TW200530400A - Secreted neural apoptosis inhibiting proteins - Google Patents

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200530400 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係屬於分子生物學領域，尤其是涉及能夠調節 自由基介導細胞死亡效應的一種新型神經保護劑。 5 【先前技術】 本發明之背景

Wnt 和捲曲 | 白（FrizQgd) 作為細胞正常發育期間增殖、遷移、分化以及組織形 10 態發生的誘導劑，胞外信號分子起著根本的作用（Finch et al·，Proc. Natl· Acad· Sci· USA(1997)94:6770 — 75)。此外， 這類分子作為調節劑又可以調節細胞的凋亡，即細胞的程 式性死亡。細胞凋亡在多細胞生物的正常發育和功能發揮 過程中起著重要的作用。當功能失調時，信號分子和凋亡 15 過程參與眾多疾病的發病機理，參閱Thompson, Science (1995)267:1456-1462 等文獻。 細胞凋亡涉及各種正常和致病的生物學過程，並且可 以被許多獨立的刺激因素所誘導。關於凋亡的最新研究啟 示，導致細胞死亡的常見代謝途徑可能起源於多種信號， 20 包括激素、金清生長因子喪失、化療藥劑、電離輻射和人 體免疫缺陷病毒（HIV)感染等（Wyllie，Nature (1980) 284:555-556; Kanter et al.? Bio chem. Biophys. Res. Commun. (1984) 118:392-399; Duke & Cohen, Lymphokine Res. (1986) 5:289-299; Tomei et al.9 Biochem. Biophys. Res. 200530400

Commun· (1988) 155:324-331; Kruman et al·，J. Cell·

Physiol. (1991) 148:267-273; Ameisen & Capron, Immunol. Today (1991) 12:102-105; and Sheppard & Ascher, J. AIDS (1992) 5:143-147)。因此，影響凋亡過程生物學調控的藥 5 物對於眾多臨床症候均有治療功用。 雖然最近許多參與凋亡不同階段的基因和基因家族 已經被鑑定和克隆，但由於凋亡途徑仍不是很清楚，許多 涉及凋亡過程的新的基因和基因產品仍有待發現。 一組已知在調節細胞發育過程中具有重要作用的分 ίο 子是Wnt蛋白家族。Wnt蛋白家族由一個大型基因家族 編碼。虫回蟲、昆蟲、軟骨魚類和脊椎動物中都有該基因家 族的成員。由於許多不同的物種都有多個保存的Wnt基 因，所以Wnt蛋白家族被認為在多種發育過程和生理過程 中都起作用。（McMahon，Trends Genet· (1992) 8:236-242; 15 and Nusse & Varmus, Cell (1992) 69:1073-1087).

Wnt基因編碼多種分泌性糖蛋白，這些糖蛋白被認為 在多種原始細胞類型中起著旁分泌或自分泌信號的作用 (McMahon (1992) and Nusse & Varmus (1992)，同上文）〇 在小鼠中，Wnt生長因子家族包括10種以上的基因 20 (Wnt_l、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7a、7b、8a、8b、10b、 11、12)(參閱 Gavin et al·，Genes Dev· (1990)4: 2319 - 2332; Lee et al.9 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:2268 -2272 ;以及 Christiansen et al·，Mech. Dev· (1995) 51:341 -350等文獻）。在人體中則至少有7種基因（Wnt-1、2、3、 200530400 4、5a、7a 和 7b)(參閱 Vant Veer etal·，Mol· Cell· Biol. (1984) 4:2532 - 2534) 〇 由於Wnt蛋白相對的不溶性，傾向於與細胞或胞外基 質緊密地結合，所以Wnt受體的鑑定受到了一定影響。 5 然而，若干觀測結果表明，捲曲蛋白（FZ)家族的成員可作 為Wnt蛋白的受體，或作為Wnt受體複合體的構成部分 而起作用（He et al·，Science (1997) 275:1652-1654)。 FZ受體基因豕無的母個成貝編碼一種镶後膜蛋白， 後者包含一個大型的胞外部分、7個推定的跨膜結構域和 ίο 一個胞漿尾（參閱 Wang et al·，J. Biol. Chem. (1997) 271:468-76)。接近胞外部分NH2-末端處，是一個FZ家族 其他成員中保守性很強的富含半胱氨酸的結構域(CRD)。 CRD由大約110個氨基酸殘基組成，包括1〇個保守的半 胱氨酸，是Wnt配體的推定結合位點（Bhan〇t et al，Nature 15 (1996) 382:25-30)。FZ受體家族中有i〇個已知的基因。 大多數Wnt-FZ信號是通過糖原合成酶激酶(GSK3 β) 的抑制和β-catenin蛋白在核中的積累來介導的。(^catenin 蛋白活化c-myc，從而誘導某些細胞的凋亡。因此，Wnt通 過FZ 1和FZ2的信號轉導以及p_catenin蛋白的存留可以 2〇 誘導細胞的死亡’尤其是小腦中未成熟的細胞。而且， FZ1、FZ2和β-catenin蛋白的過度表達可以誘導凋亡。 然而’有一些Wnt-FZ信號途控並不依賴於p-catenin蛋 白。 最後，Wnt通過讓β-catenin蛋白在細胞胞漿中積累而 200530400 傳遞其信號。在細胞質中，p_catenin蛋白與Tcf-Lef轉錄 因子家族的成員結合，並轉移到細胞核中。當Wnt不存 在時，β-catenm蛋白則與GSK3和結腸腺瘤樣息肉（APC) 腫瘤抑制蛋白形成一種複合體。這種相互作用伴隨著 5 P_Catenin蛋白的磷酸化，並給它打下標記以進行泛素化 (ubiquitination)和降解。Wnt通過抑制gs〇的功能而使 β-catenin蛋白得以積累。 那些具有FZ_CRD但;f含那7個跨職序和胞漿尾的 分子的存在，提不了存在著—種作為胸活性調節物的 1〇 纟白亞族。可溶性捲曲相關蛋白（SFRP)，例如登錄號為 AF056087的核酸序列，與分泌亡相自（SARp) 同源，並包含了 一個分泌性分子家族，該家族分子含有一 個與FZ CRD結構域高度同源的CRD結構域(Finch以d，

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:6770-6775)。SARP 通 15 過與_相互仙或通過與麟合FZ蛋㈣成無功能 的同聚複合體而阻斷Wnt信號轉導。

Wnt途徑的失調看來是異常生長和發育的-個因素。 考慮到Wnt和FZ家族多個成員之間相互作用的潛在複雜 性’可能存在著額外機制以調節特定的發育期間或某些組 、織的疾病發展/受損期間Wnt所調節的過程（如调亡）。此 類機制之鑑定，尤其是這些機制的因子的鐘定，對理解和 控制細胞調控的過程頗為重要。 自由基神經喜性 200530400 一氧化鼠(NO)是一種分佈廣泛的多功能的生物信號 分子。NO可能不僅在神經元的各種生理功能如神經遞質 釋放、神經發月、再生、突觸可塑性（Synaptic plasticity) 和基因表達的調節中起作用，而且在因過量產生N〇導致 5 神經損害而引起的各種神經疾病中也起作用（Yun et al.，

Mol Psychiatr (1997) 2:300-310)。 NO是當L-精氨酸在一氧化氮合成酶(1^〇幻作用下被 氧化為瓜氨酸時而形成的。雖然NO本身是一種自由基， 具有一個不成對電子，但它本身未被察覺參與了任何會造 10 成嚴重損害的化學反應。然而，當NO與超氧化物陰離子 反應時，就形成了反應性極強的氧化劑過氧亞硝基陰離子 (ONOC〇(<www.gsdl.com/news/ 1999/ 1990302/index>，最 後一次瀏覽的時間是2002年11月12曰）。 N-曱基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的神經毒性，可 15 能部分地依賴於經NO產生的過氧亞硝基陰離子（〇〇n〇-) (Lipton et al·，Nature (1993) 364(6438):626-632)。這種开j 式 的神經毒性被認為在各式各樣急性和慢性的神經系統疾 病中對於損傷的最終共同途徑起了 一定的作用；這些疾病 包括局灶性缺血(focal ischemia)、外傷、癲癇症、亨廷頓 20 舞蹈症（Huntington’s disease)、阿爾茨海默氏病 (Alzheimer’s disease)、肌萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis)、愛滋病相關的癡呆症（AIDS dementia)以 及其他神經退化性疾病。（Bonfoco et al·，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1995) 92:7162-7166)。而且，過氧亞硝基陰離子 200530400 參與神經元内多種損傷性過程，包括DNA鏈斷裂、DNA 脫氨基作用、包括過氧化物歧化酶在内的蛋白的硝化，以 及線粒體複合體 I 的破壞等 (www.gsdl.com/news/1999/1990302/in心γ，最後一次瀏覽 5 的時間是2002年11月12日）。確實，ONOO-已顯示可引 起神經元死亡。有人認為這種神經元死亡存在於中樞神經 糸統各種不同的疾病中’例如腦缺血、愛滋病相關的瘋呆 症、肌萎縮性脊髓側索硬化症等 （Moro et al·，

