ES2981450T3

ES2981450T3 - Métodos de diagnóstico que emplean HNL

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Publication number: ES2981450T3
Application number: ES15798395T
Authority: ES
Inventors: Roosmalen Markus Hendrikus Van; Veronique Semjonow; Jeroen Hans Nieuwenhuis; Per Venge
Original assignee: P&M Venge AB
Current assignee: P&M Venge AB
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2024-10-08
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: JP2017536361A; US20170356921A1; CN107001455A; RU2758608C2; EP3221340A1; BR112017010268B1; BR112017010268A2; EP3221340C0; RU2017121108A3; US11270782B2; JP6788586B2; CN107001455B; RU2017121108A; US20220165372A1; EP3221340B1; WO2016079219A1

Abstract

La presente invención se refiere a medios y métodos para la detección de infecciones bacterianas, métodos de discriminación entre infecciones virales y bacterianas, métodos de estratificación de pacientes para el tratamiento posterior y otros fines de diagnóstico y métodos para el seguimiento de la antibioterapia. La presente invención se basa en la detección de epítopos específicos de lipocalina de neutrófilos humanos (HNL) utilizando agentes de unión específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de diagnóstico que emplean HNL

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El presente documento se refiere a los medios y métodos para la detección de infecciones bacterianas, métodos para discriminar entre infecciones virales y bacterianas, métodos de estratificación de pacientes para su tratamiento y otros finespara el diagnóstico y monitoreo de antibioterapia. La presente invención se basa en la detección de epítopos específicos de lipocalina neutrófila humana (HNL por sus siglas en inglés) utilizando agentes aglutinantes específicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Nuevos mecanismos de resistencia a los antibióticos han surgido y se propagan a nivel mundial amenazando la capacidad de tratar enfermedades infecciosas comunes, teniendo como consecuencia la muerte y la discapacidad de individuos que hasta hace poco podían continuar con un curso de vida normal. Sin un tratamiento antiinfeccioso eficaz, muchos tratamientos médicos estándar fracasarán o se convertirán en procedimientos de muy alto riesgo (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/; Resistencia a los antimicrobianos - Ficha N°194, actualizada en abril de 2014).

En 2012, fueron detectados alrededor de 450.000 nuevos casos de tuberculosis multirresistente(MDR-TB). A detalle, la tuberculosis resistente a tratamientos(XDR-TB)identificada en 92 países, requiere ciclos de tratamiento mucho más largos y menos eficaces que los de la tuberculosis no resistente. Existen altas proporciones de resistencia a los antibióticos(ABR)en bacterias que causan infecciones comunes en todo el mundo (ej., infecciones del tracto urinario, neumonía, infecciones del torrente sanguíneo). Un alto porcentaje de infecciones intrahospitalarias son causadas por bacterias altamente resistentes, como el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina(MRSA)o las bacterias gramnegativas multirresistentes. Actualmente, en 10 países, ya se han detectado fracasos terapéuticos debidos a la resistencia a los tratamientos de último recurso para la gonorrea (cefalosporinas de tercera generación). La gonorrea podría convertirse pronto en intratable ya que no existen vacunas ni nuevos medicamentos en desarrollo. Los pacientes con infecciones causadas por bacterias resistentes a los medicamentos generalmente tienen un mayor riesgo de peores resultados clínicos y muerte, y requieren más recursos de atención médica que los pacientes infectados con las mismas bacterias que no son resistentes.

Como ejemplo, la tasa de mortalidad de los pacientes con infecciones graves causadas por bacterias resistentes comunes tratadas en hospitales puede ser aproximadamente el doble que la de los pacientes con infecciones causadas por las mismas bacterias no resistentes. Por ejemplo, se estima que las personas con Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), otra fuente común de infecciones graves en la comunidad y en los hospitales tienen un 64 % más de probabilidades de morir que las personas con una forma no resistente de la infección.

Varios modos de comportamiento favorecen el desarrollo resistencia a los antibióticos (AMR). Por ejemplo, los antibióticos se utilizan ampliamente para la profilaxis en la cría de animales y la industria ganadera para aumentar el aumento de peso. Esto lleva al desarrollo de bacterias resistentes en estos animales, su transmisión a los humanos que trabajan con ellos o a los consumidores que compran y usan los productos procedentes de animales o granjas afectadas. Otro problema es la contaminación del medio ambiente que rodea a la granja de animales. Además, el desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos (AMR) también puede ser el resultado de la prescripción y distribución descuidada de medicamentos antimicrobianos, por ejemplo, antibióticos, a pacientes que no necesitan estos medicamentos ya que la gravedad de la enfermedad no justifica el uso de antibióticos, o la enfermedad no se debe a una infección bacteriana.

Además, los antibióticos están disponibles gratuitamente como medicamentos de venta libre (OTC) en varios países. Con frecuencia, los pacientes no utilizan estos antibióticos durante un período de tiempo suficientemente largo, no utilizan los antibióticos adecuados para sus respectivas enfermedades o no desechan adecuadamente los antibióticos restantes, sino que los liberan al medio ambiente, por ejemplo, tirándolos por el inodoro.

En la actualidad, existe una creciente necesidad de discriminar entre bacterias e infecciones virales y administrar antibióticos solo a pacientes con infecciones bacterianas confirmadas. Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar medios y métodos para este propósito.

La lipocalina de neutrófilos humanos (HNL) (también llamada lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (NGAL)), es una glicoproteína ubicua originalmente aislada de neutrófilos humanos y localizados en sus gránulos específicos.

HNL/NGAL existe como un monómero de 25 kD, o como un homodímero ligado al disulfuro de 45 kD, y se conjuga covalentemente con la gelatinasa (metaloproteinasa de matriz extracelular 9) a través de un puente disulfuro intermolecular como una forma heterodimérica de 135 kD (Cai et al., Clin J Am Soc Nephrol. diciembre de 2010; 5(12): 2229-2235). La secuencia de aminoácidos de HNL se muestra en el SEQ ID NO: 1 correspondiente a la secuencia protéica que se encuentra en www.uniprot.org/uniprot/P80l88, en particular refiriéndose a la isoforma 1.

El poder discriminatorio de HNL en la diferenciación entre infecciones virales agudas y bacterianas agudas mostró variaciones en la sensibilidades y especificidades entre el 75-94%. Obviamente, las cifras más bajas no son satisfactorias en un entorno clínico y el objetivo del desarrollo debe ser un ensayo de HNL que descarte de forma fiable a bacterias como la causa de las infecciones agudas para reducir la necesidad de tratar la infección con antibióticos. Un objetivo secundario debe ser una identificación fiable de aquellas infecciones agudas que necesitan tratamiento con antibióticos.

La cuantification de HNL (lipocalina de neutrófilos humanos) en suero o plasma se puede utilizada para discriminar las infecciones agudas causadas por virus de aquellas causadas por bacterias, tal como se menciona en EP 0756708 B1. WO2009/052390 se refiere al NGAL glicosilado de mamíferos y a los métodos utilizados de dicho NGAL glicosilado de mamíferos. US 2004/115728 revela anticuerpos reactivos con epítopos distintos de lipocalina para detectar inflamación e infecciones bacterianas en mamíferos. Xu et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1482 (200) 298-307) destacan que los anticuerpos monoclonales contra el HNL mostraron que el HNL estaba localizado en los granulocitos de neutrofilos.

Es objetivo de la invención proporcionar nuevos agentes aglutinantes que reconozcan específicamente el HNL y proporcionar métodos y usos de dichos aglutinantes, por ejemplo, en la detección de infecciones bacterianas y la selección del tratamiento adecuado de los pacientes.

Otro objetivo de la invención es la monitorización de pacientes sépticos sometidos a antibioterapia, por ejemplo, para ayudar a determinar la eficacia del tratamiento y el momento de la suspención de los antibióticos a través del analisis de muestras de pacientes obtenidas en diferentes momentos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las afirmaciones adjuntas. Las representaciones que no están comprendidas en las reivindicaciones son ilustrativas. La presente invención proporciona medios y métodos para detectar HNL en una muestra. Estos medios son agentes aglutinantes, por ejemplo, anticuerpos o derivados de los mismos, que se caracterizan por sus regiones de unión (por ejemplo, las regiones determinante de la complementariedad (CDR)), así como por su capacidad para unirse específicamente a HNL. Los aglutinantes de la presente invención pueden utilizarse en la detección específica de HNL, y permiten distinguir entre infecciones bacterianas y virales. En algunas representaciones, la cantidad de HNL como parámetro es adecuada para la identificación de infecciones bacterianas y/o para distinguir las infecciones bacterianas de las virales y puede utilizarse en el diagnóstico de enfermedades, el pronóstico clínicos o en la monitorización del curso de tratamientos antibacterianos. El diagnóstico correcto de una infección bacteriana aguda permite prescribir antibióticos de forma adecuada a un individuo tras someter una muestra al analisis de presencia, ausencia o cantidad de HNL, por ejemplo, en muestras de sangre o de orina.

La muestra biológica puede ser pretratada con un activador de neutrófilos para mejorar la detección de HNL y mejorar aún más los métodos aquí descritos. El activador de neutrófilos es un péptido N-formilo, preferiblemente el tripéptido fMLP. El activador de neutrófilos es la proteína A, o puede ser una combinación de fMLP y proteína A. El activador de neutrófilos es el lipopolisacárido (LPS), el factor activador de plaquetas, un oligodinucleótido CpG no metilado o el factor de necrosis tumoral (TNF). Por lo tanto, el activador de neutrófilos puede ser cualquier combinación de dos o más elementos seleccionados del grupo que consisten fMLP, proteína A, lipopolisacárido (LPS), factor activador de plaquetas, un oligodinucleótido CpG no metilado y factor de necrosis tumoral (TNF).

Un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido recombinantemente producido, que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos del 83 al 154 de HNL, o un HNL monomérico o dimérico purificado a partir de plasma/suero humano, puede utilizarse en la producción de un agente aglutinante que reconozca específicamente el HNL. El polipéptido se puede utilizar para inmunizar a un animal, obtener células productoras de anticuerpos, producir células de hibridoma y recolectar anticuerpos, opcionalmente elucidar su secuencia y, además, producir anticuerpos recombinantes, caracterizar estos anticuerpos por su capacidad para unirse específicamente a h Nl y utilizar estos anticuerpos en el diagnóstico de infecciones bacterianas mediante la determinación del nivel de HNL en una muestra. Los anticuerpos pueden modificarse como se describe a continuación.

De acuerdo con la invención, se proporcionan métodos para detectar o diagnosticar una infección bacteriana y/o viral, o permitir la discriminación entre infecciones virales y bacterianas, caracterizadas porque el nivel de HNL en una muestra se mide utilizando un agente aglutinante que se une específicamente a los aminoácidos de los epítopos de HNL que están expuestos en la superficie interna y externa del borde como se muestra en la Fig. 1, en el que estos epítopos comprenden los aminoácidos 141 a 156 de HNL representados en el SEQ ID NO. 1.

Por lo tanto, los agentes aglutinantes descritos en este documento, y los métodos en los que se utilizan dichos agentes aglutinantes, reconocen específicamente los aminoácidos compuestos por los aminoácidos 141 a 156 de HNL (SEQ ID NO: 1). El agente aglutinante es capaz de unirse específicamente a un epítopo polipeptídico de HNL, en el que dicho epítopo polipeptídico comprende los aminoácidos 141 a 156 de HNL como se define en SEQ ID NO: 1, o en el que dicho epítopo polipeptídico es un epítopo conformacional compuesto por el péptido en SEQ ID No: 26.

De acuerdo con la presente invención, el agente aglutinante se une a HNL que predominantemente producido por neutrófilos.

De acuerdo con la presente invención, el agente aglutinante presentado y utilizado en este documento se une a una región de HNL que está comprendida por la secuencia representada en el SEQ ID NO: 26.

De acuerdo con la presente invención, el agente aglutinante comprende una región de unión específica del epítopo HNL que comprende las seis secuencias de aminoácidos representadas en los ID SEQ Nos: 8 a 13.

En otra representación de la invención se proporciona un método para diagnosticar una infección, por ejemplo, una infección bacteriana, o volver a analizar una infección bacteriana, por ejemplo, en el curso de un tratamiento con antibióticos; o diferenciar una infección bacteriana de una infección viral caracterizada a través del análisis de una muestra, por ejemplo, una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer de una infección bacteriana o viral se analiza para detectar la presencia del nivel de HNL utilizando un agente aglutinante que se une específicamente a la secuencia representada en el SEQ ID NO: 26; o como se define en el presente documento. Dicho método puede contener los siguientes pasos: a) Incubar una muestra en presencia de dicho aglutinante;

b) Lavar opcionalmente el material de muestra no unido;

c) Medir el nivel de HNL en una muestra de un sujeto sospechoso de tener una infección bacteriana o viral;

d) Comparar el nivel de HNL medido en el paso c) con una o más muestras de control, obtenidas opcionalmente a partir de (i) sujetos sanos,

(ii) sujetos que se sabe que tienen una infección bacteriana, y

(iii) sujetos de los que se sabe tienen una infección vírica y/u, opcionalmente, comparando el nivel de HNL medido en el paso c) con uno o más valores de control normalizados e indicativos para sujetos sanos, sujetos con una infección por el virus y/o sujetos con una infección bacteriana.

En una representación específica, el método comprende un paso adicional para diagnosticar una infección bacteriana cuando el nivel de HNL en el paso c) es significativamente más alto que el nivel detectado en muestras de control (i) de sujetos sanos y (iii) de pacientes que se sabe que tienen una infección viral.

En otro aspecto que no forma parte de la presente invención se refiere a un método para descartar una infección bacteriana en un sujeto que consta en:

a) medir la concentración polipeptídica de HNL en una muestra obtenida de un sujeto utilizando un agente aglutinante como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente; y

b) descartar una infección bacteriana para el individuo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un primer valor umbral predeterminado.

En un aspecto adicional, ninguna parte de la presente invención proporciona un método para descartar una infección viral en un sujeto que comprenda:

b) descartar una infección viral para el sujeto de estudio si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es superior a un primer valor del umbral predeterminado.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de confirmación de una infección bacteriana en un sujeto que comprende:

b) confirmar una infección bacteriana para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es superior a un primer valor del umbral predeterminado.

Otro aspecto que no forma parte de la invención proporciona un método para determinar una infección viral en un sujeto que comprende:

b) descartar una infección viral para el sujeto si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es inferior a un primer valor umbral predeterminado.

En una representación, el método anterior para descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral incluye además:

a) medir la concentración polipeptídica de TRAIL en una muestra obtenida de un sujeto; y

b) descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral para el sujeto de estudio si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es superior a un primer valor predeterminado.

En otra representación, que no forma parte de la invención, el método anterior de descartar una infección viral o el método de descartar una infección bacteriana comprende además:

b) descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral para el sujeto de estudio si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es inferior a un primer valor predeterminado.

En otro aspecto, ninguna parte de la presente invención se refiere a un método para distinguir entre una infección bacteriana y una infección viral en un sujeto que comprende:

a) medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante como se ha definido anteriormente o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y de PCR, opcionalmente de TRAIL, en una muestra obtenida de un sujeto;

b) aplicar una función matemática predeterminada sobre las concentraciones de HNL y CRP y, opcionalmente, de TRAIL, para calcular una puntuación;

c) comparar la puntuación con un valor de referencia predeterminado.

Otro aspecto, que no forma parte de la presente invención, proporciona un método para distinguir entre una infección bacteriana o mixta, y una infección viral en un sujeto que comprende:

a) medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y de PCR, opcionalmente de TRAIL, en una muestra obtenida de un sujeto;

b) aplicar una función matemática predeterminada sobre las concentraciones de HNL y PCR y, opcionalmente, de TRAI, para calcular una puntuación;

c) comparar la puntuación con un valor de referencia predeterminado.

De acuerdo con otro aspecto, que no forma parte de la invención, se describe un método para proporcionar una recomendación de tratamiento para un sujeto que comprende:

b) recomendar que el sujeto reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es superior a un valor umbral predeterminado;

c) recomendar que el paciente no reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado; o

d) recomendar que el paciente reciba un tratamiento antiviral si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado.

En una representación que no forma parte de la presente invención, el método de proporcionar una recomendación de tratamiento para un sujeto comprende además en el paso a) la medición adicional de la concentración polipeptídica de TRAIL en una muestra obtenida de un sujeto; y

b) recomendar que el sujeto reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es superior a un valor del umbral predeterminado y si la concentración de TRAIL determinada en el paso a) es inferior a un valor del umbral predeterminado;

c) recomendar que el paciente no reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor del umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado; o

d) recomendar que el paciente reciba un tratamiento antiviral si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es superior a un valor umbral predeterminado.

De acuerdo con otro aspecto, ninguna parte de la presente invención se refiere a un método para proporcionar una recomendación de prueba diagnóstica para un sujeto que comprende:

b) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de bacterias si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado; o

c) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de un virus si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es inferior a un valor umbral predeterminado.

De acuerdo con una representación, que no forma parte de la presente invención, el método de proporcionar una recomendación de prueba diagnóstica para un sujeto, comprende además en el paso a) la medición adicional de la concentración polipeptídica de TRAIL en una muestra obtenida de un sujeto; y b) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de bacterias si la concentración polipeptídica de<h>N<l>determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado y si la concentración de TRAIL determinada en el paso a) es inferior a un valor umbral predeterminado; c) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de un virus si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es inferior a un valor del umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado.

En otro aspecto, que no forma parte de la invención, un método para descartar una enfermedad infecciosa, preferiblemente una enfermedad bacteriana o viral, en un tema que comprende:

a) medir la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante tal como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y la concentración polipeptídica de uno o más polipéptidos seleccionados del grupo formado por TRAIL, IP10, IL1Ra o Mac-2BP en una muestra obtenida de un sujeto; b) aplicar una función matemática predeterminada sobre las concentraciones de los polipéptidos medidos para calcular una puntuación

c) comparar la puntuación con un valor de referencia predeterminado.

En otro aspecto, que no forma parte de la presente invención, se refiere a un método para identificar el tipo de infección, preferiblemente una infección bacteriana o viral en un sujeto, que comprende:

a) la medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante tal como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico tal como se ha definido anteriormente y los niveles de un primer determinante polipeptídico seleccionado del grupo formado por TRAIL, IL1RA, IP10, Mac-2BP, B2M, BCA-1, CHI3Ll, Eotaxin, IL1 a, MCP, CD62L, VEGFR2, CHP, CMPK2, CORO1C, EIF2AK2, ISG15, RPL22L1, RTN3, CD112, CD134, CD182, CD231, CD235A, CD335, CD337, CD45, CD49D, CD66A/C/D/E, CD73, CD84, EGFR, GPR162, HLA-A/B/C, ITGAM, NRG1, RAP1B, SELI, SPINT2, SSEA1, moléculas ligadas inespecíficas de IgG, IL1, I-TAC y TNFR1 en una muestra obtenida de un sujeto; y

b) medir los niveles de un segundo determinante seleccionado del grupo formado por

(i) los determinantes polipeptídicos TRAIL, IL1RA, IP10, Mac-2BP, B2M, BCA-1, CHI3L1, Eotaxin, IL1 a, MCP, CD62L, VEGFR2, CHP, CMPK2, CORO1C, EIF2AK2, ISG15, RPL22L1, RTN3, CD112, CD134, CD182, CD231, CD235A, CD335, CD337, CD45, CD49D, CD66A/C/D/E, CD73, CD84, EGFR, GPR162, HLA-A/B/C, ITGAM, NRG1, RAP1B, SELI, SPINT2, SSEA1, moléculas ligadas inespecíficas de IgG, IL1, I-TAC y TNFR1;

(ii) los determinantes polipeptídicos IFITM3, IFIT3, EIF4B, IFIT1, LOC26010, MBOAT2, MX1, OAS2, RSAD2, ADIPORl, CD15, CD8A, IFITM1 e IL7;

(iii) los determinantes polipeptídicos CRP, SAA, TREM-1, PCT, IL-8,

TREM-1 e IL6; o

(iv) los determinantes no polipeptídicos Edad, recuento absoluto de neutrófilos, recuento absoluto de linfocitos, % de neutrófilos (Neu(3/4)), % de linfocitos (Lym(%)), % de monocitos (Mono(%)), temperatura máxima, tiempo transcurrido desde los síntomas, creatinina (Cr), potasio (K), pulso y urea;

c) comparar los niveles de HNL, primer y segundo determinantes con un valor de referencia, identificando así el tipo de infección en el sujeto, en el que la medición del primer y/o segundo determinante aumenta la precisión de la identificación del tipo de infección por encima de la medida de HNL.

En un aspecto adicional, ninguna parte de la presente invención se refiere a un método para identificar el tipo de infección, preferiblemente una infección bacteriana o viral, en un sujeto constituyendo:

a) la medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante tal como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y los niveles de uno o más determinantes polipeptídicos seleccionados del grupo formado por ABTB1, ADIPOR1, A r Hg DIB, ARPC2, ATP6V0B, Clorf83, CD15, CES1, CORO1A, CSDA, EIF4B, EPSTII, GAS 7, HERC5, IFI6, KIAA0082, IFIT1, IFIT3, IFITM1, IFITM3, LIPT1, IL7R, ISG20, LOC26010, LY6E, LRDD, LTA4H, MAN1C1, MBOAT2, NPM1, OAS2, PARP12, PARP9, QARS, RAB13, RAB31, RAC2, RPL34, PDIA6, PTEN, RSAD2, SART3, SDCBP, SMAD9, SOCS3, TRIM22, SART3, UBE2N, XAF1, ZBP1, CRP y MX1 en una muestra obtenida de un sujeto; y

b) comparar los niveles de HNL y de uno o más determinantes polipeptídicos con un valor de referencia, identificando así el tipo de infección en el sujeto.

En una reapresentación, que no forma parte de la presente invención, el método de identificación del tipo de infección comprende además la medición de uno o más determinantes no polipeptídicos, seleccionados del grupo que consiste en Edad, recuento absoluto de neutrófilos, recuento absoluto de linfocitos, % de neutrófilos (Neu(3/4)), % de linfocitos (Lym (%)), % de monocitos (Mono(%)), Temperatura máxima, Tiempo desde los síntomas, Creatinina (Cr), Potasio (K), Pulso y Urea.

En otra representación, que no forma parte de la presente invención, se utiliza el nivel de los determinantes que incluyen el recuento absoluto de neutrófilos y % de neutrófilos (NEU(3/4)) para normalizar el nivel de HNL.

En otra representación que no forma parte de la invención, se proporcionan métodos para estratificar a los sujetos en aquellos que tienen una enfermedad bacteriana y aquellos que no tienen una enfermedad bacteriana que comprenden los pasos anteriores y, opcionalmente, comprenden el paso de administrar antibióticos terapéuticamente a sujetos identificados como infectados por bacterias.

En algunas reapresentaciones de la invención, la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre (es decir, sangre total) o fracciones de la misma, por ejemplo, suero, plasma y/u orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), médula ósea, saliva y esputo.

Los lugares donde se pueden utilizar las pruebas descritas en este documento y se pueden realizar los métodos descritos son las unidades de cuidados intensivos (UCI), hospitales, en particular departamentos de emergencia, departamentos neonatales, instalaciones de médicos de cabecera, farmacias, hospitales comunitarios y entornos de nivel 1 y 2.

En otra representación, la invención proporciona un dispositivo para el diagnóstico de infecciones bacterianas, dicho dispositivo comprende al menos un apartado, por ejemplo, un área de contacto, que comprende los agentes aglutinantes descritos en el presente documento. El dispositivo puede ser una tira reactiva con aglutinantes inmovilizados (aparte) de su superficie, partículas portadoras de aglutinantes inmovilizados (aparte) de su superficie, etc. La superficie puede ser tridimensional, por ejemplo, las partículas con una superficie (capa) parcialmente porosa pueden transportar los agentes aglutinantes anteriores. Es importante que el dispositivo comprenda un área de contacto que pueda estar expuesta a una muestra que se analice, por ejemplo, una muestra que se sospeche que contiene HNL. En las representaciones del dispositivo de invención, es posible la determinación del nivel de HNL. En otras representaciones, el dispositivo puede estar conectado a otros dispositivos, por ejemplo, aquellos adecuados para tomar una muestra de sangre de un sujeto sospechoso de tener una infección bacteriana, o puede estar conectado a un ordenador o aparato que permita analizar y medir la interacción entre los agentes aglutinantes descritos en este documento y el HNL que está presente en una muestra. La interacción puede medirse utilizando una señal física, química o biológica que se genera específicamente al unirse el HNL y los agentes aglutinantes descritos en el presente documento. La interacción puede producir una señal mensurable, por ejemplo, una señal cromogénica, una señal fluorogénica, una señal medible espectroscópicamente, un cambio en la ionización, un cambio en la conductividad y similares en comparación con los controles, cuando no se ha producido ninguna interacción.

En una representación específica, el dispositivo mencionado anteriormente comprende adicionalmente un agente aglutinante para uno o más de los determinantes polipeptídicos adicionales mencionados anteriormente, en el que dichas reacciones son indicativas de una interacción de los determinantes polipeptídicos, y que además permite opcionalmente determinar el nivel de dichos determinantes polipeptídicos en dicha muestra.

En una representación específica que no forma parte de la presente invención, se refiere al método tal como se define anteriormente en el presente documento, que además comprende la medición del nivel de proteína C reactiva, y/o de TRAIL, y/o de procalcitonina, y/o de CD64, y/o la determinación del número de glóbulos blancos y/o la determinación del número de neutrófilos.

Otra representación que no forma parte de la invención proporciona un método de producción de un anticuerpo que comprende el paso de cultivar células productoras de anticuerpos obtenidas de un animal previamente expuesto a un antígeno que comprende la secuencia en SEQ ID NO: 26, y proporcionar los anticuerpos, modificando opcionalmente los anticuerpos obtenidos.

Preferiblemente, los anticuerpos comprenden una región de unión que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de aminoácidos representadas en los números 1 a 6, 7 a 12 y 13 a 18, o un derivado funcional de los mismos.

Además de lo anterior, la invención puede incluir, como aspecto adicional, todas las representaciones de la invención de alcance más estrecho de cualquier manera que las variaciones definidas por párrafos específicos en este documento. Por ejemplo, ciertos aspectos de la invención se describen como una categoría, y debe entenderse que cada miembro de una categoría es, individualmente, un aspecto de la invención. Además, los aspectos descritos como una categoría o la selección de un miembro de una categoría, deben entenderse en el sentido de que abarcan combinaciones de dos o más miembros de la categoría.

Debe entenderse que, si bien varias representaciones en la especificación se presentan utilizando un lenguaje "inclusivo", en diversas circunstancias, una representación relacionada también puede describirse utilizando un lenguaje “compouesto por, o esencialmente inclusivo”.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 es una representación gráfica de la molécula de HNL.

La Fig. 2 muestra los resultados de los experimentos de activación con neutrófilos purificados de la sangre de pacientes y controles sanos utilizando fMLP. Los neutrófilos fueron expuestos a diversas concentraciones de fMLP y se incubaron durante 15 min a 37 °C y, posteriormente, se centrifugaron y se analizó el sobrenadante para detectar la presencia de HNL. Se encontró que la concentración óptima para la liberación de fMLP era de 5xl0-8 mol/L. Con el fin de estudiar la cinética de liberación de HNL, las células purificadas se incubaron durante diferentes períodos de tiempo. Se observó una liberación significativa después de 5 minutos de incubación y un mayor aumentó con la incubación prolongada.

La Fig. 3 muestra la liberación propensa de HNL a través de neutrófilos después de la incubación con fMLP. En sangre total después de la coagulación, la liberación de HNL de neutrófilos purificados de XX pacientes con infecciones agudas y sujetos sanos YY, se comparó con las concentraciones séricas de HNL de los respectivos sujetos. Se obtuvo una correlación significativa y lineal (r=0,743, p=0,002) entre las concentraciones de sobrenadante y séricas de HNL.

Las Figs. 4 a y b muestran las concentraciones de HNL en sangre total después de la activación de fMLP durante 20 min a 37 °C y en plasma EDTA. Las concentraciones de HNL en sangre total activada por fMLP de sujetos sanos (media geométrica 98 pg/L, 95% Cl 90-107, pg/L) son significativamente más bajas que las concentraciones medidas en pacientes con bacterias (media geométrica 337 pg/L, 95% Cl 300-379 pg/L) (p<0,0001) y pacientes con infecciones virales (media geométrica 117 pg/L, 95% Cl 101-136 pg/L) (p<0,05).

