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KR20050093856A - 수용성 중합체 알카날 - Google Patents

수용성 중합체 알카날 Download PDF

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KR20050093856A
KR20050093856A KR1020057014173A KR20057014173A KR20050093856A KR 20050093856 A KR20050093856 A KR 20050093856A KR 1020057014173 A KR1020057014173 A KR 1020057014173A KR 20057014173 A KR20057014173 A KR 20057014173A KR 20050093856 A KR20050093856 A KR 20050093856A
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KR
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polymer
conjugate
peg
hgh
composition
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Withdrawn
Application number
KR1020057014173A
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Inventor
안토니 코즈로브스키
Original Assignee
넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 수용성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 의 알카날 유도체, 이들의 대응 수화물 및 아세탈, 그리고 상기 중합체 알카날의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 중합체 알카날은 고순도로 제조되며, 저장 안정성을 나타낸다.

Description

수용성 중합체 알카날 {WATER-SOLUBLE POLYMER ALKANALS}
본 발명은 수용성 중합체의 특정 알데히드 유도체, 및 상기 중합체 알데히드 유도체의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
최근 수년간, 인간 치료제는 과거의 전통적 소분자 약물로부터 바이오약물 영역으로 확장되어 왔다. 신규 단백질 및 펩티드의 발견은 여러 단백질 및 폴리펩티드 바이오약물의 개발을 유도하였다. 불행히도, 단백질 및 폴리펩티드는 치료제로 사용되는 경우, 종종 이들을 제형화하거나 투여하기 어렵게 만드는 특성, 예컨대 짧은 순환 반감기, 면역원성, 단백분해 및 낮은 용해도를 나타낸다. 바이오약물의 약동학적 또는 약역학적 특성을 개선시키기 위한 하나의 접근법은 천연 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 로의 콘쥬게이션이다. PEG 의 치료 단백질로의 공유 부착은 여러 장점, 예컨대 하기를 제공할 수 있다: (i) 단백질의 항원성 에피토프를 차폐하여 그 세망내피계 제거 및 면역계에 의한 인지를 감소시킴, (ii) 단백분해 효소에 의한 분해를 감소시킴, 및 (iii) 신장 여과를 감소시킴.
바이오약물, 예컨대 펩티드에 대한 커플링을 위한 중합체 유도체의 개발, 특히 단백질의 반응성 아미노기에 대한 커플링을 위한 중합체 유도체의 개발에 많은 노력이 기울여져 왔다. 상기 중합체 유도체는 친핵제와의 반응에 적합한 친전자기, 예컨대 아민을 보유하므로, '친전자적으로 활성화된' 것으로 불린다. 상기 PEG 유도체의 예에는 PEG 디클로로트리아진, PEG 트레실레이트, PEG 숙신이미딜 카르보네이트, PEG 카르보닐이미다졸, 및 PEG 숙신이미딜 숙시네이트가 포함된다. 불행히도, 상기 특정 시약의 사용은 하기 중 하나 이상을 야기할 수 있다: 커플링을 수행하는데 필요한 반응 조건 하에서의 바람직하지 못한 부작용, 선택성의 부재, 및/또는 바이오약물 및 PEG 간의 약학 (즉, 불안정한) 연결의 형성.
상기 문제점을 극복하고자 하는 시도로, 여러 신규 또는 "2 세대" 친전자적으로 활성화된 PEG, 예컨대 PEG 프로피온알데히드 및 PEG 아세트알데히드가 개발되어 왔다 (예를 들어, U.S. 특허 제 5,252,714 및 5,990,237 을 각각 참고). 알데히드 유도체는 알데히드가 아민과만 반응하므로 (즉, 이들의 부착 화학이 선택적임), 단백질 및 다른 바이오분자에 대한 커플링을 위해 특히 선호되는 시약이다. 상기 언급된 시약은 여러 장점을 제공한다: 이들은 PEG 디올 오염의 문제점을 회피하도록 제조될 수 있고, 저분자량 mPEG 에만 제한되지 않으며, 커플링 시 안정한 아민 연결을 형성하고, 선택적이다. 상기 주지된 유도체가 1 세대 PEG 시약에 비해 여러 장점을 제공함에도 불구하고, 본 출원인들은 상기 알데히드 시약을 특정 상황에서 덜 이상적으로 만드는 일부 특정 단점을 인지하였다.
보다 구체적으로, 본 출원인들은 상기 시약을 이용한 광범위한 작업에 있어서, PEG 아세트알데히드가 특히 염기성 매질 중에서 매우 불안정하며, 반응 혼합물의 중화로 생성되는 과도한 염 형성으로 인해 단리하기 어렵다는 것을 인지하였다. 특히, PEG 아세트알데히드는 알돌 축합을 통해 이량체화되기 매우 쉽다. PEG 프로피온알데히드는 그 안정성의 견지에서는 훨씬 더 우수한 시약이지만, PEG 프로피온알데히드 생성물을 고순도로 수득하기 어렵게 만드는, 그 제조 도중 일어날 수 있는 부반응으로 인한 일부 단점을 보유한다.
보다 구체적으로, 본 출원인들은 그 전구체 PEG 알데히드 수화물로부터 PEG 프로피온알데히드를 원 위치에서 제조하는 경우, 상당분의 아세탈 시약을 소비하는 제거 반응으로 인해 산물 수율이 일반적으로 단지 약 50% 임을 발견하였다. PEG 프로피온알데히드의 합성을 위한 개선된 합성 경로, 즉 3-히드록시프로피온알데히드 디에틸 아세탈과 PEG 메실레이트의 염기 촉매 반응을 통한 경로가 채용될 수 있음에도 불구하고, 본 출원인들은 상기 반응 경로가 또한 모 (parent) 디히드록시 PEG (또한 PEG 디올로 불림) 을 제거하기 어렵게 만들고 불안정한 상당량의 PEG 비닐 에테르를 생성하는 제거 부반응을 야기한다는 것을 발견하였다. 결과적으로, 상기 반응의 수율은 일반적으로 약 85 내지 90% 미만이다. 또한, 상기 기재된 PEG 프로피온알데히드 합성 중 하나의 이용은 매우 낮은 pH, 예컨대 2 이하의 pH 에서 아세탈 중간체의 가수분해를 필요로 한다. 상기와 같이 낮은 pH 에서의 가수분해는 반응 혼합물을 콘쥬게이션에 적합한 pH 로 중화시키기 위해 필요한 다량의 염기로 인해 바람직하지 않다. 또한, 염기성 pH 에서 PEG 프로피온알데히드의 단백질로의 커플링은 제거하기 무척 어려운 상당량의 아크롤레인 (역-Michael 형 부반응으로 얻어짐) 의 형성으로 인해 문제가 될 수 있다. 상기 바람직하지 못한 부 생성물의 형성은 약품 등급 제품을 수득하기 위해 광범위한 정제를 필요로 한다.
따라서, 생물학적 활성 분자 및 표면에 콘쥬게이션시키기 위한, 개선된 친전자적으로 활성화된 중합체 유도체, 특히 하기와 같은 중합체 유도체가 요구되고 있다: (i) 이들의 커플링 화학이 선택적이며, (ii) 고수율로 적은 반응 단계로도 제조될 수 있고, (iii) 광범위한 pH 에 걸쳐 안정하고, (iv) 쉽게 단리될 수 있고, (iv) 고순도로 (즉, 실질적으로 중합체 유래 불순물 및 부산물이 없이) 제조될 수 있고, 및 (v) 공지된 중합체 유도체의 단점, 예컨대 상기 기재된 것들의 적어도 일부가 극복됨.
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로써, 본 발명의 목적은 고순도로 제조되며, 저장 안정성을 나타내는 수용성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)의 알카날 유도체, 이들의 대응 수화물 및 아세탈, 그리고 상기 중합체 알카날의 제조 및 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 중합체 알카날의 특정 패밀리-즉, 하나 이상의 삽입 탄소 원자로 중합체 절편에 커플링된 하나 이상의 알데히드 관능부를 포함하는 중합체를 제공한다.
본 발명의 중합체 알카날은 대부분의 경우 선행 기술의 알데히드 유도체 보다 덜 반응성이며, 따라서 보다 선택적이다. 또한, 본 발명의 중합체 알카날은 고수율로 제조되며, 특정 구조는 간단한 1 단계 공정으로 제조될 수 있다. 본원에 기재되는 특정 중합체 알데히드는 이전에 공지된 알데히드 유도체보다 염기성 pH 에서 보다 안정하고, 상당량 또는 검출가능한 양의 역-Michael 형 반응 부 생성물 없이 형성된다. 또한, 본 발명의 중합체 알카날은 온화한 산성 조건 하에, 즉 PEG 아세트알데히드 또는 PEG 프로피온알데히드에 대해 요구되는 것보다 훨씬 덜 가혹한 산성 조건 하에 가수분해에 의해 대응 아세탈 전구체로부터 형성된다. 이러한 온화한 조건은 개입하는 단리 단계를 필요로 하지 않으며 본 발명의 중합체 유도체와 단백질, 펩티드 또는 다른 분자 표적의 직접적인 원 위치 콘쥬게이션을 가능케 한다. 본 발명의 중합체 알카날은 또한 고순도로 제조되어, 이들을 특히 약물 및 바이오약물 커플링에 유리하게 만들어서, 포유류 대상체에 투여하기 충분한 순도를 갖는 중합체 콘쥬게이트 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 수용성 중합체에 관한 것이다:
[화학식 I]
상기 구조에 있어서, POLY 는 수용성 중합체 절편을 나타내며; X' 은 링커 부분이고; z' 은 1 내지 약 21 의 정수이고; R1 은 각각의 경우 독립적으로 H 또는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이고; R2 는 각각의 경우 독립적으로 H 또는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이다.
일부 경우에 있어서, 본 발명의 중합체 알카날은 특정 특징을 보유할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, POLY 가 선형인 경우: (a) 중합체에 존재하는 카르보닐의 총 수 (알데히드 카르보닐 탄소는 제외/세지 않음) 는 X' 이 하나 이상의 연속 (-CH2CH2O-) 또는 (-CH2CH2NH-) 절편을 포함하는 경우를 제외하고, 0 또는 2 또는 그 초과이다. X' 이 하나 이상의 연속 (-CH2CH2O-) 또는 (-CH2CH2NH-) 절편을 포함하는 경우, 중합체에 존재하는 카르보닐의 총 수는 0, 1, 2, 또는 그 초과이다.
또다른 예에 있어서, 추가 구현예에 따르면, X' 이 산소이거나 하나 이상의 (-CH2CH2O-) 절편을 포함하고, z' 이 2 내지 12 인 경우, 하나 이상의 경우에서 하나 이상의 R1 또는 R2 은 상기 정의된 바와 같은 유기 라디칼이거나 중합체가 헤테로이관능성이며, 여기서 POLY 는 하나의 말단에 히드록시가 아닌 반응기를 포함한다.
본원에서 제공되는 중합체 알카날은 본원에서 더욱 상세히 설명될, 여러 전체적 기하구조 또는 구조 중 어느 하나를 보유할 수 있다. 바람직하게는, POLY 가 분지형인 경우, (i) 하나 이상의 경우에서 하나 이상의 R1 또는 R2 은 상기 정의된 바와 같은 유기 라디칼이거나, 또는 (ii) X' 이 -(CH2CH2O)b- 를 포함한다 (여기서, b 는 1 내지 약 20 이다 (POLY 가 라이신 잔기를 포함하는 경우)). 대안적으로, POLY 가 분지형이고 2 개의 중합체 팔을 보유하는 경우, 중합체 팔은 단독 헤테로원자로 산소를 포함하지 않는다 (POLY 가 분지점으로 "C-H" 를 포함하는 경우).
일반적으로 말해서, 본 발명의 중합체 알카날은 z' 이 하기 범위 중 하나에 속하는 구조를 보유한다: z' 은 약 2 내지 21, 약 3 내지 12, 약 3 내지 8, 또는 3 내지 약 6 이다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 있어서, 중합체는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 I-A]
(식 중, POLY, X', 각각의 R1, 각각의 R2 및 R3 은 상기 정의된 바와 같다. 상기 구조에 있어서, C1 은 알데히드 카르보닐 탄소를 나타내며; C2 는 카르보닐 탄소 또는 C1 에 인접한 또는 α(알파) 위치인 탄소를 나타내고; C3 은 카르보닐 탄소에서 일단 제거된 또는 β(베타) 위치인 탄소 원자를 나타내고; C4 는 γ위치인 탄소 원자를 나타낸다). I-A 로 나타낸 전체 구조를 갖는 중합체 알카날은 본원에서 일반적으로 중합체 부타날로 언급된다. 상기 화학식 I-A 의 바람직한 변형에 있어서, C2 에 부착한 R1 은 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수는 H 이다. 바람직하게는, C2 에 부착한 R1 은 저급 알킬이다. 대안적으로, 중합체 알카날은 C3 에 부착한 R1 이 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수가 H 인 상기 구조 I-A 에 해당한다. 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 중합체 알카날은 C4 에 부착한 R1 이 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수가 H 인 구조 I-A 로 기재된다.
또다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 중합체 알카날은 화학식 I 에 해당하며, 구조 I-A 와 비교하는 경우 알킬렌쇄에 부가 탄소 원자를 보유한다. 본 구현예에 있어서 (본원의 구조 I-B 를 참고), z' 은 4 이고, C2 에 부착한 R1 은 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수는 H 이다. 대안적으로, C3 또는 C4 에 부착한 R1 중 하나는 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수는 H 이다.
화학식 I 에 속하는 또다른 특정 구현예에 있어서, z' 은 5 이며, C2 에 부착한 R1 은 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수는 H 이다 (본원의 화학식 I-C 를 참고). 대안적으로, C3 또는 C4 또는 C5 에 부착한 R1 중 하나는 알킬이고, 모든 다른 R1 및 R2 변수는 H 이다.
화학식 I 에 따른 중합체 알카날은 특정 구현예에 있어서, 일반적으로 하기 화학식으로 기재되는 링커 부분을 보유한다: -(CH2)c-De-(CH2)f- 또는 -(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q- (여기서, c 는 0 내지 8 범위이며; D 는 O, NH, 또는 S 이고; e 는 0 또는 1 이고; f 는 0 내지 8 범위이며; p 는 0 내지 8 범위이며; M 은 -NH 또는 O 이고; K 는 NH 또는 O 이고; q 는 0 내지 8 범위이며, r 및 s 는 각각 독립적으로 0 또는 1 이다). 상기 화학식에 속하는 구체적 링커를 하기에 더욱 상세히 설명한다.
링커 부분은 구조 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g- (식 중, b 및 g 는 각각 독립적으로 1 내지 20 이다) 에 해당하는 올리고머성 절편을 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, b 및 g 는 각각 독립적으로 약 1 내지 10 범위이며, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 6 범위이다. 상기 올리고머성 링커는 본 발명의 알카날에 부가적인 안정성을 제공하며, 또한 하기에 보다 상세히 기재될 중합체 제조용 합성 방법에 장점을 제공한다.
보다 구체적으로, 특정 구현예에 있어서, X' 은 하기 구조에 해당하는 부분을 포함한다: -(CH2)c-De-(CH2)f-P- 또는 -(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T- (식 중, P 및 T 는 각각 독립적으로 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g 이며; b 및 g 는 각각 독립적으로 1 내지 약 20 범위이다). 화학식 I 에 따른 중합체 알카날의 특정 구현예에 있어서, X' 은 -C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- 또는 -NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- 를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 중합체 알카날의 수용성 중합체 절편은 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 폴리(옥시에틸화 폴리올) 이다. 바람직한 구현예에 있어서, 중합체 절편은 폴리(알킬렌 옥시드), 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) 이다.
하나의 구현예에 따르면, 폴리(에틸렌 글리콜) 절편은 하기 구조를 포함한다: Z-(CH2CH2O)n- 또는 Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2- (식 중, n 은 약 10 내지 약 4000 범위이며, Z 는 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 바이오틴, 및 플루오레신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 포함하는 부분이다).
대안적으로, POLY 는 말단 캡핑 부분, 예컨대 알콕시, 치환 알콕시, 알케닐옥시, 치환 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환 알키닐옥시, 아릴옥시, 및 치환 아릴옥시로 말단 캡핑될 수 있다. 바람직한 말단 캡핑기에는 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시가 포함된다.
일반적으로, POLY 는 하기 범위 중 하나에 속하는 겉보기 평균 분자량을 보유한다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤, 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 약 2,000 달톤 내지 약 30,000 달톤. POLY 에 대한 바람직한 분자량에는 250 달톤, 500 달톤, 750 달톤, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 및 50 kDa 또는 그 초과가 포함된다.
또다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 중합체 알카날은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 II]
(식 중, POLY, 각각의 X', 각각의 (z'), 각각의 R1, 각각의 R2, 및 각각의 R3 은 앞서 정의된 바와 같다). 특정 구현예에 있어서, POLY 는 선형이며, 중합체는 호모이관능성이다.
상기 언급된 바와 같이, 중합체 알카날 내의 중합체 절편은 하기에 상세히 설명될 여러 기하구조 중 어느 하나, 예컨대 선형, 분지형, 포크형, 다중팔형, 또는 수지형 기하구조를 보유할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에는 하기 화학식에 해당하는 중합체 알카날이 포함된다:
[화학식 III-A]
[화학식 IV-A]
상기 구조에 있어서, PEG 는 폴리(에틸렌 글리콜) 이며, b 및 g 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, a 는 0 내지 6 이다. 상기 부분에 제공되는 일반화된 구조에 있어서, 달리 언급되지 않는 한 변수는 앞서 제공된 범위/값에 해당한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 중합체 알카날은 하기 구조에 해당한다:
[화학식 III-D]
일반화된 구조 III-D 에 속하는 하나의 특히 바람직한 중합체 알카날은 하기 구조를 보유한다:
[화학식 III-E]
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 구조를 갖는 수용성 중합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
[화학식 VII]
(여기서, 조성물에는 검출가능한 양의 요오드 함유종 또는 역-Michael 형 반응 생성물이 존재하지 않는다). 이는 요오드 함유종이 사슬 절단으로 인해 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬을 분해시켜서 높은 다분산도 값, 예컨대 약 1.2 초과 값을 갖는 중합체 생성물을 만들기 때문에 특히 유리하다. 바람직하게는, 본 발명의 중합체 알카날은 약 1.2 미만, 바람직하게는 약 1.1 미만, 보다 바람직하게는 약 1.05 미만의 다분산도 값을 보유할 것이다. 중합체 알카날, 예컨대 다분산도 1.04, 1.03 또는 그 미만을 특징으로 하는 본원에 기재된 것들이 보다 바람직하다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 수용성 중합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
(식 중, POLY 는 선형의, 말단 캡핑된 수용성 중합체 절편이며, 조성물에는 검출가능한 양의 디알데히드 중합체 유도체가 존재하지 않는다).
다른 공지된 중합체 알데히드 조성물과 비교하여, 본 발명의 중합체 알카날의 하나의 추가적 특징은 이들의 안정성, 예컨대 저장 안정성이다. 예를 들어, 본원에서는, 40℃ 에서 15 일 동안 저장되는 경우, NMR 로 결정하여 10% 이하의 중합체 알데히드기 분해를 나타내는 중합체 알카날 조성물이 제공된다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 하기 구조에 해당하는 중합체 알카날을 포함한다:
[화학식 VII-A]
구조 VII-A 에 따라 보다 바람직한 구현예에 있어서, POLY 는 구조 Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2- 를 보유한다 (식 중, X 는 O 이며, n 은 약 10 내지 약 4000 범위이고, Z 는 관능기, 표적화 부분, 리포터, 캡핑기 등을 포함한다).
본 발명의 또다른 조성물은 하기 구조에 따른 중합체를 포함한다:
[화학식 VIII]
본 발명의 또다른 측면에 있어서, 상기된 중합체 알카날의 수화물 또는 아세탈 형태가 제공된다.
본 발명의 아세탈에는 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈, 디-이소프로필 아세탈, 디벤질 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸 아세탈, 비스(2-니트로벤질)아세탈, S,S'-디메틸아세탈, S,S'-디에틸 아세탈, 및 디옥솔란이 포함된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 중합체 알카날의 아세탈 또는 수화물 형태는 일반적으로 하기 구조로 기재될 수 있다:
[화학식 IX]
(식 중, Wa 및 Wb 는 각각 독립적으로 O 또는 S 이며, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 H, 또는 메틸, 에틸, 이소프로필, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 및 니트로벤질로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이거나, 함께 취해지는 경우 -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 은, Wa, C1, 및 Wb 와 함께 간주되는 경우 5 또는 6 원 고리를 형성한다). 중합체 아세탈은 본 발명의 알카날의 유용한 전구체이며, 가수분해되어 중합체 알카날을 얻을 수 있다.
하나의 특정 구현예에 있어서, 하기 구조를 갖는 수용성 중합체가 제공된다:
[화학식 IX-A]
구조 IX-A 에 있어서, 알카날은 링커, X' 로부터 분자의 아세탈 또는 알데히드 수화부를 분리하는 메틸렌 또는 -(CH2)- 탄소만을 갖는 것이다.
또한, 본 발명은 생물학적 활성제와 본원에 기재된 중합체 알카날, 이들의 수화물 및/또는 대응 알카날의 반응으로 형성되는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
바람직하게는, 콘쥬게이트는 하기 구조에 해당한다:
(식 중, "NH-생물학적 활성제" 는 아미노기를 포함하는 생물학적 활성제를 나타낸다).
또한 본 발명의 구성부는 본원에 기재된 중합체 알카날 또는 이들의 전구체로부터 형성되는 히드로겔이다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 보호 알데히드 시약을 제공한다. 상기 보호 알데히드 시약은 본 발명의 중합체 알카날을 형성하는데 특히 유용하며, 일반적으로 하기 구조에 해당한다:
[화학식 XI-A]
[화학식 XI-B]
[화학식 XI-C]
(식 중, G 는 관능기이며, 나머지 변수는 상기 설정된 값을 갖는다).
