. Se recogieron los líquidos sobrenadantes brutos de 293 células T transfectadas transitoriamente con 1 ) ADNc de SNAIP de longitud completa en el plásmido TopoTA eucariota sin heparina, y 2) igual que (1) con heparina en el medio, 3) testigo de vector vacío, 4) testigo sin vector con o sin heparina, y 5) medio sin acondicionamiento de 293 con y sin heparina, y se usaron con una dilución 1 :5. Los testigos positivos para la neuroprotección incluían flavopiridol usado con 5 µm. Los agentes neurotóxicos añadidos inmediatamente después de los agentes neuroprotectores fueron S1N-1 10 mM y 500 µm de ceramida C2. Las placas se incubaron toda la noche. Los líquidos sobrenadantes se recogieron y se determinó la muerte celular usando un kit de lactato-deshidrogenasa (LDH). La SNAIP protegía frente a la neurotoxicidad de SIN-1 pero no de la ceramida C2. Clonación de SNAIP: La secuencia génica se amplificó a partir de los ADNc de la zona ventricular y corteza agrupados, usando cebadores específicos del gen sintetizados por Sigma Genosys y el kit de ADNc de la PCR Advantage (Clontech). El ADNc se clonó en un vector de expresión eucariota como se conoce en la técnica. El ADNc se clonó en el marco con el epítopo V5 para permitir la detección de la expresión de la proteína usando anticuerpo V5 disponible en el comercio (Invitrogen). También se secuenció el clon para confirmar la identidad del gen y la ausencia de mutaciones. Generación de células que expresan la SNAIP: Para proporcionar cantidades significativas de SNAIP para experimentos adicionales, el ADNc que codifica la SNAIP se clonó en un vector de expresión y se transfectó en células CHO.

Para generar células CHO que sobreexpresan la SNAIP, se cultivaron en placa células CHO en una placa de cultivo tisular de seis pocilios de 35 mm, 3 x 105 células por pocilio (Costar Catálogo no. 3516) en 2 ml de medio F12 HAM (Gibco/BRL, Catálogo no. 11765-054) en presencia de suero bovino fetal al 10% (Gibco/BRL Catálogo No. 1600-044). Después, las células se incubaron a 37°C en un incubador de C02 hasta que las células eran 50-80% confluentes. La secuencia del ácido nucleico del ADNc clonado de la SNAIP se insertó usando el procedimiento antes descrito. Se diluyeron 13 µg del ADN en 1,2 ml de medio Optimem sin suero con 78 µl de reactivo PLUS. Por separado, se diluyeron 52 µl de reactivo Lipofectamine-Plus (Life Technologies, Catálogo No. 109064-013) en 1,25 ml de Optimem sin suero. Después, se incubaron la solución de ADN y de Lipofectamine a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se combinaron las dos soluciones y se incubaron 15 minutos adicionales para permitir la formación de complejos de ADN-lípido. Las células se aclararon una vez con 2 ml de Optimem sin suero. Para cada transfección (seis transfecciones en una placa de seis pocilios), se sustituyó el medio de las células por 0,8 ml de Optimem. El complejo de ADN-lípido (en lo sucesivo la "mezcla de transfección") se añadió en un volumen de 200 µl a cada pocilio. No se añadieron reactivos antibacterianos. Después, las células se incubaron con los complejos de ADN-lípidos durante 6 horas a 37°C en un incubador con C02 para permitir la transfección. Después de completar el periodo de incubación, se añadió 1 ml de Optimem que contenía suero bovino fetal al 20% a las células sin separar primero la mezcla de transfección. 18 horas después de la transfección, se aspiró el medio que cubría las células. Después, las células se lavaron con PBS pH 2-4 (Gibco/BRL Catálogo No. 10010-023) y se sustituyó el PBS por medio F12 HAM que contenía suero al 10% ("medio selectivo"). 72 horas después de la transfección, las células se tripsinizaron y se transfirieron a matraces T150. Veinticuatro horas más tarde, el medio se sustituyó por F12 Ham con FBS al 10%, antibióticos y G418 1 mg/ml. Se continuó la selección durante tres días, y después el medio se sustituyó por medio que contenía G418 200 µg/ml. Análisis de transferencia Western: Se mezcló el líquido sobrenadante del cultivo celular de las líneas celulares transfectadas o células transfectadas lisadas, con tampón de carga de proteína Invitrogen, y se cargó en un gel de Tris-glicina al 10% de Invitrogen. La electroforesis se llevó a cabo durante 2,5 h a 100 V. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a una membrana de PDFV de Invitrogen durante 1 h a 80 V, usando el aparato de transferencia de Invitrogen. Las membranas se bloquearon e hibridaron con el anticuerpo anti-V5 como describe el fabricante (Invitrogen). Se usó un sustrato quimiolumiscente ECL (Cat. No. 1059250) e Hyperfilm ECL (Cat. No. HP79NA) de Amersham para detectar la banda de proteína, como describe Amersham. Se visualizaron las bandas. Aunque la presente ¡nvención se ha descrito con detalle haciendo referencia a los ejemplos anteriores, se entiende que se pueden hacer diferentes modificaciones sin salirse del espíritu de la invención. De acuerdo con esto, la invención está limitada sólo por las siguientes reivindicaciones. Todas las patentes citadas y publicaciones a las que se ha hecho referencia en esta solicitud, se incorporan en su totalidad en la presente memoria como referencia.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modular la apoptosis inducida por el peroxinitrito en células neuronales, que comprende poner en contacto dichas células con la proteína secretada inhibidora de la apoptosis neuronal (SNAIP).