Las Figs. 5 a y b muestran los resultados diagnósticos de los dos ensayos de HNL, es decir, en sangre total activada por fMLP y en plasma EDTA. La distinción entre sujetos sanos no infectados y aquellos con infección bacteriana confirmada se muestra por medio de curvas de características operativas del receptor (ROC). El área bajo la curva (AUC) para la prueba de HNL en sangre total activada por fMLP fue de 0,95 (95% 0,91-0,97) en comparación con 0,88 (95% Cl 0,84-0,91), p = 0,0003 para la prueba de HNL en plasma EDTA. Para la sangre total activada por fMLP, el valor predictivo negativo (NPV) a 125 pg/L de HNL fue del 90% (95% Cl 82-96%) y el valor positivo del 83% (95% Cl 77-89%). Para el plasma de EDTA a una concentración de HNL de 40 pg/L, el NPV fue del 86% (IC del 95%: 72-95%) y el PPV del 63% (Cl del 95%: 57-69%). En la distinción entre infecciones bacterianas y virales, el AUC para la sangre total activada por fMLP fue de 0,92 (95% Cl 0,87-0,96) y para EDTA-plasma de 0,79 (95% Cl 0,71-0,85), p=0,0006. A una concentración de 110 pg/L, el NPV fue del 93% (95% Cl, 68-100%) y el PPV, del 85% (77-90%) para la sangre total activada por fMLP. Las cifras correspondientes para HNL a la concentración de 40 pg/L en EDTA-plasma fueron NPV 52% (95% Cl 37-67%) y PPV 85% (95% Cl 78-90%).

El NPV no superó el 60% a ninguna concentración de HNL en EDTA-plasma. Por lo tanto, el rendimiento clínico del HNL en sangre total activada por fMLP fue superior al del HNL en plasma con EDTA, tanto en la distinción entre sujetos sanos e infecciones bacterianas como en la distinción entre infecciones bacterianas y virales.

Las Figs. 6 a-d muestran la distribución de los biomarcadores PCR, recuento de neutrófilos en sangre, expresión de CD64 en neutrófilos en sangre y procalcitonina en las poblaciones estudiadas. Con la excepción de los recuentos de neutrófilos, todos los demás biomarcadores aumentaron significativamente tanto en las infecciones bacterianas como en las virales en comparación con los sujetos sanos (p<0,0001).

La Fig. 7 muestra un dímero de HNL. El dímero de HNL se estabiliza a través de un puente de cisteína indicado en negro entre las dos estructuras del monómeros de HNL. Las regiones implicadas en la unión del antígeno anticuerpo se indican en negro (a la izquierda y a la derecha de la figura).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REPRESENTACIONES

Aunque la presente invención se describirá con respecto a representaciones particulares, esta descripción no debe interpretarse en un sentido limitante. Antes de describir en detalle las representaciones ejemplares de la presente invención, se dan definiciones importantes para comprender la presente invención.

Tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares también incluyen los plurales respectivos, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

En el contexto de la presente invención, los términos "cerca de" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que una persona experta en la materia entenderá para garantizar el efecto técnico de la característica en cuestión. El término suele indicar una desviación del ±20 % del valor numérico indicado, preferiblemente del ±15 %, aún mejor del ±10 % e incluso más preferiblemente del ±5 %.

Debe entenderse que el término "comprende" no es limitante. A los efectos de la presente invención, se considera que el término "que consiste en" es una representación preferida del término "que comprende de". Si en lo sucesivo se define un grupo que comprende al menos un cierto número de representaciones, se entiende que esto también abarca un grupo que preferiblemente consiste solo en estas representaciones. Además, los términos "primero", "segundo", "tercero" o "a)", "b)", "c)", "d)", etc., etc., y similares, en la descripción y en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las representaciones de la invención descritas en este documento son capaces de operar en secuencias distintas a las descritas o ilustradas en este documento.

En caso de que los términos "primero", "segundo", "tercero" o "a)", "b)", "c)", "d)", etc., se refieran a etapas de un método o utilización, no existe coherencia temporal o de intervalo de tiempo entre las etapas, es decir, las etapas pueden llevarse a cabo simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre dichas etapas, a menos que se indique lo contrario en la aplicaión según lo establecido en el presente documento anteriormente o a continuación. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, proteínas, bacterias, vectores, reactivos, etc., particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que laterminología utilizada en este documento es para el propósito de describir representaciones particulares solamente, y no tiene la intención de limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen los mismos significados que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la materia.

En el contexto de la presente invención, el término "aglutinante" designa cualquier molécula, por ejemplo, péptidos que comprenden aminoácidos naturales y/o modificados que les permiten unirse específicamente a las secuencias de las regiones o epítopos de HNL aquí descritos, por ejemplo, un agente aglutinante que se une a la región de HNL que está expuesta en la superficie del borde interior y/o exterior de dicha molécula como se muestra en la Fig. 1 (partes oscuras de la imagen 3D). Los agentes aglutinantes reconocen específicamente los aminoácidos 141 a 156 de HNL como se muestra en el SEQ ID NO: 1 y, en particular, a un epítopo conformacional discontinuo, preferiblemente no lineal, compuesto por el péptido en el SEQ ID No: 26. Los agentes aglutinantes preferidos son los anticuerpos o los fragmentos funcionales.

En el sentido de la invención, "significativamente" unido también significa que, de entre un conjunto de una pluralidad de antígenos diferentes igualmente accesibles como posibles socios de unión, el HNL se une al menos 10 veces, por ejemplo, 50 veces, por ejemplo, 100 veces o más frecuentemente (en un sentido cinético) que cualquier otro antígeno diferente del HNL. Estas mediciones cinéticas se pueden realizar en un aparato Biacore.

El término "nivel", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad o concentración de HNL detectada en una muestra.

Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, este término incluye ADN y ARN bicatenario y monocatenario. También incluye tipos conocidos de modificaciones, incluidas las etiquetas conocidas en la técnica, la metilación, las "tapas", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo y las modificaciones de internucleótidos, como los enlaces no cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), así como las formas no modificadas del polinucleótido.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo monoclonal o el fragmento funcional del mismo puede derivatizarse, por ejemplo, con una fracción fluorescente, una fracción radiactiva, un sustrato cromogénico y similares.

Se sabe que una unidad estructural típica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena "ligera" (alrededor de 25 kD) y otra "pesada" (entre 50-70 kD). El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu(p), delta (ó), gamma (<y>), alfa(a)y épsilon (s), y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Varios de ellos pueden dividirse a su vez en subclases o isotipos, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A). Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, Fundamental Immunology, cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

Los alotipos son variaciones en la secuencia de anticuerpos, a menudo en la región constante, que pueden ser inmunogénicas y están codificadas por alelos específicos en humanos. Se han identificado alotipos para cinco de los genes IGHC humanos, los genes IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2 e IGHE, y se designan como alotipos G1m, G2m, G3m, A2m y Em, respectivamente. Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos, véase Roth, D. B., y Craig, N. L., Cell, 94:41 1-414 (1998). Brevemente, el proceso de generación de ADN que codifica las secuencias de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera ocurre principalmente en las células B en desarrollo. Antes de la reorganización y unión de varios segmentos de genes de inmunoglobulinas, los segmentos de genes V, D, J y constante (C) se encuentran generalmente relativamente cerca de un solo cromosoma. Durante la diferenciación de las células B, un miembro apropiado de cada familia de los segmentos genéticos V, D, J (o solo V y J en el caso de los genes de cadena ligera) se recombinan para formar regiones variables funcionalmente reorganizadas de los genes de inmunoglobulina pesada y ligera. Este proceso de reordenamiento de segmentos génicos parece ser secuencial.

En primer lugar, se fabrican uniones D-a-J de cadena pesada, seguidas de articulaciones V-a-DJ de cadena pesada y articulaciones V-A-J de cadena ligera. Además del reordenamiento de los segmentos V, D y J, se genera una mayor diversidad en el repertorio primario de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas por medio de la recombinación variable en los lugares donde se unen los segmentos V y J de la cadena ligera y donde se unen los segmentos D y J de la cadena pesada. Dicha variación en la cadena ligera generalmente ocurre dentro del último codón del segmento del gen V y el primer codón del segmento J. Una imprecisión similar en la unión ocurre en el cromosoma de cadena pesada entre los segmentos D y JH y puede extenderse hasta por 10 nucleótidos. Además, se pueden insertar varios nucleótidos entre el D y el JH y entre los segmentos de los genes V<h>y D que no están codificados por el ADN genómico La adición de estos nucleótidos se conoce como diversidad de la región N. El efecto neto de tales reordenamientos en los segmentos génicos de la región variable y la recombinación variable que puede ocurrir durante dicha unión es la producción de un repertorio primario de anticuerpos.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (incluidos los anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a un antígeno (incluidos, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Se contemplan multímeros o agregados de moléculas y/o fragmentos intactos, incluidos los anticuerpos derivados químicamente.

Se contemplan anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo, incluyendo IgG, IgM, IgD, IgA e IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, o cualquier alotipo.

El término región "hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de una región determinante de complementariedad o CDR (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada como lo describe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991)). Incluso un solo CDR puede reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que todo el sitio de unión al antígeno que contiene todos los CDR.

Chothia et al., J. Mol.BioL, 196: 901-917 (1987) describen una definición alternativa de residuos de un "bucle" hipervariable como residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada.

Los residuos "marco" o FR son aquellos residuos de región variable distintos de los residuos de región hipervariable. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de una inmunoglobulina intacta, por ejemplo, una región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos multiespecíficos (biespecíficos, triespecíficos, etc.) formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de inmunoglobulinas pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Algunos ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos son Fab, Fab', F(ab')2, Fv (región variable), anticuerpos de dominio (dAb, que contiene un dominio VH; Ward et al., Nature, 341, 544-546, 1989), fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena simple (scFv, que contienen dominios VH y VL en una sola cadena polipeptídica) (Bird et al., Science, 242:423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:5879-5883, 1988, incluyendo opcionalmente un enlazador polipeptídico; y opcionalmente multiespecífico, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)), fragmentos de anticuerpos de cadena simple, diacuerpos (dominios VH y VL en una sola cadena polipeptídica que se emparejan con dominios VL y VH complementarios de otra cadena) (EP 404,097; WO 93/1 1161; y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993)), triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos (scFv fusionados con CH3 a través de un enlazador peptídico (sin bisagra) o a través de una bisagra de IgG), anticuerpos lineales (segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos recombinantes quelantes (crAb, que pueden unirse a dos epítopos adyacentes en el mismo antígeno), bicuerpos (Fab-scFv biespecífico) o tricuerpos (Fab triespecífico (scFv)(2)) (Schoonjans et al., J Immunol. 165:7050-57, 2000; Willems et al., J. Chromatogr. B. Analyt. Tecnol. Biomed. Life Sci., 786: 161-76, 2003), nanocuerpos (aproximadamente 15kDa dominio variable de la cadena pesada) (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004), una proteína de fusión de inmunoglobulina en el dominio de unión al antígeno, un anticuerpo camelizado (en el que el VH se recombina con una región constante que contiene dominios bisagra, CH1, CH2 y CH3) (Desmyter et al., J. Biol. Chem., 276:26285-90, 2001; Ewert et al., Bioquímica, 41:3628-36, 2002; Publicación de solicitud de patente de EE. UU. Nos.2005/0136049 y 2005/0037421), un anticuerpo que contiene VHH, anticuerpos de cadena pesada (HCAb, homodímeros de dos cadenas pesadas que tienen la estructura H2L2), o variantes o derivados de los mismos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir la unión de antígeno específico al polipéptido, como una secuencia CDR, siempre y cuando el anticuerpo conserve la actividad biológica deseada.

El término "variante" se refiere a una secuencia polipeptídica de un anticuerpo que contiene al menos una sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos en la región variable o en la porción equivalente a la región variable, siempre que la variante conserve la afinidad de unión o la actividad biológica deseadas.

El término "modificación" incluye, pero no se limita a, uno o más cambios de aminoácidos (incluidas sustituciones, inserciones o eliminaciones); modificaciones químicas que no interfieren con la actividad de unión a HNL; modificación covalente por conjugación a agentes diagnósticos; marcaje (por ejemplo, con radionúclidos o diversas enzimas); unión de polímeros covalentes, como la pegilación (derivatización con polietilenglicol) y la inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos no naturales. En algunas representaciones, los polipéptidos modificados (incluidos los anticuerpos) conservarán las propiedades de unión de las moléculas no modificadas.

El término "derivado" se refiere a los anticuerpos o polipéptidos que se modifican covalentemente mediante la conjugación con agentes de diagnóstico, el marcaje (por ejemplo, con radionúclidos o diversas enzimas), la unión covalente de polímeros como la pegilación (derivatización con polietilenglicol) y la inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos no naturales. En algunas representaciones, los derivados conservarán las propiedades de unión de las moléculas no derivatizadas.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, tal como se define en el presente documento, obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales o modificaciones postraduccionales alternativas que pueden estar presentes en cantidades menores, ya sea producido a partir de hibridomas o técnicas de ADN recombinante. Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos murinos, conejos, ratas, pollos, quiméricos, humanizados o humanos, anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos multiespecíficos (incluidos los anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a un antígeno (incluidos, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, diacuerpos), maxicuerpos, nanocuerpos y péptidos recombinantes que comprenden lo anterior siempre que exhiban la actividad biológica deseada, o variantes o derivados de los mismos. La humanización o modificación de la secuencia de anticuerpos para que sea más parecida a la humana se describe, por ejemplo, en Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScLl U.S.A., 81 :6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlán, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlán, Molec. Immunol, 31(3): 169-217 (1994); y Kettleborough, c A et al., Protein Engineering., 4(7):773-83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol 152, 2968-2976); Srudnicka et al., Ingeniería de Proteínas 7: 805-814 (1994). Un método para aislar anticuerpos monoclonales humanos es el uso de la tecnología de visualización sobre fagos. La visualización sobre fagos se describe, por ejemplo, en Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Caton y Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. U<s>A, 87:6450-6454 (1990). Otro método para aislar anticuerpos monoclonales humanos utiliza animales transgénicos que no tienen producción endógena de inmunoglobulinas y están diseñados para contener loci de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); WO 91/10741, WO 96/34096, WO 98/24893 o solicitud de patente de EE. UU. Publicaciones N° 2003/0194404, 2003/0031667 o 2002/0199213.

Los anticuerpos de la invención también incluyen dímeros de cadena pesada, como los anticuerpos de camélidos. Dado que la región VH de un dímero de cadena pesada IgG en un camélido no tiene que hacer interacciones hidrofóbicas con una cadena ligera, la región de la cadena pesada que normalmente entra en contacto con una cadena ligera se cambia a residuos de aminoácidos hidrófilos en un camélido. Los dominios VH de las IgG de dímeros de cadena pesada se denominan dominios VHH. Los anticuerpos para su uso en la presente invención incluyen anticuerpos de dominio único (dAbs) y nanocuerpos (véase, por ejemplo, Cortez-Retamozo, et al., Cancer Res. 64:2853-2857, 2004).

Tal como se utiliza en el presente documento, la "región V" se refiere a un dominio de región variable de anticuerpos que comprende los segmentos de Framework 1, CDRl, Framework 2, CDR2 y Framework 3, incluidos CDR3 y Framework 4, cuyos segmentos se agregan al segmento V como consecuencia del reordenamiento de los genes de la región V de cadena pesada y cadena ligera durante la diferenciación de las células B. Un "segmento V", tal como se usa en este documento, se refiere a la sección de la región V (cadena pesada o ligera) que está codificada por un gen V.

Tal como se utiliza en el presente documento, la "región determinante de la complementariedad (CDR)" se refiere a las tres regiones hipervariables de cada cadena que interrumpen las cuatro regiones "marco" establecidas por las regiones variables de la cadena ligera y pesada. Los CDR son los principales responsables de unirse a un epítopo de un antígeno. Los CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numerados secuencialmente a partir del extremo N, y también suelen identificarse por la cadena en la que se encuentra el CDR en particular. Así, por ejemplo, un CDR3 VH se localiza en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que un CDR1 VL es el CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear los CDR en el espacio tridimensional.

Las secuencias de aminoácidos de los CDR y las regiones marco pueden determinarse utilizando varias definiciones bien conocidas en la técnica, por ejemplo, Kabat, Chothia, la base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) y AbM (véase, por ejemplo, Johnson et al., supra; Chothia y Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901- 917; Chothia C. et al., 1989, structural repertoire of the human VH segments. Nature 342, 877- 883; Chothia C. et al., 1992, repertorio estructural de los segmentos Vh humanos J. Mol. Biol.227, 799- 817; Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273 (4) ). Las definiciones de sitios de combinación de antígenos también se describen en las siguientes referencias: Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219- 221 (2000); y Lefranc, M.- P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan l; 29 (1): 207- 9 (2001); MacCallum et al, Antibody antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732- 745 (1996); Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268- 9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121- 153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); Rees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction.Oxford University Press, Oxford, 141- 1721996).

"Epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos suelen conservarse al exponerse a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario (también denominados epítopos discontinuos) suelen perderse en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo suele incluir al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol.66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, para una célula, o un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector, ha sido modificada por la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o por la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan de forma anormal, se expresan de forma insuficiente o no se expresan en absoluto. Por el término "ácido nucleico recombinante" se entiende el ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, por la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, utilizando polimerasas y endonucleasas, en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. De esta manera, se logra la vinculación operativa de diferentes secuencias. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado, en forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro por ligadura de moléculas de ADN que normalmente no están unidas, se consideran recombinantes para los fines de esta invención. Se entiende que una vez que un ácido nucleico recombinante se fabrica y se reintroduce en una célula u organismo huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente, aunque posteriormente replicados de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes a los efectos de la invención. De manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína creada mediante técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ha descrito anteriormente.

Una variedad de composiciones que comprenden uno, dos y/o tres CDR de una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo pueden generarse mediante técnicas conocidas en el área.

También se describen los ácidos nucleicos aislados proporcionados que codifican anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento, opcionalmente vinculados de forma operativa a secuencias de control reconocidas por una célula huésped, vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden incluir el cultivo de la célula huésped para que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, la recuperación del anticuerpo del cultivo de la célula huésped o del medio de cultivo.

La secuencia de aminoácidos relevante de una inmunoglobulina de interés puede determinarse mediante secuenciación directa de proteínas, y las secuencias de nucleótidos codificantes adecuadas pueden diseñarse de acuerdo con una tabla de codones universal. De manera alternativa, el ADN genómico o de ADNc que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse a partir de células que producen dichos anticuerpos mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). La clonación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora aquí como referencia). Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de ADNc mediante transcripción inversa de polyA+ARNm, por ejemplo, ARNm asociado a la membrana, y la biblioteca se puede examinar utilizando sondas específicas para secuencias génicas de polipéptidos de inmunoglobulina humana. Sin embargo, en una representación, la reacción en cadena de la polimerasa (P<c>R) se utiliza para amplificar ADNc (o porciones de ADNc de longitud completa) que codifican un segmento de gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de cadena ligera o pesada). Las secuencias amplificadas se pueden clonar fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores minigénicos o vectores de visualización por fagos. Se apreciará que el método particular de clonación utilizado no es crítico, siempre que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

La frase "se une específica (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando hace referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una secuencia de proteína particular al menos dos veces más que a proteínas inespecíficas y, por lo general, más de 10 a 100 veces el fondo. El término se refiere también a la capacidad del agente aglutinante, el anticuerpo o el fragmento funcional o derivado del mismo para unirse al HNL, en particular a un epítopo discontinuo compuesto por el péptido en SEQ ID No: 26.

El término "afinidad de unión" o "afinidad", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio (Ko) asociada a cada interacción antígeno-anticuerpo. En algunas representaciones, los anticuerpos descritos en este documento exhiben propiedades deseables tales como la afinidad de unión medida por Ko para HNL en el rango de 1 x 10-6 M o menos, o alcanzando un rango mas bajo de 10-16 M o menor, (p. ej., alrededor de 10 6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16 M o menos) a un pH de aproximadamente 7.4, donde una KD más baja indica una mejor afinidad. La constante de disociación de equilibrio se puede determinar en el ensayo de equilibrio de solución utilizando, por ejemplo, BIAcore.

La afinidad de unión está directamente relacionada con la relación entre la velocidad de apagado cinético (generalmente mostrada en unidades de tiempo inverso, por ejemplo, segundos-1) dividida por la velocidad de encendido cinético (generalmente mostrada en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo, M/s). El análisis caída puede estimar la interacción que se produce in vivo, ya que una caída lenta predeciría un mayor grado de interacción durante un largo período de tiempo.

En otras representaciones, los anticuerpos descritos en este documento exhiben especificidad para o se unen específicamente a HNL. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo es "específico para" o "se une específicamente" a HNL cuando tiene una afinidad de unión significativamente mayor y, en consecuencia, es capaz de distinguir HNL en comparación con otras proteínas no relacionadas en diferentes familias. En algunas representaciones, tales anticuerpos también pueden reaccionar de forma cruzada con HNL de otras especies, tales como h Nl de ratón, rata o primates; mientras que en otras representaciones, los anticuerpos se unen solo al HNL humano. Cualquiera de los anticuerpos anteriores puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunas representaciones, el anticuerpo es un isotipo IgG, como un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En otro aspecto, las representaciones de la invención incluyen una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los anticuerpos anteriores, un vector de expresión que comprende cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico, unidas operativamente a una secuencia de control regulador, células huésped que comprenden tales moléculas o vectores aislados de ácido nucleico, y métodos de uso de dichas células huésped para producir un anticuerpo. Dichos métodos de producción comprenden el cultivo de la célula huésped en condiciones adecuadas, de modo que el ácido nucleico se exprese para producir el anticuerpo y, opcionalmente, la recuperación del anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo. En una representación relacionada, se proporciona un anticuerpo aislado o agente producido por el método antes mencionado.

Las representaciones descritas en este documento incluyen una composición, por ejemplo, una composición de diagnóstico, que contiene cualquiera de los agentes de unión anteriores, por ejemplo, anticuerpos. La invención se refiere a:

1) un agente aglutinante, por ejemplo, un anticuerpo que retiene seis de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3 como se muestra en los números 8 a 13.

En otro aspecto, que no forma parte de la invención, se proporcionan métodos para mutar anticuerpos de acuerdo con la invención, que conservan una afinidad de unión específica para HNL, particularmente para el epítopo comprendido por SEQ ID NO: 26. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-HNL producido por estos métodos. Los residuos candidatos para la mutación incluyen residuos que son sitios de contacto dirigidos con el antígeno o sitios que contribuyen a la formación de interacciones de carga a lo largo de la interfaz de unión anticuerpo-antígeno. Otros residuos candidatos incluyen residuos dentro de las regiones conservadas del anticuerpo. Sin embargo, otros residuos candidatos incluyen residuos de estructura que están expuestos al menos en un 10% de la superficie y dentro de los 4.5 A de un residuo de CDR. Los residuos candidatos adicionales incluyen aquellos seleccionados mediante inspección visual de un modelo estructural tridimensional para aminoácidos en las proximidades de los CDR o residuos de marco seleccionados. Los aminoácidos deseados pueden mutar en una o varias posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las mutaciones que producen algún efecto de unión diferencial como mutaciones simples pueden combinarse como mutaciones dobles, triples o múltiples. Los anticuerpos que han sido mutados de esta manera se analizan para determinar si se unen diferencialmente, por ejemplo, mejorados, y luego se pueden analizar para determinar otras propiedades.

En un aspecto, que no forma parte de la invención, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más residuos en la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo se eliminan y se sustituyen por otro residuo. En otro aspecto, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más residuos en la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo son eliminados y reemplazados por un residuo diferente. En algunos aspectos, al menos un residuo de la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo y al menos un residuo de la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo se sustituye por un residuo diferente, siempre que se mantenga la actividad de unión específica de dicho anticuerpo.

El anticuerpo comprende todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo formado por los números 8 a 13. Una fuente de ácidos nucleicos de anticuerpos es un hibridoma producido mediante la obtención de una célula B de un animal inmunizado con el antígeno de interés y su fusión con una célula inmortal. Alternativamente, se puede aislar el ácido nucleico de las células B (o de todo el bazo) del animal inmunizado. Otra fuente de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos es una biblioteca de dichos ácidos nucleicos generados, por ejemplo, a través de la tecnología de visualización a través de fagos.

Los polinucleótidos que codifican péptidos de interés, por ejemplo, péptidos de región variable con características de unión deseadas, pueden identificarse mediante técnicas estándar como el barrido.

La secuencia que codifica una región variable completa del polipéptido de inmunoglobulina puede determinarse; sin embargo, a veces será adecuado secuenciar solo una parte de una región variable, por ejemplo, la parte de codificación CDR. La secuenciación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, y Sanger, F. et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, que se incorpora aquí como referencia). Al comparar la secuencia del ácido nucleico clonado con las secuencias publicadas de genes de inmunoglobulina y ADNc, uno de los expertos podrá determinar fácilmente, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de la línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina de hibridoma (incluido el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de cadena pesada y ligera, incluyendo las secuencias resultantes de la adición de la región N y el proceso de mutación somática. Una fuente de información sobre la secuencia del gen de la inmunoglobulina es el Centro Nacional de Información Biotecnológica, la Biblioteca Nacional de Medicina, los Institutos Nacionales de Salud, en Bethesda, Maryland.

Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "aislada" o una secuencia de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que (1) se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico o (2) se clona, amplifica, etiqueta o se distingue de otro modo de los ácidos nucleicos de fondo de modo que se pueda determinar la secuencia del ácido nucleico de interés. Una molécula aislada de ácido nucleico no está en la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales.

Una vez aislado, el ADN puede unirse de forma operativa a secuencias de control de expresión o colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped que de otro modo no producirían proteínas inmunoglobulinas, para dirigir la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en la técnica. Las secuencias de control de expresión se refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante vinculada de forma operable en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. Un ácido nucleico se une de forma operativa cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor se une de forma operativa al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma se une de manera operativa a una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. En general, enlazado operablemente significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Muchos vectores son conocidos en la técnica. Los componentes del vector pueden incluir uno o más de los siguientes: una secuencia de señal (que puede, por ejemplo, promover la secreción del anticuerpo), un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos (que pueden, por ejemplo, conferir resistencia a los antibióticos u otros fármacos, complementar deficiencias auxotróficas o suministrar nutrientes críticos no disponibles en los medios), un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción, todos los cuales son bien conocidos en la técnica. Las células huésped ejemplares para expresar la información genética comprendida en el vector en el momento de la transfección o transformación incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores (es decir, un organismo multicelular). Las células huésped procariotas incluyen eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhimurium), Serratia (por ejemplo, Serratia marcescans) y Shigella, así como bacilos como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas y Streptomyces. Los microbios eucariotas, como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes adecuados para la clonación o la expresión de polipéptidos o anticuerpos recombinantes. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más utilizado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en este documento, como Pichia, por ejemplo, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Cándida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped para la expresión de polipéptidos glicosilados o anticuerpos pueden derivarse de organismos multicelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrados son las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivos de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypy (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para la transfección de dichas células están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-I de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV. Las células huésped de los vertebrados también son huéspedes adecuados, y la producción recombinante de polipéptidos o anticuerpos a partir de dichas células se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son las células de ovario de hámster chino, incluidas las células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-1 1, DG-44 y las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células renales de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (<v>E<r>O-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W 138, ATCC CCL 75); células de hepatoma humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At Cc CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci, 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 o células FS4; o células de mieloma de mamíferos. Las células huésped se transforman o transfectan con los ácidos nucleicos o vectores descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según corresponda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Además, los nuevos vectores y las líneas celulares transfectadas con múltiples copias de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos.

Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo descrito en este documento pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente como F10 (Sigma) de Ham, Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle Medium ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980), U.S. Patent Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; es decir, 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente de EE. UU. Re. No. 30,985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco gentamicina™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse en concentraciones apropiadas que sean conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, etc., son las que se han utilizado previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el usuario normalmente hábil.

Al cultivar las células huésped, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los restos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.

El anticuerpo se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, o cromatografía de afinidad, utilizando el antígeno de interés o las proteínas A o G como ligando de afinidad. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos basados en cadenas pesadas humanas<y>1, Y 2 o<y>4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para el humano y3 (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles.

Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C<h>3, la resina Bakerbond ABX™(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas como la precipitación de etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatofocalización, el SDS-PAGE y la precipitación de sulfato de amonio también son posibles dependiendo del anticuerpo que se vaya a recuperar.