Neuropharmacology (1998) 37(8):1071-1079)。此外，通過 ίο NMDA受體作用的過量谷氨酸可介導局部腦缺血時細胞 的死亡（Yunetal· (1997)，同上文）。谷氨酸的神經毒性也 可能在神經退化性疾病如亨廷頓舞蹈症和阿爾茨海默氏 病中起了一定的作用（Yun et al· (1997)同上文）。 因此，取決於侵襲的具體情況，NMDA或一氧化氮/ 15 超氧化物可導致凋亡性神經元細胞的損壞。 通過大腦顆粒細胞(CGC)與免疫啟動小膠質細胞的共 培養，可使NMDA受體介導的細胞死亡現象加劇（Hewett et al·，Neuron (1994) 13(2):487_494; Kim et al·，J· Neurosci· Res· (1998) 54(1):17-26)，從而暗示了誘導型NOS在上述 2〇 類型神經毒性中的作用。而且，這種加劇與NO供體3- 嗎琳斯得酮亞胺（SIN-1)的作用相似。此外，這種NMDA 神經毒性的增強/加劇以及由NO供體（例如SIN-1或S-亞 硝基乙醯青黴胺：SNAP)所產生的類似加強作用，似乎 可被NOS抑制劑或抗氧劑（過氧化物歧化酶/過氧化氫酶） 200530400 所阻斷（Hewettetal.(1994)同上文；Kimetal.(1998)同 上文）。 與之相反，用NOS抑制劑處理CGC並不能挽救接觸 神經醯胺的這類細胞（Monti et al·，Neurochem. Int. (2001) 5 39(1):11-18; Nagano et al·，J· Neurochem. (2001) 77(6):1486-1495)。而且，在其接觸神經醯胺後所觀察到的 凋亡可能未涉及NMDA受體的作用（Centeno et al.， Neuroreport (1998) 9(18):4199·4203; Moore et al·，Br· J. Pharmacol· (2002) 135(4):1069-1077)。 i〇 綜上所述，這些資料提示，神經酿胺的作用主要不是 依賴於NO的產生，而且神經醢胺和NO供體例如SIN-1 或SNAP是通過不同的途徑誘導細胞的凋亡。 因此，考慮到上文提及的眾多與NMDA/過氧亞硝基 陰離子相關的疾病，可選擇性挽救接觸SIN-1如神經毒素 15 的細胞的分子，若作為選擇性抗凋亡劑應該是很有價值 的，而且在有效地治療與NMDA/過氧亞硝基陰離子相關 的神經系統疾病的過程中是很有用的。 本專利申請人鑑定了一種分泌性神經元凋亡抑制蛋 白（Secreted Neural Apoptosis Inhibiting Protein，SNAIP)， 20 它具有神經保護作用並能選擇性地保護細胞免遭SIN-1等 分子的神經毒性侵害，但對C2神經醯胺引起的神經毒性 則無效。 【發明内容】 -11- 200530400 本發明之概要說明 本發明涉及一種調控過氧亞硝基陰離子所誘導的神 經元細胞凋亡的方法，該法包括使分泌性神經元凋亡抑制 蛋白（SNAIP)與上述細胞接觸。在一個相關的方面，本方 5 法包括加入肝素；在另一相關的方面，本方法可調控谷氨 酸/NMDA所誘導的凋亡。 本發明也涉及凋亡途徑，包括相關基因的誘導。這些 基因包括p38 MAPK和生長抑制及DNA損傷誘導基因（即 GADD) 〇 10 此外，本發明涉及一種方法，它可保護神經元免遭過 氧亞石肖基陰離子相關自由基介導的細胞死亡，該法包括使 SNAIP與上述細胞接觸。 而且，本發明涉及一種方法，它可測定與過氧亞硝基 陰離子毒性途徑相關的神經保護基因組目標序列。在一個 15 相關的方面，這種方法可包括以下步驟：一、使神經元細 胞與SNAIP接觸或不接觸；二、使上述細胞與過氧亞硝 基陰離子誘導物接觸；三、確定所接觸細胞基因表達的調 控；四、鑑定在SNAIP和誘導物存在或不存在的情況下 所調控的基因。這種方法規定了鑑定基因之方法並將這種 20 基因與過氧亞硝基陰離子所誘導的凋亡抑制相互關聯起 來。在一個相關的方面，上述方法也包括用肝素接觸細 胞。在另一相關方面，該誘導物是SIN-1。 本發明還涉及一種方法，它可治療與自由基介導的細 胞死亡相關的神經元疾病，其包括當細胞死亡屬於凋亡 -12- 200530400 時，給予需要治療的患者施用有效治療劑量的SNAIP。在 一相關的方面，與凋亡相關的疾病包括巴金森氏病 (Parkinson，s disease)、多發性硬化症（multiple sclerosis)、 局部性腦缺血(focal cerebral ischemia)、愛滋病相關的癡呆 5 症（dementia)、肌萎縮性脊髓側索硬化症（amyothrophic lateral sclerosis)、脊髓:損傷、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、中風以及阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease) 等。在一相關的方面，該治療方法包括施用肝素。 本發明之另一個方面是，彼露了調控SNAIP表達的治 ίο 療方法，包括給需要治療的患者施用肽類、致效劑、拮抗 劑、反致效劑和/或抗體。SNAIP也能被用於鑑定可結合 FZ的分子。這些分子可以是致效劑或拮抗劑，僅僅與fz 連接’但隶好為抬抗劑’以儘量減少信號轉導，從 而避免細胞〉周亡。 15 本發明之又一個方面是’披露了鐘定SNAIP調節物之 方法，其步驟包括：提供一種化學基團；提供一種表達 SNAIP的細胞或純化的SNAIP;確定該化學基團是否與 SNAIP結合。纟一個相關的方面，該化學基團可以包括但 不限於肽類、抗體和小分子。 2〇 本發明之再一個方面包括了治療組合物，這些治療組 合物包括核酸、抗體、多肽、致效劑、反致效劑以及抬抗 劑。而且，本發明之方法也包括給需要治療的患者施用這 些治療組合物的治療方法。其活性成分可以是用SNAlp 鑑定出來的一種分子或SNAIP本身。 -13- 200530400 通過參考本發明之詳細說明和附圖，本發明之這此方 面和其他方面將變得顯而易見。此外，此處列出了許多更 詳細地敘述某些步驟或組合物的參考文獻。每一篇灸考文 獻都作為整體而引述在此，就好像每一篇都是單獨地引述 5 在此一樣。 ^ 本發明之詳細說明 本發明之蛋白與被稱為分泌性凋亡相關蛋白（SARp) 的蛋白家族具有約6〇%的同源性。本專利申請者們測定了 1〇 該分子在大腦裏的表達，發現其在胎兒大腦裏的豐度比成 人大腦的為高。鑒別出該蛋白的區域是成人的前腦、中腦 和後眼區，而並非是它曾被發現的區域，即腦室區。該蛋 白和任何特定的細胞類型之間不存在詳細的關聯。該^白 似乎是抗凋亡的。SNAIP可保護神經元免受自由 15 細胞死亡。 町 办、因此，在—具體實施例中’SNAIP及其調節作用是研 ，神經退化性疾病治療干賴物的目標；神經退化性疾病 包括Γ不限於巴金森氏病、多發性硬化症、大腦局部缺 =、愛滋病相關的老年癡呆、肌萎縮性側索硬化症、脊髓 2〇 損傷、創傷性腦損傷、中風和阿爾茨海默氏病。 失控，過量產生N0能引起毒害神經的連鎖反應。據 推4 NO疋經由過氧亞麟基陰離子而殺害神經元。該強氧 化劑被認為涉及大多數漏介導的神經毒性作用。過氧亞 石肖基陰離子可進一步分解為經基和二氧化氮自由基，它們 200530400 也具有高度的反應性和生物破壞性，能導致因過量產t NO而引起的各種神經失調症狀。 例如，源自神經元的NO在介導局部缺血後神經原細 胞的死亡方面，起了重要的作用。在大腦局部缺血後期^ 6 h)，局部缺血後的炎症誘導了 iNOS的表達，NO的大量 產生導致了延遲性神經損傷(Yunetal· (1997)同上文）。 在一相關方面，3-硝基酪氨酸（3·ΝΤ)是蛋白被過氧 亞硝基陰離子（ONOCT)硝化的特定標記，而過氧亞确基 陰離子是由NO和超氧化物產生的。據報導，某些神經退 化性疾病的患者，其大腦中3-NT蛋白（即含3_NT的蛋白） 之含量有所增加（Yamamoto et al” J· Neural· Transm. (2002) 109(1) : M3)。因此，在一具體實施例中，3_NT被用作 為識別SNAIP相關途徑的標記。 在一更深入的相關方面，有絲分裂原啟動蛋白激酶 (MAPK)信號途徑籍由NO的啟動，可能是N〇如何調節 神經原的生長、刀化、生存和死亡的關鍵D由於]yjAPK信 號途徑在神經系統生長因子反應（ERK)或逆境反應 (JNK，P38MAPK)中起了主要的作用，NO-ΜΑΡΚ信號可 解釋在神經原的發育和疾病/損傷過程中，NQ在神經原的 生存、分化和凋亡細胞的死亡過程中所起的作用，（Yun 等。（1997)同上文）。 經發現，一種過氧亞硝基陰離子供體，3_嗎琳斯得綱 亞胺（SIN-1)’在人類神經母細胞瘤SH_SY5Y細胞内的細 胞死亡早期階段，誘導了三種不同的生長抑制和DNA損 200530400 傷誘導（GADD)的 mRNAs 即 GADD34、GADD45 和 GADDI 53的表達。過氧亞石肖基陰離子還啟動了 p3 8 MAPK。三種GADD基因的表達以及p38 MAPK的鱗酸化 也被用自由基清除劑、超氧化物歧化酶加過氧化氫酶和谷 胱甘肽的處理所抑制（〇|1奶11丨6{&1.，？代6^^(1丨。.6丨〇1.1^(1· (2001) 30(2): 213-221)。因此，在一具體實施例中，所關 注的途徑包括 GADD34、GADD45、GADD153 和 P38 MAPK> 10 15 SNAIP具有神經保護作用且能選擇性地預防SIN-1， 但不能預防C2神經醯胺、神經毒性。SNAIP被細胞釋放 到介質中，特別是當肝素存在時。 在一個相關方面，NO供體例如SIN-1或SNAP和神 經醯胺通過不同的途徑誘導了凋亡。在一較佳的具體實施 例中，SNAIP選擇性地防止了 NMDA誘導的凋亡。 SNAIP在那些以及其他一些組織中的存在提示， SNAIP與涉及各種神經退化性症狀的各種神經系統疾病 密切相關。SNAIP在那些組織中的鑑定和SNAIp編碼基 因的克隆，提供了各種各樣的治療方法以調節SNAlp的 表達和活性，㈣提供了轉SNAIP相_病的各種方 法0 人類的SNAIP與分泌性凋亡相關的蛋白(sARp) 只有60%的氨基酸同源性，而且與分子具有某種保守 和功能特點的（SARP)家族互不才目關。當提及本發明之 和核酸分子時，術語“家族，，旨在表示整體上具有共同結構 20 200530400 域和具有足夠的氨基酸或核苷酸序列同源性的兩種 < 兩 種以上的蛋白或核酸分子，正如本文中所定義的。芦 x ^ <像的 豕族成員可天然地產生且可源自相同的或不同的種類。例 如，一個家族可含有源自人類的第一個蛋白和源自氣科的 5 該蛋白同源物，以及第二個源自人類的截然不同的蛋白年 源自鼠科的該蛋白同源物。同一家族的成員還可以具有此 同的功能特徵。 ^ 本文中的術語“相當的氨基酸殘基”意為當對兩個或 兩個以上的序列進行比對分析時，這些氨基酸在蛋白序歹q 10 内基本上占據了同樣的位置。 本文中所用的術語“足夠地相同”指的是第一個氨基 酸或核苷酸序列與第二個氨基酸或核苷酸序列比對時，含 有足夠數量或最少數量的相同或相當的（例如，帶有類似 的侧鏈）氨基酸殘基或核苷酸，從而使得第一個氨基酸或 15 核苷酸序列和第二個氨基酸或核苷酸序列具有共同的結 構域和/或共同的功能活性。例如，含有共同結構域的氨 基酸或核苷酸序列，若具有約75%的同源性，較佳的是 80%的同源性，更佳的是85%、95%或98%同源性，則在 本文中被定義為足夠地相同。 20 如同本文中互換使用的，“SNAIP活性”、“SNAIP的 生物活性”或“SNAIP的功能活性”指的是按照標準的技術 或本文中所講授的技術，由SNAIP蛋白、多肽或核酸分 子施加在SNAIP敏感細胞上的活性。SNAIP活性可以是 直接活性，例如與第二個蛋白的關聯，或間接活性，例如’ -17- 200530400 通過:個SNAIP蛋白與第二個蛋白的相互作用而介導的 、、^K口 ?纽。在—較佳的具體實施例中，SNAIP活性至 夕包括以下一種或幾種活性··⑴在Wnt/FZ信號途徑上 與蛋白相互作用的能力；（ϋ)與SNAIP受體(例如，FZ)相 5 互作用的月匕力，㈣與細胞内-目標蛋白相互作用的能 力’以及㈣_導SNAIp的生物表現的能力。例如，以 本技術領域内眾所·的手段可確定 ，SNAIP的活性或表 現包括但不限於抑制Wm與FZ的結合。 相應地本發明之另一具體實施例的特點是分離出的 10 具有SNAIP活性的SNAIP蛋自和多肽。 本發明之各方面的特點將在以下各節中進一步詳述。 L分離出的核酸分子 本發明之一個方面係關於分離出的核酸分子，它們編 15 碼SNAIP或編碼其生物活性的部分；並關於足以作為雜

化探針以鑑定SNAIP編碼核酸(例如，sNAIPmRNA)的核 酸分子’以及作為SNAIP核酸分子擴增或突變的PCr引 子的片段。如本文中所使用的，術語“核酸分子，，旨在包括 DNA分子（例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子（例 20 如，mRNA)，以及使用核苷酸類似物所產生的DNA或RNA 類似物。此核酸分子可以是單股的或雙股的。 “分離出的”核酸分子是指從核酸天然資源其他核酸 分子中分離出的一個核酸分子。最理想的是，一個“分離 出的，，核酸不含原本天然地存在於衍生出該核酸的有機體 -18- 200530400 基因組DNA内謗核酸侧翼的核苷酸序列中（最好是蛋白編 碼序列）（即位於核酸5,端和3,端的序列）。例如，在各種 各樣的具體實施例中，該分離出的SNAIP核酸分子可能 含有少於約 5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb 或 0·1 5 kb上述的核苷酸序列；在衍生出該核酸的細胞基因組 DNA内’這些核苷酸序列原本天然地存在於該核酸分子 的侧翼。而且，一個“分離出的，，核酸分子，例如cDNA分 子，當以重組技術產生時，可基本上不含其他細胞物質或 培養基；或者，當以化學方式合成時，可基本上不含化學 ίο 前體或其他化學物質。 本發明之核酸分子或這些核苷酸序列的任何互補序 列，均可採用標準的分子生物學技術分離出來（例如，如

Sambrook et al·，eds·，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed·，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 15 Cold Spring Harbor，NY, 1989 —文中所述）。 通過人類SNAIP基因的克隆而確定的核苷酸序列，可 以產生某些探針和引子。這些探針和引子是設計用於鑑定 和/或從其他組織克隆其他細胞内的SNAIP同源物，以及 從其他哺乳動物克隆SNAIP同源物。該探針和引子通常 20 包括基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包括這樣一個 核苷酸序列區域’它在嚴格的條件下雜化為SNAIP的正 意股或反意股序列或SNAIP天然產生的突變體内至少約 12個，較佳的是25個，更佳的是約5〇、75、1〇〇、125、 150、175、200、250、300、350或400個連續的核普酸單 200530400 位以人類SNAIP核皆酸序列為基礎的探針可用於檢測 可編碼相似或相同蛋白的轉錄序列或基因組序列。該探針 可包括一與其相連的標記基團，例如，放射性同位素，螢 光化合物，酶或酶辅助因子。這類探針可用作為診斷試驗 成套試劑的一部分，以鑑定不適當地表達SNAIp蛋白的 細胞或組織，例如通過測量SNAIP編碼核酸在實驗對象 細胞樣品中的含量，例如，檢測SNAIp mRNA含量或確 定是否一個基因組SNAIP基因已發生突變或被剔除里。3 編碼“SNAIP生物活性部分，，的核酸片段可㈣ 可編碼多肽的多核苷酸來製備，多肽且右 刀 過重組表達)和判斷SNAIP編碼部分的活性。（彳如、 換方^該片段可與已知可滅活嶋？的抗體^一種替 15 二，㈣將會理解，導致·Ιρ氨基 的DNA序列多態現象，可存在於一個 ，職化 内。由於天然的等位基因變異，這種SNai^列如人群） 多態現象可存在於—個群體的某些成員中。等=的基因 =-特定基因位點出現的一組基因中的―個基因基：：在 中所使用的，術語“基因，，和“重組基0，，指@ :如本文 S N AIP蛋白的開放讀框的二：：3 -編碼 3麵蛋白。如本文中所使用的，術哺乳動物的 的是出現在讀位點或該核聽序列編碼:因：異’’指 ^酸序列，該核苦酸或多肽並非中^肽的核 遍形式。等位基因可ϋ讲斟了野賵中所發現的普 通過料多不同個體令的有關基因進 20 200530400 行測序而加以鑑定。通過使用雜化探針來鑑定許多不同個 體的同一基因位點，就很容易達到這一目的。作為天然等 位基因變異的結果且不改變SNAIP功能活性的這類核苷 酸的任何變異和所有變異，以及所引起的SNAIP氨基酸 5 的多恶現象或突變，均包括在本發明之範圍之内。 此外’那些具有不同於人類SNAIP的核苷酸序列、可 編碼其他種類SNAIP蛋白（SNAIP同源物）的核酸分子，也 包括在本發明之範圍之内。那些對應於本發明之SNAIP cDNA的天然等位基因的變異物和同源物的核酸分子，可 ίο 以按照嚴格雜化條件下的標準雜化技術用人類cdna或 其一部分作為雜化探針，以它與此處所披露的人類SNAIp 核酸的同源性為基礎進行分離。 相應地，在另一具體實施例中，本發明分離出的核酸 刀子長度至少為 300、325、350、375、400、425、450、 15 500、550、600、650、7〇〇 ' 800、900、1〇〇〇 或 11〇〇 個核 苷酸，且在嚴格的條件下雜化為一個具有SNAIp活性的 核酸分子。 如本文中所使用的，術語“在嚴格的條件下雜化，，意欲 描述這樣一些雜化和洗滌條件，在這些條件下至少 2〇 (65%、7〇%，較佳的是75〇/〇或以上）彼此相同的核普酸序 列通常保持著互相雜化的狀態。這樣的嚴格條件是孰系本 技術者所熟知的，而且可在文獻中查到，例如，

Protocols in Molecular Biology，john Wiley & 如仍，Ν γ (1989)，6.3.1-6.3.6。嚴格的雜化條件一個較佳的非限制性 -21- 200530400 例子是，於約45 °C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中進行 雜化，隨後於50-65 0C在〇·2χ SSC，0.1% SDS中洗滌一 遍或多遍。如本文中所使用的，“天然產生的，，核酸分子指 的是包含一天然產生的核苷酸序列（例如，編碼一天然產 5 生的蛋白）的RNA或DNA分子。 除了可能存在於該群體中的SNAIP序列的天然產生 的等位基因變體’熟悉本技術者還將會理解，突變可誘導 變化，從而導致編碼後SNAIP蛋白中氨基酸序列的變化， 但不改變SNAIP蛋白的生物活性。例如，可以進行核苷 ίο 酸取代以導致氨基酸取代在“非實質性，，氨基酸殘基上。一 個“非實質性氣基酸殘基是這樣一種殘基，它可從野生塑 的SNAIP序列演變而來，但其生物活性並未改變，而“實 質性”氨基酸殘基則是生物活性所必需的。例如，各種物 種SNAIP中未保留或只保留一半的氨基酸殘基，對於活 15 性可能是非實質性的，因此很可能成為改變的目標。換言 之，保留在各種物種SNAIP蛋白中的氨基酸殘基，對於 活性可能是貫質性的’因此不大可能成為改變的目標。 相應地，本發明之另一方面係關於可編碼SNAIP蛋白 的核酸分子，它們的對於活性是非實質性的氨基酸殘基中 20 包含了某些變化。在一具體實施例中，分離出的核酸分子 包括一個可編碼蛋白的核苷酸序列，它所包括的一個氨基 酸序列，與一具有SNAIP活性的多肽相比，至少約87〇/〇、 90%、93%、95%、98% 或 99%相同。 通過在天然產生的SNAIP的核替酸序列上導入一個 -22- 200530400 或多個核苷酸的取代、添加或刪除，可產生一個編碼含有 一變異序列的SNAIP蛋白的分離出的核酸分子，從而可 將一個或多個氨基酸的取代、添加或刪除導入被編碼的蛋 白0 10 15