구조 XI-A, B 및 C 의 바람직한 구현예에 있어서, G 는 이탈기, 예컨대 클로라이드, 브로마이드, 파라-톨릴술포네이트 에스테르, 메틸술포닐 에스테르, 트리플루오로술포닐에스테르, 및 트리플루오로에틸술포닐 에스테르이다.
대안적으로, G 는 -OH, -NH2, -SH, 및 이들의 보호 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이다.
본 발명의 또다른 측면은 임의로 보호 형태인, 수용성 중합체 알카날의 제조 방법에 관한 것이다. 간단히, 상기 방법에는 하나 이상의 반응기, Y 를 포함하는 수용성 중합체를, 탄소수 약 2 내지 20 및 치환되기 적합하거나 대안적으로 Y 와의 반응에 적합한 반응기 K 를 포함하는 보호 알카날 시약과 보호된 형태의 수용성 중합체 알카날을 형성하기 효과적인 조건 하에 반응시키는 단계가 포함된다. 상기 방법에 있어서, 활성화 중합체는 최종 생성물 또는 이들의 전구체의 알카날부를 갖는 시약에 커플링된다.
바람직하게는, 반응은 불활성 대기 하에 수행된다.
하나의 특정 구현예에 있어서, POLY-Y 는 직접 중합으로 제조된다.
상기 방법에는 또한 보호 수용성 중합체 알카날을, 예컨대 산성 조건 하에 가수분해하여 대응 수용성 중합체 알카날을 형성하는 부가 단계가 포함될 수 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 가수분해 단계는 약 3 이상의 pH 에서 수행된다.
방법을 수행하기 위한 알카날 시약의 보호 형태에는 아세탈, 예컨대 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈, 디-이소프로필 아세탈, 디벤질 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸 아세탈, 비스(2-니트로벤질)아세탈, S,S'-디메틸 아세탈, 및 S,S'-디에틸 아세탈, 시클릭 아세탈 및 시클릭 티오아세탈이 포함된다.
추가 구현예에 있어서, 이렇게 제조된 중합체 알카날은 반응 혼합물의 pH 를 약 6.0 에서 7.5 로 상승시키고, 중합체 알카날을 유기 용매 중에서 추출하고, 용매를 제거하여 회수된다.
상기 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 수용성 중합체는 구조 "POLY-Y" 에 해당하며, 보호 알카날 시약은 하기 구조에 해당한다:
[화학식 XI-D]
바람직하게는, POLY 는 말단-캡핑되거나 되지 않을 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포함한다.
상기 방법의 하나의 특정 구현예에 있어서, POLY-Y 는 구조 Z-(CH2CH2O)nH 를 포함한다 (식 중, n 은 약 10 내지 약 4000 이며, Z 는 -OCH3, -OCH2CH3, 및 -OCH2(C6H5) 로 이루어진 군으로부터 선택된다). 추가 구현예에 있어서, POLY-Y 는 구조 Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O-M+ 을 포함한다 (여기서, POLY-Y 는 강염기로의 Z-CH2CH2OH 의 말단-OH 기의 금속화로 제조된 말단 캡핑된 알콜레이트염, 예컨대 Z-CH2CH2O-M+ 상의 에틸렌 옥시드의 음이온성 개환 중합으로 제조된다). M+ 는 금속 짝이온, 예컨대 Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+ 를 나타낸다. 이어서 이렇게 제조된 POLY-Y 는 상술된 바와 같은 보호 알카날 시약과의 반응에 적합하다.
추가의 특히 바람직한 구현예에 있어서, 회수된 알카날에는 검출가능한 양의 미반응 POLY Y (예컨대, Z-(CH2CH2O)nH) 및 역-Michael 형 반응 생성물이 존재하지 않는다.
상기 방법의 또다른 구현예에 있어서, POLY-Y 는 PEG-디올에 해당한다, 즉 POLY-Y 는 구조 HO-(CH2CH2O)nH 를 보유한다 (식 중, n 은 약 10 내지 약 4000 이다). K 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
상기 방법으로 하기 구조를 갖는 보호 중합체 알카날이 형성된다:
[화학식 XII]
상기 방법의 또다른 구현예에 있어서, POLY-Y 는 구조 Z-(CH2CH2O)nH 을 포함한다 (식 중, n 은 약 10 내지 약 4000 이며, Z 는 보호 히드록실이다). 이 경우에 있어서, 상기 방법의 바람직한 구현예에는 반응 단계 이후, 임의로 폴리(에틸렌 글리콜) 의 말단 히드록실을 히드록실 이외 관능기로 전환시키는 것이 수반되는 보호 히드록실의 탈보호가 포함된다.
관능기의 예에는 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 및 실란이 포함된다. 바람직하게는, 관능기는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 보호 아민, 비닐술폰, 및 말레이미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, POLY-Y 에서의 "Y" 는 이온화가능한 기이거나 또는 이온화가능한 기의 유도체, 예컨대 카르복실산, 활성 에스테르, 또는 아민이다. 바람직하게는, POLY-Y 는 반응 단계에 사용하기 이전에 크로마토그래피적으로 정제된다. 하나의 특정 구현예에 있어서, POLY-Y 는 이온 교환 크로마토그래피로 사용 전에 정제된다. 이상적으로, 반응 단계에 사용하기 위해 크로마토그래피적으로 정제된 상기 POLY-Y 에는 본질적으로 검출가능한 양의 중합체성 불순물이 존재하지 않는다. 상기 방법의 하나의 구현예에 있어서, POLY-Y 는 말단-캡핑되며, 본질적으로 검출가능한 양의 PEG-디올 또는 이관능성 PEG 불순물이 존재하지 않는다.
대안적으로, 본 발명의 방법의 실시에 있어서, 알카날 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 XI-F]
또는
[화학식 XI-G]
(식 중, g 및 b 는 각각 독립적으로 약 1 내지 약 20 의 범위이다). 예로서, 바람직한 알카날 시약은 하기 구조에 해당하며:
[화학식 XI-H]
반응 단계의 생성물은 하기 일반화된 구조를 보유한다:
[화학식 IX-B]
본 발명의 중합체 알카날을 제조하기 위한 또다른 접근법에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 중합체 알카날은, 예컨대 직접 중합에 의해, 아세탈 전구체 상에 직접 중합체 절편을 구축하여 제조된다. 보다 구체적으로, 상기 방법에는 하기 단계가 포함된다:
(i) 중합을 개시하기 적합한 하나 이상의 활성 음이온성 부위를 포함하는 아세탈 전구체를 제공하고,
(ii) 아세탈 전구체의 음이온성 부위와 중합할 수 있는 반응성 단량체를 접촉시켜, 아세탈 전구체 상에 반응성 단량체의 중합을 개시하고,
(iii) 상기 접촉 단계 결과, 부가적 반응성 단량체를 아세탈 전구체에 첨가하여 중합체 사슬을 형성하고,
(iv) 목적하는 길이의 중합체 사슬에 도달할 때까지 상기 접촉을 계속하고,
(v) 반응을 종결시켜 본 발명의 중합체 알데히드 전구체를 수득함.
생성 중합체 알데히드 전구체는 또한 필요한 경우, 상기 설정된 바와 같은 대응 알카날로 가수분해될 수 있다.
상기 방법의 하나의 특정 구현예에 있어서, 반응성 단량체는 에틸렌 옥시드이며, 아세탈 전구체 내에 포함되는 반응성 음이온성 부위는 바람직하게는 알칼리 금속 또는 다른 적합한 짝이온이 수반되는, 알콕시드 음이온 (O-) 이다. 아세탈 전구체 내에 존재하는 알콕시드 말단기는 에틸렌 옥시드의 음이온성 개환 중합에 대해 활성을 가져서, 본 발명의 중합체 알카날을 형성한다.
아세탈 전구체는 일반적으로 하기에 해당하는 구조를 보유할 것이다:
(식 중, 변수는 상기된 값을 보유하며, 단 예외적으로 X' 은 산소 음이온, 또는 O- (예컨대, 그 중성 형태에 있어서, X' 은 전형적으로 강염기의 존재 하에 대응 알콕시드염으로 전환되는, 히드록실기 또는 -OH 로 종결된다) 로 종결된다). 적합한 짝이온에는 Na+, K+, Li+, 및 Cs+ 가 포함된다. 종결 단계에는 일반적으로, 예컨대 산의 첨가에 의한, 중화 반응이 포함된다. 임의로, 중합체 절편은 비반응성 말단을 제공하기 적합한 다른 시약 또는 알킬화 시약의 첨가로 캡핑될 수 있다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은 하기 상세한 설명과 함께 독서하는 경우 보다 완전히 자명해질 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 변할 수 있는 특정 중합체, 합성 기법, 활성제 등에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 이용되는 용어는 특정 구현예를 단지 설명하기 위함이며, 제한하는 것으로 간주되어서는 안되는 것임이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 이용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 에는 문맥 상 뚜렷이 달리 지칭되지 않는 경우 복수 참조물이 포함되는 것임을 주지해야 한다. 즉, 예를 들어, "중합체" 에 대한 참조물에는 단일 중합체 뿐만 아니라 둘 이상의 동일 또는 상이한 중합체가 포함되며, "콘쥬게이트" 에 대한 참조물은 단일 콘쥬게이트 뿐만 아니라 둘 이상의 동일 또는 상이한 콘쥬게이트를 나타내고, "부형제" 에 대한 참조물에는 단일 부형제 뿐만 아니라 둘 이상의 동일 또는 상이한 부형제가 포함되는 등과 같다.
본 발명을 설명하고 청구하는데 있어서, 용어는 후술되는 정의에 따라 이용될 것이다.
정의
본원에서 이용되는 하기 용어는 나타내는 의미를 갖는다.
명세서 및 첨부 청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an", "the" 에는 문맥 상 뚜렷이 달리 지칭되지 않는 경우 복수 참조물이 포함된다.
본원에서 사용되는 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)" 은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드) 를 포함하는 것을 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 사용하기 위한 PEG 는, 예컨대 합성 변환 도중, 말단 산소(들) 이 대체되었는지 여부에 따라 두 하기 구조 중 하나를 포함할 것이다: "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-". 변수 (n) 은 3 내지 3000 이며, 전체적 PEG 의 말단기 및 구조는 변할 수 있다. PEG 가 추가로 링커 부분 (하기에 더 상세히 설명될 것임) 을 포함하는 경우, PEG 절편에 공유적으로 부착되는 경우 링커 (X') 에 포함되는 원자는 하기를 형성하지 않는다: (i) 산소-산소 결합 (-O-O-, 퍼옥시드 연결), 또는 (ii) 질소-산소 결합 (N-O, O-N). "PEG" 는 주로, 즉 50% 초과의 -CH2CH2O- 인 서브유닛을 포함하는 중합체를 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 PEG 에는 하기 더 상세히 설명될 다양한 분자량, 구조 또는 기하구조를 갖는 PEG (예컨대, 분지형, 선형, 포크형 PEG, 수지형 등) 가 포함된다.
본 발명의 중합체의 문맥에서의 "수용성", 또는 "수용성 중합체 절편" 은 실온에서 수용성인 임의 절편 또는 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체 또는 절편은 여과 후 동일 용액에서 투과되는 빛의 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상을 투과시킬 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체 또는 이들의 절편은 바람직하게는 약 35 중량% 이상 수용성, 보다 바람직하게는 약 50 중량% 이상 수용성, 더욱 바람직하게는 약 70 중량% 수용성, 보다 더 바람직하게는 약 85 중량% 수용성일 것이다. 그러나, 수용성 중합체 또는 절편이 약 95 중량% 수용성 또는 완전 수용성인 것이 가장 바람직하다.
"말단 캡핑" 또는 "말단-캡핑된" 기는 중합체, 예컨대 PEG 의 말단 상에 존재하는 불활성기이다. 말단 캡핑기는 전형적 합성 반응 조건 하에 화학적 변환을 쉽게 거치지 않는 것이다. 말단 캡핑기는 일반적으로 알콕시기, -OR 이다 (식 중, R 은 탄소수 1 - 20 의 유기 라디칼이며, 바람직하게는 저급 알킬 (예컨대,메틸, 에틸) 또는 벤질이다). "R" 은 포화 또는 불포화될 수 있으며, 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로, 및 상기물 중 어느 하나의 치환 형태가 포함될 수 있다. 예를 들어, 말단 캡핑된 PEG 는 전형적으로 구조 "RO-(CH2CH2O)n-" 를 포함할 것이다 (식 중, R 은 상기 정의된 바와 같다). 대안적으로, 말단 캡핑기는 또한 유리하게는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 표지를 포함하는 말단 캡핑기를 갖는 경우, 중합체가 커플링되는 부분 (예컨대 활성제) 및/또는 중합체의 양 또는 위치가 적합한 검출기로 결정될 수 있다. 상기 표지에는, 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지에 사용되는 부분, 발색제 (예컨대, 염료), 금속 이온, 방사활성 부분 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 중합체와 관련하여 "비천연 생성" 이란, 그 전부가 천연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나 본 발명의 비천연 생성 중합체는 전체 중합체 구조가 천연에서 발견되지 않는 한, 천연 생성되는 하나 이상의 서브유닛 또는 서브유닛의 절편을 포함할 수 있다.
본 발명의 수용성 중합체, 예컨대 PEG 와 관련된 "분자량" 은 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피, 광 산란 기법, 또는 1,2,4-트리클로로벤젠 중의 내재 속도 측정으로 결정되는 중합체의 겉보기 평균 분자량을 나타낸다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 약 1.20 미만의 낮은 다분산도 값을 보유하는 다분산성이다.
특정 관능기와 함께 사용되는 경우, 용어 "반응성" 또는 "활성화" 는 전형적으로 또다른 분자 상에 존재하는 친전자제 또는 친핵제와 쉽게 반응하여 변환을 거치는 관능기를 나타낸다. 이는 반응하기 위해 강한 촉매 또는 강한 반응 조건을 필요로 하는 기 (즉, "비반응성" 또는 "불활성" 기) 와는 대조된다.
용어 "보호" 또는 "보호화 기" 또는 "보호기" 는 특정 반응 조건 하에 분자 내의 특정 화학적 반응성 관능기의 반응을 예방 또는 차단하는 부분 (즉, 보호화 기) 의 존재를 나타낸다. 보호화 기는 보호되는 화학적 반응기의 유형 뿐만 아니라 채택되는 반응 조건 및 존재하는 경우, 분자 내 부가적 반응기 또는 보호화 기의 존재에 근거하여 변할 것이다. 당분야에 공지된 보호화 기는 [Greene, T. W. 등, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3 판, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999)] 에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "관능기" 또는 이들의 임의 동의어는 이들의 보호 형태가 포함되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "링커 부분" 은 내부연결 부분, 예컨대 중합체 절편 및 알카날을 연결하는데 임의로 사용되는 원자 또는 원자의 집합을 나타낸다. 본 발명의 링커 부분은 가수분해적으로 안정하거나, 생리학적으로 가수분해가능한 또는 효소적으로 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
"생리적으로 가수분해가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 상대적으로 약한 결합이다. 결합의 수중 가수분해되는 경향은 두 개의 중심 원자를 잇는 연결의 일반적 유형 뿐만 아니라, 이들 중심 원자에 부착된 치환기에 의존할 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결의 예에는 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"효소적으로 분해가능한 연결" 은 1 개 이상의 효소에 의해 분해되는 연결을 의미한다.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은, 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 연장된 시기에 걸쳐 임의의 심각한 정도로 생리학적 조건 하에 가수분해를 겪지 않는 화학 결합, 전형적으로 공유 결합을 나타낸다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 사슬 내), 에테르, 아미드, 우레탄 등. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리학적 조건 하에서 1 일 당 약 1-2 % 미만의 가수분해 속도를 나타내는 것이다. 대표적 화학 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 참고서에서 찾을 수 있다.
"알카날" 은 중합체 절편에 중합체의 알카날부를 연결시키는 링커 부분에 대한 임의의 메틸렌 또는 치환 메틸렌 (-C(R1)(R2)- 및 카르보닐 탄소를 포함하는, 본 발명의 수용성 중합체의 알데히드부 (CHO) 를 나타낸다. 알카날 절편의 명명에 있어서, C1 은 카르보닐 탄소에 해당한다. 본원에서 사용되는 용어 "알카날" 은 알데히드기의 수화물 및 보호 형태 뿐만 아니라 칼코겐 (chalcogen) 유사체를 포함하려는 것이다. 본 발명의 알카날의 하나의 특히 바람직한 보호 형태는 아세탈이다.
본 발명의 특정 중합체 알카날과 관련된 "카르보닐의 총수" 는 알데히드 탄소(들) 을 세지 않은, 중합체 알카날에 포함되는 카르보닐기의 총 수이다.
중합체의 기하구조 또는 전체 구조와 관련된 "분지형" 은 2 개 이상의 중합체 "팔" 을 갖는 중합체를 나타낸다. 분지형 중합체는 2 개의 중합체 팔, 3 개의 중합체 팔, 4 개의 중합체 팔, 6 개의 중합체 팔, 8 개의 중합체 팔 또는 그 초과를 보유할 수 있다. 고분지형 중합체의 하나의 구체적 유형은, 본 발명의 목적을 위해 분지형 중합체와 상이한 구조를 보유하는 것으로 간주되는 수지형 중합체 또는 덴드리머이다.
"분지점" 은 중합체가 선형 구조로부터 하나 이상의 부가적 중합체 팔로 분할 또는 분지화되는, 하나 이상의 원자를 포함하는 분기점을 나타낸다.
"덴드리머" 는 모든 결합이 중심 초점 또는 코어로부터 규칙적 분지 패턴 및 각각 분지점에 기여하는 반복 단위로 방사 방출되는 구형의, 크기가 단일분산성인 중합체이다. 덴드리머는 이들을 다른 유형의 중합체와 다르게 만드는 특정한 수지형 상태 특성, 예컨대 코어 캡슐화를 나타낸다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로" 는, 일부 주어진 양의 거의 전체 또는 완전히, 예를 들어 95% 또는 그 초과를 의미한다.
"역-Michael 형 생성물" 은 Michael-형 부가 반응의 역반응으로 얻어지는 생성물을 나타낸다. Michael 부가 반응 (전방향) 은 친전자성 이중 결합에 대한 친핵성 탄소종의 부가를 나타낸다. 전형적으로, 그러나 반드시는 아니고, 친핵제는 에놀레이트 또는 에나민이지만, 친핵제는 또한 알콕시드 또는 아민 또는 다른 종일 수 있다. 친전자제는 전형적으로 알파, 베타-불포화 케톤, 에스테르, 또는 니트릴이지만, 다른 전자 끄는 기도 또한 탄소-탄소 이중 결합을 친핵성 공격에 대해 활성화시킬 수 있다. 상기된 바와 같은 Michael-형 부가의 역행 (또는 후방향), 즉 제거 반응으로 얻어지는 생성물은 친핵성 탄소종 (에놀레이트 또는 에나민일 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다) 을 소실시키며, 상기 기재된 바와 같은 친전자성 이중 결합, 예컨대 알파, 베타 불포화 케톤 등의 형성은 역-Michael 형 생성물로 간주된다. 예를 들어, mPEG-프로피온알데히드의 역-Michael-형 반응은 역-Michael 형 생성물인 mPEG-OH 및 아크롤레인 (CH2=CH-CHO) 을 만든다.
"알킬" 은 전형적으로 길이가 약 1 내지 20 원자수 범위인 탄화수소 사슬을 나타낸다. 상기 탄화수소 사슬은 바람직하게는, 그러나 반드시는 아니고, 포화될 수 있으며, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있지만, 전형적으로 직쇄가 바람직하다. 알킬기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등이 포함된다. 본원에서 사용되는 "알킬" 에는 3 개 이상의 탄소 원자가 참조되는 경우, 시클로알킬이 포함된다.
"저급 알킬" 은 탄소수 1 내지 6 의 알킬기를 나타내며, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸로 예시되는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
"시클로알킬" 은 바람직하게는 3 내지 약 12 탄소수, 보다 바람직하게는 3 내지 약 8 탄소수의, 가교, 융합 또는 스피로 시클릭 화합물을 포함하는 포화 또는 불포화 시클릭 탄화수소 사슬을 나타낸다.
"비방해성 치환기" 는 분자 내에 존재하는 경우, 분자 내에 포함된 다른 관능기와 전형적으로 비반응성인 기이다.
예를 들어 "치환 알킬" 에서의 용어 "치환" 은 하나 이상의 비방해성 치환기, 예컨대 하기와 같지만 이에 제한되지는 않는 C3-C8 시클로알킬, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸 등; 할로, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환 페닐 등으로 치환된 부분 (예컨대, 알킬기) 을 나타낸다. 페닐 고리 상의 치환을 위해, 치환기는 임의 배치 (즉, 오르토, 메타, 또는 파라) 일 수 있다.
"알콕시" 는 -O-R 기를 나타낸다 (식 중, R 은 알킬 또는 치환 알킬, 바람직하게는 C1-C20 알킬 (예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 벤질 등), 바람직하게는 C1-C7 이다.
본원에서 사용되는 "알케닐" 은 하나 이상의 이중 결합을 포함하는, 1 내지 15 원자수 길이의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기, 예컨대 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "알키닐" 은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는, 2 내지 15 원자수 길이의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기, 에티닐, n-프로피닐, 이소프로피닐, n-부티닐, 이소부티닐, 옥티닐, 데시닐 등을 나타낸다.
"아릴" 은 각각 5 또는 6 코어 탄소수의 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴에는 나프틸에서와 같이 융합되거나 비페닐에서와 같이 비융합될 수 있는 다중 아릴 고리가 포함된다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로시클릭 고리와 융합 또는 비융합될 수 있다. 본원에서 사용되는 "아릴" 에는 헤테로아릴이 포함된다.
"헤테로아릴" 은 1 내지 4 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S, 또는 이들의 조합을 포함하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 은 불포화부 또는 방향족 특징을 갖거나 갖지 않고, 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 갖는, 5-12 원자, 바람직하게는 5-7 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자에는 황, 산소, 및 질소가 포함된다.
"치환 헤테로아릴" 은 치환기로 하나 이상의 비방해성 기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환 헤테로사이클" 은 비방해성 치환기로 형성되는 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
"친전자제" 는 친전자성 중심, 즉 전자를 추구하여 친핵제와 반응할 수 있는 중심을 갖는, 이온성일 수 있는 이온, 원자 또는 원자군을 나타낸다.