Se pueden preparar otros agentes aglutinantes específicos de HNL, por ejemplo, a partir de CDR de un anticuerpo o mediante el cribado de bibliotecas de diversos péptidos o compuestos químicos orgánicos en busca de péptidos o compuestos que presenten las propiedades de unión deseadas para el HNL humano. El agente aglutinante específico de HNL incluye péptidos que contienen secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a uno o más CDR mencionados en este documento. Los agentes aglutinantes específicos de HNL también incluyen pepticuerpos. El término "pepticuerpo" se refiere a una molécula que comprende un dominio Fe de anticuerpo unido al menos a un péptido. La producción de pepticuerpos se describe generalmente en la publicación WO 00/24782 del PCT, publicada el 4 de mayo del 2000. Cualquiera de estos péptidos puede unirse en tándem (es decir, secuencialmente), con o sin enlazadores. Los péptidos que contienen un residuo de cisteinil pueden estar reticulados con otro péptido que contiene Cys, uno o ambos pueden estar unidos a un vehículo. Cualquier péptido que tenga más de un residuo de Cys también puede formar un enlace disulfuro intrapeptídico. Cualquiera de estos péptidos puede derivatizarse, por ejemplo, el extremo carboxilo puede estar cubierto con un grupo amino, las cisteínas pueden estar tapadas, o los residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos por restos que no sean residuos de aminoácidos (véase, por ejemplo, Bhatnagar et al., J. Med. Chem., 39: 3814-9 (1996), y Cuthbertson et al., J. Med. Chem., 40: 2876-82 (1997)). Las secuencias peptídicas pueden optimizarse, de forma análoga a la maduración de la afinidad por los anticuerpos, o alterarse de otro modo mediante el barrido con alanina o la mutagénesis aleatoria o dirigida, seguida de un cribado para identificar los mejores obstáculos. (Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26: 401-24 (1997)). Se pueden insertar varias moléculas en la estructura específica del agente aglutinante, por ejemplo, dentro de la propia porción peptídica o entre las porciones peptídica y vehículo de los agentes aglutinantes específicos, conservando la actividad deseada del agente aglutinante específico. Se pueden insertar fácilmente, por ejemplo, moléculas como un dominio Fe o un fragmento del mismo, polietilenglicol u otras moléculas relacionadas como el dextrano, un ácido graso, un lípido, un grupo colesterol, un pequeño carbohidrato, un péptido, una fracción detectable como la descrita en el presente documento (incluidos los agentes fluorescentes, radiomarcadores como los radioisótopos), un oligosacárido, un oligonucleótido, un polinucleótido, ARN de interferencia (u otro), enzimas, hormonas o similares. Otras moléculas adecuadas para la inserción de esta manera serán apreciadas por los expertos en la materia, y están incluidas en el ámbito de la invención. Esto incluye la inserción de, por ejemplo, una molécula deseada entre dos aminoácidos consecutivos, opcionalmente unidos por un enlazador adecuado.

No forman parte de la presente invención, los métodos de identificación de anticuerpos o agentes de unión específicos que se unen a HNL y/o que bloquean de forma cruzada anticuerpos ejemplares descritos en este documento, y/o que inhiben la actividad de HNL, tambi'en mencionados. Los anticuerpos o agentes aglutinantes específicos pueden ser examinados para determinar la afinidad de unión mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de desplazamiento de gel, Western blots, ensayo de competencia por radiomarcado, cofraccionamiento por cromatografía, coprecipitación, reticulación, ELISA y similares, que se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY. En una representación, se emplea un cribado de alto rendimiento para fragmentos de anticuerpos o CDRs con 1,2, 3 o más modificaciones en los aminoácidos dentro de los CDRs que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido de antígeno diana. Los anticuerpos anti-HNL descritos en este documento pueden modificarse fácilmente mediante técnicas bien conocidas por alguien de habilidad ordinaria en la técnica. Las mutaciones potenciales incluyen la inserción, deleción o sustitución de uno o más residuos. En algunas representaciones, las inserciones o deleciones están en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, en el rango de aproximadamente 1 a 3 aminoácidos, o en el rango de aproximadamente 1 o 2 aminoácidos. Las variantes de deleción son polipéptidos en los que se elimina al menos un residuo de aminoácidos de cualquier secuencia de aminoácidos. Las deleciones pueden efectuarse en uno o ambos extremos de la proteína, o con la eliminación de uno o más residuos dentro (es decir, interno) del polipéptido. Los métodos para la preparación de variantes de deleción son rutinarios en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press.

Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido que conforma un anticuerpo anti-HNL descrito en este documento y un polipéptido heterólogo son un tipo específico de variante de inserción contemplada en este documento. Ejemplos no limitantes de polipéptidos heterólogos que se pueden fusionar con polipéptidos de interés incluyen proteínas con una vida media circulante larga, como, entre otras, regiones constantes de inmunoglobulina (p. ej., región Fe); secuencias marcadoras que permiten la identificación del polipéptido de interés; secuencias que facilitan la purificación del polipéptido de interés; y secuencias que promueven la formación de proteínas multiméricas. Los métodos para producir proteínas de fusión de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.306.393. En ciertas representaciones, se producen proteínas de fusión que pueden incluir un enlazador flexible, que conecta el anticuerpo quimérico scFv con la fracción de proteína heteróloga. Las secuencias enlazadoras apropiadas son aquellas que no afectan a la capacidad de la proteína de fusión resultante para ser reconocida y unirse al epítopo específicamente unido por el dominio V de la proteína (véase, por ejemplo, WO 98/25965).

Con el fin de determinar qué residuos de aminoácidos de anticuerpos son importantes para el reconocimiento y la unión de epítopos, se puede realizar una mutagénesis de barrido de alanina para producir variantes de sustitución. Véase, por ejemplo, Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989). En este método, los residuos de aminoácidos individuales se reemplazan uno a la vez con un residuo de alanina y el anticuerpo anti-HNL resultante se analiza por su capacidad para unirse a su epítopo específico en relación con el anticuerpo no modificado. Los anticuerpos modificados con capacidad de unión reducida se secuencian para determinar qué residuo se ha modificado, indicando su importancia en las propiedades de unión o biológicas.

Sin ser parte de la invención, las variantes de sustitución de anticuerpos pueden prepararse mediante maduración por afinidad en la que se introducen cambios aleatorios de aminoácidos en la secuencia de anticuerpos parental. Véase, por ejemplo, Ouwehand et al., Vox Sang 74 (Supl 2):223-232, 1998; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915, 1998; Dall'Acqua et al., Curr. Opin. Struct. Biol, 8:443-450, 1998. La maduración por afinidad implica la preparación y el cribado de los anticuerpos anti-HNL, o variantes de los mismos, y la selección de las variantes resultantes de aquellas que tienen propiedades biológicas modificadas, como el aumento de la afinidad de unión en relación con el anticuerpo anti-HNL original. Una forma conveniente de generar variantes sustitutivas es la maduración por afinidad mediante la visualización por fagos. Brevemente, varios sitios de regiones hipervariables se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes así generadas se expresan de forma monovalente en la superficie de las partículas de fagos filamentosos como fusiones con el gen III producto de M1 3 empaquetado dentro de cada partícula. A continuación, se analizan las variantes mostradas por los fagos para determinar su actividad biológica (por ejemplo, la afinidad de unión). Véase, por ejemplo, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 and WO 93/19172.

No son parte de la invención, los métodos actuales de maduración por afinidad de anticuerpos a los que pertenecen dos categorías de mutagénesis: estocástica y no estocástica.Errores promovidos por PCR, cepas bacterianas mutadoras (Low et al., J. Mol. Biol.260, 359-68, 1996) y mutagénesis de saturación (Nishimiya et al.,. J. Biol. Chem. 275: 12813-20, 2000; Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) son ejemplos típicos de métodos de mutagénesis estocástica (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:8466-71, 2005). Las técnicas no estocásticas a menudo utilizan la exploración con alanina o la mutagénesis dirigida al sitio para generar colecciones limitadas de muteínas específicas. Algunos métodos se describen con más detalle a continuación. La maduración por afinidad de los anticuerpos recombinantes se realiza comúnmente a través de varias rondas de paneo de anticuerpos candidatos en presencia de cantidades decrecientes de antígeno. Al disminuir la cantidad de antígeno por ronda, se seleccionan los anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno, lo que produce anticuerpos de alta afinidad a partir de una gran cantidad de material de partida. La maduración de la afinidad a través del paneo es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Huls et al. (Cancer Immunol Immunother.

50:163-71, 2001). Los métodos de maduración por afinidad utilizando tecnologías de visualización por fagos se describen en otra parte del presente documento y se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91:2029-34, 2000).

Sin ser parte de la invención, la mutagénesis de observación (LTM) (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:8466-71, 2005) proporciona un método para mapear rápidamente el sitio de unión al anticuerpo. Para la LTM, se seleccionan nueve aminoácidos, representativos de las principales químicas de la cadena lateral proporcionadas por los 20 aminoácidos naturales, para diseccionar las contribuciones funcionales de la cadena lateral a la unión en cada posición en los seis CDR de un anticuerpo. La LTM genera una serie posicional de mutaciones individuales dentro de una CDR en la que cada residuo de "tipo salvaje" se sustituye sistemáticamente por uno de los nueve aminoácidos seleccionados. Los CDR mutados se combinan para generar bibliotecas combinatorias de fragmentos variables de cadena única (scFv) de complejidad y tamaño crecientes sin llegar a ser prohibitivos para la visualización cuantitativa de todas las mutaciones. Después de la selección positiva, se secuencian los clones con una unión mejorada y se mapean las mutaciones beneficiosas.

La PCR propensa a errores, que no forma parte de la invención, implica la aleatorización de ácidos nucleicos entre diferentes rondas de selección. La aleatorización se produce a una tasa baja por la tasa de error intrínseco de la polimerasa utilizada, pero puede mejorarse mediante una PCR propensa a errores (Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999) utilizando una polimerasa que tiene una alta tasa de error intrínseco durante la transcripción (Hawkins et al., J Mol Biol. 226:889-96, 1992). Después de los ciclos de mutación, los clones con mayor afinidad por el antígeno se seleccionan utilizando métodos rutinarios en la técnica.

No son parte de la invención, las técnicas que utilizan la mezcla de genes y la evolución dirigida que también pueden utilizarse para preparar y cribar anticuerpos anti-HNL, o variantes de los mismos, para la actividad deseada. Por ejemplo, Jermutus et al., Proc Natl Acad Sci USA., 98(1):75-80 (2001) demostraron que las estrategias de selección in vitro adaptadas basadas en la visualización de ribosomas se combinaron con la diversificación in vitro mediante la mezcla de ADN para evolucionar la estabilidad termodinámica de los valores de los scFvs; Fermer et al., Tumor Biol.2004 enero-abril; 25(1-2):7-13 mostraron que el uso de la visualización por fagos en combinación con la mezcla de ADN aumentó la afinidad en casi tres órdenes de magnitud. Dougherty et al., Proc Natl Acad Sci USA 200029 de febrero; 97(5):2029-2034 mostraron que (i) los clones funcionales ocurren con una frecuencia inesperadamente alta en bibliotecas hipermutadas, (ii) los mutantes de ganancia de función están bien representados en dichas bibliotecas, y (iii) la mayoría de las mutaciones de scFv que conducen a una mayor afinidad corresponden a residuos distantes del sitio de unión.

Sin ser parte de la invención, alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno, o utilizar software informático para modelar dichos puntos de contacto. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que se generan dichas variantes, se someten a un cribado como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su posterior desarrollo.

En otro aspecto, se proporciona un método para detectar el HNL humano en una muestra, que comprende el contacto con una muestra de un ser humano con cualquiera de los anticuerpos antes mencionados en condiciones que permiten la unión del anticuerpo al HNL humano, y la detección del anticuerpo unido. En una representación, un primer anticuerpo contra HNL se inmoviliza sobre un soporte sólido, como reactivo de captura, y un segundo anticuerpo contra HNL se utiliza como reactivo de detección. En un aspecto relacionado, la cantidad de HNL en la muestra se cuantifica midiendo la cantidad del anticuerpo unido. Los métodos de detección se pueden utilizar en una variedad de métodos de diagnóstico, pronóstico y monitoreo, incluidos los métodos de diagnóstico de un trastorno relacionado con HNL, los métodos para diferenciar una enfermedad inflamatoria de una enfermedad no inflamatoria y los métodos de monitoreo de la terapia con un anticuerpo anti-HNL. En estos métodos, un nivel de HNL por encima de un determinado umbral se correlaciona con la presencia de un trastorno relacionado con el HNL, mientras que un nivel por debajo de dicho umbral indica que es poco probable que el paciente tenga un trastorno relacionado con HNL. Del mismo modo, un nivel de HNL por encima de un determinado umbral se correlaciona con la presencia de una infección bacteriana, mientras que un nivel por debajo de dicho umbral indica que es poco probable que el paciente tenga una infección bacteriana. Para determinar la presencia o ausencia de una infección bacteriana, una muestra biológica de un paciente se pone en contacto con uno o más de los anticuerpos anti-HNL descritos en este documento en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos.

A continuación, se detectan los inmunocomplejos formados entre un anticuerpo anti-HNL y el HNL en la muestra biológica. La cantidad de HNL en la muestra se cuantifica midiendo la cantidad del inmunocomplejo formado entre el anticuerpo y el HNL. Dentro de ciertos métodos, se aísla una muestra biológica de un paciente y se incuba con uno o más de los anticuerpos anti HNL descritos en este documento, y el nivel del complejo anticuerpo-HNL por encima de un cierto umbral se correlaciona con la presencia de infección bacteriana, y un nivel por debajo de dicho umbral indica que es poco probable que el paciente tenga una infección bacteriana.

Para el seguimiento de la terapia que comprende la repetición de la prueba de un paciente para detectar la presencia de HNL después del inicio, durante o después de la terapia, destinada a combatir la infección bacteriana, un nivel de HNL por debajo de un determinado umbral indica que la terapia (fármaco y/o dosis) es eficaz, y un nivel por encima de dicho umbral indica que la terapia no es eficaz. Por lo tanto, las representaciones de la invención proporcionan un método de (re)prueba de sujetos sospechosos de sufrir una infección bacteriana (es decir, medir HNL en diferentes puntos temporales) que comprende los pasos:

- Incubar una muestra en presencia de dicho aglutinante;

- Opcionalmente, lavar el material de muestra no unido;

- Medir el nivel de HNL en una muestra de un sujeto sospechoso de tener una infección bacteriana o que tenga una infección bacteriana confirmada y esté sujeto a terapia con antibióticos;

Opcionalmente, comparando el nivel de HNL medido en el paso c) con una o más muestras de control, obtenidas opcionalmente a partir de

(i) sujetos sanos,

(ii) sujetos de los que se sabe que tienen una infección bacteriana

y, además, comparando opcionalmente el nivel de HNL medido en el paso c) con uno o más valores normalizados de HNL de control indicativos para sujetos sanos, y/o sujetos con una infección bacteriana, y/o el nivel de HNL en una muestra del paciente antes del tratamiento, y en los que el nivel de HNL en la muestra de un sujeto diagnosticado con enfermedad bacteriana se determina al menos en un punto más en el tiempo después de iniciar un tratamiento antibacteriano, que comprende opcionalmente la repetición de dicho análisis, y además opcionalmente la comparación del nivel de HNL antes, durante y/o después de la terapia antibacteriana.

Otra representación que no forma parte de la invención proporciona un método de monitorización de la eficacia o ineficacia del tratamiento antibacteriano, por ejemplo, con antibióticos específicos, en el que dicho sujeto ha sido identificado como portador de bacterias causantes de sepsis, y/o bacterias resistentes a los antibióticos.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se puede utilizar una sustancia preactivadora para aumentar la sensibilidad de los métodos de ensayo, que es preferiblemente un péptido N-formilo, más preferiblemente el tripéptido fMLP. También se contempla preferentemente el uso de la proteína A. La presente invención contempla además el uso de activadores de neutrófilos alternativos adicionales, tales como lipopolisacárido (LPS), factor activador de plaquetas, un oligodinucleótido CpG no metilado o factor de necrosis tumoral (TNF).

Estos activadores pueden utilizarse solos o en cualquier combinación, por ejemplo, en forma de fMLP y/o proteína A y/o lipopolisacárido (LPS) y/o factor activador de plaquetas y/o un oligodinucleótido CpG no metilado y/o factor de necrosis tumoral (TNF), como por ejemplo fMLP en combinación con proteína A, fMLP en combinación con LPS, fMLP en combinación con factor activador de plaquetas, fMLP en combinación con oligodinucleótido CpG no metilado, o en combinación con TNF, etc. También se prevén otras combinaciones de activadores como la proteína A en combinación con LPS, la proteína A en combinación con el factor activador de plaquetas, la proteína A en combinación con oligodinucleótidos CpG no metilados, o en combinación con TNF; o l Ps en combinación con cualquiera de los otros activadores mencionados anteriormente; u oligodinucleótido CpG no metilado en combinación con cualquiera de los otros activadores mencionados anteriormente; o TNF en combinación con cualquiera de los otros activadores mencionados anteriormente. En una representación preferida, el activador es fMLP, o una combinación de fMLP con uno o más de los otros activadores mencionados anteriormente.

También se proporcionan métodos para diferenciar una infección bacteriana de una infección no bacteriana. Se pueden utilizar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros: sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisótopos, por ejemplo), Western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej., ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc., así como, por ejemplo, dispositivos para la detección de analitos que impliquen la separación magnética de los analitos de interés (por ejemplo, el dispositivo descrito en WO2008/072156, WO2008/102218, WO2010/035204, y

WO201 l/036638). En una representación, la unión de anticuerpos se detecta mediante la detección de una etiqueta en el anticuerpo primario. En otra representación, el anticuerpo primario se detecta mediante la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En una representación adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Antibodies: A Laboratory Manual (1988) de Harlow & Lane o ediciones más recientes; Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, Gosling, J. P. (ed.) (2001) o ediciones más recientes; y/o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.), que se actualiza periódicamente. Ejemplos de tales ensayos generalmente involucran el anticuerpo unido a una superficie o matriz, el suero del paciente agregado y el tiempo permitido para que se forme un complejo; procedimientos de lavado adecuados para eliminar el complejo no unido, seguido de la adición de un segundo anticuerpo para permitir la detección del complejo (un ELISA sándwich) o una versión detectable de HNL para detectar sitios de unión de HNL libres en la superficie del anticuerpo (un ELISA de competencia). El nivel de HNL, detectado por los métodos anteriores, por encima de un determinado umbral se correlaciona con la presencia de una enfermedad inflamatoria, y un nivel por debajo de dicho umbral indica que es poco probable que el paciente tenga una enfermedad inflamatoria. Es poco probable que un paciente tenga una enfermedad de infección bacteriana cuando el nivel de HNL está dentro del rango normal. Es probable que un paciente tenga una enfermedad bacteriana cuando el nivel de HNL excede el rango normal.

En algunas representaciones, una muestra biológica obtenida de un paciente se analiza para determinar el nivel de HNL. La muestra biológica se incuba con uno o más de los anticuerpos anti-HNL descritos en el presente documento en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos. A continuación, se detectan los inmunocomplejos formados entre el HNL y los anticuerpos de la muestra biológica que se unen específicamente al HNL. Una muestra biológica para su uso dentro de estos métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que se espera que contenga HNL. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, plasma sérico, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR) y médula ósea. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos de células humanas, roedores, conejos, cabras, camellos o cualquier otra especie.

La muestra biológica se incuba con anticuerpos en una mezcla de reacción en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos entre el HNL y los anticuerpos que son inmunoespecíficos para el HNL. Después de la incubación, la mezcla de reacción se analiza para detectar la presencia de inmunocomplejos. La detección de inmunocomplejos formados entre un anticuerpo anti-HNL y el HNL presente en la muestra biológica puede lograrse mediante una variedad de técnicas conocidas, como los radioinmunoensayos (RIA) y los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Los ensayos adecuados son bien conocidos en la técnica y están ampliamente descttos en la literatura científica y de patentes (Harlow y Lane, 1988). Los ensayos que se pueden utilizar incluyen, entre otros, la técnica de inmunoensayo sándwich de doble anticuerpo monoclonal (U.S. Pat. No. 4,376,110); ensayos sándwich de anticuerpos monoclonales-policlonales (Wide L., "Solid Phase Antigen-Antibody Systems", Radioimmunoassay Methods: European Workshop September 15-171970 Edimburgo, Kirkham y Hunter, eds., (Churchill Livingston, Edimburgo, (1971)) págs.405 412; el método de "Western blot' (U.S. Pat. N° 4.452.901); inmunoprecipitación de ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem. 4980-4983m 1980); ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas; técnicas inmunocitoquímicas, incluyendo el uso de fluorocromos (Brooks et al., CHn. Exp. Immunol., 39: 477, 1980); y neutralización de la actividad (Bowen-Pope et al., Science, 226:701-703,1984). Otros inmunoensayos incluyen, entre otros, los descritos en los Nos. 3,850,752 de la Patente de EE. UU.; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4.098.876. Para fines de detección, un anticuerpo anti-HNL puede estar marcado o no marcado. Los anticuerpos no marcados se pueden usar en ensayos de aglutinación o en combinación con reactivos de detección marcados que se unen a los inmunocomplejos (p. ej., antiinmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina y anticuerpos secundarios, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, capaces de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al HNL). Si el anticuerpo anti-HNL está marcado, el grupo de detección puede ser cualquier grupo reportero adecuado conocido en la técnica, incluidos los radioisótopos, los grupos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína o rodamina), los grupos luminiscentes, las enzimas, la biotina y las partículas colorantes. Las etiquetas que son directamente detectables incluyen tintes fluorescentes o luminiscentes, metales o quelatos metálicos, etiquetas electroquímicas, radionúclidos (p. ej., 32p , l 4C, 1251, 3H o 1311), etiquetas o perlas magnéticas (p. ej., DYNABEADS), etiquetas paramagnéticas o etiquetas colorimétricas (p. ej., oro coloidal, vidrio coloreado o perlas de plástico). Dichas etiquetas detectables pueden conjugarse directamente con el anticuerpo anti-HNL o el reactivo de detección, o pueden asociarse con una perla o partícula que se adhiere al anticuerpo anti-HNL o al reactivo de detección. Las etiquetas que son detectables a través de la unión de un socio de unión específico marcado incluyen biotina, digoxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, arseniato de fenilo, ssDNA o dsDNA). Las etiquetas indirectas que pueden detectarse indirectamente por la producción de un producto de reacción detectable incluyen varias enzimas bien conocidas en la técnica, como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante, la pgalactosidasa, la xantina oxidasa, la glucosa oxidasa u otras sacáridas oxidasas, o luciferasas, que escinden el sustrato apropiado para formar un producto de reacción coloreado o fluorescente.

En ciertos ensayos, un anticuerpo anti-HNL no marcado se inmovifea sobre un soporte sólido, para su uso como "agente de captura" (o reactivo) que captura el HNL dentro de una muestra biológica. El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los expertos ordinarios en la técnica a la que se puede unir el anticuerpo. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de prueba en una placa de microttulación o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser un tubo, cordón, partícula o disco, como vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico como polietileno, polipropileno, poliestireno o cloruro de polivinilo o una matrz porosa. Otros materiales son la agarosa, el dextrano, la poliacrilamida, el nailon, el Sephadex, la celulosa o los polisacáridos. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, como los divulgados, por ejemplo, en la patente de<e>E. UU. No. 5,359,681. El anticuerpo anti-HNL inmovilizado puede ser un anticuerpo policlonal, o uno o más anticuerpos monoclonales como los descritos en este documento, o una combinación de anticuerpos policlonales y uno o más anticuerpos monoclonales. El anticuerpo puede inmovilizarse sobre el soporte sólido utilizando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia, que están ampliamente descritas en la literatura científica y de patentes. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a la asociación no covalente, como la adsorción, como a la unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace por medio de un agente de reticulación). Se contempla la inmovilización por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, la adsorción puede lograrse contactando con el anticuerpo anti-HNL, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante un período de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero suele oscilar entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, el contacto con un pocillo de una placa de microttulación de plástico (incluido el poliestireno o el cloruro de polivinilo) con una cantidad de péptido que oscila entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 10 pg, aproximadamente 100 ng y aproximadamente 1 pg, es suficiente para inmovilzar una cantidad adecuada de péptido. Después de la inmovifeación, los sitios de unión a proteínas restantes en el soporte generalmente se bloquean. Se puede utilizar cualquier agente bloqueador adecuado conocido por los expertos ordinarios en la materia, incluida la albúmina sérica bovina, Tween™ 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), suero de cabra normal (NGS) inactivado por calor o BLOTTO (solución tamponada de leche en polvo descremada que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante). A continuación, el soporte se incuba con una muestra biológica sospechosa de contener HNL. La muestra se puede aplicar sola o, más frecuentemente, se puede diluir, generalmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1% - 5,0% en peso) de proteína, como BSA, NGS o BLOTTO. En general, un tiempo de contacto adecuado (es decir, el tiempo de incubación) es un período de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que es inmunoespecífico para el HNL dentro de una muestra que contiene HNL. En algunas representaciones, el tiempo de contacto es suficiente para alcanzar un nivel de unión que es al menos alrededor del 95% del alcanzado en equilibrio entre el anticuerpo unido y no unido o el fragmento de anticuerpo. Aquellos con habilidad ordinaria en el arte reconocerán que el tiempo necesario para lograr el equilibrio puede determinarse fácilmente analizando el nivel de unión que se produce durante un período de tiempo. A temperatura ambiente, un tiempo de incubación de unos 10 a 30 minutos suele ser suficiente.

A continuación, la muestra no unida puede eliminarse lavando el soporte sólido con un tampón adecuado, como PBS que contenga 0,1% de Tween™ 20. A continuación, se puede añadir un reactivo de detección que se une al HNL en los inmunocomplejos (formado por la unión del agente de captura y el HNL de la muestra). Dicho reactivo de detección puede ser un anticuerpo policlonal, o uno o más anticuerpos monoclonales como los descritos en este documento, o una combinación de anticuerpos policlonales y uno o más anticuerpos monoclonales como los descritos en este documento o una fracción Fab de cualquier anticuerpo. El reactivo de detección puede estar marcado directamente, es decir, comprende al menos una primera molécula de etiqueta detectable o "reportera". Alternativamente, el reactivo de detección puede ser un anticuerpo anti-HNL no marcado. Este anticuerpo anti-HNL (primario) no marcado se detecta mediante la unión de un anticuerpo secundario marcado o un reactivo al anticuerpo primario. Por ejemplo, si el anticuerpo primario es una inmunoglobulina murina, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo de inmunoglobulina antimurina marcado. De manera similar, si el anticuerpo primario es una inmunoglobulina de conejo, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo de inmunoglobulina anti-conejo marcado.

El reactivo de detección se incuba con el inmunocomplejo durante un tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido o el fragmento de unión al antígeno del mismo. Por lo general, se puede determinar una cantidad apropiada de tiempo analizando el nivel de unión que se produce durante un período de tiempo. A continuación, se retira la etiqueta o el reactivo de detección no ligado y se detecta la etiqueta o el reactivo de detección encuadernado utilizando un instrumento analítico o de ensayo adecuado. El método empleado para detectar el grupo informante depende de la naturaleza del grupo informante. En el caso de las etiquetas radiactivas, el recuento de centelleo o los métodos autorradiográficos suelen ser apropiados. Los métodos espectroscópicos pueden utilizarse para detectar colorantes, fracciones luminiscentes o quimioluminiscentes y varios genes cromoscómicos, etiquetas fluorescentes y similares. La biotina puede detectarse utilizando avidina, acoplada a un grupo reportero diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos (incluyendo la peroxidasa de rábano picante, la p-galactosidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa) pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un período de tiempo específico), seguido de un análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de la reacción. Independientemente del método específico empleado, un nivel de reactivo de detección unido que sea al menos dos veces mayor que el de fondo (es decir, el nivel observado para una muestra biológica obtenida de un individuo con un nivel anormal de HNL) indica la presencia de un trastorno asociado con la expresión de HNL.

En representaciones alternativas, la muestra y el reactivo de detección pueden ponerse en contacto simultáneamente con el agente de captura, en lugar de añadirse secuencialmente. En otra alternativa, la muestra y el reactivo de detección pueden preincubarse juntos y luego agregarse al agente de captura. Otras variaciones son fácilmente evidentes para alguien con habilidad ordinaria en el arte.

En otra representación, la cantidad de HNL presente en una muestra se determina mediante un ensayo de unión competitivo. Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un patrón marcado (p. ej., un polipéptido HNL o una parte inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de la muestra de prueba (un polipéptido HNL) para unirse a una cantidad limitada de un anticuerpo anti-HNL. Tras la separación de los HNL libres y consolidados, el HNL se cuantifica relacionando la relación entre los HNL enlazados/no enlazados y los patrones definidos. La cantidad de un polipéptido HNL en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos generalmente se inmovilizan sobre un soporte sólido para que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos puedan separarse convenientemente del patrón y el analito que permanecen libres. Por lo tanto, en tales representaciones, también se contempla el contacto con una muestra biológica con HNL maduro marcado (o un fragmento marcado del mismo que conserva la antigenicidad del HNL) y un anticuerpo que se une al HNL maduro, y la detección de la cantidad de complejo HNL marcado con anticuerpos formado.

La preparación de conjugados a soportes sólidos o etiquetas detectables a menudo comprende el uso de reticulantes químicos. Los reactivos de reticulación contienen al menos dos grupos reactivos y se dividen generalmente en reticulantes homofuncionales (que contienen grupos reactivos idénticos) y reticulantes heterofuncionales (que contienen grupos reactivos no idénticos). Los reticulantes homobifuncionales que se acoplan a través de aminas, sulfhidrilos o reaccionan de forma no específica están disponibles en muchas fuentes comerciales. Las maleimidas, los haluros de alquilo y arilo, los alfá-haloacilos y los disulfuros de piridilo son grupos tiol reactivos. Las maleimidas, los haluros de alquilo y arilo y los alfahaloacilos reaccionan con los sulfuydrylos para formar enlaces de tiol éter, mientras que los disulfuros de piridilo reaccionan con los sulfuydrylos para producir disulfuros mixtos. El producto de disulfuro de piridilo es escindible.