可以通過標準的技術引入各種突變，例如針對位點的 突變和PCR介導的突變。較佳的是，使保守的氨基酸取 代在一個或多個預期是非實質性的氨基酸殘基上。“保守 的氨基酸取代”指的是該氨基酸殘基被一個具有相似側鏈 的氨基酸殘基取代。具有相似侧鏈的氨基酸殘基家族在本 技術領域内已有所定義。那些家族包括具有驗性侧鏈的氨 基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸），酸性側鏈(例如天冬 氣酸和谷氣酸）’不帶電的極性侧鍵(例如甘氨酸、天冬酿 胺、榖醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、路氨酸和半胱氨酸），非 極性侧鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸），P-分支側鏈(例 如，蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）以及芳香族S鏈(例如，

酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和組氨酸）。因此，SNAIP 内一個預期是非實質性的氨基酸殘基，最好是被另〆個屬 於同一侧鏈家族的氨基酸殘基取代。作為替換方式， 也可以沿著SNAIP編料列的全部或部分_地弓!入突 變，例如通過飽和突變的方式，而且可以 的突 變體的SN规生物活性，以鑑定保以性㈣變體。在 突變之後，被編碼的蛋白可以重組地表達， 性可 以被測定。 龙曰的/ -23- 20 200530400 在一較佳的具體實施例中，可以從以下方面檢驗突變 體SNAIP蛋白：（1)與snAIP信號途徑内的蛋白形成蛋 白與蛋白之間相互作用的能力；（2)與SNAIP受體(例如 FZ)結合的能力；或（3)與細胞内目標蛋白結合的能力。在 5 另一較佳的具體實施例中，可以檢驗一突變SNAIP調節 細胞增殖或細胞分化的能力。 本發明包含反意核酸分子，即，與編碼蛋白的正意核 酸互補的核酸分子，例如，與一雙股cDNA分子的編碼股 1〇 互補或與一 mRNA序列互補。相應地，反意核酸能以氫 鍵與正意核酸結合。該反意核酸可與SNAIP編碼股的全 4或一部分互補，例如，與蛋白編碼區域的全部或一部分 Y或開放讀框）互補。反意核酸分子可以是編碼SNAIP的核 ，酸序列的編碼股的非編碼區域的反意股。該非編碼區域 15 ( 5和3’末端未轉譯區域或侧翼區域”)是編碼區域側翼的 未被轉澤至氨基酸内的5,和3’末端序列。反意股份子可用 於抑制表達，例如抑制FZ的表達。 反意寡核苷酸的長度可以是，例如，約5、1〇、15、 、25、30、35、40、45或50個核苷酸。本發明之反意 2〇 久可以利用化學合成和酶接合反應並採用本技術領域 ，已知的步驟來構建。例如，反意核酸(例如，反意募核 苷峻）可以用天然產生的核苷酸或各種經變更的核苷酸以 予方式合成；這些經變更的核普酸是設計用於增加分子 的生物穩定性，或增加反意核酸和正意核酸之間所形成雙 鏈的物理穩定性，例如，硫代磷酸酯的衍生物、膦酸脂的 -24· 200530400 衍生物和吖啶取代的核苷酸均可以使用。 本發明還考慮到另一些抑制性RNA分子，例如 分子。構建了適當的雙股或髮夾型RNA並用於調節·lp 10 15 20 :用於產生反意股和其他核酸的經變更核苦酸的例 子匕括5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5_氯尿嘧啶、5_班 σ定、次黃嗓呤、黃嗓呤、乙基胞核射、5儀声甲= 尿♦定、1-曱基鳥嗓呤、5,曱氨基曱基士硫尿苦工、^ 甲氨基曱基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、卜半乳糖Q核苷、 甙、N6_異戊烯基腺嘌呤、^甲基肌苷、2,2_二曱基高娜人 2 -甲基腺嗓呤、2-甲基鳥,票呤、3.甲基胞核㈣美 ^純嚏:畝腺嗓呤、MU票呤、5·曱氨基甲基尿$ 咬二5-甲氧氨基曱基1硫尿t定、β-D-甘露糖Q核芽、5二 甲氧基羧曱基尿嘧啶、5_甲氧基尿嘧啶、2_甲基硫七6_里 戊晞基腺°示呤、尿噹咬_5_經乙酸、but〇x〇sine、假尿喷咬、 Q核苷、2-硫胞核嘧啶、5_甲基硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、5-曱基尿嘧啶、尿嘧啶_5-羥乙酸甲酯、^曱 基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基_3_n_2_羧丙基)尿嘧啶，以 二氨基嘌呤。 > 作為-種替換方式，反意核酸也可用一種表達载體以 生物方式生產’該表達載體内以反意的取向亞克隆了一 酸分子（即相對於所考慮的目標核酸，從被插人核酸 的RNA將具有反㈣向。這將在以下分節 ^ -25- 200530400 本發明之反意核酸或其他核酸分子可以是一個…端 基差向異構核酸分子。端基差向異構核酸分子形成特殊 的帶有互補RNA的雙股雜化物，其中各股互相平行 (Gaultier et al·，Nucleic Acids Res· (1987) 15:6625-6641)。 5 該反意核酸或其他核酸分子也可包含一個曱基核糖核:gl 酸（Inoue et al·，Nucleic Acids Res (1987) 15:6131-6148)或 一個嵌合體 RNA-DNA 類似物（Inoue etal·，FEBS Lett. (1987) 215:327-330)。 本發明還包括核酶。核酶是一些具有核糖核酸酶活性 ίο 的催化RNA分子，它們能切開含有一個與它們互補的區 域的單股核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如，jjaselhoff etal·，Nature (1988) 334:585-591中所述的錘頭狀核酶）可 用來在催化條件下切開SNAIPmRNA轉錄系列，從而抑 制SNAIP mRNA的轉譯。具有SNAIP編竭核酸特異性的 15 核酶，可以天然產生的SNAIP cDNA的核苷酸序列為基礎 而設計。例如，可以構建四膜蟲L-19 I VS RNA的衍生物， 其中活性位點的核苷酸序列與SNAIP編碼mRNA内將要 被切開的核苷酸序列是互補的，參閱，例如，Cech等， 美國專利4,987,071 ;和Cech等，美國專利5，116,742。作 20 為一種替換方式，SNAIP mRNA可用於從許多RNA分子 中選擇具有特殊核糖核酸活性的催化RNA，參閱，例如， Bartel 等，Science (1993) 261: 1411-1418。 本發明遥包括形成二螺旋結構的核酸分子。例如，通 過瞄準與SNAIP的調節區互補的核苷酸序列（例如， -26- 200530400 SNAIP啟動子和/或促進子），可以抑制SNAIp的基因表 達，以形成預防目標細胞内SNAIP基因轉錄的三螺旋結 構’一般可參閱 Helene，Anticancer Drug Dis. (1991) 6(6):569; Helene，Ann· Ν·Υ· Acad· Sci· (1992) 660:27;以 5 及 Maher，Bioassays (1992) 14(12):807。 在一較佳的具體實施例中，本發明之核酸分子可以在 驗基、糖基或磷酸基主鏈部分被變更，以改善例如分子的 穩疋性、雜化性或可溶性。例如，核酸的去氧核糖填酸基 的主鏈可以被變更，以生成肽核酸（參閱HyrUp et al·， 10 Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5)。如本文中 所使用的’術語“肽核酸”或“PNA”指的是核酸的模擬物， 例如，DNA模擬物，其中去氧核糖磷酸基主鏈被假核苷 主鏈取代’而只有四個天然核鹼基被保留。PNA的中性 主鏈已被證明可在低離子濃度的條件下特異性地雜化到 15 DNA和RNA上。PNA寡聚體的合成可使用標準的固相肽 合成方案來實現’正如前述Hyrup et al· (1996)和

Perry-0，Keefe etal·，Proc· Natl· Acad. Sci· USA (1996) 93:14670等文中所述。 SNAIP的PNA可用於治療和診斷。例如，PNA可作 2〇 為反意或反基因製劑而調節特定序列的基因表達，例如， 通過誘導轉錄或轉譯的抑制或抑制複製的方式。SNAIP的 PNA當與其他的酶例如S1核酸酶結合使用時可作為人造 限制酶使用（Hyrup (1996)同上文），或作為〇ΝΑ序列和 雜化的探針或引子使用（Hyrup (1996)同上文； -27- 200530400

Perry_0’Keefe等（1996)同上文）’以用於基因内單對驗基 突變的分析，例如，通過PNA指導的PCR夾子法 (clamping)； 在另一具體實施例中，可通過將親脂性或其他辅助子 基團連接在PNA上，通過形成PNA-DNA嵌合體，或通 過使用脂質體或本技術領域内已知的其他藥物輪入技術 等方式，來變更SNAIP的PNA，其目的是提高穩定性、 特異性或細胞的攝取量等。PNA-DNA嵌合體的合成可按 照以下文獻所述而進行：Hyrup (1996)，同上文；Finn等 ίο Nucleic Acids Res· (1996) 24(17): 3357_63; Mag 等，Nucleic Acids Res· (1989) 17: 5973 ;以及 Peterser 等，Bioorganic Med· Chem· Lett· (1975) 5: 1119。 II.分離的SNAIP蛋白和SNAIP抗體 15 本發明之一個方面係關於分離出的SNAIP蛋白，及其 生物活性部分’以及適合作為免疫原來培養SNAIP抗體鲁 的多肽片段。在一具體實施例中，町通過使用標準的蛋白 純化技術、採用適當的純化方法，從細胞或組織分離出天 生的SNAIP蛋白。在另一具體實施例中，SNAIP蛋白是 20 通過使用重組DNA技術而生產的。作為重組表達的替換 方式，可使用標準的肽合成技術以化學方式來合成SNAIP 蛋白或多肽。 “分離的，，或“純化的，，蛋白或其生物活性部分，基本上 不含細胞物質或來源於衍生該SNAIP蛋白的細胞或組織 -28- 200530400 的其他污染性蛋白，或者，當以化學方式合成時，基本上 不含化學前體或其他化學物質。“基本上不含細胞物質”的 說法包括SNAIP蛋白製劑，其中該蛋白被從細胞成分中 分出，SNAIP蛋白則從中被分離出或以重組方式生產。因 5 此，基本上不含細胞物質的SNAIP蛋白，包括其中非 SNAIP蛋白（在本文中又稱為“污染性蛋白”)含量少於約 30%、20%、10%或5% (幹重）的SNAIP蛋白的製劑。當 SNAIP蛋白或其生物活性部分是以重組方式產生時，最理 想的是它還基本上不含培養基，即培養基只占蛋白製劑體 ίο 積的約20%、10%或5%以下。當SNAIP蛋白是以化學合 成方式生產時，最理想的是它基本上不含化學前體或其他 化學物質，即它與參與蛋白合成過程的化學前體或其他化 學物質互相分離。相應地，這樣的SNAIP蛋白製劑只含 約30%、20%、10%或5% (幹重）的化學前體或非SNAIP 15 化學物質。 SNAIP蛋白的生物活性部分所包含的肽，含有與 SNAIP蛋白的氨基酸序列十分相似的氨基酸序列，或含有 從SNAIP蛋白的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，這些氨 基酸序列所包含的氨基酸數量比整個的SNAIP蛋白為 2〇 少，並顯示出SNAIP蛋白的至少一種活性。通常，生物 活性部分包括一個至少具有一種SNAIP蛋白活性的區域 或基序。SNAIP蛋白的生物活性部分可以是一個長度為例 如10、25、50、100個或更多個氨基酸的多肽。較佳的生 物活性多肽包括一個或多個已鑑定的SNAIP結構域，例 -29- 200530400 如’ 一個或多個細胞外域。 而且’其他的生物活性部分（其中該蛋白的其他區域已 被刪除）可以用重組技術來製備，並就天然snaip蛋白的 一種或多種功能活性加以評估。 5 相應地，有用的snaip蛋白是這樣的_種蛋白，它所 包括的氨基酸序列與天然產生的SNAIP的氨基酸序列相 比，至少約88%、較佳的是90〇/〇、93%、95%或99%相同， 而且它保持了 SNAIP的功能活性。 為了確疋兩個氣基酸序列或兩個核酸之間的同源性 10 百分比，將這些序列對準以便進行最佳的比較（例如，可 在弟一個氨基酸或核酸序列中引入空位，以便與第二個氨 基酸或核酸序列最佳地對準）。然後，將處於對應的氨基 酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。當 第一個序列内的一個位置被與第二個序列内對應位置同 15 樣的氨基酸殘基或核苦酸占據時，那麼該位置的分子即為 相同。兩個序列之間的同源性百分比，是這些序列所共用 的相同位置數目的函數（即’同源性百分比==相同位置數/ 位置總數（例如重疊的位置數）X 100)。在一具體實施例 中，這兩個序列具有同樣的長度。 20 兩個序列之間的同源性百分比可用一種數學演算法 來確定。比較兩個序列的數學演算法的一個較佳的、非限 制性例子是 Karlin 等人在 Proc· Natl· Acad. Sci. USA (1990) 87:2264 中提出，又在 Proc· Natl· Acad. Sci· USA (1993) 90··5873-5877中修改的演算法。這樣的演算法被納入 -30- 200530400