"친핵제" 는 친핵성 중심, 즉 친전자제를 추구하고 친전자제와 반응할 수 있는 중심을 갖는, 이온성일 수 있는 이온 또는 원자 또는 원자군을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "활성제" 에는 생체 내 또는 시험관 내에서 나타낼 수 있는, 일부 약리학적인, 종종 유익한 효과를 제공하는 임의 제제, 약물, 화합물, 물질 조성물 또는 혼합물이 포함된다. 여기에는 식품, 식품 첨가물, 영양소, 검강식품, 약물, 백신, 항체, 비타민 및 기타 유익한 제제가 포함된다. 본원에서 사용되는 상기 용어에는 또한 환자에서 국소 또는 전신 효과를 나타내는 임의의 생리학적 또는 약리학적 활성 물질이 포함된다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명의 조성물 중에 포함될 수 있고, 환자에게 유의미한 독성 부작용을 일으키지 않는 부형제를 나타낸다.
"약리학적 유효량", "생리학적 유효량" 및 "치료적 유효량" 은 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 혈류 또는 표적 조직 내에서 목적하는 활성제 및/또는 콘쥬게이트 수준을 제공하는데 필요한, 약학 제제 중에 존재하는 PEG-활성제 콘쥬게이트의 양을 의미한다. 정확한 양은 여러 요인, 예컨대, 특정 활성제, 약학 제제의 성분 및 물리적 특징, 목적 환자군, 환자 고려사항 등에 근거할 것이며, 관련 문헌에서 이용가능하고 본원에 제공되는 정보에 근거하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 중합체와 관련된 "다관능성" 은 내부에 포함된 3 개 이상의 관능기를 갖는 중합체 골격을 의미하며, 여기서 관능기는 동일 또는 상이할 수 있고, 전형적으로 중합체 말단 상에 존재한다. 본 발명의 다관능성 중합체는 중합체 골격 내에 전형적으로 약 3-100 개 관능기, 또는 3-50 개 관능기, 또는 3-25 개 관능기, 또는 3-15 개 관능기, 또는 3 내지 10 개 관능기를 포함하거나, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 관능기를 포함할 것이다.
"이관능성" 중합체는 전형적으로 중합체 말단에, 내부에 포함된 2 개 관능기를 갖는 중합체를 의미한다. 관능기가 동일한 경우, 중합체는 호모이관능성으로 불린다. 관능기가 상이한 경우, 중합체는 헤테로이관능성으로 불린다.
본원에 기재된 염기성 또는 산성 반응물에는 중성의, 하전된, 및 이들의 임의 대응 염 형태가 포함된다.
"폴리올레핀계 알콜" 은 올레핀 중합체 골격을 포함하는 중합체, 예컨대 중합체 골격에 부착된 다중 돌출 히드록실기를 갖는 폴리에틸렌을 나타낸다. 예시적 폴리올레핀계 알콜은 폴리비닐 알콜이다.
본원에서 사용되는, "비펩티드성" 은 중합체 골격에 펩티드 연결이 실질적으로 없음을 나타낸다. 그러나, 중합체에는 반복 단량체 서브유닛을 따라 배치된 소수의 펩티드 연결, 예를 들어 약 50 개 단량체 단위 당 약 1 개 이하의 펩티드 연결이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는, "수화물" 은 2 개의 히드록실기로 카르보닐 관능기를 대체하는, 알데히드기에 물 분자를 첨가하여 생성되는 수화 알데히드를 나타낸다. 알데히드는 대응 수화물 n 물로 평형에 도달한다.
용어 "칼코겐 유사체" 는 산소 원자가 또다른 헤테로원자, 일반적으로 황, 셀레늄 또는 텔루르로 대체된 알데히드 유사체를 나타낸다.
용어 "환자" 는 반드시는 아니지만 전형적으로 중합체-활성제 콘쥬게이트 형태인, 본 발명의 중합체 투여로 예방 또는 치료될 수 있는 조건을 겪거나 겪기 쉬운 생명체를 나타내며, 인간 및 동물이 모두 포함된다.
"임의" 또는 "임의로" 는 이후 기재되는 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하여, 상기 기재에는 그 상황이 일어나는 상황 및 일어나지 않는 상황이 포함된다.
중합체
제 1 측면에 있어서, 본 발명은 반응성 알데히드기를 갖는 수용성 중합체를 제공한다. 본 발명의 중합체는 여러 측면에서 독특하다. 이들은 고순도로 제조될 뿐만 아니라, 또한 중합체 사슬 분해 및 불량한 중합체 다분산도를 야기할 수 있는 해로운 반응 부산물의 부재로 인해 저장에 안정성이다. 중합체, 특히 말단-캡핑된 중합체는 부가적으로 고순도로, 예컨대 검출가능한 양의 PEG-디올 유래 및 기타 중합체성 불순물 없이 제조된다. 상기 특징은, 예컨대 분자량 약 30 kDa 이상의, 고분자량인 말단-캡핑된 PEG 중합체를 제조하는데 특히 유리하며, 여기서 원료, 예컨대 mPEG 중 PEG 디올 불순물의 양은 공급자에 따라, 약 2 중량% 내지 약 30 중량% 이상 범위일 수 있다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 중합체는 다른 공지된 중합체 알데히드 보다 덜 반응성이어서, 이들을 콘쥬게이션 반응에서 보다 차별적으로, 및 변환, 취급 및 반응 워크업 도중 보다 안정하게 만든다.
일반 구조적 특징 및 알카날부
일반적으로 말해서, 본 발명의 중합체는 삽입 링커 부분을 통해 알데히드 관능부 (즉, 알카날부) 에서 종결되는 약 1 내지 약 21 개의 연속 메틸렌 또는 치환 메틸렌에 연결된 중합체 절편을 보유한다. 본 발명의 중합체에 해당하는 일반화된 구조는 하기 화학식 I 로 제공된다:
[화학식 I]
구조 I 과 함께 고려하여 상기를 참고하면, 중합체 절편은 POLY 로 나타내며, 링커 부분은 X' 으로 나타내고, 연속 메틸렌 (알킬렌 사슬 형성) 또는 치환 메틸렌 (치환 알킬렌 사슬 형성) 은 -C(R1)(R2)- 로 나타낸다. 보다 구체적으로, 구조 I 에 있어서, POLY 는 수용성 중합체 절편이며; X' 은 링커 부분이고; z' 은 1 내지 약 21 의 정수이다. R1 은 각각의 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴이다. R2 는 각각의 경우, 또한 독립적으로 H 또는 예컨대 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터의 유기 라디칼이다. 본원에서 명백히 제공되는 여러 구조가 알데히드지만, 상기 동일 구조 및 실제로 본 발명 전체는 구조 I 의 카르보닐 산소가 황, 셀레늄 또는 텔루르로 대체되는, 대응 알데히드 수화물, 보호 형태 및 칼코겐 유사체의 알데히드에 연장되는 것을 의미함이 이해되어야 한다.
본 발명은 알데히드기에 연결된 알킬렌 사슬의 크기에 대해 상당한 유연성을 제공한다. 탄소쇄 길이는 카르보닐 탄소를 링커에 연결시키는, 카르보닐 탄소 (C1) + 개입 탄소 원자의 수 (예컨대, 중합체의 [-C(R1)(R2)]z' 부에 포함되는 C 의 총수) 로 간주된다. 탄소쇄 길이는 전형적으로 3 내지 약 22 탄소 원자, 보다 전형적으로 약 4 내지 약 13 탄소 원자이다. 상기 구조 I 을 참조하면, 이는 z' 값이 전형적으로 2 내지 약 21, 보다 전형적으로 약 3 내지 12 범위임을 의미한다. 보다 구체적으로, z' 값은 가장 전형적으로는 하기 중 하나이다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과. 2 내지 약 8 범위의 z' 값 이 가장 바람직하다. 하나의 특히 바람직한 본 발명의 중합체 알카날은 z' 이 3 인 것이다.
상기 구조 I 을 참조하면, 특정 유형의 알카날이 특히 바람직하다. 상기 화합물에는 탄소쇄 내 하나 이상의 "C" 상에 위치한 하나 이상의 유기 라디칼을 갖는 상술된 바와 같은 알카날이 포함된다. 유기 라디칼은 상기 언급된 유기 라디칼 중 어느 하나, 예컨대 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴일 수 있고, 알킬이 바람직하다. 전형적으로, 알킬기는 직쇄 저급 알킬 또는 분지형 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 펜틸 등이며, 직쇄가 일반적으로 바람직하다. 하나의 특히 바람직한 알킬 치환기는 메틸이다.
중합체의 알카날부는 탄소쇄 내에 하나 이상의 "C" 상에 위치한 하나 이상의 유기 라디칼을 보유할 수 있지만, 바람직한 알카날의 하나의 유형은 탄소쇄 내 단 하나의 "C" 가 유기 라디칼로 치환되고, 모든 다른 R1 및 R2 가 H 인 것이다. 예를 들어, 알킬렌 사슬의 길이와 무관하게, 하기를 제외하고, 모든 R1 및 R2 변수가 H 인 것이 바람직하다: (i) C-2 에 위치한 R1 또는 R2 중 하나가 알킬이거나 (ii) C-3 에 위치한 R1 또는 R2 중 하나가 알킬이거나; 또는 (iii) C-4 에 위치한 R1 또는 R2 중 하나가 알킬이거나; 또는 (iv) C-5 에 위치한 R1 또는 R2 중 하나가 알킬 등이다. 이와 관련된 하나의 특히 바람직한 유형의 치환기는 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 또는 프로필이다. 본 발명의 예시적 2-메틸 치환 알카날, mPEG-2-메틸부티르알데히드의 합성은 실시예 17 에 기재되어 있다.
이제 중합체의 알카날부에 집중하여, 특정한 바람직한 알카날을 하기에 나타낸다.
[화학식 I-A]
구조 I-A 는 구조 I 에서 z' 값이 3 인 것이다. 임의의 하나 이상의 C2, C3, 또는 C4 가 상술된 알킬 또는 다른 유기 라디칼로 치환되는지와 무관하게, 상기 구조는 본원에서 "부티르알데히드" 또는 "부타날" 로 언급된다. 본 발명의 예시적 중합체 부티르알데히드에는 중합체의 알카날부가 2-메틸부티르알데히드, 3-메틸부티르알데히드, 또는 4-메틸부티르알데히드, 2-에틸부티르알데히드, 3-에틸부티르알데히드, 또는 4-에틸부티르알데히드인 것들이 포함된다.
[화학식 I-B]
구조 I-B 는 구조 I 에서 z' 값이 4 인 것이다. 임의의 하나 이상의 C2, C3, C4 또는 C5 가 상술된 알킬 또는 다른 유기 라디칼로 치환되는지와 무관하게, 상기 구조는 본원에서 "펜타날" 또는 "발레드알데히드" 로 언급된다. 본 발명의 예시적 중합체 펜타날에는 중합체의 알카날부가 2-메틸펜타날, 3-메틸펜타날, 4-메틸펜타날, 또는 5-메틸펜타날인 것들이 포함된다. 부가적 중합체 펜타날에는 중합체의 알카날부가 2-에틸펜타날, 3-에틸펜타날, 4-에틸펜타날, 또는 5-에틸펜타날인 것들이 포함된다.
[화학식 I-C]
구조 I-C 는 구조 I 에서 z' 값이 5 인 것이다. 임의의 하나 이상의 C2, C3, C4, C5 또는 C6 가 상술된 알킬 또는 다른 유기 라디칼로 치환되는지와 무관하게, 상기 구조는 본원에서 "헥사날" 로 언급된다. 본 발명의 예시적 중합체 헥사날에는 중합체의 알카날부가 2-메틸헥사날, 3-메틸헥사날, 4-메틸헥사날, 5-메틸헥사날, 6-메틸헥사날, 2-에틸펜타날, 3-에틸펜타날, 4-에틸펜타날, 또는 5-에틸펜타날인 것들이 포함된다.
본 발명의 중합체의 부가적 알카날 성분에는 헵타날, 옥타날, 노나날 등이 포함된다.
링커 부분
이제 링커 부분을 살펴보면, 본 발명의 링커 부분 또는 간단히 "링커" 는 일반적으로 변수 X' 으로 나타낸다. 링커 부분은 중합체의 알카날부와 중합체 절편 (하기에 상세히 기재될 것임) 을 연결하는 전체 중합체의 일부이다. 본 발명의 링커는 단일 원자, 예컨대 산소 또는 황, 2 개 원자, 또는 여러 원자일 수 있다. 링커는 반드시는 아니지만 전형적으로 선형 성질이다. 링커의 전체 길이는 전형적으로 1 내지 약 40 원자 범위이며, 여기서 길이는 치환기를 세지 않은 단일 사슬내 원자의 수를 의미한다. 예를 들어, -CH2- 는 전체 링커 길이에 대해 1 개 원자로 세며, -CH2CH2O- 는 3 개 원자 길이로 센다. 바람직하게는, 링커는 약 1 내지 약 20 개 원자, 또는 약 2 내지 약 15 원자 길이를 가질 것이다.
본 발명의 링커는 단일 관능기, 예컨대 아미드, 에스테르, 우레탄, 또는 요소일 수 있고, 또는 단일 관능기의 양측 중 하나를 연결하는 메틸렌 또는 다른 알킬렌기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 링커는 동일 또는 상이할 수 있는 관능기의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 링커는 임의로 하나 이상의 산소 또는 황 원자 (즉, 에테르 또는 티오에테르) 를 포함하는 알킬렌 사슬일 수 있다. 바람직한 링커는 가수분해적으로 안정한 것들이다. 구조 I 에 대해 고려하는 경우, 링커는 전체 중합체의 일부로서 간주되는 경우에 퍼옥시드 결합 (-O-O-) 또는 -N-O- 또는 -O-N-결합을 포함하는 전체 구조를 만들지 않는 것이다.
예시적 링커, X' 은 하기 구조 중 하나에 해당하는 것들이다:
-(CH2)c-De-(CH2)f- 또는 -(CH2)p-Mf-C(O)-Ks-(CH2)q-.
상기 링커 구조를 참조하면, 변수 "c" 는 0 내지 8 범위이며; "D" 는 O, NH, 또는 S 이고; 변수 "e" 는 0 또는 1 이고; 변수 "f" 는 0 내지 8 범위이며; 변수 "p" 는 0 내지 8 범위이며; "M" 은 -NH 또는 O 이고; "K" 는 NH 또는 O 이고; 변수 "q" 는 0 내지 8 범위이며, 변수 "r" 및 "s" 는 각각 독립적으로 0 또는 1 이다.
구조 I 에 있어서, 본 발명의 링커, X' 은 하기 중 어느 하나일 수 있다: -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, C(O)-NH, NH-C(O)-NH, O-C(O)-NH, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O -CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH -CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH -CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, 이가 시클로알킬기, -N(R6)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j- 및 임의의 상기물 중 둘 이상의 조합 (여기서, (h) 는 0 내지 6 이며, (j) 는 0 내지 20 이고, R6 은 H 또는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이다). 다른 구체적 링커는 하기 구조를 갖는다: -C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- 또는 -NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- 또는 -OC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- (여기서, 각각의 메틸렌에 뒤따르는 아래 첨자값은 링커 구조에 포함되는 가능한 메틸렌의 수를 나타낸다, 예컨대 (CH2)1-6 은 링커가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 메틸렌을 포함할 수 있음을 의미한다).
그러나, 본 개시물의 목적을 위해, 일련의 원자가 중합체 절편 POLY 에 바로 인접하며, 일련의 원자가 아닌 또다른 단량체가 제안되는 링커 부분이 중합체 사슬의 단순한 연장을 나타내는 경우, 일련의 원자는 링커 부분으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 주어진 부분 구조 "POLY-X-" 에서 (여기서, POLY 는 본 경우, "CH3O(CH2CH2O)n-" 으로 정의된다), 상기 정의는 단순히 중합체의 연장을 나타낼 것이므로, 링커 부분은 "-CH2CH2O-" 가 아닐 것이다. 그러나, 이는 본 발명의 링커가 하나 이상의 연속 -CH2CH2O- 부를 보유할 수 없다는 것이 아니다. 예를 들어, 링커는 상기 제공되는 바와 같은 예시적 링커의 하나 또는 조합이 한측 또는 양측에 연결된 하나 이상의 (-CH2CH2O-) 서브유닛을 포함할 수 있다.
즉, 상기된 바와 같은 링커에는 올리고머, 예컨대 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g- 가 포함될 수 있으며, 여기서 b 및 g 는 각각 독립적으로 1 내지 약 20 범위이다. 본 출원인들은, 링커 내 상기 올리고머의 도입이 링커 내에 포함되는 임의의 반응기 및 알데히드 관능부 사이의 거리를 연장시켜, 최종 중합체 알카날 생성물에 안정성을 부여할 수 있는 것을 발견하였다. 상기 방식으로, 분자간 상호작용이 불리해져서, 제조 도중 증가된 수율 및 중합체 알카날 생성물의 개선된 안정성을 도출한다. 바람직하게는, 변수 b 및 g 는 약 1 내지 10 범위이거나, 특정 경우에 있어서는 약 1 내지 6 범위이다. 링커 내에 4 개의 연속 -(CH2CH2O)- 단위를 갖는 예시적 중합체 알카날의 합성은 실시예 5 에 기재되어 있다.
-(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g- 올리고머성 절편을 포함하는 특정 링커의 부가적 예를 하기에 나타낸다 (여기서, X' 에는 하기가 포함되거나 이로서 정의된다:
-(CH2)c-De-(CH2)f-P- 또는 -(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-).
상기 예시적 구조에 있어서, P 및 T 는 각각 독립적으로 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g- 이며, b 및 g 는 각각 독립적으로 1 내지 20 이고, 나머지 변수는 상기 정의된 바와 같다. 상기 부분의 바람직한 링커의 예는 -O-C(O)-NH- (CH2CH2O)b-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -O-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-, -C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-, 및 -NH-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g- 이다.
특정 예에 있어서, 예를 들어 POLY 가 선형 중합체 절편을 나타내는 경우, 바람직하게는 중합체 알카날에 존재하는 카르보닐의 총 수는 0 또는 2 또는 그 초과이다 (여기서, 카르보닐의 총수에는 알데히드 카르보닐(들)이 포함되지 않는다). 그러나, 링커 X' 이 하나 이상의 연속 (-CH2CH2O-) 절편을 포함하는 경우, 바람직하게는 중합체 알카날 중에 존재하는 카르보닐의 총 수는 0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 그 초과이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 구조 I 을 다시 참조하면, X' 이 산소이거나 하나 이상의 (-CH2CH2O-) 절편을 포함하고, z' 이 2 내지 12 범위인 경우, 하나 이상의 경우에서 하나 이상의 R1 또는 R2 는 상기 정의된 바와 같은 유기 라디칼이거나, 대안적으로 중합체는 헤테로이관능성이다. 중합체가 헤테로이관능성인 경우, 중합체 절편 POLY 는 바람직하게는 하나의 말단에 히드록시가 아닌 반응기를 보유한다.
바람직하게는, 링커는 가수분해적으로 안정하며, 하나 이상의 하기 관능기를 포함할 수 있다: 아미드, 우레탄, 에테르, 티오에테르, 또는 요소. 그러나, 가수분해적으로 분해가능한 연결, 예컨대 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 오르토에스테르, 무수물, 이민, 아세탈, 케탈, 올리고뉴클레오티드, 또는 펩티드가 또한 본 발명의 링커에 존재할 수 있다. 헤테로원자 링커, 예컨대 O 또는 S 가 상기된 올리고머성 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g 절편을 포함하는 링커이므로 특히 바람직하다.
중합체 알카날을 제조하기 위한 중합체 절편/중합체
상기 예시된 구조에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 중합체 알카날은 수용성 중합체 절편을 포함한다. 대표적 POLY 에는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 이 포함된다. POLY 는 단독중합체, 교차 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교차 3원중합체, 랜덤 3원중합체, 또는 이들 중 임의물의 블록 3원중합체일 수 있다. 수용성 중합체 절편은 반드시는 아니지만, 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 "PEG" 또는 이들의 유도체이다.
중합체 절편은 여러 상이한 기하구조 중 어느 하나일 수 있다, 예를 들어, POLY 는 선형, 분지형, 또는 포크형일 수 있다. 가장 전형적으로, POLY 는 선형이거나, 또는 예를 들어 2 개의 중합체 팔을 갖는 분지형이다. 본원에서 논의의 상당부분이 예시적 POLY 로서 PEG 에 초점을 맞추고 있지만, 본원에 제시되는 논의 및 구조는 상기된 임의의 수용성 중합체 절편을 포함하도록 쉽게 연장될 수 있다.
하나 이상의 반응성 말단을 갖는 임의 수용성 중합체가 사용되어 본 발명에 따른 중합체 알카날을 제조할 수 있고, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 단 하나의 반응성 말단만을 보유하는 수용성 중합체가 사용될 수 있으나, 본원에 나타낸 바와 같은 중합체 알카날로의 전환에 적합한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과의 반응성 말단을 보유하는 중합체가 사용될 수 있다. 유리하게는, 물-중합체 절편 상의 히드록실 또는 다른 반응성 부분의 수가 증가할수록, 알카날기 도입에 이용가능한 부위의 수가 증가한다. 수용성 중합체 절편에 연관된 히드록실 및/또는 반응성 부분의 수의 상한치의 비제한적 예에는 500, 100, 80, 40, 20, 및 10 이 포함된다.
이제 바람직한 POLY 인, PEG 에 대해 살펴보면, "PEG" 에는 말단-캡핑된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 돌출 PEG, 및 하기에 보다 상세히 기재될 단량체 서브유닛을 분리하는 하나 이상의 분해가능한 연결을 포함하는 PEG 를 포함하는, 임의의 그 선형, 분지형 또는 다중팔 형태의 폴리(에틸렌 글리콜) 이 포함된다.
본 발명의 중합체 알카날을 제조하기 위해, 통상 사용되는 PEG 원료의 하나는 히드록실기로 각 말단이 종결된 선형 중합체인 유리 PEG 이다:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-OH.