Los reticulantes heterobifuncionales poseen dos o más grupos reactivos diferentes que permiten conjugaciones secuenciales con grupos específicos de proteínas, minimizando la polimerización o autoconjugación indeseable.

Los reactivos heterobifuncionales también se utilizan cuando la modificación de aminas es problemática. A veces se pueden encontrar aminas en los sitios activos de las macromoléculas, y la modificación de estas puede conducir a la pérdida de actividad. Otras fracciones como los sulfuydryls, los carboxilos, los fenoles y los carbohidratos pueden ser objetivos más apropiados. Una estrategia de dos pasos permite el acoplamiento de una proteína que puede tolerar la modificación de sus aminas a una proteína con otros grupos accesibles. Una variedad de reticulantes heterobifuncionales, cada uno de los cuales combina diferentes atributos para una conjugación exitosa, están disponibles comercialmente. Los reticulantes que son reactivos a la amina en un extremo y reactivos a la sulfuydrylo en el otro extremo son bastante comunes. Si se utilizan reactivos heterobifuncionales, el grupo más lábil suele reaccionar primero para garantizar una reticulación eficaz y evitar la polimerización no deseada.

En algunas representaciones, que no forman parte de la invención, los métodos para monitorizar la eficacia de la terapia con un antibiótico incluyen la monitorización de los cambios en el nivel de HNL en una muestra, o en un animal, por ejemplo, un mamífero, o un paciente humano. Los métodos de control de los niveles de HNL pueden consistir en: a) la incubación de una primera muestra biológica, obtenida de un paciente antes de un tratamiento con uno o más de los anticuerpos anti-HNL descritos en el presente documento, en la que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos; b) la detección de inmunocomplejos formados entre el HNL en la muestra biológica y los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente al HNL; y c) repetir los pasos a) y b) utilizar una segunda muestra biológica tomada del paciente en un momento posterior, como por ejemplo, después de un tratamiento con uno o más antibióticos; y d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestra biológica. Una muestra biológica para su uso dentro de estos métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que se esperaría que contuviera HNL. Las muestras biológicas ejemplares incluyen sangre, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, médula ósea, saliva y esputo. Se puede obtener una primera muestra biológica antes del inicio de la terapia o a mitad de un régimen de terapia. La segunda muestra biológica debe obtenerse de manera similar, pero en un momento posterior a la terapia adicional. La segunda muestra biológica podrá obtenerse al finalizar o a mitad de la terapia, siempre que al menos una parte de la terapia tenga lugar entre el aislamiento de la primera y la segunda muestra biológica. Por lo general, los procedimientos de incubación y detección de ambas muestras pueden realizarse como se ha descrito anteriormente. Una disminución en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra en relación con la primera muestra indica una disminución en los niveles de HNL y refleja el éxito de la terapia.

Los métodos para establecer un umbral apropiado para el diagnóstico de los estados de enfermedad descritos en este documento y el seguimiento de la terapia como se describe en este documento son bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, los niveles de HNL en una muestra de un número suficientemente representativo de sujetos normales (por ejemplo, población sana sin la afección que se va a detectar) se analizan en relación con el nivel de HNL de un número representativo suficiente de sujetos enfermos (por ejemplo, población confirmada con la enfermedad o afección) utilizando los mismos protocolos. Se puede determinar un umbral de corte que diferencie a la mayoría de la población normal de la mayoría de la población enferma. Alternativamente, se pueden determinar valores de punto final útiles para resultados negativos, inciertos y positivos a partir de los datos. Por ejemplo, se puede determinar un rango anormal (indicativo de un resultado negativo), que incluye HNL de la mayor parte de la población normal, pero que excluye a casi toda la población enferma. En consecuencia, se puede determinar un rango indicativo de un resultado positivo, que incluye el HNL de la mayoría de la población enferma, pero que excluye a casi toda la población normal. Pueden determinarse valores adecuados para el umbral a fin de optimizar la especificidad o sensibilidad deseadas, y también pueden tenerse en cuenta factores médicos y epidemiológicos generales. Entre los factores a tener en cuenta se encuentran el objetivo clínico de la prueba IVD y si es necesario tener un valor predictivo positivo alto o un valor predictivo negativo alto, así como la prevalencia de la enfermedad en la población analizada.

No forman parte de la invención los métodos para descartar una infección bacteriana, los métodos para descartar una infección viral, los métodos para descartar una infección bacteriana y los métodos para descartar una infección viral en un sujeto. En general, la concentración de polipéptidos HNL en una muestra de un paciente con una infección bacteriana es mayor que en una muestra de un paciente sano o en una muestra de un paciente con una infección viral. Por "confirmar" una infección se entiende, en consecuencia, que el sujeto tiene ese tipo de infección. Al "descartar" una infección se quiere decir que el sujeto no tiene ese tipo de infección. Por ejemplo, la concentración de polipéptidos HNL en una muestra de un paciente con una infección bacteriana se considera más alta que en una muestra de paciente sano cuando supera un umbral de una desviación estándar y media por encima de la media de la concentración en comparación con la población de pacientes sanos. Preferiblemente, la concentración de polipéptidos HNL en una muestra de paciente es mayor cuando la concentración de HNL supera un umbral de dos desviaciones estándar por encima de la media de la concentración en comparación con la población de pacientes sanos. Más preferiblemente, la concentración de polipéptidos HNL en una muestra de paciente es mayor cuando la concentración de HNL supera un umbral de tres desviaciones estándar por encima de la media de la concentración en comparación con la población de pacientes sanos.

En ciertas representaciones, que no forman parte de la invención, se dirige así al diagnóstico de infección bacteriana (es decir, dictaminar una infección bacteriana) comparando la concentración total de polipéptido HNL en la muestra biológica del paciente con un umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total y comparando la concentración del determinante en la muestra biológica del paciente con un umbral estadísticamente validado para cada determinante(s) específico(s). El umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total se basa en la concentración total de polipéptido HNL en muestras comparables obtenidas de una población control, por ejemplo, de pacientes sanos, o pacientes con una enfermedad distinta de una infección bacteriana, por ejemplo, una infección viral. El umbral estadísticamente validado para la concentración de determinantes en el/los determinante(s) específico(s) se basa en la concentración de determinante(s) en cada determinante(s) específico(s) en muestras biológicas de control comparables de una población de control, por ejemplo, de pacientes sanos o pacientes con una enfermedad distinta de la infección bacteriana. En este documento se describen varias poblaciones de control.

En ciertas representaciones que no forman parte de la invención se dirige además a descartar una infección bacteriana comparando la concentración total del polipéptido HNL en la muestra biológica del paciente con un umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total y comparando la concentración del determinante en la muestra biológica del paciente con un umbral estadísticamente validado para cada determinante(s) específico(s). El umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total se basa en la concentración total del polipéptido HNL en muestras comparables obtenidas de una población de control, por ejemplo, de pacientes con una infección bacteriana. El umbral estadísticamente validado para la concentración de determinantes en el/los determinante(s) específico(s) se basa en la concentración del determinante en cada determinante(s) específico(s) en muestras biológicas de control comparables de una población de control, por ejemplo, de pacientes con una infección bacteriana. En este documento se describen varias poblaciones de control.

Métodos para descartar una infección bacteriana, métodos para descartar una infección viral, métodos para descartar una infección bacteriana y métodos para descartar una infección viral en un sujeto pueden comprender esencialmente los siguientes pasos:

a) medir la concentración polipeptídica de HNL en una muestra obtenida de un sujeto utilzando un agente aglutinante como se define en el presente documento, o una composición o krt de diagnóstico como se define en el presente documento; y b) (i) descartar una infección bacteriana para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es inferior a un primer valor umbral predeterminado; o

b) (ii) descartar una infección viral para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es superior a un primer valor umbral predeterminado; o

b) (iii) descartar una infección bacteriana para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es superior a un primer valor umbral predeterminado; o

b) (iv) descartar una infección viral para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un primer valor umbral predeterminado.

En el contexto del descarte de una infección bacteriana, el primer umbral predeterminado puede ser un umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total, que se basa en una concentración total de polipéptido HNL en muestras biológicas de control comparables de pacientes con una infección bacteriana.

En el contexto de descarte de una infección viral, el primer umbral predeterminado puede ser un umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total, que se basa en una concentración total de polipéptido HNL en muestras biológicas de control comparables de pacientes que tienen una infección viral.

En el contexto de la determinación de una infección bacteriana, el primer umbral predeterminado puede ser un umbral estadísticamente validado para el polipéptido total de HNL, que se basa en una concentración total de polipéptido de HNL en muestras biológicas de control comparables de pacientes sanos o pacientes con una infección viral.

En el contexto de la determinación de una infección viral, el primer umbral predeterminado puede ser un umbral estadísticamente validado para el polipéptido HNL total, que se basa en una concentración total de polipéptido HNL en muestras biológicas de control comparables de pacientes sanos o pacientes con una infección bacteriana.

De acuerdo con otro aspecto, ninguna parte de la invención se refiere a un método para proporcionar una recomendación de tratamiento para un sujeto que comprende:

a) la medición de la concentración polipeptídica de HNL en una muestra obtenida de un sujeto utilizando un agente aglutinante como se define anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se define anteriormente; y

d) recomendar que el paciente reciba un tratamiento antiviral si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado como se define anteriormente.

Como parte de la invención, los umbrales estadísticamente validados están relacionados con los valores utilizados para caracterzar tanto la concentración total de HNL como la concentración de uno o más determinantes específicos en la muestra biológica obtenida del sujeto o paciente. Por lo tanto, si la concentración total de HNL o la concentración determinante es un valor absoluto, entonces el valor de control también se basa en un valor absoluto. Otros determinantes pueden ser cualquier marcador, por ejemplo, marcadores polipeptídicos o marcadores secundarios, que tienen un valor de predicción en la determinación de una infección tal como se define en el presente documento. Para estos otros determinantes, se aplican en consecuencia las definiciones proporcionadas anteriormente que conciben los valores umbral predeterminados. Los "determinantes" en el contexto de la presente invención abarcan, sin imrtación, polipéptidos, péptidos, proteínas, isoformas de proteínas (por ejemplo, isoformas de receptores señuelo). Los determinantes también pueden incluir proteínas mutadas.

En consecuencia, los "determinantes" o "determinantes" pueden abarcar uno o más de todos los polipéptidos cuyos niveles se modifican en sujetos que tienen una infección. Los determinantes individuales ejemplares pueden incluir TRAIL, IL1RA, IP10, Mac-2BP, B2M, BCA-1, CHI3L1, Eotaxin, IL1a, MCP, CD62L, VEGFR2, CHP, CMPK2, CORO1C, EIF2AK2, ISG15, RPL22Ll, RTN3, CD112, CD134, CD182, CD231, CD235A, CD335, CD337, CD45, CD49D, CD66A/C/D/E, CD73, CD84, EGFR, GPR162, HLA-A/B/C, ITGAM, NRG1, RAP1B, SELI, SPINT2, SSEA1, moléculas ligadas no específicas de IgG, IL1, 1-TAC, TNFR1, ABTB1, ADIPOR1, ARHGDIB, ARPC2, ATP6V0B, Clorf83, CD15, CES1, COROIA, CRP, CSDA, EIF4B, EPSTII, GAS 7, HERC5, IF6, KIAA0082, IFIT1, IFIT3, IFITM1, IFITM3, LIPT1, IL7R, ISG20, LOC26010, LY6E, LRDD, LTA4H, MAN1Cl, MBOAT2, MX1, NPM1, OAS2, PARP12, PARP9, QARS, RAB13, RAB31, RAC2, RPL34, PDIA6, PTEN, RSAD2, SART3, SDCBP, TRIM 22, SMAD9, SOCS3, UBE2N, XAF1 o ZBP1; así como cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, más de 1, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2o o más o todos estos determinantes. No forma parte de la presente invención, sino que además se contempla el suministro y/o uso de agentes aglutinantes contra cualquiera de los determinantes mencionados anteriormente, en particular si están presentes como polipéptidos, pero en ciertas representaciones que también incluyen moléculas de unión a ácidos nucleicos. Dicho agente aglutinante, preferiblemente un anticuerpo, se podría obtener de acuerdo con los procedimientos conocidos por la persona experta o descritos en el presente documento en el contexto de HNL, o estaría disponible en fuentes comerciales. Se puede obtener más información, por ejemplo, de Kjeldsen et al., J Biol Chem., 1993 May 15; 268(14):10425-32, ""Isolation and primary structure of NGAL, a novel protein associated with human neutrophil gelatinase".

Los determinantes también pueden abarcar factores no polipeptídicos, factores no transmitidos por la sangre o marcadores fisiológicos del estado de salud no analitos, como los "parámetros clínicos" definidos en el presente documento, así como los "factores de riesgo de laboratorio tradicionales", también definidos en el presente documento.

Por ejemplo, tal como se utiliza en el presente documento, los determinantes pueden incluir características no polipeptídicas (es decir, determinantes no polipeptídicos) como el % de neutrófilos (abreviado Neu(%)), el % de linfocitos (abreviado Lym(%)), el % de monocitos (abreviado Mon(%)), el recuento absoluto de neutrófilos (abreviado ANC) y el recuento absoluto de linfocitos (abreviado ALC), el recuento de glóbulos blancos (abreviado WBC), la edad, el sexo y la temperatura máxima (es decir, la temperatura corporal central máxima desde la aparición inicial de los síntomas).

Los determinantes también pueden incluir cualquier índice calculado creado matemáticamente o combinaciones de una o más de las mediciones anteriores, incluidas las tendencias y diferencias temporales. Cuando esté disponible, y a menos que se describa lo contrario en el presente documento, los determinantes que son productos genéticos se identifican en función de la abreviatura de la letra oficial o el símbolo del gen asignado por el Comité Internacional de Nombres de la Organización del Genoma Humano (HGNC) y se enumeran a la fecha de esta presentación en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de los Estados Unidos, también conocido como Entrez Gene. En representaciones, que no forman parte de la invención, los determinantes incluyen características polipeptídicas y no polipeptídicas. A continuación se proporcionan ejemplos de los determinantes mencionados anteriormente y previstos por la presente invención:

ABTB1: Este gen codifica una proteína con una región de repetición de anquirina y dos dominios BTB/POZ, que se cree que están involucrados en las interacciones proteína-proteína. La expresión de este gen es activada por el homólogo de fosfatasa y tensina, un supresor tumoral. El empalme alternativo da como resultado tres variantes de transcripción. Puede actuar como mediador de la vía de señalización supresora del crecimiento PTEN. Puede desempeñar un papel en los procesos de desarrollo. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

ADIPOR1: es un receptor de adiponectina globular y de longitud completa (APM1), una hormona esencial secretada por los adipocitos que actúa como antidiabético. Probablemente esté implicado en las vías metabólicas que regulan el metabolismo de los lípidos, como la oxidación de los ácidos grasos. Actúa como mediador en el aumento de la AMPK, la actividad del ligando PPARA, la oxidación de ácidos grasos y la absorción de glucosa por la adiponectina. ADIPOR1 tiene algunos receptores de alta afinidad para la adiponectina globular y receptores de baja afinidad para la adiponectina de longitud completa. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

ARHGDIB: Regula la reacción de intercambio GDP/GTP de las proteínas Rho inhibiendo la disociación del GDP de ellas, y la posterior unión de GTP a ellas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

ARPC2: Funciona como componente de unión a actina del complejo Arp2/3 que está involucrado en la regulación de la polimerización de actina y junto con un factor promotor de nucleación activador (NPF) media la formación de redes de actina ramificadas. Parece entrar en contacto con el filamento de actina madre. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

ATP6V0B: H<+>-ATPasa (ATPasa vacuolar, V-ATPasa) es un transportador enzimático que funciona para acidificar los compartimentos intracelulares en las células eucariotas. Se expresa de forma ubicua y está presente en orgánulos de endomembrana como vacuolas, lisosomas, endosomas, el aparato de Golgi, gránulos cromafines y vesículas recubiertas, así como en la membrana plasmática. H<+>- ATPasa es un complejo de múltiples subunidades compuesto por dos dominios. El dominio VI es responsable de la hidrólisis de ATP y el dominio V0 es responsable de la translocación de proteínas. Hay dos mecanismos principales de regulación de la actividad de la H<+>-ATPasa: el reciclaje de las vesículas que contienen H<+>-ATPasa hacia y desde la membrana plasmática y el montaje/desmontaje sensible a la glucosa del complejo holoenzimático. Estos transportadores juegan un papel importante en procesos como la endocitosis mediada por receptores, degradación de proteínas y transporte acoplado. Tienen una función en la reabsorción ósea y las mutaciones en el gen A3 causan osteopetrosis recesiva. Además, las H<+>-ATPasas se han implicado en la metástasis tumoral y en la regulación de la motilidad y maduración de los espermatozoides. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

B2M: los alias adicionales de B2M incluyen, entre otros, beta-2-microglobulina y CDABP0092. B2M es un componente de las moléculas MHC de clase I, que están presentes en todas las células nucleadas. La proteína codificada por este gen también codifica una isoforma presente en el suero. La proteína tiene una estructura de lámina predominantemente plisada beta que puede formar fibrillas amiloides en algunas condiciones patológicas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

BCAl: BCAl es un quimioatrayente de linfocitos B, clonado de forma independiente y llamado Angie, es una quimiocina CXC fuertemente expresada en los folículos del bazo, los ganglios linfáticos y los parches de Peyer. Promueve preferentemente la migración de linfocitos B (en comparación con las células T y los macrófagos), aparentemente estimulando la entrada de calcio y la quimiotaxis de las células que expresan el receptor 1 del linfoma de Burkitt (BLR-1). Por lo tanto, puede funcionar en la localización de linfocitos B a los folículos (proporcionado por RefSeq). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

Clorf83: Función no totalmente caracterizada. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

CD112: Este gen codifica una glicoproteína de membrana tipo I de un solo paso con dos dominios de tipo C2 similares a Ig y un dominio de tipo V similar a Ig. Esta proteína es uno de los componentes de la membrana plasmática de las uniones adherentes. También sirve como entrada para ciertas cepas mutantes del virus del herpes simple y el virus de la pseudorrabia, y está involucrado en la propagación de célula a célula de estos virus. Las variaciones en este gen se han asociado con diferencias en la gravedad de la esclerosis múltiple. Se han caracterizado variantes alternativas de empalme transcripcional, que codifican diferentes isoformas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

CD134: La proteína codificada por este gen es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Se ha demostrado que este receptor activa NF-kappaB a través de su interacción con las proteínas adaptadoras TRAF2 y TRAF5. Los estudios knockout en ratones sugirieron que este receptor promueve la expresión de los inhibidores de la apoptosis BCL2 y BCL21L1/BCL2-XL y, por lo tanto, suprime la apoptosis. Los estudios knockout también sugirieron el papel de este receptor en la respuesta de las células T CD4+, así como en la proliferación y diferenciación de las células B dependientes de las células T. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

CD15 (FUT4): El producto de este gen transfiere fucosa a polisacáridos N-acetillactosamina para generar estructuras de carbohidratos fucosilados. Cataliza la síntesis del antígeno no sialilado, Lewis x (CD15). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD182: La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G. Esta proteína es un receptor de interleucina 8 (IL8). Se une a IL8 con alta afinidad y transduce la señal a través de un sistema de segundo mensajero activado por proteína G. Este receptor también se une al ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL1/MGSA), una proteína con actividad estimulante del crecimiento del melanoma, y se ha demostrado que es un componente importante necesario para el crecimiento de las células de melanoma dependientes del suero. Este receptor media la migración de neutrófilos a los sitios de inflamación. Los efectos angiogénicos de la IL8 en las células endoteliales microvasculares intestinales están mediados por este receptor. Los estudios knockout en ratones sugirieron que este receptor controla el posicionamiento de los precursores de oligodendrocitos en el desarrollo de la médula espinal al detener su migración. Este gen, IL8RA, un gen que codifica otro receptor de IL8 de alta afinidad, así como IL8RBP, un pseudogen de IL8RB, forman un gen en una región mapeada en el cromosoma 2q33-q36. Alternativamente, se han identificado variantes empalmadas, que codifican la misma proteína. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

CD231: La proteína codificada por este gen es un miembro de la superfamilia transmembrana 4, también conocida como familia tetraspanina. La mayoría de estos miembros son proteínas de la superficie celular que se caracterizan por la presencia de cuatro dominios hidrofóbicos. Las proteínas median eventos de transducción de señales que desempeñan un papel en la regulación del desarrollo celular, activación, crecimiento y motilidad. Esta proteína codificada es una glicoproteína de la superficie celular y puede tener un papel en el control del crecimiento de neuritas. Se sabe que se acompleja con las integrinas. Este gen se asocia con el retraso mental ligado al cromosoma X y enfermedades neuropsiquiátricas como la corea de Huntington, el síndrome del cromosoma X frágil y la distrofia miotónica (proporcionado por RefSeq).

[000121] CD235a: CD235a es la principal proteína intrínseca de membrana del eritrocito. El segmento glicosilado N-terminal, que se encuentra fuera de la membrana de los eritrocitos, tiene receptores del grupo sanguíneo M. Parece ser importante para la función de SLC4A1 y es necesario para una alta actividad de SLC4A1. Puede estar implicado en la translocación de SLC4A1 a la membrana plasmática. Receptor Isa para el virus de la influenza. Receptor Isa para el antígeno 175 de unión a eritrocitos de Plasmodium falciparum (EBA-175); la unión de EB A-175 depende de los residuos de ácido siálico de los glicanos ligados a O. Parece ser un receptor del virus de la hepatitis A (VHA). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD335: Receptor activador de citotoxicidad que puede contribuir al aumento de la eficiencia de las células asesinas naturales (K) activadas para mediar la lisis de las células tumorales. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD337: La proteína codificada por este gen es un receptor natural de citotoxicidad (NCR) que puede ayudar a las células NK en la lisis de las células tumorales. La proteína codificada se conecta con CD3-zeta (CD247), un receptor de células T. Un polimorfismo de un solo nucleótido en la región 5' no traducida de este gen se ha asociado con una leve susceptibilidad a la malaria. Se han encontrado tres variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015. CD45: La proteína codificada por este gen es miembro de la familia de las proteínas tirosina fosfatasa (PTP). Se sabe que las PTP son moléculas de señalización que regulan una variedad de procesos celulares, incluido el crecimiento celular, la diferenciación, el ciclo mitótico y la transformación oncogénica. Este PTP contiene un dominio extracelular, un solo segmento transmembrana y dos dominios catalíticos intracitoplasmáticos en tándem, por lo que pertenece al tipo de receptor PTP. Este gen se expresa específicamente en las células hematopoyéticas. Se ha demostrado que este PTP es un regulador esencial de la señalización del receptor de antígenos de células T y B. Funciona a través de interacción directa con los componentes de los complejos receptores de antígenos, o mediante la activación de varias quinasas de la familia Src necesarias para la señalización del receptor de antígenos. Este PTP también suprime las quinasas JAK y, por lo tanto, funciona como un regulador de la señalización del receptor de citoquinas. Se han reportado varias variantes de transcripción empalmadas alternativamente de este gen, que codifican isoformas distintas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD49d: El producto de este gen pertenece a la familia de proteínas de la cadena alfa de las integrinas. Las integrinas son proteínas de membrana integral heterodiméricas compuestas por una cadena alfa y una cadena beta. Este gen codifica una cadena alfa 4. A diferencia de otras cadenas alfa de integrinas, alfa 4 no contiene un dominio 1 ni sufre una escisión ligada al disulfuro. La cadena alfa 4 se asocia con la cadena beta 1 o la cadena beta 7. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD62L: Este gen codifica una molécula de adhesión a la superficie celular que pertenece a una familia de receptores de adhesión/localización. La proteína codificada contiene un dominio similar a la lectina de tipo C, un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico de unión al calcio y dos repeticiones cortas similares al complemento. El producto génico es necesario para la unión y posterior rodadura de los leucocitos en las células endoteliales, facilitando su migración a los órganos linfoides secundarios y a los sitios de inflamación. Los polimorfismos de un solo nucleótido en este gen se han asociado con varias enfermedades, incluida la nefropatía por inmunoglobulina A. Alternativamente, se han encontrado variantes de transcripción empalmadas para este gen (proporcionadas por RefSeq). La proteína codificada por este gen tiene una forma soluble denominada sCD62L. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD64: Este gen codifica una glicoproteína de membrana integral conocida como receptor Fe que se une a anticuerpos monoméricos de tipo IgG con alta afinidad. Estructuralmente CD64 está compuesto por un péptido señal que permite su transporte a la superficie de una célula, tres dominios de inmunoglobulina extracelular del tipo C2 que utiliza para unirse al anticuerpo, un dominio transmembrana hidrofóbico y una cola citoplasmática corta. CD64 se encuentra constitutivamente solo en macrófagos y monocitos. El tratamiento de leucocitos polimorfonucleares con citocinas como IFNy y G-CSF puede inducir la expresión de CD64 en estas células. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD66a: Este gen codifica un miembro de la familia de genes de antígenos carcinoembrionarios (CEA), que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Dos subgrupos de la familia CEA, las moléculas de adhesión celular CEA y las glicoproteínas específicas del embarazo, se encuentran dentro de un plumero de 1.2 Mb en el brazo largo del cromosoma 19. Once pseudogenes del subgrupo de moléculas de adhesión celular CEA también se encuentran en el plumero. La proteína codificada se describió originalmente en los conductos biliares del hígado como glicoproteína biliar. Posteriormente, se descubrió que era una molécula de adhesión célula-célula detectada en leucocitos, epitelios y endotelios. La proteína codificada media la adhesión celular a través de la unión homofílica y heterófila a otras proteínas del subgrupo. Se han atribuido múltiples actividades celulares a la proteína codificada, incluyendo roles en la diferenciación y disposición de la estructura tridimensional del tejido, la angiogénesis, la apoptosis, la supresión tumoral, la metástasis y la modulación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Se han descrito múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD66c: Antígeno carcinoembrionario (CEA; MIM 114890) es uno de los marcadores tumorales más utilizados en las determinaciones séricas de carcinoma por inmunoensayo. Una aparente falta de especificidad absoluta del cáncer para el CEA probablemente se deba en parte a la presencia en tejidos normales y neoplásicos de antígenos que comparten determinantes antigénicos con la forma de 180 kD de CEA (Barnett et al, 1988 (PubMed 3220478)). Para obtener información general sobre la familia de genes CEA, consulte CEACAMl (MIM 109770). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD66d: Este gen codifica un miembro de la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAMs), que son utilizadas por varios patógenos bacterianos para unirse e invadir las células huésped. La proteína transmembrana codificada dirige la fagocitosis de varias especies bacterianas que dependen de la pequeña GTPasa Rac. Se cree que desempeña un papel importante en el control de patógenos específicos de humanos por parte del sistema inmunitario innato. Alternativamente, se han descrito variantes de transcripción empalmadas, pero no se ha determinado su validez biológica. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD66e: un miembro de la subfamilia CEACAM, sirve como una glicoproteína de superficie que desempeña un papel en la adhesión celular y en la señalización intracelular. CD66e también sirve como receptor para las adhesinas Dr de E. coli. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015. CD73: La proteína codificada por este gen es una proteína de la membrana plasmática que cataliza la conversión de nucleótidos extracelulares en nucleósidos permeables a la membrana. La proteína codificada se utiliza como determinante de la diferenciación de linfocitos. Los defectos en este gen pueden conducir a la calcificación de articulaciones y arterias. Se han encontrado dos variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD84: CD84 desempeña un papel como receptor de adhesión que funciona mediante interacciones homofílicas y por agrupamiento. Recluta proteínas que contienen el dominio SH2 SH2D1 A SAP. Aumenta las respuestas proliferativas de las células T activadas y SH2D 1A SAP no se ve necesario para este proceso. Las interacciones homofílicas aumentan la secreción de interferón gamma/IFNG en los linfocitos e inducen la estimulación plaquetaria a través de una vía dependiente de SH2D1 A/SAP. CD84 también puede servir como marcador de células progenitoras hematopoyéticas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CD8A: El antígeno CD8 es una glicoproteína de la superficie celular que se encuentra en la mayoría de los linfocitos T citotóxicos y que media interacciones eficientes entre células dentro del sistema inmunitario. El antígeno CD8 actúa como un corepresor con el receptor de células T en el linfocito T para reconocer los antígenos mostrados por una célula presentadora de antígenos (APC) en el contexto de las moléculas MHC de clase I. El correceptor funciona como un homodímero compuesto por dos cadenas alfa, o como un heterodímero compuesto por una cadena alfa y una cadena beta. Tanto las cadenas alfa como las beta comparten una homología significativa con las cadenas ligeras variables de inmunoglobulina. Este gen codifica las isoformas de la cadena alfa CD8. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CES1: Interviene en la desintoxicación de xenobióticos y en la activación de profármacos éster y amida. Hidroliza ésteres aromáticos y alifáticos, pero no tiene actividad catalítica hacia amidas o un éster graso de acil-CoA. Hidroliza el grupo éster metílico de la cocaína para formar benzoilecgonina. Cataliza la transesterificación de la cocaína para formar cocaetileno. Muestra actividad de éster etílico sintasa de ácidos grasos, catalizando la esterificación etílica del ácido oleico a etiloleato. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CHBL1: quitinasa 3-like 1 (glicoproteína-39 del cartílago); Los alias adicionales de CHI3Ll incluyen sin imitación ASRT7, CGP-39, GP-39, GP39, HC-gp39, HCGP-3P, YKL-40, YKL40, YYL-40 y hCGP-39. Las quitinasas catalizan la hidrólisis de la quitina, que es un glicopolímero abundante que se encuentra en los exoesqueletos de los insectos y en las paredes celulares de los hongos. La familia de quitinasas glucósido hidrolasa 18 incluye ocho miembros de la familia humana. Este gen codifica un miembro de la glicoproteína de la familia de la glicosilhidrolasa 18 que carece de actividad quitinasa y puede ser secretado por macrófagos activados, condrocitos, neutrófilos y células sinoviales. CHI3L1 inhibe la lesión pulmonar inducida por oxidantes, aumenta la inmunidad adaptativa Th2, regula la apoptosis, estimula la activación alternativa de macrófagos y contribuye a la fibrosis y la cicatrización de heridas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CHP: Este gen codifica una fosfoproteína que se une al intercambiador de Na+/H+ NHE1. Esta proteína sirve como un cofactor esencial que apoya la actividad fisiológica de los miembros de la familia NHE y puede desempeñar un papel en la regulación mitogénica de NHEl. La proteína comparte similitud con la calcineurina B y la calmodulina y también se sabe que es un inhibidor endógeno de la actividad de la calcineurina (proporcionado por RefSeq). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CMPK2: Este gen codifica una proteína que puede participar en la síntesis de dUTP y dCTP en las mitocondrias. Es capaz de fosforilar dUMP, dCMP, CMP, UMP y monofosfatos de los análogos de nucleósidos de pirimidina ddC, dFdC, araC, BVDU y FdUrd con ATP como donante de fosfato. La eficacia es más alta para dUMP seguido de dCMP; CMP y UMP son sustratos pobres. Puede estar implicado en la depleción del ADNmt causada por el tratamiento a largo plazo con ddC u otros análogos de pirimidina. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CORO1A: Puede ser un componente crucial del citoesqueleto de células altamente móviles, funcionando tanto en la invaginación de grandes trozos de membrana plasmática, como en la formación de protuberancias de la membrana plasmática implicadas en la locomoción celular. En las células infectadas por micobacterias, su retención en la membrana fagosomal impide la fusión entre fagosomas y lisosomas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

CRP: proteína C reactiva. La proteína codificada por este gen pertenece a la familia de las pentaxinas. Está involucrado en varias funciones relacionadas con la defensa del huésped basadas en su capacidad para reconocer patógenos extraños y células dañadas del huésped e iniciar su eliminación mediante la interacción con los sistemas efectores humorales y celulares en la sangre. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre,

2015.