Altschul 等人在 J· Mol· Bio· (1990) 215:403 中提出的 NBLAST和XBLAST程式中。可以用NBLAST程式進行 BLAST 核苦酸搜索，例如，score 二 100，wordlength = 12 ’ 以獲得與本發明之SNAIP核酸分子同源的核苷酸序列。 5 可以用XBLAST程式進行BLAST蛋白搜索，例如，score =50，wordlength = 3，以獲得與本發明之SNAIP蛋白分 子同源的氨基酸序列。為了比較的目的而獲得空位對準 線，可使用如 Altschul 等人在 Nucleic Acids Res· (1997) 25:3389中所述的Gapped BLAST。作為一種替換方式， ίο PSI-Blast可用於進行可測出分子之間遙遠關係的重複搜 索。Altschul 等，（1997)同上文。當使用 BLAST Gapped BLAST和PSI-Blast程式時，可使用各程式的缺省參數(例 如 XBLAST 和 NBLAST) ， 參 閱 http://www.ncbi.nlm.nih.gov ° 15 另一較佳的、用於比較序列的數學演算法的非限制性 例子是Myers等人在CABIOS (1988) 4:11-17中提出的演 算法。這種演算法被納入ALIGN程式（版本2.0)，它是GCG 序列比對軟件的一部分。當使用ALIGN程式比較氨基酸 序列時，可用ΡΑΜΙ20權重殘基表(weight residue table) 2〇 並以空位長度罰分(gap length penalty) 12 、空位罰分(gap penalty) 4 為參數。 兩個序列之間同源性百分比可採用與如上所述類似 的技術，在允許空位或不允許空位的條件下來確定。在計 算同源性百分比時，只有精確配對的殘基才計算在内。 -31 - 200530400 在一較佳的具體實施例中，製備了所關注的Wnt結 合部分。SNAIP結構的這一部分可單獨使用或與另—分^ 融合，例如利用本技術領域内已知的技術和試劑與—報道 分子(reporter molecule)融合。這樣，通過在Wnt與FZ |士 5 合之前就俘獲Wnt，可將可溶性SNAIP用於下調Fz。口 在某些寄主細胞（例如，哺乳動物的寄主細胞）内，通 過使用一種異源信號序列的方式可加強SNAIP的表達 或分泌。例如，杆狀病毒包膜蛋白的gp6®分泌序列即可用 作為異源信號序列（Current Protocols in Molecular Biology 10 Ausubel et al·，eds·，John Wiley & Sons，1992)。真核細胞異 源信號序列的其他例子包括蜂毒素和人類胎盤驗性鱗酸 鹽的分泌序列（Stratagene; La Jolla，California)。在另一實 例中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號 (Sambrook等，同上文）和蛋白A分泌信號（Pharmacia 15 Biotech; Piscataway，New Jercy) 〇 最理想的是，本發明之SNAIP嵌合或融合蛋白通過標 準的重組DNA技術來製備。例如，按照常規技術將編石馬 不同多肽序列的DNA片段連接到同一讀碼框内，例如通 過利用平末端或粘性末端連接，利用限制性内切酶消化以 20 提供適當的末端，根據需要補平粘性末端，利用鹼性磷酸 酶處理以避免不需要的結合，以及酶促連接等。在另一具 體實施例中，可通過常規技術合成融合基因，包括使用自 動DNA合成儀。作為一種替換方式，基因片段的PCR擴 增可以利用錨定引物在兩個相繼的基因片段之間產生互 -32- 200530400 補的突出端，而後煉合並再擴增以產生欲合的基因序列。 (參閱例如Ausubel等，同上文）。此外，許多已經包含融 合蛋白（如某種GST多狀）編碼相的表達載體已經商品 化。編碼SNAIP的核酸可以被克隆入這種表達载體，使 SNAIP蛋白與表達載體中融合蛋白部分連接並處於同一 讀碼框内。 本發明還涉及SNAIP蛋白的各種變體（即該蛋白序列 不同於天然產生的、通常的SNAIP等位基因相應的氨基 酸序列）。這類變體可作為SNAIP模擬物而起作用。SNAIp 蛋白的變體可通過致突變作用而產生，例如，不連續點突 變（discrete point mutation)或 SNAIP 蛋白的截斷。SNAIp 蛋白的致效劑或模擬物基本上保留了與天然產生的 SNAIP蛋白同樣的的生物活性，或一部分生物活性。因 此’可以用一個功能受限或得到增強的變體進行治療而產 生特殊的生物效果。相對於用天然產生的SNAIP蛋白進 行治療，用上述這種保留了一部分生物活性的變體對治療 對象進行治療可使副作用較少。

SNAIP蛋白的變體可通過篩選SNAIP蛋白突變體例 如截短的突變體組合資料庫，以獲取具有SNAIP活性的 蛋白而得到鑑定。在一具體實施例中，通過在核酸水準上 的組合誘變，一個多樣化SNAIP變體資料庫得以產生， 並由一個多樣化基因資料庫進行編碼。一個多樣化SNAIP 變體資料庫可以這樣產生：例如，將合成寡核苦酸的混合 物以酶促連接方式連到基因序列上，使得潛在的SNAIP -33- 200530400 序列的退化集合可表達為單個的多肽；或作為一種替換方 式’可表達為含有SNAIP序列集合的較大的融合蛋白的 集合(例如噬菌體展示）。有一系列方法可用於從一個退化 的寡核苷酸序列產生潛在的SNAIP變體資料庫。可在自 5 動DNA合成儀中進行退化基因序列的化學合成，然後， 該合成的基因被連接到一個適當的表達載體上。使用退化 基因集合的方法可在一種混合物内提供為一組所需的潛 在SNAIP序列編碼的所有序列。合成退化寡核苷酸的各 種方法在本技術領域内是眾所周知的（參閱例如，Narang， 10 Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura et al.5 Ann. Rev. Biochem. (1984) 53:323; Itakura et al.? Science (1984) 198:1056; Ike et al·，Nucleic Acid Res· (1983) 11:477) 〇 此外，SNAIP蛋白編碼序列片段資料庫可用於產生一 個多樣化SNAIP片段的群體，以篩選並進而選擇snaIP ^ 蛋白的變體。在一具體實施例中，編碼序列片段資料庫可 以這樣產生·用核酸酶處理SNAIP編碼序列的雙股pcR 片段’控制條件使每個分子只產生一個基因巧合，接著讓 雙股DNA變性、再使之複性而形成新的雙股DNA，後者 所包含的那對正意股/反意股可來自不同的基因巧合產 20 物’然後用S1核酸處理以除去所形成的雙鍵體之單鍵 部分，最後將所得的片段資料庫連到一表達载體内。通過 這種方法，可以產生一個編碼SNAIP蛋白各種不同尺寸 的N-末端和基因内片段的表達資料庫。 本技術領域内已知有數種技術可用於_選以點突變 -34- 200530400 或截短方法所製備的組合資料庫基因產物，以及為具有某 種远定性質的基因產物篩選cdna資料庫。這些技術適用 於快速篩選通過SNAIP蛋白組合誘變而產生的基因資料 庫。經得起高通量分析檢驗的、篩選大型基因資料庫時最 5 廣泛使用的技術通常包括：在某些條件下將基因資料庫克 隆入可複製的表達載體，用所得載體庫轉化適當的細胞， 並表達邊組合基因（combinatorial genes)。在這些條件下， 某種所需活性的檢出可促進載體的分離，該載體為基因產 物被檢出的基因編碼。遞歸整體誘變（Recursive ensemble ίο mutagenesis，REM)是一種提高載體庫中功能突變體頻率 的技術，可與篩選分析結合使用以鑑定SNAIP變體。 (Arkin et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering (1993) 6(3):327-331)。 15 利用製備多克隆抗體和單克隆抗體的標準技術，可將 遊離的SNAIP蛋白、或其一部分或片段作為免疫原，以 產生結合SNAIP的抗體。可以使用全長的SNAIP蛋白， 或作為一種替換方式，使用本發明提供的SNAIP抗原肽 片段作為免疫原。該SNAIP抗原肽至少包括8個（較佳的 20 是10、15、20或30個）SNAIP氨基酸殘基，包含一個SNAIP 抗原決定基，使得所產生的抗原肽抗體與SNAIP形成一 種特異的免疫複合體。該抗原決定基可附在白蛋白之類的 載體分子上。 SNAIP免疫原通常用於製備抗體，其方式是用該免疫 -35- 200530400 原免疫合適的對象(如豕兔、山羊、小氣或其他哺乳動物）。 合適的免疫原製劑可含有例如重組表達的SNAIP蛋白， 或化學合成的SNAIP多肽。該製劑還可包含一種佐劑， 例如弗氏(Freund)完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激 5 因子。用免疫原性SNAIP製劑免疫合適的對象可誘導產 生抗SNAIP多克隆抗體應答。 相應地，本發明之另一個方面係關於抗SNAIP的抗 體。本文中所使用的術語“抗體”指的是免疫球蛋白分子和 免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異結合SNAIP 10 的抗原結合部位的分子。特異結合SNAIP的分子是指那 些結合SNAIP但基本上不結合樣品（例如天然含有snaIP 的生物樣品）中其他分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫 活性部分的例子包括F(ab)和F(ab，)2片段，該兩種片段可以 通過用酶例如胃蛋白酶處理抗體而產生。本發明提供了可 15 結合SNAIP的多克隆和單克隆抗體。本文所使用的術語 “單克隆抗體”或“單克隆抗體成分，，指的是一群抗體分 子，它們只含有一種能夠與SNAIP的特定抗原決定基發 生免疫反應的抗原結合部位。因此，單克隆抗體成分通常 只對與其發生免疫反應的特定SNAIP蛋白顯示單一的結 20 合親合力。 如上所述，多克隆SNAIP抗體可以用SNAIP免疫原 免疫適當對象的方式製備。免疫對象中SNAIP抗體的滴 度可採用標準技術進行實時監測，例如採用酶聯免疫吸附 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法並使用固 -36- 200530400 定化SNAIP。 如果需要，抗SNAIP的抗體分子可從哺乳動物（例如 從血液中）分離並進一步用策所周知的技術純化，例如用 蛋白A色譜法獲取IgG組分。在免疫後某一適當的時間， 5 例如當SNAIP抗體滴度最高的時候，可從免疫對象中獲 取產生抗體的細胞，並可通過標準技術將其用於製備單克 隆抗體。例如，最初由Kohler等人發表的雜交瘤技術 (Kohler et al·，Nature (1975) 256:495-497)、人類 B 細胞雜 交瘤技術(Kohler et al·，Immunol· Today (1983) 4:72)、EBV-i〇 雜交瘤技術（Cole et al·，Monoclonal Antibodies and Cancer

Therapy，（1985)，Alan R· Liss，Inc·, pp. 77 - 96)或 trioma 技術。產生雜交瘤細胞的技術是眾所周知的（一般參閱 Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al·， (eds·) John Wiley & Sons，Inc·，New York, NY)。簡而言 15 之，將永生的細胞系（通常是骨髓瘤細胞）與用SNAIP免疫 原按上述方法免疫過的哺乳動物的淋巴細胞（通常用脾細 胞）融合，再篩選所產生的雜交瘤細胞培養上清液，以鑑 定能產生與SNAIP結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞。 用於融合淋巴細胞和永生細胞系的許多知名方案中 20 的任何一個都可用於產生SNAIP單克隆抗體（參閱如

Current Protocols in Immunology，同上文；Galfre et al·， Nature (1977) 266:550-552 ; Kenneth，in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses， Plenum Publishing Corp·，New York, Ν·Υ· (1980);以及 -37- 200530400

Lerner，Yale J· Biol· Med· (1981) 54:387-402)。此外，一般 的技工將會理解這類方法還有許多有用的變通方法。通 常，永生細胞系（如骨髓瘤細胞系）與淋巴細胞源自同一種 哺乳動物。例如，小鼠雜交瘤細胞可通過使源自經本發明 5 之免疫原製劑免疫的小鼠的淋巴細胞與某一永生小鼠細 胞系融合的方式而產生。該永生細胞系的例子包括對含有 次黃嗓呤、氨基蝶呤和胸腺0密咬脫氧核苷的培養基(“hat 培養基”)敏感的骨聽瘤細胞系。很多骨聽瘤細胞系都可按 照標準的技術參與融合，例如 P3-NSl/l_Ag4-l， ίο P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤細胞系。這些骨髓 瘤細胞可由ATCC提供。通常，對HAT敏感的小鼠骨髓 瘤細胞是用聚乙二醇(PEG)融合到小鼠脾細胞内。然後用 HAT培養基選擇融合所得的雜交瘤細胞，該培養基將殺死 未融合和未正確融合的骨髓瘤細胞（未融合的脾細胞於幾 15 天後死亡，因為它們未被轉化）。產生本發明之單克隆抗 體的雜交瘤細胞可通過筛選雜交瘤細胞培養上清液中結 合SNAIP的抗體的方式而檢測，例如，採用標準的ELIS A 分析法來檢測。 除了製備單克隆抗體-分泌性雜交瘤細胞的方式以 20 外，還可以通過用SNAIP篩選重組組合免疫球蛋白資料 庫（例如抗體％鹵體展示資料庫）從而分離出結合SNAIP 的免疫球蛋白資料庫成分的方式來鑑定和分離單克隆 SNAIP抗體。產生和篩選禮菌體展示資料庫的成套試劑已 經商 α口化（例如 ’ the Pharmacia Recombinant Phage -38- 200530400

Antibody System, Catalog No· 27-9400-01 ;以及 the Stratagene SurfZAP®Phage Display Kit，Catalog No. 240612) 〇 另外，特別適用於產生並篩選抗體顯示資料庫的方法 5 和試劑的實例可參閱如下文獻：例如，U.S. Patent No.

5,223,409; PCT Publication No. WO 92/18619; PCT Publication No. WO 91/17271; PCT Publication No. WO 92/20791; PCT Publication No. WO 92/15679; PCT Publication No. WO 93/01288; PCT Publication No. WO ίο 92/01047; PCT Publication No. WO 92/09690; PCT

Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al.9 Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay et al·，Hum· Antibod· Hybridomas (1992) 3:81-85; Huse et al.5 Science (1989) 246:1275-1281; and Griffiths et al·，EMBO J· (1993) 25 12:725-734。

15 此外，重組SNAIP抗體，例如由可用標準重組DNA 技術製備的人類和非人類部分所組成的嵌合體和人類化 單克隆抗體，也包括在本發明範圍之内。這類嵌合體和人 類化單克隆抗體可使用本技術領域内已知的重組DNA技 術來生產，例如使用以下文獻所述的方法：PCT Publication 2〇 No. PCT Publication No. WO 87/02671; Europe Patent

Publication No. 184,187; Europe Patent Publication No. 171,496; Europe Patent Publication No· 173,494; PCT Publication No· WO 86/01533; U.S· Patent No· 4,816,567; Europe Patent Publication No. 125,023; Better et al.9 -39- 200530400

