MXPA05002620A - Alcanales polimericos solubles en agua. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a los derivados alcanal de polimeros solubles en agua tales como poli(etilenglicol), sus hidratos y acetales correspondientes, y a los metodos para preparar y utilizar dichos alcanales polimericos; los alcanales polimericos de la invencion se preparan con alta pureza y exhiben estabilidad estabilidad al almacenamiento.

Description

ALCANALES POLIMERICOS SOLUBLES EN AGUA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a derivados particulares de aldehido polimérico soluble en agua, y a los métodos para preparar y utilizar dichos derivados poliméricos de aldehido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En años recientes, los terapéuticos para humanos han extendido los pasados fármacos de molécula pequeña tradicionales hacia el reino de los biofarmacéuticos. El descubrimiento de proteínas y péptidos novedosos ha llevado al desarrollo de numerosas proteínas y polipéptidos biofarmacéuticos. Desafortunadamente, las proteínas y polipéptidos, cuando se utilizan como terapéuticos, frecuentemente exhiben propiedades que los hacen extremadamente difíciles para formular o administrar, tales como vidas medias cortas en circulación, inmunogenicidad, degradación proteolítica, y baja solubilidad. Un método para mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas en los biofarmacéuticos es la conjugación hacia polímeros naturales o sintéticos, tales como polietilenglicol (PEG). La unión covalente del PEG a una proteína terapéutica puede proveer numerosas ventajas, tales como (i) epítopes antigénicos protectores de la proteína, por lo tanto reduciendo su eliminación reticuloendotelial y reconocimiento por el sistema inmune, (ii) reducción de la degradación mediante enzimas proteolíticas, y (iii) reducción de la filtración renal. Se ha empleado un gran esfuerzo en el desarrollo de derivados poliméricos para el acoplamiento de biofarmacéuticos tales como péptidos, y en particular, en el desarrollo de derivados poliméricos para el acoplamiento a grupos amino reactivos de proteínas. Dichos derivados poliméricos se refieren como "electrofílicamente activados", puesto que éstos contienen grupos electrófilos adecuados para reacción con nucleófilos tales como aminas. Los ejemplos de dichos derivados de PEG incluyen PEG diclorotriazina, PEG tresilato, PEG succinimidil carbonato, PEG carbonilimidazol, y PEG succinimidil succinato. Desafortunadamente, el uso de estos reactivos particulares puede producir uno o más que los siguientes: reacciones laterales no deseables bajo las condiciones de reacción necesarias para llevar a cabo el acoplamiento, ausencia de selectividad, y/o la formación de uniones débiles (por ejemplo, inestables) entre el biofarmacéutico y el PEG. En un esfuerzo para superar algunos de estos problemas, se han desarrollaron muchos PEG novedosos o "de segunda generación" electrofílicamente activados, tales como PEG propionaldehído y PEG acetaldehído (véase, ejemplo, Patentes de E.UA Nos. 5,252,714 y 5,990,237, respectivamente). Los derivados en aldehido son reactivos particularmente atractivos para el acoplamiento a proteínas y a otras biomoléculas, puesto que los aldehidos reaccionan solamente con las aminas (por ejemplo, son selectivos en su química de unión). Los reactivos anteriormente mencionados ofrecen muchas ventajas: éstos se pueden preparar para evitar los problemas de la contaminación de PEG diol, no son restrictivos al mPEG de bajo peso molecular, a partir de uniones estables con la amina después del acoplamiento, y son selectivos. Aunque los derivados mencionados anteriormente ofrecen muchas ventajas sobre los reactivos de PEG de primera generación, los solicitantes han notado ciertas desventajas particulares de estos reactivos de aldehido, haciéndolos menos ideales en ciertos casos. Más específicamente, los solicitantes han reconocido, en su trabajo extensivo con estos reactivos, que el PEG acetaldehído es muy inestable, particularmente en medio básico, y es difícil de aislarlo debido a una formación excesiva de sales que se producen a partir de la neutralización de la mezcla de reacción. En particular, el PEG acetaldehído es muy susceptible a la dimerización vía condensación por aldol. El PEG propionaldehído, aunque es un reactivo mucho mejor en términos de estabilidad, posee ciertas desventajas debido a las reacciones laterales que pueden ocurrir durante su preparación, haciendo difícil obtener el producto PEG propionaldehído con una alta pureza. Más específicamente, los solicitantes han encontrado que cuando se prepara PEG propionaldehído in situ a partir de su precursor hidrato de aldehido de PEG, los rendimientos del producto son generalmente de solo aproximadamente 50%, debido a una reacción de eliminación que consumen una porción significativa del reactivo acetal. Aunque se puede emplear una ruta sintética mejorada para la síntesis de PEG propionaldehído, por ejemplo, vía la reacción catalizada por una base de 3-hidroxipropionaldehído dietil acetal con PEG mesilato, los solicitantes han descubierto que esta ruta de reacción también lleva a una reacción lateral de eliminación que produce cantidades significativas de PEG vinil éter, el cual es inestable y produce el dihidroxi PEG parental difícil de remover (también referido como PEG diol). Consecuentemente, el rendimiento de esta reacción generalmente es menor de aproximadamente 85 a 90%. Además, utilizando cualesquiera de las síntesis de PEG propionaldehído anteriormente mencionadas se requiere la hidrólisis del intermediario acetal a pHs muy bajos, por ejemplo, a pHs de 2 o menores. La hidrólisis a dichos pHs bajos es inestable debido a las grandes cantidades de base necesarias para neutralizar la mezcla de reacción a pHs adecuados para conjugación. Adicionalmente, el acoplamiento de PEG propionaldehído a una proteína a pHs básicos puede ser problemática debido a la formación de cantidades significativas de acroleína (que se produce a partir de una reacción lateral tipo retro-Michael), la cual es muy difícil de remover. La formación de dichos productos laterales no deseables necesita una purificación extensiva para obtener un producto grado farmacéutico. Por lo tanto, existe una necesidad para mejorar derivados de polímeros electrónicamente activados para conjugación a moléculas y superficies biológicamente activas, particularmente derivados poliméricos (i) que son selectivos en su química de acoplamiento, (ii) se pueden preparar en altos rendimientos y en pocos pasos de reacción, (iii) son estables en un amplio intervalo de pHs, (iv) se pueden aislar fácilmente, (iv) se pueden preparar con una alta pureza (por ejemplo, sustancialmente ausentes de impurezas derivadas del polímero y productos laterales, y (v) se sobreponen a al menos algunas de las desventajas de los derivados poliméricos conocidos tales como aquellos descritos en la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee una familia única de alcanales poliméricos- por ejemplo, polímeros que comprenden al menos una funcionalidad aldehido acoplada a un segmento polimérico mediante uno o más átomos de carbono interpuestos. Los alcanales poliméricos de invención son, en su mayor parte, menos reactivos que los derivados de aldehido de la técnica anterior y, por lo tanto, son más selectivos. Además, los alcanales poliméricos de la invención se preparan con un alto rendimiento, y ciertas estructuras pueden prepararse en procedimiento directo de un paso. Algunos de los aldehidos poliméricos descritos en la presente invención son más estables a pHs básicos que los derivados de aldehido previamente conocidos, y se forman sin cantidades significativas o incluso sin cantidades detectables de subproductos de reacción tipo retro-Michael. Además, los alcanales poliméricos de la invención se forman a partir de los precursores acétales correspondientes mediante hidrólisis bajo condiciones ácidas moderadas, por ejemplo, bajo condiciones ácidas mucho menos severas que aquellas requeridas ya sea para PEG acetaldehído o para PEG propionaldehído. Dichas condiciones moderadas permiten la conjugación directa in situ de los derivados poliméricos de la invención con proteínas, péptidos, u otros blancos moleculares sin requerir un paso intermedio de aislamiento. Los alcanales poliméricos de la invención también se preparan con alta pureza, haciéndolos particularmente ventajosos para el acoplamiento a fármacos y biofarmacéuticos para proveer composiciones poliméricas conjugadas que tienen una pureza suficiente para administración a un sujeto mamífero. Más particularmente, en un aspecto, la presente inversión se dirige a polímeros solubles en agua que tienen la estructura: I En la estructura anteriormente mencionada, POLY representa un segmento polimérico soluble en agua; X' es una porción enlazadora; z' es un entero a partir de 1 a aproximadamente 21 ; R1 cada vez que se presenta, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido; y R2, cada vez que se presenta, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido. En ciertos casos, los alcanales poliméricos de la invención poseerán ciertas características. Por ejemplo, de conformidad con una modalidad de la invención, cuando POLY es lineal: (a) el número total de carbonilos (excluyendo/no contando el carbono del aldehido del carbonilo) presente en el polímero es de 0 ó 2 o mayor excepto cuando X' comprende uno o más segmentos (-CH2CH20-) o (-CH2CH2NH-) contiguos. Cuando X' comprende uno o más segmentos (-CH2CH20-) o (-CH2CH2NH-) contiguos, entonces el número total de carbonilos presente en el polímero es 0, 1 , 2, o mayor. En incluso otro ejemplo, de conformidad con una modalidad adicional, cuando X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH20-) y z' es de 2 a 12, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o el polímero es heterobifuncional, en donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxilo. Los alcanales poliméricos provistos en la presente invención pueden poseer cualesquiera de numerosas geometrías o estructuras generales, a ser descritas con mayor detalle en la presente invención. Preferentemente, cuando POLY está ubicado, entonces cualquier (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- en donde b es de 1 a aproximadamente 20 en el caso en donde POLY comprende un residuo de lisina. Alternativamente, cuando POLY está ramificado y posee dos brazos poliméricos, entonces ningún brazo polimérico comprende oxígeno como el único heteroátomo en el caso en donde POLY comprende "C-H" como un punto de ramificación.

Generalmente hablando, los alcanales poliméricos de la invención poseen una estructura en donde z' cae dentro de uno de los siguientes intervalos: z' es de aproximadamente 2 a 21 , de aproximadamente 3 a 12, de aproximadamente 3 a 8, o de 3 a aproximadamente 6. En una modalidad particular de la invención, el polímero tiene la estructura: R' R' R' O I I I II POLY X' C4 C¡> ¾ C, — H I I? L R2 R2 R2 I-A en donde POLY, X', cada R1, cada R2 y R3 son como se definieron anteriormente. En la estructura precedente, Ci indica el carbono del carbonilo del aldehido; C2 indica el carbono adyacente a o a (alfa) al carbono del carbonilo o C-i; C3 indica el átomo de carbono una vez removido a partir del carbono del carbonilo o en la posición ß (beta); y C4 indica el átomo de carbono en la posición ?. Los alcanales poliméricos que tienen la estructura general ilustrada por l-A se refieren generalmente en la presente invención como butanales poliméricos. En variaciones preferidas de la fórmula l-A anteriormente mencionada, R1 unido a C2 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H. Preferiblemente, el R unido a C2 es alquilo inferior.

Alternativamente, el alcanal polimérico corresponde a la estructura l-A anteriormente mencionada, en donde el R1 unido a C3 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H. En incluso otra modalidad preferida, el alcanal polimérico se describe por la estructura l-A en donde el R1 unido a C4 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H. En incluso otra modalidad particular, un alcanal polimérico de la invención corresponde a la fórmula I, y posee un átomo de carbono adicional en la cadena alquileno cuando se compara con la estructura l-A. En esta modalidad (véase la estructura l-B en la presente invención), z' es 4, el R unido a C2 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H.

Alternativamente, cualesquiera de los R1 unido a C3 o a C4 es alquilo, y todas las otras variables R y R2 son H. En incluso otra modalidad particular que cae dentro de la fórmula I, z' es 5, el R1 unido a C2 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H (véase la estructura l-C en la presente invención). Alternativamente, uno de las variables R1 unido a C3 o a C4 o a C5 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H. El alcanal polimérico de conformidad con la fórmula I, en ciertas modalidades, posee una porción enlazadora descrita generalmente por la fórmula: -(CH2)e-De-(CH2)f- o -(CH2)p-Mr-(0)-Ks-(CH2)q-, en donde c tiene un intervalo de cero a 8; D es O, NH, o S; e es 0 ó 1 ; f tiene un intervalo de cero a 8; p tiene un intervalo de cero a 8; M es -NH ú O; K es NH ú O; q tiene un intervalo de cero a 8, y r y s son cada uno independientemente 0 ó 1. Los enlazadores específicos que caen dentro de esta fórmula general se describen con mayor detalle a continuación. La porción enlazadora puede incluir opcionalmente un segmento oligomérico que corresponde a la estructura -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g-, en donde b y g son cada uno independientemente 1 a 20. Preferiblemente, b y g cada uno independientemente tiene un intervalo de aproximadamente 1 a 10, e incluso más preferiblemente tiene un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6. Estos enlazadores oligoméricos proveen estabilidad adicional a los alcanales de la invención, y también proveen ventajas en la metodología sintética para preparar los polímeros, a ser descritos con mayor detalle a continuación. Más particularmente, en ciertas modalidades, X' comprende una porción que corresponde a la estructura: -(CH2)c-De-(CH2)rP- o -(CH2)P-Mr-C(0)-Ks-(CH2)q-T-, en donde P y T son cada uno independientemente -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g; y b y g cada uno tiene un intervalo independientemente a partir de 1 a aproximadamente 20. En una modalidad específica de un alcanal polimérico de conformidad con la fórmula I, X' comprende -C(0)NH-(CH2)1-6NH-C(0)- o -NHC(0)NH-(CH2)i-6NH-C(0)-. Preferiblemente, el segmento polimérico soluble en agua de un alcanal polimérico de la invención es un poli(óxido de alquileno), un poli(vinilpirrolidona), un poli(vinil alcohol), una polioxazolina, una poli(acriloilmorfolina), o un poli(poliol oxietilado). En una modalidad preferida, el segmento polimérico es un poli(óxido de alquileno), Preferiblemente poli(etilenglicol). De conformidad con una modalidad, el segmento poli(etilenglicol) comprende la estructura: Z-(CH2CH20)n- o Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-, en donde n tiene un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000 y Z es una porción que comprende un grupo funcional seleccionado a partir del grupo que consiste de hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina, y fluoresceína. Alternativamente, POLY puede estar terminalmente cubierto con una porción para cubrimiento de extremo tales como alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquinilo, oxi, alquinilo sustituido, oxi, ariloxi, y ariloxi sustituido. Los grupos para cubrimiento de extremo preferidos incluyen metoxi, etoxi, y benciloxi. Generalmente, POLY posee una masa molecular promedio nominal que cae dentro de uno de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 daltones a aproximadamente 100,000 daltones, de aproximadamente 1,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones, o de aproximadamente 2,000 daltones a aproximadamente 30,000 daltones. Las masas moleculares preferidas para POLY incluyen 250 daltones, 500 daltones, 750 daltones, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, y 50 kDa, o incluso mayores. En incluso otra modalidad particular, el alcanal polimérico de la invención comprende la estructura: ? en donde POLY, cada X', cada (?'), cada R1, cada R2, y cada R3 son como se definieron previamente. En una modalidad específica, POLY es lineal y el polímero es homobifuncional. Como se estableció anteriormente, el segmento polimérico dentro del alcanal polimérico puede poseer cualesquiera de diversas geometrías, tales como lineales, ramificadas, bifurcado, con brazos múltiples, o dendríticas, a ser descritas con mayor detalle a continuación. Las modalidades especificas de la invención incluyen alcanales poliméricos que corresponden a las siguientes estructuras: IV-A En las estructuras anteriormente mencionadas, PEG es poli(etilenglicol), y b y g son cada uno independientemente 0 a 20, a es 0 a 6. Para las estructuras generalizadas provistas en esta sección, las variables corresponden a los intervalos/valores previamente provistos a menos que se mencione de otra manera. En una modalidad específica, un alcanal polimérico de conformidad con la invención corresponde a la estructura: PEG LH-D Un alcanal polimérico particularmente preferido que cae dentro de la estructura generalizada lll-D posee la estructura: o II CH30-(C¾CH20)„-C— H <CH_)4 o II I I CHaO-ÍCHjCHüOJn-C-NH — CH — CíOJIIN-íCtyCHjOU-CH^CHj^-CHO II1-E De conformidad con otro aspecto, la invención se dirige a una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura: VI! en donde la composición carece de cantidades detectables de especies que contienen yodo o productos de reacción tipo retro-Michael. Esto es particularmente ventajoso, puesto que las especies que contienen yodo pueden llevar a la degradación de cadenas de poli(etilenglicol) debido a la escisión de la cadena, produciendo un producto polimérico que tiene un elevado valor de polidispersión, por ejemplo, mayor de alrededor de 1.2. Preferiblemente, un alcanal polimérico de la invención poseerá un valor de polidispersión de menos de aproximadamente 1.2, preferiblemente de menos de aproximadamente 1.1 , e incluso más preferiblemente de menos de aproximadamente 1.05. Incluso más preferidos son los alcanales poliméricos tales como aquellos descritos en la presente invención caracterizados por una polidispersión de 1.04, 1.03 o menor. De conformidad con incluso otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura: en donde POLY es un lineal, segmento polimérico soluble en agua terminalmente modificado en el extremo y la composición carece de cantidades detectables de derivado de dialdehído polimérico. Una característica adicional de los alcanales poliméricos de la invención es su estabilidad, por ejemplo, estabilidad de almacenamiento, en comparación con otras composiciones conocidas de aldehido polimérico. Por ejemplo, se provee en la presente invención una composición de alcanal polimérico que exhibe 10% o menos de degradación del grupo aldehido polimérico cuando se almacena a 40°C por 15 días, como se determinó mediante RMN.

En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende un alcanal polimérico que corresponde a la siguiente estructura: VII-A. En una modalidad incluso más preferida, de conformidad con la estructura VI l-A, POLY posee la estructura Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-, en donde X es O, n tiene un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z comprende un grupo funcional, porción direccionadora, reportero, grupo modificador del extremo, o los similares.

Otra composición de la invención comprende un polímero de conformidad con la estructura: vin En incluso otro aspecto de la invención, se proveen formas hidrato o acetal de los alcanales poliméricos descritos anteriormente.

Los acétales de la invención incluyen dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil) acetal, S.S'-dimetilacetal, S.S'-dietil acetal, y dioxolanos. Más particularmente, se puede describir generalmente una forma acetal o hidrato de un alcanal polimérico de la invención por la siguiente estructura: IX en donde Wa y Wb son cada uno independientemente O ó S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H, o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de metilo, etilo, isopropilo, bencilo, 1 ,1 ,1-tricloroetilo, y nitrobencilo, o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3-, formando un anillo de 5 ó 6 miembros cuando se consideran junto con Wa, C1 ( y Wb. Los acétales poliméricos son precursores útiles de los alcanales de la invención, y se pueden hidrolizar para producir un alcanal polimérico. En una modalidad particular, se provee un polímero soluble en agua que tiene la estructura: IX A En la estructura IX-A, el alcanal es uno que tiene solamente metileno o carbonos -(CH2)- separando la porción acetal o hidrato de aldehido de la molécula a partir del enlazador, X'. Además, la invención se dirige a conjugados formados mediante la reacción de un agente biológicamente activo con los alcanales poliméricos descritos en la presente invención, sus hidratos y/o los alcanales correspondientes. Preferiblemente, el conjugado corresponde a la siguiente estructura: ?i H i POLY — x — I C - -c— NH- agente biológicamente activo H El NH- agente biológicamente activo en donde "el NH-agente biológicamente activo" representa un agente biológicamente activo que comprende un grupo amino. También formando parte de la presente invención están los hidrogeles formados a partir de los alcanales poliméricos o sus precursores descritos en la presente invención. De conformidad con incluso otro aspecto, la invención provee reactivos aldehido protegidos. Estos reactivos aldehido protegidos son particularmente útiles para formar los alcanales poliméricos de la invención, y corresponden generalmente a las siguientes estructuras: XI-A XI B XI c en donde G es un grupo funcional, y las variables remanentes tienen los valores establecidos anteriormente. En las modalidades preferidas de las estructuras Xl-A, B, y C, G es un grupo residual tales como cloruro, bromuro, para-tolilsulfonato éster, metilsulfonil éster, trifluorosulfoniléster, y trifluoroetilsulfonil éster. Alternativamente, G es un grupo funcional seleccionado a partir del grupo que consiste de -OH, -NH2, -SH, y formas protegidas de los mismos. Otro aspecto de la invención se dirige a un método para preparar un alcanal polimérico soluble en agua, opcionalmente en forma protegida. Brevemente, el método incluye los pasos de hacer reaccionar un polímero soluble en agua que comprende al menos un grupo reactivo, Y, con un reactivo alcanal protegido que comprende de aproximadamente 2 a 20 átomos de carbono y un grupo reactivo, K, adecuado para desplazamiento mediante o alternativamente, reacción con Y, bajo condiciones efectivas para formar un alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida. En este método, un polímero activado se acopla a un reactivo que comprende la porción alcanal del producto final, o un precursor del mismo. Preferiblemente, la reacción se lleva a cabo bajo una atmósfera inerte. En una modalidad específica, POLY-Y, se prepara mediante polimerización directa. El método también puede incluir el paso adicional de hidrolizar el alcanal polimérico soluble en agua protegido, por ejemplo, bajo condiciones ácidas, para formar el alcanal polimérico soluble en agua correspondiente. En una modalidad preferida, el paso de hidrólisis se lleva a cabo a un pH de no menos de aproximadamente 3. Las formas protegidas del reactivo alcanal para llevar a cabo el método incluyen acétales tales como dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil)acetal, S,S*-dimetil acetal, y S,S'-dietil acetal, acétales cíclicos y tioacetales cíclicos. En incluso una modalidad adicional, el alcanal polimérico así producido se recupera al elevar el pH de la mezcla de reacción de aproximadamente 6.0 a 7.5, extrayendo el alcanal polimérico en un solvente orgánico, y removiendo el solvente. En una modalidad preferida del método, el polímero soluble en agua corresponde a la estructura, "POLY-Y", y el reactivo alcanal protegido corresponde a la estructura: XI-D Preferiblemente, POLY comprende un poli(etilenglicol) que puede o no estar terminalmente modificado en el extremo. En una modalidad particular del método, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z se selecciona a partir del grupo que consiste de -OCH3, -OCH2CH3, y -OCH2(C6H5). En una modalidad adicional, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nCH2CI-l2O"M+, en donde POLY-Y se prepara mediante polimerización por abertura del anillo aniónico del óxido de etileno en una sal de alcoholato modificada en su extremo tal como Z-CH2CH2O"M+, preparado mediante metalación del grupo OH terminal de Z-CH2CH2OH con una base fuerte. M+ representa un contraión metálico tales como Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+. El POLY-Y así preparado es adecuado posteriormente para reacción con un reactivo alcanal protegido como se describió anteriormente. En incluso una modalidad adicional particularmente preferida, el alcanal recuperado carece de cantidades detectables de POLY Y no reaccionado (por ejemplo, Z-(CH2CH2O)nH) y productos de reacción tipo retro- ichael. En incluso otra modalidad del método, POLY-Y corresponde a PEG- diol, es decir, POLY-Y posee la estructura HO-(CH2CH20)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, K se selecciona a partir del grupo que consiste de: y el método resulta en la formación de un alcanal polimérico protegido que tiene la estructura: XII En incluso otra modalidad del método, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH20)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z es hidroxilo protegido. En este caso, una modalidad preferida del método incluye desproteger el hidroxilo protegido después del paso de reacción, opcionalmente seguido por la conversión del hidroxilo terminal del poli(etilenglicol) a un grupo funcional diferente al hidroxilo. Los grupos funcionales ejemplares incluyen amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, y silano. Preferiblemente, el grupo funcional se selecciona a partir del grupo que consiste de N-hidroxisuccinimidil éster, carbonato de benzotriazolilo, amina, amina protegida, viniisulfona, y maleimida. De conformidad con incluso otra modalidad de la invención, "Y' en POLY-Y es un grupo ionizable o es un derivado de un grupo ¡onizable tales como un ácido carboxílico, éster activo, o amina. Preferiblemente, POLY-Y se ha purificado mediante cromatografía antes de su uso en el paso de reacción. En una modalidad particular, POLY-Y se purifica antes de su uso mediante cromatografía de intercambio iónico. Idealmente, dicho POLY-Y purificado mediante cromatografía para uso en el paso de reacción esencialmente carece de cantidades detectables de impurezas poliméricas. En una de tales modalidades de este método, POLY-Y está modificado en su extremo, y esencialmente carece de cantidades detectables de PEG-diol o de impurezas de PEG difuncionales. Alternativamente, en la práctica del método de la invención, el reactivo alcanal comprende la estructura: XI-F XI-G en donde g y b cada uno independientemente tiene un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. Como un ejemplo, un reactivo alcanal preferido corresponde a la estructura: R' OR3 I NH2— (CH2CH2Oh, -C[— OR4 I XI-H y el producto del paso de reacción posee la estructura generalizada: IX-B En incluso otro método para preparar un alcanal polimérico de la invención, un alcanal polimérico como se describe en la presente invención se prepara al construir el segmento polimérico directamente sobre un precursor acetal, por ejemplo, mediante polimerización directa. Más específicamente, este método comprende los pasos de: (i) proveer un precursor acetal que comprende al menos un sitio aniónico activo adecuado para el inicio de la polimerización, (ii) poner en contacto el sitio aniónico del precursor acetal con un monómero reactivo capaz de llevar a cabo polimerización, para iniciar así la polimerización del monómero reactivo en el precursor acetal, (iii) como un resultado de dicho paso de contacto, añadir monómeros reactivos adicionales al precursor acetal para formar una cadena polimérica, (¡v) permitir que dicho contacto continúe hasta que se alcance una longitud deseada de la cadena polimérica, y (v) terminar la reacción al lograr un precursor aldehido polimérico de la invención. El precursor aldehido polimérico resultante se puede hidrolizar adicionalmente al alcanal correspondiente como se estableció anteriormente, si se desea. En una modalidad particular del método anteriormente mencionado, el monómero reactivo es óxido de etileno y el sitio aniónico reactivo contenido dentro del precursor acetal es un anión alcóxido (O-), preferiblemente acompañado por un metal alcalino u otro contraión adecuado. El grupo alcóxido terminal presente en el precursor acetal es activo para polimerización por abertura del anillo aniónico del óxido de etileno para formar un alcanal polimérico de la invención. El precursor acetal generalmente poseerá una estructura que corresponde a: en donde las variables poseen los valores anteriormente descritos, con la excepción de que X' termina en un anión oxígeno, u O" (por ejemplo, en su forma neutra, X' típicamente termina en un grupo hidroxilo o -OH, más que en la presencia de una base fuerte, que se convierte a la sal de aicóxido correspondiente). Los contraiones adecuados incluyen Na+, K\ Li+, y Cs+. El paso de terminación generalmente comprende neutralizar la reacción, por ejemplo, mediante la adición de ácido. Opcionalmente, el segmento polimérico puede ser estar modificado en su extremo mediante la adición de un reactivo para alquilatación u otros reactivos adecuados para proveer un extremo terminal no reactivo. Estos y otros objetivos y características de la invención se volverán completamente evidentes cuando se lean en conjunción con la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA La figura 1 es un esquema de reacción general para preparar un alcanal polimérico de la invención mediante polimerización por abertura del anillo aniónico de óxido de etileno (EO) sobre un precursor acetal que tiene un sitio aniónico. Esta figura muestra el precursor acetal que tiene un sitio anionico, en donde M+ es un contraion metálico, y (?' 0.1-O-) indica un enlazador terminal en un alcoxido, en donde X' 0.1-O- cuando se toma junto puede ser simplemente "O", o la porción X' puede comprender cualesquiera de los enlazadores descritos en la presente invención o combinaciones de los enlazadores DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a los polímeros particulares, técnicas sintéticas, agentes activos, y los similares puesto que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente invención es solamente para describir modalidades particulares, y no se pretende que sea limitante. Debe mencionarse que, como se utiliza en esta especificación, las formas singulares "un", "una", y " el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a un "polímero" incluye un polímero particular así como dos o más de los mismos polímeros o de polímeros diferentes, la referencia a un "conjugado" se refiere a un conjugado particular así como a dos o más de los mismos conjugados o de conjugados diferentes, la referencia a un "excipiente" incluye a un excipiente particular así como a dos o más de los mismos excipientes o de excipientes diferentes, y los similares.