CSDA: Se une al promotor del GM-CSF y parece actuar como un represor. Se une también a ARNm de longitud completa y a secuencias cortas de ARN que contienen el sitio de consenso 5' UCCAUCA-3'. Puede tener un papel en la represión de la traducción. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

EGFR: La proteína codificada por este gen es una glicoproteína transmembrana que es miembro de la superfamilia de las proteínas quinasas. Esta proteína es un receptor para los miembros de la familia de los factores de crecimiento epidérmico. El EGFR es una proteína de la superficie celular que se une al factor de crecimiento epidérmico. La unión de la proteína a un ligando induce la dimerización del receptor y la autofosforilación de la tirosina y conduce a la proliferación celular. Las mutaciones en este gen se asocian con el cáncer de pulmón. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción empalmadas altemativamente que codifican diferentes isoformas de proteínas para este gen.

GPR162: Este gen se identificó mediante el análisis genómico de una región densa en genes en el cromosoma 12p 13 humano. Parece expresarse principalmente en el cerebro; sin embargo, se desconoce su función. Se han identificado variantes de transcripción empalmadas alternativamente que codifican diferentes isoformas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

EIF2AK2: EIF2AK2 es una proteína serina/treonina quinasa que adquiere actividad enzimática tras la autofosforilación, un proceso mediado por ARN bicatenario (dsR A). Los alias adicionales incluyen sin imitación: PKR, PRKR, EIF2AK1, proteína quinasa, dependiente de ARN bicatenario inducible por interferón, quinasa p68, etc. La activación de EIF2AK2 permite a la quinasa fosforilar su sustrato natural, la subunidad alfa del factor de iniciación de la síntesis de proteínas eucariotas-2 (EIF2-alfa; MIM 603907), lo que conduce a la inhibición de la síntesis de proteínas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

EIF4B: Necesario para la unión del ARNm a los ribosomas. Funciones en estrecha asociación con EIF4-F y EIF4-A. Se une cerca de la tapa terminal 5' del ARNm en presencia de EIF-4F y ATP. Promueve la actividad de la ATPasa y la actividad de desenrollado del ARN dependiente de ATP tanto de EIF4-A como de EIF4-F. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

Eotaxina: Este gen es uno de varios genes de citocinas Cys-Cys (CC) agrupados en el brazo q del cromosoma 17. Las citoquinas son un área de proteínas secretadas que participan en procesos inmunorreguladores e inflamatorios. Las citoquinas CC son proteínas caracterizadas por dos cisteínas adyacentes. La citoquina codificada por este gen muestra actividad quimiotáctica para los eosinófilos, pero no para las células mononucleares ni los neutrófilos. Se supone que esta quimiocina específica de eosinófilos está implicada en enfermedades inflamatorias eosinofílicas como la dermatitis atópica, la rinitis alérgica, el asma y las infecciones parasitarias. En respuesta a la presencia de alérgenos, esta proteína promueve directamente la acumulación de eosinófilos, una característica destacada de las reacciones inflamatorias alérgicas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015. EPSTII: La función aún no estaba completamente caracterizada. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

GAS7: La detención del crecimiento específica 7 se expresa principalmente en las células cerebrales terminalmente diferenciadas y predominantemente en las neuronas de Purkinje cerebelosas maduras. GAS7 desempeña un papel putativo en el desarrollo neuronal. Se han descrito varias variantes de transcripción que codifican proteínas que varían en el extremo N-terminal. Podría desempeñar un papel en la promoción de la maduración y la diferenciación morfológica de las neuronas cerebelosas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

HERC5: ligasa E3 mayor para la conjugación ISG15. Actúa como regulador positivo de la respuesta antiviral innata en las células inducida por el interferón. Forma parte de la maquinaria de ISGilación que reconoce proteínas diana de forma amplia y relativamente inespecífica. Cataliza la ISGilación de IRF3, lo que da lugar a una activación sostenida. Atenúa la interacción IRF3-PIN1, lo que antagoniza la ubiquitinación y degradación de IRF3, y aumenta la respuesta antiviral. Cataliza la ISGilación del virus de la influenza A NS1 que atenúa la virulencia; la NS1 ISGilada no logra formar homodímeros y, por lo tanto, conectarse con sus dianas de ARN. Cataliza la ISGilación de la proteína LI del virus del papiloma tipo 16, lo que da lugar a un efecto dominante-negativo sobre la infectividad del virus. Asociado físicamente con los polirribosomas, modifica ampliamente las proteínas recién sintetizadas de manera co-traduccional. En una célula estimulada por interferón, las proteínas virales recién traducidas son dianas primarias de ISG15. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

HLA-A: HLA-A pertenece a los parálogos de cadena pesada HLA clase I. Esta molécula de clase I es un heterodímero formado por una cadena pesada y una cadena ligera (microglobulina beta-2). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I desempeñan un papel central en el sistema inmunitario al presentar péptidos derivados de la luz del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón 1 codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfal y alfa2, que se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa3, el exón 5 codifica la región transmembrana y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplasmática. Los polimorfismos dentro del exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión al péptido de cada molécula de clase uno. La tipificación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para el trasplante de médula ósea y riñón. Se han descrito cientos de alelos HLA-A. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

HLA-B: HLA-B pertenece a los parálogos de cadena pesada HLA clase I. Esta molécula de clase I es un heterodímero formado por una cadena pesada y una cadena ligera (microglobulina beta-2). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I desempeñan un papel central en el sistema inmunitario al presentar péptidos derivados de la luz del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón 1 codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios alfa1 y alfa2, que se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa3, el exón 5 codifica la región transmembrana y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplasmática. Los polimorfismos dentro del exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión al péptido de cada molécula de clase uno. La tipificación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para el trasplante de médula ósea y riñón. Se han descrito cientos de alelos HLA-B. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

HLA-C: HLA-C pertenece a los parálogos de cadena pesada HLA clase I. Esta molécula de clase I es un heterodímero formado por una cadena pesada y una cadena ligera (microglobulina beta-2). La cadena pesada está anclada en la membrana. Las moléculas de clase I juegan un papel central en el sistema inmunológico al presentar péptidos derivados de la cavidad del retículo endoplásmico. Se expresan en casi todas las células. La cadena pesada es de aproximadamente 45 kDa y su gen contiene 8 exones. El exón uno codifica el péptido líder, los exones 2 y 3 codifican el dominio alfal y alfa2, que se unen al péptido, el exón 4 codifica el dominio alfa3, el exón 5 codifica la región transmembrana y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplasmática. Los polimorfismos dentro del exón 2 y el exón 3 son responsables de la especificidad de unión al péptido de cada molécula de clase uno. La tipificación de estos polimorfismos se realiza de forma rutinaria para el trasplante de médula ósea y riñón. Se han descrito más de cien alelos HLA-C. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

IFI6: Este gen se identificó por primera vez como uno de los muchos genes inducidos por el interferón. La proteína codificada puede desempeñar un papel fundamental en la regulación de la apoptosis. Un mini satélite que consta de 26 repeticiones de un elemento repetidor de 12 nucleótidos que se asemeja a la secuencia de consenso del donante de empalme de mamíferos comienza cerca del final del segundo exón. Alternativamente, se han descrito variantes de transcripción empalmadas que codifican diferentes isoformas utilizando las dos unidades de repetición posteriores como sitios donantes de empalme. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

IFIT1: Proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

IFIT3: La función aún no se ha caracterizado completamente. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

iFit M1: Proteína antiviral inducida por IFN que media la inmunidad innata celular frente a al menos tres patógenos humanos principales, principalmente, el virus de la influenza A HlNl, el virus del Nilo Occidental y el virus del dengue mediante la inhibición de los primeros pasos de replicación. Desempeña un papel clave en la acción antiproliferativa del IFN-gamma, ya sea inhibiendo la activación de ERK o deteniendo el crecimiento celular en fase Gl de una manera dependiente de p53. Implicado en el control del crecimiento celular. Componente de un complejo multimérico implicado en la transducción de señales de adhesión antiproliferativas y homotípicas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

IFITM3 IFITM2: Proteína antiviral inducida por IFN que media la inmunidad celular innata frente a al menos tres patógenos humanos principales, principalmente, el virus de la influenza A H1N1, el virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (VNO), mediante la inhibición de los primeros pasos de replicación. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

<i>L1 a: La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia de las citoquinas de la interleucina I. Esta citocina es una citocina pleiotrópica involucrada en diversas respuestas inmunes, procesos inflamatorios y hematopoyesis. Esta citoquina puede ser producida por monocitos y macrófagos como una proproteína, que se procesa proteolíticamente y se libera en respuesta a la lesión celular y, por lo tanto, induce la apoptosis. Este gen y otros ocho genes de la familia de la interleucina I forman un gen de citocinas en el cromosoma 2. Las proteínas IL-I están involucradas en la respuesta inflamatoria, identificándose como pirógenos endógenos, y se informa que estimulan la liberación de prostaglandinas y colagenasas de las células sinoviales. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

IL1RA: La proteína codificada por este gen es un receptor de citoquinas que pertenece a la familia de receptores de interleucina 1. Esta proteína es un receptor de interleucina alfa (IL1A), interleucina beta (IL1B) y receptor de interleucina 1, tipo I (ILIRI/ILIRA). Es un mediador importante implicado en muchas respuestas inmunitarias e inflamatorias inducidas por citoquinas. Los nombres adicionales del gen incluyen, entre otros: CD121A, IL-1RT1, p80, antígeno CD121a, CD121A, IL1R e IL1 ra. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

IL6: Este gen codifica una citoquina que funciona en la inflamación y la maduración de las células B. Además, se ha demostrado que la proteína codificada es un pirógeno endógeno capaz de inducir fiebre en personas con enfermedades autoinmunes o infecciones. La proteína se produce principalmente en sitios de inflamación aguda y crónica, donde se secreta en el suero e induce una respuesta inflamatoria transcripcional a través del receptor de interleucina 6, alfa. El funcionamiento de este gen está implicado en una amplia variedad de estados patológicos asociados a la inflamación, incluida la susceptibilidad a la diabetes mellitus y la artritis reumatoide juvenil sistémica. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

IL7R: La proteína codificada por este gen es un receptor de interleucina 7 (IL7). La función de este receptor requiere el receptor de interleucina 2, cadena gamma (IL2RG), que es una cadena gamma común compartida por los receptores de varias citocinas, incluidas las interleucinas 2, 4, 7, 9 y 15. Se ha demostrado que esta proteína desempeña un papel fundamental en la recombinación de V(D)J durante el desarrollo de linfocitos. También se ha descubierto que esta proteína controla la accesibilidad del locus gamma TCR mediante STATS y acetilación de histonas. Los estudios knockout en ratones sugirieron que el bloqueo de la apoptosis es una función esencial de esta proteína durante la diferenciación y activación de los linfocitos T. Los defectos funcionales de esta proteína pueden estar asociados a la patogénesis de la inmunodeficiencia combinada grave (IDCG). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank 0 Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

IL-8: La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia de las quimiocinas CXC. Los alias adicionales de IL-8 incluyen sin imitación: Interleucina 8, K60, CXCL8, SCYB8, GCP-1, TSG-1, MDNCF, b-ENAP, MONAP, factor quimiotáctico 1 de macrófagos alveolares, NAP-1, péptido activador de neutrófilos derivado de células endoteliales beta, GCPl, proteína similar a la beta-tromboglobulina, LECT, ligando 8 de quimiocina (motivo C-X-C), LUCCT, emoctaquina, LYNAP, interleucina-8, NAF, proteína quimiotáctica derivada del carcinoma de células gigantes de pulmón, NAP1, péptido activador de neutrófilos derivado de linfocitos, IL-8, péptido activador de neutrófilos 1, proteína quimiotáctica de granulocitos 1, pequeña subfamilia B de citocinas inducibles, miembro 8, factor quimiotáctico de neutrófilos derivado de monocitos, gen 1 inducido por factor de necrosis tumoral, péptido activador de neutrófilos derivado de monocitos, Emoctakin, Factor quimiotáctico de células T, quimiocina 8 con motivo C-X, 3-l0C, proteína activadora de neutrófilos 1, AMCF-1 y proteína 3-1OC. Esta quimiocina es uno de los principales mediadores de la respuesta inflamatoria. Esta quimiocina es secretada por varios tipos de células. Funciona como quimioatrayente y también es un potente factor angiogénico. Se cree que este gen desempeña un papel en la patogénesis de la bronquiolitis, una enfermedad común del tracto respiratorio causada por una infección viral. Este gen y otros diez miembros de la familia de genes de quimiocinas CXC forman un plumero de genes de quimiocinas en una región asignada al cromosoma 4q. La IL-8 es un factor quimiotáctico que atrae a los neutrófilos, basófilos y células T, pero no a los monocitos. T ambién interviene en la activación de los neutrófilos. La IL-8(6-77) tiene una actividad 5-10 veces mayor en la activación de neutrófilos, la IL-8(5-77) tiene una mayor actividad en la activación de neutrófilos y la IL-8(7-77) tiene una mayor afinidad por los receptores CXCRl y CXCR2 en comparación con la IL-8(1-77), respectivamente. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

IP10: Este gen codifica una quimiocina de la subfamilia CXC y ligando para el receptor CXCR3. La unión de esta proteína a CXCR3 da lugar a efectos pleiotrópicos, incluida la estimulación de los monocitos, la migración de células asesinas naturales y T, y la modulación de la expresión de la molécula de adhesión. Los nombres adicionales del gen incluyen, sin limitaciones: CXCL10, Gamma-IP 10, INP10 y ligando 10 de quimiocinas (motivo C-X-C). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

ISG15: modificador similar a la ubiquitina ISG15; Los alias adicionales de ISG15 incluyen, entre otros, G1P2, IFI15, IP17, UCRP y hUCRP. Esta proteína similar a la ubiquitina se conjuga con proteínas diana intracelulares después de la estimulación con IFN-alfa o IFN-beta. Su vía enzimática es parcialmente distinta de la de la ubiquitina, diferenciándose en la especificidad del sustrato y la interacción con las enzimas de ligadura. La vía de conjugación ISG15 utiliza una enzima E1 dedicada, pero parece converger con la vía de conjugación Ub a nivel de una enzima E2 específica. Los objetivos incluyen STAT1, SERPINA3G/SPI2A, JAKl, MAPK3/ERK1, PLCGl, EIF2AK2/PKR, MXl/MxA y RIG-1. Muestra actividad quimiotáctica específica hacia los neutrófilos y los activa para inducir la liberación de factores quimiotácticos eosinófilos. Puede servir como un factor de unión trans que dirige la asociación de proteínas diana ligadas a filamentos intermedios. También puede estar implicado en mecanismos autocrinos, paracrinos y endocrinos, como en la señalización de célula a célula, posiblemente en parte mediante la inducción de la secreción de IFN-gamma por monocitos y macrófagos. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015. ITGAM: Este gen codifica la cadena alfa M de la integrina. Las integrinas son proteínas heterodiméricas integrales de membrana compuestas por una cadena alfa y una cadena beta. Esta integrina alfa que contiene el dominio 1 se combina con la cadena beta 2 (ITGB2) para formar una integrina específica de leucocitos denominada receptor de macrófagos 1 («Mac-1») o receptor 3 («CR3») de C3b inactivado (iC3b). La integrina alfa M beta 2 es importante en la adherencia de neutrófilos y monocitos al endotelio estimulado, y también en la fagocitosis de partículas recubiertas de complemento. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen.

Mac-2-BP: Los alias adicionales de MAC-2-BP incluyen, entre otros, LGALS3BP, 90K, proteína sérica 90K, BTBDl 7B, M2BP y lectina, proteína de unión a galactósidos, soluble, de unión a 3. Las galectinas son un área de proteínas de unión a beta-galactósidos implicadas en la modulación de las interacciones célula-célula y célula-matriz. Se encontró que los niveles de MAC-2-BP estaban elevados en el suero de pacientes con cáncer. Parece estar implicado en la respuesta inmunitaria asociada con la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) y las células asesinas activadas por linfocinas (LAK). La proteína nativa puede unirse específicamente a una lectina asociada a macrófagos humanos conocida como Mac-2, así como a la galectina 1. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

MCP: La proteína codificada por este gen es una proteína de membrana tipo I y es una parte reguladora del sistema del complemento. La proteína codificada tiene actividad cofactora para la inactivación de los componentes del complemento C3b y C4b por el factor I sérico, que protege a la célula huésped del daño por el complemento. Además, la proteína codificada puede actuar como receptor para la cepa Edmonston del virus del sarampión, el herpesvirus humano-6 y los pili tipo IV de la Neisseria patógena. La proteína codificada por este gen puede estar implicada en la fusión de los espermatozoides con el ovocito durante la fecundación. Las mutaciones en este locus se han asociado con la susceptibilidad al síndrome urémico hemolítico. Alternativamente, se han descrito variantes de transcripción empalmadas que codifican diferentes isoformas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

ISG20: Exonucleasa con especificidad para el ARN monocatenario y, en menor medida, para el ADN. Degrada el ARN a una velocidad aproximadamente 35 veces mayor que su tasa para el ADN monocatenario. Implicado en la función antiviral del IFN contra los virus de ARN.

KIAA0082 (FTSJD2): Metiltransferasa dependiente de S-adenosil-L-metionina que media la metilación de la capl 2'-0-ribosa del ARNm a la estructura de la tapa 5' de los ARNm. Metila la ribosa del primer nucleótido de un ARNm con m(7)GpppG para producir m(7)GpppNmp (capí). La modificación de mayúsculas está relacionada con niveles más altos de traducción. Puede estar implicado en la vía de respuesta al interferón. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

LIPTl: El proceso de transferencia de ácido lipoico a las proteínas es un proceso de dos pasos. El primer paso es la activación del ácido lipoico por la enzima activadora del lipoato para formar el AMP lipoil. Para el segundo paso, la proteína codificada por este gen transfiere la fracción de lipoilo a apoproteínas. El empalme alternativo en la UTR 5' de este gen da como resultado cinco variantes de transcripción que codifican la misma proteína. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

LOC26010(Sp a TS2): La función aún no estaba completamente caracterizada. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

LRDD: La proteína codificada por este gen contiene un dominio de repetición y muerte rico en leucina. Se ha demostrado que esta proteína se conecta con otras proteínas del dominio de la muerte, como la asociada a Fas (TNFRSF6) a través del dominio de la muerte (FADD) y la proteína que contiene el dominio de la muerte activadora de la quinasa MAP (MADD), y por lo tanto puede funcionar como una proteína adaptadora en los procesos de señalización relacionados con la muerte celular. Se ha encontrado que la expresión de la contraparte de ratón de este gen está regulada positivamente por el supresor tumoral p53 e induce la apoptosis celular en respuesta al daño del ADN, lo que sugiere un papel de este gen como efector de la apoptosis dependiente de p53. El empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcripción. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

LTA4H: Hidroliza una fracción de epóxido de leucotrieno A4 (LTA-4) para formar leucotrieno B4 (LTB-4). La enzima también tiene cierta actividad peptidasa. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

LY6E: La función aún no estaba completamente caracterizada. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

MANI C I: Las manosidasas se dividen en dos subtipos; I e Il, (números CE 3.2.1.113 y 3.2.1.114 respectivamente) que muestran un patrón de expresión amplio. La manosidasa I hidroliza los residuos de alfa-D-manosa ligados a (1,2) en el oligosacárido Man9(GlcNAc)2 y la manosidasa II hidroliza los residuos de alfa-D-manosa ligados a (1,3)- y (1,6) en Man5(GlcNAc)3. Ambos subtipos requieren un cofactor catiónico divalente. Las mutaciones en las manosidasas pueden causar manosidosis (deficiencia de manosidasa I). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

MBOAT2: Aciltransferasa que media la conversión de lisofosfatidil-etanolamina (1-acil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina o LPE) en fosfatidil-etanolamina (l,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina o PE) (actividad LPEAT). Cataliza también la acilación del ácido lisofosfatídico (LPA) en ácido fosfatídico (PA) (actividad LPAAT). También tiene una lisofosfatidil-colina aciltransferasa muy débil (actividad LPCAT). Prefiere el oleoil-CoA como donante de acilo. Las aciltransferasas de lisofosfolípidos (LPLAT) catalizan el paso de reacilación de la vía de remodelación de los fosfolípidos, también conocida como ciclo de Land. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

MXI/MXA: En el ratón, la proteína Mx inducible por interferón es responsable de un estado antiviral específico contra la infección por el virus de la influenza. La proteína codificada por este gen es similar a la proteína del ratón, determinada por su relación con el antígeno, las condiciones de inducción, las propiedades fisicoquímicas y el análisis de aminoácidos. Esta proteína citoplasmática es miembro tanto de la familia de las dinaminas como de la familia de las GTPasas grandes. Se han encontrado dos variantes de transcripción que codifican la misma proteína para este gen. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

NPMl: Está implicado en diversos procesos celulares como la biogénesis de ribosomas, la duplicación de centrosomas, el acompañamiento de proteínas, el ensamblaje de histonas, la proliferación celular y la regulación de los supresores tumorales TP53/p53 y ARF. Se une al ribosoma, presumiblemente, para impulsar la exportación nuclear de ribosomas. Se asocia con estructuras ribonucleoproteicas nucleolares y se une a ácidos nucleicos monocatenarios. Actúa como chaperonina para las histonas centrales H3, H2B y H4. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

NRG1: La proteína codificada por este gen se identificó originalmente como una glicoproteína de 44 kD que se conecta con la tirosina quinasa del receptor NEU/ERBB2 para aumentar su fosforilación en los residuos de tirosina. Esta proteína es una proteína de señalización que media las interacciones entre las células y desempeña un papel fundamental en el crecimiento y desarrollo de múltiples sistemas de órganos. Se sabe que a partir de este gen se produce una extraordinaria variedad de isoformas diferentes mediante el uso de promotores alternativos y el empalme. Estas isoformas se expresan específicamente en el tejido y difieren significativamente en su estructura, por lo que se clasifican en los tipos I, II, III, IV, V y VI. La desregulación genética se ha relacionado con enfermedades como el cáncer, la esquizofrenia y el trastorno bipolar (TLP). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

OAS2: Este gen codifica un miembro de la familia de las sintetasas 2-5A, proteínas esenciales implicadas en la respuesta inmunitaria innata a la infección viral. La proteína codificada es inducida por interferones y utiliza trifosfato de adenosina en reacciones de transferencia de 2 nucleótidos específicos para sintetizar 2',5'-oligoadenilatos (2-5 As). Estas moléculas activan la ARNasa L latente, lo que da lugar a la degradación del ARN viral y a la inhibición de la replicación viral. Los tres miembros conocidos de esta familia de genes se encuentran en un plumero en el cromosoma 12. Alternativamente, se han descrito variantes de transcripción empalmadas que codifican diferentes isoformas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

PARP9: La poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) cataliza la modificación postraduccional de las proteínas mediante la adición de múltiples fracciones de ADP-ribosa. PARP transfiere ADP-ribosa del dinucleótido de nicotinamida (NAD) a residuos de glu/asp en la proteína sustrato, y también polimeriza ADP-ribosa para formar polímeros de cadena larga/ramificada. Los inhibidores de PARP se están desarrollando para su uso en una serie de patologías, como el cáncer, la diabetes, los accidentes cerebrovasculares y las enfermedades cardiovasculares. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

PARP12: La poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) cataliza la modificación postraduccional de las proteínas mediante la adición de múltiples fracciones de ADP-ribosa. PARP transfiere ADP-ribosa del dinucleótido de nicotinamida (NAD) a residuos de glu/asp en la proteína sustrato, y también polimeriza ADP-ribosa para formar polímeros de cadena larga/ramificada. Los inhibidores de PARP se están desarrollando para su uso en una serie de patologías, como el cáncer, la diabetes, los accidentes cerebrovasculares y las enfermedades cardiovasculares. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

PCT: La procalcitonina (PCT) es un péptido precursor de la hormona calcitonina, esta última implicada en la homeostasis del calcio. Los niveles de procalcitonina aumentan en respuesta a un estímulo proinflamatorio. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

PDIA6: Las proteínas isomerasas disulfuro (EC 5.3.4.1), como la PDIA6, son proteínas residentes en el retículo endoplásmico (RE) que catalizan la formación, reducción e isomerización de enlaces disulfuro en proteínas y se cree que desempeñan un papel en el plegamiento de proteínas unidas a disulfuro. Podría funcionar como una chaperona que inhibe la agregación de proteínas mal plegadas. Desempeña un papel en la agregación plaquetaria y la activación por agonistas como la convulxina, el colágeno y la trombina. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

Procalcitonina: Es un péptido precursor de la hormona calcitonina, que está involucrada en la homeostasis del calcio. El nivel de procalcitonina aumenta en respuesta a un estímulo proinflamatorio, especialmente de origen bacteriano. En este caso, es producida principalmente por las células del pulmón y el intestino. No aumenta significativamente con inflamaciones virales o no infecciosas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015

