MXPA04009418A - Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos y porciones de union a antigeno de los mismos que se unen especificamente a interleucina-5 (IL-5), la cual es de preferencia IL-5 humana; la invencion se refiere tambien a anticuerpos anti-IL-5 humanos, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla quimericos, biespecificos o derivatizados, o porciones de proteinas de fusion; la invencion se refiere tambien a moleculas de inmunoglobulina aisladas de cadena ligera y pesada derivadas de anticuerpos anti-IL-5, y moleculas de acido nucleico que codifican para dichas moleculas; la presente invencion se refiere tambien a metodos para obtener anticuerpos anti-IL-5, composiciones farmaceuticas que comprenden estos anticuerpos, y metodos para usar los anticuerpos y composiciones de los mismos para diagnostico y tratamiento; la invencion provee tambien metodos de terapia genica usando moleculas de acido nucleico que codifican para las moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera que comprenden los anticuerpos anti-IL-5 humanos; la invencion se refiere tambien a metodos de terapia genica y animales transgenicos que comprenden moleculas de acido nucleico de la presente invencion.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA INTERLEUCINA-5.Y METODOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos y porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a interleucina-5 (IL-5), y métodos y composiciones que comprenden dichos anticuerpos monoclonales o porciones de unión a antígeno de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los eosinófilos desempeñan una función importante en la patogénesis del asma. Tanto la severidad del asma como el grado de hipersensibilidad de la vía aérea se correlacionan con los números de eosinófilos en sangre y esputo. Los estudios de biopsias bronquiales muestran que los eosinófilos son un componente prominente de inflamación de la vía aérea del asmático, y que están presentes contenidos de gránulos de los eosinófilos en concentraciones incrementadas en el fluido que reviste la vía aérea de los asmáticos. Estos contenidos de gránulos consisten de muchas proteínas que tienen efectos tóxicos directos sobre las células de la vía aérea, a través de mecanismos múltiples tales como desecho de células epiteliales, ciliostasis, generación de radicales oxígeno y lesión de fibras nerviosas de la vía aérea. Los eosinófilos producen también mediadores que pueden aumentar la liberación de histamina por las células cebadas. Este espectro de actividades favorece directamente la inflamación crónica de la vía aérea bronquial, según se manifiesta mediante hinchamiento de las paredes de la vía aérea y la generación de moco en la vía aérea. Al facilitarse la penetración de agentes aereotransportados a través del epitelio dañado de la vía aérea, esta inflamación puede causar directamente sensibilidad neuronal y contracción del músculo liso incrementadas (Greenfeder et al., Respiratory Research 2: 71-79, 2001 ). La interleucina-5 (IL-5) es un mediador importante de eosinófilos, y un factor crítico en lesión inflamatoria de las vías aéreas en asma. Es producida principalmente por el subgrupo Th2 de células T y, a un menor grado, por otros tipos de células que incluyen eosinófilos. La IL-5 es de importancia crítica para la maduración de los eosinófilos en la médula ósea, y de importancia menor para la respuesta quimiotáctica de los eosinófilos. La IL-5 estimula también la activación de los eosinófilos, prolonga la supervivencia, facilita la desgranulación en respuesta a estímulos específicos (tales como IgA o IgG), y es en general un mediador proinflamatorio. Se han medido niveles incrementados de IL-5 en modelos de desafío de antígeno bronquial humano y en asma clínico (Greenfeder et al., Respiratory Research 2: 71-79, 2001 ). Actualmente, el asma se trata más eficazmente mediante un régimen de esteroides inhalados u orales que suprimen la expresión de muchos mediadores clave en el asma, incluyendo IL-5, resultando en inflamación pulmonar disminuida. Sin embargo, existen desventajas percibidas a largo plazo de la terapia con esteroides. Por estas razones, la terapia directa con anti-IL-5 es un objetivo atractivo en el manejo del asma. De esta manera, sería deseable obtener anticuerpos de alta afinidad, en particular anticuerpos anti-IL-5 humanos, que puedan usarse para tratar patologías mediadas por IL-5 en humanos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a IL-5. En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno, son aislados y pueden ser policlonales o monoclonales. En modalidades preferidas, los anticuerpos se unen específicamente a IL-5 humana. En modalidades particularmente preferidas, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos. La presente invención incluye anticuerpos que comprenden una cadena ligera humana y/o cadena pesada humana, la región variable humana completa o cualquier porción de la misma, incluyendo CDRs individuales, de un anticuerpo provisto en la presente. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de un gen V3-23 humano, un gen D1-20 humano y un gen JH4B humano. En otras modalidades, la CDR2 de la cadena pesada de los anticuerpos o fragmentos de unión antígeno de los mismos, comprende una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, y la CDR3 de la cadena pesada contiene dos sustituciones de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las secuencias de aminoácidos de la línea germinal de un gen VK08/018 humano y un gen JK4 humano. En otras modalidades, cada una de la CDR1 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de la cadena ligera comprende una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende las CDR1 , CDR2 y CDR3 mostradas en SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente. En otra modalidad, la cadena pesada del anticuerpo comprende una porción contigua de la secuencia de aminoácidos mostrada en el cuadro 2 de CDR1 a CDR3. En otra modalidad, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 6. En otras modalidades, cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente comprende además la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, o la región variable (residuo de aminoácido 23-130 de SEQ ID NO: 4), CDR1 a CDR3, como se muestra en el cuadro 3 (residuo de aminoácido 46-119 de SEQ ID NO: 4) o CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 16) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Los anticuerpos o porción de los mismos de la invención, pueden ser una molécula de ¡nmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD. En una modalidad preferida, el anticuerpo humano es una IgG, y es un subtipo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. En una modalidad más preferida, el anticuerpo humano es un subtipo lgG4. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo humano es 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se deriva de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo quimérico. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo forma parte de una proteína de fusión. En otro aspecto, la invención provee moléculas de polinucleótido que comprenden secuencias que codifican para las moléculas de ¡nmunoglobulina de cadena ligera y pesada de la invención, o porciones de las mismas, en particular secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera y pesada, secuencias de aminoácidos contiguas de cadena ligera y pesada de CDR1 a CDR3, y CDRs individuales.

De conformidad con otro objetivo, la invención provee un anticuerpo anti-IL-5 humano o porción de unión a antígeno del mismo que es marcado o derivatizado. En una modalidad, el anticuerpo o porción del mismo es marcado con una marca radiactiva, una marca de enzima, una toxina, un agente magnético o un conjugado de fármaco. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo es derivatizado para mejorar una o más de sus características, tales como vida media, biodisponibilidad o actividad. En una modalidad preferida, el anticuerpo o porción del mismo es derivatizado con polietilenglicol, por lo menos un grupo metilo o etilo, o por lo menos una porción de carbohidrato. En otra modalidad preferida, el anticuerpo o porción del mismo marcado o derivatizado, se usa en métodos de diagnóstico o terapéuticos. De conformidad con otro objetivo, la invención provee un anticuerpo anti-IL-5 o porción de unión a antígeno del mismo de la invención, que se caracteriza por uno o más de los siguientes: inhibe o disminuye la inflamación mediada por IL-5, la maduración, activación, desgranulación o infiltración de eosinófilos en un tejido in vivo o in vitro, inhibe la hipersensibilidad de un músculo liso inducida por IL-5, y disminuye los niveles de IL-5 en pulmones, vías aéreas o sangre. En una modalidad preferida, el anticuerpo humano inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en un tejido in vivo. En una modalidad preferida, el tejido es pulmón o tejido que reviste las vías aéreas. De conformidad con otro aspecto, la invención provee composiciones y equipos farmacéuticos que comprenden el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, la composición o equipo farmacéutico comprende además otro componente, tal como un reactivo de formación de imágenes o agente terapéutico. En modalidades preferidas, la composición o equipo farmacéutico se usa en métodos de diagnóstico o terapéuticos. Otro aspecto de la invención comprende métodos de diagnóstico. En una modalidad, la invención provee un método para diagnosticar la presencia o ubicación de un tejido que expresa IL-5. En una modalidad preferida, el método usa un anticuerpo marcado o porción del mismo. El método puede usarse in vivo o in vitro. En otra modalidad, se provee un método de diagnóstico que comprende determinar si un anticuerpo anti-IL-5 humano inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en un tejido, por ejemplo, el pulmón. Otro objetivo de la invención comprende métodos terapéuticos para usar un anticuerpo anti-IL-5 humano, o porción de unión a antígeno del mismo. En una modalidad, un método terapéutico comprende el paso de administrar una cantidad efectiva del anticuerpo a un sujeto que necesita del mismo. En una modalidad preferida, el sujeto sufre de asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica. En una modalidad más preferida, el método inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en el pulmón. El anticuerpo o porción del mismo puede administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses, y puede administrarse mediante una vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o tópica. En otra modalidad, el método se lleva a cabo junto con cirugía u otra inmunoterapia. En otra modalidad, el anticuerpo es marcado con una marca radiactiva, un conjugado de fármaco, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico. En otro aspecto, la presente invención provee métodos para producir un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno del mismo, incluyendo producción mediante una célula inmortalizada, medios de síntesis, expresión recombinante o presentación visual de fagos. Otro objetivo de la invención, es proveer ácidos nucleicos que codifiquen para la cadena pesada y/o ligera, porciones de unión a antígeno de los mismos, o derivados de los mismos, de un anticuerpo anti-IL-5. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico se deriva de una célula o línea de células que expresa un anticuerpo antí-IL-5. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico se deriva de un hibridoma. En una modalidad aún más preferida, el hibridoma es 20.13.3. En otra modalidad, la invención provee vectores y células hospederas que comprenden las moléculas de ácido nucleico. En otra modalidad, la invención provee un método para producir en forma recombinante la cadena ligera y/o pesada, las porciones de unión a antígeno de las mismas, o derivados de las mismas. La invención provee también un método para tratar a un sujeto que necesita del mismo, con una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera y/o pesada, porciones de unión a antígeno de la misma, o derivados de la misma de un anticuerpo anti-IL-5. En una modalidad preferida, el método se usa para tratar, sin limitación, asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopuimonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones y técnicas generales A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados con relación a la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares incluirán pluralidades, y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas con relación a, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente, son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica, y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se describen a lo largo de la presente especificación, a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), citas incorporadas en la presente como referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo a las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las nomenclaturas usadas con relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéuticos, y tratamiento de pacientes. Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados: El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Los polipéptidos preferidos de conformidad con la invención, comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera k, así como fragmentos y análogos de las mismas. El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado", es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no se asocia con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. De esta manera, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Puede hacerse también que una proteína esté sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica. Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado", cuando por lo menos de alrededor de 60 a 75% de una muestra exhibe una especie individual de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá típicamente alrededor de 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en p/p de una muestra de proteína, más usualmente alrededor de 95%, y de preferencia será más de 99% puro. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante muchos medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida de visualización de una banda de polipéptido individual tras tinción del gel con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, puede proveerse mayor resolución mediante CLAR u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación. El término "fragmento de polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural. Los fragmentos tienen típicamente por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente por lo menos 20 aminoácidos de longitud, usualmente por lo menos 50 aminoácidos de longitud, y aún más preferiblemente por lo menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo de polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende un segmento de por lo menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos, y que se une específicamente a IL-5 bajo condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución (o inserción o deleción) conservativa de aminoácidos con respecto a la secuencia de ocurrencia natural. Los análogos tienen típicamente por lo menos 20 aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos de longitud o más, y con frecuencia pueden ser tan largos como un polipéptido de ocurrencia natural de longitud completa. Se usan comúnmente análogos no peptídicos en la industria farmacéutica, como fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Véase Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), citas que se incorporan en la presente como referencia. Dichos compuestos se desarrollan con frecuencia usando elaboración de modelos moleculares computarizados. Pueden usarse peptidomiméticos que sean estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles, para producir un efecto profiláctico o terapéutico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructu raímente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad farmacológica o propiedad bioquímica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: -CH2NH-, -CH2S--, -CH2-CH2--, -CH=CH-(cis y trans), --COCH2-, -CH(OH)CH2-- y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse también sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos constreñidos que comprendan una secuencia consenso o una secuencia consenso sustancialmente idéntica, mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 : 387 (1992), cita incorporada en la presente como referencia); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar enlaces disulfuro intramoleculares que ciclicen el péptido. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de ocurrencia natural, cada tetrámero comprende dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena "ligera" (de alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras ? y ?. Las cadenas pesadas se clasifican como µ, ?, ?, a o e, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, en donde la cadena pesada incluye también una región "D" de alrededor de 10 aminoácidos más. Véase, en general, Fundamental Immunology capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión al anticuerpo, de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión. Las cadenas de inmunoglobulina exhiben la misma estructura general de las regiones de estructura (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas también regiones determinantes de complementariedad, o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones de estructura, permitiendo la unión a un epítope específico. Del extremo amino al extremo carboxilo, las cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de conformidad con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989). Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta, o a una porción de unión al antígeno de la misma, que compite con el anticuerpo intacto para unión específica. Pueden producirse porciones de unión al antígeno mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante digestión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2l Fv, dAb, y fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, cuerpos completos y polipéptidos que contengan por lo menos una porción de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir unión específica del antígeno al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente disulfuro en la región de pivoteo; un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341 : 544-546, 1989) consiste de un dominio VH. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), es un anticuerpo en el cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes mediante un enlazador sintético que permite que se formen como una cadena de proteína sencilla (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Los cuerpos completos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica sencilla, pero usando un enlazador que sea muy corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena, y creando dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, y Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1 121-1123, 1994). Una o más CDRs pueden incorporarse en una molécula covalentemente o no covalentemente, para hacerla una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR(s) como parte de una cadena polipeptídica más larga, puede enlazar covalentemente las CDR(s) a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar las CDR(s) no covalentemente. Las CDRs permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés. Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos a algún otro, o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de ocurrencia natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1 ) no está asociado con componentes asociados naturalmente, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-IL-5 que ha sido purificado por afinidad usando IL-5, un anticuerpo anti-IL-5 que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea de células in vitro, y un anticuerpo anti-IL-5 humano derivado de un ratón transgénico. El término "anticuerpo humano", incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos pueden prepararse en una variedad de formas, como se describe a continuación. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que se deriva de una especie no humana, en el cual ciertos aminoácidos en la estructura y dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras han sido mutados para evitar o suprimir una respuesta inmune en humanos. En forma alternativa, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano a los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de cómo obtener anticuerpos humanizados, pueden encontrarse en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293.