Para describir y reclamar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de conformidad con las definiciones que se describen a continuación.

Definiciones Los siguientes términos como se definen en la presente invención tienen los significados indicados. Como se utiliza en la especificación, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el/la", incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo indique otra manera. "PEG" o "poli(etilenglicol)" como se utiliza en la presente invención, se entiende que abarca cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, PEGs para uso en la presente invención comprenderá una de las dos siguientes estructuras: "-(CH2CH20)n-" o (CH2CH20)n dependiendo de sí o no se desplazó el oxígeno(s) terminal, por ejemplo, durante una transformación sintética. La variable (n) es 3 a 3000, y los grupos terminales y la arquitectura del PEG general puede variar. Cuando PEG comprende adicionalmente una porción enlazadora (a ser descrita con mayor detalle a continuación), los átomos que comprenden el enlazador (?'), cuando está covalentemente unido a un segmento de PEG, no resulta en la formación de (i) un enlace oxígeno-oxígeno (-0-0-, un enlace peróxido), o (ii) un enlace nitrógeno-oxígeno (N-O, O-N). "PEG" significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de subunidades que son -CH2CH2O-. PEGs para uso en la invención incluyen PEGs que tienen una variedad de pesos moleculares, estructuras o geometrías (por ejemplo, PEGs ramificados, lineales, bifurcados, dendríticos, y los similares), a ser descritas con mayor detalle a continuación. "Soluble en agua", en el contexto de un polímero de la invención o un "segmento polimérico soluble en agua" es cualquier segmento o polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero o segmento soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de luz, transmitida por la misma solución después del filtrado. En una base en peso, un polímero soluble en agua o un segmento del mismo preferiblemente será de al menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, incluso más preferiblemente de aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. No obstante, se prefiere más que el polímero o segmento soluble en agua sea de aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o que sea completamente soluble en agua. Y el grupo "modificador del extremo" o "modificado en su extremo" es un grupo inerte presente en el extremo de un polímero tales como PEG. Un grupo modificador del extremo es uno que lleva a cabo fácilmente transformación química bajo condiciones típicas de reacción sintética. Y el grupo modificador del extremo generalmente es un grupo alcoxi, -OR, en donde R es un radical orgánico que comprende de 1-20 átomos de carbono y preferiblemente es alquilo inferior (por ejemplo, metilo, etilo) o bencilo. "R" puede estar saturado o insaturado, e incluye arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y formas sustituidas de cualesquiera de los precedentes. Por ejemplo, un PEG modificado en su extremo típicamente comprenderá la estructura "RO-(CH2CH20)n-", en donde R es como se definió anteriormente. Alternativamente, el grupo modificador del extremo también puede comprender ventajosamente una marca detectable. Cuando el polímero tiene un grupo modificador del extremo que comprende una marca detectable, la cantidad o localización del polímero y/o la porción (por ejemplo, agente activo) al cual está acoplado el polímero, se puede determinar mediante el uso de un detector adecuado. Dichas marcas incluyen, sin limitación, elementos fluorescentes, quimioluminiscentes, porciones utilizadas en el marcado enzimático, colorimétricos (por ejemplo, colorantes), iones metálicos, porciones radiactivas, y las similares. "Que se presentan de manera no natural" con respecto a un polímero de la invención se refiere un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero de la invención que no se presenta de manera natural puede contener no obstante una o más subunidades o segmentos de subunidades que se presentan de manera natural, siempre y cuando la estructura polimérica general no se encuentre en la naturaleza. "Masa molecular" en el contexto de un polímero soluble en agua de la invención tal como PEG, se refiere a la masa molecular promedio nominal de un polímero, típicamente determinada mediante cromatografía por exclusión de tamaño, técnicas de dispersión de la luz, o determinación de la velocidad intrínseca en 1 ,2,4-triclorobenceno. Los polímeros de la invención típicamente son polidispersos, poseyendo valores bajos de polidispersion de menos de aproximadamente 1.20. El término "reactivo" o "activado" cuando se utiliza en conjunción con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional que reacciona fácilmente con un electrófilo o con un nucleófilo, típicamente presente en otra molécula, para llevar a cabo la transformación. Esto está en contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción severas con el objeto de reaccionar (por ejemplo, un grupo "no reactivo" o "inerte"). El término "protegido" o "grupo para protección" o "grupo protector" se refiere a la presencia de una porción (por ejemplo, el grupo protector) que previene o que bloquea la reacción de un grupo funcional particular químicamente reactivo en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de reacción sobre el tipo de grupo químicamente reactivo siendo protegido así como de las condiciones de reacción a ser empleadas y la presencia de reactivos adicionales o grupos protectores en la molécula, en caso de que se presenten. Los grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene, T. W., et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3a edición, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999).

Como se utiliza en la presente invención, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo se entiende que abarca formas protegidas del mismo. El término "porción enlazadora" se utiliza en la presente invención para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente utilizados para enlazar a las porciones de interconexión, tales como un segmento polimérico y un alcanal. Las porciones enlazadoras de la invención pueden ser hid rol ¡ticamente estables o pueden incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente débil que reacciona con el agua (por ejemplo, está hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace para hidrolizarse en agua dependerá no solamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino también en los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los enlaces apropiados h id rol ¡ticamente inestables o los enlaces débiles incluyen pero no se limitan a éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acétales, -cetales, aciloxialquil éter, ¡minas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que se somete a degradación por una o más enzimas. Un enlace o puente "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es substancialmente estable en agua, es decir, no lleva a cabo hidrólisis bajo condiciones fisiológicas a ningún grado apreciable en un periodo de tiempo extendido. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen pero no se limitan a los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos, y los similares. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una velocidad de hidrólisis de menos de aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las velocidades de hidrólisis de los enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de los libros de texto estándares de química. "Alcanal" se refiere a la porción aldehido de polímero de la invención (CHO) soluble en agua, incluyendo el carbono del carbonilo y cualesquiera metilenos o metilenos sustituidos adicionales (-C(R1)(R2)- hasta la porción enlazadora que conecta la porción alcanal del polímero al segmento polimérico. Al nombrar un segmento alcanal, C1 corresponde al carbono del carbonilo. El término "alcanal" como se utiliza en la presente invención se entiende que abarca hidrato y formas protegidas del grupo aldehido, así como análogos chalcogen. Una forma protegida particularmente preferida de un alcanal de la invención es un acetal. El "número total de carbonilos", con referencia a ciertos alcanales poliméricos de la invención, es el número total de grupos carbonilo contenidos en el alcanal polimérico, sin contar el carbono(s) del aldehido. "Ramificado" en referencia a la geometría o a la estructura general de un polímero se refiere a un polímero que tiene 2 o más "brazos" poliméricos. Un polímero ramificado puede poseer 2 brazos poliméricos, 3 brazos poliméricos, 4 brazos poliméricos, 6 brazos poliméricos, 8 brazos poliméricos o más. Un tipo particular de un polímero altamente ramificado es un polímero dendrítico o dendrímero, que para los propósitos de la invención, se considera que posee una estructura distinta de la de un polímero ramificado. "Punto de ramificación" se refiere a un punto de bifurcación que comprende uno o más átomos en el cual un polímero se divide o ramifica a partir de una estructura lineal hacia uno o más brazos poliméricos adicionales. Un "dendrímero" es un polímero de tamaño monodisperso, globular, en el cual todos los enlaces emergen radialmente a partir de un punto focal central o núcleo con un patrón de ramificación regular y con unidades repetidas que cada una contribuye al punto de ramificación. Los dendrímeros exhiben ciertas propiedades del estado dendítico tales como encapsulacion del núcleo, que los hacen únicos a partir de otros tipos de polímeros. "Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, 95% o mayor de cierta cantidad dada. Un "producto tipo retro-Michael" se refiere a un producto que se genera a partir de la reacción reversa de una reacción de adición tipo Michael. Una reacción de adición Michael (dirección hacia adelante) se refiere a la adición de una especie nucleofílica de carbono a un enlace doble electrofílico. Típicamente, pero no necesariamente, el nucleófilo es un enolato o una enamina aunque el nucleófilo también puede ser un alcóxido o una amina u otras especies. Típicamente el electrófilo es una cetona alfa, beta-insaturada, éster, o nitrilo, aunque otros grupos para el retiro de electrones también pueden activar un ataque nucleofílico al enlace doble de carbono-carbono. Un producto que se genera a través de la adición reversa (o dirección retrógrada) de una adición tipo Michael como se describió anteriormente, es decir, una reacción de eliminación resultante en la pérdida de una especie nucleofílica de carbono (que puede ser, pero no necesariamente es un enolato o enamina) y la formación de un enlace doble electrofílico tal como una cetona alfa, beta insaturada o los similares como se describió anteriormente se considera un producto tipo retro-Michael. Por ejemplo, una reacción tipo retro-Michael de mPEG-propionaldehído que resulta en los productos tipo retro-Michael, mPEG-OH y acroleína (CH2=CH-CHO). "Alquilo" se refiere a una cadena hidrocarburo, típicamente teniendo un intervalo de aproximadamente 1 a 20 átomos en longitud. Dichas cadenas de hidrocarburo preferiblemente están saturadas pero no necesariamente y pueden ser de cadena ramificada o recta, aunque típicamente se prefiere una cadena recta. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo, y los similares. Como se utiliza en la presente invención, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando tres o más átomos de carbono son referidos. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena recta o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo.

"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, incluyendo compuestos enlazados, fusionados, o espirocíclicos, preferiblemente hechos de 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente de 3 a aproximadamente 8. Los "sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente no son reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula. El término "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a una porción (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes que no interfieren, tales como, pero no limitados a: cicloalquilo de C3-C8, por ejemplo, cíclopropílo, ciclobutilo, y los similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo, y iodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; y los similares. Para las sustituciones en un anillo fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (por ejemplo, orto, meta, o para). "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo de C1-C20 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, bencilo, etc. ), preferiblemente de C1-C7. Como se utiliza en la presente invención, "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 1 a 15 átomos en longitud, que contiene al menos un enlace doble, tales como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo, y los similares.

El término "alquinilo," como se utiliza en la presente invención se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 2 a 15 átomos en longitud, que contiene al menos un enlace triple, etinilo, n-propinilo, isopropinilo, n-butinilo, isobutinilo, octinilo, decinilo, y etcétera. "Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono en el núcleo. Arilo incluye múltiples anillos arilo que pueden estar fusionados, como en el naftilo o no fusionados, como en el bifenilo. Los anillo arilo también pueden estar fusionados o no fusionados con uno o más anillos cíclicos hidrocarburo, heteroarilo, o heterocíclicos. Como se utiliza en la presente invención, "arilo" incluye heteroarilo. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente N, O, o S, o una combinación de los mismos. Los anillos heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos cíclicos hidrocarburo, heterocíclicos, arilo, o heteroarilo. "Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y que tiene al menos un átomo en el anillo el cual no es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno, y nitrógeno. "Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes. "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren. "Electrófilo" se refiere a un ion, átomo, o colección de átomos que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrófilo, por ejemplo, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleófilo, por ejemplo, un centro que busca un centro electrófilo, y que es capaz de reaccionar con un electrófilo. "Agente activo" como se utiliza en la presente invención incluye cualquier agente, fármaco, compuesto, composición de materia o mezcla la cual provee ciertos efectos farmacológicos, frecuentemente benéficos que se pueden demostrar in-vivo o in vitro. Esto incluye alimentos, suplementos alimenticios, nutrientes, nutricéuticos, fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas, y otros agentes benéficos. Como se utiliza en la presente invención, estos términos incluyen adicionalmente cualquier sustancia fisiológicamente o farmacológicamente activa que produce un efecto localizado o sistémico en un paciente. "Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que se puede incluir en las composiciones de la invención y que no ocasiona efectos toxicológicos adversos al paciente. "Cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad fisiológicamente efectiva", y "cantidad terapéuticamente efectiva" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para significar la cantidad de un conjugado de PEG-agente activo- presente en una preparación farmacéutica que es necesaria para proveer un nivel deseado de agente activo y/o conjugado en el torrente sanguíneo o en el tejido blanco. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y características físicas de la preparación farmacéutica, población pretendida de pacientes, consideraciones del paciente, y los similares, y se puede determinar fácilmente por un experto en la técnica, basándose en la información provista en la presente invención y disponible en la literatura relevante. "Multi-funcional" en el contexto de un polímero de la invención significa una estructura base polimérica que tiene 3 o más grupos funcionales contenidos en la presente invención, en donde los grupos funcionales pueden ser los mismos o pueden ser diferentes, y típicamente están presentes en los extremos del polímero. Los polímeros multi-funcionales de la invención típicamente contendrán de aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o de 3-50 grupos funcionales, o de 3-25 grupos funcionales, o de 3-15 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro de la estructura base del polímero. Un polímero "difuncional" significa un polímero que tiene dos grupos funcionales contenidos en la presente invención, típicamente en los extremos del polímero. Cuando los grupos funcionales son los mismos, se dice que el polímero es homodífuncional. Cuando los grupos funcionales son diferentes, se dice que el polímero es heterobifuncional Un reactivo básico o ácido descrito en la presente invención incluye formas de sales neutras, cargadas, y cualesquiera formas de sales correspondientes de las mismas. "Alcohol poliolefínico" se refiere a un polímero que comprende una estructura base de polímero olefínico, tales como polietileno, que tiene múltiples grupos hidroxilo colgantes unidos a la estructura base del polímero. Un alcohol poliolefínico ejemplar es alcohol polivinílico. Como se utiliza en la presente invención, "no peptídico" se refiere a una estructura base del polímero sustancialmente libre de enlaces peptídicos. No obstante, el polímero puede incluir un número menor de enlaces peptídicos espaciados a lo largo de las subunidades repetidas del monómero, tales como, por ejemplo, no más de aproximadamente 1 enlace peptídico por aproximadamente 50 unidades monoméricas. Como se utiliza en la presente invención, "hidrato"se refiere a un aldehido hidratado resultante de la adición de una molécula de agua al grupo aldehido, el cual reemplaza la funcionalidad carbonilo con dos grupos hidroxilo. Los aldehidos alcanzan el equilibrio con el hidrato correspondiente en agua. El término "análogo de chalcogen" se refiere a los análogos aldehido cuando en la presente invención el átomo de oxigeno se reemplaza con otro heteroátomo, generalmente azufre, selenio, o telurio. El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que padece de o que es propenso a una condición que se puede prevenir o tratar mediante la administración de un polímero de la invención, típicamente pero no necesariamente en la forma de un conjugado de polímero-agente activo, y que incluye tanto a humanos como a animales. Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia subsecuentemente descrita puede ocurrir o no puede ocurrir, de manera que la descripción incluye casos en donde la circunstancia ocurre y casos en donde no ocurre.

El polímero En un primer aspecto, la invención provee un polímero soluble en agua que tiene un grupo reactivo aldehido. Los polímeros de la invención son únicos en muchos aspectos. Estos se preparan no solamente con un alto rendimiento, sino que también son estables al almacenamiento debido a la ausencia de subproductos de reacción deletéreos que pueden llevar la degradación de la cadena polimérica y a una escasa polidispersión del polímero. Los polímeros, en particular los polímeros modificados en su extremo, se preparan adicionalmente con una alta pureza, por ejemplo, carecen de cantidades detectables de derivados de PEG-diol y otras impurezas poliméricas. Esta característica es particularmente ventajosa para preparar polímeros de PEG modificados en su extremo con alto peso molecular, por ejemplo, que tienen un peso molecular de aproximadamente 30 kDa o mayor, en donde la cantidad de impureza de PEG diol en el material sin purificar tal como mPEG puede tener un intervalo de aproximadamente 2% en peso a 30% en peso con mayor, dependiendo del fabricante. Además, en ciertas modalidades, los polímeros de la invención son menos reactivos que otros aldehidos poliméricos conocidos, haciéndolos más discriminantes en las reacciones de conjugación y más estables durante la transformación, manejo, y procesamiento de reacción.

Características estructurales generales y porción alcanal Generalmente hablando, el polímero de la invención posee un segmento polimérico conectado de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 metilenos contiguos o metilenos sustituidos que terminan en una función aldehido (por ejemplo, la porción alcanal) vía una porción enlazadora interpuesta. Una estructura generalizada que corresponde al polímero de la invención se provee a continuación como la estructura I.

Estructura I Con referencia a la descripción anteriormente mencionada cuando se observa en conjunción con la estructura I, el segmento polimérico se representa por POLY, la porción enlazadora se representa por X', y los metilenos contiguos (que forman una cadena alquileno) o metilenos sustituidos (que forman una cadena alquileno sustituida) se representan por -C(R1)(R2)-. Más específicamente, en la estructura I, POLY es un segmento polimérico soluble en agua; X' es una porción enlazadora; y z' es un entero de 1 a aproximadamente 21. R , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico tal como alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido. R2, en cada caso, también es independientemente H o un radical orgánico tal como partir del grupo que consiste que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido. Aunque muchas de las estructuras explícitamente provistas en la presente invención son aldehidos, deben entenderse que estas mismas estructuras y de hecho la invención como un todo se entiende que abarca a los hidratos de aldehido correspondientes, aldehidos en forma protegida, y análogos de chalcogen. En donde el oxígeno del carbonilo en la estructura I se reemplaza por un azufre, selenio, o telurio. La presente invención provee flexibilidad considerable con respecto al tamaño de la cadena alquileno conectada con el grupo aldehido. La longitud de la cadena de carbono se considera como el carbono del carbonilo (C1) mas el número de átomos de carbono que intervienen, (por ejemplo, el número total de Cs que comprende la porción [-C(R1)(R2)]z' del polímero), que conecta el carbono del carbonilo con el enlazador. Típicamente la longitud de la cadena de carbono es de 3 a aproximadamente 22 átomos de carbono, o más típicamente de aproximadamente 4 a aproximadamente 13 átomos de carbono. Con referencia a la estructura I anteriormente mencionada, esto significa que el valor de z' típicamente tiene un intervalo de 2 a aproximadamente 21 , o más típicamente de aproximadamente 3 a 12. Más explícitamente, el valor de z' es más típicamente uno de los siguientes: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, o mayor. Los más preferidos son los valores z' en el intervalo de 2 a aproximadamente 8. Un alcanal polimérico particularmente preferido de la invención es uno en donde z' es 3. Con referencia a estructura I anteriormente mencionada, se prefieren particularmente ciertos tipos de alcanales. Dichos compuestos incluyen alcanales como se describió anteriormente que tienen al menos un radical orgánico ubicado en al menos un "C" en la cadena de carbono. El radical orgánico puede ser cualesquiera de los radicales orgánicos anteriormente mencionados, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, con el alquilo siendo preferido. Típicamente, el grupo alquilo es alquilo inferior de cadena recta o alquilo inferior ramificado tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, pentilo, etc., con la cadena recta siendo generalmente preferida. Un sustituyente de alquilo particularmente preferido es metilo. Aunque la porción alcanal del polímero puede poseer más de un radical orgánico ubicado en uno o más "C"s en la cadena de carbono, un tipo de alcanal preferido es uno en el cual solamente un "C" en la cadena de carbono está sustituido con un radical orgánico y todos los otros R1 y R2 son H. Por ejemplo, sin importar la longitud de la cadena alquileno, se prefieren los alcanales en donde todas las variables R1 y R2 son H, con la excepción de que: (i) uno de R1 o R2 que está ubicado en C-2 es alquilo, or (ii) uno de R o R2 que está ubicado en C-3 es alquilo; o (iii) uno de R1 o R2 que está ubicado en C-4 es alquilo; o (iv) uno de R1 o R2 que está ubicado en C-5 es alquilo, y así consecutivamente. Un tipo particularmente preferido de sustituyente a este respecto es alquilo inferior tales como metilo, etilo, o propilo. La síntesis de un alcanal 2-metilo sustituido ilustrativo de la invención, mPEG-2- metilbutiraldehído, se describe en el ejemplo 17. Enfocándose actualmente en la porción alcanal del polímero, se muestran a continuación ciertos alcanales preferidos.