상기 중합체, 알파-,오메가-디히드록실폴리(에틸렌 글리콜) 은 간단한 형태 HO-PEG-OH 로 나타낼 수 있으며, 또한 본원에서 PEG-디올로 언급된다 (여기서, "HO-PEG-OH" 에서의 "-PEG-" 는 하기에 해당하며: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2-,
(n) 은 전형적으로 약 3 내지 약 4,000, 또는 약 3 내지 약 3,000, 또는 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 1,000 범위이다). 구조 I 을 참조하면, POLY 는, 예를 들어 히드록시-종결 PEG, 예컨대 HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2- 일 수 있다.
본 발명의 중합체 알카날 제조에 유용한 또다른 유형의 PEG 는 말단-캡핑된 PEG 이다 (여기서, PEG 는 불활성 말단-캡핑기로 말단 캡핑된다). 바람직한 말단-캡핑된 PEG 는 말단 캡핑 부분으로서, 예컨대 알콕시, 치환 알콕시, 알케닐옥시, 치환 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환 알키닐옥시, 아릴옥시, 치환 아릴옥시기를 갖는 것들이다. 말단 캡핑기, 예컨대 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시가 바람직하다.
이제 구조 I 및 I-A 내지 I-C 를 참조하면, 특정 구현예에서, POLY 는 다음 구조에 해당하는 폴리(에틸렌 글리콜)이거나, 또는 이를 포함한다:
"Z-(CH2CH2O)n" 또는 "Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-"
(식 중, n은 약 3 내지 약 4000, 또는 약 10 내지 약 4000 범위이고, Z는 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴, 및 플루오레신과 같은 관능기이거나, 또는 이를 포함한다). 또한, 상기한 POLY 구조는 선형 중합체 절편을 나타낼 수 있거나, 또는 분지형 또는 포크형인 중합체 절편의 일부를 형성할 수도 있다. 중합체 절편이 분지형인 경우에, 바로 위에 언급한 POLY 구조는 예를 들면, 전체 POLY 구조의 일부를 형성하는 중합체의 팔에 해당한다. 대안적으로, POLY 가 포크형 구조를 보유하는 경우, 상기 POLY 구조는 예를 들면, 분지점에 앞선 중합체 절편의 선형 부분에 해당할 수 있다.
POLY는 또한 2 개의 팔, 3 개의 팔, 4 개의 팔, 5 개의 팔, 6 개의 팔, 7 개의 팔, 8 개의 팔 또는 그 초과의 팔을 갖는 분지형 PEG 분자에 해당할 수 있다. 본 발명의 중합체 알카날을 제조하는데 사용되는 분지형 중합체는 2 내지 300개 정도의 반응성 말단을 보유할 수 있다. 2 또는 3개의 중합체 팔을 갖는 분지형 중합체 절편이 바람직하다. 미국 특허 제5,932,462호에 기재된 바와 같은 예시적인 분지형 POLY는 다음 구조에 해당한다:
상기 예에서, R"은 H, 메틸 또는 PEG와 같은 비반응성 부분이고, P 및 Q는 비반응성 연결이다. 바람직한 구현예에서, 분지형 PEG 중합체 절편은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 이치환 리신이다.
상기 특정한 분지 형태에서, 분지형 중합체 절편은 링커를 통하여 반응성 알카날기의 배치를 위하여 "C" 분지점으로부터 뻗어나가는 단일 반응성 부위를 보유한다. 본 발명에서 사용되는 이와 같은 분지형된 PEG 는 전형적으로 4개 미만의 PEG 팔, 보다 바람직하게는 2 또는 3개의 PEG 팔을 가질 것이다. 이와 같은 분지형 PEG 는 그들의 선형 PEG 대응 부분보다 더 크고 치밀한 중합체 구름과 커플링되는 단일 반응성 부위를 갖는 잇점을 제공한다.
분지형 PEG 알카날의 하나의 특정한 유형은 다음 구조에 해당한다:
(MeO-PEG-)iG-X'-알카날
(식 중, i 는 2 또는 3 이고, G는 리신 또는 기타 적당한 아미노산 잔기이다).
본 발명의 예시적인 분지형 중합체 알카날은 다음에 나타낸 구조를 갖는다:
[화학식 V-A]
상기 예에서, 링커는 임의로 하기 구조 V-B 에 나타낸 바와 같은 중합체의 알카날부와 아미드 질소 사이에 위치한 올리고머성 -(CH2CH2O)b- 또는 -(CH2CH2NH)g- 절편을 포함하는 C(O)-NH에 해당한다. 올리고머성 절편의 예는, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 30 범위의 b 또는 g 값을 보유할 것이다. 바람직하게는, b 또는 g는 20 의 값을 갖는다. 바람직하게는 b 또는 g는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 값 중 어느 하나를 가질 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, b 또는 g는 2 내지 6 범위이고, mPEGa 및 mPEGb는 동일 또는 상이하다.
[화학식 V-B]
분지형 구조를 갖는 중합체 알카날이 특정 구현예로 바람직하다. 예를 들면, 한 특정 구현예에서는, 예를 들면, 구조 I 에서 POLY가 분지형인 경우, 하나 이상의 경우에서 하나 이상의 R1 또는 R2 가 상기 정의한 바와 같이 유기 라디칼이다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 예를 들면, I 구조에서 POLY가 분지형인 경우, X'는 -(CH2CH2O)b-(식중, b는 1 내지 약 20이고, 예를 들면, POLY가 리신 잔기를 포함한다)를 포함한다. POLY가 2개의 중합체 팔을 갖는 경우, POLY가 분지점으로서 "C-H"를 포함하는 경우에 어느 중합체 팔도 유일한 헤테로원자로서 산소를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 중합체 알카날을 제조하는 데 사용되는 분지형 PEG 는 보다 일반적으로 화학식 G(PEG)n(식중, G는 2개 이상의 PEG 팔이 신장되는 중심 또는 코어 분자이다)으로 나타내어지는 것을 또한 포함한다. 변수 n이 PEG 팔의 수를 나타내고, 이 경우, 각 중합체 팔은 독립적으로 말단 캡핑될 수 있거나, 대안적으로, 그의 말단에, 알카날 또는 기타 반응성 관능기와 같은 반응성 관능기를 보유할 수 있다. 일반적으로 상기 화학식 G(PEG)n으로 나타내는 것과 같은 분지형 PEG 는 2개의 중합체 팔 내지 약 300개의 중합체 팔을 보유한다(즉, n은 2 내지 약 300 범위이다). 상기와 같은 분지형 PEG는 바람직하게는 2 내지 약 25개의 중합체 팔, 보다 바람직하게는 2 내지 약 20개의 중합체 팔, 보다 더 바람직하게는 2 내지 약 15개, 또는 그보다 적은 수의 중합체 팔을 보유한다. 가장 바람직한 것은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 팔을 갖는 다중팔형 중합체이다.
상기한 바와 같은 분지형 PEG 중의 바람직한 코어 분자는 폴리올이다. 이와 같은 폴리올은 에틸렌 글리콜, 알칸 디올, 알킬 글리콜, 알킬리덴 알킬 디올, 알킬 시클로알칸 디올, 1,5-데칼린디올, 4,8-비스(히드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬리덴 디올, 디히드록시알칸, 트리히드록시알칸 등을 포함하는, 탄소수 1 내지 10이고, 히드록실기 1 내지 10인 지방족 폴리올을 포함한다. 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨, 퀘브라키톨(quebrachitol), 트레이톨, 아라비톨, 에리트리톨, 아도니톨, 둘시톨, 파코스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 리속스, 람노스, 갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 소르보스, 만노스, 피라노스, 알트로스, 탈로스, 타기토스, 피라노시드, 수크로스, 락토스, 말토스 등과 같은 직쇄 또는 폐환 당 및 당 알콜을 포함하는 지환족 폴리올을 사용할 수 있다. 추가의 지방족 폴리올은 글리세르알데히드, 글루코스, 리보스, 만노스, 갈락토스의 유도체 및 관련 입체 이성질체를 포함한다. 사용할 수 있는 다른 코어 폴리올은 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린 및 전분 및 아밀로스와 같은 기타 탄수화물을 포함한다. 바람직한 폴리올은 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨 및 트리메틸올프로판을 포함한다.
본 발명의 중합체 알카날을 제조하는데 사용되는 다중팔형 PEG 로는 넥타사(Nektar, Huntsville, Alabama)로부터 입수가능한 다중팔 PEG 를 들 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중팔 중합체 알카날은 하기 (분자의 알카날부의 상세한 사항은 본 명세서의 다른 부분에 제시되어 있다)에 해당한다.
[화학식 XIII-A]
n = 0 내지 4
대안적으로, 중합체 알카날은 전체적으로 포크형인 구조를 보유할 수 있다. 포크형 PEG의 예는, 다음 구조에 해당한다:
PEG-Y-CH-(X'-[C(R1)(R2)]z'-CHO)2
(식 중, PEG는 본원에 기재된 PEG 중 임의의 형태이고, Y는 연결기, 바람직하게는, 가수분해적으로 안정한 연결이고, 링커 및 알카날부에 해당하는 다른 변수들은 상기 정의한 바와 같다).
추가의 예시적인 포크형의 PEG 알카날 유도체는 다음의 구조에 해당한다:
[화학식 XIII-B]
PEG-Q-CH-[(CH2)m-X0 ,1-C(O)-Y-V-알카날]2
(식 중, PEG는 본원에 기재된 PEG 중 임의의 형태이다. Q는 산소, 황, 또는 -C(O)-NH-와 같은 가수분해적으로 안정한 연결이며; m은 1 내지 10이고(즉, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같을 수 있다), 바람직하게는 m은 1, 2, 3, 또는 4이며; X는 선택적인 원자이고, 존재하는 경우에는, O 또는 N이며; Y는 NH 또는 O이고; V는 상기한 바와 같은 -(CH2CH2O)b- 또는 (CH2CH2NH)g와 같은 임의의 올리고머성 절편이다). 상기 식에서 "PEG"에 해당하는 분지형 PEG의 예는 mPEG 이치환 리신이고, 이때, "PEG"는 다음에 해당한다:
대안적으로, 본 발명의 중합체 알카날을 제조하는데 사용하는 PEG 중합체 절편은 말단 보다는 PEG 쇄의 길이를 따라 돌출형 반응기를 갖는 PEG 분자로서 링커 X'에 의해 PEG 쇄에 부착되는 하나 이상의 돌출형 알카날기를 갖는 중합체 알카날을 제조할 수 있다.
또한, 중합체 절편은 가수분해되는 에스테르 연결과 같은 하나 이상의 약하거나 분해가능한 연결을 보유할 수 있다. POLY 내에 함유될 수 있는 다른 가수분해적으로 분해가능한 연결로는 카르보네이트, 이민, 포스페이트 에스테르 및 히드라존을 포함한다.
일반적으로, 수용성 중합체 절편, POLY의 겉보기 평균 분자량은 변할 것이다. POLY의 겉보기 평균 분자량은 전형적으로 다음 범위의 하나 이상에 속한다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 500 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 약 2,000 달톤 내지 약 25,000 달톤; 약 5,000 달톤 내지 약 20,000 달톤. 수용성 중합체 절편 POLY의 예시적인 겉보기 평균 분자량에는 약 1,000 달톤, 약 5,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 및 약 40,000 달톤이 포함된다. 저분자량 POLY는 분자량 약 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 5000 달톤을 보유한다.
대표적 중합체 알카날류
상기한 일반적 기술에 이어서, 본 발명에 따른 바람직한 중합체 알카날을 나타내는 일부 예시적인 구조를 후술한다.
예를 들면, 본 발명의 중합체 알카날(직쇄인 경우)은 하기 구조 II 에 따른 호모이관능성 또는 헤테로이관능성 구조를 보유할 수 있다. 하기 구조에 따른 호모이관능성 구조는 양 말단이 동일한 것이다.
[화학식 II]
X' 및 -CR1R2- 의 바람직한 값은 상기한 바와 같다. 구조 II 에 따른 특히 바람직한 구조는 POLY 가 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X'는 -O-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)b- 또는 -NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-이며, z'는 2 내지 약 12 범위이고, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6 인 것들이다. 보다 구체적으로는 본 발명의 대표적인 중합체 알카날은 다음 구조를 포함한다:
[화학식 III-A]
[화학식 IV-A]
[화학식 III-C]
[화학식 IV-C]
(식 중, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, b 및 g는 각각 독립적으로 0 내지 20이고, a는 0 내지 6이며, 나머지 변수들은 상기 정의한 바와 같다). b 및 g는 1 내지 8 범위이거나, 또는 대안적으로 1 내지 약 6 범위인 구조가 바람직하다. z'는 1 내지 약 21 범위이나, z'는 2 내지 6 범위, 예를 들면, 3 또는 4 인 구조가 바람직하다.
변수 "a"(바로 위의 구조에 나타내어져 있는)가 0인 2개의 중합체 알카날의 구조적인 대표예를 이하에 제시한다.
[화학식 III-B]
또는
[화학식 IV-B]
예시적인 중합체 부타날은 다음 구조를 보유한다:
[화학식 III-D]
상기 구조 III-D 에 해당하는 특히 바람직한 PEG 로는 다음의 것을 들 수 있다:
Z-(CH2CH2O)n- 또는
본 발명에 따른 추가의 분지형 구조들은 다음과 같다 (식 중, b는 전형적으로 0 내지 20이고, s는 전형적으로 0 내지 6이며, d는 1, 2 또는 3이다).
[화학식 VI-A]
*또는
[화학식 VI-B]
상기 구조 VI-A 및 B 에서, PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 바람직하게는 R1 및 R2는 각각의 경우 H이고, z'는 3 내지 12 범위이며, 보다 더 바람직하게는 3, 4, 5 또는 6이다. 한 예로서, 구조 VI-B 에 따른 중합체는 PEG가 다음 구조에 해당하는 것이다:
(식 중, Z는 상기한 바와 같이 말단 캡핑기이거나 또는 관능기이다).
본 발명의 다른 예시적인 중합체 알카날은 하기 나타낸 구조를 보유한다:
[화학식 XIV]
상기 구현예에서, 중합체 알카날은 또한 포크형 구조를 가지고, 2 개의 생물학적 활성제에 대한 공유 부착에 적당하다. 상기한 구조는 -CH- 분지점으로부터 신장되는 부분에, 올리고머성 -(CH2CH2O)- 절편을 포함하는 링커를 포함한다 (이때, 각 부분 내의 이와 같은 절편의 수는 3이다). 상기 구조에서 이와 같은 올리고머성 절편의 수는 상기한 일반화된 기술에 따라 변화할 수 있다.
또 다른 예시적인 중합체 알카날 구조는 하기의 것을 포함한다(식중, 변수는 상기 정의한 바와 같다):
[화학식 VII]
[화학식 VII-A]
[화학식 VIII]
바람직하게는, 상기 구조 중의 어느 하나는 이후 보다 상세하게 기재하는 독특한 조성물 특징의 하나 이상을 갖는 조성물로서 제공된다.
형성된 중합체 알카날 조성물의 특성 및 제조 방법
본 발명의 중합체 알카날은, 앞서 제조된 중합체 알데히드에 비해 다수의 장점을 가진다. 먼저, 중합체 알카날은 매우 고수율로 제조되는데, 이는 특히 링커 잔기로써 산소를 가지는 알카날에 대한, 사용한 합성법의 단순성에 일부 비롯한 것이다. 또한, 본 발명의 부타날 안정성 검사에서, 이들 유형의 알카날은, 이미 알려진 중합체 알데히드 유도체 (예컨대, 프로피온알데히드, 아세트알데히드) 보다, 염기성 pH에서 보다 안정하고, 유의하거나 심지어 검출가능한 양의 역-Michael 형 반응 부산물이 없이 생성됨이 밝혀졌다. 일례로, 실시예 3에 개시된 바와 같이, 염기성 조건하에서, mPEG 프로피온알데히드는 역-Michael 형 반응을 거쳐, mPEG-OH 및 제거 산물인 아크롤레인을 상당량 생성한다 (pH 8 및 실온에서 24 시간 이후, 거의 40%의 PEG-프로피온알데히드가 분해됨). 반면, mPEG 부티르알데히드는 염기성 조건에서 보다 매우 안정하며, 이는, 사용한 조건하에서 상기 종류의 분해가 본질적으로 발생하지 않음을 나타낸다.
또한, 본 발명의 부타날 중합체 유도체는, 약 50% 수화물에서 해당 수화물과 물에서 평형에 이르며, 이는, 프로피온알데히드가 나타내는 70% 수화물 평형 및, 아세트알데히드가 나타내는 100% 수화물 평형에 비해 매우 낮은 것이다. 본 발명의 중합체 유도체의 저반응성은 또한, 염기성 조건하에서 본 발명 유도체의 현저하게 높은 안정성에 의해 입증된다 (하기 실시예 3 참조). 본 발명의 알데히드 유도체 및 단백질 또는 기타 분자의 염기성 pH 에서의 콘쥬게이션 반응 동안, 아크롤레인 부산물은 관측되지 않는다. 본 발명의 알데히드 유도체의 저반응성은, 본 발명의 유도체가 보다 선택적이어서, 본 발명의 유도체가 단백질 또는 펩티드 상의 특정 아미노기, 특히 N-말단 아미노기와 높은 선택성 또는 특이성으로 반응할 수 있음을 나타내며, 이는, 단백질 또는 펩티드 분자 상의 아미노기 임의의 수와의 비선택적 또는 랜덤 반응과 대비된다. 많은 적용에 있어, 중합체 주쇄의 선택적인 N-말단 부착은, 단백질의 형태 및 생활성의 더 나은 보존 면에 있어 바람직하다.
또한, 본 발명의 중합체 알카날은 약한 산성 조건, 즉, PEG 아세트알데히드 또는 PEG 프로피온알데히드에 필요한 산성 조건보다 훨씬 약한 조건 하에서 가수분해에 의해 해당 아세탈 전구체로부터 생성된다. 필요시, 그러한 약한 산성 조건은 본 발명의 중합체 유도체와 단백질, 펩티드 또는 기타 분자 표적의 분리 단계 개입을 필요로 하지 않는 직접적 원 위치 반응을 가능하게 한다. 나아가, 사용한 합성 접근법으로 인해, 본 발명의 중합체 알카날은 요오드 함유 종 또는, 중합체 절편의 분해를 촉진할 수 있는 종이 존재하지 않는 고순도로 또한 제공된다.
사용한 합성 접근법의 온화성, 또한 여기에서 제공되는 구조의 안정적 특성 때문에, 본 발명의 중합체 알카날은, 역-Michael 형 반응 산물이 본질적으로 부재하는 조성물로 추가로 제공된다. 따라서, 여기에서 제공되는 중합체 알카날 조성물은 특히 저장에 안정하여, 중합체 분해가 있는 경우라도 그 양이 매우 제한적이다. 일례로, 시간에 걸쳐 수합한 안정성 데이터에 비추어 볼 때, 본 발명의 중합체 알카날은 40℃에서 15일간 저장시 중합체 알데히드 기가 약 10% 미만으로 분해되는 것으로 나타났다. 이러한 분해 백분율은 NMR 분석에 의해 결정된다. 또한, 본 발명에서는 선형 mPEG 중합체 알카날이 제공되며, 이는, 대응 PEG-디알카날 (즉, mPEG-OH 원료 물질 내 PEG-디올 양의 존재에 따른 호모이관능성 PEG 불순물)이 실질적으로 존재하지 않는 것이다.
이제 보다 구체적으로 본 발명의 중합체 알카날의 제조 방법에 주목하면, 중합체 알카날은 보통 하나 이상의 반응기 Y를 가지는 수용성 중합체와, Y에 의한 대체 또는 그와 다르게는 Y와의 반응에 적절한 반응기 K를 가지는 보호된 알카날 시약간의 반응에 의해, 보호된 형태로 수용성 중합체 알카날을 형성하기에 효과적인 조건하에서 제조된다. 일반적으로, 보호된 알카날 시약은 약 2 내지 약 20개의 탄소원자를 가질 것이다. 이에 따라 형성된, 보호된 형태의 수용성 중합체 알카날은, 일례로 산성 조건하에서 보통 가수분해되어, 목적 수용성 중합체 알카날을 형성한다.
일반적으로, 커플링 반응 (즉, 반응성 중합체와 보호된 알카날 시약간의 커플링)은, 톨루엔, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 아세토니트릴, 아세톤, 디옥산, 메탄올 및 에탄올과 같은 유기 용매 중에서 실시한다. 반응은 바람직하게 불활성 대기하, 약 20℃ 내지 약 150℃ 범위의 온도하에서 실시한다. 목적 알카날을 형성하기 위한 가수분해는 보통 산에 의해 촉매되는 것으로, 7.0 미만의 pH, 바람직하게는 약 3 내지 약 6.5 범위의 pH에서 실시한다. 가수분해는, 약 3, 4, 5 또는 6의 pH에서 실시할 수 있으며, 3 근처의 낮은 pH가 바람직하다.
상기한 합성 접근법의 구체적 실시예는 실시예 1, 2, 5 및 17에 제공된다.
가장 전형적으로는, 중합체 절편을 보호된 알카날 시약과 커플링하는 것은, 윌리암슨 에테르 합성에 의해 실시한다. 보다 구체적으로, 중합체의 반응기 Y는 히드록실 (강염기 존재하에서는 대응 음이온성 또는 알콕시 형태로 변환하는 것)이고, 보호된 알카날 시약 아세탈 상의 반응기 K는 우수한 이탈기, 예컨대 할라이드 (바람직하게는 Cl- 또는 Br-) 또는 메틸 술페이트 (술포네이트 에스테르)이고, 이는 중합체 말단에 존재한 산소 음이온에 의해 쉽게 대체될 수 있다. 바람직한 생성 연결은, POLY를 알카날에 연결하는 에테르 연결 (O-)이다.