El término "anticuerpo quimérico", se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo, y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. El término "Kde disociación" se refiere a la constante de la velocidad de disociación, para la disociación de un anticuerpo del complejo antígeno/anticuerpo. El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción particular de antígeno-anticuerpo. El término "epítope" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno, cuando la constante de disociación es < 1 µ?, de preferencia < 100 nM, y más preferiblemente < 10 nM. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden ser preparados fácilmente por los expertos en la técnica, siguiendo las enseñanzas de esta especificación. Los extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos, ocurren cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse comparando los datos de secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos con bases de datos de secuencias patentadas o públicas. De preferencia, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína predichos que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase Bowie et al. Science 253: 164 (1991 ). Sustituciones de aminoácidos preferidas, son aquellas que: (1 ) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia peptídica de ocurrencia natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (de preferencia sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia de ocurrencia natural (de preferencia, en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman contactos ¡ntermoleculares). Una sustitución conservativa de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia precursora, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia precursora). Ejemplos de estructuras secundaria y terciaria de polipéptidos reconocidos en la técnica, se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991 )); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991 ), citas que se incorporan en la presente como referencia. Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas, siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a. edición, E. S. Golub y D. R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991 )), cita incorporada en la presente como referencia. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales, pueden ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetil lisina, e-?-acetil Usina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e ¡minoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en la presente, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino-terminal, y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo al uso y convención estándar. El término "polinucleótido", como se refiere en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos diez bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de cadena sencilla y de doble cadena. El término "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, significará un polinucleótido de ADNc genómico, o de origen sintético, o alguna combinación de los mismos, el cual en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1 ) no se asocia con un polinucleótido completo, o una porción del mismo, en donde el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado operablemente a un polinucleótido el cual no está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "oligonucleótido" referido en la presente, incluye nucleótidos de ocurrencia natural y nucleótidos modificados enlazados mediante enlaces de oligonucleótido de ocurrencia natural y de ocurrencia no natural. Los oligonucleótidos son un subgrupo de polinucleótidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud, y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de cadena sencilla, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble cadena, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen muíante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido.

El término "nucleótidos de ocurrencia natural" referido en la presente, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos, y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" referido en la presente, incluye enlaces de oligonucleótidos, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucí Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Desing 6: 539 (1991 ); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practica! Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991 )); Stec et al. patente de E.U.A. No. 5,151 ,510; y Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. A menos que se especifique de otra manera, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena, es referida como la dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes, es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y las cuales son 5' al extremo 5' del transcrito de ARN, son referidas como "secuencias hacia el extremo 5"'; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y las cuales son 3' al extremo 3' de transcrito de ARN, son referidas como "secuencias hacia el extremo 3"'. Las secuencias "enlazadas operablemente", incluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés, y secuencias de control de la expresión que actúan en posición trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. Secuencias de control de la expresión incluyen secuencias adecuadas de promotor e intensificador de término e inicio de la transcripción; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARN mensajero citoplásmico; secuencias que intensifican la eficiencia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que intensifican la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo hospedero; en procariontes, dichas secuencias de control incluyen en general promotor, sitio de unión al ribosoma, y secuencia de término de la transcripción; en eucariontes, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de término de la transcripción. El término "secuencias de control" se usa para incluir, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para expresión y procesamiento, y pueden incluir también otros componentes cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de miembros de fusión. El término "vector", como se usa en la presente, se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el cual pueden unirse otros segmentos de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden unirse otros segmentos de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de exhibir replicación autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera tras introducción en la célula hospedera, y se replican de esta manera junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son enlazados operablemente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse recíprocamente, ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), los cuales cumplen funciones equivalentes. El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente, "célula hospedera"), como se usa en la presente, se usa para referirse a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Debe entenderse que dichos términos se usan para referirse no sólo a la célula sujeto particular, sino a la progenie de dicha célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero se incluyen aún dentro del alcance del término "célula hospedera", como se usa en la presente. El término "hibridar selectivamente" referido en la presente, significa unir detectablemente y específicamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos, de conformidad con la invención, hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que reducen al mínimo cantidades apreciables de unión detectable con ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta severidad" o "altamente severas", para lograr condiciones de hibridación selectivas, como es sabido en la técnica y como se describe en la presente. Un ejemplo de condiciones de "alta severidad" o "altamente severas", es un método de incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, en donde un polinucleótido puede ser adherido a una superficie sólida tal como una membrana, en un regulador de pH de hibridación de 6X de SSPE o SSC, formamida a 50%, 5X de reactivo de Denhardt, SDS a 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, a una temperatura de hibridación de 42°C durante 12-16 horas, seguida de dos veces lavado a 55°C usando un regulador de pH de lavado de 1X de SSC, SDS a 0.5%. Véase también Sambrook et al., citado anteriormente, pp. 9.50-9.55. Dos secuencias de aminoácidos son homologas, si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias son alineadas para coincidencia máxima. Se permiten espacios (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando), para aumentar al máximo la coincidencia; se prefieren longitudes de espacio de 5 o menos, siendo más preferidas 2 o menos. En forma alternativa y de preferencia, dos secuencias de proteína (o secuencias polipeptídicas derivadas de las mismas de por lo menos 30 aminoácidos de longitud) son homologas, como este término se usa en la presente, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación, y una penalidad de espacio de 6 o más. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)), y complemento 2 de este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homologas, si sus aminoácidos son más que, o igual a, 50% idénticos cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN. El término "corresponde a", se usa en la presente para indicar que una secuencia de polinucleótidos es idéntica a una secuencia de polinucleótidos de referencia, o una porción de la misma, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. En contraste, el término "complementaria a" se usa en la presente para indicar que la secuencia complementana es idéntica a una secuencia de polinucleótidos de referencia completa, o una porción de la misma. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC", y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA". Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más larga, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de genes o de ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias, o puede comprender una secuencia de genes o de ADNc completa. En general, una secuencia de referencia tiene por lo menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, con frecuencia por lo menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y con frecuencia por lo menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos pueden comprender (1 ) una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos, típicamente se hacen comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas, comparando secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación", para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos, en donde una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos puede compararse con una secuencia de referencia de por lo menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos, y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (es decir, espacios) de 20 por ciento o menos, en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones), para alineación óptima de las dos secuencias. Puede realizarse alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981 ), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de genética Wisconsin, publicación 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), Geneworks, o paquetes de programas MacVector), o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, resultando en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por los varios métodos. El término "identidad de secuencias", significa que dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos son idénticas (es decir, sobre una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencias", se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o residuo ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones comparadas, dividiendo el número de posiciones comparadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias. El término "identidad sustancial", como se usa en la presente, denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencias, de preferencia por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencias, más preferiblemente por lo menos 98 por ciento de identidad de secuencias, más usualmente por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencias, en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), con frecuencia sobre una ventana de por lo menos 24 a 48 posiciones de nucleótidos (8 a 16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencias se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones, que suma en total 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia, sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más larga. Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan ponderaciones de espacio por omisión, comparten por lo menos 80 por ciento de identidad de secuencias, de preferencia por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencias, más preferiblemente por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencias, aún más preferiblemente por lo menos 98 por ciento de identidad de secuencias, y muy preferiblemente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencias. De preferencia, las posiciones de los residuos que no son idénticas, difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas, es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida, es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas, es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, es Usina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre, es cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-argnina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como se describe en la presente, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, siendo abarcadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, 90% o 95%, y muy preferiblemente 99% de identidad de secuencias. En particular, se contemplan reemplazos conservativos de aminoácidos. Los reemplazos conservativos son aquellos que ocurren dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en familias: (1 ) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son una familia hidroxialifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, Ieucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una Ieucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente, no tenga un efecto importante sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no incluye un aminoácido dentro de un sitio de la estructura. Si el cambio de un aminoácido resulta en un péptido funcional, puede determinarse fácilmente poniendo a prueba la actividad específica del derivado del polipéptido. Se describen pruebas en detalle en la presente. Como se usa en la presente, los términos "marca" o "marcada" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una modalidad, la marca es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido marcado radiactivamente o unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente, o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En otra modalidad, la marca o el marcador puede ser un agente terapéutico, por ejemplo, una toxina o conjugado de fármaco. Varios métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas se conocen y pueden usarse en la técnica. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitadas a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 5N, 35S, 90Y, 99Tc, 11 ln, 125l, 3 l), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fosfores de lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de la cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epítope), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina de tos ferina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. En algunas modalidades, las marcas se unen mediante brazos separadores de varias longitudes para reducir la obstrucción esférica potencial. El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto obtenido de materiales biológicos. El término "fármaco o agente farmacéutico", como se usa en la presente, se refiere a una composición o compuesto químico capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos se usan en la presente de acuerdo a su uso convencional en la técnica, como es ejemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), cita incorpora en la presente como referencia). El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios. A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, se entenderá que el término "comprende" o variaciones tales como "que comprende", implica la inclusión de un entero o grupo de enteros establecidos, pero no la exclusión de algún otro entero o grupo de enteros.

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables de ratón o rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de ratón o rata, puede llevar a la depuración rápida de los anticuerpos, o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Se espera que los anticuerpos anti-IL-5 totalmente humanos reduzcan al mínimo las respuestas inmunógenas y alérgicas intrínsecas a anticuerpos monoclonales de ratón o derivatizados de ratón, y de esta manera aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Puede esperarse que el uso de anticuerpos totalmente humanos provea una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación y cáncer, las cuales pueden requerir administraciones repetidas de anticuerpos.