Science (1988) 240:1041-1043; Liu et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:3439-3443; Lin et al·，J· Immunol· (1987) 139:3521-3526; Sun et al.? Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:214-218; Nishimura et al.? Cane. Res. (1987) 5 47:999-1005; Wood et aL? Nature (1985) 314:446-449; Shaw et al·，J· Natl· Cancer· Inst· (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi et al.5 Bio/Techniques (1986) 4:214; U.S. Patent No. 5,225,539; Jones et al.5 Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan et al.5 Science (1988) o 239:1534，以及 Beidler et al·，J· Immunol. (1988) 141:4053_4060。 完全人類的抗體對於人類患者的治療是特別理想 的。這類抗體可用不能表達内源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈 基因、但能表達人類的重鏈和輕鏈基因的轉基因小鼠來生 5 產°这些轉基因小鼠用所選擇的抗原例如全部或部分 SNAI^以通常的方式進行免疫。針對抗原的單克隆抗體可 使用常規的融合細胞技術而獲得。轉基因小鼠所含的人類 免f球蛋白轉基因在B細胞分化期間重新排列，隨後經受 了等、、及轉換和細胞體(somatic)突變。如此，使用這樣的抗 :〇 原決定基，^ 仰制SNAIP活性的抗體得以鑑定。非人類抗 ^。、例^和輕鏈被克隆並被用於產生噬菌體顯示Fab片 ^ 重鍵基因可被克隆入質粒載體’使得該重鏈可 以 足細_分、山 白A因， 出來。輕鏈基因可被克隆入噬菌體的外殼蛋 ^ 使得該輕鏈可以表達在噬菌體表面。與噬菌體融 200530400 合的人類輕鏈庫（隨機收集）被用於傳染表達非人類重鍵的 細菌。所得的後代嗟菌體顯示出雜化物抗體（人類輕鍵/非 人類重鏈）。選定的抗原被用於以淘篩的方式筛選與選定 才几原結合的11莖囷體。鑑疋這樣的嗤囷體可能需要經過幾輪 5 篩選。然後，人類輕鏈基因與結合選定抗原的選定嗟菌^ 分離。其後，這些選定的人類輕鏈基因被用於指導如下的 人類重鏈基因的選擇。選定的人類輕鏈基因被插入載體由 細菌表達。表達選定人類輕鏈的細菌被與嗟菌體融合的人 類重鏈感染。所得的後代噬菌體顯示了人類抗體（人類輕 10 鏈/人類重鏈）。 其次，選定的抗原被用於以淘篩的方式蒒選與選定抗 原結合的噬菌體。在該步驟選出的噬菌體顯示了一個完全 人類的抗體，它可識別被原來選出的非人類單克隆抗體識 別的同樣抗原決定基。這些可編碼重鍵和輕鏈的基因很容 15 易被分離，並可進一步處理以生產人類抗體。Jespers等人 敘述了該項技術(Bio/Technology (1994) 12:899-903)。 SNAIP抗體(例如單克隆抗體）可用於以標準技術分離 SNAIP，例如親合色譜法或免疫沉殿反應。SNAIP抗體可 促進源自細胞的天然SNAIP的純化，以及表達在寄主細 20 胞裏的重組產生的SNAIP的純化。而且，SNAIP抗體可 用於檢測SNAIP蛋白（例如，在細胞溶解產物或細胞上清 液内）’以評估SNAIP蛋白表達的豐度和模式。作為一個 臨床試驗過程的一部分，SNAIP抗體在診斷上可用於監測 組織内的蛋白含量，例如，確定某種治療方法的功效。使 200530400 抗體與一種可檢測的物質結合則可促進檢測。可檢測物質 的例子包括各種各樣的酶、輔劑，螢光物質，發光物質， 生物發光物質和放射性物質。適當的酶的例子包括辣根過 氧化物酶，鹼性磷酸酶、半乳糖甘酶或乙醯膽鹼酯酶；適 當的辅劑複合物的例子包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗 生物素蛋白/生物素；適當的螢光物質的例子包括傘形 酮、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三嗪胺熒 光素、丹磺醯氯、特定的螢光蛋白或藻紅蛋白；發光物質 的例子包括魯米諾(iuminal);生物發光物質的例子包括螢 光素i#、螢光素、水母發光蛋白，·適當的放射性物質的例 子包括 1251、1311、358或311。 SNAIP分子可通過例如χ_射線結晶學分析，以鑒別 結合Wnt那部分的結構。基於結構上的資訊，技術人員 能夠構建結合Wnt的合成分子。這樣的SNAIP模擬物可 由各種各樣的任何構建單元來製備，包括氨基酸、核苷 酉欠、糖類、有機分子等，以及它們的組合。 SNAIP分子還可用作為免疫原以培養具有模仿界泔 結構的抗體。這類抗體與直接培養在FZ上的抗體相似， 將共FZ結合並將阻止Wm與fz的結合。最好，這類抗 體不會激發FZ的活化。 III·重，表達載體和寄主細胞 红本發明之另一方面係關於含有可編碼SNAIP(或其一 邛刀)的核酸分子的載體，較佳的是表達載體。如本文中 •42· 200530400 所使用的，術語“载體，，指 核酸的核酸分子。—種載與匕相連接的另― A片段可料接上ft的麵是1粒”，指的是其他 載體是病毒細，雙股疆環。另-類型的 毒的基因_，因的麗片段可以連接到該病 夠在被引人寄主細胞^；基/組的容量較大。某些載體能 菌複製來源的細菌自發複製(例 些載體(例如，哺乳動物非自礼動物附加型載體P其他一 時被整合到寄主細胞的基型載體）在被弓丨人寄主細胞 被複製。而且，某些载2，声且：’因此：寄主基因組-起 操作地連接的A _ 、達載體’㈣指導與它們可 15 的表達載㈣職技術 明還意在包括Α他料、㈣式存在。但是，本發 毒載_如，複的表達载體，例如起等效作用的病 病毒）。 、曰处轉錄酶病毒、腺病毒和腺相關 20 核酸在寄主細:二括本發明之核酸’它以適合 載體包括料料;重組表達 個調控序列，該調控序 為基擇的-個或多 的核*酸序列以便於該核二==在表示所考慮 轉錄/轉譯李轉η㈣μ序表達(例如’在一體内 括啟動子、促進子以及语5周控序列”意在包 進子及其他表達控似素(例如，多聚腺 -43- 200530400 苷酸化信號）。有些文獻中敘述了這類調控序列，例如

Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol· 185，Academic Press，San Diego，CA 5 10 15 20 (1990)。調控序列包括在許多種寄主細胞内指導核苷酸序 列組成性表達的調控序列（例如，組織特異性的調控序 列）。熟悉本技術者應理解表達載體的設計可取決於諸如 欲轉化的寄主細胞的選擇、所希望的蛋白表達水準等因 素本毛月之表達載體可導入寄主細胞，從而生產如本文 所述的由核酸編碼的蛋白或肽(例如，SNAn>蛋白、突變 體形式的SNAIP、融合蛋白等）。

本發明之重組表達載體可設計用於SNAIP 真核細胞内的表達，例如，大腸桿菌、昆蟲細胞(使用杆 狀病毒表達載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞 ^ 二=r〇eddel 一文一 進v讶调。作為一種替換方式，重組表達載體士 =轉錄和轉譯，例如使用T7啟動子調控序^^ 合 S#。 1 / 1 蛋白在原核生物巾的表達最时是在 行的’所用的载體含有指導融合或非融 的蛋白，通常添加到重組蛋 合載體通常用於三個目的：υ增加重組蛋：頬场 增：重組蛋白的溶解度;以及3)作為親合純化=達丄2 配體而輔助重組蛋白的純化。通常，在融合表達 -44- 200530400 在融合部分和重組蛋白的連接處導入一蛋白水解酶切位 點，使得重組蛋白在融合蛋白純化之後可與融合部分分 離。這類酶以及它們的同源識別序列包括Xa因子、凝血 酶以及腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX 5 (Pharmacia Biotech Inc·; Smith et al·，Gene (1988) 67:31-40)，pMAL (New England Biolabs，Beverly，MA)以 及 pRITS (Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們將谷胱甘肽-5-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A分別與目標重 組蛋白融合。 10 可誘導非融合大腸桿菌表達載體的適當例子包括

pTrc (Amann et al·，Gene (1988) 69:301-315)和 pET lid (Studier et al·，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego, California (1990) 185:60-89)。源自pTrc載體的目標基因表達依賴於宿主 15 RNA聚合酶來自雜化trp-lac融合啟動子的轉錄。源自pET lid載體的目標基因表達依賴於由共表達病毒RNA聚合 酶(T7 gnl)介導的來自T7 gnl-lac融合啟動子的轉錄。該 病毒聚合酶是由宿主菌株BL21 (DE3)或HMS 174(DE3) 在lacUV 5啟動子的轉錄控制下從含有T7 gnl基因的常駐 20 λ原噬菌體供給。 一種能使大腸桿菌内重組蛋白的表達達到最高程度 的策略是在一個被削弱的宿主細菌内表達蛋白，從而以蛋 白水解方式分裂重組蛋白（Gottesman，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology，Academic Press, San 200530400

Diego, California (1990) 185:119-128)。另一策略是修改被 插入表達載體的核酸的核酸序列，使得每個氨基酸各自的 密碼子是優先用於大腸桿菌的那些密碼子（Wada etal.， Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111_2118)。本發明之核酸序 5 列的上述改變可通過標準^的DNA合成技術來實現。 在另一具體實施例中，SNAIP表達载體是酵母表達載 體。在釀酒酵母（S· cerevisiae)内表達的載體例子包括 pYepSecl (Baldari et al.9 EMBO J. (1987) 6:229-234) ^ pMFa (Kurjan et al·，Cell (1982) 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et ίο al·, Gene (1987) 54:113-123) ^ pYES2 (Invitrogen

Corporation，San Diego, CA)，以及 pPicZ (Invitrogen Corp·，

San Diego, CA)。 作為一種替換方式，可使用杆狀病毒表達載體使得 SNAIP可表達在昆蟲細胞裏。可表達在經培養的昆蟲細胞 15 (例如Sf9細胞）蛋白裏的杆狀病毒載體包括pAc系列

(Smith et al·，Mol· Cell· Biol· (1983) 3:2156-2165)和 PVL 系列（Lucklow et al·，Virology (1989) 170:31-39) 〇 在另一個具體實施例中，使用了哺乳動物表達載體使 得本發明之核酸被表達在哺乳動物細胞裏。哺乳動物表達 20 載體的例子包括 PCDM8 (Seed，Nature (1987) 329:840)和 pMT2PC (Kaufman et al·，EMBO J· (1987) 6:187-195)。當 用於哺乳動物細胞晨時，表達載體的控制功能經常是由病 毒調控元件提供的。例如，常用的啟動子是從多瘤病毒、 腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒4〇衍生而來的。關於其 -46- 200530400 他原核細胞和真核細胞的適當表達系統，參閱上文提及的 Sambrook等人的論文第16章和第17章。 在另一具體實施例中，重組哺乳動物的表達載體能優 先指導特殊類型細胞内核酸的表達（例如，組織特異性調 5 控元件被用於表達核酸）。組織特異性調控元件在本技術 領域内是眾所周知的。適當的組織特異性啟動子的非限制 例子包括白蛋白啟動子（肝臟特異；Pinkert etal.，Genes