PTEN: Supresor de tumores. Actúa como una proteína fosfatasa de doble especificidad, fosforilando tirosina, serina y treonina. También actúa como fosfatasa lipídica, eliminando el fosfato en la posición D3 del anillo de inositol del fosfatidilinositol (PI) 3,4,5-trifosfato, PI 3,4-difosfato, PI 3-fosfato e inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato con orden de preferencia de sustrato in vitro Ptdins(3,4,5)P3 > Ptdins(3,4)P2 > Ptdins3P > Ins(l,3,4,5)P4. La actividad de la fosfatasa lipídica es crítica para su función supresora de tumores. Antagoniza la vía de señalización PBK-AKT/PKB mediante la desfosforilatación de fosfoinositidos y, por lo tanto, modula la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular. La forma no fosforilada coopera con AIP1 para suprimir la activación de AKT1. Defosforila la quinasa de adhesión focal fosforilada por tirosina e inhibe la migración celular y la propagación celular mediada por integrinas y la formación de adhesión focal. Desempeña un papel como modulador clave de la vía de señalización AKT-mTOR controlando el ritmo del proceso de integración de las neuronas recién nacidas durante la neurogénesis adulta, incluido el posicionamiento correcto de las neuronas, el desarrollo dendrítico y la formación de sinapsis. Puede ser un regulador negativo de la señalización de la insulina y del metabolismo de la glucosa en el tejido adiposo. La forma nuclear monoubiquitinada posee un mayor potencial apoptótico, mientras que la forma citoplasmática no ubiquitinada induce una menor capacidad supresora de tumores. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RAB13: podría participar en el transporte polarizado, en el montaje y/o en la actividad de uniones estrechas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RAP1B: Proteína de unión a g Tp que posee actividad GTPasa intrínseca. Contribuye a la actividad polarizante de KRIT1 y CDH5 en el establecimiento y mantenimiento de la correcta polaridad de las células endoteliales y la cavidad vascular. Necesario para la localización de PRKCZ, PARD3 y TIAM1 fosforilados en la unión celular. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

RTN3: Puede estar implicado en el tráfico de membranas en la vía secretora temprana. Inhibe la actividad de BACE1 y el procesamiento de proteínas precursoras amiloides. Puede inducir la cascada de caspasa-8 y la apoptosis. Puede favorecer la translocación de BCL2 a las mitocondrias ante el estrés del retículo endoplásmico. En caso de infección por enterovirus, RTN3 puede estar implicado en la replicación o patogénesis viral. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

SAA: codifica un miembro de la familia de lipoproteínas apo amiloide A sérica. La proteína codificada es una proteína de fase aguda importante que se expresa en gran medida en respuesta a la inflamación y la lesión tisular. Esta proteína también juega un papel importante en el metabolismo de las HDL y la homeostasis del colesterol. Los niveles altos de esta proteína se asocian con enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis, la artritis reumatoide, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Crohn. Esta proteína también puede ser un biomarcador potencial para ciertos tumores. El empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcripción que codifican la misma proteína. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

QARS: Las aminoacil-ARNt sintetasas catalizan la aminoacilación del ARNt por su aminoácido afín. Debido a su papel central en la unión de aminoácidos con tripletes de nucleótidos contenidos en ARNt, se cree que las aminoacil-ARNt sintetasas se encuentran entre las primeras proteínas que aparecieron en la evolución. En los metazoos, 9 aminoacil-ARNt sintetasas específicas para la glutamina (gin), el ácido glutámico (glu) y otros 7 aminoácidos están asociados dentro de un complejo multienzimático. Aunque está presente en eucariotas, la glutaminil-ARNt sintetasa (QARS) está ausente de muchos procariotas, mitocondrias y cloroplastos, en los que el Gln-ARNt (Gln) se forma por transamidación del Glu-ARNt misacilado (Gln). La glutaminil-ARNt sintetasa pertenece a la familia de las aminoacil-ARNt sintetasa de clase I. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015. RAB13: podría participar en el transporte polarizado, en el montaje y/o en la actividad de uniones estrechas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RAB31: Las pequeñas proteínas de unión a GTP de la familia RAB, como RAB31, desempeñan un papel esencial en la orientación de vesículas y gránulos. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RAC2: Las proteínas G pequeñas (GTPasas pequeñas) son homólogas a las proteínas Galfa y a menudo se las conoce como la superfamilia de protooncogenes Ras. La superfamilia Ras contiene más de 100 pequeñas GTPasas agrupadas en ocho familias; Ras, Rho, Rab, Rap, Arf, Ran, Rheb y Rad. Las pequeñas GTPasas regulan una amplia variedad de procesos en la célula, incluyendo el crecimiento, la diferenciación, el movimiento y el transporte de vesículas lipídicas. Al igual que las proteínas Galpha, las GTPasas pequeñas alternan entre un estado Encendido' (unido a GTP) y un estado Apagado' (unido a GDP). Este proceso cíclico requiere el factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) y la proteína activadora de GTPasa (GAP). Las GTPasas pequeñas son los efectores posteriores de la mayoría de los receptores tirosina quinasas (RTK) y se unen a través de dos proteínas, GRB2 y SOS. Se acoplan a cascadas de señalización intracelular, incluida la vía MAPK, a través de interacciones con la quinasa Raf. Normalmente, la activación de pequeñas GTPasas es inducida por la unión del ligando a una RTK. En muchas células transformadas, las mutaciones activadoras de las GTPasas, a menudo Ras, producen una respuesta celular en ausencia de un ligando, promoviendo así la progresión maligna. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RPL34: Los ribosomas, los orgánulos que catalizan la síntesis de proteínas, consisten en una pequeña subunidad 40S y una gran subunidad 60S. Juntas, estas subunidades están compuestas por 4 especies de<a>R<n>y aproximadamente 80 proteínas estructuralmente distintas. Este gen codifica una proteína ribosómica que es un componente de la subunidad 60S. La proteína pertenece a la familia de proteínas ribosómicas L34E. Se localiza en el citoplasma. Originalmente se pensaba que este gen se localizaba en l 7q21, pero se ha mapeado en 4q. Existen variantes de transcripción derivadas de empalme alternativo, sitios de iniciación de transcripción alternativos y/o poliadenilación alternativa; Estas variantes codifican la misma proteína. Como es típico de los genes que codifican proteínas ribosómicas, hay múltiples pseudogenes procesados de este gen dispersos por el genoma. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

RSAD2 : Interviene en la defensa antiviral. Puede perjudicar la gemación del virus al interrumpir las balsas lipídicas en la membrana plasmática, una característica que es esencial para el proceso de gemación de muchos virus. Actúa a través de la unión e inactivación de FPPS, una enzima implicada en la síntesis de colesterol, proteínas farnesiladas y geranilatadas, ubiquinona dolichol y hemo. Desempeña un papel en el estado antiviral celular inducido por el interferón tipo I y tipo II. Muestra efecto antiviral contra el virus VIH-1, el virus de la hepatitis C, el citomegalovirus humano y los afavirus, pero no contra el vesiculovirus. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

SART3: La proteína codificada por este gen es una proteína nuclear de unión al ARN que es un antígeno de rechazo tumoral. Este antígeno posee epítopos tumorales capaces de inducir linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA-A24 y específicos del tumor en pacientes con cáncer y puede ser útil para inmunoterapia específica. Se ha descubierto que este producto génico es un factor celular importante para la expresión génica del VIH-1 y la replicación viral. También se asocia transitoriamente con snRNPs U6 y U4/U6 durante la fase de reciclaje del ciclo del spliceosoma. Se cree que esta proteína codificada está involucrada en la regulación del empalme del ARNm. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

SDCBP: La proteína codificada por este gen se identificó inicialmente como una molécula que une la señalización mediada por sindecanas con el citoesqueleto. La proteína sintenina contiene dominios PDZ repetidos en tándem que se unen a los dominios citoplasmáticos, C-terminales de una variedad de proteínas transmembrana. Esta proteína también puede afectar la organización de la membrana citoesquelética, la adhesión celular, el tráfico de proteínas y la activación de factores de transcripción. La proteína se localiza principalmente en las uniones adherentes asociadas a la membrana y en las adherencias focales, pero también se encuentra en el retículo endoplásmico y el núcleo. El empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas. Parece acoplar el factor de transcripción SOX4 al receptor de IL-5 (IL5RA). Puede desempeñar un papel en el tráfico vesicular y parece ser necesario para dirigir el TGFA a la superficie celular en la vía secretora temprana. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

SELI: Este gen codifica una selenoproteína, que contiene un residuo de selenocisteína (Sec) en su sitio activo. La selenocisteína está codificada por el codón UGA que normalmente señala la terminación de la traducción. La UTR 3' de los genes de la selenoproteína tiene una estructura de bucle de tallo común, la secuencia de inserción Sec (SECIS), que es necesaria para el reconocimiento de UGA como un codón Sec en lugar de como una señal de parada. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha de11 de noviembre de 2015.

SPINT2: Este gen codifica una proteína transmembrana con dos dominios de Kunitz extracelulares que inhibe una variedad de serina proteasas. La proteína inhibe el activador HGF que impide la formación del factor de crecimiento activo de los hepatocitos. Este gen es un supresor tumoral putativo, y las mutaciones en este gen dan lugar a diarrea sódica congénita. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

SMAD9: La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia SMAD, que transduce señales de los miembros de la familia TGF-beta. La proteína codificada es activada por proteínas morfogenéticas óseas e interactúa con SMAD4. Se han encontrado dos variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. Modulador transcripcional activado por la quinasa del receptor BMP (proteínas morfogenéticas óseas) tipo 1. SMAD9 es un SMAD regulado por receptores (R-SMAD). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

SOCS3: Las proteínas de la familia SOCS forman parte de un sistema clásico de retroalimentación negativa que regula la transducción de señales de citoquinas. SOCS3 está implicado en la regulación negativa de las citocinas que señalan a través de la vía JAK/STAT. Inhibe la transducción de señales de citocinas mediante la unión a los receptores de tirosina quinasa, incluidos gpl30, LIF, eritropoyetina, insulina, IL12, GCSF y receptores de leptina. La unión a JAK2 inhibe su actividad quinasa. Suprime la eritropoyesis hepática fetal. Regula la aparición y el mantenimiento de las respuestas alérgicas mediadas por las células T auxiliares de tipo 2. Regula la señalización de IL-6 in vivo (por similitud). Probable componente de reconocimiento de sustrato de un complejo E3 ubiquitina-proteína ligasa E3 ECS (Elongin BC-CUL2/5-SOCS-box protein) similar a SCF que media la ubiquitinación y posterior degradación proteasómica de proteínas diana. Parece reconocer IL6ST (por similitud). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

TRAIL: La proteína codificada por este gen es una citocina que pertenece a la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral (t Nf ). Los nombres adicionales del gen incluyen, entre otros, AP02L, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF, TNFSF10 y CD253. TRAIL existe en una forma unida a la membrana y en una forma soluble, las cuales pueden inducir la apoptosis en diferentes células, como las células tumorales transformadas. Esta proteína se une a varios miembros de la superfamilia de receptores de TNF, como TNFRSF 1 OA/TRAILR1, NFRSF1 0B/TRAILR2, NFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF 10D/Tr A iLR4, y posiblemente también a NFRSFl IB/OPG. La actividad de esta proteína puede ser modulada por la unión a los receptores señuelo como NFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF 10D/TRAILR4 y NFRSFl IB/OPG que no pueden inducir la apoptosis. Se ha demostrado que la unión de esta proteína a sus receptores desencadena la activación de MAPK8/JNK, caspasa 8 y caspasa 3. Alternativamente, se han encontrado variantes de transcripción empalmadas que codifican diferentes isoformas para este gen. TRAIL se puede escindir proteolíticamente de la superficie celular para producir una forma soluble que tiene una estructura homotrimérica. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre.

TREMl: Receptor desencadenante expresado en las células mieloides 1; los alias adicionales de TREM1 son CD354 y TREM-l. Este gen codifica un receptor perteneciente a la superfamilia Ig que se expresa en las células mieloides. Esta proteína amplifica las respuestas inflamatorias mediadas por neutrófilos y monocitos desencadenadas por infecciones bacterianas y fúngicas al estimular la liberación de quimiocinas y citocinas proinflamatorias, así como el aumento de la expresión superficial de marcadores de activación celular. Alternativamente, se han observado variantes de transcripción empalmadas que codifican diferentes isoformas para este gen. La proteína codificada por este gen tiene una forma soluble que se denota por sTREMl. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

TRIM22: Proteína antiviral inducida por interferón implicada en la inmunidad innata celular. La actividad antiviral podría estar mediada en parte por la ubiquitinación de proteínas virales dependiente de TRIM22. Desempeña un papel en la restricción de la replicación del VIH-1, el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y el virus de la hepatitis B (VHB). Actúa como represor transcripcional del promotor central del VHB. Puede tener actividad E3 ubiquitina-proteína ligasa. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante será conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

UBE2N: Los heterodímeros UBE2V1-UBE2N y UBE2V2-UBE2N catalizan la síntesis de cadenas de poliubiquitina no canónicas ligadas a 'Lys-63'. Este tipo de poliubiquitinación no conduce a la degradación de proteínas por el proteasoma. Media la activación transcripcional de los genes diana. Desempeña un papel en el control del progreso a través del ciclo celular y la diferenciación. Desempeña un papel en la vía de reparación del ADN sin errores y contribuye a la supervivencia de las células después del daño del ADN. Actúa junto con las ligasas E3, HLTF y SHPRH, en la poliubiquitinación de PCNA ligada a 'Lys-63' en caso de estrés genotóxico, que es necesario para la reparación del ADN. Parece actuar junto con la ligasa E3 RNF5 en la poliubiquitinación ligada a 'Lys-63' de JKAM<p>, regulando así la función de JKAMP al disminuir su asociación con componentes del proteasoma y ERAd . La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

VEGFR2: El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) es un factor de crecimiento importante para las células endoteliales. Este gen codifica uno de los dos receptores del VEGF. Este receptor, conocido como receptor de dominio de inserción de quinasa, es un receptor de tirosina quinasa tipo III. Funciona como el principal mediador de la proliferación endotelial inducida por VEGF, la supervivencia, la migración, la morfogénesis tubular y la brotación. La señalización y el tráfico de este receptor están regulados por múltiples factores, entre los que se encuentran la GTPasa Rab, el receptor de nucleótidos de purina P2Y, la integrina alfaVbeta3, la proteína tirosina fosfatasa de células T, etc. Las mutaciones de este gen están implicadas en los hemangiomas capilares infantiles (proporcionado por RefSeq). La proteína codificada por este gen tiene una forma soluble denominada sVEGFR2. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

Xa f 1: Parece funcionar como un regulador negativo de los miembros de la familia IAP (proteína inhibidora de la apoptosis). Inhibe la actividad anticaspasa de BIRC4. Induce la escisión y la inactivación de BIRC4 independientemente de la activación de las caspasas. Media la apoptosis inducida por TNF-alfa y está implicada en la apoptosis de las células trofoblásticas. Puede inhibir BIRC4 indirectamente mediante la activación de la vía de apoptosis mitocondrial. Después de la translocación a las mitocondrias, promueve la translocación de BAX a las mitocondrias y la liberación de citocromo c de las mitocondrias. Parece promover la redistribución de BIRC4 desde el citoplasma hasta el núcleo, probablemente independiente de la inactivación de BIRC4 que parece ocurrir en el citoplasma. El complejo BIRC4-XAF1 media la regulación a la baja de BIRC5/survivina; el proceso requiere la actividad ligasa E3 de BIRC4. Parece estar implicado en la sensibilidad celular a las acciones proapoptóticas de t Ra IL. Puede ser un supresor tumoral al mediar la resistencia a la apoptosis de las células cancerosas. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

ZBP1: DLM1 codifica una proteína de unión al ADN-Z. La formación del ADN-Z es un proceso dinámico, controlado en gran medida por la cantidad de superenrollamiento. Puede desempeñar un papel en la defensa del huésped contra tumores y patógenos. Se une al ADN-Z (por similitud). La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de este determinante sería conocida por la persona experta o puede derivarse de entradas de bases de datos adecuadas, por ejemplo, en Genbank o Uniprot con fecha del 11 de noviembre de 2015.

No forma parte de la presente invención, pero también se contempla el uso de otros determinantes en forma de determinantes no polipeptídicos, tales como la edad, el recuento absoluto de neutrófilos (RAN), el recuento absoluto de linfocitos (ALC), el % de neutrófilos (Neu(%)), el % de linfocitos (Lym (%)), el % de monocitos (Mono(%)), la temperatura máxima, el tiempo transcurrido desde los síntomas, la creatinina (Cr), el potasio (K), el pulso y la urea. El término "% de neutrófilos (Neu(%))" se refiere a la fracción de glóbulos blancos que son linfocitos. El término "% de linfocitos (Lym (%))" se refiere a la fracción de glóbulos blancos que son linfocitos. El término "% de monocitos (Mono(%))" se refiere a la fracción de glóbulos blancos que son monocitos.

Otros determinantes particularmente preferidos son el TRAIL y CRP. También se prefieren determinantes como la procalcitonina, CD64, IP10, ILIRa o Mac-2BP. Sin formar parte de la presente invención, se prevé la medición de HNL en combinación con TRAIL, la medición de HNL en combinación con<c>R<p>, así como la medición de HNL con procalcitonina, la medición de HNL con CD64, la medición de HNL en combinación con IP10, la medición de HNL en combinación con ILIRa, la medición de HNL en combinación con Mac-2BP, o la medición de HNL en combinación con uno o más de TRAIL, IP10, ILIRa y Mac-2BP. También se prefieren los determinantes no polipeptídicos recuento absoluto de neutrófilos (ANC) y % de neutrófilos (Neu(%)).

En otra representación, que no forma parte de la invención, se utiliza el nivel de los determinantes recuento absoluto de neutrófilos (ANC) y % de neutrófilos (NEU(%)) para normalizar el nivel de HNL. Dicha normalización puede realizarse correlacionando los neutrófilos (ANC) o el Neu% con el HNL medido.

En consecuencia, en una representación, que no forma parte de la invención, el método descrito anteriormente para descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral, dicho método comprende además

b) descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es superior a un primer valor umbral predeterminado.

En otra realización, que no forma parte de la invención, del método descrito anteriormente para descartar una infección viral o el método para descartar una infección bacteriana, dicho método comprende además

b) descartar una infección bacteriana o descartar una infección viral para el sujeto de ensayo si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es inferior a un primer valor umbral predeterminado.

Además, en una realización adicional, que no forma parte de la invención, es el método de proporcionar una recomendación de tratamiento para un sujeto, que comprende además

a) la medición adicional de la concentración polipeptídica de TRAIL en una muestra obtenida de un sujeto; y b) recomendar que el sujeto reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es superior a un valor umbral predeterminado y si la concentración de TRAIL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado;

c) recomendar que el paciente no reciba un tratamiento antibiótico si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es superior a un valor umbral predeterminado; o

d) recomendar que el paciente reciba un tratamiento antiviral si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso (a) es inferior a un valor umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso (a) es superior a un valor umbral predeterminado, tal como se define anteriormente.

De acuerdo con otra representación, que no forma parte de la invención, el método de proporcionar una recomendación de prueba diagnóstica para un sujeto, comprende además

a) la medición adicional de la concentración polipeptídica de TRAIL en una muestra obtenida de un sujeto; y b) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de bacterias si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado y si la concentración de TRAIL determinada en el paso a) es inferior a un valor umbral predeterminado;

c) recomendar el análisis de la muestra para detectar la presencia de un virus si la concentración polipeptídica de HNL determinada en el paso a) es inferior a un valor umbral predeterminado y si la concentración polipeptídica de TRAIL determinada en el paso a) es superior a un valor umbral predeterminado.

Sin formar parte de la invención, también se contempla un método para descartar una enfermedad infecciosa, preferiblemente bacteriana o viral, en una materia que comprenda:

a) medir la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante tal como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y la concentración polipeptídica de uno o más polipéptidos seleccionados del grupo formado por TRAIL, IP10, ILIRa o Mac-2BP en una muestra obtenida de un sujeto; b) aplicando una función matemática predeterminada sobre las concentraciones de los polipéptidos medidos para calcular una puntuación

c) comparar la puntuación con un valor de referencia predeterminado.

Un "valor de referencia" tal como se utiliza en el presente documento puede ser relativo a un número o valor derivado de estudios de población, incluidos, entre otros, sujetos que tienen la misma infección, sujetos que tienen el mismo rango de edad o similar, sujetos del mismo grupo étnico o similar, o relativo a la muestra inicial de un sujeto que se somete a tratamiento para una infección. Dichos valores de referencia pueden obtenerse a partir de análisis estadísticos y/o datos de predicción de riesgos de poblaciones obtenidos a partir de algoritmos matemáticos e índices calculados de infección. Los índices determinantes de referencia también pueden construirse y utilizarse utilizando algoritmos y otros métodos de clasificación estadística y estructural. El valor de referencia es la cantidad (es decir, el nivel) de determinantes en una muestra de control derivada de uno o más sujetos que no tienen una infección (es decir, individuos sanos o no infecciosos). En una representación adicional, dichos sujetos son monitoreados y/o analizados periódicamente durante un período de tiempo relevante para el diagnóstico ("estudios longitudinales") después de dicha prueba para verificar la ausencia continua de infección. Dicho período de tiempo podrá ser de un día, dos días, de dos a cinco días, de cinco días, de cinco a diez días, de diez días o de diez o más días a partir de la fecha de prueba inicial para la determinación del valor de referencia. Además, la medición retrospectiva de los determinantes en muestras históricas debidamente almacenadas puede utilizarse para establecer estos valores de referencia, acortando así el tiempo de estudio necesario. Un valor de referencia también puede comprender las cantidades de determinantes derivadas de los sujetos que muestran una mejoría como resultado de los tratamientos y/o terapias para la infección. Un valor de referencia también puede comprender las cantidades de determinantes derivadas de sujetos que han confirmado la infección mediante técnicas conocidas.

El valor de referencia es un valor de índice o un valor de referencia. Un valor índice o valor basal es una muestra compuesta de una cantidad efectiva de determinantes de uno o más sujetos que no tienen una infección. Un valor basal también puede comprender las cantidades de determinantes en una muestra derivada de un sujeto que ha mostrado una mejoría en los tratamientos o terapias para la infección. En esta representación, para hacer comparaciones con la muestra derivada del sujeto, las cantidades de determinantes se calculan de manera similar y se comparan con el valor del índice. Opcionalmente, los sujetos identificados como portadores de una infección son elegidos para recibir un régimen terapéutico para retrasar la progresión o eliminar la infección.

Además, la cantidad del determinante puede medirse en una muestra de prueba y compararse con el "nivel de control normal", utilizando técnicas como límites de referencia, límites de discriminación o umbrales de definición de riesgo para definir puntos de corte y valores anormales. Por "nivel de control normal" se entiende el nivel de uno o más determinantes o índices determinantes combinados que se encuentran normalmente en un sujeto que no padece una infección. Este nivel de control normal y los puntos de corte pueden variar en función de si un determinante se utiliza solo o en una fórmula que se combina con otros determinantes en un índice. Alternativamente, el nivel de control normal puede ser una base de datos de patrones determinantes de sujetos previamente probados.

Sin ser parte de la invención, la eficacia de un régimen de tratamiento puede monitorizarse mediante la detección de un determinante en una cantidad efectiva (que puede ser una o más) de muestras obtenidas de un sujeto a lo largo del tiempo y la comparación de la cantidad de determinantes detectados. Por ejemplo, se puede obtener una primera muestra antes de que el sujeto reciba el tratamiento y se tomen una o más muestras posteriores después o durante el tratamiento del sujeto.

Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden utilizar para discriminar entre infecciones bacterianas, virales y mixtas (es decir, coinfecciones bacterianas y virales). Esto permitirá estratificar a los pacientes y tratarlos en consecuencia. Se puede utilizar cualquier fórmula para combinar los resultados determinantes en índices. Como se ha indicado anteriormente, y sin limitación, dichos índices pueden indicar, entre otras indicaciones, la probabilidad, la posibilidad, el riesgo absoluto o relativo, el tiempo o la tasa de conversión de uno a otro estado patológico, o hacer predicciones de futuras mediciones de biomarcadores de infección. Esto puede durante un período de tiempo u horizonte específico, o para el riesgo restante de por vida, o simplemente proporcionarse como un índice en relación con otra población de sujetos de referencia.

Aunque aquí se describen varias fórmulas preferidas, varios otros tipos de modelos y fórmulas más allá de los mencionados en este documento y en las definiciones anteriores son bien conocidos por un experto en la materia. El tipo de modelo real o la fórmula utilizada puede seleccionarse a su vez del campo de los modelos potenciales en función de las características de rendimiento y precisión diagnóstica de sus resultados en una población de entrenamiento. Los detalles de la fórmula en sí pueden derivarse comúnmente de los resultados determinantes en la población de entrenamiento relevante.

Entre otros usos, dicha fórmula puede estar destinada a mapear el espacio de características derivado de una o más entradas determinantes a un conjunto de clases de sujetos (por ejemplo, útil para predecir la pertenencia a clases de sujetos como normales o teniendo una infección), para derivar una estimación de una función de probabilidad de riesgo utilizando un enfoque bayesiano, o para estimar las probabilidades condicionales de clase, luego use la regla de Bayes para producir la función de probabilidad de clase como en el caso anterior.

Las fórmulas preferidas incluyen la amplia clase de algoritmos de clasificación estadística y, en particular, el uso del análisis discriminante. El objetivo del análisis discriminante es predecir la pertenencia a una clase a partir de un conjunto de características previamente identificadas. En el caso del análisis discriminante lineal (LDA), se identifica la combinación lineal de características que maximiza la separación entre grupos por algunos criterios. Las características de LDA se pueden identificar utilizando un enfoque basado en genes propios con diferentes umbrales (ELDA) o un algoritmo escalonado basado en un análisis multivariante de la varianza (MANOVA). Se pueden realizar algoritmos hacia adelante, hacia atrás y paso a paso que minimizan la probabilidad de que no haya separación según el estadístico de Hotelling-Lawley.

El Análisis Discriminante Lineal (ELDA) basado en Eigengene es una técnica de selección de características desarrollada por Shen et al. (2006). La fórmula selecciona características (por ejemplo, biomarcadores) en un marco multivariante utilizando un análisis eigen modificado para identificar características asociadas con los vectores propios más importantes. "Importante" se define como aquellos vectores propios que explican la mayor varianza en las diferencias entre las muestras que intentan ser clasificadas en relación con algún umbral.

Una máquina de vectores de soporte (SVM) es una fórmula de clasificación que intenta encontrar un hiperplano que separe dos clases. Este hiperplano contiene vectores de soporte, puntos de datos que están exactamente a la distancia de margen del hiperplano. En el caso probable de que no exista un hiperplano de separación en las dimensiones actuales de los datos, la dimensionalidad se expande en gran medida al proyectar los datos en dimensiones más grandes tomando funciones no lineales de las variables originales (Venables y Ripley, 2002). Aunque no es obligatorio, el filtrado de entidades para SVM a menudo mejora la predicción. Las características (p. ej., biomarcadores) se pueden identificar para una máquina de vectores de soporte utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (KW) para seleccionar las mejores características univariantes. Un bosque aleatorio (RF, Breiman, 2001) o una partición recursiva (RPART, Breiman et al., 1984) también se puede utilizar por separado o en combinación para identificar las combinaciones de biomarcadores que son más importantes. Tanto KW como RF requieren que se seleccionen varias características del total. RPART crea un único árbol de clasificación utilizando un subconjunto de biomarcadores disponibles. Se puede utilizar otra fórmula para preprocesar los resultados de la medición de determinantes individuales en formas de información más valiosas, antes de su presentación a la fórmula predictiva. En particular, la normalización de los resultados de los biomarcadores, utilizando transformaciones matemáticas comunes como funciones logarítmicas o logísticas, como posiciones normales u otras posiciones de distribución, en referencia a los valores medios de una población, etc., son bien conocidas por los expertos en la materia. De particular interés son un conjunto de normalizaciones basadas en determinantes clínicos como la edad, el tiempo transcurrido desde los síntomas, el género, la raza o el sexo, donde las fórmulas específicas se utilizan únicamente en sujetos dentro de una clase o combinando continuamente un determinante clínico como entrada. En otros casos, los biomarcadores basados en analitos pueden combinarse en variables calculadas que posteriormente se presentan a una fórmula.

Además de la posible normalización de los valores de los parámetros individuales de un sujeto, una fórmula predictiva general para todos los sujetos, o cualquier clase conocida de sujetos, puede recalibrarse o ajustarse de otro modo en función del ajuste de la prevalencia esperada de una población y los valores medios de los parámetros de los biomarcadores, de acuerdo con la técnica descrita en D'Agostino et al, (2001) JAMA 286: 180-187, u otras técnicas similares de normalización y recalibración. Dichas estadísticas de ajuste epidemiológico podrán ser capturadas, confirmadas, mejoradas y actualizadas continuamente a través de un registro de datos anteriores presentados al modelo, que pueden ser legibles por máquina o no, u ocasionalmente a través de la consulta retrospectiva de muestras almacenadas o la referencia a estudios históricos de dichos parámetros y estadísticas. Otros ejemplos que pueden ser objeto de recalibración de fórmulas u otros ajustes son las estadísticas utilizadas en los estudios de Pepe, M.S. et al, 2004 sobre las limitaciones de las probabilidades de promedios; Cook, N.R., 2007 en relación con las curvas ROC. Por último, el resultado numérico de una fórmula clasificadora en sí misma puede transformarse después del procesamiento por su referencia a una población clínica real y a los resultados del estudio y a los criterios de valoración observados, con el fin de calibrar el riesgo absoluto y proporcionar intervalos de confianza para los resultados numéricos variables del clasificador o de la fórmula de riesgo.