POLY로의 부착 이후, 보호된 알카날은 산성 pH에서 가수분해되어 대응 알데히드 또는 알카날 관능기를 생성한다. 상기한 바와 같이, 부타날 아세탈과 같은 알카날 아세탈은, 대응 프로판알 또는 에탄알 아세탈에 비해 보다 온화한 조건에서 가수분해된다. 일례로, z'이 3 이상인 경우, 본 발명의 알카날 아세탈은 약 3 또는 4, 또는 그 초과의 pH에서 가수분해될 수 있으며, 특히 R1 및 R2가 모든 경우 H일 때 그러하다. 실시예 2 및 4에 기재한 바와 같이, 기재한 부타날 아세탈기는 pH 3에서 약 3시간 내에 가수분해된다. 온화한 산성 조건하에서 이러한 알카날 관능기를 형성하는 능력은 콘쥬게이션에 적절한 pH (일반적으로 약 5 내지 약 10의 pH)로, 중합체 알카날 함유 용액을 중화한 이후, 단백질 또는 기타 생활성 분자로의 콘쥬게이션을 위한 알데히드 관능화된 중합체의 원 위치 사용을 가능하게 때문에 유리하다. 반면, 선형 중합체 프로피온알데히드는, 낮은 pH 용액을 중화하는데 필요한 염기량 및, 그러한 중화 단계 동안 생성되는 대응 염의 상당량 때문에, 콘쥬게이션 이전의 단리가 필요하다.
사용되는 방법에서, 보호된 알카날 시약은 보통 아세탈, 예컨대 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈, 디이소프로필 아세탈, 디벤질 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸 아세탈, 비스(2-니트로벤질)아세탈, S,S'-디메틸 아세탈, 및 S,S'-디에틸 아세탈이다. 대안적으로, 아세탈은 시클릭 아세탈 또는 시클릭 티오아세탈일 수 있다.
보다 구체적으로, 보호된 알카날은 하기의 구조를 보통 가질 것이다:
[화학식 XI-D]
상기 구조에서, z'은 1 내지 약 21의 정수이다. 상기한 중합체 알데히드에서, R1은 각 경우에서 독립적으로 H 또는, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴 및 치환 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고; R2은 각 경우에서 독립적으로 H 또는, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴 및 치환 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다. Wa 및 Wb는, 각각 독립적으로 O 또는 S이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는, 메틸, 에틸, 이소프로필, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 및 니트로벤질로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이거나, 또는 함께 취해지는 경우, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 은, Wa, C1 및 Wb를 함께 고려할 때 5원 또는 6원 고리를 형성한다.
바람직하게 K는 하기 반응기 중의 하나이다:
본 방법에서, 보호된 형태의 중합체 알카날은 보통 약 85% 초과의 수율, 보다 바람직하게는 약 90-95% 초과의 수율로 형성된다.
목적하는 알데히드 관능기화 중합체 수득을 위한 가수분해 이후, 필요시에는 반응 혼합물을 중화하여, 예컨대 pH를 약 6.0 에서 약 7.5로 올리고, 이후, 유기 용매 내로 중합체 알카날을 추출하고, 예컨대 회전 증발, 동결건조 또는 증류에 의해 용매를 제거하여, 생성물을 단리할 수 있다.
목적하는 알데히드 관능기를 제공하기 위해 직접적인 산화 방법 또는 요오드 함유 종을 사용하지 않는 이러한 접근법의 단순성 덕분에, 생성된 산물은 매우 고순도로써, 이는, 기타 공지의 중합체 알데히드에 비해 증가된 저장 안정성을 시사하며, 낮은 다분산도 값을 가진다 (약 1.5 미만, 바람직하게는 약 1.2 미만이며, 보통 다분산성은 약, 1.1, 1.08, 1.05, 1.04 및 1.3 미만이다). 1.03, 1.02 및 1.01 와 같이 낮은 다분산성을 가지는 중합체를 이와 같이 제조한다.
본 발명의 단리된 중합체 알카날은, 중합체성 오염물을 기준으로, 바람직하게는 약 95% 이상의 순도를 가질 것이다.
실시예 1 및 2는, mPEG 중합체 알카날의 형성을 예시한다. 일례로, 중합체 출발 물질이 PEG-디올인 경우, 보호된 알카날 시약으로 반응 이전에 PEG 히드록실기 중 하나를 보통 보호하고, 이후 탈보호한 후 커플링한다. 이와 같이 형성된 예시적 중합체 보호 알카날 모두는 하기의 구조 XI-E로 개시된다:
[화학식 XI-E]
PEG의 히드록시 말단은 이후, 필요시에는 관능기로 전환되어 호모이관능성 또는 헤테로이관능성 보호된 알카날을 제공할 수 있다. 적절한 관능기는, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 히드라지드, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드 및 실란을 포함한다. 관능기, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 비닐술폰, 및 말레이미드, N-숙신이미딜 카르보네이트, 히드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 글리시딜 에테르, 옥시카보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데히드, 오르토피리딜-디술피드 및 아크릴로일이 바람직하다.
기타 대표적인 알카날 시약은 하기 구조로 기재된다:
[화학식 XI-F]
[화학식 XI-G]
다른 접근법에서, 본 발명의 중합체 알카날은 크로마토그래피적으로 정제한 POLY-Y로부터 유리하게 제조된다. 이러한 방식에서, 만약 존재하는 경우, 중합체 불순물 및 특히 PEG-디올에서 비롯된 이관능성 불순물을 제거하여, 상기한 바와 같은 극히 고순도의 중합체 알카날 생성물을 형성하게 된다. 이러한 접근법은, 실시예 5에 예시된다. 사용한 합성 접근법의 전반적 요약, 그 장점, 본원에 개시한 일반적 방법에 대한 그 적용성, 및 실행한 반응의 구체적인 점은 실시예 5에 개시하였다.
어떤 크로마토그래피 분리법도 사용 가능하나, 이온교환 크로마토그래피가 특히 바람직하며, POLY-Y의 Y는 이온화가능한 기 또는 이온화가능한 기의 유도체, 예컨대 카르복실산, 활성 에스테르, 아민 등이다.
*본 발명의 중합체 알카날 아세탈의 예는, 임의의 하기 구조를 가질 수 있고, 변수들은 상기 기재한 바와 같다:
[화학식 IX]
[화학식 IX-A]
본 발명의 중합체 알카날을 제조하기 위한 다른 접근법에 있어서, 중합체 알카날은 중합체 절편 POLY 를, 예를 들면 직접 중합에 의해서 아세탈 전구체상에 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 방법에서는, 먼저, 중합을 개시시키는데 적합한 하나 이상의 활성 음이온성 부위를 갖는 아세탈 전구체를 제공한다. 이어서, 아세탈 전구체의 음이온성 부위를 중합할 수 있는 반응성 단량체와 접촉시켜 아세탈 전구체상에서 반응성 단량체의 중합을 개시시킨다. 접촉 단계의 결과로서, 추가의 반응성 단량체를 아세탈 전구체에 첨가하여 중합체 사슬을 형성시킨다. 접촉은 원하는 길이의 중합체 사슬에 도달할 때까지 계속하고, 이어서 반응을 종료하여 본 발명의 중합체 알데히드 전구체를 수득한다.
수득된 중합체 알데히드 전구체는 필요에 따라, 상기 언급한 바와 같은 대응하는 알카날로 추가로 가수분해시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응성 단량체는 에틸렌 옥사이드이고, 아세탈 전구체내에 함유된 반응성의 음이온성 부위는, 바람직하게는 알칼리 금속 또는 다른 적합한 짝이온을 수반하는 알콕시드 음이온 (O-) 이다. 아세탈 전구체내에 존재하는 알콕시드 말단기는 본 발명의 중합체 알카날을 형성시키기 위한 에틸렌 옥사이드의 음이온성 개환 중합에 활성이다.
더욱 구체적으로는, 아세탈 전구체는 일반적으로 하기 화학식에 해당하는 구조를 가질 것이다:
(식 중, 변수는 전술한 값을 가지며, 단, X' 는 산소 음이온 또는 O- 로 종결된다 (예를 들면, 중성 형태에서, X' 는 전형적으로 히드록실기 또는 -OH 로 종결되고, 이것은 강 염기 존재하에서 대응하는 알콕시드염으로 전환된다)). 적합한 짝이온은 Na+, K+, Li+ 및 Cs+ 를 포함한다. 종결 단계는 일반적으로, 예를 들면 산 첨가에 의해서 반응을 중화시키는 것을 포함한다. 임의로, 중합체 절편은 알킬화 시약 또는 비반응성 말단을 제공하는데 적합한 다른 시약을 첨가하여 캡핑시킬 수 있다.
상기 방법의 한가지 특별한 구현예에 있어서, POLY-Y 는 구조 Z-(CH2CH2O)nH (식 중, n 은 약 10 내지 약 4000 이고, Z 는 -OCH3, -OCH2CH3 및 -OCH2(C6H5) 로 구성된 군에서 선택된다) 에 해당한다. 또다른 양태에 있어서, POLY-Y 는 구조 Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O-M+ 에 해당하며, 여기서 POLY-Y 는 강염기로의 Z-CH2CH2OH 의 말단 -OH 기의 금속화에 의해 제조되는 Z-CH2CH2O-M+ 와 같은 말단 캡핑 알콜레이트염상에서 에틸렌 옥사이드의 음이온성 개환 중합에 의해 제조된다. M+ 는 Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+ 와 같은 금속 짝이온을 나타낸다. 이어서, 이와 같이 제조된 POLY-Y 는 전술한 바와 같은 보호된 알카날 시약과의 반응에 적합하다.
이 접근법의 개요를 말하는 일반화도가 본원에서 도 1 로서 제공되며, 이러한 반응 또는 일련의 반응을 수행하기 위한 조건이 실시예 15 에서 제공된다.
중합체 알카날 시약의 보관
바람직하게는, 본 발명의 중합체 알카날은 아르곤하에서 또는 질소하에서와 같은 불활성 분위기하에서 보관하는데, 그 이유는 알데히드 관능기가 대기 산소와 반응하여 대응하는 카르복실산을 생성할 수 있기 때문이다. 상기 분자의 알데히드부와 물의 반응 (예를 들면, 수분에의 노출에 의해 대응하는 수화물을 형성) 가능성으로 인해, 본 발명의 중합체 알카날의 수분에의 노출을 최소화하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 바람직한 보관 조건은 약 -15 ℃ 미만의 온도에서의 건조 아르곤 또는 다른 건조 불활성 기체하이다. 저온 조건하에서의 보관은 중합체 알데히드의 대응하는 수화물 형태로의 가수분해율을 감소시킨다. 또한, 중합체 알카날의 중합체 절편이 PEG 인 경우에서, 알카날의 PEG 부는 산소와 서서히 반응하여 상기 분자의 PEG 부를 따라 퍼옥시드를 형성시킬 수 있다. 퍼옥시드의 형성은 궁극적으로 사슬 절단을 야기할 수 있으므로, PEG 알카날 시약의 다분산도를 증가시킬 수 있다. 상기의 관점에서, 본 발명의 PEG 알카날은 암흑속에서 보관하는 것이 또한 바람직하다.
생물학적 활성 콘쥬게이트
커플링 화학
단백질에의 콘쥬게이션 - 랜덤 및 N-말단 선택적
전술한 중합체 알카날은 반응에 이용할 수 있는 하나 이상의 아미노기를 갖는 생물학적 활성제 또는 표면에 콘쥬게이션하는데 유용하다. 전형적으로, 본 발명의 PEG 알데히드는 환원성 아민화에 의해 아미노기에 커플링되어, 중합체 절편과 표면 또는 생물학적 활성제 사이에 2 차 아민 결합을 형성시킨다. 본 발명의 중합체 알카날과 아미노 함유 생물학적 활성제 또는 표면의 콘쥬게이션에서, 중합체 알카날은 적합한 용매중에서 표적 아미노 함유 분자와 반응하여 대응하는 이민 결합 중간체를 형성시키고, 이어서 이것은 환원되어 중합체와 생물학적 활성제 또는 표면 사이에 2 차 아민 연결을 형성시킨다. 이민의 대응하는 아민으로의 환원은 환원제의 첨가에 의해 달성된다. 환원제의 예는 나트륨 시아노보로히드라이드, 나트륨 보로히드라이드, 리튬 알루미늄 히드라이드 등을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 중합체 알데히드는 N-말단 아미노산에서 알파 아민의 반응성을 차별화시키는 조건하에서 N-말단을 선택적으로 개질시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정한 중합체 알카날은 종래 공지의 알데히드 유도체보다 높은 선택성을 입증하는 것으로 보이며, 따라서 선택적 N-말단 단백질 개질이 요구되는 적용에 더욱 적합하다. N-말단 개질 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위한 반응 조건은 (i) 개질시키고자 하는 단백질 또는 펩티드를 비아민 함유 완충액 (예를 들면, 약 4 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5 내지 6.5 범위의 pH 에서, 가장 바람직하게는 약 5 내지 5.5 의 pH 에서) 에 용해시키고, (ii) 상기 단백질 또는 펩티드 용액에 본 발명의 중합체 알카날을 첨가하고, (iii) 단백질 또는 펩티드와 중합체 알카날을 반응시켜 이미드 커플링 중합체 콘쥬게이트를 형성시키고, 이어서 (iv) 환원제를 첨가하여 대응하는 2 차 아민 커플링 중합체 콘쥬게이트를 형성시키는 것을 포함한다. 중합체 알카날의 랜덤 부착의 반응 조건은, pH 가 다소 높은 것 (하기에서 보다 상세히 논의될 것임) 이외에는, 본질적으로 전술한 것과 동일하다.
N-말단 개질을 장려하기 위해서는 약 5 내지 5.5 의 pH 가 가장 바람직한데, 그 이유는 이것이 N-말단 아미노산의 아미노기와 라이신의 아미노기의 pKa 값의 차이에 기인하여 선택적 N-말단 개질화를 용이하게 하는 것으로 생각되기 때문이다. 대체로, N-말단 선택성을 장려하는 조건은 7 미만, 및 전형적으로 약 4 이상의 pH 를 포함한다. N-말단 선택성을 촉진하는 가장 바람직한 pH 는 당업자에 의해서 결정될 수 있으며, 개질시키고자 하는 특정 단백질에 의존할 것이다. 콘쥬게이션을 수행하는데 적합한 완충액은 인산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨 및 인산염 완충 염수 (PBS) 를 포함한다. 전형적으로, 중합체 알카날은 표적 단백질과 동몰량 또는 이보다 과량 몰로 단백질 함유 용액에 첨가된다. 중합체 알카날은 약 1:1 (중합체 알카날: 단백질), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 또는 10:1 의 몰비로 표적 단백질에 첨가된다. 표적 단백질에 비해 과량인 PEG-알카날의 몰은 전형적으로 약 2 내지 5 의 범위이다. 환원성 아민화 반응은 전형적으로 약 실온 (25 ℃) 또는 그 미만의 온도에서 약 1 내지 24 시간 동안 수행되지만, 상기 온도는 약 -15 ℃ 내지 약 100 ℃, 더욱 바람직하게는 약 4 ℃ 내지 37 ℃ 범위일 수 있다. 환원제는 또한 전형적으로 과량으로, 즉 중합체-단백질 콘쥬게이트에 대해 약 2 배 내지 30 배 과량 몰 범위의 양으로 첨가된다. 중합체-단백질 콘쥬게이트에 대해 10 배 내지 20 배 과량 몰로 환원제를 첨가하는 것이 바람직하다. 정확한 반응 시간은 시간에 따른 반응의 진행을 모니터링하여 결정된다. 반응의 진행은 전형적으로 여러 시점에서 반응 혼합물로부터 분취량을 취하고, 반응 혼합물을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광계 또는 임의의 다른 적합한 분석법으로 분석하여 모니터링한다. 수득된 peg화 콘쥬게이트는 또한 MALDI, 모세관 전기영동, 겔 전기영동 및/또는 크로마토그래피와 같은 분석법을 사용하여 더욱 특징분석된다.
보다 상세하게는, 알데히드 중합체 유도체를 단백질 또는 펩티드에 커플링시키기 위해서, 여러가지 상이한 접근법이 사용될 수 있다. 한가지 접근법 (즉, 랜덤 peg화 접근법) 은 표면이 접근하기 쉬운 임의의 수의 라이신 잔기에 PEG 를 공유 부착시키는 것이다. 이러한 반응을 수행하기 위해서, 단백질 또는 펩티드 (예를 들면, 하기에 제공되는 생체분자의 예들) 를 전형적으로 통상 약 5 내지 8 범위의 온화한 pH 에서 비아민 함유 완충액중에서 본 발명의 중합체 알카날과 반응시킨다 (비아민 함유 완충액이, 완충액중의 아미노기가 중합체 알카날에의 커플링을 위해 단백질 아미노기와 경쟁할 수 있기 때문에 바람직하다). 적합한 비아민 함유 완충액은 콘쥬게이션 화학을 수행하기 위한 요구되는 pH 범위에 대해 적절한 pK 를 갖는 것이 선택된다. 커플링 반응은 일반적으로 수 분 내지 수 시간 사이 (예를 들면, 5 분 내지 24 시간 이상 사이) 에 일어나며, 평균적으로, 커플링은 약 0.2 내지 4 시간 사이에 이루어져 이미드 커플링된 콘쥬게이트를 형성시킨다. 이어서, 전술한 바와 같은 여러가지 적합한 환원제중 임의의 하나 (예를 들면, 나트륨 시아노보로히드라이드) 를 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 수득된 혼합물은 일반적으로 저온 내지 주위 온도 조건하에서, 예를 들면 4 ℃ 내지 37 ℃ 에서 약 1 시간 내지 48 시간 동안 반응시킨다. 바람직하게는, 환원 반응은 약 24 시간 미만에서 완료된다. 랜덤 커플링은 약 7 내지 7.5 정도의 pH 에서 장려되는 반면, N-말단에서의 커플링은 낮은 pH (예를 들면 약 5.5 정도) 에서 장려된다.
개질 정도를 증가시키기 위해서, 즉 표적 분자상의 이용 가능한 부위에서 공유 부착되는 PEG 수의 증가를 촉진시키기 위해서, 임의의 하나 이상의 전술한 조건 (예를 들면, 중합체 알카날과 단백질 또는 펩티드의 몰비, 온도, 반응 시간, pH 등) 을 독립적으로 또는 동시에 증가시킬 수 있다. 사용되는 PEG 알카날의 분자량과 무관하게, 수득되는 생성물 혼합물은 과량의 시약, 비 peg화 단백질 (또는 임의의 표적 분자), 다중 peg화 콘쥬게이트 및 유리 또는 비반응 PEG 알카날을 분리 제거하기 위해 정제하는 것이 바람직하나, 반드시 필요한 것은 아니다.
실례가 되는 단백질의 랜덤 peg화는 실시예 4 및 6 에서 제공된다. 실례가 되는 단백질의 부위 선택적 peg화는 실시예 7 내지 13 에서 기재되어 있다.
PEG 체의 특성분석/임의적 분리
임의로는, 본 발명의 PEG 알데히드와 생물학적 활성제의 반응에 의해 제조되는 콘쥬게이트는 정제하여 상이한 PEG 화 종을 수득/단리한다. 대안적으로는, 그리고 보다 바람직하게는, 예를 들면 약 20 킬로달톤 (kilodalton) 미만, 바람직하게는 약 10 킬로달톤 이하의 분자량을 갖는 저분자량 PEG 의 경우, 생성물 혼합물을 정제하여 단백질 분자당 대략 특정수의 PEG 분포를 수득할 수 있다. 예를 들면, 생성물 혼합물을 정제하여 단백질당 평균 1 내지 5 개의 PEG, 전형적으로는 단백질당 평균 약 3 개의 PEG 를 수득할 수 있다. 최종 콘쥬게이트 반응 혼합물의 정제 방법은 여러가지 인자, 즉 사용되는 중합체의 분자량, 특정 단백질, 원하는 투여 요법, 및 개개의 콘쥬게이트(들) 종의 잔류 활성 및 생체내 성질에 의존할 것이다.
필요에 따라서, 상이한 분자량을 갖는 PEG 콘쥬게이트는 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 단리할 수 있다. 즉, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 상이한 분자량 (그 차이는 본질적으로 PEG 사슬의 평균 분자량에 해당한다) 에 근거해서 상이한 PEG 체 (단량체, 이량체, 삼량체 등) 을 분류한다. 예를 들면, 100 kDa 단백질을 약 20 kDa 의 분자량을 갖는 PEG 알카날로 랜덤 콘쥬게이션시키는 전형적인 반응에서, 수득되는 반응 혼합물은 개질되지 않은 단백질 (MW 100 kDa), 모노peg화 단백질 (MW 120 kDa), 디peg화 단백질 (MW 140 kDa) 등을 함유할 것이다. 이 접근법은 상이한 분자량을 갖는 PEG 콘쥬게이트를 분리하는데 사용될 수 있으나, 일반적으로 단백질내에 상이한 peg화 부위를 갖는 위치 이성질체를 분리하는데는 효과적이지 않다. 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피를 PEG 단량체, 이량체, 삼량체 등의 각각의 다른 혼합물로부터 분리하는데 사용할 수 있으나, 각각의 회수된 PEG 체 조성물은 단백질내의 상이한 반응성 아미노기 (예를 들면, 라이신 잔기) 에 부착된 PEG 를 함유할 수 있다.
이 유형의 분리를 수행하는데 적합한 겔 여과 컬럼은 Amersham Biosciences 에서 시판되는 SuperdexTM 및 SephadexTM 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼의 선택은 원하는 분류 범위에 의존할 것이다. 용출은 일반적으로 포스페이트, 아세테이트 등과 같은 비아민계 완충액을 사용하여 수행된다. 수집된 분획은 여러가지 상이한 방법, 예를 들면 (i) 단백질 함량에 대한 280 ㎚ 에서의 OD, (ii) BSA 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 시험 (Sims G.E.C., 등, Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980), 또는 대안적으로, (iv) SDS PAGE 겔 수행, 이어서 요오드화바륨으로의 착색에 의해서 분석할 수 있다.
위치 이성질체의 분리는 RP-HPLC C18 컬럼 (Amersham Biosciences or Vydac) 을 사용하는 역상 크로마토그래피, 또는 이온 교환 컬럼, 예를 들면 Amersham Biosciences 에서 시판되는 SepharoseTM 이온 교환 컬럼을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 수행된다. 다른 접근법이 동일한 분자량을 갖는 PEG 바이오분자 이성질체 (위치 이성질체) 를 분리하는데 사용될 수 있다.