R1 R1 R1 o I I I II POLY— X1— C4— -C3 Cz~ — C. — H I I I R2 R2 R2 Estructura l-A.

La estructura l-A es una en donde el valor de z' a partir de la estructura I es 3. Esta estructura, sin importar si cualesquiera uno o más de C2, C3, o C4 está sustituido con un alquilo o con otro radical orgánico como se describió anteriormente, se refiere en la presente invención como un "butiraldehído" o como un "butanal". Los butiraldehídos poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos en donde la porción alcanal del polímero es 2-metilbutiraldehído, 3-metilbutiraldehído, o 4-metilbutiraldehído, 2-etilbutiraldehído, 3-etilbutiraldehído, o 4-etilbutiraldehído.

R1 R1 R1 n1 o I I I I II POLV — * — |r- < — c¾ — c¡ — c,-H RA R2 n1 R? Estructura l-B La estructura l-B es una en donde el valor de z' a partir de la estructura I es 4. Esta estructura, sin importar si cualesquiera uno o más de C2, C3, C4 o C5 está sustituido con un alquilo o con otro radical orgánico como se describió anteriormente, se refiere en la presente invención como "pentanal" o como un valeraldehído". Los pentanales poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos en donde la porción alcanal del polímero es 2-metilpentanal, 3-metilpentanal, 4-metilpentanal,o 5-metilpentanal. Los pentanales poliméricos adicionales incluyen aquellos en donde la porción alcanal del polímero es 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal, o 5-etilpentanal.

La estructura l-C es una en donde el valor de z' en la estructura I es 5. Esta estructura, sin importar si cualesquiera uno o más de C2, C3, C4, C5 o C6 está sustituido con un alquilo o con otro radical orgánico como se describió anteriormente, se refiere en la presente invención como un "hexanal". Los hexanales poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos en donde la porción alcanal del polímero es 2-metilhexanal, 3-metilhexanal, 4-metilhexanal, 5-metilhexanal, 6-metilhexanal, 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal, o 5-etilpentanal. Los componentes alcanales adicionales de un polímero que la invención incluyen heptanales, octanales, nonanales, y los similares.

La porción enlazadora Regresando ahora a la porción enlazadora, una porción enlazadora o simplemente "enlazador" de la invención se representa generalmente por la variable, X'. La porción enlazadora es la porción del polímero general que se une a la porción alcanal del polímero con el segmento polimérico (a ser descrita con mayor detalle a continuación). Un enlazador de la invención puede ser un átomo particular, tal como un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, dos átomos, o numerosos átomos. Un enlazador típicamente pero no necesariamente es lineal en naturaleza. La longitud general del enlazador típicamente tendrá un intervalo de entre 1 a aproximadamente 40 átomos, en donde por longitud se entiende el número de átomos en una cadena sencilla, sin contar los sustituyentes. Por ejemplo, -CH2- se considera como un átomo con respecto a la longitud total del enlazador, -CH2CH20- se considera como 3 átomos en longitud. Preferiblemente, un enlazador tendrá una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos. Un enlazador de la invención puede ser un grupo funcional particular tal como una amida, un éster, un uretano, o una urea, o puede contener metileno u otros grupos alquileno que flanquean ambos lados del grupo funcional particular. Alternativamente, un enlazador puede contener una combinación de grupos funcionales que pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. Adicionalmente, un enlazador de la invención puede ser una cadena alquileno, opcionalmente conteniendo uno o más átomos de oxígeno o de azufre (por ejemplo, un éter o tioéter). Los enlazadores preferidos son aquellos que son estables hidrolíticamente. Cuando se observa en el contexto de la estructura I, un enlazador es uno que cuando se considera como parte del polímero general, no produce una estructura general que contiene un enlace de peróxido (-0-0-) o un enlace -N-O- o -0-N-. Los enlazadores ilustrativos, X', son aquellos que corresponden a cualesquiera de las siguientes estructuras: -(CH2)e-De-(CH2)f- o - (CH2)p-Mf-C(0)-Ks-(CH2)q-. Con referencia a las estructuras enlazadoras anteriormente mencionadas, la variable "c" tiene un intervalo de cero a 8; "D" es O, NH, o S; la variable "e" es 0 ó 1 ; la variable "f ' tiene un intervalo de cero a 8; la variable "p" tiene un intervalo de cero a 8; "M" es -NH ú O; "K" es NH ú O; la variable "q" tiene un intervalo de cero a 8, y las variables "r" y "s" son cada una independientemente 0 ó 1. En el contexto de la estructura I, un enlazador de la invención, X', puede ser cualesquiera de los siguientes: -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, C(0)-NH, NH-C(0)-NH, 0-C(0)-NH, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -CH2-0-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)- NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-0-CH2-, -CH2-C(0)-0-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-0-CH2-, -C(0)-0-CH2-CH2-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(0)-CH2-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, grupo cicloalquilo bivalente, -N(R6)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, y combinaciones de dos o más de cualesquiera de los precedentes, en donde (h) es 0 a 6, (j) es 0 a 20, R6 es H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Otros enlazadores específicos tienen las estructuras: C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(0)-, o -NHC(0)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- o -OC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-, en donde los valores de los subíndices que siguen a cada metileno indica el número posible de metilenos contenidos en la estructura del enlazador, por ejemplo, (CH2)i-6 significa que el enlazador puede contener 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 metilenos. No obstante, para los propósitos de la presente descripción, una serie de átomos no se considera como una porción enlazadora cuando la serie de átomos es inmediatamente adyacente a un segmento polimérico, POLY, y la serie de átomos no es sino otro monómero de tal manera que la porción enlazadora propuesta podría representar una mera extensión de la cadena polimérica. Por ejemplo, dada la estructura parcial "POLY-X'-", en donde POLY en este caso se define como "CH30(CH2CH20)n-", la porción enlazadora podría no ser "-CH2CH20-" puesto que dicha definición meramente podría representar una extensión del polímero. Eso es decir, no obstante, que un enlazador de la invención no puede poseer una o más porciones -CH2-CH20-contiguas. Por ejemplo, un enlazador puede contener una o más subunidades (-CH2CH20-) flanqueadas en uno o en ambos lados por uno o una combinación de enlazadores ilustrativos como se proveyó anteriormente. Es decir, un enlazador como se describió anteriormente también puede incluir un oligómero tal como -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g-, en donde b y g independientemente tienen un intervalo de 1 a aproximadamente 20. Los solicitantes han encontrado que la inclusión de dichos oligómeros dentro del enlazador pueden llevar a la estabilidad de Iproducto final del alcanal polimérico al extender la distancia entre la funcionalidad aldehido y cualesquiera grupos reactivos contenidos dentro del enlazador. De esta manera, las interacciones intramoleculares se desfavorecen, llevando a rendimientos incrementados durante la preparación y estabilidad mejorada del producto alcanal polimérico. Preferiblemente, las variables b y g tienen un intervalo de aproximadamente 1 a 10, o en ciertos casos, tienen un intervalo entre aproximadamente 1 a 6. La síntesis de un alcanal polimérico ilustrativo que tiene cuatro unidades contiguas -(CH2CH2O)- en el enlazador se describe en el ejemplo 5. Los ejemplos adicionales de enlazadores específicos que contienen segmentos oligoméricos -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g- se muestran a continuación, en donde X' incluye o se define por los siguientes: -(CH2)c-Dc-(CH2)rP- o -(CH2)p-Mr-C(0)-Ks-(CH2)Q-T- En las estructuras ilustrativas anteriormente mencionadas, P y T son cada uno independientemente -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g, b y g son cada uno independientementel a 20, y las variables remanentes son como se definieron anteriormente. Los ejemplos de enlazadores preferidos de este tipo son -0-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -NH-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -0-C(0)-NH-(CH2CH2NH)g-, -C(0)-NH-(CH2CH2NH)g-, y -NH-C(0)-NH-(CH2CH2NH)g-. En ciertos casos, por ejemplo, cuando POLY representa un segmento polimérico lineal, entonces preferiblemente el número total de carbonilos presentes en el alcanal polimérico es 0 ó 2 o mayor, cuando el número total de carbonilos no incluye el carbonilo(s) del aldehido. No obstante, cuando el enlazador, X' incluye uno o más segmentos (-CH2CH20-) contiguos, entonces preferiblemente el número total de carbonilos presentes en el alcanal polimérico es 0, o 1 , o 2, o 3, o mayor. Refiriéndose de nuevo a la estructura I, en otra modalidad preferida de la invención, cuando X' es oxígeno o incluye al menos un segmento (-CH2CH20-), y z' tiene un intervalo de 2 a 12, entonces al menos un R o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o alternativamente, el polímero es heterobifuncional. En el caso en que el polímero sea heterobifuncional, el segmento polimérico, POLY, preferiblemente posee un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi. Preferiblemente, el enlazador es estable hidrolíticamente, y puede contener uno o más de los siguientes grupos funcionales: amida, uretano, éter, tioéter, o urea. No obstante, los enlaces hidrolíticamente degradables, tales como éster de carboxilato, éster de fosfato, ortoéster, anhídrido, imina, acetal, cetal, oligonucleótido, o péptido, también pueden estar presentes en un enlazador de la invención. Los heteroátomos enlazadores tales como O ó S, son particularmente preferidos, puesto que son enlazadores que contienen segmentos oligoméricos -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g como se describió anteriormente.

El segmento polimérico/polímeros para preparar un alcanal polimérico Como se muestra en las estructuras ilustrativas anteriormente mencionadas, un alcanal polimérico de la invención contiene un segmento polimérico soluble en agua. Los POLYs representativos incluyen poli(alquílenglicoles) tales como poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido a-hidroxi), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina). POLY puede ser un homopolímero, un copolímero intercalado, un copolímero al azar, un copolímero en bloque, un tripolímero intercalado, un tripolímero al azar, o un tripolímero en bloque de cualesquiera de los anteriores. El segmento polimérico soluble en agua preferiblemente es, aunque no necesariamente, un poli(etilenglicol) o "PEG" o un derivado del mismo. El segmento polimérico puede tener cualquier número de geometrías diferentes, por ejemplo, POLY puede ser lineal, ramificado, o bifurcado. Más típicamente, POLY es lineal o ramificado, por ejemplo, teniendo 2 brazos poliméricos. Aunque gran parte de la discusión en la presente invención se enfoca en el PEG como un POLY ilustrativo, la discusión y las estructuras presentadas en la presente invención se pueden extender fácilmente para que abarquen cualesquiera de los segmentos poliméricos solubles en agua anteriormente descritos. Cualquier polímero soluble en agua que tiene al menos un extremo reactivo se puede utilizar para preparar un alcanal polimérico de conformidad con la invención y la invención no se limita a este respecto. Aunque se pueden utilizar los polímeros solubles en agua que contienen solamente un extremo reactivo particular, se pueden utilizar los polímeros que contiene dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más extremos reactivos adecuados para la conversión a un alcanal polimérico como se establece en la presente invención. De manera ventajosa, conforme el número de porciones hidroxilo o de otras porciones reactivas del segmento polimérico soluble en agua se incrementa, se incrementa el número de sitios disponibles para introducir un grupo alcanal. Los ejemplos no limitantes del límite superior del número de porciones hidroxilo y/o porciones reactivas asociadas con el segmento polimérico soluble en agua incluyen 500, 100, 80, 40, 20, y 10. Regresando ahora a los POLY preferidos, PEG, el "PEG" incluye poli(etilenglicol) en cualesquiera de sus formas lineales, ramificadas o con múltiples brazos, incluyendo PEG modificado en el extremo, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG colgante, y PEG que contiene uno o más enlazadores degradables que separan las subunidades monoméricas, que se describirán más completamente a continuación. Para preparar un alcanal polimérico de la invención, una materia prima de PEG comúnmente utilizada es PEG libre, un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: HO-CH2CH20-(CH2CH20)m-CH2CH2-OH. El polímero anterior, alfa-, omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), se puede representar en forma breve como HO-PEG-OH, y también se refiere en la presente invención como PEG-diol, en donde "-PEG-" en "HO-PEG-OH" corresponde a: -CH2CH20-(CH2CH20)n-i-CH2CH2- y (n) típicamente tiene un intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4,000, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 3,000, o más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 1 ,000. Con referencia a la estructura I, POLY puede ser por ejemplo, un PEG hidroxi terminado tal como HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-i-CH2CH2- Otro tipo de PEG útil para la preparación de alcanales poliméricos de la invención es PEG modificado en su extremo, en donde la PEG está modificado terminalmente con un grupo inerte para modificación del extremo. Los PEGs para modificación del extremo preferidos son aquellos que tienen una porción para modificación del extremo de un grupo tal como alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxí, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido. Los grupos para modificación terminal preferidos son aquellos tales como metoxi, etoxi, y benciloxi. Con referencia ahora a las estructuras I y l-A hasta l-C, POLY, en ciertas modalidades, ya sea que es o comprende a poli(etilenglicol) que corresponde a la estructura: "Z-(CH2CH20)n" o "Z-(CH2CH20)CH2CH2-", en donde n tiene un intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z es o incluye un grupo funcional tales como hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, ¡odoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina, y fluoresceína. De nuevo, las estructuras POLY mostradas inmediatamente anteriormente pueden representar segmentos poliméricos lineales, o pueden formar parte de un segmento polimérico ramificado o bifurcado. En un caso en donde el segmento polimérico está ramificado, las estructuras POLY inmediatamente anteriores pueden corresponder, por ejemplo, a los brazos poliméricos que forman parte de la estructura POLY general. Alternativamente, en un caso en donde POLY posee una estructura bifurcada, la estructura POLY anteriormente mencionada puede corresponder, por ejemplo, a la porción lineal del segmento polimérico antes del punto de ramificación. POLY también puede corresponder a una molécula de PEG ramificado que tiene 2 brazos, 3 brazos, 4 brazos, 5 brazos, 6 brazos, 7 brazos, 8 brazos o más. Los polímeros ramificados utilizados para preparar los alcanales poliméricos de la invención pueden poseer cualesquiera de 2 a 300 o más extremos reactivos. Se prefieren los segmentos poliméricos ramificados que tiene 2 o 3 brazos poliméricos. Un POLY ramificado ilustrativo, como se describió en la Patente de E.U.A. No. 5,932,462, corresponde a la estructura: PEG — p I R1- C — I PEG — Q En esta representación, R" es una porción no reactiva, tales como H, metilo o un PEG, y P y Q son enlaces no reactivos. En una modalidad preferida, el segmento polimérico PEG ramificado es metoxi poli(etilenglicol) disustituido con lisina. En la configuración ramificada particular anteriormente mencionada, el segmento polimérico ramificado posee un sitio de reacción particular que se extiende a partir del punto de ramificación "C" para el posicionamiento del grupo alcanal reactivo vía un enlazador. Los PEGs ramificados tales como estos para uso en la presente invención típicamente tendrán menos de 4 brazos PEG, y más preferiblemente, tendrán 2 o 3 brazos PEG. Dichos PEGs ramificados ofrecen la ventaja de tener un sitio de reacción particular, acoplado con una nube polímerica más larga, más densa que sus contrapartes PEG lineales. Un tipo particular de PEG alcanal ramificado corresponde a la estructura: (MeO-PEG-)iG-X'-alcanal, en donde i es igual a 2 ó 3, y G es una lisina u otro residuo de aminoácido adecuado. Un alcanal polimérico ramificado ilustrativo de la invención tiene la estructura que se muestra a continuación: En este caso, el enlazador corresponde a C(0)-NH, opcionalmente que contiene un segmento oligomérico -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g- ubicado entre el nitrógeno de la amida y la porción alcanal del polímero como se muestra en la estructura V-B a continuación. Los segmentos oligoméricos ejemplares poseerán valores b o g que tienen un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 30. Preferiblemente b o g poseen valores de alrededor de 20 o menos. Preferiblemente, b o g tendrán uno de los siguientes valores: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mayor. En una modalidad particularmente preferida, b o g tiene un intervalo de 2 a 6, y mPEGa y mPEGb son los mismos o son diferentes.

Ciertas modalidades se prefieren para los alcanales poliméricos que tienen una estructura ramificada. Por ejemplo, en una modalidad particular, por ejemplo cuando POLY en la estructura I está ramificado, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente. En una modalidad alternativa preferida, por ejemplo, cuando POLY en la estructura I está ramificado, entonces X' incluye - (CH2CH2O)b- en donde b es de 1 a aproximadamente 20, en el caso en donde POLY comprende un residuo lisina. En ocasiones cuando POLY tiene 2 brazos poliméricos, se prefiere que ningún brazo polimérico comprenda oxígeno como el único heteroátomo en el caso en donde POLY comprende "C-H" como un punto de ramificación. Los PEGs ramificados para uso en la preparación de un aicanal polimérico de la invención adicionalmente incluyen aquellos representados más generalmente por la fórmula G(PEG)n, en donde G es una molécula central o núcleo a partir de la cual se extienden 2 o más brazos PEG. La variable n representa el número de brazos PEG, en donde cada uno de los brazos poliméricos puede estar independientemente modificado en su extremo o alternativamente, posee un grupo reactivo funcional en su extremo, tales como un alcanal u otro grupo reactivo funcional. Los PEGs ramificados tales como aquellos representados generalmente por la fórmula, G(PEG)n, anteriormente mencionada poseen de 2 brazos poliméricos a aproximadamente 300 brazos poliméricos (por ejemplo, n tiene un intervalo de 2 a aproximadamente 300). Los PEGs ramificados tales como éstos preferiblemente poseen de 2 a aproximadamente 25 brazos poliméricos, más preferiblemente de 2 a aproximadamente 20 brazos poliméricos, e incluso más preferiblemente de 2 a aproximadamente 15 brazos poliméricos o menos. Los más preferidos son los polímeros con múltiples brazos que tienen 3, 4, 5, 6, 7 ú 8 brazos. Las moléculas núcleo preferidas en los PEGs ramificados como se describió anteriormente son polioles. Dichos polioles incluyen polioles alifáticos que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 10 grupos hidroxilo, incluyendo etilenglicol, alean dioles, alquil glicoles, alquiliden alquil dioles, alquil cicloalcan dioles, 1 ,5-decalindiol, 4,8-bis(hidroximetil)triciclodecano, cicloalquiliden dioles, dihidroxialcanos, trihidroxialcanos, y los similares. Los polioles cicloalifáticos también se pueden emplear, incluyendo azúcares de cadena recta o azúcares con anillo cerrado y azúcar alcoholes, tales como manitol, sorbitol, inositol, xilitol, quebraquitol, treitol, arabitol, eritritol, adonitol, dulcitol, facosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ramnosa, galactosa, glucosa, fructosa, sorbosa, mañosa, piranosa, altrosa, talosa, tagitosa, piranosidos, sacarosa, lactosa, maltosa, y los similares. Los polioles alifáticos adicionales incluyen derivados de gliceraldehido, glucosa, ribosa, mañosa, galactosa, y estereoisómeros relacionados. Otros polioles núcleo que se pueden utilizar incluyen éter corona, ciclodextrinas, dextrinas y otros carbohidratos tales como almidones y amilosa. Los polioles preferidos incluyen glicerol, pentaeritritol, sorbitol, y trimetilolpropano. Los PEGs con múltiples brazos para uso en la preparación de un alcanal polimérico de la invención incluyen PEGs con múltiples brazos disponibles a partir de Nektar, Huntsville, Alabama. En una modalidad preferida, un alcanal polimérico con múltiples brazos de la invención corresponde a los siguientes, en donde se proveen los elementos específicos de la porción alcanal de la molécula en otro lugar en la presente invención. n = 0 a 4 Estructura Xlll-A.

Alternativamente, el alcanal polimérico puede poseer una estructura general bifurcada. Un ejemplo de un PEG bifurcado corresponde a la estructura: PEG-Y-CH-(X'-[C(R )(R2)]z-CHO)2, en donde PEG es cualesquiera de las formas de PEG descritas en la presente invención, Y es un grupo enlazador, preferiblemente un enlace hidrolíticamente estable, y las otras variables que corresponden al enlazador y a la porción alcanal son como se definieron anteriormente. Los derivados PEG alcanales bifurcado adicionales ilustrativos corresponden a los siguientes: PEG-Q-CH-[(CH2)m-Xo.rC(0)-Y-V-alcanal]2 Estructura Xlll-B. En donde PEG es cualesquiera de las formas de PEG descritas en la presente invención. Q es un enlace hidrolíticamente estable, tales como oxígeno, azufre, o -C(0)-NH-; m tiene un intervalo de 1 a 10, (es decir, m puede ser igual a 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10) pero preferiblemente m es 1 , 2, 3, ó 4; X es un átomo opcional, y cuando está presente, es O ó N; Y es NH ú O; y V es un segmento oligomérico opcional tal como -(CH2CH20)b- o (CH2CH2NH)g- como se describió previamente. Un PEG ramificado ejemplar que corresponde a "PEG" en la fórmula anteriormente mencionada es mPEG disustituido con lisina, en donde "PEG" corresponde a: mPEG," mPEG), Alternativamente, el segmento polimérico PEG para uso en la preparación de un alcanal polimérico de la invención puede ser una molécula PEG que tiene grupos reactivos colgantes a lo largo de la longitud de la cadena PEG más que en el extremo(s), para producir un alcanal polimérico que tiene uno o más grupos alcanal colgantes unidos a la cadena PEG mediante un enlazador, X'. Además, el segmento polimérico puede poseer uno o más enlaces débiles o degradables, tales como enlaces éster que se someten a hidrólisis. Otros enlaces hidrolíticamente degradable que pueden estar contenidos en el POLY incluyen carbonato, ¡mina, éster de fosfato, e hidrazona. Generalmente, la masa molecular promedio nominal del segmento polimérico soluble en agua, POLY variará. La masa molecular promedio nominal del POLY típicamente cae en uno o más de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 daltones a aproximadamente 100,000 daltones; de aproximadamente 500 daltones a aproximadamente 80,000 daltones; de aproximadamente 1 ,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones; de aproximadamente 2,000 daltones a aproximadamente 25,000 daltones; de aproximadamente 5,000 daltones a aproximadamente 20,000 daltones. Las masas moleculares promedio nominales ejemplares para el segmento polimérico POLY soluble en agua incluyen aproximadamente 1 ,000 daltones, aproximadamente 5,000 daltones, aproximadamente 10,000 daltones, aproximadamente 15,000 daltones, aproximadamente 20,000 daltones, aproximadamente 25,000 daltones, aproximadamente 30,000 daltones, y aproximadamente 40,000 daltones. Los POLYs de bajo peso molecular poseen masas moleculares de aproximadamente 250, 500, 750, 1000, 2000, o 5000 daltones.

Alcanales poliméricos representativos Siguiendo la descripción general anteriormente mencionada, las siguientes son estructuras ilustrativas que demuestran los alcanales poliméricos preferidos de conformidad con la invención. Por ejemplo, el alcanal polimérico de la invención, cuando es lineal, puede poseer una estructura homobifuncional o heterobifuncional de conformidad con la estructura II a continuación. Una estructura homobifuncional de conformidad con la estructura a continuación es una en donde ambos extremos son los mismos.