Métodos para producir anticuerpos y líneas de células que producen anticuerpos Inmunización En una modalidad de la presente invención, se producen anticuerpos humanos inmunizando a un animal no humano que comprende todos los loci de inmunoglobulina humana, o algunos de los mismos, con un antígeno de IL-5 o fragmento inmunógeno del mismo. En una modalidad, el animal no humano es un XenoMouse™. El XenoMouse™ es una cepa de ratón diseñada que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana, y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994), y patentes de E.U.A. 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,1 14,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741 , publicado en julio 25 de 1991 , WO 94/02602, publicado en febrero 3 de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados en octubre 31 de 1996, WO 98/16654, publicado en abril 23 de 1998, WO 98/24893, publicado en junio 11 de 1998, WO 98/50433, publicado en noviembre 12 de 1998, WO 99/45031 , publicado en septiembre 10 de 1999, WO 99/53049, publicado en octubre 21 de 1999, WO 00 09560, publicado en febrero 24 de 2000, y WO 00/037504, publicado en junio 29 de 2000. Las cepas de XenoMouse™ fueron diseñadas con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían fragmentos de configuración de línea germinal de 245 kb y 190 kb de tamaño, del locus de la cadena pesada y del locus de la cadena ligera kappa humanos, respectivamente, que contenían secuencias centrales de la región constante y variable. Id. El XenoMouse™ produce un repertorio de anticuerpos totalmente humanos tipo adulto, y genera anticuerpos monoclonales (Mabs) humanos específicos del antígeno. Un XenoMouse™ de segunda generación contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por introducción de fragmentos de YACs de configuración de la línea germinal, de tamaño en megabases, de los loci de la cadena pesada y los loci de la cadena ligera kappa humanos. Véase Méndez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), y solicitud de patente de E.U.A. número de serie 08/759,620, presentada en diciembre 3 de 1996, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. En otra modalidad, el animal no humano que comprende loci de genes de inmunoglobulina humana, es un animal que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En la alternativa del minilocus, un locus de Ig exógeno es simulado a través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig. De esta manera, uno o más genes VH, uno o más genes DH, o uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma), forman una construcción para inserción en un animal. Este procedimiento se describe, entre otros documentos, en las patentes de E.U.A. No. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215 y 5,643,763, incorporadas en la presente como referencia. Una ventaja de la alternativa del minilocus, es la rapidez con la cual construcciones que incluyen porciones del locus de Ig, pueden generarse e introducirse en animales. Sin embargo, una desventaja potencial de la alternativa del minilocus, es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulinas para sustentar el desarrollo completo de células B, de modo que puede haber una menor producción de anticuerpos. En otra modalidad, la invención provee un método para obtener anticuerpos anti-IL-5 de animales no humanos y diferentes del ratón, inmunizando a animales transgénicos no humanos que comprenden loci de ¡nmunoglobulina humana. Es posible producir dichos animales usando los métodos descritos en las patentes de E.U.A. 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,1 14,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741 , publicado en julio 25 de 1991 , WO 94/02602, publicado en febrero 3 de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados en octubre 31 de 1996, WO 98/16654, publicado en abril 23 de 1998, WO 98/24893, publicado en junio 11 de 1998, WO 98/50433, publicado en noviembre 12 de 1998, WO 99/45031, publicado en septiembre 10 de 1999, WO 99/53049, publicado en octubre 21 de 1999, WO 00 09560, publicado en febrero 24 de 2000, y WO 00/037504, publicado en junio 29 de 2000. Los métodos descritos en estas patentes pueden modificarse, como se describe en la patente de E.U.A. 5,994,619. En una modalidad preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. Para producir un anticuerpo anti-IL-5, un animal no humano que comprenda todos los loci de inmunoglobulina humana, o algunos de los mismos, es inmunizado con un antígeno de IL-5, o fragmento ¡nmunógeno del mismo. En una modalidad, el antígeno de IL-5 es IL-5 aislada y/o purificada. En una modalidad preferida, el antígeno de IL-5 es IL-5 humana. En otra modalidad, el antígeno de IL-5 es un fragmento de IL-5. En otra modalidad, el antígeno de IL-5 es un fragmento que comprende por lo menos un epítope de IL-5. En otra modalidad, el antígeno de IL-5 es una célula que expresa IL-5. La inmunización de animales puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para inmunizar a animales no humanos, tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado y caballos, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, y patente de E.U.A. 5,994,619. En una modalidad preferida, el antígeno de IL-5 se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo e incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos de inmunoestimulación). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida, secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al hospedero para que secrete factores que son quimiotácticos para macrofagos, y otros componentes del sistema inmune. De preferencia, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del polipéptido, y extensión durante varias semanas.

Producción de anticuerpos v líneas de células que producen anticuerpos Después de la inmunización de un animal con un antígeno de IL-5, pueden obtenerse anticuerpos y/o células que producen anticuerpos del animal. En una modalidad, el suero que contiene anticuerpos anti-IL-5 se obtiene del animal, sangrando o sacrificando al animal. El suero puede usarse como se obtiene del animal, una fracción de inmunoglobulina puede obtenerse del suero, o los anticuerpos anti-IL-5 pueden purificarse del suero. Es bien sabido por los expertos en la técnica, que el suero o las inmunoglobulinas obtenidos de esta forma pueden ser policlonales. La desventaja de usar anticuerpos policlonales preparados de suero, es que la cantidad de anticuerpos que puede obtenerse es limitada, y el anticuerpo policlonal tiene una disposición heterogénea de propiedades. En otra modalidad, pueden prepararse células inmortalizadas que producen anticuerpos del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal es sacrificado, y las células B del bazo o los nodulos linfáticos son inmortalizadas de acuerdo a medios bien conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, transformación, tal como con EBV o fusión con una línea de células inmortalizadas adecuada, tales como células de mieloma, como es bien sabido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente. En una modalidad preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretoria). Después de fusión y selección del antibiótico, se seleccionan los hibridomas usando IL-5, o una porción de la misma, o una célula que exprese IL-5. En una modalidad preferida, la selección inicial se lleva a cabo usando un ¡nmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo. En una modalidad más preferida, se usa una ELISA para la selección inicial. Un ejemplo de selección por ELISA se provee en el documento WO 00/37504, incorporado en la presente como referencia. Hibridomas que producen anticuerpos anti-IL-5 son seleccionados, clonados y seleccionados además para características deseables, incluyendo crecimiento vigoroso de hibridomas, alta producción de anticuerpos y características de anticuerpos deseables, como se describe más adelante. Pueden expandirse hibridomas ¡n vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo de células in vitro. Métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas, son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En una modalidad preferida, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y células B de bazo o nodulos linfáticos, son fusionadas a un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. En una modalidad más preferida, el animal inmunizado es un XenoMouse™, y la línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretorio. En ciertas modalidades, la línea de células de mieloma es NSO-bcl2 o P3-X63-Ag8.653. Véase, por ejemplo, el ejemplo 1. En una modalidad, se producen hibrídomas que producen anticuerpos anti-IL-5 humanos. En una modalidad preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describió anteriormente. En otra modalidad preferida, los hibridomas se producen en una especie no humana y diferente del ratón, tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma no secretorio humano es fusionado con una célula que expresa un anticuerpo anti-IL-5.

Acidos nucleicos, vectores, células hospederas y métodos recombinantes para producir anticuerpos Acidos nucleicos La presente invención abarca también moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos anti-IL-5 humanos. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para una cadena ligera y/o pesada de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana intacta. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico individual codifica para una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana, y otra molécula de ácido nucleico codifica para la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana. En una modalidad más preferida, la inmunoglobulina codificada es una IgG humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena ? o una cadena . En una modalidad aún más preferida, la cadena ligera codificada es una cadena ?. En modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada (VH) se deriva de un gen VH DP-47/3-11. En varias modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica para la VH contiene no más de diez, no más de seis o no más de tres cambios de aminoácido del gen DP-47/3-11 de la línea germinal. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para la VH contiene por lo menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, que es idéntico al cambio de aminoácido en la secuencia de la línea germinal de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3. En una modalidad aún más preferida, la VH contiene por lo menos tres cambios de aminoácido en comparación con las secuencias de la línea germinal, que son idénticos a por lo menos tres cambios de aminoácido en la secuencia de la línea germinal de la VH del anticuerpo 20.13.3. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos derivada de un gen del segmento de diversidad D1 -20 humano. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos derivada de un gen JH4B humano. El cuadro 1 da una lista de las secuencias de ácido nucleico, y las secuencias de aminoácidos correspondientes que codifican, del anticuerpo 20.13.3, o porciones del mismo.

CUADRO 1 Lista de secuencias para el anticuerpo monoclonal 20.13.3, o porciones de mismo SEQ ID NO: Información de las secuencias 1 Secuencia de ADN de la cadena pesada completa 2 Secuencia de proteína de la cadena pesada completa 3 Secuencia de ADN de la cadena ligera completa 4 Secuencia de proteína de la cadena ligera completa Secuencia de ADN de la región variable de la cadena 5 pesada (VH) Secuencia de proteína de la región variable de la cadena 6 pesada (VH) 7 Secuencia de ADN de la CDR 1 de la VH 8 Secuencia de proteína de la CDR 1 de la VH 9 Secuencia de ADN de la CDR 2 de la VH 10 Secuencia de proteína de la CDR 2 de la VH 11 Secuencia de ADN de la CDR 3 de la VH 12 Secuencia de proteína de la CDR 3 de la VH 13 Secuencia de ADN de la CDR 1 de la VL 14 Secuencia de proteína de la CDR 1 de la VL 15 Secuencia de ADN de la CDR 2 de la VL 16 Secuencia de proteína de la CDR 2 de la VL 17 Secuencia de ADN de la CDR 3 de la VL 18 Secuencia de proteína de la CDR 3 de la VL En modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo 20.13.3, por lo menos de la CDR1 a la CDR3, como se muestra en el cuadro 2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrada en SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrada en SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más de las CDRs de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrada en el cuadro 2, o como se muestra en SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente.

CUADRO 2 Secuencia de aminoácidos (SEO. ID NO: 2) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 El péptido de señal, los primeros 19 aminoácidos, está subrayado. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 , CDR2 y CDR3), están en negritas y están subrayadas. 1 MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS. Péptido de señal 51 YAMSWVRQAP GKGLEWVSTI SGSGGSTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL CDR1 CDR2 101 QMNSLRAEDT AVYYCAKERY NWNYLHYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA CDR3 p empieza CH1 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP 251 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSQEDPE VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSLGK En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente puede hibridar bajo condiciones altamente severas, tales como las descritas anteriormente, con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena ligerada del anticuerpo comprende una secuencia de nucleótidos derivada de un gen VK 08/018 humano. Dicha molécula de ácido nucleico puede contener hasta 10, hasta 6 o hasta 3 cambios de aminoácido del gen VK 08/018 de la línea germinal. En modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico contiene por lo menos tres cambios de aminoácido en comparación con la secuencia VK de la línea germinal, que son idénticos a los cambios de la línea germinal presentes en el anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otras modalidades, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores comprende además una secuencia de nucleótidos derivada de un gen del segmento de unión a JK4 humano. En modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3, por lo menos de la CDR1 a la CDR3 como se muestra en el cuadro 3. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 20.13.3. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (SEQ ID NO: 4). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs mostrada en SEQ ID NOS: 14, 16 y 18.

CUADRO 3 Secuencia de aminoácidos (SEO. ID NO: 4) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 El péptido de señal, los primeros 22 aminoácidos, está subrayado. Nota: no se sabe si el péptido de señal comienza como "MDMRV..." o "MRV..." Las regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1 , CDR2 y CDR3), están en negritas y están subrayadas. DMRVPAQLL GLLLLWLSGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCQASQD CDR1 IINYLNWYQQ KPGKAPKLLI YSASNLETRV PSRFSGSGSG TDFTFTISSL CDR2 QPEDIATYYC QQYDNHPLTF GGGTKVEIRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG CDR3 p empieza CL1 TASWCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica para una VL puede hibridar bajo condiciones altamente severas, tales como las descritas anteriormente, con un ácido nucleico que codifica para una VL descrita anteriormente. Una molécula de ácido nucleico que codifique para la cadena ligera completa o la cadena pesada completa de un anticuerpo anti-IL-5, o las regiones variables de la misma, puede obtenerse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo anti-IL-5. En otra modalidad de la invención, la molécula de ácido nucleico puede obtenerse de un hibridoma que exprese un anticuerpo anti-IL-5. Métodos para aislar ARN mensajero que codifique para un anticuerpo, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. El ARN mensajero puede usarse para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes del anticuerpo. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico se deriva de un hibridoma que tiene como uno de sus miembros de fusión una célula animal transgénica que expresa genes de inmunoglobuiina humana. En una modalidad aún más preferida, la célula animal del miembro de fusión se deriva de un animal XenoMouse™. En otra modalidad, el hibridoma se deriva de un animal transgénico no humano y diferente del ratón, como se describió anteriormente. En una modalidad preferida, la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-5 puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifique para el dominio variable de una cadena pesada, con un dominio constante de una cadena pesada. En forma similar, la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-5 puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifique para el dominio variable de una cadena ligera, con un dominio constante de una cadena ligera. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y la molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de las cadenas ligeras codifica para la secuencia de aminoácidos del residuo 23-130 de SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos del residuo 139-465 de SEQ ID NO: 2 ilustra la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3, y la secuencia de aminoácidos del residuo 131-236 de SEQ ID NO: 4 ¡lustra la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera del anticuerpo 20.13.3. La secuencia de ácido nucleico del nucleótido 415-709, 1 102-1137, 1256-1585 y 1683-2002 de SEQ ID NO: 1 , ilustra la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región constante de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3, y la secuencia de ácido nucleico del nucleótido 391-708 de SEQ ID NO: 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región constante de la cadena ligera del anticuerpo 13.13.3. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio constante de la cadena pesada codifica para la secuencia de aminoácidos del residuo 139-465 de SEQ ID NO: 2, y la molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio constante de la cadena ligera codifica para la secuencia de aminoácidos del residuo 131-236 de SEQ ID NO: 4. En una modalidad aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio constante de la cadena pesada tiene la secuencia de ácido nucleico del nucleótido 415-709, 1102-1137, 1256-1585 y 1683-2002 de SEQ ID NO: 1 , y la molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio constante de la cadena ligera tiene la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico del nucleótido 391 -708 de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una célula misma que produce anticuerpos anti-IL-5 puede aislarse de un animal no humano. En una modalidad, la célula que produce anticuerpos puede derivarse de un animal transgénico que exprese genes de inmunoglobulina humana y haya sido inmunizado con un antígeno de IL-5. El animal transgénico puede ser un ratón, tal como un ratón XenoMouse , u otro animal transgénico no humano. En otra modalidad, la célula que produce anticuerpos anti-IL-5 se deriva de un animal no transgénico. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico puede usarse para producir vectores usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al. En una modalidad, los vectores pueden ser vectores de plásmido o cósmido. En otra modalidad, los vectores pueden ser vectores virales. Los vectores virales incluyen, sin limitación, adenovirus, retrovirus, virus adenoasociados y otros picornavirus, virus de hepatitis y baculovirus. Los vectores pueden ser también bacteriófagos incluyendo, sin limitación, 13. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar en forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-IL-5, como se describe más adelante. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse también para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, cuerpos completos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe más adelante. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la región variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL), son convertidas a genes de anticuerpo de longitud completa. En una modalidad, dichas moléculas de ácido nucleico son insertadas en vectores de expresión que comprenden ya secuencias que codifican para regiones constantes de cadena pesada o regiones constantes de cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH o VL es enlazado operativamente a los segmentos CH o CL, respectivamente, dentro del vector. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas VH y/o VL son convertidas en genes de anticuerpo de longitud completa, enlazando la molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena VH a una molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena CH, usando técnicas estándar de biología molecular. Lo mismo puede lograrse usando moléculas de ácido nucleico que codifiquen para las cadenas VL y CL. Se conocen en la técnica las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera y cadena pesada humana. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological lnterest, 5a. ed., Publ. de los NIH No. 91-3242, 1991.