보관
*수득되는 PEG 콘쥬게이트, 이후의 콘쥬게이션, 및 임의로 부가의 분리 단계에 대해 의도되는 용도에 따라서, 콘쥬게이트 혼합물은 농축, 살균 여과, 및 약 -20 ℃ 내지 약 -80 ℃ 의 저온에서 보관할 수 있다. 대안적으로는, 콘쥬게이트는 잔류 완충액과 함께 또는 이것 없이 동결건조되어, 동결건조 분말로서 보관될 수 있다. 몇가지 예에 있어서, 아세트산나트륨과 같은 콘쥬게이트에 사용되는 완충제를 동결건조 동안에 쉽게 제거될 수 있는 탄산암모늄 또는 아세트산암모늄과 같은 휘발성 완충액으로 교환하여, 동결건조된 단백질 콘쥬게이트 분말 제제에 잔류 완충액이 없도록 하는 것이 바람직하다. 대안적으로는, 완충액 교환 단계는 제제 완충액을 이용하여 사용할 수 있으며, 이로써 동결건조된 콘쥬게이트는 제제 완충액으로의 재구성 및 궁극적으로 포유동물에의 투여에 적합한 형태가 된다.
소분자 콘쥬게이션
세부적인 반응 조건이 개질될 소분자에 따라 달라질 수 있음에도 불구하고 본 발명의 PEG-알카날의 암포테리신 B와 같은 소분자에의 콘쥬게이션은 일반적으로 실시예 14에 기술된 바와 같이 수행된다. 보통, 콘쥬게이션은 소분자에 대하여 PEG 시약의 약간의 몰 과량, 예를 들어 약 1.2 - 1.5, 약 5 내지 10-배 몰 과량을 이용하여 수행된다. 일부의 경우에서, 분자에 따라서, 소분자 약물은 미반응 약물이 용액 중에 남아있을때, PEG-소분자 콘쥬게이트가 반응 용매, 예를 들어 에테르에 침전되는 경우와 같이 실제로 초과로 사용될 수 있다.
표적 분자 및 표면
본 발명의 반응성 중합체 알카날은 공유 혹은 비공유로 막, 화학적 분리 및 정제 표면, 고체 지지물, 금속/금속 산화물 표면 예컨대 금, 티타늄, 탄탈륨, 니오븀, 알루미늄, 강철 및 이들의 산화물, 산화규소, 거대분자 및 소분자를 포함하는 다수의 실체들에 부착될 수 있다. 추가로 본 발명의 중합체들 또한 생화학적 센서, 바이오전기 스위치(bioelectronic switch) 및 게이트에서 사용될 수 있다. 본 발명의 중합체 알카날은 또한 친화도 분배용 중합체-리간드 콘쥬게이트, 가교결합 혹은 비가교결합된 히드로겔, 및 바이오반응기용 중합체-보조인자 부가물을 제조하기 위하여 펩티드 합성, 중합체-코팅된 표면 및 중합체 그래프트의 제조를 위한 담체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 중합체에 커플링시 사용을 위한 생물학적 활성제는 하기 중에서 임의의 하나 이상일 수 있다. 적합한 제제는 예를 들어 최면제 및 진정제, 항우울제, 정신 안정제, 호흡기계 약물, 항경련제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 진통제, 항염증제, 항불안제 (anxiolytics), 식욕 억제제, 편두통 치료제, 근육 수축제, 항감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신) 항관절염제, 항말라리아제, 진토제, 항간질제, 기관지 확장제, 사이토카인, 성장인자, 항암제, 항응고제, 항고혈압제, 심혈관계 약물, 항부정맥제, 항옥시칸트, 항천식제, 피임제, 교감신경 유사약물, 이뇨제를 포함하는 호르몬 제제, 지질 조절제, 항안드로겐 제제, 항기생충제, 항응고제, 종양제, 항종양제, 혈당강하제, 영양제 및 보충제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 조영제로부터 선택될 수 있다.
보다 상세하게는, 활성제는 소분자 (바람직하게는 불용성 소분자), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 다당류, 스테로이드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지방, 전해질 등의 다수의 구조적 부류 중의 하나에 속할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 중합체 알카날에 커플링을 위한 활성제는 고유 아미노기를 갖거나, 또는 선택적으로 변형되어 본 발명의 중합체 알카날에 커플링을 위해 적절한 하나 이상의 반응성 아미노기를 포함한다.
본 발명의 중합체로의 공유 부착을 위해 적절한 활성제의 구체적인 예로로는 아스파리기나아제, 암독소비르 (DAPD), 안티드, 베카플레르민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리트로포이에틴 (EPO), EPO 작동제 (예를 들어, 길이 약 10-40 아미노산 및 WO 96/40749 에 기술된 바와 같은 특정 코어 서열을 포함하는 펩티드), 도나제 알파, 에리트로포이에시스 자극 단백질 (NESP), 응고인자 예컨대 Factor V, Factor VII, Factor VIIa, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, von Willebrand factor; 세레다제, 세레자임, 알파-글루코시다제, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 디펜신, 베타 디펜신, 엑센딘-4, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로티나제 저해제, 엘카토닌, 과립구/대식구 집락 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 골 형성 단백질 예컨대 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-6, OP-1; 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론; 인터루킨 및 인터루킨 수용체 예컨대, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체; 락토페린 및 락토페린 단편, 황체형성호르몬-방출호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 특허 No. 5,922,675 에 기술된 바와 같은 모노-아실화 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인플루엔자 백신, 인슐린양 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 대식구 집락 자극 인자 (M-CSF), 플라스미노겐 활성제 예컨대 알테프라제, 유로키나제, 레테플라제, 스트렙토키나제, 파미테플라제, 라노테플라제, 및 테네테플라제; 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테게린, 혈소판-유도된 성장 인자, 조직 성장 인자, 형질전환 성장 인자-1, 혈관 내피세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 각화세포 성장 인자 (KGF), 신경교세포 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 단핵구 화학주성 단백질-1, 내피세포 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤양펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 저해제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 항트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 (very late antigen-4), VLA-4 저해제, 비스포스포네이트, 호흡기 세포융합 바이러스 항체, 낭성 섬유증 막통과 조절제 (CFTR) 유전자, 데옥시리보뉴클레이스 (Dnase), 살균/투과 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하지만 이에 제한하지는 않는다. 대표적인 모노클로날 항체는 에타너셉트 (IgG1의 Fc 부에 연결된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합부로 이루어진 이량체 융합 단백질), 압식시맙, 아펠리오모맙, 바실릭시맙, 다클리주맙, 인플릭시맙, 이브리투모맙 티우엑세탄, 미투모맙, 무로모납-CD3, 요오드 131 토시투모맙 콘쥬게이트, 올리주맙, 리툭시맙, 및 트라스투주맙 (헤르셉틴)을 포함한다.
본 발명의 중합체에 공유 부착을 위해 적절한 추가적인 제제는 아미포스틴, 아미다론, 아미노카프로산, 아미노힙푸레이트 나트륨, 아미노글루테트이미드, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 안트라사이클린, 벡사로텐, 비칼루타미드, 블레오마이신, 부세렐린, 부술판, 카베르골린, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부신, 실라스타틴 나트륨, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시타라빈, 캄토테신, 13-시스 레티노산, 모두 트랜스인 레티노산; 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데페록사민, 덱사메탄손, 디클로페낙, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포시드, 엑세메스탄, 펙소페나딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 에피네프린, L-도파, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이리노테칸, 이트라코나졸, 고세렐린, 레트로졸, 류코보린, 레바미솔, 리시노프릴, 로보티록신 나트륨, 로무스틴, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메타라미놀 비타르트레이트, 메토트렉세이트, 메토클로프라미드, 멕실레틴, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 날록손, 니코틴, 닐루타미드, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 필카마이신, 포르피머, 프레드니손, 프로카바진, 프로클로르페라진, 온단세트론, 랄티트렉스드, 시롤리무스, 스트렙토조신, 타크롤리무스, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론, 테트라히드로칸나비놀, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 돌라세트론, 그라니세트론; 포르모테롤, 플루티카손, 류프롤리드, 미다졸람, 알프라졸람, 암포테리신 B, 포도파이로톡신, 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존, 수마트립탄; 마크롤리드 예컨대 에리트로마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 록시트로마이신, 클라리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피로마이신, 미데카마이신, 류코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 안다지트로마이신, 및 스위놀리드 A; 플루오로퀴놀린 예컨대 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 트로바플록사신, 알라트로플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 에녹사신, 그레파플록사신, 가티플록사신, 로메플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 페플록사신, 아미플록사신, 플레록사신, 토수플록사신, 프룰리플록사신, 이르록사신, 파주플록사신, 클리나플록사신, 및 시타플록사신; 아미노글루코시드 예컨대 겐타미신, 네틸미신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌, 람폴라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그라미시딘, 콜리스티메테이트; 폴리믹신 예컨대 폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실리나제-민감성 제제를 포함하는 페니실린; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실리나제-저항성 제제; 암피실린, 아목시실린, 및 헤타실린, 실린, 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제; 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항수도모날 페니실린; 세포독심, 세프로질, 세프트부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세프라드린, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지딤, 로라카르베프, 및 목살락탐과 같은 세팔로스포린, 아즈트레오남과 같은 모노박탐; 및 카바페넴 예컨대 이미페넴, 메로페넴, 펜타미딘 이세티오우에이트, 알부테롤 술페이트, 리도카인, 메타프로테레놀 술페이트, 베클로메타손 디프레피오네이트, 트리암시놀론 아세타미드, 부데소니드 아세토니드, 플루티카손, 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔리드, 크로몰린 나트륨, 및 에르고타민 타르트레이트; 파클리탁셀과 같은 탁센; SN-38, 및 티르포스틴을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 중합체 알카날에 커플링하기 위한 바람직한 소분자는 하나 이상의 아미노기를 갖는 것들이다. 바람직한 분자들은 아미노힙푸레이트 나트륨, 암포테리신 B, 독소루비신, 아미노카프로산, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 메타라미놀 비타르트레이트, 파미드로네이트 디나트륨, 다우노루비신, 레보티록신 나트륨, 리시노프릴, 실라스타틴 나트륨, 멕실레틴, 세팔렉신, 데페록사민, 및 아미포스틴을 포함한다.
본 발명의 중합체 알카날에 커플링하기 위한 바람직한 펩티드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 콘센서스 IFN, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, IL-2, 레미케이드 (인플릭시맙), Rituxan (리툭시맙), Enbrel (에타너셉트), Synagis (팔리비주맙), Reopro (압식시맙), Herceptin (트라스투지맙), tPA, Cerizyme (이미글루세라제), B형 간염 백신, rDNAse, 알파-1 프로티나제 저해제, GCSF, GMCSF, hGH, 인슐린, FSH, 및 PTH 을 포함한다.
상기 대표적인 생물학적 활성제는 적절하다면, 유사체, 작동제, 길항제, 저해제, 이성질체, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 펩티드 및 단백질과 관련하여, 본 발명은 이의 생물학적 활성 단편뿐만 아니라, 합성, 재조합, 천연, 글리코실화, 및 비글리코실화 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 생물학적 활성 단백질은 생성 변이체 단백질이 모(native) 단백질의 어느 정도 이상의 활성을 가지기만 한다면, 추가적으로 하나 이상의 치환, 결실된 아미노산 등을 갖는 변이체를 포함하는 것을 의미한다.
약학 조성물
본 발명은 또한 약학적 부형제와 조합하여 본원에 제공된 바와 같은 콘쥬게이트를 포함하는 약학 제제를 포함한다. 일반적으로, 콘쥬게이트 자체는 고체 혹은 액체 형태일 수 있는 적절한 약학적 부형제와 조합될 수 있는, 고체 형태(예를 들어, 침전물)일 것이다.
대표적인 부형제는, 이에 제한되지는 않지만, 탄수화물, 무기염, 항미생물 제제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기, 및 이의 조합을 포함한다.
탄수화물 예컨대 당, 유도당 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화당, 및/또는 당 중합체들은 부형제로서 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제는, 예를 들어: 단당류, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 녹말 등; 그리고 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등을 포함한다.
부형제는 또한 무기염 또는 완충액 예컨대 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 나트륨 술페이트, 칼륨 니트레이트, 나트륨 포스페이트 일염기, 나트륨 포스페이트 이염기, 및 이의 조합을 포함한다.
제제는 또한 미생물 성장을 방해 또는 저해하기 위한 항미생물 제제를 포함할 수 있다. 본 발명을 위해 적절한 항미생물 제제의 비제한적인 예로서는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메르솔, 및 이의 조합을 포함한다.
항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 막기 위해 사용되어, 콘쥬게이트 또는 제제의 다른 성분들의 변형을 방지한다. 본 발명에 사용되는 적절한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술피트, 나트륨 포름알데히드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술피트, 및 이의 조합을 포함한다.
계면활성제는 부형제로서 존재할 수 있다. 대표적인 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트, 예컨대 "Tween 20" 및 "Tween 80", 및 플루로닉스 예컨대 F68 및 F88 (모두 BASF, Mount Olive, New Jersey로부터 시판됨); 소르비탄 에스테르; 인지질 같은 지질, 예컨대 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (그러나 바람직하게는 리포솜 형태가 아님), 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 아연 및 다른 적절한 양이온.
산 또는 염기가 제제 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예로서는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 니트르산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 산들을 포함한다. 적절한 염기의 예로서는 이에 제한되지는 않지만, 수산화나트륨, 나트륨 아세테이트, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모늄 아세테이트, 칼륨 아세테이트, 나트륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포르메이트, 나트륨 술페이트, 칼륨 술페이트, 칼륨 푸메레이트, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 포함한다.
상기 약학 제제는 모든 형태의 제형, 특히 주사용으로 적합한 것, 예를 들어 현탁액 및 용액뿐만 아니라 복원이 가능한 분말을 포함한다. 조성물 내에 콘쥬게이트의 함량 (즉, 본원에 기술된 활성제 및 중합체 사이에 형성된 콘쥬게이트)은 다수의 요인들에 따라 달라질 것이지만, 조성물이 단위 용량 용기 (예를 들어, 바이알)에 저장되는 경우 최적의 치료적 유효량이 될 것이다. 또한, 약학 제제는 주사기에 수납될 수 있다. 치료적 유효량은 임상적으로 목적하는 결과를 생산하는 함량을 결정하기 위해 콘쥬게이트의 함량을 증가시키면서 반복 투여함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물 내에 임의의 개별적 부형제의 함량은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 요건에 따라 다를 것이다. 보통, 임의의 부형제의 최적량은 보통의 실험, 즉, 다양한 함량(저함량에서 고함량의 범위)의 부형제를 포함하는 조성물의 제조, 안정성 및 다른 파라미터들의 검사, 및 이후 현저한 부작용 없이 최적의 수행이 수득되는 범위를 결정하는 실험을 통해 결정될 것이다.
그러나 일반적으로 부형제는 조성물 내에 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 중량% - 98 중량%, 보다 바람직하게는 약 15 - 95 중량% 로 존재할 것이며, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다.
이러한 상기 약학적 부형제는 다른 부형제들과 함께 "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19판, Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52판, Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 및 Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3판, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000 에 기술된다.
*본 발명의 약학 제제는 보통, 필수적이지는 않지만, 주사를 통해 투여되며 따라서 일반적으로 투여 직전에 액체 용액 또는 현탁액이다. 약학 제제는 또한 다른 형태, 예컨대 시럽, 크림, 연고, 정제, 분말 등을 취할 수 있다. 다른 투여 방식은 또한 예컨대 폐, 직장, 피부, 점막, 경구, 척수강, 피하, 동맥내 투여 등을 포함한다.
이전에 기술된 바와 같이, 콘쥬게이트는 정맥 주사로 비경구적으로, 또는 덜 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있다. 비경구 투여용의 적절한 제형은 다른 것들 중에서, 준비된 주사 용액, 사용전에 용매와 조합을 위한 건조 분말, 주사용으로 준비된 현탁액, 사용전에 담체와의 조합을 위한 건조된 불용성 조성물, 및 투여전 희석을 위한 액체 농축물 및 에멀젼을 포함한다.
투여 방법
본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 콘쥬게이트를 콘쥬게이트의 처리에 반응성인 병으로 고생하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 일반적으로 콘쥬게이트의 치료적 유효량(바람직하게는 약학 제제의 일부로서 제공됨)을 주사를 통해 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 특정 콘쥬게이트의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 임의의 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자들은 어느 질병을 특정 콘쥬게이트가 유효하게 치료할 수 있는지를 알 수 있을 것이다. 투여될 실제 용량은 치료될 질병의 심각도, 건강 치료 전문가의 판단, 및 투여되는 콘쥬게이트뿐만 아니라 대상의 연령, 체중, 및 건강 상태에 따라 다를 것이다. 치료적 유효량은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고/있거나 관련 참고 문헌에 기술된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg의 범위, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 용량, 및 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량의 범위일 것이다.
임의의 주어진 콘쥬게이트의 단위 용량(재차, 바람직하게는 약학 제제의 일부로서 제공됨)은 임상의학자의 판단, 환자의 필요 등에 따른 다양한 용량 스케쥴로 투여될 수 있다. 특정 용량 스케쥴은 당업계에 숙련자들에 의해 공지되거나 또는 통상의 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 것이다. 대표적인 용량 스케쥴은 이에 제한되지는 않지만, 일일 5회, 4회, 3회, 2회, 1회, 주당 3회, 2회, 1회, 월 2회, 1회, 및 이의 조합을 포함한다. 일단 임상적 결과가 성취되면, 조성물의 투여는 중단된다.
*본 발명의 콘쥬게이트 투여의 한가지 잇점은 개별적 수용성 중합체부가 제거될 수 있다는 점이다. 이러한 결과는 신체로부터 제거가 중합체 크기의 이유로 잠재적인 문제가 되는 경우에 유리하다. 최적으로는, 각 수용성 중합체부의 제거는 생리학적으로 절단가능하고/하거나 효소적으로 분해가능한 연결, 예컨대 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르 함유 연결의 이용을 통해 촉진된다. 이러한 방법으로, 콘쥬게이트의 제거(개별적 수용성 중합체부의 절단을 통해)는 중합체 분자 크기 및 목적하는 제거 성질을 제공할 유형의 관능기를 선택함으로써 조절될 수 있다. 당업자는 절단가능한 관능기 뿐만 아니라 중합체의 적절한 분자 크기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 통상적 실험을 이용하여, 먼저 다른 중합체 중량 및 절단가능한 관능기를 갖는 다양한 중합체 유도체를 제조한 후, 환자에게 상기 중합체 유도체의 투여 및 주기적인 혈액 및/또는 요 샘플 채취에 의해 제거 프로파일 (예컨대 주기적 채혈 또는 채뇨를 통해) 을 수득함으로써 적당한 분자 크기 및 절단가능한 관능기를 결정할 수 있다. 일단 일련의 제거 프로파일이 각 시험된 콘쥬게이트에 대해 수득되면, 적절한 콘쥬게이트가 확인될 수 있다.
본원에 참조된 모든 문서, 책, 특허, 특허공보 및 다른 출판물은 이들 전문이 참조로서 포함된다.
실시예
본 발명이 이들의 특정한 바람직한 구체적 구현예와 함께 기술되지만, 전술한 상세한 설명 뿐만 아니라 하기의 실시예는 본 발명을 설명하려는 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 범위 내의 다른 측면, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 분명할 것이다.
재료 및 방법
첨부된 실시예 내에 나타낸 모든 PEG 시약은 달리 언급되지 않는다면 시판되는 것이다. 모든 NMR 데이타는 Bruker 사의 300 ㎒ NMR 분광계에 의해 얻어졌다.
리소자임은 시그마 (Sigma) 사에서 입수하였다.
실시예 1
M PEG (2K)- 부티르알데히드의 합성
A. mPEG (2K Da )- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈의 제조
mPEG (2K Da) (2.0 g) 및 톨루엔 (30 ㎖) 의 혼합물을 감압하에 톨루엔을 증류제거하여 공비 건조시켰다. 분자량 2 킬로달톤인 건조된 mPEG 를 tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 용액 (4.0 ㎖, 0.004 몰) 및 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈 (0.5 g, 0.00277 몰)(Alfa Aesar) 이 첨가된 무수 톨루엔 (15 ㎖) 에 용해시켰다. 상기 혼합물을 아르곤 대기하에 하룻밤 동안 100-105℃ 에서 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 여과하여 0 - 5℃ 에서 150 ㎖ 에틸 에테르에 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고 감압하에 건조시켰다. 수율 : 1.6 g. 상기 반응은 본질적으로 정량적 수율로 진행되었다. 즉, 1H NMR 에 따른 mPEG-OH 출발 물질에 대응하는 히드록실 양자의 부재에 근거하여, 본질적으로 모든 mPEG 출발 물질은 대응하는 디에틸 아세탈로 전환되었다.
B. mPEG (2kD)- 부티르알데히드의 제조
mPEG (2K Da) 부티르알데히드, 상기 A 의 디에틸 아세탈 (1.0 g), 탈이온수 (20 ㎖) 및 pH 를 3.0 으로 조정하기 위한 양의 5% 인산의 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 염화나트륨 (1.0 g) 을 첨가하고, 0.1 M 소듐 히드록시드의 첨가로 pH 를 6.8 로 조정하였다. 상기 생성물인 mPEG (2kD) 부티르알데히드를 디클로로메탄 (3×20 ㎖) 으로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압하에 증류제거하여 mPEG 부티르알데히드 생성물을 단리된 형태로 제공하였다. 수율 : 0.72 g.
상기 반응은 본질적으로 정량적 수율로 진행되었다. 즉, 1H NMR 에 따른 디에틸 아세탈에 대응하는 히드록실 양자의 부재뿐만 아니라, mPEG-OH 출발 물질에 대응하는 히드록실 양자의 부재에 근거하여, 본질직으로 모든 mPEG 부티르 알데히드 디에틸 아세탈은 대응하는 알데히드로 전환되었다.