Estructura II. Los valores preferidos para X' y -CR1R2- son como se establecieron anteriormente. Las estructuras particularmente preferidas de conformidad con la estructura II son aquellas en las cuales POLY es poli(etilenglicol), y X' es -0-C(0)-NH-, -C (O)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -O-C(O)-NH-(CH2CH20)b-, -C(0)-NH-(CH2CH20)b-, o -NH-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, y z' tiene un intervalo de 2 a aproximadamente 12, y más preferiblemente es 2, 3, 4, 5, ó 6. Más específicamente, los alcanales poliméricos representativos de la invención incluyen los siguientes: -(CH2)a— Estructura lll-A Estructura IV-A O II PEQ-íCH^.- HN-C-NH -ICHzCHjO)», — -C— H Estructura lll-C PEG— (CH,)a-HN— C-NH -<CH2CH2NH), - fC— H Estructura IV- C, Cuando en la presente invención PEG es poli(etilenglicol), b y g son cada uno independientemente 0 a 20, a es 0 a 6, y las variables remanentes son como se definieron previamente. Se prefieren las estructuras en las cuales b y g tienen un intervalo de 1 a 8 o alternativamente tienen un intervalo de 1 a aproximadamente 6. Aunque z' tiene un intervalo de 1 a aproximadamente 21 , se prefieren las estructuras en las cuales z' tiene un intervalo de 2 a 6, por ejemplo, es 3 ó 4.

A continuación se proveen las representaciones estructurales de dos alcanales poliméricos en donde la variable "a" (como se muestra en las estructuras inmediatamente anteriores) es cero.

Estructura lll-B Estructura IV- B.

Un butanal polimérico ilustrativo posee la estructura: Estructura lll-D.

Los PEGs particularmente preferidos que corresponden a la estructura lll-D anteriormente mencionada incluyen Z-(CH2CH20)n- o o II Z^CHsCHaO^-C— NH (CHj)4 O II Z-ÍCHzCHjOín-C— H — CH — Las estructuras ramificadas adicionales de conformidad con la invención son las siguientes, en donde b típicamente es 0 a 20, s típicamente es 0 a 6, y d es 1 , 2 ó 3, Estructura VI-A Estructura Vl-B En las estructuras VI-A y B anteriormente mencionadas, PEG puede ser lineal o ramificado. Preferiblemente, R1 y R2 en cada caso son H, y z' tiene un intervalo de 3 a 12, y es incluso más preferiblemente 3, 4, 5, ó 6. Como un ejemplo, un polímero de conformidad con la estructura Vl-B es uno en donde PEG corresponde a la estructura: o II H Z-íCWíCHzOJn-C-N-GH en donde Z es un grupo modificador del extremo o grupo funcional como se describió previamente. Otro alcanal polimérico ilustrativo de la invención posee la estructura que se muestra a continuación: Estructura XIV En la modalidad anteriormente mencionada, el alcanal polimérico también tiene una estructura bifurcada y es adecuado para la unión covalente a dos agentes biológicamente activos. La estructura anteriormente mencionada contiene, en las porciones que se extienden a partir del punto de ramificación -CH-, un enlazador que contiene segmentos oligoméricos -(CH2CH20)-, en donde el número de dichos segmentos en cada porción es 3. El número de dichos segmentos oligoméricos en la estructura anteriormente mencionada puede variar de conformidad con la descripción generalizada anteriormente provista. Las estructuras ejemplares adicionales de alcanal polimérico incluyen las siguientes, en donde las variables han sido definidas previamente: Estructura VII Estructura Vll-A Estructura VIII. Preferiblemente, cualesquiera de las estructuras anteriormente mencionadas se proveen como una composición que tiene una o más de las características únicas de la composición descritas con mayor detalle a continuación.

Características de las composiciones de alcanal polimérico formadas v métodos de preparación Los alcanales poliméricos de la invención poseen diversas ventajas sobre los aldehidos poliméricos previamente preparados. Primero, los alcanales poliméricos se preparan en rendimientos muy altos, en parte debido a la simplicidad del método sintético empleado, particularmente para los alcanales que tienen oxígeno como la porción enlazadora. Además, al examinar la estabilidad de los butanales de la invención, se descubrió que estos tipos de alcanales son más estables a pHs básicos que los derivados de aldehido poliméricos previamente conocidos (por ejemplo, propionaldehídos, acetaldehídos), y se forman sin cantidades significativas o incluso detectables de subproductos de reacción tipo retro-Michael. Por ejemplo, como se demostró en el ejemplo 3, bajo condiciones básicas, mPEG propionaldehído lleva a cabo una reacción tipo retro-Michael, produciendo mPEG-OH y el producto de eliminación, acroleína, en cantidades significativas (después de 24 horas a temperatura ambiente y pH 8, casi 40% del PEG-propionaldehído se ha descompuesto). En contraste, mPEG butiraldehido es significativamente más estable bajo condiciones básicas, demostrando esencialmente que no lleva a cabo descomposición de este tipo bajo las condiciones empleadas. Además, el derivado de butanal polimérico de la invención alcanza equilibrio en agua con su hidrato correspondiente a aproximadamente 50% de hidrato, mucho menor que el 70% de hidrato en equilibrio exhibido por el propionaldehído y el 100% de hidrato exhibido por el acetaldehído. La baja reactividad de los derivados poliméricos de la invención también se evidencia por la estabilidad marcadamente superior de los derivados de la invención bajo condiciones básicas (véase el ejemplo 3 a continuación). No se observó ningún subproducto de acroleína durante las reacciones de conjugación entre los derivados de aldehido de la invención y las proteínas u otras moléculas a pH básico. La baja reactividad de los derivados de aldehido de la invención sugiere que los derivados de la invención son más selectivos, significando que los derivados de la invención son capaces de reaccionar con mayor selectividad o especificidad con grupos amino específicos, particularmente grupos amino N-terminales, en proteínas o péptidos, en oposición a la reacción no selectiva o al azar con cualquier número de grupos amino en una molécula de proteína o péptido. En muchas aplicaciones, se prefiere la unión N-terminal selectiva de la estructura base del polímero para preservar mejor la conformación protéica y la actividad biológica. Además, los alcanales poliméricos de la invención se forman a partir de los precursores acetal correspondientes mediante hidrólisis bajo condiciones ácidas moderadas, por ejemplo, bajo condiciones ácidas mucho menos severas que las requeridas ya sea para PEG acetaldehído o para PEG propionaldehído. Si se desea, dichas condiciones moderadas permiten la conjugación directa in situ de los derivados poliméricos de la invención con proteínas, péptidos, u otros blancos moleculares sin requerir un paso de aislamiento intermedio. Además, Debido a los métodos sintéticos empleados, los alcanales poliméricos de la invención también se proveen con una alta pureza, frecuentemente las especies ausentes contienen yodo o pueden promover la descomposición del segmento polimérico. Debido a la ligereza del método sintético empleado, y además debido a la naturaleza estable de las estructuras provistas en la presente invención, los alcanales poliméricos de la invención se proveen adicionalmente como composiciones que están esencialmente ausentes de productos de reacción tipo retro-Michael. Así, las composiciones de alcanales poliméricos provistas en la presente invención son particularmente estables al almacenamiento, exhibiendo cantidades muy limitadas si es que hay alguna de descomposición polimérica. Como un ejemplo, basándose en los datos de estabilidad recolectados durante el tiempo, se encontró que los alcanales poliméricos de la invención exhiben menos de aproximadamente 10% de degradación del grupo aldehido polimérico cuando se almacenan a 40°C por 15 días. Este porcentaje de degradación se determinó mediante análisis de RMN. Adicionalmente, se proveen mPEG alcanales poliméricos lineales de la invención que están sustancialmente libres del PEG-dialcanal correspondiente (por ejemplo, una impureza de PEG homobifuncional que se genera a partir de la presencia de una cantidad de PEG-diol en el material sin purificar de mPEG-OH). Cambiando ahora más específicamente al método para elaborar un alcanal polimérico de la invención, un alcanal polimérico generalmente se prepara al hacer reaccionar un polímero soluble en agua que tiene al menos un grupo reactivo, Y, con un reactivo alcanal protegido que contiene un grupo reactivo, K, adecuado para desplazamiento mediante o alternativamente, reacción con Y, bajo condiciones efectivas para formar alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida. Generalmente, un reactivo alcanal protegido poseerá de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono. El alcanal polimérico en forma protegida soluble en agua así formado se hidroliza entonces típicamente, por ejemplo, bajo condiciones ácidas para formar el alcanal polimérico deseado soluble en agua. Típicamente, la reacción de acoplamiento (por ejemplo, el acoplamiento del polímero reactivo y el reactivo alcanal protegido) se lleva a cabo en un solvente orgánico tales como tolueno, cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo, acetona, dioxano, metanol, y etanol. Preferiblemente la reacción se lleva a cabo bajo una atmósfera inerte, a temperaturas que tienen un intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 150°C. La hidrólisis para formar el alcanal deseado típicamente se promueve por un ácido, y se lleva a cabo a los pHs a continuación 7.0, con pHs preferidos que tienen un intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6.5. La hidrólisis se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 3, 4, 5, ó 6, con pHs bajos de alrededor de 3 siendo preferidos. Los ejemplos detallados del método sintético esbozado anteriormente se proveen en los ejemplos 1 , 2, 5, y 17. Más típicamente, el acoplamiento del segmento polimérico del reactivo alcanal protegido procede vía una síntesis éter de Williamson. Más específicamente, el grupo reactivo Y del polímero es hidroxilo (el cual en la presencia de una base fuerte se convierte a su forma aniónica o alcoxi correspondiente), y el grupo reactivo K en el reactivo acetal alcanal protegido es un buen grupo residual, tales como un haliduro (Preferiblemente Cl- o Br-) o sulfato de metilo (un éstersulfonato), que se puede desplazar fácilmente por el anión oxígeno que está ubicado en el extremo del polímero. El enlace preferido resultante es un enlace éter (O-) que conecta al POLY con el alcanal. Después de la unión al POLY, el alcanal protegido se hidroliza a un pH ácido para formar el grupo aldehido o alcanal funcional correspondiente. Como se mencionó anteriormente, los acétales de alcanal tales como butanal acetal se hidrolizan bajo condiciones más moderadas que los propanal o etanal acétales correspondientes. Por ejemplo, cuando z' es 3 o mayor, un alcanal acetal de la invención puede ser hidrolizado a un pH de aproximadamente 3 ó 4 o superior, particularmente cuando R1 y R2 en todos los casos son H. Como se mencionó en los ejemplos 2 y 4, el grupo butanal acetal descrito en la presente invención se hidroliza en aproximadamente 3 horas a un pH de 3. La capacidad para formar este grupo alcanal funcional bajo condicones ácidas moderadas es ventajosa puesto que permite el uso ¡n situ del polímero aldehído-funcionalizado para conjugación a una proteína o a otra molécula biológicamente activa después de la neutralización de la solución que contiene el alcanal polimérico a un pH adecuado para conjugación (típicamente a pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10). En contrast, los propionaldehídos poliméricos lineales requieren aislamiento antes de la conjugación debido a la cantidad de base requerida para neutralizar el bajo pH de la solución y las cantidades correspondientemente superiores de sales generadas durante dicho paso de neutralización. En el método empleado, el reactivo alcanal protegido típicamente es un acetal tales como dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil)acetal, S,S'-dimetil acetal, y S,S'- dietil acetal. Alternativamente, el acetal puede ser un acetal cíclico o un tioacetal cíclico. Más específicamente, el alcanal protegido usualmente poseerá una estructura como sigue: Estructura XI- D.

En esta estructura, ?' es un entero a partir de 1 a aproximadamente 21. Como para los aldehidos poliméricos provistos anteriormente mencionados, R1 , cada vez que se presenta, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquiniio sustituido, arilo, y arilo sustituido; y R2, cada vez que se presenta, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido. Wa y Wb son cada uno independientemente O o S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de metilo, etilo, isopropilo, bencilo, 1 ,1 ,1 -tricloroetilo, y nitrobencilo, o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o - (CH2)3-, formando un anillo de 5 ó 6 miembros cuando se consideran junto con Wa, Ci, y Wb. Preferiblemente, K es uno de los siguientes grupos reactivos: Cl, Br, En este método, el alcanal polimérico en forma protegida típicamente se forma en un rendimiento mayor de aproximadamente 85%, e incluso más preferiblemente en un rendimiento mayor de aproximadamente 90 a 95%. Después de la hidrólisis para obtener el polímero aldehído-funcionalizado deseado, el producto se puede aislar si se desea mediante neutralización de la mezcla de reacción, por ejemplo, elevando el pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.5, seguido por la extracción del alcanal polimérico en un solvente orgánico, y removiendo el solvente, por ejemplo, mediante evaporación rotatoria, liofilización, o destilación. Debido a la simplicidad de este método que no utiliza ni métodos oxidativos directos ni especies que contienen yodo para proveer la función aldehido deseada, los productos así formados son altamente puros, demostrando una estabilidad de almacenamiento mejorada en comparación con otros aldehidos poliméricos conocidos, y poseen bajos valores de polidispersión (de menos de aproximadamente 1.5, preferiblemente de menos de aproximadamente 1.2, y típicamente polidispersiones de menos de aproximadamente 1.1 , 1.08, 1.05, 1.04, y 1.3). Por lo tanto se han preparado polímeros que tiene polidispersiones tan bajas como 1.03, 1.02 y 1.01. Un alcanal polimérico aislado de la invención preferiblemente tendrá una pureza de al menos aproximadamente 95%, basándose en los contaminantes poliméricos. Los ejemplos 1 y 2 ilustran la formación de alcanales mPEG poliméricos. En los casos en donde la materia prima polimérica es PEG-diol, uno de los grupos PEG hidroxilo generalmente es protegido antes de la reacción con el reactivo alcanal protegido, seguido por la desprotección subsecuente al acoplamiento. Todos los alcanal poliméricos protegidos ilustrativos así formados se muestran por la estructura Xl-E a continuación.

Estructura Xl-E.

Luego el extremo hidroxi del PEG se puede convertir, si se desea, a un grupo funcional para proveer ya sea un alcanal homobifuncional o heterobifuncional protegido. Los grupos funcionales adecuados incluyen amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxilico, isocianato, hidrazida, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, ¡odoacetamida, y silano. Se prefieren los grupos funcionales tales como N-hidroxisuccinimidil éster, benzotriazolil carbonato, amina, vinilsulfona, y maleimida, N-succinimidil carbonato, hidrazida, succinimidil propionato, succlnimidil butanoato, succinimidil succinato, succinimidil éster, glicidil éter, oxicarbonilimidazol, p-nitrofenil carbonato, aldehido, ortopiridil-disulfuro, y acrilol. Otros reactivos alcanales representativos se describen por las estructuras: WR3 -(CH2CHsNr% C C¡— Wh 4 H Estructura Xl-F K-iCHaCHzO), En incluso otro método, un alcanal polimérico de la invención se prepara ventajosamente a partir de POLY-Y purificado mediante cromatografía. De esta manera, las impurezas poliméricas, si están presentes, y en particular las impurezas difuncionales generadas a partir de PEG-diol, se remueven para permitir la formación de un producto alcanal polimérico extremadamente puro como se describió previamente. Este método se ejemplifica en el ejemplo 5. Un resumen del método sintético general empleado, sus ventajas, su aplicabilidad a los métodos generales descritos en la presente invención, así como los detalles específicos de las reacciones llevadas a cabo se proveen en el ejemplo 5. Aunque se puede utilizar cualquier método de separación cromatográfica, es particularmente preferida la cromatografía de intercambio iónico, en donde el Y en POLY-Y es un grupo ionizable o es un derivado de un grupo ionizable tales como un ácido carboxilico, éster activo, amina o los similares. Los acétales de alcanal polimérico ilustrativos de la invención pueden poseer cualesquiera de las siguientes estructuras, en donde las variables se han descrito previamente: Estructura IX.

Estructura IX-A. En incluso otro método para preparar un alcanal polimérico de la invención, se puede preparar un alcanal polimérico al construir el segmento polimérico, POLY, directamente sobre un precursor acetal, por ejemplo, mediante polimerización directa. Más específicamente, en este método, se provee inicialmente un precursor acetal que tiene al menos un sitio aniónico activo adecuado para el inicio de la polimerización. Posteriormente el sitio aniónico del precursor acetal se pone en contacto con un monómero reactivo capaz de llevar a cabo polimerización, para iniciar así la polimerización del monómero reactivo en el acetal precursor. Como un resultado del paso de contacto, los monómeros reactivos adicionales se añaden al precursor acetal para formar una cadena polimérica. Se permite que el contacto continué hasta que se alcanza una longitud deseada de la cadena polimérica, seguido por la terminación de la reacción al lograr un precursor aldehido polimérico de la invención. precursor de aldehido polimérico resultante se puede hidrolizar adicionalmente al alcanal correspondiente como se estableció anteriormente, si se desea. Más preferiblemente, el monómero reactivo es óxido de etileno y el sitio amónico reactivo contenido dentro del precursor acetal es un anión alcóxido (O-), preferiblemente acompañado por un metal alcalino u otro contraión adecuado. El grupo alcóxido terminal presente en el precursor acetal es activo para polimerización por abertura del anillo aniónico del óxido de etileno para formar un alcanal polimérico de la invención. Más particularmente, el precursor acetal generalmente poseerá una estructura que corresponde a: en donde las variables poseen los valores anteriormente descritos, con la excepción de que X' termina en un anión oxígeno, u O- (por ejemplo, en su forma neutra, X' típicamente termina en un grupo hidroxilo u -OH, que en la presencia de una base fuerte, se convierte a la sal de alcóxido correspondiente). Los contraiones adecuados incluyen Na\ K+, Li+, y Cs+. El paso de terminación generalmente comprende neutralizar la reacción, por ejemplo, mediante la adición de ácido. Opcionalmente, el segmento polimérico puede estar modificado en su extremo mediante la adición de un reactivo para alquilatación u otros reactivos adecuados para proveer un extremo terminal no reactivo. En una modalidad particular del método anteriormente mencionado, POLY-Y corresponde a la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z se selecciona a partir del grupo que consiste de -OCH3, -OCH2CH3, y -OCH2(C6H5). En una modalidad adicional, POLY-Y corresponde a la estructura Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O"M+, en donde POLY-Y se prepara mediante polimerización por abertura del anillo aniónico del óxido de etileno hacia una sal de alcoholato modificada en su extremo tales como Z-CH2CH2O"M+, preparada mediante metalización del grupo -OH terminal de Z-CH2CH2OH con una base fuerte. M+ representa un contraion metálico tales como Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+. POLY-Y así preparado es adecuado posteriormente para reacción con un reactivo alcanal protegido como se describió anteriormente. Un esquema generalizado que ilustra este método se provee en la presente invención como la figura 1 , y las condiciones para llevar a cabo dicha reacción o serie de reacciones se proveen en el ejemplo 15.

Almacenamiento de reactivos alcanal poliméricos Preferiblemente, los alcanales poliméricos de la invención se almacenan bajo una atmósfera inerte, tales como bajo argón o bajo nitrógeno, puesto que la funcionalidad aldehido puede reaccionar con oxígeno atmosférico para producir el ácido carboxílico correspondiente. Debido al potencial para reacción de la porción aldehido de la molécula con agua (por ejemplo, mediante la exposición a la humedad para formar el hidrato correspondiente), también es preferible minimizar la exposición de los alcanales poliméricos de la invención a la humedad. Así, las condiciones preferidas de almacenamiento son bajo argón seco u otro gas inerte seco a temperaturas por debajo de aproximadamente -15°C. El almacenamiento bajo condiciones de baja temperatura reduce la velocidad de hidrólisis del aldehido polimérico hacia la forma hidrato correspondiente. Adicionalmente, en los casos en donde el segmento polimérico del alcanal polimérico es PEG, la porción PEG del alcanal puede reaccionar lentamente con oxígeno para formar peróxidos junto con la PEG de la molécula. La formación de los peróxidos puede llevar finalmente a la escisión de la cadena, incrementando así la polidispersión del reactivo PEG alcanal. En vista de lo anteriormente mencionado, se prefiere adicionalmente almacenar los alcanales PEG de la invención en la oscuridad.

Conjugados biológicamente activos Química de acoplamiento Conjugación a las proteínas al azar y selectiva a las proteínas N-terminales Los alcanales poliméricos anteriormente descritos son útiles para la conjugación a agentes o superficies biológicamente activas que contienen al menos un grupo amino disponible para reacción. Típicamente, un PEG aldehido de la invención se acopla a un grupo amino mediante aminación reductora, resultante en la formación de un enlace amina secundaria entre el segmento polimérico y agente de superficie o agente biológicamente activo.