Vectores Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpo de la invención, moléculas de ADN que codifican para cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parcial, obtenidas como se describió anteriormente, son insertadas en vectores de expresión, de modo que los genes son enlazados operativamente a secuencias de control de la transcripción y traducción. Vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo es ligado en un vector, de modo que las secuencias de control de la transcripción y traducción dentro del vector sirven su función deseada de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. Se seleccionan el vector de expresión y las secuencias de control de la expresión que sean compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado. En una modalidad preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el vector y fragmento del gen del anticuerpo, o ligación de extremos rasurados si no están presentes sitios de restricción). Un vector conveniente es uno que codifique para una secuencia de inmunoglobulina de CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción diseñados adecuados diseñados de modo que cualquier secuencia de VH o VL pueda ser fácilmente insertada y expresada, como se describió anteriormente. En dichos vectores, ocurre usualmente empalme entre el sitio donador de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones de CH humanos. Ocurre poliadenilación y término de la transcripción en sitios cromosómicos nativos hacia el extremo 3' de las regiones de codificación. El vector de expresión recombinante puede codificar también para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en un vector, de modo que el péptido de señal sea enlazado en el marco de lectura al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de ¡nmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína diferente de ¡nmunoglobulina). Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención poseen secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedera. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser trasformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Secuencias reguladoras preferidas para expresión en células hospederas de mamífero, incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (C V) (tales como el intensificador/promotor de CMV), virus 40 de simios (SV40) (tal como el intensificador/promotor de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), promotores de mamífero fuertes y de polioma, tales como los promotores de actina e ¡nmunoglobulina nativos. Para otra descripción de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,168,062 por Stinski, la patente de E.U.A. No. 4,510,245 por Bell et al., y la patente de E.U.A. No. 4,968,615 por Schaffner et al. Además de los genes de la cadena del anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden poseer secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las cuales el vector ha sido introducido (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospederas dhfr" con amplificación/selección de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Células hospederas no de hibridoma, v métodos para producir proteínas en forma recombinante Pueden usarse moléculas de ácido nucleico que codifiquen para anticuerpos anti-IL-5, y vectores que comprendan estos anticuerpos, para transformación de una célula hospedera adecuada de mamífero. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera. Métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica, e incluyen transfección mediada por dextrán, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico en células de mamífero mediante el uso de vectores virales. Métodos para transformar células son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. No. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica, e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de The American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HeLa, células de riñon de cría de hámster (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, y muchas otras líneas de células. Se seleccionan líneas de células de preferencia particular, determinando qué líneas de células tienen altos niveles de expresión. Otras líneas de células que pueden usarse, son líneas de células de insecto, tales como células Sf9. Cuando vectores de expresión recombinantes que codifican para genes del anticuerpo se introducen en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un período suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, más preferiblemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células hospederas están creciendo. Pueden recuperarse anticuerpos del medio de cultivo, usando métodos estándar de purificación de proteínas. Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) de líneas de células de producción, puede intensificarse usando muchas técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de glutamina sintetasa (el sistema GS), es un procedimiento común para intensificar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se describe totalmente o en parte con relación a las patentes europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997, y la solicitud de patente europea No. 89303964.4.

Animales transqénicos Pueden producirse también transgénicamente anticuerpos de la invención a través de la generación de un mamífero o planta que sea transgénico para las secuencias de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de interés, y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de los mismos. Con relación a la producción transgénica en mamíferos, pueden producirse anticuerpos en, y recuperarse de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741 ,957. En una modalidad, animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana, son inmunizados con IL-5 o una poción de la misma. Es posible producir dichos animales transgénicos, usando métodos descritos en las patentes de E.U.A. 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,114,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741 , publicado en julio 25 de 1991 , WO 94/02602, publicado en febrero 3 de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados en octubre 31 de 1996, WO 98/16654, publicado en abril 23 de 1998, WO 98/24893, publicado en junio 11 de 1998, WO 98/50433, publicado en noviembre 12 de 1998, WO 99/45031 , publicado en septiembre 10 de 1999, WO 99/53049, publicado en octubre 21 de 1999, WO 00 09560, publicado en febrero 24 de 2000, y WO 00/037504, publicado en junio 29 de 2000. En otra modalidad, los animales transgénicos pueden comprender un "minilocus" de genes de inmunoglobulina humana. Los métodos descritos anteriormente pueden modificarse como se describe, entre otras patentes, en la patente de E.U.A. 5,994,619. En una modalidad preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra modalidad, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos anti-IL-5. En una modalidad preferida, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para cadenas pesadas y ligeras especificas de IL-5. En otra modalidad, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-IL-5 pueden obtenerse en cualquier animal transgénico. En una modalidad preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos.

Colecciones de presentación visual de fagos Los anticuerpos humanos anti-IL-5 recombinantes de la invención, además de los anticuerpos anti-IL-5 descritos en la presente, pueden aislarse por selección de una colección de anticuerpos combinatoria recombinante, de preferencia una colección de presentación visual de fagos de scFv, preparada usando moléculas de ADNc de VL y VH humanas preparadas a partir de ARN mensajero derivado de linfocitos humanos. Metodologías para preparar y seleccionar dichas colecciones, se conocen en la técnica. Existen equipos disponibles comercialmente para generar colecciones de presentación visual de fagos (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-041 ; y el equipo de presentación visual de fagos SurfZAP™ de Stratagene, número de catálogo 240612). Existen también otros métodos y reactivos que pueden usarse para generar y seleccionar colecciones de presentación visual de anticuerpos (véase, por ejemplo, Ladner et al., patente de E.U.A. No. 5,223,409; Kang et al., publicación del PCT No. WO 92/18619; Dower et al., publicación del PCT No. WO 91/17271 ; Winter et al., publicación del PCT No. WO 92/20791 ; Markland et al., publicación del PCT No. WO 92/15679; Breitling et al., publicación del PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al., publicación del PCT No. WO 92/01047; Garrard et al., publicación del PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991 ) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281 ; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991 ) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991 ) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991 ) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (199 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982. En una modalidad preferida, para aislar anticuerpos anti-IL-5 humanos con las características deseadas, un anticuerpo anti-IL-5 humano como se describe en la presente, se usa primero para seleccionar secuencias de cadena ligera y cadena pesada humanas que tengan actividad de unión similar hacia IL-5, usando los métodos de imprimación de epítopes descritos en Hoogenboom et al., publicación del PCT No. WO 93/06213. Las colecciones de anticuerpos usadas en este método, son de preferencia colecciones de scFv preparadas y seleccionadas como se describe en McCafferty et al., publicación del PCT No. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; y Griffiths et al. (1993), EMBO J 12: 725-734. Las colecciones de anticuerpos de scFv se seleccionan de preferencia usando IL-5 humana como el antígeno. Una vez que se seleccionan segmentos VL y VH humanos iniciales, se realizan experimentos de "mezcla y acoplamiento", en los cuales diferentes pares de los segmentos VL y VH seleccionados inicialmente se seleccionan para unión a IL-5, para seleccionar combinaciones de pares de VL VH preferidas. Además, para mejorar la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH de los pares de VL/VH preferidos pueden ser mutados aleatoriamente, de preferencia dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un procedimiento análogo al procedimiento de mutación somática in vivo responsable de la maduración de los anticuerpos por afinidad, durante una respuesta inmune natural. Esta maduración por afinidad in vitro puede lograrse amplificando regiones VH y VL usando iniciadores de PCR complementarios a la CDR3 de la VH o la CDR3 de la VL, respectivamente, cuyos iniciadores hayan sido "inutilizados" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones, de modo que los productos de PCR resultantes codifiquen para segmentos VH y VL en los cuales se hayan introducido mutaciones aleatorias en la regiones CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos VH y VL mutados aleatoriamente pueden volverse a seleccionar para unión a IL-5. Después de la selección y el aislamiento de un anticuerpo anti-IL-5 de la invención de una colección de presentación visual de inmunoglobulina recombinante, puede recuperarse ácido nucleico que codifique para el anticuerpo seleccionado del paquete de presentación visual (por ejemplo, del genoma del fago), y puede subclonarse en otros vectores de expresión mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe más adelante. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por selección de una colección combinatoria, el ADN que codifica para el anticuerpo es clonado en un vector de expresión recombinante e introducido en células hospederas de mamífero, como se describió anteriormente.

Cambio de clase Otro aspecto de la presente invención, es proveer un mecanismo por el cual la clase de un anticuerpo anti-IL-5 pueda ser cambiada con otra. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifique para VL o VH se aisla usando métodos bien conocidos en la técnica, de modo que no incluya secuencia de ácido nucleico alguna que codifique para CL o CH. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para VL o VH son entonces enlazadas operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifique para una CL o CH de una clase diferente de molécula de ¡nmunoglobulina. Esto puede lograrse usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprenda una cadena CL o CH como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-5 que fue originalmente IgM, puede ser cambiado de clase a una IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de lgG1 a lgG2.

Derivados de anticuerpo Pueden usarse las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente para generar derivados de anticuerpo, usando técnicas y métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Anticuerpos mutados En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospederas, pueden usarse para obtener anticuerpos anti-IL-5 mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, para alterar la propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede producirse una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo para IL-5, para aumentar o disminuir la Kde disociación, o para alterar el carácter específico de unión del anticuerpo. Técnicas en mutagénesis dirigida a sitio, son bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., citados anteriormente. En una modalidad preferida, se producen mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe será cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-IL-5. En una modalidad más preferida, se producen una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe será cambiado en comparación con la linea germinal en una región variable de uno de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico son mutadas en una o más de las regiones de estructura. Puede producirse una mutación en una región de estructura o dominio constante para aumentar la vida media del anticuerpo anti-IL-5. Véase, por ejemplo, la solicitud de los Estados Unidos No. 09/375,924, presentada en agosto 17 de 1999, incorporada en la presente como referencia. Puede producirse también una mutación en una región de estructura o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proveer un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como fijación del complemento. Pueden producirse mutaciones en cada una de las regiones de estructura, el dominio constante y las regiones variables en un anticuerpo mutado individual. En forma alternativa, pueden producirse mutaciones en sólo una de las regiones de estructura, las regiones variables o el dominio constante en un anticuerpo mutado individual. En una modalidad, no existen más de diez cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IL-5 mutado, en comparación con el anticuerpo anti-IL-5 antes de la mutación. En una modalidad más preferida, no existen más de cinco cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IL-5 mutado, más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácido. En otra modalidad, no existen más de quince cambios de aminoácido en los dominios constantes, más preferiblemente, no más de diez cambios de aminoácido, aún más preferiblemente, no más de cinco cambios de aminoácido.

Anticuerpos de fusión e inmunoadhesinas En otra modalidad, puede producirse un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprenda un anticuerpo anti-IL-5 completo, o una porción del mismo, enlazado a otro polipéptido. En una modalidad preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo anti-IL-5 son enlazadas al polipéptido. En otra modalidad preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-IL-5 es enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-IL-5 es enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido, en una forma en la cual los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión al anticuerpo. En otra modalidad preferida, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador, de modo que los dominios VH y VL pueden interactuar con algún otro (véase más adelante bajo la sección de anticuerpos de cadena sencilla). El anticuerpo de VH-enlazador-VL, es enlazado entonces al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión se usa para dirigir un polipéptido hacia una célula o tejido que expresa IL-5. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que puede ser visualizada fácilmente, tal como peroxidasa de rábano picante. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla son enlazados a algún otro. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena polipeptídica individual, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico. En una modalidad, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara usando las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara usando una o más regiones CDR de un anticuerpo anti-IL-5, tal como del anticuerpo monoclonal 20.13.3.