실시예 2
M PEG (30 kD)- 부티르알데히드의 합성
A. mPEG (30K Da )- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈의 제조
mPEG (30 kD)(톨루엔 내 60% 용액, 3.30 g), 톨루엔 (30 ㎖) 및 BHT (부틸화된 히드록시톨루엔, 0.004 g) 의 혼합물을 감압하에 용매를 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 건조된 mPEG 30 K 를 무수 톨루엔 (15 ㎖) 에 용해시키고, 상기 용액에 tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 (4.0 ㎖, 0.004 몰), 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈 (0.5 g, 0.00277 몰)(Alfa Aesar) 및 칼륨 브로마이드 (0.05 g) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 아르곤 대기하에 105℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 감압하에 건조로 농축시키고, 상기 조 생성물을 20 ㎖ 디클로로메탄에 용해시켰다. 상기 생성물-함유 용액을 실온에서 에틸 에테르 (300 ㎖) 에 첨가하여 상기 생성물을 침전시켰다. 침전된 생성물을 여과로써 단리하고 감압하에 건조시켰다. 수율 : 1.92 g.
생성물의 수율 및 분석에 근거하여, mPEG-OH 시약의 히드록시-말단에서 아세탈 시약의 치환은 매우 고효율, 즉, 본질적으로 100% 치환에서 진행되었다. 생성물은 추가의 정제의 필요 없이, 검출가능한 또는 유의미한 양의 미반응 mPEG-OH 없이, 고순도로 생성되었다. 일반적으로, 본 발명의 알카날 또는 아세탈 중합체는 고순도로 생성된다, 즉 일반적으로 목적하는 알카날 생성물이 85% 이상 순도, 바람직하게는 90% 이상 순도, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 순도로 최종 조성물에 존재한다.
B. mPEG (30K Da )- 부티르알데히드 , mPEG 30K -O- CH 2 ( CH 2 ) 2 -C(O)H 의 제조
mPEG (30K Da) 부티르알데히드, 상기 A 의 디에틸 아세탈 (1.0 g), 탈이온수 (20 ㎖) 및 pH 를 3.0 으로 조정하기 위한 양의 5% 인산의 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 염화나트륨 (1.0 g) 을 첨가하고, 0.1 M 소듐 히드록시드의 첨가로 pH 를 6.8 로 조정하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄 (3×20 ㎖) 으로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 증류로써 제거하였다. 젖은 생성물을 감압하에 건조시켰다. 수율 : 0.82 g.
대응하는 알데히드로의 전환은 본질적으로 정량적 수율로 진행되었다.
실시예 3
염기성 pH 에서 M PEG- 프로피온알데히드 및 M PEG- 부티르알데히드의 비교 안정 성
메톡시-PEG-프로피온알데히드 및 mPEG-부티르알데히드는 염기성 pH 조건하에 각각의 중합체의 상대적 안정성을 비교하기 위해 각각 연장된 기간 동안 높은 pH 조건에 노출되었다. 하기에 나타난 바와 같이, 상기 조건 하에 상당량의 프로피온알데히드 PEG 가 반응하여 mPEG-OH 를 형성하고 아크롤레인 (역-Michael 형 반응으로 인해) 을 방출한 반면, PEG 부티르알데히드 화합물의 손실은 검출되지 않았다. 상기 실험의 상세한 사항은 하기에 제공되었다.
A. 염기성 pH 에서 mPEG (2K Da )- 부티르알데히드의 안정성
mPEG (2K Da)-부티르알데히드 (실시예 1 로부터)(0.5 g) 를 10 ㎖ 5 mM 인산염 완충용액 (pH = 8.0) 에 용해시키고, 생성 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. NaCl (0.5 g) 을 첨가하고 상기 생성물을 메틸렌 클로라이드 (3×10 ㎖) 로 추출하였다. 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 25℃ 에서 감압하에 증류제거하였다.
1H NMR 분석에 근거하여, 상기 생성물은 변하지 않았다. 즉, 상기 염기성 pH 조건하에서 연장된 기간 후에도, PEG-부타날의 분해는 검출되지 않았다.
B. 염기성 pH 에서 mPEG(5K Da )- 프로피온알데히드의 안정성
mPEG(5K Da)-프로피온알데히드 (Shearwater Corporation, 알데히드 치환 82%)(0.5 g) 를 10 ㎖ 5 mM 인산염 완충용액 (pH = 8.0) 에 용해시켰다. 생성 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 기체 크로마토그래피 헤드스페이스 분석은, 상기 용액이 단백질 콘쥬게이션에 일반적으로 적용된 것과 같은 염기성 조건하 제거 반응으로부터 생성되는 아크롤레인 (CH2=CH-CHO) 을 함유한다는 것을 보여 주었다. NaCl (0.5 g) 을 첨가하고, 상기 생성물을 메틸렌 클로라이드 (3×10 ㎖) 로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 용매를 25℃ 에서 감압하에 증류제거하였다.
1H NMR 분석에 근거하여, mPEG(5K Da)-프로피온알데히드의 치환은 62% 로 하락하였고 (즉, PEG-프로파날의 38% 가 분해되었음), 상기 생성물은 PEG-프로파날의 프로파날부에 대응하는 C-3 절편의 손실로부터 얻어지는 상당량의 mPEG-OH 를 포함하였다.
실시예 4
리소자임의 PEG화
("리소자임-NH2" 는 나타낸 그 반응성 아미노기 중 하나와 함께 리소자임 분자를 지시함을 나타냄).
*A. 2 K D PEG 알카날을 이용한 랜덤 PEG화
모델 단백질인 리소자임은 129 개 아미노산의 분비 효소로, 본 발명의 알카날 중합체의 예시적 단백질로의 커플링을 설명하는데 이용되었다.
리소자임 (2.1 ㎎) 을 mPEG (2kD)-부티르알데히드 (실시예 1 로부터, 1.5 ㎎) 가 첨가된 1 ㎖ 의 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.6) 에 용해시켰다. 상기 용액에 환원제인 NaCNBH3 (소듐 시아노보로히드리드) 를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 생성 리소자임 콘쥬게이트는 개입 -(CH2)4-쇄에 의해 리소자임 아미노기에 커플링된 PEG 쇄를 가지고 있었다.
반응 생성물은 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정에 의해 분석되어, 비변형된 단백질뿐만 아니라 약 2000 Da 질량이 다른 (PEG 부타날 시약의 크기에 대응), 16208 달톤, 18422 달톤 및 20520 달톤에서 리소자임의 3 개의 PEG 화된 종에 대응하는 피크를 나타내었다. MALDI-TOF 에 의한 비변형 (고유의) 리소자임의 질량은 14153 으로 결정되었다. 따라서, 형성된 콘쥬게이트는 실제로 모노PEG 화된 단백질, 디-PEG 화된 단백질 및 트리-PEG화된 단백질 (단량체, 이량체 및 삼량체) 의 혼합물이었다.
상기는 본 발명의 예시적 단백질의 랜덤 PEG 화가, PEG 화된 생성물의 분포를 나타냄을 보여주었다. 필요하다면, 상기 반응 혼합물을 추가로 분리하여 각각의 PEG 콘쥬게이트, 즉 거기에 부착된 하나의 PEG 분자를 가진 리소자임, 부착된 2 개의 PEG 를 가진 리소자임 및 부착된 3 개의 PEG 를 가진 리소자임으로 단리할 수 있다. 상기에서 기술된 콘쥬게이트 조성물 각각 (단량체, 이량체, 삼량체) 에 있어서, PEG 분자는 리소자임 분자 내에 있는 다른 반응성 아미노 위치에 부착될 수 있었다.
B. 5 KD PEG 알카날 , M PEG-2- 메틸부티르알데히드를 이용한 PEG화
모델 단백질, 리소자임의 콘쥬게이션을 알파 분지쇄된 PEG 시약, mPEG5kD-2-메틸부티르알데히드를 이용하여 반복하였다. 리소자임 (3 ㎎) 을 약 5.5 내지 7.5 의 pH 범위에서 약 1 ㎖ 의 소듐 포스페이트 완충용액에 용해시켰다. PEG 시약의 2 내지 5-배 몰 과량인 mPEG5kD-2-메틸부티르알데히드를 리소자임 용액에 첨가하고, 생성 용액을 회전 혼합기에 위치시키고, 실온에서 반응시켰다. 약 15 분 후, NaCNBH3 의 20-배 몰 과량을 첨가하고 반응을 지속시켰다. 다양한 시간 간격 (4 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간 등) 에서 분취량을 취하고, 반응의 진행을 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 질량 분광 측정으로 모니터링하였다.
반응이 완료되었을 때, 생성 콘쥬게이트 혼합물을 농축시키고, 멸균 여과하여, 추가의 사용 전까지 저온 조건 (-20℃ 내지 -80℃) 하에 보관하였다.
실시예 5
분지형 PEG2 (40.3 KD A )- 부티르알데히드의 제조
분지형 PEG 절편을 가진 예시적 중합체 알카날의 제조를 하기에 제공한다.
요약. 전체 합성은 맨처음 테트라(에틸렌 글리콜) 스페이서를 반응성 알카날 전구체인 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈에 커플링하는 것이 관여되었다. 올리고머성 에틸렌 글리콜 스페이서의 도입은 반응성 알데히드 (또는 아세탈) 기 및 링커 부분, 'X' 에 함유될 수 있는 반응기 사이의 사슬 길이를 확장시켜서 잠재적인 부반응의 발생을 최소화하고 수율을 향상시킴으로써 생성물에 더 큰 안정성을 제공하였다.
테트라에틸렌 글리콜과 같은 올리고머 스페이서의 이용은 또한 필요하다면 PEG-디올, mPEG-OH 등과 같은 중합 불순물을 제거하고자 크로마토그래피적으로 정제된 중합체 절편에 커플링하도록 전환될 수 있는 히드록시와 같은 반응성 관능기를 제공하였다. 상기 방식으로, PEG-디알데히드 (PEG 디올 유래의) 등과 같은 목적하지 않는 관능화된 중합체성 불순물이, 알카날 전구체에 커플링하기 전에 PEG 절편로부터 제거되어, 본질적으로 중합체성 불순물이 없는 최종 생성물인 수용성 중합체 알카날이 제공되었다.
하기의 구체적인 반응을 볼 때, 테트라(에틸렌 글리콜) 스페이서의 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈로의 커플링은 디-알카날 생성물 및 출발 테트라(에틸렌 글리콜) 로 오염된 목적하는 모노-알카날 생성물의 형성을 초래하였다. 그러나, 상기 반응 혼합물 내 모든 성분의 용해도 차이를 이용하는, 간단한 워크-업은 고순도의 모노알카날 생성물, 즉, 테트라(에틸렌 글리콜) 분자의 반응성 히드록시기 중 하나 상에만 치환된 알카날 (아세탈) 관능부를 갖는 생성물의 제조를 쉽게 하였다 (반응 A.). 그 후, 반응 A 의 생성물은 메탄술포닐 클로라이드와의 반응에 의해 대응하는 메실레이트로 전환된다, 즉, 테트라(에틸렌 글리콜) 의 자유 히드록시기가 처음에 메실레이트로 전환되고 (반응 B), 이어서 메실레이트가 1 차 아미노기로 전환되었다 (반응 C). 그 후, 아세탈 시약의 반응 아미노기는 아세탈 시약의 아미노기와의 반응에 적합한 반응성 카르보닐 탄소를 가진 예시적 분지형 중합체 골격 절편에 커플링되었다. PEG 반응물로의 전구체인 mPEG-이치환된 리신은 중합체성 불순물을 제거하기 위해 대응하는 활성화된 에스테르로의 전환 전에 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 그 후, mPEG-이치환된 리신의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르는 아미드 결합의 형성을 통해 아미노-알카날 아세탈과 반응하여 생성되는 분지형 PEG-스페이서-알카날 아세탈을 형성하였다. 그 후, 아세탈은 산-촉매 반응에서 쉽게 가수분해되어 대응하는 알카날, 특히 2-팔 분지형 PEG (40KDa) 부티르알데히드를 형성하였다.
상기 합성 접근법은 즉, 분지형 중합체 절편에 제한된 것이 아니라 여기에 기술된 임의의 기하구조를 가진 중합체 절에 적용될 수 있다.
전체 합성의 요약 :
A. 테트라 (에틸렌 글리콜) 모노- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈
테트라(에틸렌 글리콜)(97.1 g, 0.500 몰) 및 톨루엔 (200 ㎖) 의 혼합물을 감압하에 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다 (회전 증발기). 건조된 테트라(에틸렌 글리콜) 을 무수 톨루엔 (180 ㎖) 에 용해시키고, tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 용액 (120.0 ㎖, 0.120 몰) 및 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈 (18.1 g, 0.100 몰)(Alfa Aesar) 을 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 대기하 95 - 100℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 여과하고 용매를 감압하에 증류제거하였다. 조 생성물을 1000 ㎖ 탈이온수에 용해시키고, 생성 용액을 활성 탄소를 통해 여과하였다. 염화나트륨 (10 g) 을 첨가하고 상기 생성물을 디클로로메탄 (250, 200 및 150 ㎖) 으로 추출하였다. 추출물을 건조시키고 (MgSO4 로), 상기 용매를 감압하에 증류제거하였다 (회전 증발로써).
조 생성물을 300 ㎖ 10% 인산염 완충용액 (pH = 7.5) 에 용해시키고, 불순물을 에틸 아세테이트 (2×50 ㎖)로 추출하였다. 생성물을 디클로로메탄 (200, 150 및 100 ㎖) 으로 추출하였다. 상기 추출물을 건조시키고 (MgSO4 로), 용매를 감압하에 증류제거하였다 (회전 증발로써).
순도: ~ 100% (미반응 출발 물질은 검출 안됨)
B. 테트라 (에틸렌 글리콜)-α- 메실레이트 -ω- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈
테트라(에틸렌 글리콜) 모노-부티르알데히드, 디에틸 아세탈 (12.5 g, 0.037 몰) 및 톨루엔 (120 ㎖) 의 혼합물을 감압하에 톨루엔을 증류제거하여 공비건조시켰다 (회전 증발기). 건조된 테트라(에틸렌 글리콜) 모노-부티르알데히드, 디에틸 아세탈을 무수 톨루엔 (100 ㎖) 에 용해시켰다. 상기 용액에 20 ㎖ 의 무수 디클로로메탄 및 5.7 ㎖ 의 트리에틸아민 (0.041 몰) 을 첨가하였다. 그 후, 4.5 g 의 메탄술포닐 클로라이드 (0.039 몰) 를 적가하였다. 상기 용액을 질소 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 다음에 탄산나트륨 (5 g) 을 첨가하고, 상기 혼합물을 1 시간 교반하였다. 그 후, 상기 용액을 여과하고, 용매를 감압하에 증류제거하였다 (회전 증발기).
C. 테트라 (에틸렌 글리콜)-α-아미노-ω- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈
테트라(에틸렌 글리콜)-α-메실레이트-ω-부티르알데히드, 디에틸 아세탈 (14.0 g), 진한 암모늄 히드록시드 (650 ㎖) 및 에틸 알콜 (60 ㎖) 의 혼합물을 실온에서 42 시간 교반하였다. 다음에 모든 휘발성 물질을 감압하에 증류제거하였다. 조 생성물을 150 ㎖ 탈이온수에 용해시키고, 상기 용액의 pH 를 1.0 M NaOH 로써 12 로 조정하였다. 생성물을 디클로로메탄 (3×100 ㎖) 으로 추출하였다. 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 용매를 감압하에 증류제거하였다 (회전 증발기).
D. 분지형 PEG2 (40.3 KDa )- 부티르알데히드 , 디에틸 아세탈
PEG2 (40 KDa)-N-히드록시숙신이미드를 U.S. 특허 No. 5,932,462 (Harris, J. 등) 에서 기술된 바와 같이 대응하는 PEG2-리신으로부터 제조하였다. 전구체 PEG-2 리신은 이온화가능한 카르복시기를 가진 분지형 PEG 로, U.S. 특허 No. 5,932,462 에서 또한 기술한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
메틸렌 클로라이드 (100 ㎖) 내에 PEG2 (40 KDa)-N-히드록시숙신이미드 (5.0 g, 0.000125 몰)(Shearwater Corporation) 의 용액에 테트라(에틸렌 글리콜)-α-아미노-ω-부티르알데히드, 디에틸 아세탈 (0.50 g, 0.000148 몰) 및 트리에틸아민 (0.035 ㎖) 을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 용매를 회전 증발기를 이용해 증발 건조시켰다. 조 생성물을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 젖은 생성물을 감압하에 건조시켰다. 수율 4.8 g.
E. 분지형 PEG2 (40.3 KDa )- 부티르알데히드
분지형 PEG2(40.3 KDa)-부티르알데히드, 디에틸 아세탈 (4.8 g) 을 100 ㎖ 물에 용해시키고, 상기 용액의 pH 를 묽은 인산으로 3 으로 조정하였다. 상기 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 이어서 상기 용액의 pH 를 약 7 로 조정하기 충분한 0.5 M 소듐 히드록시드를 첨가하였다. 상기 생성물을 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시켰다. 상기 용매를 감압하에 증류제거하였다.
상기는 본 발명의 또다른 구현예, 대표적인 분지형 PEG 알카날의 제조를 설명하였다. 상기는 또한 중합체 알카날이 짧은 올리고머성 기, 상기 경우에서는 분자의 중합체 골격 및 알카날 절편 사이에 삽입된 테트라에틸렌 글리콜을 함유하는 본 발명의 구현예를 설명하였다. 추가로, 상기 실시예는 상기 중합체 절편이 알카날-아세탈 시약에 커플링하기 전에 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되어서 반응식에서 중합체성 불순물을 일찍 효과적으로 제거할 수 있는, 이온화가능한 기를 포함하는 전구체 중합체 절편의 용도를 설명하였다. 상기 경우에, 형성된 생성물에는 mPEG2-리신 전구체에 존재할 수 있으나 크로마토그래피에 의해 제거되는, PEG-디올 또는 mPEG 또는 모노-PEG 화된 리신 등의 반응으로부터 생기는 상기와 같은 이관능성 중합체성 불순물이 존재하지 않았다.
실시예 6
* 중합체- 알카날 단백질 콘쥬게이트의 제조
EPO 의 랜덤 PEG 화
재조합 EPO (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 를 mPEG-부티르알데히드 30 kDa (실시예 2 에 기재된 바와 같이 제조됨) 에 커플링하였다.
EPO (~2 ㎎) 를 1 ㎖ 의 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.6) 에 용해시키고, mPEG(30 kDa)-부티르알데히드를 5X 몰 EPO 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 30,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하고 있었다. PEG 시약 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리PEG 화의 정도, 즉, 이량체, 삼량체 등의 형성을 증가시켰다.
약 20 kDa 초과의 분자량을 가진 고분자량 PEG 알카날의 이용은 모노-PEG 화된 종의 형성을 선호하였다. 더 작은 분자량의 PEG 알카날은, 단백질에 커플링할 때, 상기 조건하에서 폴리-PEG 화된 종을 더 쉽게 형성하였다.
상기는 본 발명의 예시적 단백질의 랜덤 PEG 화를 설명하여 PEG 화된 EPO 생성물의 분포를 얻었다. 필요하다면, 상기 반응 혼합물은 추가로 분리되어 하기에 기술된 바와 같이 각각의 이성질체를 단리할 수 있었다.
그 후, 다른 분자량을 가진 PEG 콘쥬게이트는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 다른 PEG 콘쥬게이트 (단량체, 이량체, 삼량체 등) 은 다른 분자량 (상기 경우에, 약 30 kDa 이 다른) 에 근거하여 분획화되었다. 구체적으로, 상기 분리는 관찰되는 분자량 범위에서 생성물의 효과적인 분리에 적합한 일련의 칼럼 시스템, 예를 들어 Superdex™200 칼럼 (Amersham Bioscience) 을 이용하여 수행되었다. 상기 생성물을 1.5 ㎖/분의 유속으로 10 ㎖ 아세테이트 완충용액으로 용출하였다. 수합된 분획 (1㎖) 을 단백질 함량에 대해 280 ㎚ 에서 OD 로써 또한, PEG 함량에 대한 요오드 테스트를 이용해 분석하였다 (Sims G.E.C. 등, Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980). 대안적으로, 결과를 SDS PAGE 겔을 주행시킨 후 요오드화바륨으로 염색하여 시각화하였다. 용출된 피크에 대응하는 분획을 수합하고, 10 - 30 kD 컷-오프 막을 이용해 초여과함으로써 농축하고, 동결건조시켰다. 상기 방법은 동일한 분자량을 갖는 콘쥬게이트의 분리/정제를 초래하나, 동일한 분자량을 가지나 상이한 PEG 화 위치를 갖는 콘쥬게이트 (즉, 위치 이성질체) 의 분리를 제공하지는 않았다.
위치 이성질체의 분리는 RP-HPLC C18 칼럼 (Amersham Bioscience 또는 Vydac) 을 이용한 역상 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 상기 과정은 동일한 분자량을 갖는 PEG-생분자 이성질체 (위치 이성질체) 를 분리하는 데 효과적이었다. 역-상 크로마토그래피는 RP-HPLC C18 제조 칼럼을 이용해 수행되었고, 물/0.05% TFA (용출액 A) 및 아세토니트릴/0.05% TFA (용출액 B) 의 구배로 용출되었다.
용출된 피크에 대응하는 분획을 수합하고, 아세토니트릴 및 TFA 로 증발 제거하고, 이어서 용매를 제거함으로써 각각의 위치적 PEG-이성질체를 단리하였다.
실시예 7
중합체- 알카날 단백질 콘쥬게이트의 제조
EPO 의 N-말단 PEG 화
재조합 EPO (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 를 mPEG-부티르알데히드, 30 kDa (실시예 2) 에 커플링하였다.
EPO (~2 ㎎) 을 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG(30 kDa)-부티르알데히드 (실시예 2 유래) 를 5X 몰 EPO 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 를 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 30,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 EPO 및 더 높은 분자량 종을 제거하였다.
N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 대 단백질의 비율을 증가시키면 PEG 화의 정도를 증가시켜서 폴리-PEG 화된 단백질을 얻었다.