Algunos determinantes pueden presentar tendencias que dependen de la edad del paciente (por ejemplo, la línea de base de la población puede aumentar o disminuir en función de la edad), que pueden utilizarse como determinantes no polipeptídicos como se describe anteriormente. Por lo tanto, se puede utilizar un esquema de normalización o estratificación dependiente de la edad para ajustar las diferencias relacionadas con la edad. La normalización o estratificación dependiente de la edad se puede utilizar para mejorar la precisión de los determinantes para diferenciar entre diferentes tipos de infecciones.Por ejemplo, un experto en la materia puede generar una función que se ajuste a los niveles medios de la población de cada determinante en función de la edad y utilizarla para normalizar el determinante de los niveles de sujetos individuales a través de diferentes edades. Otro ejemplo es estratificar a los sujetos según su edad y determinar umbrales específicos de edad o valores de índice para cada grupo de edad de forma independiente.

El rendimiento y, por lo tanto, la utilidad clínica absoluta y relativa de la invención pueden evaluarse de múltiples maneras, como se ha señalado anteriormente. Entre las diversas evaluaciones de rendimiento, la invención está destinada a proporcionar precisión en el diagnóstico clínico y el pronóstico. La exactitud de una prueba, ensayo o método diagnóstico o pronóstico se refiere a la capacidad de la prueba, ensayo o método para distinguir entre sujetos que tienen una infección y se basa en si los sujetos tienen una "alteración significativa" (p. ej., clínicamente significativa "diagnósticamente significativa") en los niveles de un determinante. Por "cantidad efectiva" se entiende que la medición de un número apropiado de determinantes (que puede ser uno o más) produce una "alteración significativa" (por ejemplo, el nivel de expresión o actividad de un determinante) que es diferente del punto de corte predeterminado (o valor umbral) para ese determinante o determinantes y, por lo tanto, indica que el sujeto tiene una infección para la cual el determinante o determinantes son determinantes. La diferencia en el nivel de determinante es preferentemente estadísticamente significativa. Como se indica a continuación, y sin ninguna limitación de la invención, lograr significación estadística y, por lo tanto, la precisión analítica, diagnóstica y clínica preferida, generalmente, pero no siempre, requiere que las combinaciones de varios determinantes se utilicen juntas en paneles y se combinen con algoritmos matemáticos para lograr un índice determinante estadísticamente significativo.

En el diagnóstico categórico de un estado de enfermedad, cambiar el punto de corte o el valor umbral de una prueba (o ensayo) generalmente cambia la sensibilidad y la especificidad, pero en una relación cualitativamente inversa. Por lo tanto, al evaluar la exactitud y utilidad de una prueba, ensayo o método médico propuesto para evaluar la condición de un sujeto, siempre se debe tener en cuenta tanto la sensibilidad como la especificidad y tener en cuenta cuál es el punto de corte en el que se informan la sensibilidad y la especificidad, ya que la sensibilidad y la especificidad pueden variar significativamente en el rango de puntos de corte. Una forma de lograrlo es mediante el uso de la métrica MCC, que depende tanto de la sensibilidad como de la especificidad. Se prefiere el uso de estadísticas como el AUC, que abarca todos los valores potenciales del punto de corte, para la mayoría de las medidas de riesgo categóricas que utilizan la invención, mientras que para las medidas de riesgo continuas, se prefieren las estadísticas de bondad de ajuste y calibración a los resultados observados u otros criterios de referencia.

El término "MCC" significa coeficiente de correlación de Mathwes y se calcula de la siguiente manera: MCC = (TP * TN -FP *FN)/ {(TP FN)* (TP FP) * (TN FP) * (TN FN)}<A>0.5 donde TP, FP, TN, FN son verdaderos positivos, falsos positivos, verdaderos negativos y falsos negativos, respectivamente. Debe tenerse en cuenta que los valores de MCC oscilan entre - 1 y 1, lo que indica una clasificación completamente incorrecta y perfecta, respectivamente. Un MCC de 0 indica una clasificación aleatoria. Se ha demostrado que el MCC es útil para combinar sensibilidad y especificidad en una sola métrica (Baldi, Brunak et al. 2000). También es útil para medir y optimizar la precisión de la clasificación en casos de tamaños de clase desequilibrados (Baldi, Brunak et al. 2000). Los valores de m Cc pueden oscilar entre -1 y 1, lo que indica una clasificación completamente incorrecta y perfecta, respectivamente. Un MCC de 0 indica una clasificación aleatoria. Se ha demostrado que el MCC es especialmente útil para medir y optimizar la precisión de la clasificación en casos de tamaños de clase desequilibrados (Baldi, Brunak et al. 2000). El diagnóstico diferencial de los determinantes puede evaluarse mediante un esquema de clasificación lineal, en el que se calcula el punto de corte que maximiza el MCC en el conjunto para preparación y luego se utiliza para clasificar a los pacientes en el conjunto de prueba.

El término "TP" significa "verdadero positivo", es decir, un resultado positivo de la prueba que refleja con precisión la actividad analizada. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, un TP es, por ejemplo, pero no limitado a, clasificar verdaderamente una infección bacteriana como tal.

"TN" es verdadero negativo y significa resultado negativo de la prueba que refleja con precisión la actividad analizada. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, una TN es, por ejemplo, pero no se limita a, clasificar verdaderamente una infección viral como tal.

"FN" es falso negativo y significa un resultado que parece negativo pero no revela una situación. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, un FN es, por ejemplo, pero no limitado a, clasificar falsamente una infección bacteriana como una infección viral.

"FP" es falso positivo y se refiere al resultado de prueba que se clasifica erróneamente en una categoría positiva. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, un FP es, por ejemplo, pero no limitado a, clasificar falsamente una infección viral como una infección bacteriana.

La "sensibilidad" se calcula mediante TP/(TP+FN) o la fracción positiva verdadera de los sujetos de la enfermedad. La "especificidad" se calcula por TN/(TN+FP) o la fracción negativa verdadera de sujetos normales o no enfermos. La "precisión total" se calcula mediante (TN T<p>)/(TN FP TP FN). El "valor predictivo positivo" o "PPV" se calcula por TP/(TP+FP) o la fracción positiva verdadera de todos los resultados positivos de las pruebas. Se ve intrínsecamente afectado por la prevalencia de la enfermedad y la probabilidad previa a la prueba de la población a la que se pretende realizar la prueba. El "valor predictivo negativo" o "NPV" se calcula por TN/(TN FN) o la fracción negativa verdadera de todos los resultados negativos de las pruebas. También se ve inherentemente afectado por la prevalencia de la enfermedad y la probabilidad previa a la prueba de la población que se pretende realizar la prueba. Véase, por ejemplo, O'Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results," Clin. Ped. 1993, 32(8): 485-491, que analiza la especificidad, la sensibilidad y los valores predictivos positivos y negativos de una prueba, por ejemplo, una prueba de diagnóstico clínico.

El término "exactitud" se refiere al grado de conformidad de una cantidad medida o calculada (un valor notificado por la prueba) con su valor real (o verdadero). La exactitud clínica se relaciona con la proporción de resultados verdaderos (verdaderos positivos (TP) o verdaderos negativos (TN) frente a resultados mal clasificados (falsos positivos (FP) o falsos negativos (FN)), y puede expresarse como sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos (PPV) o valores predictivos negativos (NPV), coeficiente de correlación de Matheus (MCC), o como una probabilidad, probabilidades de promedios, curva de características operativas del receptor (ROC), Área Bajo la Curva (AUC) entre otras medidas. A menudo, para los enfoques de clasificación del estado binario de la enfermedad que utilizan una medición de prueba diagnóstica continua, la sensibilidad y la especificidad se resumen mediante una curva de características operativas del receptor (ROC) de acuerdo con Pepe et al, "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic, or Screening Marker" Am. J. Epidemiol 2004, 159 (9): 882-890, y resumida por el área bajo la curva (AUC) o estadística-c, un indicador que permite representar la sensibilidad y la especificidad de una prueba, ensayo o método en todo el rango de puntos de corte de la prueba (o ensayo) con un solo valor. Véase también, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures", capítulo 14 en Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burtis and Ashwood (eds.), 4a edición 1996, W.B. Saunders Company, páginas 192-199; y Zweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992, 38(8): 1425-1428.

Un enfoque alternativo que utiliza funciones de verosimilitud, razones de probabilidades, teoría de la información, valores predictivos, calibración (incluida la bondad de ajuste) y medidas de reclasificación se resumen de acuerdo con Cook, "Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction", Circulation 2007, 115: 928-935.

Una "fórmula", "algoritmo" o "modelo", tal como se utiliza en el presente documento, es cualquier ecuación matemática, proceso algorítmico, analítico o programado, o técnica estadística que toma una o más entradas continuas o categóricas (en lo sucesivo denominadas "parámetros") y calcula un valor de salida, a veces denominado "índice" o "valor de índice". Entre los ejemplos no limitantes de "fórmulas" se incluyen sumas, proporciones y operadores de regresión, como coeficientes o exponentes, transformaciones y normalizaciones de valores de biomarcadores (incluidos, entre otros, los esquemas de normalización basados en determinantes clínicos, como el género, la edad o el origen étnico), reglas y directrices, modelos de clasificación estadística y redes neuronales entrenadas en poblaciones históricas. De particular utilidad en la combinación de determinantes son las ecuaciones lineales y no lineales y los análisis de clasificación estadística para determinar la relación entre los niveles de determinantes detectados en una muestra de sujetos y la probabilidad de que el sujeto tenga una infección o un determinado tipo de infección. En la construcción de paneles y combinaciones, de particular interés son los algoritmos de clasificación estadística estructural y sintáctica, y los métodos de construcción de índices, utilizando características de reconocimiento de patrones, incluidas técnicas establecidas como la correlación cruzada, el análisis de componentes principales (PCA), la rotación de factores, la regresión logística (LogReg), el análisis discriminante lineal (LDA), Análisis Discriminante Lineal Eigengene (ELDA), Máquinas de Vectores de Soporte (SVM), Bosque Aleatorio (RF), Árbol de Partición Recursiva (RPART), así como otras técnicas de clasificación de árboles de decisión relacionados, Centroides Reducidos (SC), StepAIC, Kth-Nearest Neighbor, Boosting, Árboles de Decisión, Redes Neuronales, Redes Bayesianas y Modelos Ocultos de Markov, entre otros. Se pueden utilizar otras técnicas en el análisis de riesgos de supervivencia y tiempo hasta el evento, incluidos los modelos de Cox, Weibull, Kaplan Meier y Greenwood bien conocidos por los expertos en la técnica. Muchas de estas técnicas son útiles ya sea combinadas con una técnica de selección determinante, como la selección hacia adelante, la selección hacia atrás o la selección escalonada, la enumeración completa de todos los paneles potenciales de un tamaño dado, los algoritmos genéticos, o pueden incluir metodologías de selección de biomarcadores en su propia técnica. Estos pueden combinarse con criterios de información, como el Criterio de Información de Akaike (AIC) o el Criterio de Información de Bayes (BIC), con el fin de cuantificar el equilibrio entre los biomarcadores adicionales y la mejora del modelo, y ayudar a minimizar el sobreajuste. Los modelos predictivos resultantes pueden ser validados en otros estudios, o validados de forma cruzada en el estudio en el que fueron entrenados originalmente, utilizando técnicas como Bootstrap, Leave-One-Out (LOO) y validación cruzada de 10 veces (CV de 10 veces). En varios pasos, las tasas de falsos descubrimientos pueden estimarse mediante permutación de valores de acuerdo con las técnicas conocidas en en área Una "función de utilidad económica para la salud" es una fórmula que se deriva de una combinación de la probabilidad esperada de un rango de resultados clínicos en una población de pacientes idealizada y aplicable, tanto antes como después de la introducción de una intervención diagnóstica o terapéutica en el estándar de atención. Abarca estimaciones de la exactitud, la eficacia y las características de rendimiento de dicha intervención, y una medición del costo y/o del valor (una utilidad) asociada a cada resultado, que puede derivarse de los costes reales de la atención del sistema de salud (servicios, suministros, dispositivos y medicamentos, etc.) y/o como un valor aceptable estimado por año de vida ajustado por calidad (QALY) que da lugar a cada resultado.

La suma, en todos los resultados previstos, del producto del tamaño de la población previsto para un resultado multiplicado por la utilidad esperada del resultado respectivo es la utilidad económica total para la salud de un determinado estándar de atención. La diferencia entre (i) la utilidad económica total para la salud calculada para el estándar de atención con la intervención comparada con (ii) la utilidad económica total para la salud para el estándar de atención sin la intervención da como resultado una medida general del costo o valor económico para la salud de la intervención. Esto puede dividirse entre todo el grupo de pacientes que se analiza (o solo entre el grupo de intervención) para llegar a un costo por unidad de intervención y para guiar decisiones tales como el posicionamiento en el mercado, los precios y los supuestos de aceptación del sistema de salud. Estas funciones de utilidad económica para la salud se utilizan comúnmente para evaluar la relación costo-efectividad de la intervención, pero también pueden transformarse para estimar el valor aceptable por QALY que el sistema de atención médica está dispuesto a pagar, o las características aceptables de rendimiento clínico costo-efectivo requeridas para una nueva intervención.

Para las intervenciones diagnósticas de la invención, dado que cada resultado (que en una prueba diagnóstica clasificatoria de enfermedad puede ser un TP, FP, TN o FN) conlleva un coste diferente, una función de utilidad económica de la salud puede favorecer preferentemente la sensibilidad sobre la especificidad, o el PPV sobre el NPV en función de la situación clínica y los costos y el valor de los resultados individuales y, por lo tanto, proporciona otra medida del rendimiento y el valor económico de la salud que puede ser diferente de las medidas de rendimiento clínico o analítico más directas. Estas diferentes mediciones y compensaciones relativas generalmente convergerán solo en el caso de una prueba perfecta, con una tasa de error cero (es decir, cero clasificaciones erróneas de resultados de sujetos predichos o FP y FN), que todas las medidas de desempeño favorecerán sobre la imperfección, pero en diferentes grados.

En un aspecto adicional que no forma parte de la presente invención, se refiere, en consecuencia, a un método para distinguir entre una infección bacteriana y una infección viral en un sujeto que comprende:

a) medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante como se ha definido anteriormente o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y de CRP, opcionalmente de TRAIL, en una muestra obtenida de un sujeto;

c) comparar la puntuación, tal y como se define en el presente documento, con un valor de referencia predeterminado, tal y como se define en el presente documento.

En un aspecto adicional que no forma parte de la presente invención, se proporciona un método para distinguir entre una infección bacteriana o mixta y una infección viral en un sujeto que comprende:

a) medición de la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante como se ha definido anteriormente, o una composición o kit de diagnóstico como se ha definido anteriormente, y de CRP, opcionalmente de TRAIL, en una muestra obtenida de un sujeto;

b) aplicar una función matemática predeterminada sobre las concentraciones de HNL y CRP y, opcionalmente, de TRAI, para calcular una puntuación;

En otro aspecto, que no forma parte de la invención, se proporciona un método para identificar el tipo de infección, preferiblemente una infección bacteriana o viral, en un sujeto, que comprende:

a) medir la concentración polipeptídica de HNL utilizando un agente aglutinante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición o kit de diagnóstico de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 y los niveles de un primer determinante polipeptídico, tal como se define en el presente documento, seleccionado del grupo formado por TRAIL, IL1RA, IP10, Mac-2BP, B2M, BCA-1, CHI3LI, Eotaxina, IL1a, MCP, CD62L, VEGFR2, CHP, CMPK2, CORO1C, EIF2AK2, ISG15, RPL22L1, RTN3, CD112, CD134, CD182, CD23 l, CD235A, CD335, CD337, CD45, CD49D, CD66A/C/D/E, CD73, CD84, EGFR, GPR162, HLA-A/B/C, ITGAM, NRGl, RAPlB, SELI, SPINT2, SSEAl, IgG moléculas unidas inespecíficas, IL1, I-TAC y TNFRl en una muestra obtenida de un sujeto; y

b) que consiste en medir los niveles de un segundo determinante seleccionado del grupo

(i) los determinantes polipeptídicos, tal como se definen en el presente documento, TRAIL, IL1RA, IP10, Mac-2BP, B2M, BCA-1, CHI3L1, Eotaxin, IL1 a, MCP, CD62L, VEGFR2, CHP, CMPK2, CORO1C, EIF2AK2, ISG15, RPL22L1, RTN3, CD112, CD134, CD182, CD23l, CD235A, CD335, CD337, CD45, CD49D, CD66A/C/D/E, CD73, CD84, EGFR, GPR162, HLA-A/B/C, ITGAM, NRG1, RAP1B, SELI, SPINT2, SSEAl, moléculas ligadas no específicas de IgG, IL1, I-TAC y TNFRl ;

(ii) los determinantes polipeptídicos, tal como se definen en el presente documento, IFITM3, IFIT3, EIF4B, IFIT1, LOC26010, MBOAT2, MX1, OAS2, RSAD2, ADIPORl, CD15, CD8A, IFITMl e IL7;

(iii) los determinantes polipeptídicos, tal como se definen en el presente documento CRP, SAA, TREM-1, PCT, IL-8, TREM-1 e IL6; o

(iv) los determinantes no polipeptídicos, tal como se definen anteriormente, edad, recuento absoluto de neutrófilos (RAN), recuento absoluto de linfocitos (ALC), % de neutrófilos (Neu(%)), % de linfocitos (Lym (%)), % de monocitos (Mono(%)), temperatura máxima, tiempo desde los síntomas, creatinina (Cr), potasio (K), pulso y urea; c) comparar los niveles de HNL, primer y segundo determinante con un valor de referencia, identificando así el tipo de infección en el sujeto en el que la medición del primer y/o segundo determinante aumenta la precisión de la identificación del tipo de infección sobre la medición de HNL.

"Tipo de infección", tal como se usa en este documento, significa incluir infecciones bacterianas, infecciones virales, infecciones mixtas, sin infección (es decir, no infecciosas). Más específicamente, algunos métodos de la invención se utilizan para distinguir sujetos que tienen una infección bacteriana, una infección viral, una infección mixta (es decir, coinfección bacteriana y viral), pacientes con una enfermedad no infecciosa e individuos sanos.

Por una cuestión de conveniencia, un anticuerpo descrito en este documento puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloque o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los distintos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden suministrarse en forma de polvos secos, generalmente liofilizados, incluidos los excipientes que, al disolverse, proporcionarán una solución reactiva con la concentración adecuada.

También se proporcionan reactivos de diagnóstico y kits que comprenden uno o más de estos reactivos para su uso en una variedad de ensayos de diagnóstico, incluidos, por ejemplo, inmunoensayos como ELISA (tipo sándwich o formato competitivo). En algunas representaciones, tales kits pueden incluir al menos un primer péptido (opcionalmente un estándar de HNL maduro debidamente plegado como se describe en el presente documento), o un primer fragmento de unión al anticuerpo o antígeno descrito en el presente documento, un fragmento funcional del mismo, o un cóctel del mismo, y medios para la generación de señales. Los componentes del kit pueden estar prefijados a un soporte sólido o pueden aplicarse a la superficie de un soporte sólido cuando se usa el kit. En alguna representación, los medios generadores de señales pueden venir preasociados con un anticuerpo descrito en este documento o pueden requerir la combinación con uno o más componentes, por ejemplo, tampones, conjugados anticuerpo-enzima, sustratos enzimáticos o similares, antes de su uso. Los kits también pueden incluir reactivos adicionales, por ejemplo, reactivos de bloqueo para reducir la unión inespecífica a la superficie de la fase sólida, reactivos de lavado, sustratos enzimáticos y similares. La superficie de la fase sólida puede tener la forma de un tubo, una perla, una placa de microtitulación, una microesfera u otros materiales adecuados para inmovilizar proteínas, péptidos o polipéptidos.

En algunas representaciones, una enzima que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente o cromogénico o la reducción de un sustrato quimioluminiscente o cromogénico es un componente de los medios generadores de señales. Tales enzimas son bien conocidas en la técnica. Los kits pueden incluir cualquiera de los agentes de captura y reactivos de detección descritos en este documento. Opcionalmente, el kit también puede incluir instrucciones para llevar a cabo los métodos descritos en este documento. Los kits pueden incluir además agentes para la detección y medición de otros parámetros biológicos, por ejemplo, agentes para medir la expresión y la cantidad de procalcitonina, proteína C reactiva, CD64 o de cualquiera de los determinantes polipeptídicos mencionados anteriormente, y para la determinación del número de glóbulos blancos, por ejemplo, neutrófilos, células T, células B, monocitos, eosinófilos, basófilos.

También se pueden preparar kits de diagnóstico que comprendan al menos uno de los anticuerpos, péptidos, fragmentos de unión al antígeno o polinucleótidos descritos en este documento e instrucciones para usar la composición como reactivo de diagnóstico o agente terapéutico. Los recipientes destinados a su uso en dichos kits podrán constar normalmente de al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringa u otro recipiente adecuado, en el que puedan colocarse una o varias de las composiciones diagnósticas y/o terapéuticas, y estar convenientemente alicuotadas. Cuando también se suministre un segundo agente terapéutico, el kit también podrá contener un segundo recipiente distinto en el que pueda colocarse esta segunda composición diagnóstica y/o terapéutica. Alternativamente, se puede preparar una variedad de compuestos en una sola composición farmacéutica y se puede envasar en un solo recipiente, como un vial, un matraz, una jeringa, un frasco u otro recipiente individual adecuado. Los kits de la presente invención también incluirán típicamente un medio para contener el/los vial(es) en estrecho confinamiento para la venta comercial, tales como, por ejemplo, recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se retienen el/los vial/es deseado(s). Cuando en el kit se incluya un marcador radiológico, cromogénico, fluogénico u otro tipo de marcaje o medio de detección medible, el agente de marcado podrá suministrarse en el mismo recipiente que la propia composición diagnóstica o terapéutica o, alternativamente, podrá colocarse en un segundo medio de envasado distinto en el que pueda colocarse esta segunda composición y alícuota adecuada. Alternativamente, el reactivo de detección y la etiqueta pueden prepararse en un solo recipiente y, en la mayoría de los casos, el kit también incluirá un medio para contener los viales en confinamiento cerrado para la venta comercial y/o el envasado y la entrega convenientes.

También se proporciona un dispositivo o aparato para llevar a cabo los métodos de diagnóstico o monitoreo descritos en este documento. Dicho aparato puede incluir una cámara o tubo en el que se pueda introducir la muestra, un sistema de manipulación de fluidos que incluya opcionalmente válvulas o bombas para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo, filtros opcionales para separar el plasma o el suero de la sangre, cámaras de mezcla para la adición de agentes de captura o reactivos de detección y, opcionalmente, un dispositivo de detección para detectar la cantidad de marcaje detectable unida al inmunocomplejo del agente de captura. El flujo de la muestra puede ser pasivo (p. ej., por fuerzas capilares, hidrostáticas u otras fuerzas que no requieren una manipulación adicional del dispositivo una vez que se aplica la muestra) o activo (p. ej., por aplicación de fuerza generada a través de bombas mecánicas, bombas electroosmóticas, fuerza centrífuga o aumento de la presión del aire), o por una combinación de fuerzas activas y pasivas. Los dispositivos para la detección de analitos que implican la separación magnética de los analitos de interés (por ejemplo, el dispositivo descrito en WO2008/072156, WO2008/102218, WO2010/035204 y WO201 l/036638) también se pueden utilizar para realizar las pruebas y métodos descritos en este documento.

También se proporciona un procesador, una memoria legible por computadora y una rutina almacenada en la memoria legible por computadora y adaptada para ser ejecutada en el procesador para realizar cualquiera de los métodos descritos en este documento, y/o para generar como salida el nivel detectado de HNL y un umbral o rango de niveles de umbral considerados "normales", de modo que los niveles fuera del rango "normal" se correlacionen con una o más de las condiciones descritas en este documento. También se proporcionan medios legibles por ordenador que contienen programas o rutinas para realizar funciones similares. Entre los ejemplos de sistemas, entornos y/o configuraciones informáticas adecuados se incluyen los ordenadores personales, los ordenadores servidores, los dispositivos portátiles o portátiles, los sistemas multiprocesador, los sistemas basados en microprocesadores, los decodificadores, los productos electrónicos de consumo programables, los ordenadores de red, los miniordenadores, los ordenadores centrales, los entornos informáticos distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas o dispositivos anteriores, o cualquier otro sistema conocido en la técnica.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico para el antígeno diana, por ejemplo, para detectar su expresión en células, tejidos o suero específicos. Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, para estos fines, el anticuerpo se marca con un radionúclido para que el sitio pueda localizarse mediante inmunogammagrafía.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos, como ELISA, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147- 158 (CRC Press, Inc. 1987). Los anticuerpos también se pueden utilizar para la inmunohistoquímica, para etiquetar muestras celulares utilizando métodos conocidos en la técnica

EXPERIMENTOS

1. Caracterización de los anticuerpos y de los epítopos de HNL

Mapeo de epítopos mediante espectrometría de masas MALDI de alta masa

Antes de iniciar el mapeo de epítopos, se ha realizado un análisis MALDI de alta masa en cada muestra (Anticuerpos y Antígeno) con el fin de verificar su integridad y nivel de agregación. Para la prueba de integridad/agregación, las mediciones se realizaron utilizando un espectrómetro de masas Ultraflex III MALDI ToF (Bruker) equipado con el módulo de interacción HM3 de CovalX. El módulo de interacción de CovalX contiene un sistema de detección especial diseñado para optimizar la detección hasta 2MDa con sensibilidad nanomolar.20p1 de cada muestra de proteína (clon anti-HNL MAB l; El clon MAB2 y el clon MAB3 y HNL) se pipetearon para preparar 8 diluciones con un volumen final de 10 pl. La concentración de anticuerpos en estas diluciones fue de 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.63 pg/ml, 7.82 pg/ml. El antígeno HNL se diluyó para proporcionar las siguientes concentraciones: 350 pg/ml, 175 pg/ml, 87.5 pg/ml, 43.75 pg/ml, 21.88 pg/ml, 10.94 pg/ml, 5.47 pg/ml y 2.74 pg/ml. Estas 8 diluciones de las muestras se prepararon con el fin de obtener las siguientes concentraciones esperadas:

1 p1 de cada dilución obtenida se mezcló con 1 p1 de una matriz compuesta por una matriz de ácido sinapínico recristalizado (10 mg/ml) en acetonitrilo/agua (1:1, v/v), TFA 0,1% (K200 MALDl Kit). Después de la mezcla, se detectó 1 pl de cada muestra en la placa MALDI (SCOUT 384). Después de la cristalización a temperatura ambiente, la placa se introdujo en el espectrómetro de masas MALDI y se analizó inmediatamente en modo MALDI de alta masa. El análisis se ha repetido por triplicado.

Los experimentos de reticulación permiten el análisis directo de la interacción no covalente mediante espectrometría de masas MALDI de alta masa. Al mezclar una muestra de proteína que contiene interacciones no covalentes con una mezcla de reticulación especialmente desarrollada (Bich, C. et al. Anal. Chem., 2010, 82 (1), pp 172-179), es posible detectar específicamente complejos no covalentes con alta sensibilidad. La unión covalente generada permite que las especies que interactúan sobrevivan al proceso de preparación de la muestra y a la ionización de MALDI. Un sistema especial de detección de alta masa permite caracterizar la interacción en el rango de alta masa.

Cada mezcla preparada para el experimento de control (quedando 9 p1) se sometió a reticulación utilizando el kit de análisis K200 MALDI MS de CovalX. 9 p1 de las mezclas (de 1 a 1/128) se mezclan con 1 p1 del reactivo estabilizador K200 (2 mg/ml) y se incuban a temperatura ambiente. Después del tiempo de incubación (180 minutos) las muestras se prepararon para el análisis MALDI para los experimentos de control. Las muestras se analizaron mediante análisis MALDI de alta masa inmediatamente después de la cristalización. El análisis MALDI ToF MS se ha realizado utilizando el módulo de interacción HM3 de CovalX con un láser de nitrógeno estándar y centrándose en diferentes rangos de masa de 0 a 1500 kDa. Para el análisis se han aplicado los siguientes parámetros: Espectrómetro de masas: modo lineal y positivo, Fuente de Ion 1: 20 kV, Fuente de Ion 2: 17 kV, Lente: 12 kV, Extracción de pulso de Ion: 400 ns, HM3: Tensión de ganancia: 3,14 kV, Tensión de aceleración: 20 kV

Resultados

Anticuerpo Anti-HNL MABl

En los experimentos de control, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l46.935±0.098kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 146.935±0.098 Ma Bi anti-HNL.

En los experimentos de reticulación, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l48.717±0.l 12kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 148.717±0.112 MABI anti-HNL. No se han detectado otros complejos no covalentes en el rango de masa más alto. Además, utilizando un software de seguimiento complejo no se detectaron complejos no covalentes.

Anticuerpo Anti-HNL MAB2

En los experimentos de control, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l52.657±0.l 15kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 152.657±0.115 Anti-HNL MAB2

En los experimentos de reticulación, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l54.521±0.142kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 154.521±0.142 Anti-HNL MAB2. No se han detectado otros complejos no covalentes en el rango de masa más alto. Utilizando un software de seguimiento complejo, no se detectaron complejos no covalentes.