Anticuerpos de cadena sencilla Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL son enlazados operativamente a otro fragmento que codifique para un enlazador flexible, por ejemplo, que codifique para la secuencia de aminoácidos Gly4-Ser3, de modo que las secuencias de VH y VL puedan ser expresadas como una proteína contigua de cadena sencilla, en donde las regiones VL y VH son unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si sólo se usa una VH y VL individual, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. En una modalidad, el anticuerpo de cadena sencilla se prepara usando una o más de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo de cadena sencilla se prepara usando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

Cuerpos kappa, minicuerpos, cuerpos completos v Janusins En otra modalidad, pueden prepararse anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifiquen para anti-IL-5. Por 7 ejemplo, pueden prepararse "cuerpos kappa" (III et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "minicuerpos" (Martin et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "cuerpos completos" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) o "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991 ), y Traunecker et al. "Janusín: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cáncer Supl. 7: 51-52 (1992)) usando técnicas estándar de biología molecular, siguiendo las enseñanzas de la especificación. En una modalidad, los anticuerpos modificados se preparan usando una o más de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo modificado se prepara usando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

Anticuerpos quiméricos En otro aspecto, pueden generarse anticuerpos biespecíficos. En una modalidad, puede generarse un anticuerpo quimérico que se une específicamente a IL-5 a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo quimérico puede producirse mediante técnicas de biología molecular recombinante, o puede conjugarse físicamente. Además, puede generarse un anticuerpo de cadena sencilla que contenga más de una VH y VL que se une específicamente a IL-5 y a otra molécula. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que son bien conocidas; véase, por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, citado anteriormente, y con relación a (iii) véase, por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (supl.) 7: 51-52 (1992). En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico se une a IL-5 y a otra molécula que interviene en promover la proliferación de eosinófilos y basófilos. En modalidades preferidas, la otra molécula es eotaxina, IL-3 o GM-CSF. En una modalidad, los anticuerpos quiméricos se preparan usando una o más de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo quimérico se prepara usando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

Anticuerpos derivatízados y marcados Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser derivatizado o enlazado a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o porción de los mismos son derivatizados, de modo que la unión a IL-5 no es afectada adversamente por la derivatización o marcación. Por consiguiente, se pretende que los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención incluyan formas intactas y modificadas de los anticuerpos anti-IL-5 humanos descritos en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser enlazado funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, etc.) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un cuerpo completo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región del núcleo de estreptavidina o una marca de polihistidina). Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce entrelazando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Entrelazadores adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, teniendo dos grupos distintamente reactivos separados por un separador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), u homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III. Otro tipo de anticuerpo derivatizado, es un anticuerpo marcado. Agentes de detección útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser derivatizado, incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-1-naftalensulfonilo, ficoeritrina, fosfores de lantánidos, y similares. También es posible marcar un anticuerpo con enzimas que son útiles para detección, tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, y similares. Cuando un anticuerpo es marcado con una enzima detectable, se detecta añadiendo otros reactivos que las enzimas usan para producir un producto de reacción que puede ser discernido. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable. Un anticuerpo puede marcarse también con biotina, y detectarse a través de medición indirecta de unión a avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede marcarse también con un epítope polipeptídico predeterminado reconocido por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de la cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítope). En algunas modalidades, las marcas son unidas por brazos separadores de varias longitudes para reducir la obstrucción estérica potencial. Un anticuerpo anti-IL-5 puede marcarse también con un aminoácido marcado radiactivamente. La marca radiactiva puede usarse para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. El anticuerpo anti-IL-5 marcado radiactivamente puede usarse para diagnóstico, por ejemplo, para determinar los niveles de IL-5 en un sujeto. Además, el anticuerpo anti-IL-5 marcado radiactivamente puede usarse terapéuticamente para tratar, por ejemplo, enfermedades alérgicas caracterizadas por infiltración pronunciada de eosinófilos tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 14C, 5N, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 125l y 131l. Un anticuerpo anti-IL-5 puede derivatizarse también con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la vida media en suero, o para aumentar la unión al tejido.

Caracterización de los anticuerpos anti-IL-5 Clase y subclase de los anticuerpos anti-IL-5 La clase y subclase de los anticuerpos anti-IL-5 puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo puede determinarse usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase puede determinarse mediante ELISA, Western Blot, así como otras técnicas. En forma alternativa, la clase y subclase puede determinarse secuenciando todos los dominios constantes, o una porción de los mismos, de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una modalidad preferida, el anticuerpo es una IgG, y es un subtipo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. En una modalidad más preferida, los anticuerpos anti-IL-5 son de la subclase lgG2. En otra modalidad preferida, los anticuerpos anti-IL-5 son de la misma clase y subclase que el anticuerpo monoclonal 20.13.3.

Afinidad de unión de anti-IL-5 a IL-5 En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-IL-5 se unen a IL-5 con alta afinidad. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-5 se une a IL-5 con una Kd de 1 x 10'8 M o menos. En una modalidad más preferida, el anticuerpo se une a IL-5 con una Kd de 1 x 10"9 M o menos. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo se une a IL-5 con una Kd de 0.5 x 10'9 M o menos (por ejemplo, una Kd de 0.25 x 10"9 M o menos). En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une a IL-5 con sustancialmente la misma Kd que el anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une a IL-5 con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una o más CDRs del anticuerpo monoclonal 20.13.3. La afinidad de unión y velocidad de disociación de un anticuerpo anti-IL-5 a IL-5 puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, la afinidad de unión puede medirse mediante tecnología competitiva de ELISAs, RIAs, BIAcore o KinExA. La velocidad de disociación puede medirse también mediante tecnología BIAcore o KinExA. En una modalidad, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden mediante resonancia de plasmones de superficie usando, por ejemplo, un BIAcore.

Identificación de epítopes de IL-5 reconocidos por el anticuerpo anti-IL-5 La invención provee también un anticuerpo anti-IL-5 que se une al mismo antígeno o epítope que un anticuerpo anti-IL-5 humano. Además, la invención provee un anticuerpo anti-IL-5 que compite en forma cruzada con un anticuerpo anti-IL-5 humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 humano es el anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 humano comprende una o más CDRs del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es otro anticuerpo humano. Puede determinarse si un anticuerpo anti-IL-5 se une al mismo antígeno, usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse si un anticuerpo anti-IL-5 de prueba se une al mismo antígeno, usando un anticuerpo anti-IL-5 para capturar un antígeno que se sabe se une al anticuerpo anti-IL-5, tal como IL-5, eluyendo el antígeno del anticuerpo, y determinando entonces si el anticuerpo de prueba se une al antígeno eluido. Puede determinarse si un anticuerpo se une al mismo epítope que un anticuerpo anti-IL-5, uniendo el anticuerpo anti-IL-5 a IL-5 bajo condiciones de saturación, y determinando entonces la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a la IL-5. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a la IL-5 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-IL-5, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítope diferente que el anticuerpo anti-IL-5. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la IL-5 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba se une al mismo epítope que el anticuerpo anti-IL-5 humano. Este experimento puede llevarse a cabo usando ELISA, RIA o resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad preferida, el experimento se lleva a cabo usando resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad más preferida, se usa BIAcore. Puede determinarse también si un anticuerpo anti-IL-5 compite en forma cruzada con un anticuerpo anti-IL-5. En una modalidad preferida, puede determinarse si un anticuerpo anti-IL-5 compite en forma cruzada con otro, usando el mismo método que se usa para medir si el anticuerpo anti-IL-5 es capaz de unirse al mismo epítope que otro anticuerpo anti-IL-5.

Uso de la cadena ligera y pesada La presente invención provee también un anticuerpo anti-IL-5 que comprende secuencias variables de la cadena ligera codificadas por un gen VK humano y un gen JK humano. En el anticuerpo monoclonal 20.13.3, las cadenas ligeras ? usan un gen VK 08/018 humano unido a un gen JK4 humano. En modalidades preferidas, la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención contiene las mismas sustituciones de aminoácido, respecto a la secuencia de aminoácidos del gen 08/018 de la línea germinal, como el anticuerpo monoclonal 20.13.3. Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-5 puede contener una o más de las sustituciones de aminoácido respecto a la secuencia de la línea germinal 08/018 que están presentes en el anticuerpo monoclonal 20.13.3. De esta manera, es posible mezclar y acoplar diferentes características de unión al anticuerpo para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por IL-5 o su velocidad de disociación del antígeno. En otra modalidad, la región variable de la cadena ligera contiene sustituciones de aminoácido en las mismas posiciones que en el anticuerpo monoclonal 20.13.3, pero usa diferentes aminoácidos en esas posiciones. De preferencia, la sustitución es conservativa respecto al aminoácido presente en esa posición en el anticuerpo monoclonal 20.13.3. Por ejemplo, si está presente glutamato en el anticuerpo monoclonal 20.13.3 en una posición particular y el glutamato representa una sustitución en comparación con la línea germinal, de conformidad con la presente invención, puede sustituirse conservativamente el aspartato en esa posición. En forma similar, si la sustitución de aminoácido es serina, puede reemplazarse la serina con treonina. En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de la VL del Mab 20.13.3. En otra modalidad altamente preferida, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos que son iguales que las regiones CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (como se muestra en el cuadro 3 y en SEQ ID NOS: 14, 16 y 18, respectivamente). En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos una región CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo comprende una cadena ligera lambda. La presente invención provee también un anticuerpo anti-IL-5, o porción del mismo, que comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una cadena pesada humana. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada se deriva de una familia de genes VH DP-47 humana. En una modalidad más preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de aminoácido de la VH DP-47 de la línea germinal, más preferiblemente no más de seis cambios de aminoácido, y aún más preferiblemente, no más de tres cambios de aminoácido. En una modalidad preferida, la VH del anticuerpo anti-IL-5 contiene las mismas sustituciones de aminoácido, respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, como el Mab 20.13.3. En otra modalidad, las sustituciones de aminoácido se hacen en la misma posición que la que se encuentra en la VH del Mab 20.13.3, pero se hacen sustituciones conservativas de aminoácidos, más que usando el mismo aminoácido. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de la VH del Mab 20.13.3. En otra modalidad altamente preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son iguales a las regiones CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostradas en el cuadro 2. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos una región CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10 y 12. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 8, 10 y 12.

Inhibición de la actividad del receptor de IL-5 por el anticuerpo anti-IL-5 Inhibición de la unión de IL-5 al receptor de IL-5 En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo anti-IL-5 que inhibe la unión de IL-5 al receptor de IL-5. En una modalidad preferida, el receptor de IL-5 es humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es un anticuerpo humano. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo inhibe la unión entre IL-5 y el receptor de IL-5 con una IC50 no mayor de 50 nM. En una modalidad preferida, la IC50 es no mayor de 10 nM. En una modalidad más preferida, la IC5o es no mayor de 2.0 nM, 0.5 nM, 0.25 nM, 0.1 nM o 0.05 nM. La IC50 puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, una IC50 puede medirse mediante ELISA, RIA o antagonismo funcional. En una modalidad preferida, la IC50 se mide mediante antagonismo funcional.

Inhibición de la proliferación celular mediada por IL-5 por el anticuerpo anti-IL-5 (in vitro) En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo anti-IL-5 que inhibe la proliferación mediada por IL-5 de una línea de células sensible a IL-5. En una modalidad preferida, la línea de células es humana. En una modalidad aún más preferida, la línea de células es una línea de células de eosinofilos humanos, o una línea de células de eritroleucemia humana, por ejemplo, TF-1. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En una modalidad más preferida, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 20. 3.3, o fragmentos funcionales del mismo. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-IL-5 o porción funcional del mismo, inhibe la proliferación de una línea de células sensible a IL-5 con un valor de IC50 no mayor de 10 nM. En modalidades preferidas, la iC50 es no mayor de 1 nM. En otras modalidades preferidas, la IC50 es no mayor de 250 pM. En otras modalidades preferidas, la IC50 es no mayor de 100 pM. En otras modalidades preferidas, la IC50 es no mayor de 50 pM.