상기는 주로 N-말단 단독 PEG 화된 단백질이 얻어지는 본 발명의 예시적인 단백질의 PEG 화를 설명하였다.
실시예 8
GCSF 의 N-말단 PEG 화
재조합 GCSF (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포) 또는 다른 미생물원에서 생성됨) 를 mPEG-부티르알데히드, 30 kDa 에 커플링하였다.
GCSF (~2 ㎎) 를 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG(30 kDa)-부티르알데히드 (실시예 2 유래) 를 5X 몰 GCSF 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 를 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-부타날 시약을 커플링하였다.
생성 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 30,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 GCSF 의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 GCSF 및 더 높은 분자량 종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리-PEG 화된 단백질이 얻어지는 PEG 화의 정도를 증가시켰다.
실시예 9
인터페론 α의 N-말단 PEG 화
재조합 IFN-α(대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 다른 미생물원에서 생성됨) 를 mPEG-부티르알데히드 30 kDa 에 커플링하였다.
인터페론-α(~2 ㎎) 를 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG(30 kDa)-부티르알데히드 (실시예 2 유래) 를 5X 몰 IFN 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 를 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 30,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 인터페론 α및 더 높은 분자량 종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리-PEG 화된 IFN 이 얻어지는 PEG 화의 정도를 증가시켰다.
단백질 hGH, IFN-β및 FSH 의 또다른 예시적 PEG-알카날, mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 으로의 콘쥬게이션을 본질적으로 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 10
인간 성장 호르몬의 N-말단 PEG 화
재조합 인간 성장 호르몬 (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 을 mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 에 커플링하였다.
인간 성장 호르몬 (~2 ㎎) 을 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 을 5X 몰 hGH 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 의 5 내지 20-배 몰 과량을 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-α메틸부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응의 진행을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 20,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 hGH 및 더 높은 분자량종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 알데히드 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리-PEG 화된 hGH 군이 얻어지는 PEG화의 정도를 증가시켰다.
실시예 11
인터페론-β의 N-말단 PEG 화
재조합 인터페론-β(대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 를 mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 에 커플링하였다.
인터페론-β(~2 ㎎) 를 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 을 5X 몰 IFN-β농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 의 5 내지 20-배 몰 과량을 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-α메틸부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응의 진행을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 20,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 IFN-β및 더 높은 분자량 종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 알데히드 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리-PEG 화된 IFN-β 군이 얻어지는 PEG화의 정도를 증가시켰다.
실시예 12
FSH 의 N-말단 PEG 화
*재조합 여포 자극 호르몬 (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 을 mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 에 커플링하였다.
여포 자극 호르몬, FSH (~2 ㎎) 를 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, mPEG-2-메틸 부티르알데히드, 20 kDa 을 5X 몰 FSH 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 의 5 내지 20-배 몰 과량을 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 PEG-α메틸부타날 시약을 커플링하였다.
상기 반응의 진행을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 등의 확인을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 종이 나타낸 피크는 약 20,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 FSH 및 더 높은 분자량 종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다. PEG 알데히드 대 단백질의 비율을 증가시키면 폴리-PEG 화된 FSH 군이 얻어지는 PEG 화의 정도를 증가시켰다.
실시예 13
인간 성장 호르몬의 N-말단 PEG 화
재조합 hGH (대장균, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포 (그러나 이에 제한되지 않음)) 또는 또다른 미생물원에서 생성됨) 를 분지형 PEG2(40.3 KDa)-부티르알데히드 (실시예 5E) 에 공유 부착하였다.
인간 성장 호르몬 (~2 ㎎) 을 1 ㎖ 의 0.1 mM 소듐 아세테이트 (pH 5) 에 용해시키고, 분지형 PEG2(40.3 KDa)-부티르알데히드를 5X 몰 hGH 농도로 첨가하였다. 환원제인 NaCNBH3 의 5 내지 20-배 몰 과량을 첨가하고, 상기 용액을 4℃ 에서 24 시간 동안 교반하여 아민 연결을 통해 단백질에 분지형 PEG2(40.3 KDa)-부티르알데히드 시약을 커플링하였다.
상기 반응의 진행을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정으로 분석하여 PEG 화의 정도를 결정하였다. PEG 화의 정도, 단량체, 이량체 (존재하는 경우) 등의 결정을 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) 질량 분광측정으로 수행하였다. 고유의 및 모노-PEG 화된 및 다른 종이 나타낸 피크는 약 40,000 Da 달랐다. 생성 반응 혼합물은 일차적으로 특히, 분지형 PEG 알카날 시약의 크기 및 기하구조로 인해, 고유의 및 모노PEG 화된 단백질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG 화된 종을 칼럼 크로마토그래피로써 정제하여 유리 hGH 및 더 높은 분자량 종을 제거하였다. N-말단 PEG 화의 확인을 펩티드 맵핑으로 수행하였다.
실시예 14
암포테리신 B 의 PEG 화
작은 분자, 암포테리신 B 의 아미노기를 중합체 알카날의 부착에 의해 변형시켰다.
탈이온수 내의 암포테리신 B.HCl 의 용액에 pH 6.5 의 0.1 M 인산염 완충용액 내에 용해된 mPEG2k-부티르알데히드 (실시예 1) 의 2-배 몰 과량을 첨가하였다. 상기 혼합물에 pH 6.5 의 인산염 완충용액 내의 NaCNBH3 (1.5 내지 10-배 몰 과량) 의 용액을 첨가하고, 상기 생성 용액을 아르곤 대기하에 하룻밤 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 분취량을 다양한 시간 간격에서 취하여 1H NMR 에 의해 반응의 진행을 모니터링하였다. 완료 시, 상기 반응 혼합물을 물의 첨가에 의해 추가 희석시키고, NaCl 을 포화를 달성할 때까지 첨가하였다. 그 후, 상기 생성물을 디클로로메탄으로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 무수 소듐 술페이트로 건조시키고, 여과하여 건조제를 제거하고, 상기 용매를 회전 증발기로 증발시켰다. 그 후, 생성물을 디에틸 에테르의 첨가로 침전시키고, 진공하에 하룻밤 동안 건조시켰다. 회복된 생성물을 겔 투과 크로마토그래피로 분석하여 콘쥬게이션의 범위를 결정하였다.
조 생성물을 Poros 50 HS 양이온 교환 수지 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 탈이온수로 칼럼을 세척한 후, 이어서 상기 생성물을 1N NaCl 용액으로 용출하였다. 콘쥬게이트를 함유한 추출물을 조합하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 용액을 무수 소듐 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 상기 용매를 회전 증발기로 증발시켰다. 정제된 콘쥬게이트를 디에틸 에테르의 첨가로 정제하였다.
필요하다면, 상기 생성물을 추가로 Betasil C18 칼럼 (Keystone Scientific) 을 이용한 역상 HPLC 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 15
에틸렌 옥시드의 음이온성 아세탈 전구체 상으로의 직접적 음이온성 개환 중 합에 의한 PEG(3500 DA)-α-히드록시-ω-부티르알데히드의 제조
본 실시예에서, 에틸렌 옥시드로 개환 중합을 개시하는데 적합한 부위를 갖는 아세탈 전구체를 4-클로로-부티르알데히드 디에틸 아세탈을 디-알콜, 에틸렌 글리콜과 반응시켜 제조하였다. 상기 방법에서, 할로-아세탈은 히드록시-말단 아세탈로 전환되었다. 히드록실기는, 대응하는 알콕시드 음이온으로 전환될 때, 에틸렌 옥시드 (EO) 의 중합을 개시하기 위한 부위를 제공하여, 중합체 알카날 전구체를 형성하였다. 중합체 알카날 전구체 (아세탈) 는 가수분해 시, 목적하는 중합체 알카날로 전환되었다.
본 발명의 중합체 알카날의 제조를 위한 본 합성 접근법에 대한 일반화된 도식을 도. 1 에서 나타내었다.
A. 2-(4,4- 디에톡시 - 부톡시 )에탄올 (화합물 15A) 의 제조
무수 에틸렌 글리콜 (120 g, 1.93 몰), tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 용액 (70 ㎖, 0.07 몰) 및 4-클로로부티르알데히드 디에틸 아세탈 (11 g, 0.061 몰) 의 혼합물을 아르곤 대기하에 100℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 반응 혼합물을 600 ㎖ 증류수에 첨가하였다. 생성물을 디클로로메탄 (150, 125 및 125 ㎖) 으로 추출하였다. 그 후, 조합된 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압하에 증류제거하였다. 다음에 상기 생성물을 진공 증류하였다 (kugelrohr, t = 90 - 110℃, 0.10 ㎜ Hg). 수율 5.5 g.
B. PEG(3,500 Da )-α-히드록시-ω- 부티르알데히드 디에틸 아세탈의 제조
화합물 15A (0.51 g, 0.00247 몰), THF 200 ㎖ 및 칼륨 나프탈리드 (0.3 몰/L-테트라히드로푸란 용액, 20 ㎖, 0.006 몰) 를 유리 반응기에 첨가하고, 아르곤 대기하에 3 분 동안 교반하였다. 에틸렌 옥시드 (8.8 g, 0.20 몰) 를 상기 용액에 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 44 시간 동안 교반하였다. 다음에 상기 혼합물을 아르곤으로 충전시키고, 0.1 M 인산염 완충용액 (pH = 8, 100 ㎖) 을 첨가하였다. THF 층을 분리하고 버렸다. 나프탈렌을 에틸 에테르 추출에 의해 상기 용액으로부터 제거하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄 (3× 50 ㎖) 으로 잔류물로부터 추출하였다. 추출물을 무수 소듐 술페이트로 건조시키고, 약 30 ㎖ 로 농축시켰다. 다음에 에틸 에테르 (250 ㎖) 를 첨가하고, 혼합물을 0℃ 에서 15 분 교반하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압하에 건조시켰다.
수율 7.2 g.
C. PEG(3,500 Da )-α-히드록시-ω- 부티르알데히드
PEG(3,500 Da)-α-히드록시-ω-부티르알데히드 디에틸 아세탈 (1.0 g), 탈이온수 (20 ㎖) 및 pH 를 3.0 으로 조정하기 위한 5% 인산의 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음에, 염화나트륨 (1.0 g) 을 첨가하고, 0.1 M 소듐 히드록시드로써 pH 를 6.8 로 조정하였다. 생성물을 디클로로메탄 (3× 20 ㎖) 으로 추출하였다. 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 증류제거하였다. 젖은 생성물을 감압하에 건조시켰다. 수율: 0.82 g.
실시예 16
메톡시 -PEG(3500 DA) 부티르알데히드의 제조
본 실시예는 PEG α-히드록시-ω-알카날 아세탈로부터 예시적 말단 캡핑된 PEG-알카날의 제조를 설명한다.
A. mPEG(3,500 Da )- 부티르알데히드 디에틸 아세탈
PEG(3,500 Da)-α-히드록시-ω-부티르알데히드 디에틸 아세탈 (3.5 g, 0.001 몰), 톨루엔 (50 ㎖), tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 용액 (5 ㎖, 0.005 몰) 및 메틸 p-톨루엔 술포네이트 (0.75 g, 0.004 몰) 의 혼합물을 45℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 다음에, 상기 용매를 감압하에 증류제거하였다 (회전 증발기). 조 생성물을 디클로로메탄에 용해시키고, 냉 에틸 에테르에 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압하에 건조시켰다. 수율: 3.1 g.
B. mPEG(3,500 Da )- 부티르알데히드
mPEG(3,500 Da)-부티르알데히드 디에틸 아세탈 (1.0 g), 탈이온수 (20 ㎖) 및 pH 를 3.0 으로 조정하기 위한 5% 인산의 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음에, 염화나트륨 (1.0 g) 을 첨가하고, 0.1 M 소듐 히드록시드로써 pH 를 6.8 로 조정하였다. 생성물을 디클로로메탄 (3× 20 ㎖) 으로 추출하였다. 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 용매를 증류제거하였다. 젖은 생성물을 감압하에 건조시켰다. 수율: 0.85 g.
실시예 17
메톡시 -PEG(2 KDA ) 2- 메틸부티르알데히드의 제조
본 실시예는 본 발명의 예시적 중합체 2-알킬치환된 알카날의 합성을 기술하였다. 상기 중합체는 링커로부터 알데히드 탄소를 분리시키는 직쇄 알킬렌쇄를 소유하기보다 C-2 위치에서 메틸 치환기를 소유하고 있었다.
개요: 처음에 부타노에이트 탄소를 대응하는 알콜로 환원시키고, 이어서 부티르알데히드로 산화시킴으로써 시판하는 출발 물질 2-메틸-4-클로로부타노에이트로부터 보호된 아세탈 시약, 17-A 를 제조하였다. 그 후, 부티르알데히드를 대응하는 아세탈로 보호하여 PEG 에 커플링하기 위한 보호된 아세탈 시약을 제공하였다. PEG 에 커플링한데 이어서, 생성 중합체 아세탈을 산에서 가수분해하여 목적하는 중합체 알카날을 제공하였다.
A. 4- 클로로 -2- 메틸부티르알데히드 디에틸 아세탈의 제조
4- 클로로 -2- 메틸부탄올 - 1 의 제조
*에틸 에테르 (80 ㎖) 내 2-메틸 4-클로로부타노에이트 (TCI America)(22.0 g, 0.146 몰) 의 용액을 아르곤 대기하 0℃ 에서 에틸 에테르 (360 ㎖) 내 리튬 알루미늄 히드리드 (4.55 g, 0.12 몰) 의 교반된 용액에 30 분 동안 적가하였다. 다음에 메탄올 (12 ㎖) 을 30 분에 걸쳐서 적가하고 이어서 얼음-냉각된 2N HCl (420 ㎖) 을 20 분에 걸쳐 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 분리 깔때기에 옮기고, 4-클로로-2-메틸부탄올-1 을 함유한 에테르 층을 분리하였다. 추가 생성물을 에틸 에테르 (3×200 ㎖) 를 가진 수층으로부터 추출하였다. 에테르 추출물을 조합하고, 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 용매를 감압하에 증류시켰다. 수율 18.6 g.
4- 클로로 -2- 메틸부티르알데히드
피리디늄 클로로크로메이트 (23.6 g, 0.110 몰) 를 무수 디클로로메탄 (470 ㎖) 내 4-클로로-2-메틸부탄올-1 (8.80 g, 0.078 몰) 의 교반된 용액에 점차 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 건조 에테르 (820 ㎖) 를 첨가하고; 혼합물을 20 분 동안 교반한 다음, 여과하여 과량의 산화제를 제거하였다. 그 후, 용액을 400 g 의 Florisil 로 채워진 칼럼을 통해 여과하고, 용매를 감압하에 증류제거하였다. 수율 6.0 g.
4- 클로로 -2- 메틸부티르알데히드 디에틸 아세탈
4-클로로-2-메틸부티르알데히드 (4.8 g, 0.040 몰), 트리에틸 오르토포르메이트 (6.48 g, 0.044 몰), 에틸 알콜 (3.0 g) 및 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (0.0144 g, 0.000757 몰) 의 혼합물을 아르곤 대기하에 45℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 다음에, 실온으로 냉각시킨 후, Na2CO3 (0.40 g) 를 첨가하고 혼합물을 15 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 에틸 알콜 및 잔류한 트리에틸 오르토포르메이트를 감압하에 증류제거하였다. 잔류물을 분획 진공 증류하여, 3.2 g 의 순수한 4-클로로-2-메틸부티르알데히드 디에틸 아세탈을 얻었다.
B. mPEG (2K Da )-2- 메틸부티르알데히드 , 디에틸 아세탈
톨루엔 (30 ㎖) 내 mPEG (2K Da)(2.0 g, 0.001 몰) 의 용액을 감압하에 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 상기 건조된 mPEG 2K 를 무수 톨루엔 (15 ㎖) 에 용해시키고, tert-부탄올 내 1.0 M 칼륨 tert-부톡시드 용액 (4.0 ㎖, 0.004 몰) 및 상기 A 유래의 4-클로로-2-메틸부티르알데히드 디에틸 아세탈 (0.5 g, 0.00277 몰) 을 첨가하였다. 다음에, 리튬 브로마이드 (0.05 g) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 대기하에 100℃ 에서 하룻밤 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 여과하고, 0-5℃ 에서 150 ㎖ 에틸 에테르에 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압하에 건조시켰다. 수율: 1.5 g.
C. mPEG (2K Da )-2- 메틸부티르알데히드
mPEG (2K Da)-2-메틸부티르알데히드, 상기 B 유래의 디에틸 아세탈 (1.0 g), 탈이온수 (20 ㎖) 및 pH 를 3.0 으로 조정하기 위한 5% 인산을 함유한 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음에, 염화나트륨 (1.0 g) 을 첨가하고, 0.1 M 소듐 히드록시드로써 pH 를 6.8 로 조정하였다. 생성물을 디클로로메탄 (3×20 ㎖) 으로 추출하였다. 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압하에 증류제거하였다. 수율: 0.83 g.
이상에서 본 바와 같이, 본 발명에 따르면 고순도로 제조되며, 저장 안정성을 나타내는 중합체 알카날이 수득될 수 있다.
도 1 은 음이온성 부위를 갖는 아세탈 전구체 상에 에틸렌 옥시드 (EO) 의 음이온성 개환 중합으로 인해 본 발명의 중합체 알카날을 제조하기 위한 일반 반응식이다.

Claims (51)

  1. 하기 구조를 갖는 화합물:
    (식 중, hGH는 N-말단 아미노산을 포함하는 인간 성장 호르몬을 나타내고; 각 mPEG는 약 18,000 내지 약 22,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜기를 나타낸다)
  2. 제 1 항에 있어서, 각 mPEG는 약 20,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, hGH를 제외한 화합물이 약 1.2 미만의 다분산도를 갖는 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서, hGH를 제외한 화합물이 약 1.1 미만의 다분산도를 갖는 화합물.
  5. 제 2 항에 있어서, hGH를 제외한 화합물이 약 1.05 미만의 다분산도를 갖는 화합물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, hGH가 2차 아민을 통해 hGH의 N-말단 아미노산에 공유결합되는 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항에 있어서, 화합물이 모노-PEG화된 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, hGH가 hGH의 N-말단 아미노산에서 일차적으로 모노-PEG화되는 화합물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, hGH가 재조합 hGH인 화합물.
  10. 제 9 항에 있어서, 재조합 hGH가 대장균에서 생성되는 화합물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 정제된 화합물.
  12. 제 11 항에 있어서, 화합물이 크로마토그래피에 의해 정제되는 화합물.
  13. 제 12 항에 있어서, 화합물이 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되는 화합물.
  14. 중합체와 N-말단 아미노산을 포함하는 인간 성장 호르몬(hGH)을 반응시켜 형성된 콘쥬게이트.
    [여기서, 중합체는 하기 식을 갖는다:
    여기서, 각 mPEG는 약 18,000 내지 약 22,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜기를 나타낸다;
    (실시예 13, 실시예 5(중합체 부분), 청구항 90, 페이지 11, 14-16 라인), 페이지 37- 구조식 V-B, 페이지 40, 10-12 라인]
  15. 제 14 항에 있어서, 각 mPEG가 약 20,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트.
  16. 제 14 항에 있어서, 중합체가 약 40,300 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 약 1.2 미만의 다분산도를 갖는 콘쥬게이트.
  18. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 약 1.1 미만의 다분산도를 갖는 콘쥬게이트.
  19. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 약 1.05 미만의 다분산도를 갖는 콘쥬게이트.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 콘쥬게이트가 일차적으로 모노-PEG화되는 콘쥬게이트.
  21. 제 20 항에 있어서, 콘쥬게이트가 hGH의 N-말단에서 일차적으로 모노-PEG화되는 콘쥬게이트.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, hGH가 재조합 hGH인 콘쥬게이트.
  23. 제 22 항에 있어서, 재조합 hGH가 대장균에서 생성되는 콘쥬게이트.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 콘쥬게이트가 중합체를 환원성 아민화 조건 하에서 반응 혼합물 내 hGH와 반응시켜 형성되는 콘쥬게이트.
  25. 제 24 항에 있어서, 반응 혼합물 내의 hGH에 대한 중합체의 개시 몰비가 약 5 이하인 콘쥬게이트.
  26. 제 25 항에 있어서, 콘쥬게이트가 반응 혼합물로부터 분리되는 콘쥬게이트.
  27. 제 26 항에 있어서, 콘쥬게이트가 반응 혼합물로부터 크로마토그래피적으로 분리되는 콘쥬게이트.
  28. 제 27 항에 있어서, 크로마토그래피적 분리가 이온 교환에 의한 콘쥬게이트.
  29. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적 부형제를 포함하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 약학적 부형제는 탄수화물, 무기염, 항미생물제제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 및 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 조성물이 액체 형태인 조성물.
  32. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 조성물이 고체 형태인 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 고체 형태가 동결 건조된 분말인 조성물.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 단위 용량 형태의 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서, 조성물이 단위 용량 용기에 저장되는 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, 용기가 주사기인 조성물.
  37. hGH의 투여로 치료가능한 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  38. 제 14 항 내지 28 항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트 및 약학적 부형제를 포함하는 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 약학적 부형제가 탄수화물, 무기염, 항미생물제제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 및 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 조성물이 액체 형태인 조성물.
  41. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 조성물이 고체 형태인 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 고체 형태가 동결 건조된 분말인 조성물.
  43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 단위 용량 형태의 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 조성물이 단위 용량 용기에 저장되는 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 용기가 주사기인 조성물.
  46. hGH의 투여로 치료가능한 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 제 14 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 용도.
  47. hGH의 투여로 치료가능한 질환의 치료를 위한 제 14 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 용도.
  48. hGH의 투여로 치료가능한 질환의 치료를 위한 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  49. 환원성 아민화 조건 하에서 hGH를 반응 혼합물 내 중합체와 반응시키는 단계; 및 임의로는 반응 혼합물로부터 콘쥬게이트를 분리시키는 단계를 포함하는, 제 14 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 콘쥬게이트의 제조 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 반응 혼합물의 pH가 약 5 내지 약 8 인 방법.
  51. 제 49 항에 있어서, 반응 혼합물의 pH가 약 7 내지 약 7.5 인 방법.
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