Dev· (1987) 1:268-277)，淋巴腺特異啟動子（Calame etal.， Adv· Immunol· (1988) 43:235_275)，尤其是 T 細胞受體啟 ίο 動子（Winoto et al·，EMBO J· (1989) 8:729-733)和免疫球 蛋白（Banerji et al·，Cell (1983) 33:729-740; Queen et al·， Cell (1983) 33:741-748) ’神經元特異啟動子（例如，神經 細絲啟動子；Byrne et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA (1989) 86:5473-5477)，胰腺特異啟動子（Edlund et al.，Science 15 (1985) 230:912-916)和乳腺特異啟動子（例如，牛奶乳清 啟動子；U.s· Patent 4,873,316 和 EPO Publication No. 264,166)。發育調節啟動子也包括在内’例如氣科hox啟 動子（Kessel et al·，Science (1990) 249:374-379)以及 α_ 胎兒球蛋白啟動子（Campes et al·，Genes Dev. (1989) 20 3:537-546) 〇 本發明進一步提供了一種重組表達載體，它包含以反 意方向克隆進表達載體的本發明之DNA分子。換言之， 該DNA分子以這樣一種方式與一調控序列可操作地連 接，使得作為SNAIPmRNA反意股的一 RNA分子可以（通 -47- 200530400 過DNA刀子的轉錄）而表達。可以選擇與以反意方向克 隆的核酸可操作地連接的調控序列，賴控序列指導反意 RNA分子在各種各樣細胞中的連續表達，例如病毒啟動 子和/或促進子，也可以選擇指導反意RNA的組成性、組 5 織特異性或細胞類型特異性表達的調控序列。該反意表達 載體可採取重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中， 反意核酸在一個高效調控區域的控制下而產生，其活性可 由載體被導入的細胞類型確定。關於使用反意基因調控基 因表達的討論’可參閱Weintraub等的文章（Reviews - ίο Trends in Genetics，Vol· 1(1)1986)。 本發明之另一方面係關於本發明之重組表達载體所 導入的寄主細胞。術語“寄主細胞”和“重組宿主細胞，，在本 文中互換地使用。應該理解，這樣的術語指的不僅是特定 的細胞，還包括這類細胞的後代或潛在的後代。由於突變 15 或環境影響，某些改變可能在後繼的幾代中發生，所以在 事貫上，這樣的後代未必與親本細胞相同，但仍然被包括 在本文中所用的術語範圍之内。 寄主細胞可以是任何原核細胞或真核細胞。例如， SNAIP蛋白可以表達在細菌細胞裏，例如大腸桿菌、昆蟲 20 細胞、酵母或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞 或COS細胞）。其他適當的寄主細胞是熟悉本技術者所熟 知的。載體DNA可通過常規轉化或轉染技術導入原核^ 胞或真核細胞。如本文中所使用的，術語“轉化，，和‘‘轉染，， 意指本領域内公認的將外來核酸(例如DNA)導入寄主細 -48 - 200530400 胞的各種技術，力杯 糖介導轉染，脂轉染;=氣化1^共沉澱、deae葡聚 ，於哺乳動物細胞的穩定轉染，取決於所使用 的表達 技術’已知只有—小部分細胞可以將外來的 考ι口進基因組。為了鑒別和選擇那些整合子，通常 將編碼可選擇標記(例如對抗生素的抵抗）的基因與所研究 的基，一起導入寄主細皰。較佳的可選擇標記包括那些對 某些藥物例如G418、嘲黴素和曱氨蝶呤等具有抗藥性的 可選擇標記。編碼一可選擇標記的核酸可導入寄主細胞内 ίο 那個與編碼SNAIP的戴體相同的載體，或可導入一不同 的載體。用所導入核酸穩定地轉染的細胞可通過藥物選擇 來鑑定（例如，整合了可選擇標記基因的細胞將生存，而 其他的細胞則死亡）。 本發明之寄主細胞，例如培養液中的原核細胞或真核 15 細胞的宿主細胞，可用於生產（即表達）SNAIP蛋白。相應 地’本發明進一步提供了利用本發明之寄主細胞生產 SNAIP蛋白的方法。在一具體實施例中，該方法包括在一 種適當的培養基内培養(編碼SNAIP的重組表達載體被導 入的）本發明之寄主細胞，使得SNAIP蛋白得以產生。在 20 另一具體實施例中，該法進一步包括從培養基或寄主細胞 分離SNAIP。 本發明之寄主細胞也可用於繁殖非人類轉基因動 物。例如，在一具體實施例中，本發明之寄主細胞是一個 受精的卵母細胞或胚胎幹細胞，其中導入了 SNAIp編碼 -49- 200530400 序列。然後，這樣的寄主細胞可用於創造其基因組内導入 了外源性SNAIP序列的非人類轉基因動物，或其内源性 SNAIP序列被改變的同源重組動物。這樣的動物對於研究 SNAIP的功能和/或活性、以及鑒別和/或評估SNAIP活性 調控因子是很有用的。如本文中所使用的，“轉基因動物，， 較佳的是哺乳動物，更佳的是嚙齒動物，例如大鼠或小 鼠，該動物的一個或多個細胞含有一個轉基因。轉基因動 物的其他例子包括非人類靈長類動物 '綿羊、狗、奶牛、 山羊、雞以及兩樓動物等。轉基因是被整合進細胞基因組 的外源性DNA，該細胞發育為轉基因動物，轉基因仍遺 留在成熟動物的基因組内，從而指導該轉基因動物一種或 一種以上細胞或組織内編碼基因產品的表達。如本文中所 使用的，“同源重組動物”較佳的是哺乳動物，更佳的是小 鼠’其中一個内源性SNAIP基因通過内源性基因和在動 物發育之前引入該動物細胞例如胚胎細胞的外源性DNA 分子之間的同源性重組而得到了改變。 通過將SNAIP編碼核酸導入一受精卵母細胞的雄性 原核，例如，通過顯微注射、逆轉錄病毒傳染以及讓該卵 母細胞在一假孕雌性代孕動物體内發育，可以創造本發明 之轉基因動物。SNAIP DNA序列，例如序列鑒別號為1 的序列，可作為轉基因被導入非人類動物的基因組内。作 為一種替換方式，人類SNAIP基因的非人類同源物，例 如小鼠的SNAIP基因，可以在雜化為人類SNAIP cDNA 的基礎上被分離，並用作為轉基因。内插子序列和多聚腺 -50- 200530400 苷酸化信號也可包括在轉基因以增加該轉基因的表達效 率。一組織特異性調控序列可與SNAIP轉基因可操作地 連接’以將SNAIP蛋白的表達指向特定的細胞。通過胚 胎處理和顯微注射的方式繁殖轉基因動物尤其是小鼠之 5 類動物的方法，是本技術領域内傳統的方法並在以下文獻 中有所敘述，例如，U.S· Patent Nos. 4,736,866 和 4,870,009、U.S· Patent No· 4,873，191 以及 Hogan， Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ·，1986)。類似的 i〇 方法可用於繁殖其他轉基因動物。然後，一個初始的轉基 因動物可用於繁殖更多載有該轉基因的動物。而且，载有 轉基因編碼SNAIP的轉基因動物可進一步繁殖為載有其 他轉基因的其他轉基因動物。 為了創造一種同源重組動物，製備了一種至少含有一 15 部分SNAIP基因（例如人類或非人類的SNAIP基因的同源 物，例如一種鼠科SNAIP基因）的載體，該SNAIP基因通 過剔除、添加或取代而被改變，例如其功能受到了擾亂。 在一較佳的具體實施例中，該載體的設計使得内源性 SNAIP基因的功能在同源重組時受到擾亂（即不再編碼功 2〇 能蛋白；又被稱為“基因剔除”動物）。作為一種替換方式， 載體也可設計得使内源性SNAIP基因在同源重組時雖然 發生了突變或變化，但卻仍可編碼功能蛋白（例如，上游 調控區域可被改變，從而改變該内源性SNAIP蛋白的表 達）。在同源重組載體内，位於SNAIP基因被改變的部分 -51 - 200530400 側翼的5’和3’末端存在附加的SNAIP基因核酸，使得在 該載體所傳送的外源性SNAIP基因和胚胎幹細胞内的内 源性SNAIP基因之間發生了同源重組。該側翼附加的 SNAIP核酸具有足夠的長度使得與内源性基因的同源重 5 組得以成功。通常，側翼DNA的幾千個鹼基(位於5’末 端和3’末端）均被包括在該載體内（參閱例如，Thomas et al·，Cell (1987) 51:503關於同源重組載體的敘述）。將該 載體導入一胚胎幹細胞系（例如，通過電穿孔法），並選擇 細胞内所導入的SNAIP基因與内源性SNAIP基因發生同 ίο 源重組的細胞（參閱例如，Li et al·，Cell (1992) 69:915)。 然後，將所選擇的細胞注入一動物的胚泡（例如小鼠），以 形成聚集欲合體（參閱例如，Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach，Robertson， ed·，IRL，Oxford，（1987) pp· 113-152)。其後，將嵌合體胚 15 胎植入一個適宜的假孕雌性代孕動物，並使胚胎發育長 大。生殖細胞内含有同源重組DNA的後代可用於繁殖動 物。通過該轉基因的生殖線傳遞，所繁瘦動物的所有細胞 都含有該同源重組DNA。構建同源重組載體和同源重組 動物的方法在以下文獻中有進一步的敘述：Bradley， 20 Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829 和 PCT Publication Nos· WO 90/11354，WO 91/01140，wo 92/0968 及 WO 93/04169。 在另一具體實施例中，可生產出含有調節轉基因表達 的選定系統的非人類轉基因動物。這種系統的一個例子是 -52- 200530400 嗤菌體P1的cre/loxP重組酶系統。關於creAloxP重組酶 系統的敘述，可參閱例如 Lakso et al·，Proc· Natl. Acad· Sci· USA (1992) 89:6232-6236。重組酶系統的另一例子是釀酒 酵母（S· cerevisiae)的 FLP 重組酶系統（O’Gorrnan et al·， 5 Science (1991) 251:1351-1355)。如果 cre/loxP 重組酶系統 被用於調節轉基因的表達，則需要含有既可編碼Cre重組 酶又可編碼所選蛋白的轉基因的動物。這種動物可通過構 建“雙”轉基因動物而獲得，例如，使兩個轉基因動物交 配，其中一個含有可編碼所選蛋白的轉基因，而另一個則 1〇 含有可編碼重組酶的轉基因。 本文所述的非人類轉基因動物的克隆也可按照以下 文獻中所述的方法產生：Wilmut et al·，Nature (1997) 385:810-813 和 PCT Publication Nos. WO 97/07668 以及 WO 97/07669。簡而言之，源自轉基因動物的一個細胞， 例如體細胞，可被分離和誘導退出生長週期而進入G〇階 段。然後，該靜止細胞可與源自同種動物的去核卵母細胞 融合，例如，通過使用電子脈衝；該卵母細胞系源自分離 出該靜止細胞的同種動物。然後，培養重新構建的卵母細 胞，使其發育為桑椹胚(morula)或胚球(blastocyte)，然後 2〇 再轉移到一個假孕雌性代孕動物體内。該雌性代孕動物所 生的後代將是分出該細胞例如體細胞的動物的克隆。 IV·醫藥組合物 本發明之SNAIP蛋白、SNAIP抗體和SNAIP結合分 -53- 200530400 子（在本文中又稱為“活性化合物”)可被納入適合於給藥 方式的醫藥組合物。這類組合物通常含有蛋白或抗體以及 一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。如本文中所 使用的，術語“藥學上可接受的載體”意在包括適合於給藥 5 方式的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣，抗菌劑和抗 真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質和試劑用 於醫藥活性物質的做法是本技術領域内眾所周知的。除了 那些常規的介質或試劑與活性化合物不相容的情況，這類 介質和試劑在組合物内的使用是經過深思熟慮的。辅助的 10 活性化合物也可被納入該組合物内。 本發明之醫藥組合物是按照預定的給藥途徑而配製 的。給藥途徑的例子包括注射，例如靜脈注射、皮内、皮 下、口腔（例如吸入）、透皮（局部的），黏膜和直腸給藥。 用於注射、皮内或皮下給藥的溶液或懸浮液可包括以下組 15 分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、非揮發性油、 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如 苯曱醇或對羥基苯甲酸曱酯；抗氧劑，例如抗壞血酸或亞 硫酸氫鈉；螯合劑，例如EDTA ;緩衝劑，例如醋酸鹽、 檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調節滲透壓的試劑，例如氯化鈉 20 或葡萄糖。酸度(pH)可用酸或鹼來調節，例如HC1或

NaOH。注射製劑可密封於安瓿瓶、一次性注射器或玻璃 或塑膠製成的多劑量小瓶。 適合於注射用的醫藥組合物包括用於即時製備無菌 注射液或分散劑的無菌水溶液(若為水溶性）或分散劑以及 -54- 200530400 無菌粉末。對於靜脈給藥方式，適合的載體包括生理鹽 水’抑菌水，Cremophor EL® (BASF; Parsippany，NJ)或磷 酸鹽級衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物都必須無 菌而且應具有一定的流動性以便於注射。它在製造和儲存 條件下必須是穩定的，必須加以處理以抵抗微生物例如細 菌和真菌的污染。载體可以是含有水、乙醇、多羥基化物 (例如丙二醇、丙二醇、液體聚乙二醇等）及其適當混合物 的溶劑或分散介質。為了維持適當的流動性，可使用包 衣，例如㈣脂，·若在分散劑的倩況下，則可通過維持所 需的顆粒度來維持流動性；以及使用表面活化劑。為了預 防微生物的作用，可使用各種各樣的抗_和抗真菌劑， 甲酸f、氯丁醇、苯紛、抗壞血酸、硫柳 二在夺多情況下，較佳的是在該組+_ 15 加=，劑’例如糖、甘露醇和山梨糖醇之類的多元醇， 以及虱化鈉。可注射型組合物的延遲吸 物内加入包括延遲吸收的試劑 了通過在、、“ 銘和明膠。 μ而達到，例如加入單硬醋酸 無菌可注射溶液的製備是腌兮、工^ SNMP蛋白或画p抗^將5亥活性化合物（例如 述一種成分或幾種成份的組合一起力入^據品要與上 劑，隨後進行過滤滅菌。通常，分散劑W是!二當： 合物加入-種無菌載體，後者含有 疋將該活性化 所需的上述其他成份。在製備無菌注射;：=分散劑以及 況下，較佳的製備方法是通過真空乾燥和冷 -55- 20 200530400 滅菌過濾的溶液形成活性成分的粉末再加入任何其他所 需的成份。 口服組合物一般包括一灌惰性稀釋劑或可食用的載 體。它們可被密封在明膠膠嚢内或被壓成片劑。為了口服 治療的目的，活性化合物可與赋形劑一起成型並以月劑、 錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物也可用一種液態載體 製備而作為漱口液使用，其中，液態載體中的化合物是經 口腔，徑施用，或者漱口後吐出，或者咽下。 藥=相容的枯合劑和/或佐劑材料可作為組合物的 15 何成份，或性質類似的^物U劑等可包含以下任 素、黃請或明膠；賦形:二，劑，例如微晶質纖維 例如藻酸、Primes或玉^例如澱粉或乳糖；崩散劑， Sterotes ;助滑劑，例如膠、閏α劑’例如硬脂酸鎮或 糖或糖精；或調味劑，例如二氧化石夕；甜味劑，例如嚴 劑。為了以吸入方式給藥，化掎、水揚酸甲酯或橙色調味 如二氧化碳之類的鏡）的^物可從含有適當揮發劑(例 氣霧劑噴霧的形式給藥。墼谷盗或分配器或霧化器以 =性給樂也：通過黏與或透皮的方式。對於齡 f皮、七樂’在配方中使用了對應於滲透障礙的滲透劑。i 樣的滲透劑在本技術領域内是取所周知的，例如，用於聋 膜給藥的滲透劑包括洗滌劑、膽汁鹽，以及梭鏈孢酸衍^ 物。黏膜給藥可通過使用鼻腔嘴霧或栓劑來完成。對於透 皮給藥，如本技術領域内眾所周知的，可將活性化合物配 -56- 20 200530400 入軟膏、藥膏、凝膠或油膏。 該化合物也可絮 劑基料，如可可的形式（例如使用常規的栓 用於直腸灌腸。、、他甘油脂），或製成灌腸劑的形式 合物過快地從體內/中，該活性化合物與一種可防止該化 " j 权非出的载體一起製成藥劑，例如控制釋 ㈢ 〇植入體内和微膠囊給藥系統。可以使用生 匆降解生物相各性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酉旨共聚 10 15 物、:酐、I甘醇酸、膠原、聚原酸醋以及聚乳酸。製備 这類藥劑的方法對於熟悉本技術者將是顯而易見的。各種 材料也了以通過商業途徑從Aiza Corporation和Nova

Pharmaceuticals，Inc·等公司購得。Liposomal 懸浮液（其 含有目標對準被感染細胞、單克隆抗體對準病毒抗原的脂 質體）也可用作為藥學上可接受的載體。這些載體可按照 為熟悉本技術者已知的方法製備，例如，按照U S. patent No· 4,522,811所述的方法製備。 為了給藥方便和劑量一致，以單位劑量的形式配製口 服或注射用組合物是特別有利的。本文中所謂的單位劑量 形式指的是對應於單位劑量的形體上獨立的單位，每個單 位含有根據所需的醫藥載體而算出的預定量的活性化合 物，以產生所希望的治療效果。取決於疾病的類型和嚴重 性，給患者輸入約1 pg/kg至15 mg/kg (例如0·1至20 mg/kg)的抗體是一種可供選擇的初始劑量，無論是一次或 多次地分別給藥，還是連續地注入。典型的曰劑量範圍可 -57- 20 200530400 從約1 pg/kg至loo mg/kg或以上，取決於以上提到的因 素。對於幾天或更長時間的重覆性給藥，根據具體情況， 應維持治療直至出現所希望的抑制疾病症狀的效果。但 ^ ’其他劑量的療程也可能會有效。治療的進展情況可以 5 常規的技術和分析很容易地監測。WO 94/04188專利披露 了示範性劑量的療程。本發明之單位劑量的規格受制於 且直接依賴於該活性化合物的獨特性質和所欲達到的具 體治療效果’以及這種活性化合物配製技術上的固有局限 性。本發明之核酸分子可被插入載體並用作為基因療法載 10 體。基因療法载體可通過各種方式輸入治療對象，例如靜 脈注射、局部輪入(U.S. Patent Ν〇· 5,328,470)或通過立體 定位注射等（參閱，例如 Chen et al·，Pr〇c· Natl· Acad· Sci· USA (1994) 91:3054-3057)。基因療法載體的醫藥製劑可包 括存在於一種可接受的稀釋劑内的基因療法載體，或含有 15 一種已嵌入基因傳遞載體的緩釋性基體。作為一種替換方 式’在可從重組細胞例如逆轉錄病毒載體產生完全的基因 傳遞載體的情況下，該醫藥製劑玎包含一個或多個產生基 因傳遞系統的細胞。 該醫藥紕合物可密封在容器、藥包或分配器内，並附 2〇 上使用說明。 V·本發明之用途和方法 本文中所述的核酸分子、蛋白、SNAIP結合分子和抗 體可用於以下一種或數種方法·· a)篩選試驗；b)檢測試 -58- 200530400 驗(例如染色®圖譜法'址織分型、法醫生物學試驗 預 測醫學試驗(例如診斷試驗、預診斷試驗、臨床監測試驗 和藥物基因學）；以及d)治療方法(例如疾病治療及預防 方法PSNAIP蛋白可與其他細胞蛋白發生相互作用，、並 5 可用於⑴細胞增殖的調節；⑼細胞分化的調節；以及 (iii)細胞存活的調節。本發明之分離出的核酸分子可用於 表達SNAIP蛋自（例如在基因療法應用中通過一寄主細 胞内的重組表達载體）、檢測SNAIPmRNA(例如在一個生 物樣品中）SSNAIP基因内的基因損傷，以及調控sNAip 1〇 活性（例如通過反意股和RNAi技術）。此外，SNAIp蛋白 可用於篩選那些調控或模擬SNAIp的活性或表達的藥物 或化合物，以及治療其特徵為SNAIp蛋白的產生或功能 不足或過份的疾病，或治療其特徵為與野生型SNAip蛋 白比較所產生的SNAIP蛋白活性下降或異常的疾病。此 15 外，本發明之SNAIP抗體可用於檢測和分離SNAlp蛋白 及調節SNAIP活性。本發明還涉及通過上述篩選試驗鑑 定的新穎製劑以及如本文所述的治療應用。 A·篩選試驗 20 本發明提供了一種鑑定調控因子的方法（本文中又稱 為“篩選試驗，，）。該調控因子也就是與SNAIP蛋白結合或 對SNAIP的表達或SNAIP的活性具有一種啟動或抑制作 用的候選化合物或試劑或試驗化合物或試劑（例如肽、狀 模擬物、小分子或其他藥物），或與Wnt或FZ結合的、$ -59- 200530400 阻止Wnt與FZ結合以及阻止凋亡的SNAIp模擬物。 在一具體實施例中，本發明提供了篩選某些候選化合 物或試驗化合物的試驗方法。該候選化合物或試驗化合物 與SNAIP結合、調節或模擬SNAIP蛋白或多肽或其生物 5 活性部分的活性。本發明之試驗化合物可通過本技術領域 内已知的許多組合資料庫方法中的任何方法製備，包括·· 生物資料庫；可空間定址的平行的固相或溶液相資料庫； 需要使用重疊法的合成資料庫方法；天然產品資料庫；所 謂“一珠一化合物”(〇ne-bead one compound)資料庫方法； 10 以及使用親合色譜選擇法的合成資料庫方法。其中生物資 料庫方法局限於肽資料庫，而其他四種方法則可用於肽、 非肽寡聚物或小分子化合物資料庫(Lam，Anticancer Drug Des· (1997) 12:145) 〇 分子資料庫合成方法的例子可在本技術領域内查 15 到，例如：DeWitt et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA (1993) 90:6909; Erb et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:11422; Zuckermann et al.? J. Med. Chem. (1994) 37:2678; Cho et al·，Science (1993) 261:1303; Carrell et al·，Angew Chem· Int· Ed· Engl· (1994) 33:2059; Carell et al·，Angew 20 Chem· Int· Ed· Engl· (1994) 33:2061;以及 Gallop et al·，J·