Inhibición de la acumulación de eosinófilos in vivo En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-5 inhibe la acumulación de eosinófilos in vivo. En una modalidad preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos, comparando la acumulación de eosinófilos en un animal no tratado. En una modalidad más preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos en 50%. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos en 75%. En ciertas modalidades, la terapia con anticuerpos anti-IL-5 se lleva a cabo en conjunto con terapia con uno o más de otros agentes terapéuticos. En una modalidad preferida, el agente adicional promueve la inhibición adicional de la producción, maduración, migración en la sangre, activación, acumulación o infiltración de eosinófilos, en tejidos en un mamífero. En ciertas modalidades, la terapia adicional comprende la administración de uno o más de los agentes seleccionados del grupo que consiste de corticosteroides, agonistas ß2, inhibidores de 5-LO, antagonistas del receptor de LTD4 y antihistamínicos. Ejemplos de corticosteroides para dicha terapia incluyen, pero no están limitados a, betametasona, prednisolona e hidrocortisona. Los uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse por separado o simultáneamente con un anticuerpo anti-IL-5 de la invención. En una modalidad preferida, la coadministración del agente y el anticuerpo anti-IL-5 inhibe la acumulación de eosinófilos en cuando menos 50%, más preferiblemente 75%, muy preferiblemente 90% después de un período de 22 a 24 días.

Composiciones y equipos farmacéuticos La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos, en particular trastornos alérgicos, caracterizados por producción, maduración, migración en la sangre, activación o infiltración de eosinófilos, mediadas por IL-5 en tejidos en un mamífero. En una modalidad, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de enfermedades eosinofílicas tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica. Los anticuerpos anti-IL-5 de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio, en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes mojantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales agentes mojantes o emulsionantes, conservadores o reguladores de pH, intensifican la vida de almacenamiento o eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo. Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo/ formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e instilables), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica deseados. Composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o instilables, tales como composiciones similares a las que se usan para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. La forma de administración preferida es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección o infusión intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Típicamente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura indicada adecuada para alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles que incorporen el anticuerpo anti-IL-5 en la cantidad requerida en un solvente adecuado, con un ingrediente o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, si se requiere, seguida de esterilización con filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos, de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos, son desecación en vacío y deshidratación por congelación que den un polvo del ingrediente activo más algún otro ingrediente deseado de una solución filtrada del mismo previamente estéril. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. Puede producirse la absorción prolongada de composiciones inyectables, incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/forma de administración preferida es subcutánea, intramuscular, intravenosa o por infusión. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, la vía y/o la forma de administración variará, dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que proteja al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato etilenvinílico, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados, o son conocidos en general por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-IL-5 o fragmentos de unión a antígeno de la invención pueden administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) puede incluirse también en una cápsula de gelatina de coraza dura o blanda, puede comprimirse en tabletas, o puede incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes, y pueden usarse en forma de tabletas tragables, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención más que mediante administración parenteral, 5 puede ser necesario recubrir el compuesto con un material que prevenga su inactivación, o coadministrar el compuesto con el mismo. Pueden incorporarse también compuestos activos complementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-IL-5 de la invención es coformulado con uno o más de otros 10 agentes terapéuticos, y/o coadministrado con los mismos. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen uno o más factores de crecimiento o citocinas o sus receptores de superficie celular), agentes que reducen la producción o actividad de IL-5, tales como proteínas de unión a IL-5, oligonucleótidos l 15 antisentido contra IL-5 o receptor de IL-5, análogos de péptidos que bloquean la activación del receptor de IL-5, receptor de IL-5 soluble, glucocorticoides y ciclosporina, y agentes que inhiben la producción, maduración, supervivencia, activación o migración de eosinófilos desde la médula ósea, tales como corticosteroides. Dichas terapias de combinación pueden requerir 20 dosificaciones menores del anticuerpo anti-IL-5 y/o los agentes coadministrados, evitando de esta manera toxicidades o complicaciones posibles asociadas con las varias monoterapias. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva", de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante períodos necesarios, para lograr el resultado 5 terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar, de acuerdo a factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva, es también una en la 10 cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo sea excedido por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva", se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante períodos necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se usa en ' \ 15 sujetos antes de la enfermedad, o en una etapa prematura de la misma, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proveer la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o 20 profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente, según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación, para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. El término forma de unidad de dosificación como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención es determinada por, y depende directamente de, (a) las características únicas del anticuerpo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se logrará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinación de dicho anticuerpo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Un ejemplo de escala no limitativa para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención, es 0.1-100 mg/kg, más preferiblemente 0.1-50 mg/kg, muy preferiblemente 0.1 -20 mg/kg, y aún más preferiblemente 1-10 mg/kg (por ejemplo, a 0.3, 1 ó 3 mg/kg). Se observará que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la severidad de la condición que se va a aliviar. Se entenderá además que para cualquier sujeto particular, deben ajustarse regímenes de dosificación específicos con el tiempo de acuerdo a la necesidad del individuo, y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosificación descritas en la presente son sólo un ejemplo, y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reclamada. Otro aspecto de la presente invención, provee equipos que comprenden los anticuerpos anti-IL-5 o fragmentos de unión a antigeno, y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un equipo puede incluir, además del anticuerpo o composición farmacéutica, agentes terapéuticos o de diagnóstico. Un equipo puede incluir también instrucciones para el uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una modalidad preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo, y un agente de diagnóstico que puede usarse en un método descrito más adelante. En otra modalidad preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo, y uno o más agentes terapéuticos que pueden usarse en un método descrito más adelante.

Métodos de uso de diagnóstico Los anticuerpos anti-IL-5 de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse para detectar IL-5 en una muestra biológica. Los anticuerpos anti-IL-5 pueden usarse en un inmunoensayo convencional incluyendo, sin limitación, ELISA, RIA, FACS, ¡nmunohistoquímica de tejidos, Western blot o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-IL-5 de la invención pueden usarse para detectar IL-5 de humanos. En otra modalidad, los anticuerpos anti-IL-5 pueden usarse para detectar IL-5 de primates del viejo mundo, tales como Cynomologus y monos rhesus, chimpancés y simios. La invención provee un método para detectar IL- 5 en una muestra biológica, el cual comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-5 de la invención, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, y detectar el anticuerpo unido a IL-5, para detectar la IL-5 en la muestra biológica. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-5 es marcado directamente con una marca detectable. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-5 (el primer anticuerpo) es no marcado, y un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unir el anticuerpo anti-IL-5, es marcado. Como es bien sabido por los expertos en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unir específicamente la clase y especie específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si él anticuerpo anti-IL-5 es una IgG humana, entonces el segundo anticuerpo puede ser una IgG anti-humano. Otras moléculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, sin limitación, proteína A y proteína G, las cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Pierce Chemical Co. Se han descrito anteriormente marcas adecuadas para el anticuerpo o anticuerpo secundario, e incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatase alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125l, 131l, 35S o 3H. En una modalidad alternativa, puede ponerse a prueba la IL-5 en una muestra biológica mediante un ¡nmunoensayo de competencia usando estándares de IL-5 marcados con una sustancia detectable, y un anticuerpo anti-IL-5 no marcado. En esta prueba, se combinan la muestra biológica, los estándares de IL-5 marcados y el anticuerpo anti-IL-5, y se determina la cantidad de estándar de IL-5 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de IL-5 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de estándar de IL-5 marcado unido al anticuerpo anti-IL-5. Pueden usarse los inmunoensayos descritos anteriormente, para muchos propósitos. En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-5 o fragmentos de los mismos pueden usarse para detectar IL-5 en una muestra, en particular una muestra biológica.

Métodos de uso terapéuticos En otra modalidad, la invención provee un método para inhibir la actividad de IL-5, administrando un anticuerpo anti-IL-5 de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a un paciente que necesita del mismo. Cualquiera de los tipos de anticuerpos descritos en la presente puede usarse terapéuticamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es un anticuerpo humano. En otra modalidad preferida, la IL-5 es humana, y el paciente es un paciente humano. En forma alternativa, el anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse a un mamífero no humano que exprese una IL-5 con la cual el anticuerpo reacciona en forma cruzada (es decir, un primate, Cynomologus o mono rhesus) para propósitos veterinarios, o como un modelo animal de enfermedad humana. Dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención. Como se usa en la presente, se pretende que el término "un trastorno en el cual la actividad de IL-5 es perjudicial", incluya enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-5 en un sujeto que sufre del trastorno se ha mostrado es responsable o se sospecha es responsable de la fisiopatología del trastorno, o un factor que favorezca un empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de IL-5 es perjudicial, es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad de IL-5 alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Dichos trastornos mediados por IL-5 incluyen, pero no están limitados a, trastornos alérgicos, en particular trastornos alérgicos de la piel y tejidos pulmonares e inflamación pulmonar. Dichos trastornos pueden ponerse en evidencia, por ejemplo, por un número incrementado de eosinófilos y/o basófilos en la médula ósea, sangre u otros tejidos, o en el fluido de lavado broncoalveolar (BAL). En particular, dichos trastornos pueden caracterizarse por eosinofilía pulmonar o cutánea, hipersensibilidad bronquial, acumulación de eosinófilos en el tejido pulmonar, regiones perivasculares y/o peribronquiales, daño al epitelio de las vías aéreas, edema intersticial de las vías aéreas, secreción incrementada de moco en los bronquios, o broncoconstricción. En forma alternativa, la actividad patológica de la IL-5 puede ponerse en evidencia por una o más de eosinopoyesis incrementada en la médula ósea, supervivencia incrementada de eosinófilos, adhesión incrementada de eosinófilos a las células endoteliales, y actividad citotóxica intensificada de los eosinófilos. En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-IL-5 de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede administrarse a un paciente que sufre de inflamación, incluyendo enfermedad alérgica caracterizada por infiltración pronunciada de eosinófilos, tales como rinitis nasal, pólipos nasales, asma, síndromes eosinofílicos idiopáticos y dermatitis atópica. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo anti-IL-5 se administra a un paciente que sufre de una inflamación pulmonar crónica. En una modalidad altamente preferida, el método hace que la inflamación sea menos severa o que desaparezca. En otra modalidad preferida, un anticuerpo anti-IL-5 puede administrarse a un paciente que tenga niveles incrementados de eosinófilos en médula ósea, sangre u otros tejidos corporales. Se sabe en la técnica que la presencia incrementada de eosinófilos se asocia con enfermedades tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-5 de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se administra a un paciente con asma. En una modalidad aún más preferida, el método previene o reduce la severidad de la enfermedad. El anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse de alrededor de tres veces al día, a aproximadamente una vez cada seis meses, y de preferencia puede administrarse mediante una vía oral, por mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo puede administrarse también continuamente mediante una minibomba. El anticuerpo se administrará en general en tanto la condición de enfermedad esté presente, siempre que el anticuerpo haga que la condición detenga su empeoramiento o mejore. El anticuerpo se administrará en general como parte de una composición farmacéutica como se describió anteriormente. El anticuerpo puede administrarse también profilácticamente para prevenir que ocurra inflamación alérgica y/o infiltración de eosinófilos. Esto puede ser especialmente útil en pacientes en los que se ha mostrado tienen un riesgo mayor de desarrollar una condición mediada por eosinófilos o mediada por IL-5.

Terapia qénica Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesita de las mismas, mediante terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico que codifican para una cadena pesada y una cadena ligera, se administran a un paciente. En una modalidad más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran, de modo que sean integradas establemente en el cromosoma de las células B, debido a que estas células están especializadas para producir anticuerpos. En una modalidad preferida, células B precursoras son transfectadas o infectadas ex vivo, y retransplantadas en un paciente que necesita de las mismas. En otra modalidad, células B precursoras u otras células son infectadas in vivo usando un virus que se sabe infecta al tipo de célula de interés. Vectores típicos usados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos o vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Después de la infección in vivo o ex vivo, pueden monitorearse los niveles de expresión del anticuerpo tomando una muestra del paciente tratado, y usando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica y descrito en la presente. En una modalidad preferida, el método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena pesada, o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano, y que exprese la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano, y que exprese la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, el método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano, y una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano, y que exprese las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia génica puede comprender también el paso de administrar otro agente que tenga efectos terapéuticos similares a los del anticuerpo o fragmento funcional del mismo, tales como los enumerados anteriormente. Para que esta invención pueda entenderse mejor, se dan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son sólo para propósitos de ilustración, y de ninguna manera se pretende que sean limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Generación de hibridomas que producen anticuerpos anti-IL-5 Los anticuerpos de la invención se prepararon, se seleccionaron y se pusieron a prueba, de la manera siguiente: Inmunización y generación de hibridomas Se inmunizó un total de 288 XenoMice™ de lgG2 o lgG4 divididos en grupos de 15 a 20 ratones y de 8 a 15 semanas, de acuerdo al esquema mostrado en el cuadro 4 siguiente: CUADRO 4 Programas de inmunización Para inmunizaciones en la base de la cola (bot), se emulsionó IL-5 humana en adyuvante completo de Freund (CFA) para la primera inmunización, y en adyuvante incompleto de Freund (IFA) para inmunizaciones subsecuentes, a las dosis y los tiempos indicados anteriormente (para la información de secuencias de IL-5, véase la solicitud de patente europea número de publicación EP0267779). Para inmunización en el cojinete de la pata (FP), el antígeno fue emulsionado en adyuvante de Ribi. Algunos animales (grupo 7) recibieron antígeno a través de la base de la cola e intraperitonealmente (ip) en CFA o Ribi. El grupo 8 recibió antígeno en forma de conjugado, en el cual la IL-5 humana fue conjugada químicamente con un anticuerpo anti-CD3 de ratón. Se fusionaron células de bazo y/o de nodulos linfáticos de ratones inmunizados con la línea de células no secretorias P3-X63-Ag8.653 de mieloma (ATCC, Rockville, MD), o la línea de células de mieloma NSO-bcl2 (B. Diamond, Albert Einstein College of Medicine, NY), como se describió anteriormente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981 ). Se examinaron regularmente los cultivos para crecimiento de células híbridas, y se recogieron los sobrenadantes de esas cavidades que contenían hibridomas para una selección de ELISA primaría para la presencia de IgG/kappa humana específica de IL-5.