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende además poner en contacto dichas células con heparina.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha apoptosis comprende la inducción por SIN-1 (3-morfolinosidonimina) de la ruta asociada al peroxinitrito.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha ruta comprende activar uno o más de MAPK p38 y genes inducibles por parada del crecimiento y por daño en el ADN (GADD).

5. El método de la reivindicación 3, en el que dicha ruta se detecta identificando un marcador específico de nitración de proteína.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho marcador específico es la 3-nitrotirosina (3-NT).

7. El método de la reivindicación 4, en el que dichos GADD son GADD34, GADD45 0 GADD153.

8. El método de la reivindicación 1 , en el que dicha apoptosis comprende la disfunción mitocondrial.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha disfunción mitocondrial comprende la nitración de las subunidades I del complejo mitocondrial.

10. Un método para proteger neuronas de la muerte celular mediada por radicales libres asociada con peroxinitrito, que comprende poner en contacto dichas células con la proteína secretada inhibidora de la apoptosis neuronal.

11. Un método para determinar los objetivos genómicos neuroprotectores asociados con la ruta de toxicidad del peroxinitrito, que comprende: i) poner en contacto muestras individuales de células neuronales con o sin proteína secretada inhibidora de la apoptosis de células neuronales. ii) poner en contacto las células de la etapa (i) con un inductor de peroxinitrito; ni) determinar los cambios de la expresión de genes o proteínas en las células de la etapa (ii) y iv) identificar los genes o proteínas modulados en presencia o ausencia de SNAIP y el inductor, en el que los genes o proteínas así identificados se correlacionan con la inhibición de la apoptosis inducida por la inducción de peroxinitrito.

12. El método de la reivindicación 11 , en el que la etapa (i) comprende además poner en contacto dichas células con o sin heparina.

13. El método de la reivindicación 11 , en el que dicho inductor de peroxinitrito es la SIN-1.

14. El método de la reivindicación 11 , en el que dichos genes o proteínas identificados se correlacionan con la apoptosis.

15. Un método para tratar enfermedades neuronales asociadas con la muerte celular mediada por radicales libres, que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína secretada inhibidora de la apoptosis neuronal (SNAIP).

16. El método de la reivindicación 15, en el que dichas enfermedades asociadas con dicha muerte celular mediada por radicales libres, se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, daño en la médula espinal, daño cerebral traumático, ataque de apoplejía y enfermedad de Alzheimer.

17. El método de la reivindicación 15, en el que dicha administración comprende además la administración de heparina.