Med· Chem· (1994) 37:1233。 化合物資料庫可存在於溶液中（例如Houghten， Bio/Techniques (1992) 13:412-421)，或培養珠上（Lam， Nature (1991) 354:82-84)、晶片上（Fodor，Nature (1993) 200530400 364:555-556)、細菌上（U.S. Patent No. 5,223,409)、孢子上 (U.S· Patent No· 5,571，698; 5,403,484 以及 5,223,409)、質 粒上（Cull et al·，Proc· Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:1865-1869)或嗟菌體上（Scott et al·，Science (1990) 5 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6378-6382 ； 以及 Felici，J. Mol· Biol· (1991) 222:301-310)。 由於SNAIP是配位體，故可用已知的方法來研究 SNAIP以確定它與例如FZ或Wnt結合的具體部位。該具 10 體的部位可用某些已知的生物合成方法來合成，例如結合 使用碳水化合物合成和酶反應。SNAIP的那一部位相當於 一個“抗原決定基”。可以使用其他單體或非碳水化合物的 分子部分來變更該SNAIP抗原決定基，以產生經變更的 含有抗原決定基的結構，且改善其某些性質，例如企清半 15 衰期，與FZ/Wnt持續地結合等性質。任何一種抗原決定 基變體的適宜性可運用本文所講授的結合試驗和筛選試 驗來確定。 在一具體實施例中，試驗是以細胞為基礎而進行的。 在該試驗中，使一個表達細胞表面的膜結合形式Fz或其 20 生物活性部分的細胞與一試驗化合物接觸，而且可以測定 該試驗化合物在SNAIP蛋白存在時與FZ競爭性結合的能 力。該細胞可以是酵母細胞或源自哺乳動物的細胞。該試 驗化合物與FZ結合的能力測試可通過以下方式來實現： 例如使該試驗化合物與一種放射性同位素或酶標記搞 200530400 口，化種麵合使得讀試驗化合物與FZ或其生物活性部分 2結合可通過檢鲫_複合物中標記化合物的方式來測 4 驗化合^以直接地或間接地標記為1251、 或通過閃爍計數位素可通過射電減直接計ί ah 出。作為一種替換方式，該試驗化合 >西」\二過氣化物酶、鹼式磷酸鹽或螢光素酶等標 上轉心"己’"亥酶標記可通過確定某種適當的底物和產品之 10 15 門的mu'j$。在—較佳的具體實施例中，該試驗包括 使一個表達細胞表面的膜結合形式FZ或其生物活性部分 的細胞與一種與FZ結合形成試驗混合物的已知化合物接 觸’再使該試驗混合物與_試驗化合物接觸，並確定該試 驗化合物與FZ相互作用的能力，其中，確定該試驗化合 物在SNAIP蛋白存在時與ρζ相互作用的能力，包括確定 該試驗化合物比SNAIP優先與FZ或其生物活性部分結合 的能力。

在另一具體實施例中，本發明的試驗是一種無細胞試 驗，包括使SNAIP蛋白或其生物活性部分與一種試驗化 合物接觸，並確定該試驗化合物與SNAIP蛋白或其生物 活性部分結合的能力。如上所述，該試驗化合物與SNAIP 蛋白之間的結合可直接地或間接地確定。在一較佳的具體 實施例中，該試驗包括使SNAIP蛋白或其生物活性部八 與一種與SNAIP結合形成試驗混合物的已知化人 觸，再使該試驗混合物與一種試驗化合物接觸，並 a _ 試驗化合物與SNAIP蛋白相互作用的能力，盆士 疋該 ” T ’確定 -62- 20 200530400 該試驗化合物與SNAIP蛋白相互作用的能力勹 該試驗化合物比該已知化合物優先與SNAip栝確定 活性部分結合的能力。 或—個生物 在另-具體實施例中，該試驗是一種無 5括使S讀蛋白或其生物活性部分與一種試::物: 觸，並確定該試驗化合物調節（例如啟動或抑制）sna= 白或其生物活性部分之活性的能力。確定該試驗化合物調 節SNAIP活性的能力’可通過以上述的_種確定直接結 合的方法來確定SNAIP蛋白與SNAIp目標分子結合能力 〇 的方式來實現。在一供選擇的具體實施例中，確定該試驗 化合物調節SNAIP活性的能力可通過確定SNAIp蛋白進 一步調節SNAIP目標分子的能力來實現。例如，該目標 分子在一適當底物上的催化/酶促活性可按如上所述的方 法來確定。

5 在另一具體實施例中，該無細胞試驗包括使SNAIP 蛋白或其生物活性部分與一種可結合SNAIP而形成試驗 混合物的已知化合物接觸，使該試驗混合物與試驗化合物 接觸’以及測定試驗化合物與SNAIP蛋白相互作用的能 力’其中，確定該試驗化合物與SNAIP蛋白相互作用的 此力也包括確定該SNAIP蛋白與SNAIP目標分子優先結 合或調節其活性的能力。 在本發明之上述試驗方法的許多具體實施例中，可能 需要使SNAIP或Wnt失活以便於其中任一種或兩種蛋白 的複合形式與非複合形式之間的分離，並便於實現試驗的 -63- 200530400 自動化。試驗化合物與SNAIP的結合，或在候選化合物 存在或不存在的情況下SNAIP與Wnt之間的相互作用， 可在任何適合於容納該反應物的容器内實現。這類容器的 例子包括微滴定盤、試管和微離心管。在一具體實施例 5 中，可以提供一種融合蛋白，它增加了一個結構域使得上 述任一種或兩種蛋白可與一基質結合。例如，谷胱甘肽_s_ 轉移酶/SNAIP融合蛋白、或谷胱甘肽_S_轉移酶/Wnt融合 蛋白可被吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠上（Sigma Chemical, St. Louis, MO)、或谷胱甘肽衍生的微滴定盤上，然後再與該 1〇 試驗化合物結合，或與該試驗化合物以及未被吸附的Wnt 或SNAIP蛋白中任一種蛋白結合，該混合物在有利於複 合物形成的條件(例如在鹽的生理條件和pH值）下培養。 培養完畢後，洗滌壤脂糖珠或微滴定盤培養孔以除去任何 未結合的組分，並按照如上所述的方法直接或間接地測量 15 複合物的形成。作為一種替換方式，可將該複合物從基質 上解離下來，並使用標準技術測定SNAIP結合或活性的 水準。

其他使基貪上蛋白失活的技術也可用於本發明之篩 選試驗中。例如，可利用生物素和鏈黴抗生物素蛋白的結 20 合使SNAIP失活，或使Wnt失活。生物素化的SNAIP 或目標分子可以用本技術領域内眾所周知的技術（例如生 物素化組合試劑，Pierce Chemicals, R〇ckf〇rd，IL)，從生 物素-NHS (N-羥基琥轴醯亞胺）來製備。並在塗有鏈黴抗 生物素蛋白的96孔培養板内失活(pierce Chemicals)。作 -64- 200530400 為一種替換方式，可與SNAIP或Wnt反應但不干擾SNAIP 蛋白與Wnt結合的抗體可在該培養板的培養孔内衍生，未 結合的Wnt或SNAIP被抗體結合而滯留在孔内。檢測這 類複合物的方法，除了上述用於谷胱甘肽轉移酶（GST) 失活的複合物的方法以外，還包括使用易與SNAIP或目 標分子反應的抗體所進行的複合物免疫檢測法，以及依賴 於檢測SNAIP或目標分子相關酶活性的酶聯試驗。 在另一具體實施例中，SNAIP表達的調控因子通過以 下方法得到了鑑定：在該方法中使細胞與一候選化合物接 觸’並測定了 SNAIP mRNA或蛋白在細胞中的表達。在 該候選化合物存在和不存在的不同情況下，對SNAIP mRNA或蛋白的表達水準進行了比較。然後，在上述比較 的基礎上，該候選化合物可被鑑定為SNAIP表達的調控 因子。例如，如果該候選化合物存在時SNAIP mRNA或 蛋白的表達水準是高於（統計上顯著地高於)該候選化合物 不存在時的表達水準，則該候選化合物即被鑑定為SNAIP mRNA或蛋白表達的刺激因子。SNAIP mRNA或蛋白在 細胞内的表達水準可通過本文中所述的檢測SNAIP mRNA或蛋白的方法而確定。 在本發明之另一方面，該SNAIP蛋白可在一種雙雜交 物試驗或三雜交物試驗中用作為“誘餌蛋白，，（參閱例如 U.S. Patent No. 5,283,317 ； Zervos et al.? Cell (1993) 72:223-232 ; Madura et al·，J· Biol· Chem· (1993) 268:12046-12054 ； Bartel et al.9 Bio/Techniques (1993) -65- 200530400 14:920-924 ; Iwabuchi et al·， Oncogene (1993) 8:1693-1696;以及 PCT Publication No. WO 94/10300)，以 鑑定與SNAIP結合或與其相互作用（“結合SNAIP的蛋白，， 或“SNAIP-bp”)和調節SNAIP活性的其他蛋白。這類可結 合SNAIP的蛋白也很可能參與SNAIP蛋白信號的傳播， 例如作為該SNAIP信號通路的上游或下游成分。 在另一具體實施例中，使用了一種SNAIP抗體或結合 SNAIP的分子例如wnt來篩選資料庫以鑑定類似於 SNAIP的分子。然後，使用本文中所講授的一種方法測試 被結合分子的SNAIP活性。這樣的一種篩選方法展現了 SNAIP —類的分子，它們是致效劑、反致效劑或SNAIP 的拮抗劑。 本發明進一步涉及通過上述筛選試驗而鑑定的新穎 製劑及其如本文中所述的治療用途。 B·檢測試驗 此處所鑑定的cDNA序列的部分或片段（以及對應的 完整基因序列）可以許多方式作為多核苷酸試劑使用。例 如’這些序列可用於：（i)繪製染色體基因圖譜從而找出 與遺傳疾病相關的基因區域；（ii)根據一微小的生物樣品 來鑑定一生物體（組織分型）；以及(iii)協助法醫鑑定一生 物樣品。 本文中所述的各種抗體可用於檢測SNAIP或FZ。 -66- 200530400 c·預測醫學 本發明還涉及預測醫學領域，在該領域中，將診斷試 驗、預診斷試驗、藥物基因學和臨床監測試驗等用於預診 辦（預測）之目的’從而預防性地治療患者。相應地，本發 明的一個方面係關於確定SNAIP蛋白和/或核酸的表達以 及SNAIP活性的診斷試驗，就生物樣品（例如血液、尿液、 糞便、血清、細胞，組織）而言，可確定一個患者是否患 有與SNAIP的表達或活性異常或下降相關的病症，或正 處於發病的危險之中。例如，在受傷之後在體内存活的神 經元或光感受區域可以見到SNAIP。 本發明還提供了預診斷（或預測）試驗方法，以確定一 個患者是否正處於與SNAIP蛋白、核酸表達或活性相關 的發病危險之中。例如，可從一個生物樣品檢驗出SNAIP 基因内的突變。這類試驗可用於預診斷或預測之目的，從 而可在某種以SNAIP蛋白、核酸表達或活性為特徵的或 與其相關的疾病發病之前，預防性地治療患者。 本發明之另一方面提供了確定患者體内SNAIP蛋 白、、核酸表達或SNAIp活性的方法，從而可為該患者選 擇適且的治療或預防疾病的製劑（本文中稱為“藥物基因 子）。藥物基因學可根據一患者的基因類型（例如為了確定 1者對某種具體製劑的反應能力而檢查該患者的基因類 型）’為治療或預防性治療該患者而選擇製劑（例如藥物）。 _本發明之又—個方面涉及監視臨床試驗中製劑（例如 藥物或其他化合物)對SNAIp表達或活性的影響。 -67- 200530400 D ·治療方法 本發明為正處於發病危險之中（或容易罹患）或者 患有與神經系統尤其是中樞神經系統中snaip的: 活性異常或下降相關的病症的患者，提供了預防和= 法。這類疾病包純不限於阿爾茨海默氏病和精; I·預防疾病的方法 在本發明的一個方面，通過給患 SNMP表達或至少一種SNAlp活：入 了預防與SNAIP表達或活性 二卜為患者提$ 15 20 狀的方法。通過如本文中所述的任何目_疾病或达 驗或其某種組合，可以發現由於V二驗或預診斷急 或下降而處於相關疾病發病危險 表^或活性異1 SNAIP異常為特徵的症狀者。可以心 劑，從而可以預防或者推遲疾病或異常 π·治療方法 本發明之另—個方面係關於 S N A !P表達或活性的方法。本發明^ 了^療目的而調節 與一種製劑接觸，該製劑可調節與^即方法涉及使細胞 蛋白的-種或多種活性。該製劑可了胞相_ SNAIP 擬物。該模擬物可以是多核㈣ I SNAIP的一種模 肽、多聚糖、有機分 -68- 200530400 子、無機分子或其組合’只要該類比物具有本文中所定義 ;Γ二ΓΓ這種SN AIP活性可以是任何已知的腸p 應例如抑制社等等。 b皰内誘導某種回 因此，調節SNAIP蛋白活性的製劑可 的製劑例如核酸或蛋白、天然產生的二= 配位體、肽，SNAIP肽模擬物或其他小分子。=的^ 施例中’該製劑可啟動SNAIp蛋 。在—具體只 性。這類啟動劑的例子包括活性SNai ^種生物活 =胞的SNAIP的核酸分子。該調節方法 (:如通過用該製劑培養細胞)實現，或作 式，在體内實現(例如通過將製… 、 本發明為患有以，|白Μ者h如此， 15 20 常或下降从*或核欠分子的表達或活性異 :飞：降為特徵的疾病或異常 法。在一具體實施例中，兮纽本π杈供了-療方 通過本文中所述㈣選及輸人某種製劑(例如 組合，該製劑可輸疋的某種製劑)或製劑的 性。t y^ (例如上調或下調)SNAIP的表達或活 a 例中’該方法涉及輸入 SNAIP I 白 刀子作為治療方法，以補償下降或異常的SNAIP 表達或活性。 在IP被異$下調和/或SNAIP活性被減少的情況 下，SNAIP活性的啟動是合乎需要的。反言之，對sNAip 活性的抑制被減弱。 本發明將通過以下例子得魏一步說日月，但這些例子 -69- 200530400 不應被解釋為是限制性的。本申請書自始至終所援引的所 有參考文獻、專利和公開的專财請書均係作為參考文獻 引述在此。 5 【實施方式】 實例 一將RNA萃取·分別按照每10 cm培養皿或50 mg組織 句漿使用 h5 ml Triz〇l 試劑（Gibco，Cat· No· 15596)的比 例，裂解所培養的細胞或組織勻漿。用移液管吸放裂解產 1〇 物多，，以均化該裂解產物（隨後將細胞裂解產物轉移至 一试官中）。在均化之後，於30 QC培養該裂解產物5分 鐘以使核蛋白複合物完全解離。在培養之後，按每1 ml Tnzo1 試劑 0·2 ml 氯仿（Sigma , Cat· No· C53 12)的比例 將氯仿加入該裂解產物，且用力搖晃該試管15秒鐘。然 15 後於30 °c培養該裂解產物3分鐘。在培養之後，按照 12,000 xg於4°C離心該裂解產物15分鐘。離心後，棄 去上清液並用70%乙醇淋洗剩下的rnA微粒。然後將淋 洗後的樣品按照7500 X g於4 °C離心10分鐘，並棄去所 得清液。將剩下的RNA微粒乾燥，然後重新懸浮在不含 20 RNAase 的水中（Life Technologies，Cat· No· 10977-015)。 DNA酶處理：按照製造廠所提供的方案用DNAse I (Gibco)處理總 RNA。 差異顯示：使用 Clontech 出品的 Advantage RT-for-PCR組合試劑從經DNAse處理的總RNA合成第一 200530400 鏈cDNA。每次反應使用總RNA 2 ug。將cDNA產物按 1:10和1:100的比例稀釋，取每種稀釋液各1 μΐ用任意 引子進行PCR反應。所用的任意引子為Hieroglyph與 Fluoro DD引子組合試劑（Beckman公司）。該引子含有 5 oligodT或與M13或T7部分融合的任意序列。用一種螢 光報導分子標記一套引子。PCR反應是按照製造商推薦的 方案使用Advantage cDNA PCR組合試劑（Clontech)而進 行的。螢光標記的PCR產物用GenomyxLR DNA測序儀 (Beckman)經HR-1000丙烯醯胺凝膠（Beckman)電泳分 〇 離。采自不同實驗變體的樣品至少做一式兩份試驗，並與 對照樣品進行比較。凝膠在1600 V電壓下電泳6小時， 在玻璃板上乾燥，洗滌多次以除去尿素結晶並用 GenomyxSC掃描器進行掃描。用Adobe Photoshop對圖像 進行分析，並確定差異表達條帶的座標。使用這些座標， 5 將差異表達條帶定位於乾燥的凝膠上。將條帶切下，浸泡 於100 μΐ水中並離心沉降。取5 μΐ上清液，用Advantage 聚合酶混合物和T7/M13引子(cl〇ntech公司）進行PCr反 應’對該條帶進行再擴增。再擴增的條帶可以用T7/M13 引子直接測序，也可以先克隆進Invitrogen公司的pCR2.1 :〇 - TOPO載體然後再測序。 反轉錄：使用Cl〇ntech&司的“RTf〇rPCR”組合試劑 (Cat· K1402_1)進行反應。按上述步驟分離出1 並用DNA酶處理，然後與20pmol oligodT引子混合，使 總體積為13·5 μΐ。於7〇°C培養該混合物2 min，冷卻至4 X： -71- 200530400 使引子退火。隨後，將含有反應缓衝液、dNTp混合物、 RNA酶抑制劑和MMLV反轉錄酶(均取自“RT加pCR，，組 & 口式片丨J)的反應混合物6.5 μΐ加入Perkin Elmer公司的 GeneAmpPCR System 9700，並按製造廠提供的方案進行 5 反應。所得cDNA產物儲存於_2〇。〇備用。 即時PCR: TaqMan®或即時rt-PCR是檢測樣品中信 使RNA的有效方法。該技術利用AmpliTaq Gold® DNA聚 合酶的5f核酸酶活性在pCR過程中切割TaqMan®探 針。TaqMan®探針於探針5，_端含有一種螢光報導染料(本 ίο 實驗中為6_FAM(6 -羧基螢光素)），針3，_端含有一種螢 光淬滅染料(本實驗中為TMRA(6-羧基-N，N，N，，N，-四甲 基羅丹明））。TaqMan®探針是為了與所研究的靶cDNA在 正向引子和反向引子之間的部位雜交而專門設計的。當探 針完整的時候，3f-末端淬滅染料抑制了 5，-末端報導染料 15 的螢光。在過程中，AmpliTaq Gold® DNA聚合酶的 5’—3’外切酶活性使探針在5’-末端報導染料和3，-末端淬 滅染料之間被切割，從而導致報導染料易位。一旦易位， 報導染料的螢光不再被淬滅染料所抑制。因此，從乾cdna 範本得到的PCR產物的累積可以通過監測報導染料螢光 20 的增加而檢測。 使用了 Perkin Elmer Applied Biosystems 公司的 ABI Prism序列檢測系統(Model No· ABI7700)監測PCR過程中 報導螢光的增加。報導信號用惰性參照(passive refei*eiiee> 發射的螢光標準化。RT-PCR反應按上述方法進行，產物 -72- 200530400 用水按1:100稀釋後在TaqMan®分析中作為範本。 引子用 Primer Express 軟體（Perkin Elmer 公司）設 計，由SigmaGenosys公司合成。用每對引子進行的pcR 反應均經4 %壤脂糖凝膝電泳證貫早個條帶的存在。對於 5 大多數引子對來說，本反應最佳的最終引子濃度為0.2 μΜ 〇