Anticuerpo Anti-HNL MAB3

En los experimentos de control, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l47.717±0.133kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 147.717±0.133 Anti-HNL MAB3.

En los experimentos de reticulación, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/64 con MH+=l49.134±0.089kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 149.134±0.089 Anti-HNL MAB3. No se han detectado otros complejos no covalentes en el rango de masa más alto. Utilizando un software de seguimiento complejo, no se detectaron complejos no covalentes.

Antígeno HNL

En los experimentos de control, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/32 con MH+=45.43 l±0.33 kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 45.431 ±0.33.

En los experimentos de reticulación, se detectó un pico principal para cada dilución de 1 a 1/32 con MH+=48.509±0.052 kDa. El peso molecular observado (kDa) es de 48.509±0.052. No se han detectado otros complejos no covalentes en el rango de masa más alto. Utilizando un software de seguimiento complejo, no se detectaron complejos no covalentes. Conclusión Prueba de agregación

Utilizando espectrometría de masas MALDI de alta masa y reticulación química, no se detectaron agregados no covalentes del anticuerpo anti-HNL y multímeros de los antígenos<h>N<l>.

Caracterización de la naturaleza del epítopo

Con el fin de determinar la naturaleza del epítopo (es decir, lineal o conformacional), se evaluó si la interacción entre las proteínas del antígeno y los anticuerpos puede ser inhibida por péptidos no estructurados generados por proteólisis del antígeno.

Si los péptidos generados por la proteólisis completa del antígeno son capaces de inhibir la unión del antígeno al anticuerpo, la interacción no se basa en la conformación. En este caso, el epítopo es lineal. Un simple ensayo de competición con un banco de péptidos superpuestos generado a partir de la secuencia del antígeno será suficiente para determinar la secuencia del epítopo.

Si los péptidos generados por la proteólisis completa del antígeno no pueden inhibir la unión del antígeno al anticuerpo, la conformación es necesaria para la interacción. En este caso, el epítopo puede ser continuo (con una conformación especial, es decir, bucle) o discontinuo (debido a la estructura terciaria). En este caso será necesario el uso de marcaje covalente, mapeo peptídico y espectrometría de masas de alta resolución.

Para caracterizar la naturaleza del epítopo, las mediciones se realizaron utilizando un espectrómetro de masas Ultraflex 111 MALDI ToF (Bruker) equipado con el sistema HM3 High-Mass de CovalX.

Experimentos de control

Mezcla de mAb/Ags (Anti HNL MABl/HNL; Anti HNL MAB2/HNL y Anti HNL MAB3/HNL). 1 p1 de la mezcla obtenida se mezcló con 1 |j1 de una matriz compuesta por una matriz de ácido sinapínico recristalizado (10 mg/ml) en acetonitrilo/agua (1:1, v/v), TFA 0,1% (K200 MALDI Kit). Después de la mezcla, se detectó 1<j>1 de cada muestra en la placa MALDI (SCOUT 384). Después de la cristalización a temperatura ambiente, la placa se introdujo en el espectrómetro de masas MALDI y se analizó inmediatamente. El análisis se repitió por triplicado.

Experimentos de reticulación

La mezcla preparada para el experimento de control (9j 1 a la izquierda) se sometió a reticulación utilizando el kit de análisis K200 MALDI Ms de CovalX. 9 j 1 de la mezcla se mezclan con 1 j 1 del reactivo estabilizador K200 (2 mg/ml) y se incuban a temperatura ambiente. Después del tiempo de incubación (180 minutos) las muestras se prepararon para el análisis MALDI como para los experimentos de control. Las muestras se analizan mediante análisis MALDI de alta masa inmediatamente después de la cristalización.

Ensayo de competencia

Con el fin de determinar la naturaleza del epítopo, se realizó una proteólisis del antígeno HNL con pepsina inmovilizada. Se mezclaron 25 j 1 del antígeno con una concentración de 10 j M con pepsina inmovilizada 2,5 j M y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del tiempo de incubación, la muestra se centrifuga y el sobrenadante se pipetea. La finalización de la proteólisis se controla mediante espectrometría de masas MALDI de alta masa en modo lineal y modo reflectrón. La proteólisis de pepsina se optimizó para obtener una gran cantidad de péptido en el rango de 1000-3500 Da. 5<j>1 de los péptidos antígenos generados por proteólisis (7.6<j>M) se mezclaron con 5<j>1 de anticuerpo anti-HNL (3.8<j>M) y se incubaron a 37° durante 2 horas. Después de la incubación de los anticuerpos con los péptidos del antígeno, 5<j>1 de la mezcla se mezcla con 5<j>1 del antígeno intacto (3,8<j>M).

Análisis de interacción

Para el ensayo de competencia, el análisis de interacción anticuerpo/antígeno se realizó con el mismo protocolo (experimentos de control y cross-link) descrito anteriormente.

Análisis de MS de MALDI de alta masa

El análisis MALDI ToF MS se ha realizado utilizando el módulo de interacción HM3 de CovalX con un láser de nitrógeno estándar y centrándose en diferentes rangos de masa de 0 a 2000 kDa. Para el análisis se han aplicado los siguientes parámetros: Espectrómetro de masas: modo lineal y positivo; Fuente de Ión 1: 20 kV; Fuente de Ión 2: 17 kV; Lente: 12 kV; Extracción de pulsos: 400 ns; HM3: Tensión de ganancia: 3.14 kV; Tensión de aceleración: 20 kV. Para calibrar el instrumento, se aplicó una calibración externa con plumeros de lnsulina, BSA e IgG. Para cada muestra se analizaron 3 puntos (300 disparos láser por punto). El espectro presentado corresponde a la suma de 300 disparos láser. Los datos de MS se analizaron utilizando el software de análisis Complex Tracker versión 2.0 de CovalX.

Resultados

Anti HNL MAB1/HNL

En los experimentos control, el antígeno y el anticuerpo tuvieron un MH+=45.862 kDa y un MH+=l48.577 kDa. Peso molecular observado (kDa) 45.725 HNL; 148.431 MABI anti-HNL.

Se completó un experimento de reticulación después de 180 minutos de tiempo de incubación con el reactivo de reticulación K200. Después de la reticulación, se detectaron dos picos adicionales con MH+=l95.941 kDa y MH+=241.619 kDa. Utilizando el software Complex Tracker, se superpusieron los espectros de control y reticulación. Se detectaron dos complejos no covalentes con la siguiente estequiometría. La estequiometría de peso molecular (kDa) observada fue de 194.865 [Anti-HNL MABl/HNL] y 241.287 [Anti-HNL MAB1/2HNL], respectivamente.

En los experimentos de competencia, no se detectó inhibición de la unión del anticuerpo Anti-HNL al antígeno HNL. Los péptidos del antígeno no inhibieron la unión del anticuerpo al antígeno.

Anti HNL MAB2/HNL

En los experimentos control, el antígeno y el anticuerpo tuvieron un MH+=45.755 kDa y un MH+=l48.53 l kDa, respectivamente. El peso molecular (kDa) observado fue de 45.755 HNL y 148.531 de MAB2 anti-HNL.

Se completó un experimento de reticulación después de 180 minutos de tiempo de incubación con el reactivo de reticulación K200. Después de la reticulación, se detectaron dos picos adicionales con MH+=201.793 kDa y MH+=248.696 kDa. Utilizando el software Complex Tracker, se superpusieron los espectros de control y reticulación. Se detectaron dos complejos no covalentes con la siguiente estequiometría: Estequiometría de peso molecular observado (kDa) 194.881 [Anti-HNL MAB2/HNL] y 240.978 [Anti-HNL MAB2/2HNL].

En los experimentos de competencia, no se detectó inhibición de la unión del anticuerpo Anti HNL al antígeno HNL. Los péptidos del antígeno no inhibieron la unión del anticuerpo al antígeno.

Anti HNL MAB3/HNL

En los experimentos control, el antígeno y el anticuerpo se detectaron con MH+=45.742 kDa y MH+=l48.554 kDa. El peso molecular (kDa) observado fue de 45.742 HNL y 148.554 Anti-HNL MAB3, respectivamente.

Se completó un experimento de reticulación después de 180 minutos de tiempo de incubación con el reactivo de reticulación K200. Después de la reticulación, se detectaron dos picos adicionales con MH+=l96.482 kDa y MH+=243.468 kDa. Utilizando el software Complex Tracker, superpusimos los espectros de control y reticulación. Se detectaron dos complejos no covalentes con la siguiente estequiometría. La estequiometría de peso molecular (kDa) observada fue de 194.130 [Anti-HNL MAB3/HNL] y 240.793 [Anti-HNL MAB3/2HNL], respectivamente.

Conclusión Ensayo de competencia

El ensayo de competencia indicó que los péptidos del antígeno no inhiben la unión del anticuerpo al antígeno. El epítopo de Anti-HNL en h Nl no es lineal.

Caracterización y huella de masa peptídica del antígeno HNL

Con el fin de caracterizar el HNL, las muestras del mismo se sometieron a proteólisis de ASP-N, tripsina, quimotripsina, elastasa y termolisina, seguidas de análisis LC-LTQ Orbitrap MS/MS. Para la caracterización del antígeno se procesó una cromatografía nano-LC utilizando un sistema Ultimate 3000 (Dionex) en línea con un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL (Thermo). Se mezclaron 10 p1 del antígeno (0.35 mg/mL) con 40 p1 de bicarbonato de amonio (25 mM, pH 8.3). Después de mezclar, se añaden 2 p1 de DTT (500 mM) a la solución. A continuación, la mezcla se incuba 1 hora a 55 °C. Después de la incubación, se añaden 2 pl de iodioacetamida (1M) antes de 1 hora de incubación a temperatura ambiente en una habitación oscura. Después de la incubación, la solución se diluye 1/5 añadiendo 120 p1 del tampón utilizado para la proteólisis con tripsina, quimotripsina, ASP-N, elastasa o termolisina:

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 0.7 p1 de tripsina (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/100. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 37°C.

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 0.35 p1 de quimotripsina (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/200. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 25°C.

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 0.35 p1 de ASP-N (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/200. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 37°C.

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 0.70 p1 de elastasa (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/100. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 37°C.

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 1.40 p1 de termolisina (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/50. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 70°C.

Después de la proteólisis, 10 p1 del péptido generado por proteólisis se cargaron en un sistema de cromatografía nanolíquida (Ultimate 3000, Dionex) y se sometieron a análisis. La generación y filtrado de DTA se realizó utilizando LTQ OrbiTrap.

Caracterización de las interfaces moleculares

Con el fin de determinar el epítopo de Anti-HNL MAB1; Anti-HNL MAB2 y Anti-HNL MAB3 en antígeno HNL con alta resolución los complejos anticuerpo/antígeno se incuban con reticulantes deuterados y se someten a una escisión multienzimática. Después del enriquecimiento de los péptidos reticulados, las muestras se analizan mediante espectrometría de masas de alta resolución (nLC-Orbitrap MS) y los datos generados se analizan utilizando el software XQuest y Stavrox.

Complejo anticuerpo/antígeno

5p1 de la muestra de antígeno (concentración 3.8 pM) se mezcló con 5p1 de la muestra de anticuerpos (Concentración l .9pM) para obtener una mezcla de anticuerpo/antígeno con concentración final de 0.95pM/1.9pM. La mezcla se incubó a 37°C durante 180 minutos.

En un primer paso, se mezcló 1 mg de reticulante d0 con 1 mg de reticulante dl2. Los 2 mg preparados se mezclaron con 1 ml de DMF para obtener una solución de 2 mg/ml de DSS do/dl2. Se mezclaron 10 p1 de la mezcla de anticuerpo/antígeno preparada previamente con 1 p1 de la solución de reticulante D0/dl2 preparada (2 mg/ml). La solución se incubó 180 minutos a temperatura ambiente para lograr la reacción de reticulación.

Se mezclaron 10 p1 del antígeno (0.35 mg/mL) con 40 p1 de bicarbonato de amonio (25 mM, pH 8,3). Después de mezclar, se añaden 2 p1 de DTT (500 mM) a la solución. A continuación, la mezcla se incuba 1 hora a 55 °C. Después de la incubación, se añaden 2 p1 de iodioacetamida (1M) antes de 1 hora de incubación a temperatura ambiente en una habitación oscura. Después de la incubación, la solución se diluye 1/5 añadiendo 120 p1 del tampón utilizado para la proteólisis.

- Se mezclaron 145 p1 del antígeno reducido/alquilado con 1,40 p1 de termolisina (Roche Diagnostic) en una proporción de 1/50. La mezcla proteolítica se incubó durante la noche a 70°C.

Los péptidos de reticulación se analizaron utilizando Xquest versión 2.0 y Stavrox Software versión 2.1.

Anticuerpo Anti-HNL MAB1

Después de la reticulación, los péptidos generados por la proteólisis multienzimática cubren el 95 % de la secuencia total del antígeno.

Utilizando los hibridomas anti-HNL MABI siempre que se haya realizado una secuenciación de ADNc con el siguiente resultado:

Cadena ligera Región variable:

DIVMTQTPATLSVTPGDSVSLSCRASQSIITDLHWYQQRSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSVETE DFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRA DAAPTVS

Región variable de cadena pesada:

VQLQESGPDLVAPSQSLSITCTVSGFSLSSYGVHWVRQPPGKGLEWLIVMWSDGSTTSNSALKSRLSISKDNSKSQV FLKVNSLQSDDTAIYYCARHYGYFTMD YWGQGTSVTVSS

Mediante reticulación química, espectrometría de masas MALDI de alta masa y espectrometría de masas nLC-Orbitrap se caracterizó la interfaz de interacción entre el antígeno HNL y el anticuerpo monoclonal Anti-HNL MAB1. El epítopo de este anticuerpo monoclonal incluye los siguientes aminoácidos sobre el antígeno HNL: 144; 145; 154. En el anticuerpo, el paratopo incluye los siguientes aminoácidos: Cadena pesada: 80; 86.

Anticuerpo Anti-HNL MAB2

Después de la reticulación, los péptidos generados por la proteólisis multienzimática cubren el 95 % de la secuencia total de antígenos. Utilizando los hibridomas anti-HNL MAB2 siempre que se haya realizado una secuenciación del ADNc con el siguiente resultado:

Cadena ligera Región variable:

DIVLTQSTSSLSVSLGDRVTINCRASQDISNYLNWYQEKPDGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTITNLEQ EDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTV

Región variable de cadena pesada:

EVQLEESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGIHWLRQPPGKDLEWLVVIWGDGSTTSNSALKSRLSISKDNSKSQVF FKMSGLQTDDTAIYYCARHR YSDYHAM DYWGPGTSVTVS

Mediante reticulación química, espectrometría de masas MALDI de alta masa y espectrometría de masas nLC-Orbitrap se caracterizó la interfaz de interacción entre el antígeno HNL y el anticuerpo monoclonal Anti-HNL MAB2. El análisis indica que el epítopo de este anticuerpo monoclonal incluye los siguientes aminoácidos sobre el antígeno HNL: 83; 88; 145; 154. En el anticuerpo, el paratopo incluye los siguientes aminoácidos: Cadena pesada: 76; Cadena ligera: 114.

Anticuerpo Anti-HNL MAB3

Después de la reticulación, los péptidos generados por la proteólisis multienzimática cubren el 95 % de la secuencia total del antígeno. Utilizando los hibridomas anti-HNL MAB3 siempre que se haya realizado una secuenciación de ADNc con el siguiente resultado:

Cadena Ligera Región variable:

DIVLTQTTSSLSVSLGDRVTINCRASQDISNYLNWYQEKPDGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTITNLEQ EDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKR ADAAPTV

Región variable de cadena pesada:

EVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGIHWLRQPPGKDLEWLVVIWGDGSTTSNSALKSRLSISKDNSKSQVF FKMSGLQTDDTAIYYCARHR YSDYHAM DYWGPGTSVTVSS

Mediante reticulación química, espectrometría de masas MALDI de alta masa y espectrometría de masas nLC-Orbitrap se caracterizó la interfaz de interacción entre el antígeno HNL y el anticuerpo monoclonal Anti-HNL MAB3. El análisis indica que el epítopo de este anticuerpo monoclonal incluye los siguientes aminoácidos sobre el antígeno HNL: 145; 154. En el anticuerpo, el paratopo incluye los siguientes aminoácidos: Cadena ligera: 74; 76; 85.

2. Análisis de muestras clínicas con anticuerpos anti-HNL

El alto poder discriminatorio de HNL se acentúa más con mediciones en suero y no con plasma EDTA, lo que parece sugerir que los neutrófilos en el tubo de ensayo ex vivo continúan liberando su HNL tras la preparación del suero.

Esta actividad de liberación refleja el estado de activación de los neutrófilos que fue inducido por el desafío bacteriano pero no por los virus. Para que sea útil en el servicio de urgencias o en la consulta del médico, el tiempo total de ensayo desde la extracción de sangre hasta el resultado de cualquier biomarcador debe ser corto, es decir, <15-20 minutos, que es la filosofía que subyace al desarrollo de los ensayos en el punto de atención (POC). Tales requisitos son bastante difíciles con las mediciones séricas de HNL, ya que, como se indicó anteriormente, esto requiere una preactivación bastante larga de los neutrófilos. Se probó la posibilidad de que la activación de los neutrófilos en la sangre por el tripéptido activador de neutrófilos fMLP, bien establecido, eluda el problema. El activador de neutrófilos se utiliza para imitar la activación de neutrófilos que se produce durante la coagulación de la sangre total y sustituye la necesidad de medir el HNL en suero después de una incubación prolongada.

En este ejemplo, se recolectó sangre de una cohorte de pacientes con signos de infección aguda para comparar el rendimiento diagnóstico de las concentraciones de HNL en sangre total después de la activación con fMLP con el rendimiento diagnóstico de HNL en plasma no activado. Además, se comparó el rendimiento diagnóstico de la prueba HNL utilizando este principio con el rendimiento diagnóstico de pruebas contemporáneas como recuento de neutrófilos en sangre, CRP, la expresión en los neutrófilos del receptor de IgG1 CD64 y la procalcitonina.

Activación de neutrófilos por fMLP

Los neutrófilos purificados de la sangre de pacientes y e individuos saludables se expusieron a diversas concentraciones de fMLP y se incubaron durante 15 min a 37 °C y posteriormente se centrifugaron y se analizó el sobrenadante para detectar la presencia de HNL. Se encontró que la concentración óptima para la liberación de fMLP era de 5x10-8 mol/L. Con el fin de estudiar la cinética de liberación de HNL, las células purificadas se incubaron durante diferentes períodos de tiempo. Se observó una liberación significativa después de 5 min de incubación y aumentó aún más con la incubación prolongada (Fig. 2).

Con el fin de probar la posibilidad de que la propensión a la liberación de neutrófilos después de la incubación con fMLP reflejara la liberación de HNL en sangre total después de la coagulación, se comparó la liberación de HNL de los neutrófilos purificados de 23 pacientes con infecciones agudas y 20 sujetos sanos con las concentraciones séricas de HNL de los respectivos sujetos. Como se puede observar en la Fig. 3 se obtuvo una correlación significativa y lineal (r=0.743, p=0.002) entre las concentraciones sobrenadante y sérica de HNL.

Resultados clínicos

Se recolectó sangre total heparinizada y plasma EDTA de 600 pacientes con síntomas de infección aguda y de 144 sujetos sanos aparentemente no infectados. Sin conocer los resultados de los biomarcadores investigados (expresión de HNL, PCT y CD64 en neutrófilos sanguíneos), los pacientes infectados fueron clasificados por motivos clínicos como causantes bacterianos o virales de la enfermedad. Esta clasificación incluyó el conocimiento de las concentraciones de CRP y glóbulos blancos y diferenciales. Se clasificó a 240 pacientes como portadores de bacterias o virus como causa probable de sus infecciones y se consideró que 325 pacientes tenían una causa posible o incierta de sus infecciones. 35 pacientes tuvieron micoplasma como causa de infección. En los pacientes con una causa probable de sus infecciones, la infección se confirmó mediante pruebas objetivas como cultivo bacteriano y/o PCR y/u otras pruebas objetivas. También se incluyeron en el diagnóstico CRP y los recuentos de glóbulos blancos. Este último grupo de pacientes, sin los que tenían una infección por micoplasma, constituyó en total 384 sujetos (sanos: 144, infecciones bacterianas: 185, infecciones virales: 55) y fue el grupo utilizado en este informe para examinar el rendimiento diagnóstico de los biomarcadores.

El rendimiento diagnóstico de HNL para el diagnóstico de infección bacteriana aguda

En las Figs. 4 a y b se muestran las concentraciones de HNL en sangre total después de la activación de fMLP durante 20 min a 37°C y en plasma EDTA. En comparación con las concentraciones de HNL en sangre total activada por fMLP de sujetos sanos (media geométrica 98 pg/L, 95% Cl 90-107, pg/L), las concentraciones en pacientes con infecciones bacterianas (media geométrica 337 pg/L, 95% Cl 300-379 pg/L) (p<0,0001) y virales (media geométrica 117 pg/L, 95% Cl 101-136 pg/L) (p<0,05) aumentaron significativamente.

Las concentraciones de HNL en plasma de sujetos sanos fueron de 35 pg/L (media geométrica, 95% Cl 34-36 pg/L) con concentraciones significativamente mayores en pacientes con infecciones bacterianas, 64 pg/L (media geométrica, 95% Cl 60-69) (p<0,0001) y en pacientes con infecciones virales, 43 pg/L (media geométrica 95% Cl 38-49) (p=0,0001). Es evidente que la superposición entre lo sano y lo bacteriano es mayor con el plasma EDTA. En promedio, las cantidades adicionales de HNL liberadas por los neutrófilos en sangre total activadas por fMLP fueron 2.8 veces para los sujetos sanos, 5.3 veces para los pacientes con infecciones bacterianas y 2.7 veces para los que tenían infecciones virales. Por lo tanto, no se observó ninguna liberación adicional de HNL sobre sujetos sanos con sangre total activada por fMLP.

Las Figs. 5 a y b muestran los resultados diagnósticos de los dos ensayos de HNL, es decir, en sangre total activada por fMLP y en plasma EDTA. En la Fig. 5a la distinción entre sujetos sanos no infectados y aquellos con infección bacteriana confirmada se muestra por medio de curvas de características operativas del receptor (ROC). El área bajo la curva (AUC) para la prueba de HNL en sangre total activada por fMLP fue de 0.95 (95% 0.91-0.97) en comparación con 0.88 (95% Cl 0.84-0.91), p = 0.0003 para la prueba de HNL en plasma EDTA. Para la sangre total activada por fMLP, el valor predictivo negativo (VPN) a 125 pg/L de HNL fue del 90% (95% Cl 82-96%) y el valor positivo del 83% (95% Cl 77-89%). Para el plasma de EDTA a una concentración de HNL de 40 pg/L, el VPN fue del 86% (IC del 95%: 72-95%) y el VPP, del 63% (Cl del 95%: 57-69%). En la distinción entre infecciones bacterianas y virales, el AUC para la sangre total activada por fMLP fue de 0.92 (95% Cl 0.87-0.96) y para EDTA-plasma de 0.79 (95% Cl 0.71-0.85), p=0.0006.

A la concentración de 110 pg/L el NVP fue del 93% (95% Cl 68-100%) y el PPV 85% (77-90%) para sangre total activada por fMLP. Las cifras correspondientes para HNL a la concentración de 40 pg/L en EDTA-plasma fueron NPV 52% (95% Cl 37-67%) y PPV 85% (95% Cl 78-90%). El NPV no superó el 60% a ninguna concentración de HNL en plasma EDTA. Por lo tanto, el rendimiento clínico del HNL en sangre total activada por fMLP fue superior al del HNL en el plasma de EDTA, tanto en la distinción entre sujetos sanos e infecciones bacterianas como en la distinción entre infecciones bacterianas y virales.

Rendimiento diagnóstico de CRP, recuento de neutrófilos en sangre, expresión de CD64 en neutrófilos y procalcitonina para el diagnóstico de infección bacteriana aguda.

Las Figs. 6 a-d muestran la distribución de los biomarcadores PCR, recuento de neutrófilos en sangre, expresión de CD64 en neutrófilos en sangre y procalcitonina en las poblaciones estudiadas. Con la excepción de los recuentos de neutrófilos, todos los demás biomarcadores aumentaron significativamente tanto en las infecciones bacterianas como en las virales en comparación con los sujetos sanos (p<0.0001). Todos los biomarcadores fueron significativamente más altos en infecciones bacterianas frente a virales (p<0.0001). Las concentraciones medias se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Concentraciones y expresiones de cuatro biomarcadores.

Los AUC se indican en la tabla 2. En la distinción entre infecciones sanas y bacterianas, cuatro biomarcadores mostraron AUCs >90 y estos fueron CRP, HNL en sangre total activada por fMLP, la expresión de CD64 en neutrófilos sanguíneos y recuentos de neutrófilos sanguíneos. El AUC de HNL en sangre total activada por fMLP fue significativamente mayor que el AUC de HNL en EDTA-plasma (p<0.001) y procalcitonina (p<0.05) y el AUC de la expresión de CD64 en neutrófilos fue mayor que el HNL plasmático de EDTA (p=0.002), pero no significativamente diferente del PCT (p=0.06). CRP mostró el AUC más alto, pero no se calcularon las estadísticas debido al riesgo inherente de sesgo.

En la distinción entre infecciones bacterianas y virales, solo el AUC de la sangre total activada por fMLP fue del >90%. Esto fue significativamente diferente de EDTA-HNL plasmático (p = 0.003), la expresión de CD64 en neutrófilos y procalcitonina (p<0.0001 para ambas comparaciones). El AUC del HNL plasmático con EDTA fue significativamente mayor que el de la procalcitonina (p=0.01).

T l 2. Ár l rv R l biomarcadores estudiados

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente aglutinante capaz de unirse específicamente a un epítopo polipeptídico de la lipocalina neutrófila humana (HNL), en el que dicho epítopo polipeptídico es un epítopo conformacional compuesto por el péptido en SEQ ID No: 26, en el que el agente aglutinante comprende las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que se representan en SEQ ID Nos: 8 a 13.

2. El agente aglutinante según la reivindicación 1, en el que dicho agente aglutinante se selecciona a partir de anticuerpos, fragmentos de los mismos, y en el que la cadena pesada tiene una secuencia como se muestra en el SEQ ID NO: 3, y la cadena ligera tiene una secuencia como se muestra en el SEQ ID NOs: 2.

3. Una composición diagnóstica que comprende un agente aglutinante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

4. Un kit de diagnóstico que comprenda recipientes que contengan un agente aglutinante mencionado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, opcionalmente instrucciones de uso, tampones y un dispositivo para análisis de muestras de sangre, plasma, suero, orina, LCR, médula ósea, saliva o esputo.

5. Un método para diagnosticar una infección bacteriana o diferenciar una infección bacteriana de una infección viral, caracterizado porque una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de tener una infección bacteriana o viral se analiza para el nivel de HNL utilizando un agente aglutinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, o una composición diagnóstica según la reivindicación 3 o un kit según la reivindicación 4, dicho método comprende:

a) Incubar una muestra en presencia de dicho aglutinante;

b) Lavar opcionalmente el material de muestra no unido;

d) Comparar el nivel de HNL medido en el paso c) con un nivel de control;

e) Diagnóstico de una infección bacteriana cuando el nivel de HNL en el paso c) es significativamente más alto que el nivel detectado en muestras de control de sujetos sanos y de pacientes que se sabe que tienen una infección viral.

6. Un dispositivo para el diagnóstico de infecciones bacterianas en una muestra de sangre, plasma, suero, orina, LCR, médula ósea, saliva o esputo que comprenda un compartimento que comprenda el agente aglutinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho compartimento sea adecuado para entrar en contacto con dicha muestra, que comprenda opcionalmente un compartimento que comprenda un sustrato químico capaz de activar los neutrófilos presentes en la muestra antes de su posterior análisis, en el que dicho compartimento comprenda un orificio que lo conecte con dicho compartimento que comprenda el agente aglutinante, que comprenda opcionalmente un conector para conectar dicho dispositivo con otro dispositivo para la extracción de una muestra de sangre de un sospechoso, y/o un conector para combinar dicho dispositivo con un ordenador y/o un aparato para el análisis de reacciones químicas, físicas o biológicas en dicho dispositivo, en el que dichas reacciones son indicativas de una interacción de HNL y dicho aglutinante, y que además permite determinar opcionalmente el nivel de HNL en dicha muestra.

7. El producto según la reivindicación 6, seleccionado de los dispositivos en el punto de atención, tiras reactivas, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, ensayos de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ, preferiblemente los que utilizan oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisótopos, Western blots, ensayos de precipitación, ensayos de aglutinación, preferiblemente ensayos de aglutinación en gel o ensayos de hemaglutinación, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, ensayos de inmunoelectroforesis y dispositivos para la detección de analitos que impliquen la separación magnética de los analitos.