Prueba de unión a IL-5 Se recubrieron placas de ELISA con 50 µ?/cavidad de antígeno de IL-5 a 2 µg/ml en regulador de pH de recubrimiento (regulador de pH de carbonato a 0.1 M, pH 9.6, y 8.4 g/l de NaHC03 (PM 84)), y se incubaron a 4°C durante la noche, o a 37°C durante 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con regulador de pH de lavado (Tween a 0.05% en PBS), se bloquearon con 200 µ?/cavidad de regulador de pH de bloqueo (BSA a 0.5%, Tween 20 a 0.1%, timerosal a 0.01 % en 1 x de PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron tres veces más con regulador de pH de lavado. Se añadieron 50 µ?/cavidad de la muestra (o los controles) a las cavidades, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de tres lavados con regulador de pH de lavado, se añadieron 100 µ?/cavidad de anticuerpo de detección de cabra anti-hulgGfc-HRP (Caltag, número de catálogo H10507) (y GT anti-hkappa-HRP en selección secundaria) a cada cavidad, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, y se añadieron a cada cavidad 100 µ? de solución de desarrollo (10 mi de regulador de pH de substrato, 7.14 g/l de ácido cítrico y 16.96 g/l de fosfato de sodio dibásico), 0 mg de o-fenilendiamina (Sigma, número de catálogo P-7288) y 10 µ? de H202 a 30%). Después de aproximadamente 10 minutos, se añadió a cada cavidad solución de detención (H2SO4 a 2 M), y las placas se analizaron usando un lector de placa de ELISA a una longitud de onda de 492 nm. Los cultivos positivos se transfirieron a placas de 48 cavidades, y se transfirieron subsecuentemente a placas de 24 cavidades después de alcanzar la confluencia. Se obtuvo un total de 116 hibridomas que producen anticuerpos reactivos con IL-5, de los cuales 7 eran lgG2 y 109 eran lgG4. Se piensa que la frecuencia desproporcionada de anticuerpos lgG4 se relaciona con un efecto de IL-5 sobre el cambio de clase. De los 116 hibridomas que producen anticuerpos específicos de IL-5, se seleccionó un hibridoma lgG4/kappa designado como 20.13.3 para caracterización adicional con base en su fuerte actividad de neutralización comparable a la del anticuerpo control IgG de ratón (39D10 de Schering-Plough).

EJEMPLO 2 Prueba de proliferación para determinar anticuerpos biológicamente funcionales Se usaron sobrenadantes y ascitis de hibridoma purificados por afinidad, para una prueba funcional cuantitativa para neutralización de la proliferación de células TF1 inducida por IL-5 (DNAX). Brevemente, se diluyó IL-5 humana recombinante en medio de cultivo RPMI-1640 con FBS a 1 % hasta una concentración final de 1.0 ng/ml, y el anticuerpo control, 39D10 (Schering-Plough), se diluyó hasta una concentración final de 1.0 µg/ml con medio de IL-5. Se añadió la solución de IL-5 o la solución de 39D10 más IL-5, a las cavidades de placas de 96 cavidades. Las cavidades control contenían sólo medio o sólo IL-5. Se lavaron dos veces las células TF1 con medio RPMI-1640, y se resuspendieron a una concentración final de 2.5 x 105 células TF1 por mi en medio de cultivo de FBS. Se añadieron 100 µ? de la suspensión de células a cada cavidad, y se incubaron durante 48-56 horas a 37°C y CO2 a 5%. Después de 48 horas, se añadieron a cada cavidad 20 µ? de azul Alamar, y se incubaron durante la noche. Las placas se analizaron usando un lector de placa FluoroCount™ a una longitud de onda de excitación de 530 nm, longitud de onda de emisión de 590 nm, y PMT de 600 voltios.

Los resultados de los estudios que usan el anticuerpo 20.13.3 purificado de ascitis o sobrenadantes, muestran que 20.13.3 bloqueó eficazmente la proliferación celular inducida por la IL-5.

EJEMPLO 3 Determinación de la ICsn de neutralización Se puso a prueba el Mab 20.13.3 en la prueba de antiproliferación de TF-1 contra IL-5 humana y de murino (Egan et al. Drug Res. 49: 779-790 (1999)). Brevemente, se añadieron 50 µ? de medio de prueba (RPMI 1640 complementado con glutamina a 1 %, solución a 1 % de penicilina/estreptomicina, mercaptoetanol a 0.1 %, fungizona a 0.05% y suero de bovino fetal a 1 %) a las cavidades de una placa de cultivo de 96 cavidades. Se añadieron concentraciones variables del Mab 20.13.3 a las cavidades, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron a cada cavidad veinte microlitros (20 µ?) de IL-5 humana o de murino (12 ng/ml) (salvo los controles negativos). Se prepararon células TF-1 a una concentración de 5x105 células por mi, y se añadieron a todas las cavidades alícuotas de 30 µ? de la suspensión de células. Las placas se incubaron durante 44-48 horas a 37°C y C02 a 5%. Se añadieron entonces a cada cavidad 25 µ? de una solución de 5 mg/ml de MTT, y se incubaron durante otras 6 horas. Se añadieron a cada cavidad 100 µ? de una solución de SDS a 10%, y las placas se incubaron durante la noche. Las placas se analizaron en un 00 espectrofotómetro UV MAX . Los resultados indican que en la prueba, el Mab 20.13.3 exhibe valores de IC5o de 250 pM y 380 pM contra la IL-5 humana y de murino, respectivamente.

EJEMPLO 4 Prueba funcional in vivo Se evaluó un anticuerpo anti-IL-5 de la invención en un modelo de ratón de inflamación pulmonar inducida por antígenos (Kung et al 1994). Brevemente, se dosificó a ratones sensibilizados con ovoalbúmina (OVA), con solución salina, Mab 20.13.3 a 5, 1 , 0.5 ó 0.1 mg/kg s.c. o un Mab anti-IL-5 de murino como control positivo, TRFK-5 (Schering Plough Research Institute; Mita et al., J. Immunol. Methods 125: 233 (1987)) a 1 mg/kg i.p 2 horas antes del desafío con OVA dispersada en un gas. Se recogió el fluido del lavado broncoalveolar (BAL) 24 horas después del desafio, y se determinó la celularidad. El TRFK-5 causó una disminución significativa en todos los parámetros. El Mab 20.13.3 inhibió significativamente el total de células y los eosinófilos en el BAL a 5, 1 y 0.5 mg/kg. Se evaluó la duración de la actividad de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención, en el modelo descrito anteriormente. Se dosificó a ratones sensibilizados con ovoalbúmina (OVA), con solución salina o el Mab 20.13.3 a 5 y 1 mg/kg s.c. 2 horas, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas, antes del desafío con OVA dispersada en un gas. Se recogió el fluido del lavado broncoalveolar 24 horas después del desafío, y se determinó la celularidad. Se tomaron muestras de sangre a la hora de la colecta del BAL para análisis farmacocinético. Las dosis de 5 y 1 mg/kg del Mab 20.13.3, inhibieron significativamente el total de células y los eosinófilos en el BAL cuando se administraron 2 horas y 13 días antes del desafío con OVA. El Mab 20.13.3 inhibió significativamente el total de células y los eosinófilos en el BAL cuando se administró 4 semanas antes del desafío sólo a la dosis de 5 mg/kg. Dejó de observarse inhibición cuando el Mab 20.13.3 se dosificó 6 semanas a 12 semanas antes del desafío. Los presentes inventores evaluaron el Mab 20.13.3 en un modelo de monos Cynomolgus de inflamación pulmonar inducida por antígenos (Mauser et al 1995). Brevemente, nueve monos sensibles naturalmente a Ascaris suum, fueron primero tratados con placebo con vehículo (solución salina subcutánea), y 18 horas después desafiados con Ascaris suum (antígeno) dispersado en un gas. Veinticuatro horas después del desafío con Ascaris, se recogió una muestra de fluido del BAL, y se obtuvo una muestra de sangre periférica. Se determinaron el contenido celular del BAL y las muestras de sangre. Tres semanas después, se dosificó a los nueve monos con el Mab 20.13.3 a 0.3 mg/kg s.c. Dieciocho horas después, los monos fueron desafiados con Ascaris suum dispersado en un gas, y se colectó una muestra del BAL 24 horas después. Se tomaron muestras de sangre antes y en tiempos seleccionados, después de la administración de Ascaris suum. El desafío con Ascaris suum se repitió 4 y 8 semanas después de la dosificación inicial con el Mab 20.13.3, y se analizó el contenido de células en el fluido del BAL antes y 24 horas después de cada desafío con Ascarís. El Mab 20.13.3 redujo significativamente la acumulación de eosinófilos inducida por antígenos en el BAL 4 semanas después de la dosificación, con una tendencia hacia niveles reducidos (55% de reducción) 8 semanas después de la dosificación. El Mab 20.13.3 redujo significativamente el número de eosinófilos en la sangre periférica, 42 horas, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas después de la dosificación, regresando los niveles a casi los niveles de predosificación alrededor de las 14 semanas.

EJEMPLO 5 Análisis estructural de los anticuerpos monoclonales anti-IL-5 totalmente humanos Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos de conformidad con la presente invención, los presentes inventores clonaron y secuenciaron ácidos nucleicos que codifican para fragmentos de cadena pesada y ligera de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-IL-5. Analizaron todas las secuencias mediante alineaciones con el "directorio de secuencias V BASE" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido), usando los programas MacVector y Geneworks.

Para clonar el ADNc que codifica para el anticuerpo monoclonal 20.13.3, los presentes inventores aislaron ARN de aproximadamente 1 X 106 células de hibridoma mediante el método de RNAzol (Tel-Test, INC.). Transcribieron en forma inversa el ARN mensajero usando oligo-dT (18) y el equipo de RT/PCR Advantage™ (Clontech). Usaron los siguientes iniciadores para amplificar el ADNc: Se sometieron a electroforesis productos de PCR de cadena ligera del ADNc de 20.13.3 en geles de agarosa a 1 %/TAE, y se separó una banda de aproximadamente 760 pares de bases y se purificó con perlas Sephaglas (Amersham), y fue subclonada en el vector TOP02.1 mediante PCR (Invitrogen). Se secuenciaron inserciones de ADNc con el equipo de tinción para secuenciación del iniciador (Applied Biosystems) con iniciadores vk018-Eco y ckp2-Apa. Se realizó el análisis de secuencias usando los programas SeqEd y GeneWorks. Los fragmentos de EcoRI/Apal aislados de los plásmidos identificados, fueron clonados en el vector de expresión pManuKappa. Productos de PCR de cadena pesada de 20.13.3 fueron digeridos con EcoRI/Nhel, sometidos a electroforesis en geles de agarosa a 1 %/TAE, y se separó una banda de aproximadamente 435 pares de bases, y se purificó con Sephaglas (Amersham), y fue subclonada en pManuGamma4. Los clones fueron secuenciados con el equipo de tinción para secuenciación del iniciador (Applied Biosystems), con iniciadores v3023-Eco y Jh4-Nhe. Para cada clon, los presentes inventores verificaron la secuencia en ambas cadenas en por lo menos tres reacciones.

Análisis del uso de genes El cuadro 5 describe el uso de genes por el hibridoma 20.13.3 de conformidad con la invención.

CUADRO 5 Uso de genes de cadena ligera v cadena pesada Análisis de mutaciones Como se apreciará, el análisis del uso de genes provee sólo un repaso limitado de la estructura de los anticuerpos. Puesto que las células B en los animales XenoMouse™ generan estocásticamente transcritos de cadena pesada V-D-J o de cadena ligera V-J kappa, existen muchos procedimientos secundarios que ocurren incluyendo, sin limitación, hipermutación somática, adiciones y extensiones de CDR3. Véase, por ejemplo, Méndez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), y la publicación de patente internacional W098/24893, publicada en octubre 1 1 de 1998. Por consiguiente, para examinar mejor la estructura de los anticuerpos, los presentes inventores generaron secuencias predichas de aminoácidos de los anticuerpos a partir de las moléculas de ADNc obtenidas de los clones. El dominio variable de la cadena pesada del Mab 20.13.3 contiene tres sustituciones de aminoácido en comparación con la línea germinal - una en la CDR2 y dos en la CDR3. El dominio variable de la cadena ligera del Mab 20.13.3 contiene cinco mutaciones de la línea germinal, una en cada CDR1 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se apreciará que muchas de las sustituciones o inserciones de aminoácido identificadas anteriormente, existen en estrecha proximidad a una CDR o dentro de la misma. Dichas sustituciones parecerían poseer cierto efecto sobre la unión del anticuerpo a la molécula de IL-5. Además, dichas sustituciones podrían tener un efecto significativo sobre la afinidad de los anticuerpos.