Para la conjugación de un alcanal polimérico de la invención con un agente o superficie biológicamente activa que contiene el amino, el alcanal polimérico se hace reaccionar con la molécula blanco que contiene amino en un solvente adecuado para formar el intermediario asociado a ¡mina correspondiente, el cual se reduce entonces para formar un enlace de amina secundaria entre el polímero y el agente o superficie biológicamente activa. La reducción de la imina hacia la amina correspondiente se logra mediante la adición de un agente reductor. Los agentes reductores ejemplares incluyen cianoborohiduro de sodio, borohidruro de sodio, hidruro de litio aluminio, y los similares. Generalmente, los aldehidos poliméricos de la invención pueden ser utilizados para dirigir selectivamente la modificación del N-terminal bajo condiciones que diferencian la reactividad de la amina alfa en el aminoácido N-terminal. Ciertos alcanales poliméricos de la invención parecen demostrar una mayor selectividad que los derivados aldehido previamente conocidos y, así, son más adecuados para aplicaciones en donde se desea la modificación selectiva de la proteína N-terminal. Las condiciones de reacción para preparar una proteína o péptido N-terminalmente modificado incluyen (i) disolver la proteína o péptido a ser modificado en un regulador de pH que no contiene amina (por ejemplo, a un intervalo de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.5, preferiblemente de aproximadamente 5 a 6.5, más preferiblemente a un pH de aproximadamente 5 a 5.5), (i¡) añadir a la solución de proteína o de péptido un alcanal polimérico de la invención, (iii) permitir que la proteína o el péptido y el alcanal polimérico reaccionen para formar el conjugado polimérico acoplado a ¡mina, seguido por (¡v) la adición de un agente reductor para formar el polímero conjugado acoplado a amina secundaria correspondiente. Las condiciones de reacción para unión al azar de un alcanal polimérico son esencialmente idénticas a aquellas anteriormente descritas, con la excepción de que el pH es de alguna manera superior (como se discute con mayor detalle a continuación). Para favorecer la modificación N-terminal, un pH de aproximadamente 5 a 5.5 se prefiere más puesto que se cree que facilita la modificación N-terminal selectiva debido a las diferencias en el valor de pKa del grupo amino de un aminoácido N-terminal y el grupo amino de lisinas. Generalmente hablando, las condiciones que favorecen la selectividad N-terminal incluyen pHs por debajo de 7, y típicamente no menores de aproximadamente 4. El pH más favorable para promover la selectividad N-terminal se puede determinar por un experto en la técnica, y dependerá de la proteína particular a ser modificada. Los reguladores de pH adecuados para llevar a cabo la conjugación incluyen fosfato de sodio, acetato de sodio, carbonato de sodio, y solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Típicamente, el alcanal polimérico se añade a la solución que contiene proteína a una cantidad equimolar o a un exceso molar con relación a la proteína blanco. El alcanal polimérico se añade a la proteína blanco a una relación molar de aproximadamente 1 :1 (alcanal polimérico: proteína), 1.5:1 , 2:1 , 3:1 , 4:1 , 5:1 , 6:1, 8:1, ó 10:1. Los excesos molares de PEG-alcanal con relación a la proteína blanco típicamente están en el intervalo de aproximadamente 2 a 5. La reacción de aminación reductora típicamente se lleva a cabo a temperaturas por debajo de aproximadamente temperatura ambiente (25°C), aunque las temperaturas pueden tener un intervalo de aproximadamente -15°C a aproximadamente 100°C, más preferiblemente de aproximadamente 4°C a 37°C, por aproximadamente una a veinticuatro horas. El agente reductor también se añade típicamente en exceso, es decir, en cantidades que tienen un intervalo de aproximadamente 2-veces a un exceso molar de 30-veces con relación al conjugado polímero-proteína. Se prefiere añadir el agente reductor en un exceso molar de 10-veces a 20-veces con relación al conjugado polímero-proteína. El tiempo exacto de reacción se determina al monitorear el progreso de la reacción durante el tiempo. Típicamente el progreso de la reacción se monitorea al retirar alícuotas a partir de la mezcla de reacción a diversos puntos de tiempo y analizando la mezcla de reacción mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF o cualesquiera de otros métodos analíticos adecuados. Los conjugados polietilenglicosilados resultantes se caracterizan adicionalmente utilizando métodos analíticos tales como MALDI, electroforesis capilar, electroforesis en gel, y/o cromatografía. Más específicamente, para acoplar un derivado de aldehido polimérico a una proteína o péptido, se pueden emplear numeroso métodos diferentes. Un método (por ejemplo, un método de polietilenglicosilación al azar) es unir covalentemente PEG a cualquier número de residuos de lisina que están accesibles en la superficie. Para llevar a cabo dicha reacción, típicamente una proteína o péptido (tales como aquellas biomoléculas ejemplares provistas a continuación) se hacen reaccionar con un alcanal polimérico de la invención en un regulador de pH que contiene no amina a pHs moderados que generalmente tienen un intervalo de aproximadamente 5 a 8. (se prefieren los reguladores de pH que no contienen amina puesto que los grupos amino en el regulador de pH pueden competir con los grupos amino de las proteínas para el acoplamiento al alcanal polimérico). Se selecciona una no-amina adecuada que contiene regulador de pH que tiene un pK apropiado para el intervalo de pH deseado para llevar a cabo la química de conjugación. La reacción de acoplamiento generalmente toma de minutos a varias horas (por ejemplo, de 5 minutos a 24 horas o más), y en promedio, el acoplamiento se alcanza entre aproximadamente 0.2 y 4 horas para formar el conjugado acoplado a imina. Luego a la mezcla de reacción se le añaden cualesquiera de numerosos agentes reductores adecuados como se describió anteriormente (por ejemplo, cianoborohiduro de sodio). Luego la mezcla resultante generalmente se deja reaccionar bajo condiciones de temperatura baja a temperatura ambiente, por ejemplo, 4°C a 37°C por aproximadamente una hora a 48 horas. Preferiblemente, la reacción de reducción se completa en menos de aproximadamente 24 horas. El acoplamiento al azar se favorece a los pHs alrededor de 7 a 7.5 o alrededor de este valor, mientras que el acoplamiento en el N-terminal se favorece a pHs bajos (por ejemplo, alrededor de 5.5 o alrededor de este valor). Para incrementar el grado de modificación, es decir, para promover un incremento en el número de PEGs que están covalentemente unidos en los sitios disponibles de la molécula blanco, se pueden incrementar cualesquiera una o más de las condiciones anteriormente descritas (por ejemplo, relación molar de alcanal polimérico a proteína o péptido, temperatura, tiempo de reacción, pH, etc. ), ya sea independientemente o simultáneamente. Sin importar el peso molecular del PEG alcanal empleado, la mezcla del producto resultante preferiblemente, pero no necesariamente, se purifica para separar los reactivos en exceso, proteína no polietilenglicosilada (o cualquier molécula blanco), conjugados multi-polietilenglicosílados, y PEG alcanal libre o que no reaccionó. La polietilenglicosilación al azar de proteínas ilustrativas se provee en los ejemplos 4 y 6. La polietilenglicosilación sitio selectiva de proteínas ilustrativas se describe en los ejemplos 7 a 13.

Caracterización/separación opcional de elementos que contienen PEG Opcionalmente, los conjugados producidos mediante la reacción de un PEG aldehido de la invención con un agente biológicamente activo se purifican para obtener/aislar diferentes especies polietilenglicosiladas. Alternativamente, y más preferiblemente para PEGs con peso molecular más bajo, por ejemplo, que tienen pesos moleculares de menos de aproximadamente 20 kilodaltones, preferiblemente menos de o igual a aproximadamente 10 kilodaltones, la mezcla del producto se puede purificar para obtener una distribución alrededor de un cierto número de PEGs por molécula de proteína. Por ejemplo, la mezcla del producto se puede purificar para obtener un promedio de uno a cinco PEGs por proteína, típicamente un promedio de aproximadamente 3 PEGs por proteína. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de numerosos factores -el peso molecular del polímero empleado, la proteína particular, el régimen de dosis deseado, y la actividad residual y las propiedades in vivo de las especies del conjugado(s) individual. Si se desea, los conjugados de PEG que tiene diferentes pesos moleculares se pueden aislar utilizando cromatografía por filtración en gel. Es decir, la cromatografía por filtración en gel se utiliza para fraccionar diferentes elementos que contienen PEG (1 -elemento, 2-elementos, 3-elementos, etc. ) con base en sus pesos moleculares diferentes (en donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de las cadenas de PEG). Por ejemplo, en una reacción ejemplar en donde una proteína de 100 kDa se conjuga al azar con un PEG alcanal que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, la mezcla de reacción resultante probablemente contendrá proteína no modificada (PM 100 kDa), proteína mono-polietilenglicosilada (PM 120 kDa), proteína di-polietilenglicosilada (PM 140 kDa), etc. Aunque este método puede ser utilizado para separar PEG conjugados que tiene diferentes pesos moleculares, es método generalmente no es efectivo para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de polietilenglicosilación dentro de la proteína. Por ejemplo, la cromatografía por filtración en gel puede ser utilizada para separar de entre sí otras mezclas de PEG con 1 -elemento, 2-elemento, 3-elementos, etc., aunque cada una de las composiciones recuperadas de elementos que contienen PEG pueden contener PEGs unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro de la proteína. Las columnas para filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex y Sephadex disponibles a partir de Amersham Biosciences. La selección de una columna particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. Generalmente la elución se lleva a cabo utilizando un regulador de pH basado en no amina, tales como fosfato, acetato, o los similares. Las fracciones recolectadas se pueden analizar mediante numerosos métodos diferentes, por ejemplo, (i) DO a 280 nm para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteína mediante BSA, (iii) prueba de yodo para contenido de PEG (Sims G. E. C, et al., Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980), o alternativamente, (iv) mediante corrimiento de un gel de SDS PAGE, seguido por tinción con yoduro de bario. La separación de isómeros posicionales se lleva a cabo mediante cromatografía en fase reversa utilizando una columna FR-CLAR C18 (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico de Sepharose disponible a partir de Amersham Biosciences. Cualquier método se puede utilizar para separar isómeros biomoleculares de PEG que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales).

Almacenamiento Dependiendo del uso pretendido para los conjugados de PEG resultantes, después de la conjugación, y opcionalmente de los pasos de separación adicionales, la mezcla del conjugado se puede concentrar, filtrar para esterilizar, y almacenar a bajas temperaturas de aproximadamente -20°C a aproximadamente -80°C. Alternativamente, el conjugado se puede liofilizar, ya sea con o sin regulador de pH residual y se puede almacenar como un polvo liofilizado. En ciertos casos, es preferible intercambiar un regulador de pH utilizado para conjugación, tales como acetato de sodio, para un regulador de pH volátil tales como carbonato de amonio o acetato de amonio, que se puede remover fácilmente durante la liofilización, de manera que la formulación en polvo del conjugado de proteína liofilizada carece de residuos utilizando un regulador de pH. Alternativamente, se puede utilizar un paso de intercambio de regulador de pH utilizando una formulación de regulador de pH, de manera que el conjugado liofilizado está en una forma adecuada para reconstitución dentro de un regulador de pH par formulación y finalmente para la administración a un mamífero.

Conjugación de molécula pequeña Se llevó a cabo la conjugación de un PEG-alcanal de la invención a una molécula pequeña tal como amfotericina B generalmente como se describió en el ejemplo 14, aunque las condiciones precisas de reacción variarán de conformidad con la molécula pequeña a ser modificada. Típicamente, la conjugación se lleva a cabo utilizando un ligero exceso molar del reactivo PEG con relación a la molécula pequeña, por ejemplo, aproximadamente 1.2-1.5, a aproximadamente 5 a 10 veces de exceso molar. En ciertos casos, dependiendo de la molécula, el fármaco de molécula pequeña puede utilizarse realmente en exceso, tal como cuando el conjugado de PEG-molécula pequeña se precipita en el solvente de reacción, por ejemplo, éter, mientras que el fármaco que no ha reaccionado permanece en solución.

Moléculas blanco y superficies Los reactivos alcanales poliméricos de la invención pueden estar unidos, ya sea covalentemente o no covalentemente, a numerosas entidades incluyendo películas, superficies para separación y purificación química, soportes sólidos, superficies metálicas/óxido metálico tales como oro, titanio, tántalo, niobio, aluminio, acero, y sus óxidos, óxido de silicón, macromoléculas, y moléculas pequeñas. Adicionalmente, los polímeros de la invención también se pueden utilizar en sensores bioquímicos, interruptores bioelectrónicos, y puertas. Los alcanales poliméricos de la invención también se pueden emplear como vehículos para síntesis peptídica, para la preparación de superficies revestidas con polímero e injertos poliméricos, para preparar conjugados de polímero-ligando para particionamiento por afinidad, para preparar hidrogeles entrecruzados y no entrecruzados, y para preparar complejos de polímero-cofactor para bioreactores. Un agente biológicamente activo para uso en el acoplamiento a un polímero de la invención puede ser cualesquiera uno o más de los siguientes. Los agentes adecuados se pueden seleccionar a partir de, por ejemplo, hipnóticos y sedantes, energizantes psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsivos, relajantes musculares, agentes anti-parkinson (antagonistas de dopamina), analgésicos, anti-inflamatorios, fármacos anti-ansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes anti-migraña, elementos que contraen los músculos, anti-infecciosos (antibióticos, antivirales, antifungales, vacunas) anti-artrítícos, antimalariales, anti-eméticos, anepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anti-cancerosos, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares, antiarríthmicos, antioxidantes, agentes anti-astma, agentes hormonales incluyendo anticonceptivos, simpatomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglicémicos, agentes nutricionales y suplementos, suplementos de crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes diagnósticos, y agentes para contraste. Más particularmente, los agentes activos pueden caer dentro de uno de diversas clase estructurales, incluyendo pero no limitadas a moléculas pequeña (preferiblemente moléculas insolubles pequeñas), péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos, y los similares. Preferiblemente, un agente activo para acoplamiento a un alcanal polimérico de la invención posee un grupo amino nativo, o alternativamente, se modifica para que contenga al menos un grupo amino reactivo adecuado para acoplamiento a un alcanal polimérico de la invención. Los ejemplos específicos de agentes activos adecuados para unión covalente a un polímero de la invención incluyen pero no se limitan a aspariginasa, amdoxovir (DAPD), antida, becaplermina, calcítoninas, cianovirina, denileucina diftitox, eritropoietina (EPO), agonistas EPO (por ejemplo, péptidos de aproximadamente 10-40 aminoácidos en longitud y que comprenden una secuencia núcleo particular como se describió en WO 96/40749), dornasa alfa, proteína estimulante de la erítropoiesis (NESP), factores de coagulación tales como Factor V, Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor de von Willebrand; ceredasa, cerezíma, alfa-glucosídasa, colágena, ciclosporina, alfa defensinas, beta defensinas, exedina-4, factor estimulante de colonia del granulocito (GCSF), trombopoietina (TPO), inhibidor de la alfa-1 proteínasa, elcatonina, factor estimulante de la colonia del macrófago granulocito (GMCSF), fibrinógeno, filgrastima, hormona de crecimiento de humano (hGH), hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), GRO-beta, anticuerpo a GRO-beta, proteínas morfogenéticas de hueso tales como proteínamorfogenética de hueso-2, proteína morfogenética de hueso-6, OP-1 ; factor de crecimiento fibroblástico ácido, factor de crecimiento fibroblástico básico, ligando CD-40, heparina, albúmina de suero de humano, heparina de bajo peso molecular (LMWH), interferones tales como ¡nterferón alfa, interferón beta, ¡nterferón gamma, ¡nterferón omega, interferón tau, ¡nterferón consenso; interleucinas y receptores de interleucina tales como receptor de interleucina-1 , interleucina-2, proteínas de fusión a interleuc¡na-2, antagonista del receptor a interleucina-1 , interleucina-3, ¡nterleucina-4, receptor de interleucina-4, ¡nterleucina-6, interleucina-8, interleucina-12, receptor de interleucina-13, receptor de interleucina-17; lactoferrina y fragmentos de lactoferrina, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), insulina, pro-insulina, análogoues de insulina (por ejemplo, insulina mono- acilatada como se describió en la Patente de E.U.A. No. 5,922,675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina incluyendo octreótido, vasopresina, hormona estimulante del folículo (FSH), vacuna de la influenza, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), insulinotropina, factor estimulante de la colonia de macrófago (M-CSF), activadores del plasminógeno tales como alteplasa, uroquinasa, reteplasa, estreptoquinasa, pamiteplasa, lanoteplasa, y teneteplasa; factor de crecimiento nervioso (NGF), osteoprotegerina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento transformante-1 , factor de crecimiento endotelial vascular, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento del queratinocito (KGF), factor de crecimiento glial (GGF), receptores de célula T, moléculas/antígenos de CD, factor de necrosis tumoral (TNF), proteína quimioatrayente del monocito- 1 , factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroidea (PTH), péptido semejante a glucagon, somatotropina, timosina alfa 1 , inhibidor de la timosina alfa 1 llb/llla, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, alfa-1 antitripsina, compuestos de fosfod iesterasa (PDE), VLA-4 (antígeno muy tardío-4), inhibidores de VLA-4, bisfosfonatos, anticuerpo del virus del sincitio respiratorio, gen regulador transmembranal de la fibrosis quística (CFTR), deoxirribonucleasa (Dnase), proteína bactericida/que incrementa la permeabilidad (BP1 ), y anticuerpo anti-C V. Los anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen etanercept (una proteína de fusión diméríca que consiste de la porción de unión al ligando extracelular de humano del receptor de TNF de 75 kD asociado a la porción Fe de la lgG1 ), abciximab, afeliomomab, basiliximab, daclizumab, inflixímab, ibritumomab tiuexetan, mitumomab, muromonab-CD3, tositumomab conjugado con yodo 131 , olizumab, rituximab, y trastuzumab (herceptina). Los agentes adicionales adecuados para unión covalente a un polímero de la invención incluyen pero no se limitan a amifostina, amiodarona, acido aminocapróico, aminohipurato sódico, aminoglutetimida, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, amsacrina, anagrelida, anastrozol, asparaginasa, antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfan, cabergolina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucina, cilastatina sódica, cisplatina, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas, ácido 13-cis retinóico, ácido completamente trans retinóico; dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenac, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estramustina, etopósido, exemestano, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, epinepfrina, L-Dopa, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, ¡rinotecan, itraconazol, goserelina, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinoprilo, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, naloxona, nicotina, nilutamida, octreótido, oxaliplatina, pamidronato, pentostatina, pilcamicina, porfimer, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrona, raltitrexed, sirolimus, estreptozocina, tacrolimus, tamoxifen, temozolomida, tenipósido, testosterona, tetrahidrocanabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecano, tretinoina, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, dolasetron, granisetron; formoterol, fluticasona, leuprolida, midazolam, alprazolam, amfotericina B, podofilotoxinas, nucleósido antivirales, aroil hidrazonas, sumatriptan; macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina, y swinolida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina y sitafloxacina; aminoglicósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, canamicina, neomicina, y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penemos; penicilinas incluyendo agentes sensibles a penicilinasa semejantes a penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa semejantes a meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agente activos de microorganismos gram negativos semejantes a ampicilina, amoxicilina, y hetacilina, cilina, y galampicilina; penicilinas antipseudomonales semejantes a carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, y piperacilina; cefalosporinas semejantes a cefpodoxima, cefprozilo, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetril, cefepima, cefixima, cefonicida, cefoperazona, cefotetano, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef, y moxalactam, monobactamos semejantes a aztreonam; y carbapenemos tales como imipenem, meropenem, isetiouato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolin sódico, y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38, y tirfostinas.

Las moléculas pequeña preferidas para acoplamiento a un alcanal polimérico de la invención son aquellas que tiene al menos un grupo amino. Las moléculas preferidas incluyen aminohipurato sódico, amfotericina B, doxorubicina, acido aminocapróico, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, bitartrato de metaraminol, pamidronato disódico, daunorubicina, levotiroxina sódica, lisinoprilo, cilastatina sódica, mexiletina, cefalexina, deferoxamina, y amifostina. Los péptidos o proteínas preferidos para acoplamiento a un alcanal polimérico de la invención incluyen EPO, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, IFN consenso, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, IL-2, remicada (infliximab), Rituxan (rituximab), Enbrel (etanercept), Synagis (palivizumab), Reopro (abciximab), Herceptin (trastuzimab), tPA, Cerizyme (imiglucerasa), vacuna de la hepatitis-B, rDNAsa, inhibidor de la proteinasa alfa-1 , GCSF, GMCSF, hGH, insulina, FSH, y PTH. Los agentes biológicamente activos ejemplares anteriormente mencionados se pretende que abarquen, en donde sea aplicable, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores, isómeros, y formas salinas de los mismos farmacéuticamente aceptables. Con referencia a los péptidos y proteínas, se pretende que la invención abarque formas sintéticas, recombínantes, nativas, glicosiladas, y no-glicosiladas, así como fragmentos de las mismas biológicamente activos. Se pretende que las proteínas biológicamente activas anteriormente mencionadas abarquen adicionalmente variantes que tienen uno o más aminoácidos sustituidos, deletados, o los similares, siempre y cuando la proteína variante resultante posea al menos un cierto grado de actividad de la proteína parental (nativa).

Composiciones farmacéuticas La presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se provee en la presente invención en combination con un excipiente farmacéutico. Generalmente, el conjugado mismo estará en una forma sólida (por ejemplo, un precipitado), el cual puede estar combinado con un excipiente farmacéutico adecuado que puede estar ya sea en forma sólida o líquida. Los excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, aquellos seleccionado a partir del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tensioactivos, reguladores de pH, ácidos, bases, y combinaciones de los mismos. Un carbohidrato tales como un azúcar, un derivado de azúcar tales como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado, y/o un polímero de azúcar puede estar presente como un excipiente. Los excipientes específicos de carbohidrato incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y los similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trealosa, celobiosa, y los similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y los similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, y los similares.

El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o regulador de pH tales como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato monobásico de sodio, sodio dibásico de fosfato, y combinaciones de los mismos. La preparación también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o impedir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y combinaciones de los mismos. Un antioxidante también puede estar presente en la preparación. Los antioxidantes se utilizan para prevenir la oxidación, por lo tanto previniendo el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, bisulfito de sodio, sulfoxilato de formaldehído sódico, metabisulfito sódico, y combinaciones de los mismos. Un agente tensloactivo puede estar presente como un excipiente. Los agentes tensioactivos ejemplares incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80", y plurónicos tales como F68 y F88 (ambos disponibles a partir de BASF, Mount Olive, New Jersey); ésteres de sorbitano; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatldllcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y ésteres de ácido graso; esferoides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, zinc y otros cationes adecuados. Los ácidos o las bases puede estar presente como un excipiente en la preparación. Los ejemplos no limitantes de ácidos que se pueden utilizar incluyen aquellos ácidos seleccionados a partir del grupo que consiste de ácido clorhídrico, ácido acético, fosfórico ácido, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, fórmico ácido, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido azufréico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas a partir del grupo que consiste de hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de postasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio, y combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas abarcan todos los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que se pueden reconstituir así como suspensiones y soluciones. La cantidad del conjugado (por ejemplo, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero descrito en la presente invención) en la composición variará dependiendo de numerosos factores, pero de manera óptima será una dosis terapéuticamente efectiva cuando la composición se almacena en un contenedor de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica se puede alojar en una jeringa. Una dosis terapéuticamente efectiva se puede determinar experimentalmente mediante administración repetida de cantidades en incremento del conjugado con el objeto de determinar cuál cantidad produce un punto final clínicamente deseado. La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de experimentación de rutina, por ejemplo, mediante la preparación de composiciones que contiene cantidades variables del excipiente (que tienen un intervalo de bajo a alto), examinando la estabilidad y otros parámetros, y luego determinando el intervalo en el cual se alcanza el desempeño óptimo sin efectos adversos significativos. No obstante, generalmente, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99% en peso, preferiblemente de aproximadamente 5%-98% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 15-95% en peso del excipiente, con las concentraciones menores de 30% en peso siendo más preferidas. Los excipientes farmacéuticos precedentes junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice de Pharmacy", 19a edición, Williams & Williams, (1995), el "Physician's Desk Reference", 52a edición, Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.

H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000. Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención típicamente son, aunque no necesariamente, administradas vía inyección y por lo tanto generalmente son soluciones líquidas o suspensiones inmediatamante antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede tomar otras formas tales como jarabes, cremas, ungüentos, tabletas, polvos, y los similares. También se incluyen otros modos de administración, tales como pulmonal, rectal, transdermal, transmucosal, oral, intratecal, subcutánea, intra-arterial, y así sucesivamente. Como se describió previamente, los conjugados pueden ser administrados por inyección parenteralmente mediante inyección intravensa, o menos preferiblemente mediante inyección intramuscular o mediante inyección subcutánea. Los tipos de formulación adecuados para administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos para combinación con un solvente antes de su uso, suspensiones listas para inyección, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de la administración, entre otros.

Métodos de administración La invención también provee un método para administrar un conjugado como se provee en la presente invención a un paciente que padece de una condición que responde al tratamiento con un conjugado. El método comprende administrar, generalmente via inyección, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (preferiblemente provista como parte de una preparación farmacéutica). El método de administración se puede utilizar para tratar cualquier condición que se puede remediar o prevenir mediante la administración del conjugado particular. Aquellos expertos en la técnica aprecian cuáles condiciones pueden tratar efectivamente un conjugado específico. La dosis real a ser administrada variará dependiendo de la edad, peso, y condición general del sujeto así como la severidad de la condición a ser tratada, el juicio del profesional del cuidado de la salud, y el conjugado a ser administrado. Las cantidades terapéuticamente efectivas se conocen por auellos expertos en la técnica y/o se describen en los textos de referencia y en la literatura pertinente. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva tendrá un intervalo de aproximadamente 0.001 mg a 100 mg, preferiblemente en dosis a partir de 0.01 mg/día a 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis a partir de 0. 0 mg/día a 50 mg/día. La unidad de dosis de cualquier conjugado dado (de nuevo, preferiblemente provista como parte de una preparación farmacéutica) se puede administar en una variedad de programas de dosificación dependiendo del juicio del médico, necesidades del paciente, y asi sucesivamente. El programa de dosificación específico se conocerá por aquellos expertos en la técnica o se puede determinar experimentalmente utilizando métodos de rutina. Los programas de dosificación ejemplares incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquier combinación de los mismos. Una vez que se ha alcanzado el punto terminal clínico, se detiene la dosificación de la composición. Una ventaja de administrar los conjugados de la presente invención es que las porciones poliméricas individuales solubles en agua pueden ser escindidas. Dicho resultado es ventajoso cuando la eliminación a partir del cuerpo es potencialmente un problema debido al tamaño del polímero. De manera óptima, la escisión de cada porción polimérica soluble en agua se facilita a través del uso de enlaces fisiológicamente escindible y/o enzimáticamente degradables tales como enlaces que contienen uretano, amido, carbonato o éster. De esta manera, la eliminación del conjugado (vía escisión de las porciones poliméricas individuales solubles en agua) se puede modular mediante la selección del tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que podría proveer las propiedades de eliminación deseadas. Un experto en la técnica puede determinar el tamaño molecular adecuado del polímero así como la eliminación del grupo funcional. Por ejemplo, un experto en la técnica, utilizando experimentación de rutina, puede determinar un tamaño molecular adecuado y grupo funcional escindible mediante la preparación inicialmente de una variedad de derivados poliméricos con diferentes pesos y grupos funcionales escindibles del polímero, y luego obteniendo el perfil de eliminación (por ejemplo, a través de la muestra periódica de sangre o de orina) mediante la administración del derivado polimérico a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/o de orina. Una vez que se han obtenido las series de perfiles de eliminación para cada conjugado probado, se puede identificar un conjugado adecuado. Todos los artículos, libros, patentes, publicaciones de patentes y otras publicaciones referidas en la presente invención se incorporan como referencias en su totalidad.