TaqMan® 分析係在 Micro Amp optical plate (Perkin Elmer，Catalog No· N801 - 0560) 96 孔板中進行。將由 25 μΐ TaqMan® CybrGreen PCR 混合物（Perkin Elmer 公司， ίο Catalog No· 4309155)、2 μΐ 正向引子、2 μΐ 反向引子、5 plcDNA和17μ1水所組成的反應混合物置於每個孔中。 然後，用 Micro Amp optical 8 - strip caps (Perkin Elmer 公 司，Catalog No· N801 - 0935)密封該96孔板。對每一個實 驗樣品均用任意標準基因的引子(beta-肌動蛋白，Perkin 15 Elmer Cat· No· N801-0935)分別進行 TaqMan®反應，以使 結果標準化。即時PCR反應係在ABI Prizm System 7700 序列檢測儀(Perkin Elmer公司）上進行。 RNA標記和Affymetrix晶片雜交：RNA標記和晶片 雜交係按照Affymetrix公司標準步驟進行。 20 微陣列數據分析：微陣列數據分析係用Gecko (Aventis)和 GeneSpring (Silicon Genetics)晶片分析軟體 進行。 用人類SNAIP進行神經保護試驗：將人類神經母細胞 瘤細胞系SK-N-SH和SY5Y種入96孔板，讓其貼壁過夜。 -73- 200530400 對每種因子都做二次重複檢測。293 τ細胞用以下物質暫 態轉染：·ι)真核τ〇Ρ〇ΤΑ質粒中的全長sNAipc疆，不 3肝素，2)同⑴’但介質中有肝素；空白載體對照； 4)無載體對照，含或不含肝素；〇未經M3培養的培養 5 基，含或不含肝素。24小時後收集原始上清液，以1:5比 例稀釋·後使帛°神經保護陽性對照物&括5 _ flavopiridol(—種細胞週期抑制劑）。以i〇 mM sin _ i和 500 μΜ02神經酿胺為神經毒劑，於加入神經保護劑後立 即加入。將培養皿放置培養過夜。然後收集上清液，並用 10 乳酸脫氳酶(LDH)組合試劑測定細胞的死亡。SNAIP可以 對抗SIN_1，但不能對抗C2神經醯胺的神經毒性。 SNAIP克隆·使用由Sigma Genosys公司合成的基因 特異引子和（Clontech公司的Advantage cDNA PCR組合 試劑，從大腦皮層和室區cDNA擴增基因序列。按照本領 15 域内已知方法將cDNA克隆入真核表達載體。cDNA與 V5抗原決定基須在同一個讀碼框内，使得可用已商品化 的（Invitrogen公司）V5抗體檢測蛋白表達。克隆也需進行 測序以確認基因的同源性並保證基因沒有突變。 表達SNAIP細胞的產生：為了提供足夠量的SNAIP 20 以進行進一步實驗，將編碼SNAIP的cDNA克隆入表達 載體並轉染至CHO細胞内。 為了產生過量表達SNAIP的CHO細胞，將CHO細 胞以每孔3 X 105個細胞的密度接種於6孔35 mm組織培 養板(Costar 公司 Catalog No· 3516)，每孔加 2 ml 含 10% 200530400 胎牛血清（Gibco/BRL 公司 Catalog No· 1600_044)的 F12 HAM 培養基（Gibco/BRL 公司 Catalog No· 11765-054)。 然後將細胞置入C02培養箱内於3 7 °C培養，直至細 胞鋪滿50 - 80%。用上文所述的步驟將克隆的SNAIP的 5 cDNA核酸序列插入表達载體。取13 pgDNA，用含78 μΐ PLUS試劑的無金清〇ptimem培養基稀釋至1.2 ml。另取 52 μΐ Lipofectamine Plus 試劑（Life Technologies 公司 Catalog No· 109064-013)，用無血清 Optimem 培養基稀釋 至1.25 ml。然後，於室溫下培養dNA溶液和Lipofectamine 10 溶液丨5分鐘。將兩種溶液混合後再培養15分鐘，以形成 DNA-脂質複合體。 用2 ml無jk清Optimem洗滌細胞一次。分別以〇.8 ml Optimem替換每份轉染樣品（一塊6孔板上共6份轉染樣 品）中細胞原培養基。每孔加入200 μΐ的DNA-脂質複合 ^ 體（以下稱為轉染混合物）。不加入任何抗菌藥物。然後 將細胞與脂質-DNA複合體置入C02培養箱於37°C培養6 小時，以發生轉染反應。 培養過程結束後，加入1 ml含20%胎牛血清的 Optimem，無需去除轉染混合物。轉染18小時後，吸出覆 20 蓋在細胞上的培養基。然後用PH 2-4 PBS(Gibco/BRL公 司Catalog No· 10010-023)洗蘇細胞，棄去pbs再加入含 10%血清的F12 HAM培養基(“選擇培養基，，）。轉染72小 時後’用胰蛋白酶消化細胞，然後轉入T150培養瓶。24 小時後，用含10%FBS、抗生素和img/mlG4i8的F12 • 75- 200530400 HAM培養基替換原培養基。持續選擇培養3天后，再用 含200 pg/ml G418的培養基替換原培養基。 西方墨潰法分析：將轉染細胞系的細胞培養上清液或 轉染細胞裂解產物與Invitrogen出品的蛋白上樣緩衝液混 5 合’並载於 Invitrogen 的 10% Tris-Glycine 凝膠上。於 1〇〇 V電泳2·5小時。蛋白分離後，用Invitrogen公司轉膜裝 置於⑽V運轉1小時，以將蛋白轉移至Invitrogen的PVDF 膜上。按照製造廠(Invitrogen公司）所述方法將膜封閉後再 用抗V5抗體雜交。用Amersham公司的化學發光底物 ίο ECL(Cat. Νο· 1059250)和 Hyperfilm ECL(Cat. No· HP79NA)，按照Amersham戶斤述方法檢湏丨J蛋白條帶。 條帶顯現。 雖然通過以上實例已經詳細地敘述了本發明，但應該 理解’可以進行各種各樣的修改而不背離本發明之精神。 15 因此，本發明只受以下專利申請範圍的限制。 本申請書中所引用的所有專利和出版物均以其整體 而引述在此。 -76-

Claims (1)

1. 200530400 2. 3· 10 4. 5· 15 6· 7. 8. 20 9· 申請專利範圍：=在，細胞内調節過氧亞石肖基陰離子所誘導〉周亡之 (s麵Γ接括:。該細胞與分泌之神經細胞〉周亡抑制蛋白質 利範圍第1項所述之方法，其中該方法進一步 包括使该細胞與肝素接觸。 t申請^彳範圍第i項所述之方法，其中糊亡包括 :N-1 (3-嗎啉斯得，亞胺)過氧亞硝酸鹽相關途徑的誘 導。 如申清專利範圍第3 所> 士、+ …h 所述方法，其中該途徑包括一 個或多個p38 MAPK，以；5 At 因叫_的活化。 制和DNA損傷誘導基 如=請專利範圍第3項所述之方法，其中該途徑是通過 鑑疋蛋白硝化的一特定標記而發現的。 如申請專利範圍第5項所述之方法、，其中鋪定標記為 3-硝基酪氨酸(3-NT)。 如申請專利範圍第4項所述之方法 GADD34、GADD45 或 GADD153。 如申請專利範圍第1項所述之方法 粒體功能不良。 如申請專利範圍第8項所述之方法 — 不良包括線粒體複合物I亞單位的確化'。 -種保護神經元免遭過氧亞硝基陰離子相關自由基介每 的細胞死亡的方法，包括使該纟，與分泌之神經細心 1其中該GADD為 其中該凋亡包括祷 其中該線粒體功能 -77· 10. 200530400 亡抑制蛋白接觸。 η. —種確定與過氧亞硝基陰離子毒性途徑相關的神經保護 基因目標的方法，包括： i) 使神經細胞的各個樣品分別與分泌之神經細胞凋亡 5 抑制蛋白質（SNAIP)接觸或不接觸； ii) 使步驟（i)中的細胞與過氧亞硝基陰離子誘導劑接 觸； iii) 確定步驟(ii)中的細胞内基因或蛋白的表達變化；以 及 1〇 iv)鑑定在SNAIP和該誘導劑存在或不存在的條件下所 調節的基因或蛋白，並將如此鑑定的基因或蛋白與 過氧亞硝基陰離子所誘導的細胞凋亡抑制相關聯。 12.如申請專利範圍第11項所述之方法，其中步驟⑴進一 步包括使細胞與肝素接觸或不接觸。 15 13.如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該過氧亞硝基 陰離子誘導劑為SIN-1。 14. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該鑑定的基因 或蛋白與細胞凋亡相關。 15. —種治療與自由基介導細胞死亡相關的神經元疾病的方 20 法，包括給需要治療的患者輸入有療效劑量的分泌之神 經細胞凋亡抑制蛋白質（SNAIP)。 16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該與自由基介 導細胞死亡相關的疾病包括巴金森氏病（Parkinson’s disease)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、脊髓損傷、 -78- 200530400 創傷性腦損傷、中風和阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease)等疾病。 17.如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該輸入進一步 包括肝素的輸入。 -79- 200530400 七、指定代表圖·· (一） 本案指定代表圖為：第（ ）圖。為 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無