EJEMPLO 6 Determinación de las constantes de afinidad (KH) del anticuerpo monoclonal anti-IL-5 totalmente humano, medíante prueba de exclusión cinética Se determinó la constante de disociación en equilibrio (Kd) para el anticuerpo monoclonal humano 20.13.3, usando el instrumento KinExA 3000™ (Sapidyne Instruments Inc.). El KinExA usa el principio del método de prueba de exclusión cinética basado en medir la concentración del anticuerpo no combinado en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo antígeno-anticuerpo. La concentración del anticuerpo libre se mide exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado de fase sólida durante un breve período. En la práctica, esto se logra haciendo fluir la mezcla de antígeno-anticuerpo de fase en solución más allá de las partículas recubiertas de antígeno atrapadas en una celda de flujo. Los datos generado por el instrumento se analizan usando el programa acostumbrado. Se calculan las constantes de equilibrio usando una teoría matemática basada en las siguientes premisas: 1. La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibrio: Kde asoc¡ación[Ab][Ag]=Kde disociación [Ab Ag] 2. El anticuerpo y el antígeno se unen 1 :1 , y el total de anticuerpo iguala al complejo de antígeno-anticuerpo más el anticuerpo libre; y 3. La señal del instrumento está relacionada linealmente con la concentración del anticuerpo libre. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo al manual de KinExA 3000™. Todas las pruebas se llevaron a cabo por duplicado. El siguiente cuadro muestra las condiciones de prueba para las pruebas de Kd estándar a concentraciones de anticuerpo de 0.1 nM y 0.01 n , respectivamente: En cada prueba, se prepararon diluciones graduales dos veces mayores del antígeno, y se mezclaron con el anticuerpo a concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, hasta alcanzar el equilibrio. Los materiales usados en las pruebas anteriores fueron: Mab 20.13.3; IL-5 humana recombinante (rhlL-5) (disponible de Sigma (No. de catálogo I 5273), R&D Systems (No. de catálogo 205-IL-005), Amersham (No. de catálogo ARM19005), y Calbiochem (No. de catálogo 407641 )); partículas de PMMA de 8 mieras (Sapidyne, No. de catálogo 440198); Neutravidina (Pierce, No. de catálogo 31000); enlazador EZ TPF PEO-biotina (Pierce, No. de catálogo 21219); rhlL-5 biotinilada (relación de biotina/proteína: 19/1 ); y anti-HulgG de cabra conjugado con Cy5 (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, No. de catálogo 109-175-003). Las partículas de PMMA fueron recubiertas con rhlL-5 biotinilada de acuerdo al "Protocol for coating PMMA partióles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms", de Sapidyne. Para la biotinilación del enlazador EZ de rhlL-5, se usó TFP PEO-biotina de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (boletín de Pierce 0874). Se calculó la relación de biotina/proteína usando la prueba de HABA (boletín de Pierce 0212). El análisis de curva doble (concentraciones de anticuerpo de 0.1 y 0.01 nM) en el "modo estándar" (véase el manual de KinExA 3000™ para una explicación de los métodos de análisis de datos de curvas dobles), generó la mejor curva de ajuste para la Kd con un mínimo de claros. El valor calculado de la Kd para el Mab 20.13.3 para este método de análisis, fue de 1.5 x 10"11 M. La Kd calculada del Mab 20.13.3 mediante el método de curva doble (antígeno desconocido), fue de 1.95 x 10"11 M, la cual estuvo realizablemente cerca de la Kd obtenida mediante el método de curva doble (estándar). El peso molecular del anticuerpo usado para el cálculo fue de 150 kDa. Los análisis de cinética indican que los anticuerpos preparados de conformidad con la invención, poseen altas afinidades para la IL-5 humana. A lo largo de esta especificación y en las reivindicaciones, se entenderá que el término "comprende", o variaciones tales como "que comprende", implica la inclusión de un entero o grupo de enteros señalado, pero no la exclusión de algún otro entero o grupo de enteros. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia, como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora en la presente como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención, que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS <1 10> Schering Corporation y Abgenix, Inc. Greenfeder, Scott Corvalán, José <120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA INTERLEUCINA-5, Y METODOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN LOS MISMOS <130> LI01564 <160> 22 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211 > 2002 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> Región V <222> (1)..(414) <223> <220> <221> Región CH1 C <222> (415)..(709) <223> <220> <221> Pivote <222> (1102)..(1137) <223> <220> <221> Región CH2 C <222> (1256)..(1585) <223> <220> <221 > Región CH3 C <222> (1683).. (2002) <223> <400> 1 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaactatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agagaggtat 360 aactggaact acctacacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagctagc 420 accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca 720 gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc 780 cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag 840 gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc 900 cgggcagcca caggctggat gcccctaccc caggccctgc gcatacaggg gcaggtgctg 960 cgctcagacc tgccaagagc catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc 1020 aaaggccaaa ctctccactc cctcagctca gacaccttct ctcctcccag atctgagtaa 1080 ctcccaatct tctctctgca gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccaggta 1140 agccaaccca ggcctcgccc tccagctcaa ggcgggacag gtgccctaga gtagcctgca 1200 tccagggaca ggccccagcc gggtgctgac gcatccacct ccatctcttc ctcagcacct 1260 gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 1320 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 1380 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1440 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1500 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1560 gagaaaacca tctccaaagc caaaggtggg acccacgggg tgcgagggcc acatggacag 1620 aggtcagctc ggcccaccct ctgccctggg agtgaccgct gtgccaacct ctgtccctac 1680 agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa 1740 gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga 1800 gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 1860 cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg 1920 gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag 1980 cctctccctg tctctgggta aa 2002 <210> 2 <211 > 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SEÑAL <222> (1 )..(19) <223> <220> <221 > Región variable <222> (20)..(138) <223> <220> <221> Región CH1 <222> (139)..(236) <223> <220> <221 > Región de pivoteo <222> (237)..(248) <223> <220> <221 > Región CH2 <222> (249)..(358) <223> <220> <221 > Región CH3 <222> (359)..(465) <223 <400> 2 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val GIn 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Thr lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu GIn Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 1 10 Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Leu His Tyr Trp 115 120 125 Gly GIn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu GIn Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser GIn Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val GIn Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu GIn Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His GIn Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser He Glu Lys 340 345 350 Thr Me Ser Lys Ala Lys Gly GIn Pro Arg Glu Pro GIn Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser GIn Glu Glu Met Thr Lys Asn GIn Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Me Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 3 <211 > 708 <212> ADN <213> Homo sapiens 0 <400> 3 atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 120 gtcaccatca cttgccaggc gagtcaggac attatcaact alttaaattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tacagtgctt ccaatttgga aacaagagtc 240 ccatcaaggt tcagtggaag tggttctggg acagatttta ctttcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atattgcaac atattattgt caacagtatg ataatcaccc gctcactttc 360 ggcggaggga ccaaggtgga gatcagacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708 <210> 4 <21 1 > 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221 > Péptido de señal <222> (1 )..(22) <223> <400> 4 Met Asp Met Arg Val Pro Ala GIn Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp He GIn Met Thr GIn Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys GIn Ala Ser 35 40 45 GIn Asp lie lie Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr GIn GIn Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Arg Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu GIn Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys GIn GIn 100 105 110 Tyr Asp Asn His Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 1 15 120 125 Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu GIn Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val GIn Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 GIn Ser Gly Asn Ser GIn Glu Ser Val Thr Glu GIn Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His GIn Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 5 <21 1 > 414 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaactatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agagaggtat 360 aactggaact acctacacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 414 <210> 6 <211 > 1 19 <212> PRT <213> Homo sapiens 4 <400> 6 Glu Val GIn Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val GIn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg GIn Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu GIn Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Leu His Tyr Trp Gly GIn Gly 100 105 1 10 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 15 <210> 7 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 agctatgcca tgagc <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 9 <211> 51 <212> ADN <213> Homo saDiens <400> 9 actattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c <210> 10 <211 > 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 gagaggtata actggaacta cctacactac 30 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Leu His Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 caggcgagtc aggacattat caactattta aat <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ala Ser Gln Asp He He Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 15 <211 > 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 gtgcttccaa tttggaaaca 20 <210> 16 <211 > 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 17 <211 > 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 caacagtatg ataatcaccc gctcact <211 > <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Gln Tyr Asp Asn His Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <21 1 > 31 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 ggaagaattc accctgtgca ggagtcagtc c <210> 20 <211 > 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 tgagatcgag ggccccttct ccctctaaca ctctcc <210> 21 <211 > 34 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 ccggaattcc agagagaact caccatggag tttg <210> 22 <21 1> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 gagagagagc tagctgagga gacggtgacc agggttccct

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-5, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido de señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos del residuo 50-127 de SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 mostradas en SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente. 2. - El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido de señal; (b) la secuencia de aminoácidos del residuo 23-130 de SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de aminoácidos del residuo 46-119 de SEQ ID NO: 4; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 mostradas en SEQ ID NOS: 14, 16 y 18, respectivamente. 3. - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido de señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos del residuo 50-127 de SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 mostradas en SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente. 4.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 -709, 1102-1137, 1256-1585 y 1683-2002 de SEQ ID NO: 1 ; (b) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 58-709, 1102-1 137, 1256-1585 y 1683-2002 de SEQ ID NO: 1 ; (c) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 58-709 de SEQ. ID NO: 1 ; (d) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 148 a 381 de SEQ ID NO: 1 ; y (e) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 a 2002 de SEQ ID NO: 1. 5 - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido de señal; (b) la secuencia de aminoácidos del residuo 23-130 de SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de aminoácidos del residuo 46-119 de SEQ ID NO: 4; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1 , CDR2 y CDR3 mostradas en SEQ ID NOS: 14, 16 y 18, respectivamente. 6.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 3; (b) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 67-708 descrita en SEQ ID NO: 3; (c) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 67-390 descrita en SEQ ID NO: 3; y (d) la secuencia de nucleótidos del nucleótido 67-357 descrita en SEQ ID NO: 3. 7. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizada además porque está enlazada operablemente a una secuencia de control de la expresión. 8. - Una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7. 9. - Un método para producir una inmunoglobulina o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-5, el cual comprende el paso de cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8. 10.- Una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 4, y una molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6. 11. - Un método para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-5, el cual comprende el paso de cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 10. 12. - Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende un componente seleccionado del grupo que consiste de: (a) un agente de diagnóstico; y (b) un agente terapéutico. 14. - Un equipo que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2. 15. - El uso del anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, o una composición de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, para preparar un medicamento para prevenir o inhibir una condición o trastorno que se caracteriza por actividad no deseada de IL-5. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde la condición o trastorno se selecciona del grupo que consiste de: asma, exacerbaciones de asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Leoffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica o conjuntivitis alérgica. 136 17. - El uso como se reclama en las reivindicaciones 15 ó 16, en donde el medicamento disminuye o inhibe la infiltración de eosinófilos en el tejido afectado. 8. - El uso del anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad 5 con las reivindicaciones 1 ó 2, o una composición de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, para preparar un medicamento para prevenir o inhibir una respuesta alérgica mediada por IL-5 en un sujeto. 19. - El uso del anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, o una composición de conformidad con las 10 reivindicaciones 12 ó 13, para preparar un medicamento para prevenir o inhibir un evento mediado por IL-5 seleccionado del grupo que consiste de: (a) proliferación, maduración, supervivencia, activación o migración de eosinófilos en la corriente sanguínea, adhesión al endotelio e infiltración en tejidos; (b) edema pulmonar; (c) broncoconstricción; (d) hipersensibilidad de vías aéreas; 15 (e) eosinofilia o neutrofilia pulmonar; (f) eosinofilia cutánea; y (g) daño epitelial de vías aéreas. 20. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde el medicamento es administrable en conjunto con otro agente terapéutico. 20 21.- Un método para prevenir o inhibir la unión de IL-5 a un receptor de IL-5, el cual comprende el paso de administrar al ambiente en donde existen las células que expresan un receptor de IL-5, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una composición de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13. 22.- Un método para prevenir o inhibir la fosforilación de tirosina mediada por el receptor de IL-5, el cual comprende el paso de administrar al ambiente en donde existen las células que expresan un receptor de IL-5, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una composición de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13.