EJEMPLOS Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito en conjunción con ciertas modalidades específicas preferidas de las mismas, la descripción precedente así como los ejemplos a continuación se pretende que ilustren y no que limiten el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención.

Materiales y métodos Todos los reactivos PEG referidos en los ejemplos anexos están comerialmente disponibles a menos que se indique de otra manera. Todos los datos de RMN se generaron mediante un espectrómetro de RMN de 300 MHz fabricado por Bruker. La lisozima se obtuvo a partir de Sigma.

EJEMPLO 1 Síntesis de mPEG (2K)-butiraldehído CH PE JJK-OH + A. Preparación de mPEG (2K Da -butiraldehído. dietil acetal.

CHaO-íCH^HjOJíno-CHjCHzCHzCH OCH2CH3 Una mezcla de mPEG (2K Da) (2.0 g) y tolueno (30 ml_) se secó azeotrópicamente mediante destilación del tolueno bajo presión reducida. El mPEg seco, peso molecular, 2 kilodaltones, se disolvió en tolueno anhidro (15 mi) al cual se le añadió una solución de ter-butóxido de potasio 1.0 M en ter-butanol (4.0 mi, 0.004 moles) y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (0.5 g, 0.00277 moles) (Alfa Aesar). La mezcla se agitó a 100-105°C durante toda la noche bajo una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se añadió a 150 mi etil éter a 0-5°C. El producto precipitado se filtró y se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 1.6 g. La reacción procedió esencialmente con un rendimiento cuantitativo. Es decir, esencialmente toda la materia prima de mPEG se convirtió al dietil acetal correspondiente, basándose en la ausencia de protones hidroxilo que corresponden a la matera prima mPEG-OH de conformidad con 1H RMN. RMN (de-DMSO): 1.09 ppm (t, CH3-C-) 1.52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 4.46 ppm (t, -CH, acetal).

B. Preparación de mPEG (2kD)-Buteraldehído o HOH, H* || CHJ0-PEG21c-0-CH2(CH2)r H(OCH,CH3)2 ? C^ PEGat-O-CHztCHzJrC-H Una mezcla de mPEG (2K Da) butiraldehído, dietil acetal (1.0 g) a partir de A. anteriormente mencionado, agua desionizada (20 mi), y una cantidad de ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3.0, se agitó por 3 horas a temperatura ambiente. A esta mezcla se le añadió cloruro de sodio (1.0 g) y el pH se ajustó a 6.8 mediante la adición de hidróxido de sodio 0.1 M. El producto, mPEG (2kD) butiraldehído, se extrajo con diclorometano (3 x 20 mi). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló bajo presión reducida para proveer el producto de mPEG butiraldehído en forma aislada. Rendimiento: 0.72g. La reacción procedió esencialmente con un rendimiento cuantitativo. Es decir, esencialmente todo el mPEG butiraldehído dietil acetal se convirtió al aldehido correspondiente, basándose en la ausencia de protones hidroxilo que corresponden a la materia prima de mPEG-OH así como a la ausencia de protones hidroxilo que corresponden a dietil acetal de conformidad con 1H RMN. RMN (de-DMSO): 1.75 ppm (p, -CH CH?-CHO-) 2.44 ppm (dt,-CHp-CHC . 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 9.66 ppm (t, -CHO).

EJEMPLO 2 Síntesis de mPEG(30kD)-butiraldehído A. Preparación de mPEG (30KDa)-but¡raldehído. dietil acetal mPEG30K-O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH3)2 Una mezcla de mPEG (30 kD) (solución al 60% en tolueno, 3.30g), tolueno (30 mi) y BHT (hidroxitolueno butilado, 0.004 g) se secó azeotrópicamente mediante la destilación del solvente bajo presión reducida. El mPEg 30K seco se disolvió en tolueno anhidro (15 mi), y a esta solución se le añadió ter-butóxido de potasio 1.0 M en ter-butanol (4.0 mi, 0.004 moles), 4-clorobutiraldehído dietil acetal (0.5 g, 0.00277 moles) (Alfa Aesar), y bromuro de potasio (0.05 g). La mezcla resultante se agitó durante toda la noche a 105°C bajo atmósfera de argón. La mezcla se filtró, se concentró hasta secarla bajo presión reducida y el producto sin purificar se disolvió en 20 mi de diclorometano. Esta solución que contiene el producto se añadió a etil éter (300 mi) a temperatura ambiente para precipitar el producto. El producto precipitado se aisló mediante filtración y se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 1.92 g. RMN (de-DMSO): 1.09 ppm (t, CH3-C-) 1.52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 4.46 (t, -CH, acetal). Basándose en los rendimientos y en el análisis del producto, la sustitución del reactivo acetal en el extremo hidroxi del reactivo mPEG-OH procedió a una eficiencia muy alta, es decir, a esencialmente 100% de sustitución. El producto resultante, sin requerir purificación adicional, se produjo con una alta pureza, sin cantidades detectables o significativas de mPEG-OH no reaccionado. Típicamente, los polímeros alcanal o acetal de la invención se producen a elevadas purezas - es decir, típicamente, el producto alcanal deseado está presente en la composición final en al menos 85% de pureza, preferiblemente al menos 90% de pureza, e incluso más peferiblemente, en al menos 95% de pureza.

B. Preparación de mPEG (30KDa)-butiraldehído. mPEG30K-O- Una mezcla de mPEG (30K Da) butiraldehído, dietil acetal (1.0 g), a partir de A. anteriormente mencionada, agua desionizada (20 mL), y una cantidad de ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3.0 se agitó por 3 horas a temperatura ambiente. A esta mezcla se le añadió cloruro de sodio (1.0 g), y el pH se ajustó a 6.8 mediante la adición de hidróxido de sodio 0.1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20 mi). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se removió mediante destilación. El producto mojado se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 0.82 g. RMN (de-DMSO): 1.75 ppm(p, -CHrCH?-CHO-) 2.44 ppm (dt, - CH2-CHO). 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 9.66 ppm (t, -CHO). Sustitución: -100%.

La conversión hacia el aldehido correspondiente procedió esencialmente en rendimiento cuantitativo.

EJEMPLO 3 Estabilidad comparativa del mPEG-propionaldehído y mPEG- butiraldehído a pH básico Metoxi-PEG-propionaldehído y mPEG-butiraldehído se expusieron cada uno a condiciones de elevado pH por periodos prolongados de tiempo para comparar la estabilidad relativa de cada polímero bajo condiciones de pH básico. Como se indica a continuación, cantidades significativas de propionaldehído PEG se reaccionó bajo estas condiciones para formar mPEG-OH y liberar acroleína (debido a una reacción tipo retro-Michael), a la vez que no se detectó pérdida del compuesto PEG butiraldehído. Los detalles de este experimento se proveen a continuación.

A. Estabilidad de mPEG Í2K Da)-butiraldehído a DH básico mPEG (2K Da)-butiraldehído (a partir del ejemplo 1 ) (0.5 g) se disolvió en 10 mi de regulador de pH con fosfato 5 mM (pH = 8.0) y la solución resultante se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. Se añadió NaCI (0.5 g) y el producto se extrajo con cloruro de metileno (3 x 10 mi). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló bajo presión reducida a 25°C.

Basándose en el análisis de 1H RMN, el producto no cambió. Es decir, no se detectó descomposición del PEG-butanal, incluso después de un periodo de tiempo extendido bajo estas condiciones de pH básico.

B. Estabilidad de mPEG (5K DaVproDionaldehído a DH básico mPEG (5KDa)-propionaldehído (S earagua Corporation, aldehido sustitución 82%) (0.5g), se disolvió en 10 mi de regulador de pH con fosfato 5 mM (pH = 8.0). La solución resultante se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. El análisis de cromatografía de gas de espacio en la cabeza mostró que la solución contenía acroleína (CH2=CH-CHO), resultante a partir de una reacción de eliminación bajo condiciones básicas tales como aquellas típicamente empleadas para la conjugación de la proteína. Se añadió NaCI (0.5 g) y el producto se extrajo con cloruro de metileno (3 x 10 mi). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló bajo presión reducida a 25°C. Basándose en el análisis de H RMN, la sustitución de mPEG (5K Da) propionaldehído cayó a 62% (es decir, 38% del PEG-propanal se ha descompuesto), y el producto que contenía una cantidad sustancia de mPEG-OH, se genera a partir de la pérdida del segmento C-3 que corresponde a la porción propanal del PEG-propanal.

EJEMPLO 4 Polietilenqlicosilación de la lisozima o Lisozima -ra ¾KCHi)rCH2 -PEG2rOCH3 ("L¡soz¡ma-NH2" se pretende que indique la molécula de lisozima con uno de sus grupos amino reactivos mostrados).

A. Polietilenqlicosilación al azar utilizando un PEG alcanal 2 kD. La proteína modelo, lisozima, una enzima secretora de 129 aminoácidos, se utilizó para demostrar el acoplamiento de un alcanal polímero de la invención a una proteína ilustrativa. La lisozima contiene seis residuos de lisina como sitios potenciales para la polietilenglicosilación. La lisozima (2.1 mg) se disolvió en 1 mi de regulador de pH con fosfato 50 mM (pH 7.6) al cual se le añadió mPEG (2kD) -butiraldehído (a partir del ejemplo 1 , 1.5 mg). A esta solución se le añadió el agente reductor, NaCNBH3 (cianoborohidruro de sodio), y la solución se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. El conjugado de lisozima resultante posee cadenas PEG acopladas a los grupos amino de la lisozima mediante una cadena -(CH2)4- intermediaria. El producto de reacción se analizó mediante ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF) espectrometría de masas y se exhibieron picos que corresponden a tres especies polietilenglicosiladas de lisozima a 16208 Da, 18422 Da, y 20520 Da, difiriendo en masa por aproximadamente 2000 Da (que corresponde al tamaño del PEG butanal reactivo), así como una proteína no modificada. La masa de la lisozima no modificada (nativa) mediante MALDI-TOF se determinó para que fuera de 14153. Así, el conjugado formado fue realmente una mezcla de proteína monopolietilenglicosilada, proteína di-polietilenglicosilada, y proteína tri-polietilenglicosilada (de 1 -elemento, 2-elementos y 3-elementos). La polietilenglicosilación al azar anteriormente mencionada demuestra una proteína ilustrativa de la invención para producir una distribución de productos polietilenglicosilados. Si se desea, la mezcla de reacción se puede separar adicionalmente para aislar los conjugados PEG individuales, es decir, lisozima que tiene una molécula PEG unida al mismo, lisozima que tiene dos PEGs unidos, y lisozima que tiene tres PEGs unidos. En cada una de las composiciones del conjugado descrito anteriormente (1-elemento, 2-elemehtos, 3-elementos), la molécula PEG puede estar unida a diferentes sitios amino reactivos dentro de la molécula de lisozima.

B. Polietilenglicosilación utilizando un PEG alcanal de 5KD. mPEG-2-Metilbutiraldehído. La conjugación de la proteína modelo, lisozima, se repite utilizando el PEG reactivo alfa ramificado, mPEG 5kD-2-metilbutiraldehído. La lisozima (3 mg) se disuelve en aproximadamente 1 mL de regulador de pH con fosfato de sodio a un pH que tienen un intervalo de aproximadamente 5.5 a 7.5. Un exceso molar de dos a cinco veces del reactivo PEG, mPEG 5kD-2-metilbutiraldehído, se añade a la solución de lisozima, y la solución resultante se coloca en un mezclador rotatorio y se deja reaccionar a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 minutos, se añade un exceso molar de 20 veces de NaCNBH3 y la reacción se deja continuar. Las alícuotas se retiran a diversos intervalos de tiempo (4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, etc.) y el progreso de la reacción se monitorea mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas ALDI-TOF. Después del término de la reacción, la mezcla del conjugado resultante se concentra, se esteriliza mediante filtración, y se almacena bajo condiciones de baja temperatura (-20°C a -80°C) hasta su uso posterior.

EJEMPLO 5 Preparación de PEG2 (40.3 KDA) ramificado-butiraldehído Se provee a continuación la preparación de un alcanal polimérico ejemplar que tiene un segmento ramificado de PEG. Resumen. La síntesis general implica ¡nicialmente el acoplamiento de un tetra(etilenglicol)espaciador a un precursor alcanal reactivo, 4-clorobutiraldehído dietil acetal. La introducción de un espaciador oligomérico de etilenglicol provee mayor estabilidad al producto resultante al extender la longitud de la cadena entre el grupo aldehido reactivo (o acetal) y un grupo reactivo que puede estar contenido en la porción enlazadora, X', por lo tanto minimizando la ocurrencia de reacciones laterales potenciales y mejorando los rendimientos. El uso de un espaciador oligomérico, tal como tetraetilenglicol, también provee un grupo reactivo funcional, en este caso, hidroxi, que puede convertirse, si es necesario, para acoplamiento a un segmento polimérico que se ha purificado mediante cromatografía para remover las impurezas poliméricas tales como PEG-diol, mPEG-OH, y los similares. De esta manera, las impurezas poliméricas funcionalizadas no deseadas tales como PEG-dialdehído (resultante a partir de PEG diol) y los similares se remueven a partir del segmento de PEG antes de acoplarse al precursor alcanal para proveer el producto final, alcanal polimérico soluble en agua es decir esencialmente libre de impurezas poliméricas. Volviendo a la reacción específica a continuación, el acoplamiento del tetra(etilenglicol) espaciador a 4-clorobutiraldehído dietil acetal lleva a la formación del producto mono-alcanal deseado contaminado con producto di-alcanal y tetra(etilenglicol) inicial. No obstante, un procesamiento directo que utiliza las diferencias en solubilidad de todos los componentes en la mezcla de reacción permite la fácil preparación de producto monoalcanal altamente puro, es decir, que tiene la función alcanal (acetal) sustituida en solamente uno de los grupos hidroxi reactivos de la molécula de tetra (etilenglicol). (Reacción A.). El producto a partir de la reacción A se convirtió entonces hacia el mesilato correspondiente mediante reacción con cloruro de metansulfonilo, por ejemplo, el grupo hidroxi libre del tetra(etilenglicol) se convirtió primero al mesilato (Reacción B), seguido por la conversión del mesilato a un grupo amino primario (Reacción C). El grupo amino reactivo del reactivo acetal se acopló entonces a un segmento de estructura base polimérica ramificada que tiene un acrbono reactivo en el carbonilo adecuado para reacción con el grupo amino del reactivo acetal. El precursor del reactivo PEG, mPEG-lisina disustituida, se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico antes de la conversión al éster correspondiente activado para remover las impurezas poliméricas. El N-hidroxisuccinimidil éster del mPEG-lisina disistituida se hizo reaccionar entonces con un acetal amino-alcanal, vía la formación de un enlace de amida, para formar el PEG-espaciador-acetal alcanal resultante ramificado. El acetal se hidrolizó posteriormente en la reacción catalizada por ácido para formar el alcanal correspondiente, y en particular, el PEG (40Kda) butiraldehído ramificado de 2 brazos. Este método sintético, por ejemplo, no se limita a segmentos poliméricos ramificados pero se puede emplear para segmentos poliméricos que tiene cualesquiera de las geometrías descritas en la presente invención.

Resumen de la síntesis general: •BuOH HÓ-(CH :HjÓ), CHih-CHfOCH!CH j>2 »»- CH,SOjO <CH JCHJOL, ¦a¾CH2)2-CHiOCH;CH3)J CHjSQj HqHjí:H2Qí«-CHi(CH2)r M(OCHiCHjh CHjCMCHjCHaOJn-C — NH O II CHjO-íCHzCHaOJft-C- H— CH -CíOjH -íCHjC^Oí^CCHjh- HtCCH^Hj)! 0 II C A. Tetra(etileneqlicol) mono-butiraldehído, dietil acetal HO-(CH2CH20)4CH2CH20-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2 Una mezcla de tetra (etilenglicol) (97.1 g, 0.500 moles) y tolueno (200 mi) se secó azeotrópicamente mediante destilación del tolueno bajo presión reducida (evaporador rotatorio). El tetra(etilenglicol) seco se disolvió en tolueno anhidro (180 mi) y se añadieron solución de ter-butóxido de potasio 1.0 M en ter-butanol (120.0 mi, 0.120 moles) y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (18.1 g, 0.100 moles) (Alfa Aesar). La mezcla se agitó a 95-100°C durante toda la noche bajo atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y los solventes se destilaron bajo presión reducida. El producto sin purificar se disolvió en 1000 mi de agua deionizada y la solución resultante se filtró a través de carbón activado. Se añadió cloruro de sodio (10 g) se añadió y el producto se extrajo con diclorometano (250, 200, y 150 mi). El extracto se secó (sobre MgS04) y el solvente se destiló bajo presión reducida (mediante evaporación rotatoria). El producto sin purificar se disolvió en 300 mi de 10% de un regulador de pH con fosfato (pH = 7.5) y las impurezas se extrajeron con acetato de etilo (2 x 50 mi). El producto se extrajo con diclorometano (200, 150, y 100 mi). El extracto se secó (sobre MgS04) y el solvente se destiló bajo presión reducida (mediante evaporación rotatoria). Rendimiento: 20.3 g. RMN (d6-DMSO): 1.10 ppm (t, CH3-C-) 1.51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3.49 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4.46 ppm (t, -CH, acetal), 4.58 ppm (t,-OH). Pureza: -100% (no se observaron signos de materias primas sin reaccionar).

B. Tetra(etilenql¡8l)-a-mesilato-(o-butiraldehído. dietil acetal CH3-S(0)2-0-(CH2CH20)4CH2CH20-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2 Una mezcla de tetra(etilenglicol) mono-butiraldehído, dietil acetal (12.5g, 0.037 moles) y tolueno (120 mi) se secó azeotrópicamente mediante destilación del tolueno bajo presión reducida (evaporador rotatorio). El tetra (etilenglicol) mono-butiraldehído, dietil acetal seco se disolvió en tolueno anhidro (100 mi). A la solución se le añadieron 20 mi de diclorometano anhidro y 5.7 mi de trietilamina (0.041 moles). Luego se añadieron gota a gota 4.5 g de cloruro de metanosulfonilo (0.039 moles). La solución se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno durante toda la noche. A continuación se añadió carbonato de sodio (5 g), la mezcla se agitó por 1 hora. Luego la solución se filtró y los solventes se destilaron bajo presión reducida (evaporador rotatorio). 1.10 ppm (t, CH3-C-) 1.51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3.17 ppm (s, CH3-metansulfonato), 3.49 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4.30 ppm (m, -CH2-metansulfonato), 4.46 ppm (t, -CH, acetal). Pureza: -100%.

C. Tetra(etilenqlicol)-a-am¡no-o-butiraldehído, dietil acetal H2N-(CH2CH20)4CH2CH20-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2 Una mezcla de tetra (etileneglicol)-a-mesilato-ro-butiraldehído, dietil acetal (14.0 g), hidróxido de amonio concentrado (650 mi), y alcohol etílico (60 mi) se agitó por 42 horas a temperatura ambiente. A continuación se destilaron todos los materiales volátiles bajo presión reducida. El producto sin purificar se disolvió en 150 mi de agua deionizada y el pH de la solución se ajustó a 12 con NaOH 1.0 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 100 mi). El extracto se secó (MgSC ) y el solvente se destiló bajo presión reducida (evaporador rotatorio). Rendimiento 10.6 g. RMN (D20): 1.09 ppm (t, CH3-C-) 1.56 ppm (m, C-CH2-CH2-), 2.69 ppm (t, CH2-N), 3.56 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4.56 ppm (t, -CH, acetal). Pureza: -100%.

D. PEG2 ramificado (40.3KDaVbutiraldehído dietil acetal mPEO-0-C(0)-NH I mPEG-0-C(0)- H- CH QO- H.ÍCHJCHIOÍ-CHJCHJCHJ-CHÍOCH^H^ PEG2 (40KDa)-N-hidroxisuccinimida se preparó a partir del PEG2-lisina correspondiente como se describió en la Patente de E.U.A. No. 5,932,462 (Harris, J., et al.). El precursor de PEG-2 lisina, un PEG ramificado que tiene un grupo carboxilo ionizable, se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico, como se describe también en Patente de E.U.A. No. 5,932,462. A una solución de PEG2 (40 KDa)-N-hidroxisuccinimida (5.0g, 0.000125 moles) (Shearagua Corporation) en cloruro de metileno (100 mi), se le añadieron tetra (etilenglicol)-a-amino-co-butiraldehido, dietil acetal (0.50g, 0.000148 moles) y trietilamina (0.035 mi) y la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. El solvente se evaporó hasta secarlo utilizando un evaporador rotatorio. El producto sin purificar se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol ¡sopropílico. El producto mojado se secó bajo presión reducida. Rendimiento 4.8 g. RMN (d6-DMSO): 1.10 ppm (t, CH3-C), 1.51 ppm (m, C-CH2-CH2- ), 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 4.46 ppm (t, - CH-, acetal). Sustitución: -100%.

E. PEG2 ramificado (40.3KDa)-butiraldehído PEG2 ramificado (40.3 KDa) -butiraldehído, dietil acetal (4.8 g) se disolvió en 100 mi de agua y el pH de la solución se ajustó a 3 con ácido fosfórico diluido. La solución se agitó por 3 horas a temperatura ambiente, seguido por la adición de hidróxido de sodio 0.5 M suficiente para ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7. El producto se extrajo con cloruro de metileno, y el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente se destiló bajo presión reducida. Rendimiento 4.2 g. RMN (d6-DMSO): 1.75 ppm (p, -CHrCH?- CHO-) 2.44 ppm (dt, -CH CHO). 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, estructura base de PEG), 9.66 ppm (t, -CHO). Sustitución: -100%. Lo anteriormente mencionado ilustra incluso otra modalidad de la invención, la preparación de un PEG alcanal ramificado representativo. Lo anteriormente mencionada también ilustra una modalidad de la invención cuandoe en la presente invención el alcanal polimérico contiene un grupo oligomérico corto, en este caso, un tetraetilenglicol intercalado entre la estructura base del polímero y el segmento alcanal de la molécula. Además, este ejemplo ilustra el uso de un precursor del segmento polimérico que contiene un grupo ionizable de tal manera que dicho segmento polimérico se puede purificar mediante cromatografía de intercambio iónico antes de acoplarse al alcanal-acetal reactivo, por lo tanto removiendo efectivamente las impurezas poliméricas temprano en el esquema de reacción. En este caso, el producto formado está ausente de impurezas poliméricas difuncionales tales como aquellas que se generan a partir de reacciones de PEG-diol, o mPEG, o lisina mono-polietilenglicosilada o los similares, que pueden estar presentes en el precursor de mPEG2-lisina pero que se removieron mediante cromatografía.

EJEMPLO 6 Preparación del conjugado protéico de polímero-alcanal mediante polietilenalicosilación al azar de EPO La EPO recombinante (producida en células de mamífero E. coli (por ejemplo, células CHO) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butrialdehído 30 kDa (preparado como se describió en el ejemplo 2). EPO (~2 mg) se disuelve en 1 mi de regulador de pH con fosfato 50 mM (pH 7.6) y se añade mPEG (30kDa)-butiraldehído a 5X la concentración molar de EPO. Se añade un agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a temperatura ambiente para acoplar el PEG- butanal reactivo a la proteína vía un enlace amina. La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, de 1 -elemento, 2 elementos, etc. se realiza mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos que se exhiben para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas difieren por aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene una mezcla de proteína nativa y monopolietilenglicosilada. Incrementando la relación de PEG reactivo a proteína se incrementa el grado de polipolietilenglicosilación, es decir, la formación de 2- elementos, 3-elementos, etc. El uso de PEG alcanales de alto peso molecular que tienen un rendimiento mayor de aproximadamente 20 kDa favorece la formación de especies mono-polietilenglicosiladas. Los PEG alcanales de menor peso molecular, cuando se acoplan a una proteína, son más propensos a la formación de especies poli-polietilenglicosilados bajo estas condiciones. La polietilenglicosilación al azar anteriormente mencionada demuestra una proteína ilustrativa de la invención para producir una distribución de productos polietilenglicosilados EPO. Si se desea, la mezcla de reacción se puede separar adicionalmente para aislar los isómeros individuales como se describió a continuación. Los PEG conjugados que tienen diferentes pesos moleculares se separan entonces mediante cromatografía por filtración en gel. Los conjugados PEG diferentes (1 -elemento, 2-elementos, 3-elementos, etc.) se fraccionan con base en sus diferentes pesos moleculares (en este caso, varían por aproximadamente 30 kDa). Específicamente, la separación se lleva a cabo mediante la utilización de un sistema de columna serial adecuado para la separación efectiva de productos en el intervalo de peso molecular observado, por ejemplo, una columna de Superdex™200 (Amersham Biosciences). Los productos se eluyen con 10 mi de regulador de pH de acetato a una velocidad de flujo de 1.5 ml/minutos. Las fracciones recolectadas (1 mi) se analizan mediante DO a 280 nm para el contenido de proteína y también utilizando una prueba de yoduro para el contenido de PEG (Sims G. E. C, et al., Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980). Alternativamente, los resultados se visualizan mediante corrimiento de un del de SDS PAGE, seguido por tinción con yoduro de bario. Se recolectaron las fracciones que corresponden a los picos eluídos, se concentraron mediante ultrafiltración utilizando una membrana con límite de 10-30 kD, y se liofilizó. Este método produce la separación/purificación de conjugados que tienen los mismos pesos moleculares pero no provee separación de los conjugados que tienen el mismo peso molecular pero diferentes sitios de polietilenglicosilación (por ejemplo, isómeros posicionales). La separación de isómeros posicionales se lleva a cabo mediante cromatografía en fase reversa utilizando una columna FR-CLAR C18 (Amersham Biosciences o Vydac). Este procedimiento es efectivo para separar los isómeros de PEG-biomolécula que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales). La cromatografía en fase reversa se lleva a cabo utilizando una columna preparativa de FR-CLAR C18 y se eluye con un gradiente de agua/0.05% de TFA (eluente A) y acetonitrilo/0.05% de TFA (eluente B). Las fracciones que corresponden a los picos eluídos se recolectaron, se evaporaron para eliminar el acetonitrilo y el TFA, seguido por la remoción del solvente para aislar los isómeros PEG individuales posicionales.

EJEMPLO 7 Preparación del conjugado protéico de polímero-alcanal medíante polietilenglicosilación N-terminal de EPO El EPO recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitadas a éstas) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butrialdehído, 30 kDa (ejemplo 2). EPO (~2. mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG (30kDa)-butiraldehído (a partir del ejemplo 2) a 5X la concentración molar de EPO. Se añade un agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG-butanal reactivo a la proteína vía un enlace amina. La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1 -elemento, 2-elementos etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Estos picos exhibidos para especies nativas y mono- polietilenglicosiladas difieren por aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y proteína monopolietilenglicosilada. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover el EPO libre y especies de mayor peso molecular. La confirmación de polietilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG a proteína se incrementa el grado de polietilenglicosilación produciendo proteína poli-polietilenglicosilada. Lo anteriormente mencionado demuestra polietilenglicosilación de una proteína ilustrativa de la invención para producir una proteína polietilenglicosilada particular predominantemente N-terminal.

EJEMPLO 8 Polietilenglicosilación N-terminal de GCSF El GCSF recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como células CHO) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butrialdehído, 30 kDa. GCSF (~2. mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG (30kDa)-butiraldehído (a partir del ejemplo 2) a 5X la concentración molar de GCSF. Se añade el agente reductor, NaCNBhb, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo PEG-butanal a la proteína vía un enlace amina. La mezcla de reacción resultante se analizó mediante SDS- PAGE para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1-elemento, 2 elementos, etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas difieren por aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de GCSF nativo y monopolietilenglicosilado. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover el GCSF libre y especies con mayor peso molecular. La confirmación de polietilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG a proteína se incrementa el grado de polietilenglicosilación produciendo proteína poli-polietilenglicosilada.

EJEMPLO 9 Polietilenglicosilación N-terminal de interferón a El IFN-a recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitados a) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butrialdehído, 30 kDa. El ¡nterferón- (~2. mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG (30kDa)-butiraldehído (a partir del ejemplo 2) a 5X la concentración molar de IFN. Se añade un agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG-butanal reactivo a la proteína vía un enlace amina. La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de polietilenglicosiiación. La confirmación del grado de polietilenglicosiiación, 1 -elemento, 2 elementos etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas difieren por aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y proteína monopolietilenglicosilada. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover el interferon a libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la polietilenglicosiiación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG a proteína se incrementa el grado de polietilenglicosiiación produciendo IFN poli-polietilenglicosilado. La conjugación de las proteínas hGH, IFN-ß, y FSH a otros PEG-alcanal, mPEG-2-metil butiraldehído ilustrativos, 20 kDa se lleva a cabo esencialmente como se describió en los ejemplos anteriormente mencionados.

EJEMPLO 10 Polietilenglicosilación N-terminal de la hormona de crecimiento de humano La hormona de crecimiento recombinante de humano (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitados a éstas) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG- 2-metil butiraldehído, 20 kDa. La hormona de crecimiento de humano (~2 mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa a 5X la concentración molar de hGH. Se añade de 5 a 20 veces de exceso molar del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG-a metilbutanal reactivo a la proteína vía un enlace amino. El progreso de la reacción se analizó mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1-elemento, 2 elementos etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de masas de ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas y otras especies difieren por aproximadamente 20,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y proteína monopolietilenglicosilada. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover la hGH libre y especies con mayor peso molecular. La confirmación de la políetilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG aldehido a proteína se incrementa el grado de políetilenglicosilación produciendo una población de hGH poli-políetilenglicosilada.

EJEMPLO 11 Polietilenglicosilación N-terminal de interferón-ß El interferón-ß recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitadas a éstas) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa. El interferón-ß (~2 mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa a 5X la concentración molar de IFN. Se añade de 5 a 20 veces de exceso molar del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG-a metilbutanal reactivo a la proteína vía un enlace amino. El progreso de la reacción se analizó mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1-elemento, 2 elementos etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono- polietilenglicosiladas y otras especies difieren por aproximadamente 20,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopolietilenglicosilada. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover el IFN-ß libre y las especies con mayor peso molecular. La confirmación de polietilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG aldehido a proteína se incrementa el grado de polietilenglicosilación produciendo una población de IFN-ß poli-polietilenglucosilado.

EJEMPLO 12 Polietilenglicosilación N-terminal de FSH La hormona estimulante del folículo recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitadas a éstas) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa. La hormona estimulante del folículo, FSH (~2 mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa a 5X la concentración molar de FSH. Se añade de 5 a 20 veces de exceso molar del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agita por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG-a metilbutanal reactivo a la proteína vía un enlace amino. El progreso de la reacción se analizó mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1-elemento, 2 elementos etc. se lleva a cabo mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas y otras especies difieren por aproximadamente 20,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y proteína monopolietilenglicosilada. Las especies mono-polietilengllcosiladas se purifican mediante columna cromatografía para remover la FSH libre y especies con mayor peso molecular. La confirmación de polietilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico. Incrementando la relación de PEG aldehido a proteína se incrementa el grado de polietilenglicosilación produciendo una población de FSH poli-polietilenglicosilada.

EJEMPLO 13 Polietilenglicosilación N-terminal de hormona de crecimiento de humano La hGH recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero no limitadas a éstas) u otra fuente microbiana) se une covalentemente a PEG2 ramificado (40.3 KDa) -butiraldehído (ejemplo 5E). La hormona de crecimiento de humano (~2 mg) se disuelve en 1 mi de acetato de sodio 0.1 mM (pH 5) y se añade PEG2 ramificado (40.3 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de hGH. Se añadió de 5 a 20 veces de exceso molar del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el PEG2 ramificado (40.3 KDa) -butiraldehído reactivo a la proteína vía un enlace amino. El progreso de la reacción se analizó mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar el grado de polietilenglicosilación. La confirmación del grado de polietilenglicosilación, 1-elemento, 2 elementos (si están presentes) etc., se lleva a cabo mediante espectrometría de masas por ionización por tiempo de vuelo de desorción láser asistida por la matriz (MALDI-TOF). Los picos exhibidos para especies nativas y mono-polietilenglicosiladas y otras especies difieren por aproximadamente 40,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y proteína monopolietilenglicosilada, en particular debido al tamaño y geometría del PEG alcanal reactivo ramificado. Las especies mono-polietilenglicosiladas se purifican mediante cromatografía en columna para remover la hGH libre y especies con mayor peso molecular. La confirmación de la polietilenglicosilación N-terminal se lleva a cabo mediante mapeo peptídico.

EJEMPLO 14 Polietilenglicosilación de amfotericina B El grupo amino de una molécula pequeña, amfotericina B, se modifica mediante la unión de un alcanal polimérico. A una solución de amfotericina B. se añade HCI en agua desionizada a 2 veces de exceso molar de mPEG2k-butiraldehído (ejemplo 1 ) disuelto en regulador de pH con fosfato 0.1 M a pH 6.5. A esta mezcla se le añade una solución de NaCNBH3 (a un exceso molar de 1.5 a 10 veces) en regulador de pH con fosfato a pH 6.5, y la solución resultante se agita a temperatura ambiente durante toda la noche bajo una atmósfera de argón. Las alícuotas de la mezcla de reacción se retiran a diversos intervalos de tiempo para monitorear el progreso de la reacción mediante 1H RMN. Después del término, la mezcla de reacción se diluye adicionalmente mediante la adición de agua, y se añade NaCI para lograr la saturación. Luego el producto se extrae con diclorometano, y los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran para remover el agente de secado, y el solvente se evapora mediante evaporación rotatoria. Luego el producto se precipita mediante la adición de dietil éter, y se seca bajo vacío durante toda la noche. El producto recuperado se analizó mediante cromatografía de permeación en gel para determinar el grado de conjugación. El producto sin purificar se purifica mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando resina para intercambio catiónico Poros 50 HS (PerSeptive BioSystems, Framingham, A). Después del lavado de la columna con agua deionizada, el producto se eluyó con solución de NaCI 1 N. Los extractos que contiene el conjugado se combinan, y el producto se extrae con diclorometano. La solución orgánica se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra, y el solvente se evapora mediante evaporación rotatoria. El conjugado purificado se purifica mediante la adición de dietil éter. Si es necesario, el producto se purifica adicionalmente mediante cromatografía CLAR en fase reversa utilizando una columna Betasil C18, Keystone Scientific).

EJEMPLO 15 Preparación de PEG (3500DA)-a-hidrox¡-( -butiraldehído mediante polimerización por abertura del animmo amónico de óxido de etileno directamente sobre un precursor acetal amónico En este ejemplo, un precursor acetal que tiene un sitio adecuado para iniciar polimerización por abertura del anillo con óxido de etileno se prepara al hacer reaccionar 4-clorobutiraldehído dietil acetal con el di-alcohol, etiienglicol. De esta manera, un halo-acetal se convierte a un acetal terminado en hidroxilo. El grupo hidroxilo, cuando se convierte al alcóxido aniónico correspondiente, provee un sitio para iniciar la polimerización de óxido de etileno (EO), para formar así un precursor de alcanal polimérico. El precursor de alcanal polimérico (acetal), después de la hidrólisis, se convierte al alcanal polimérico deseado. Un esquema generalizado para este método sintético para preparar un alcanal polimérico de la invención se muestra en la figura 1.

A. Preparación de 2-(4,4-dietoxi-butoxi)etanol (compuesto15A). lBuO K+ CICHjCHjCHíCHíOCHsiCHaJs + H0-0¾CH2-OH HO-CH2CH2-O-CH2CH2CH2CH(0GH2CH3)2 Una mezcla de anhidro etilenglicol (120 g, 1.93 moles), una solución de ter-butóxido de potasio 1.0 M en ter-butanol (70 mi, 0.07 moles), y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (11 g, 0.061 moles) se agita durante toda la noche a 100°C bajo una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se añade a 600 mi de agua destilada. El producto se extrae con diclorometano (150, 125, y 125 mi). Los extractos combinados se secan entonces con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destila bajo presión reducida. A continuación el producto se somete a destilación al vacío (kugelrohr, t = 90-110°C, 0.10 mm de Hg). Rendimiento 5. 5 g. 1.64 ppm (m, -CH?CH?CH. 2H), 3.37 ppm (t, -Q-CHZCH?CH?CH, 2H), 3.53 ppm (t, HO- CH2CH2Q-. 2H), 3.62 ppm (q, -CH2CI-k 4H), 3.70 ppm (t, HO- B. Preparación de PEG (3,500 Da)-a-hidroxi-co-butiraldehído dietil acetal nafthaliduro de potasio EO, THF El compuesto 15A (0.51 g, 0.00247 moles), THF 200 mi, y nafthaliduro de potasio (0.3 mol/L-solución de tetrahidrofurano, 20 mi, 0.006 moles) se añaden a un reactor de vidrio y se agitan por 3 minutos en una atmósfera de argón. El óxido de etileno (8.8 g 0.20 moles) se añade a esta solución y la mezcla de reacción se agita por 44 horas a temperatura ambiente. A continuación la mezcla se purga con argón y se añade regulador de pH con fosfato 0.1 M (pH = 8, 100 mi): La capa de THF se separa y se desecha. El naftaleno se remueve a partir de la solución mediante extracción por etil éter. El producto se extrae a partir del residuo con diclorometano (3 x 50 mi). El extracto se seca con sulfato de sodio anhidro y se concentra hasta aproximadamente 30 mi. A continuación se añade etil éter (250 mi) y la mezcla se agita 15 minutos a 0°C. El producto precipitado se filtra y se seca bajo presión reducida. Rendimiento 7.2 g. RMN (d6-D SO): 1.09 ppm (t, CH3-, 3H) 1.52 ppm (m, C-CH2- CH2-, 4H), 3.51 ppm (s, estructura base de polímero), 4.46 ppm (t, -CH, acetal, 1 H), 4.57 ppm (t-OH, 1 H).

C. PEG (3,500Da)-a-hidroxi-cú-but¡raldehído Una mezcla de PEG (3,500)-a-hidroxi-co-butiraldehído dietil acetal (1.0 g), agua desionizada (20 ml), y 5% de ácido fosfórico para ajustar el pH a 3.0 se agita por 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añade cloruro de sodio (1.0 g) y el pH se ajusta a 6.8 con hidróxido de sodio 0.1 M. El producto se extrae con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se seca con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destilada. El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 0.82 g. RMN (de-D SO): 1.75 ppm (p, -CHz-CH?-CHO-) 2.44 ppm(dt, -CHa-CHO), 3.51 ppm (s, estructura base de polímero), 4.57 ppm (t, -OH), 9.66 ppm (t,-CHO).

EJEMPLO 16 Preparación de Metoxi-PEG (3500 DA) butiraldehído Este ejemplo demuestra la preparación de un PEG-alcanal modificado en su extremo ilustrativo a partir de un PEG a-hidroxi-rn-alcanal acetal.

A. mPEG f3.500 Da)-butiraldehído dietil acetal Una mezcla de PEG (3,500 Da)-a-hidroxi-co-butiraldehído dietil acetal (3.5 g, 0.001 moles), tolueno (50 ml), solución de ter-butóxido de potasiol .O M en ter-butanol (5 ml, 0.005 moles) y metil p-tolueno sulfonato (0.75 g, 0.004 moles) se agita durante toda la noche a 45°C. A continuación, los solventes se destilan bajo presión reducida (rotoevaporador). El producto sin purificar se disuelve en diclorometano y se añadió un etil éter frío. El producto precipitado se filtra y se seca bajo presión reducida. Rendimiento: 3.1 g. RMN (d6-DMSO): 1.09 ppm (t, CH3-, 3H) 1.52 ppm (m, CH2-CH2-CH2-, 4H), 3.24 ppm (s, CH30-, 3H), 3.51 ppm (s, estructura base de polímero), 4.46 ppm (t, -CH, acetal, 1 H).

B. mPEG (3. 500 Da)-butiraldehído Una mezcla de mPEG (3, 500)-butiraldehído dietil acetal (1.0 g), agua desionizada (20 mL), y 5% de ácido fosfórico para ajusfar el pH a 3.0 se agita por 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añade cloruro de sodio (1.0 g) y el pH se ajusta a 6.8 con hidróxido de sodio 0.1 M. El producto se extrae con diclorometano (3 x 20 mi). El extracto se seca con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destilada. El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 0.85 g. RMN (de-DMSO): 1.75 ppm (p, -CHz-CH?-CHO-, 2H) 2.44 ppm (dt, -CHICHO, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, estructura base de polímero), 9.66 ppm (t,- CHO, 1 H).

EJEMPLO 17 Preparación de metoxi-PEG(2 kDA) 2-Metilbutiraldehído Este ejemplo describe la síntesis de un polímero alcanal 2-alquilo sustituido ilustrativo de la invención. Este polímero, en vez de poseer una cadena alquileno recta que separa el carbono del aldehido a partir del enlazador, posee un sustituyente metilo en la posición C-2. Revisión general: El reactivo acetal protegido, 17-A, se preparó a partir de una materia prima comercialmente disponible, 2-metil-4-clorobutanoato, mediante la reducción inicial del carbono del butanoato hacia el alcohol correspondiente, seguido por oxidación al butiraldehído. Luego el butiraldehído se protegió como el acetal correspondiente para proveer un reactivo acetal protegido para acoplamiento al PEG. Después del acoplamiento al PEG, el polímero acetal resultante se hidroliza en ácido para proveer el alcanal polimérico deseado.

A. Preparación de 4-cloro-2-metilbutiraldehído dietil acetal Preparación de 4-cloro-2-metilbutanol-1 Una solución de 2-metil 4-clorobutanoato (TCI America) (22.0 g, 0146 moles) en etil éter (80 mi) se añadió gota a gota durante 30 minutos a una solución en agitación de hidruro de litio aluminio (4.55 g, 0.12 moles) en etil éter (360 mi) a 0°C bajo atmósfera de argón. A continuación se añadió metanol (12 mi) gota a gota por un periodo de 30 minutos y luego se añadió HCI 2N gota a gota enfriado con hielo (420 mi) durante un periodo de 20 minutos. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de separación y se separó la capa de éter, que contiene 4-cloro-2-metilbutanol-1. El producto adicional se extrajo a partir de la capa de agua con etil éter (3 x 200 mi). Los extractos de éter se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio anhidro, y el solvente se destiló abajo presión reducida. Rendimiento 18.6 g. RMN (d6-DMSO): 0.84 ppm (d, -CH3, 3H), 1 .50 ppm (m, -CH?CH?CI, 1 H), 1 .68 ppm (m, -CH-, 1 H), 1.82 ppm (m, -CH2CH?CI. 1 H) 3.26 ppm (t, -CH2OH, 2H), 3.66 ppm (m, -CH2CI, 2H), 4.50 ppm (t, -OH, 1 H). 4-Cloro-2-metilbutiraldehído El clorocromato de piridinio (23.6 g, 0.1 10 g) se añadió gradualmente a una solución en agitación de 4-cloro-2-metilbutanol-1 (8.80 g, 0.078 moles) en diclorometano anhidro (470 mi). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Se añadió éter seco (820 mi); la mezcla se agitó por 20 minutos, y luego se filtró para remover el exceso de agente oxidante. Luego la solución se filtró a través de una columna llenada con 400 g de Florisil, y los solventes se destilaron bajo presión reducida. Rendimiento 6.0 g. RMN (de-DMSO): 1.06 ppm (d, -CH3, 3H), 1 .74 ppm (m, -CH¿ CH2CI, 1 H), 2.14 ppm (m, -CH2CH?CI. 1 H), 2.56 ppm (m, -CH, 1 H), 3.69 ppm (m, -CH2CI, 2H), 9.60 ppm (t, -CHO, 1 H). 4-Cloro-2-metilbuteraldehído dietil acetal Una mezcla de 4-cloro-2-metilbutiraldehído (4.8 g, 0.040 moles), trietil ortoformato (6.48 g, 0.044 moles), alcohol etílico (3.0 g), y ácido p-toluensulfónico monohidratado (0.0144 g, 0.000757 moles) se agitó a 45°C durante toda la noche bajo una atmósfera de argón. A continuación, después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió Na2CÜ3 (0.40 g) y la mezcla se agitó por 15 minutos. La mezcla de reacción se filtró y se destilaron alcohol etílico y trietil ortoformato residual bajo presión reducida. El residuo se sometió a destilación fraccional al vacío produciendo 3.2 g de 4-cloro-2-metilbutiraldehído dietil acetal puro. RMN (d6-DMSO): 0.85 ppm (d, -CH3, 3H) 1.13 ppm (m, -CH3, 6H), 1.52 ppm (m, -CH-, 1 H), 1 .87 ppm (m, -CH?CH?CI. 2H), 3.35-3.75 ppm (bm, -OCHpCHs, 4H, y -CH2CI, 2H), 4.22 ppm (d, -CH acetal, 1 H).

B. mPEG (2KDa)-2-Metilbutiraldehído. dietil acetal Una solución de mPEG (2K Da) (2. Og, 0.001 moles) en tolueno (30 mi) se secó azeotrópicamente mediante destilación del tolueno bajo presión reducida. El mPEG 2K seco se disolvió en tolueno anhidro (15 mi) y se añadieron solución de ter-butóxido de potasio 1 .0 M en ter-butanol (4.0 mi, 0.004 moles) y 4-cloro-2-metilbutiraldehído dietil acetal a partir de A anteriormente mencionado (0.5 g, 0.00277 moles). A continuación, se añadió bromuro de litio (0.05 g) y la mezcla se agitó a 100°C durante toda la noche bajo una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se añadió a 150 mi etil éter a 0-5°C. El producto precipitado se filtró y se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 1.5 g. RMN (ds-DMSO): 0.83 ppm (d, -CH3, 3H) 1.10 ppm (m, -CH30, 6H), 1.24 ppm (m, -CH-, 1 H), 1.72 ppm (m, PEG-0-CH?-CHr, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, estructura base de polímero), 4.18 ppm (d, -CH acetal, 1H). Sustitución: -100%.

C. mPEG (2KDa)-2-Metilbutiraldehído Una mezcla que contiene mPEG (2K Da)-2-metilbutiraldehído, dietil acetal a partir de B anteriormente mencionado (1.0 g), agua desionizada (20 mi), y ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3.0 se agitó por 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió cloruro de sodio (1.0 g) y el pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de sodio 0.1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló bajo presión reducida. Rendimiento: 0.83 g. RMN (d6-DMSO): 1.01 ppm (d, -CH3, 3H) 1.56 ppm (m,-CH, 1 H), 1.90 ppm (m, PEG-Q-CH?-CH -. 1 H), 2.45 ppm (m, PEG-0-CH?-CHr.1 H). 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, estructura base del polímero), 9.56 ppm (d, -CH aldehido, 1 H). Sustitución: ~100%.

Claims (129)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polímero soluble en agua que tiene la estructura: en donde: POLY es un segmento poiimerico soluble en agua; X' es una porción enlazadora; z" es un entero de 1 a aproximadamente 21 ; R1, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido; R2, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, y adicionalmente en donde lo siguiente aplica: -cuando POLY es lineal: (a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero es 0 ó 2 o mayor excepto cuando X' comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-), (b) y adicionalmente en donde X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-) y z' es de 2 a 12, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, en donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y -cuando POLY es ramificado: (c) ya sea (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o (i¡) X' incluye -(CH2CH2O)b- en donde b es de 1 a aproximadamente 20 en el caso en donde POLY comprende un residuo de lisina, (d) y adicionalmente en donde dicho POLY tiene 2 brazos poliméricos, entonces ningún brazo polimérico comprende oxígeno puesto que el único heteroátomo en el caso en donde POLY comprende "C-H" como un punto de ramificación. 2.- El polímero de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque z' tiene un intervalo de 2 a 21 o de 3 a 12. 3.- El polímero de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene una estructura seleccionada a partir de:

I-A

I-B

I-C en donde en cada una de las estructuras anteriormente mencionadas, POLY, X', cada R1, cada R2 y cada R3 son como se definieron previamente. 4. - Cualesquiera de las estructuras poliméricas que se reclaman en la reivindicación 3, en las que R1 unido a C2 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H.

5. - Cualesquiera de las estructuras poliméricas que se reclaman en la reivindicación 4, en las que R unido a C2 es alquilo inferior.

6. - Cualesquiera de los polímeros que se reclaman en la reivindicación 3, en los que R1 unido a C3 es alquilo, y todas las otras variables R1 y R2 son H.

7. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque X' comprende una porción que corresponde a la estructura: -(CH2)c-De-(CH2)f. o -(CMi M CíC -IC-CCHz en donde: c es cero a 8, D es O, NH, o S, e es 0,1 , f es cero a 8, p es cero a 8, M es -NH, O, K es NH, O, q es de cero a 8, y r y s son cada uno independientemente 0, 1.

8. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque X' comprende -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g-, y b y g son cada uno independientemente 1 a 20.

9. - El polímero de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque los valores de b y g cada uno tiene un intervalo independientemente a partir de 1 a 10 o de 1 a 6.

10. - El polímero de conformidad con reivindicación 7, caracterizado además porque X" comprende: -iCH2)c-Dt-(CH2)i-P- o -(CHj rCCOJ-K CHa -en donde: P y T son cada uno independientemente -(CH2CH20) - o -(CH2CH2NH)g, b y g son cada uno independientemente 1 a 20, y las variables remanentes son como se definieron en la reivindicación 7.

11. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque dicho X' comprende -C(0)NH-(CH2)i-6NH-C(0)- o -NHC(0)NH-(CH2)i-6NH-C(0)-.

12. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque POLY se selecciona a partir del grupo que consiste de poli(óxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, poli(acriloilmorfolina), y poli(poliol oxietilado).

13. - El polímero de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque POLY es poli(óxido de alquileno).

14. - El polímero de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque POLY es poli(etilenglicol).

15. - El polímero de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) está modificando terminalmmente con la porción modificadora del extremo seleccionada a partir del grupo que consiste de alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido.

16. - El polímero de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción modificadora del extremo se selecciona a partir del grupo que consiste de metoxi, etoxi, y benciloxi.

17. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene una masa molecular promedio nominal seleccionada a partir del grupo que consiste de aproximadamente 100 daltones a aproximadamente 100,000 daltones, de aproximadamente 1 ,000 daltones a aproximadamente 50,000 daltones, y de aproximadamente 2,000 daltones a aproximadamente 30,000 daltones.

18. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado además porque dicho poli(etilenglicol) tiene una estructura seleccionada a partir del grupo que consiste de estructuras lineales, ramificadas y bifurcadas.

19. - El polímero de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 7-14, caracterizado además porque comprende la estructura: II en donde POLY, cada X', cada (?'), y cada R y cada R2 son como se definieron previamente.

20. - El polímero de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho POLY es lineal y el polímero es homobifuncional.

21. - El polímero de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho poli(etilenglicol) comprende la estructura: Z-(CH2CH20)e- o Z-íCHiCIfcO CHzCHz-, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z comprende una porción seleccionada a partir del grupo que consiste de hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina, y fluoresceína.

22.- El polímero de conformidad con ia reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene una estructura selecciona a partir del grupo que consiste de: PEG-(CH2)a — HI-A III-C IV-C en donde PEG es poli(etilenglicol), y b y g son cada uno independientemente 0 a 20, a es 0 a 6, y las variables remanentes son como se definieron anteriormente en la reivindicación 1 .

23. - El polímero de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque PEG tiene una estructura que es lineal, ramificada, o bifurcada.

24. - El polímero de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizado además porque los valores para b, g, z', y a se seleccionan cada uno independientemente a partir del grupo que consiste de: (i) b y g independientemente tienen un intervalo de 1-8 o de 1-6, (ii) z tiene un intervalo de'2 a 6, o es 3, y (iii) a es 0 ó 1 .

25. - El polímero de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tiene la estructura: III-D

26. - El polímero de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque "PEG" tiene una la estructura que corresponde a: Z-(CH2CH20)„- , o O II Z-(CH2CH20)n-C — NH O | Z-fCHsCHzOyC- H—CH — V en donde n en cada caso es independientemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z comprende una porción seleccionada a partir del grupo que consiste de hidroxi, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, fosfolípido, biotina, y fluoresceína.

27. - El polímero de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque Z es alcoxi, y n en cada caso es el mismo y tiene un intervalo de aproximadamente 100-600. 28. - El polímero de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura:

VI-A o PEG†(CH2), -NH-C-NH -(CHzCH^ icHC-H

Vl-B en donde: PEG es un poli(etilenglicol) que es lineal o ramificado, b es 0 a 20, s es 0 a 6, d es 1 , 2 ó 3, y las variables remanente son como se definieron de conformidad con la reivindicación 1. 29.- El polímero de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque d es 2 y PEG corresponde a la estructura: o " H Z-(CH2CHsjO)n-C -N-CH en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, Z comprende una porción seleccionada a partir del grupo que consiste de hidroxi, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acriiato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotíocianato, maleimida, viniisulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, fosfolípido, biotina, y fluoresceína, y las variables remanentes son como se definieron en la reivindicación 28.

30.- Una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura: VII en donde: POLY es un segmento polimérico soluble en agua; X' es una porción enlazadora;y z' es un entero de 1 a aproximadamente 21 , y dicha composición carece de cantidades detectables de especies que contienen yodo o productos de reacción tipo retro-Michael.

31.- Una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura:

VII en donde: POLY es un segmento polimérico soluble en agua modificado terminalmente, lineal; X' es una porción enlazadora, z' es un entero de 1 a aproximadamente 21, y dicha composición carece de cantidades detectables de derivados de dialdehído polimérico. 32. - La composición de conformidad con la reivindicación 30 ó 31 , caracterizada además porque z" es un entero seleccionado a partir del grupo que consiste de 2 a 31 , de 3 a 12, y de 3 a 8.

33. - La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizada además porque POLY se selecciona a partir del grupo que consiste de un un poli(óxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, poli(acriloilmorfolina), y poli(poliol oxietilado).

34. - La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque POLY es un poli(etilenglicol).

35. - La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizada además porque dicho polímero comprende la estructura: VH-A

36. - La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque X' comprende una porción que corresponde a la estructura: -<CH2)c-De-(CH2)f- o -(CHjJp-Mr-CXO-IC-ÍCHz en donde: c es cero a 8, D es O, NH, o S, e es 0. 1 , f es cero a 8, p es cero a 8, M es -NH, O, K es NH, O, q es de cero a 8, y r y s son cada uno independientemente 0, 1.

37. - La composición de conformidad con cualesquiera de las 5 reivindicaciones 30-34, caracterizada además porque X' es hidrolíticamente estable.

38. - La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30-35, caracterizada además porque dicho polímero comprende la estructura: en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000.

39. - La composición de conformidad con cualesquiera de las 5 reivindicaciones 30-34, caracterizada además porque X' incluye una porción oligomérica que corresponde a la estructura -(CH2CH20)b- o -(CH2CH2NH)g-, en donde b y g son cada uno independientemente 1 a 20.

40. - La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicha porción oligomérica está covalentemente unida al C4 del metileno.

41. - La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque dicho X' comprende -C(0)NH-(CH2CH20)b-, - OC(0)NH-(CH2CH20)b-, C(0)NH-(CH2CH2NH)g-, o -OC(0)NH-(CH2CH2NH)g-.

42. - Una forma hidrato o acetal del polímero soluble en agua de cualesquiera de las reivindicaciones precedentes.

43. - El acetal de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho acetal se selecciona a partir del grupo que consiste de dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil)acetal, S.S'-dimetil acetal, y S,S'-dietil acetal, y dioxolanos.

44. - Un conjugado formado mediante la reacción de una molécula blanco que contiene al menos un grupo amino reactivo con el polímero que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 41.

45. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dicha molécula blanco es un agente biológicamenete activo.

46. - Un conjugado que comprende la siguiente estructura: POLY x -| c H- reactivo biológicamente activo I z X en donde: POLY es un segmento polimérico soluble en agua; X' es una porción enlazadora; z' es un entero de 1 a aproximadamente 21; R1, en cada caso es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido; R2, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste el alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, -"NH-agente biológicamente activo" representa un agente biológicamente activo que comprende un grupo amino, y adicionalmente en donde aplica la siguiente: -cuando POLY es lineal: (a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero es 0 ó 2 o mayor excepto cuando X' comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-), (b) y X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-) y z' es de 2 a 12, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, en donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y -cuando POLY es ramificado: (c) entonces ya sea al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se definió anteriormente o X' incluye -(CH2CH2O)t>- en donde b es de 1 a aproximadamente 20, y adicionalmente en el caso en donde POLY comprende un residuo de Usina, (d) y tiene 2 brazos poliméricos, entonces ningún brazo polimérico comprende oxígeno como el único heteroátomo en el caso en donde POLY comprende "C-H" como un punto de ramificación.

47. - Un hidrogel que se forma utilizando el polímero soluble en agua que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 41.

48. - Un aldehido protegido que comprende la estructura selecciona a partir del grupo que consiste de: Xl-A XI-B XI-C en donde: ?' es un entero de 1 a 21 ; R1, en cada caso, es independientemente H o radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido; R2, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, Wa y Wb son cada uno independientemente O ó S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H, o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de metió, etilo, isopropilo, bencilo, 1 ,1 ,1 -tricloroetilo, y nitrobencilo, o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o -??^-, formando un anillo de 5 ó 6 miembros cuando se considera junto con Wa, Ci , y Wb, b y g son cada uno independientemente 1 a 20, y G es un grupo funcional.

49.- El aldehido protegido de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque G es un grupo residual.

50.- El aldehido protegido de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque G se selecciona a partir del grupo que consiste de Cl, Br, para-tolilsulfonato éster, metilsulfonil éster, trifluorosulfoniléster, y trifluoroetilsulfonil éster.

51. - El aldehido protegido de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque G es un grupo funcional seleccionado a partir del grupo que consiste de -OH, -NH2, -SH, y temas protegidas de los mismos.

52. - Un método para formar un alcanal polimérico soluble en agua, opcionalmente en forma protegida, dicho método comprende los pasos de: hacer reaccionar un polímero soluble en agua que comprende al menos un grupo reactivo, Y, con un reactivo alcanal protegido que comprende de aproximadamente 2 a 20 átomos de carbono y un grupo reactivo, K, adecuado para el desplazamiento mediante o alternativamente, reacción con Y, bajo condiciones efectivas para formar un alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida.

53. - El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque dicho paso de reacción se lleva a cabo en un solvente orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de tolueno, cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo, acetona, dioxano, metanol, y etanol.

54. - El método de conformidad con la reivindicación 52 ó 53, caracterizado además porque comprende hidrolizar a dicho alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida bajo condiciones ácidas para formar así el alcanal polimérico soluble en agua correspondiente.

55. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque dicha hidrólisis se lleva a cabo en un solvente acuoso.

56. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 52-55, caracterizado además porque dicho reactivo alcanal comprende 4 o más átomos de carbono.

57. - El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque dicha hidrólisis se lleva a cabo a un pH no menor de aproximadamente 3.

58. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 52-57, caracterizado además porque dicho reactivo alcanal se pritege como un acetal.

59. - El método de conformidad con la reivindicación 52 ó 53, caracterizado además porque dicho polímero soluble en agua comprende la estructura, POLY-Y, y dicho reactivo alcanal protegido comprende la estructura, XI-D en donde: ?' es un entero de 1 a aproximadamente 21 ; R1, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido; R2, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, y arilo sustituido, Wa y Wb son cada uno independientemente O ó S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H o un radical orgánico seleccionado a partir del grupo que consiste de metilo, etilo, isopropilo, bencilo, 1 ,1 ,1-tricloroetilo, y nitrobencilo, o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3-. formando un anillo se 5 ó 6 miembros cuando se considera junto con Wa, C-i , y Wb.

60. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque POLY se selecciona a partir del grupo que consiste de un poli(óxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, poli(acriloilmorfolina), y poli(poliol oxietilado).

61. - El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque POLY es un poli(etilenglicol).

62.- El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque: POLY-Y comprende la estructura Z- (CH2CH20)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4,000, y Z se selecciona a partir del grupo que consiste de -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2(C6H5), y K se selecciona a partir del grupo que consiste de: n— ? O O O O Cl, Br, CH3-- \~|- , O — ¾_ CF3— S- CF3av-S- W O % ' d * ¾ en donde: R1 y R2 son cada uno independientemente H o un alquilo inferior, y

Wa y Wb son cada uno O. 63.- El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque dicho alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida se forma a una rendimiento mayor de 85%.

64. - El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque comprende adicionalmente hidrolizar dicho alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida bajo condiciones acidas para formar así el alcanal polimérico soluble en agua en una mezcla de reacción.

65. - El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de aislar dicho alcanal a partir de la mezcla de reacción para proveer un alcanal aislado.

66. - El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho alcanal aislado carece de cantidades detectables de Z-(CH2CH20)nH y productos de reacción tipo retro- ichael. 67. - El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho alcanal aislado tiene una pureza de al menos aproximadamente 95%, basándose en los contaminantes poliméricos. 68. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 59-61 , caracterizado además porque: POLY-Y comprende la estructura HO-(CH2CH20)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y K se selecciona a partir del grupo que consiste de:

O. Br, en donde: 1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo inferior, y Wa y Wb son cada uno O, para formar un alcanal en forma protegida que tiene la estructura:

XII 69.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 59-61 , caracterizado además porque: POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z es hidroxilo protegido, y K se selecciona a partir del grupo que consiste de:

CI. Br, en donde: R1 y R son cada uno independientemente H o alquilo inferior, y Wa y Wb son cada uno O.

70.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque comprende adicionalmente después de dicho paso de reacción, desproteger a dicho hidroxilo protegido para formar y convirtiendo dicho -OH terminal en el poli(etilenglicol) hacia un grupo funcional diferente a hidroxilo.

71. - El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque dicho grupo se selecciona a partir del grupo que consiste de amino, éster, carbonato, aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, y silano.

72. - El método de conformidad con la reivindicación 70 ó 71 , caracterizado además porque comprende el paso de hidrolizar dicho alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida bajo condiciones ácidas para así formar el alcanal polimérico correspondiente soluble en agua.

73. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 59-61 , caracterizado además porque Y es dicho POLY-Y en un grupo ionizable o es un derivado de un grupo ionizable, y ha sido purificado mediante cromatografía antes de su uso en dicho paso de reacción.

74. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque POLY-Y para uso en dicho paso de reacción carece esencialmente de cantidades de impurezas poliméricas.

75. - El método de conformidad con la reivindicación 52 ó 53, caracterizado además porque dicho reactivo alcanal comprende la estructura: W¾3 K— (CHaCHgNH -C- — Cj— w I *· H XI-F R1 W*R3 — (CHjCHgOJb I I ,· H en donde g y b tienen un intervalo independientemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.

76.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo inferior, y Wa y Wb son cada uno O.

77. - El método de conformidad con la reivindicación 75 ó 76, caracterizado además porque K es una porción que comprende un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste de ácido carboxílico, éster activo, amina, carbonato activo, e isocianato. 78. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 75-77, caracterizado además porque dicho reactivo alcanal comprende la estructura: R OR3 I H2- (CH2CH20)b -c- -Cr-OR4 R2 l H

XI-H y el producto de dicho paso de reacción comprende una estructura:

PEG —

IX-B 79. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 75-78, caracterizado además porque comprende el paso de hidrolizar dicho alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida bajo condiciones ácidas para formar el alcanal polimérico soluble en agua conjugar correspondiente a un rendimiento mayor del 50%. 80. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 52-79, caracterizado además porque comprende el paso de conjugar dicho alcanal polimérico soluble en agua con un agente biológicamente activo que comprende un grupo amino. 81. - Un compuesto que tiene la estructura:

(C¾)4 I mPEG-OC(0)-NH- CH C(Oym CH1CH20)4-CH¿CH2CH2CH2- -hGH en donde hGH representa una hormona de crecimiento de humano que comprende un aminoácido N-terminal; y en donde cada mPEG representaun grupo metoxi-polietilenglicol que tiene una masa molecular entre 18,000 a aproximadamente 22,000 daltones.

82. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado además porque mPEG tiene una masa molecular promedio nominal de aproximadamente 20,000 daltones.

83. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque el compuesto exclusivo de hGH, tiene una polidispersión de menos de aproximadamente 1.2.

84. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque el compuesto exclusivo de hGH, tiene una polidispersión de menos de aproximadamente 1.1.

85.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque el compuesto exclusivo de hGH, tiene una polidispersión de menos de aproximadamente .05.

86.- El compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 81 , 82, 83, 84, u 85, caracterizado además porque la hGH, está covalentemente unida a través de la amina secundaria al aminoácido N-terminal de la hGH.

87.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 81 , 82, 83, 84, 85, u 86, caracterizado además porque el compuesto está mono-polietilenglicosilado.

88. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado además porque la hGH está mono-polietilenglicosilada principalmente en el aminoácido N-terminal de hGH.

89. - El compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, ú 88, caracterizado además porque la hGH es hGH recombinante.

90. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado además porque la hGH recombinante se produce en E. coli.

91. - El compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ó 90, caracterizado además porque el compuesto es un compuesto purificado.

92. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 91 , caracterizado además porque el compuesto de purifica mediante cromatografía.

93. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado además porque el compuesto de purifica mediante cromatografía en columna de intercambio iónico.

94. - Un conjugado formado mediante la reacción del polímero 5 con una hormona de crecimiento de humano (hGH) que comprende un aminoácido N-terminal, en donde el polímero tiene la estructura: y en donde cada mPEG representa un grupo metoxi-polietilenglicol que tiene una masa molecular entre aproximadamente 18,000 a aproximadamente 22,000 daltones; (ejemplo 13, ejemplo 5 (porción polimérica), reivindicación 90, página 11 , líneas 14-16), página 37, estructura V-B, página 40, líneas 10-5 12.

95. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado además porque cada mPEG tiene una masa molecular promedio nominal de aproximadamente 20,000 daltones.

96. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado además porque el polímero tiene una masa molecular promedio nominal de aproximadamente 40,000 daltones.

97. - El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94, 95 ó 96, caracterizado además porque el polímero tiene una polidispersión de menos de aproximadamente 1.2.

98. - El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94, 95 ó 96, caracterizado además porque el polímero tiene una polidispersión de menos de aproximadamente 1.1.

99. - El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94, 95 ó 96, caracterizado además porque el polímero tiene una polidispersión de menos de aproximadamente 1.05.

100.- El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94, 95, 96, 97, 98 ó 99, caracterizado además porque el conjugado es principalmente un conjugado mono-polietilenglicosilado.

101. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado además porque el conjugado está mono-polietilenglicosilado principalmente en el extremo N-termínal de hGH.

102. - El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94-101 , caracterizado además porque la hGH es hGH recombinante.

103. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado además porque la hGH recombinante se produce en E. coli.

104. - El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102 o 103, caracterizado además porque el conjugado se forma mediante la reacción del polímero con la hGH en una mezcla de reacción bajo condiciones de aminación reductora.

105. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado además porque en la mezcla de reacción la relación molar inicial del polímero a la hGH es menor que o igual a aproximadamente 5.

106. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además porque el conjugado se separa a partir de la mezcla de reacción.

107. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado además porque el conjugado se separa mediante cromatografía a partir de la mezcla de reacción.

108. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además la separación cromatográfica es mediante un intercambio iónico.

109.- Una composición que comprende el compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 81-93, y un excipiente farmacéutico.

110.- La composición de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada además porque el excipiente farmacéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tensioactivos, reguladores de pH, ácidos y bases.

111. - La composición de conformidad con la reivindicación 109 ó 110, caracterizada además porque la composición está en forma líquida.

112. - La composición de conformidad con la reivindicación 109 ó 110, caracterizada además porque la composición está en forma sólida.

113.- La composición de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada además porque la forma sólida es un polvo liofilizado.

114.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 109, 110, 111, 112 o 113, caracterizada además porque está en forma de dosis unitaria.

115.- La composición de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada además porque la composición se almacena en un contenedor de dosis unitaria.

116.- La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada además porque el contenedor es una jeringa.

117.- El uso de un compuesto como el que se utiliza en cualesquiera de las reivindicaciones 81-93, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una condición que se puede tratar mediante administración de hGH.

118. - Una composición que comprende el conjugado que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 94-108, y un excipiente farmacéutico.

119. - La composición de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada además porque el excipiente farmacéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tensioactivos, reguladores de pH, ácidos y bases.

120. - La composición de conformidad con la reivindicación 118 ó 119, caracterizada además porque la composición está en forma líquida.

121. - La composición de conformidad con la reivindicación 118 ó 119, caracterizada además porque la composición está en forma sólida.

122. - La composición de conformidad con la reivindicación 121 , caracterizada además porque la forma sólida es un polvo liofilizado.

123.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 118, 119, 120, 121 o 122, caracterizada además porque está en forma de dosis unitaria.

124. - La composición de conformidad con la reivindicación 123, caracterizada además porque la composición se almacena en un contenedor de dosis unitaria.

125. - La composición de conformidad con la reivindicación 124, caracterizada además porque el contenedor es una jeringa.

126. - El uso de un conjugado como el que se utiliza en cualesquiera de las reivindicaciones 94-108, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una condición que se puede tratar mediante administración de hGH.

127. - Un procedimiento para preparar el conjugado que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 94-108, que comprende el paso de hacer reaccionar hGH con el polímero en una mezcla de reacción bajo condiciones de aminación reductora; y separar opcionalmente el conjugado de la mezcla de reacción.

128. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado además porque la mezcla de reacción tiene un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8.

129. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado además porque la mezcla de reacción tiene un pH entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7.5.