CN117741165A - 一种高特异性、高灵敏度hnl检测用胶体金免疫层析试纸条及其制备方法以及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板，PVC底板上依次设置有样品垫、金标垫、包被膜、吸水垫；样品垫和吸水垫分别设置在PVC底板的两端，金标垫的一端压在所述样品垫的下方，硝酸纤维素膜的两端分别压在金标垫以及吸水垫的下方；金标垫上包被有胶体金标记的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体和小鼠IgG抗体混合物；包被膜包括硝酸纤维素膜以及设置在硝酸纤维素膜上的包被中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体的检测线、包被羊抗鼠多克隆抗体的控制线。本发明还公开了试纸条的制备方法以及使用方法。本发明提供的试纸条测试精确度高，具有较低的最低检测限。

Description

一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条及 其制备方法以及使用方法

技术领域

本发明涉及测试技术领域，具体涉及一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条及其制备方法以及使用方法。

背景技术

中性粒细胞载脂蛋白(Human neutrophil lipocalin，HNL)，是人中性粒细胞二级颗粒的主要组成成分，分子量约45kD。在正常生理状态下，HNL在肾、肺、前列腺、胃肠道等器官中均低表达。研究表明，当人体发生细菌感染时，中性粒细胞将HNL释放至外周血，可引起外周血中HNL水平明显升高，其含量在感染6-8h即可升高，在24-48h达到峰值，可以用于早期细菌感染的诊断；而健康人或病毒感染时，HNL含量则无明显升高。采用HNL检测区分急性细菌和病毒感染时，其敏感度和特异性为97％和96％。因此，对患者体内HNL的含量检测可以用于急性细菌感染的早期诊断以及急性细菌感染与病毒感染的鉴别诊断。

酶联免疫法(ELISA)是目前最常用的一种免疫分析筛查方法。该方法将抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一，敏感性相结合的一种标记免疫学技术。其基本原理是将检测所需的抗原或抗体通过非共价键结合在固相载体表面；检测时，待检样品中目标物与固相载体表面抗原或抗体发生免疫学反应；洗涤后，加入酶标抗原或抗体。此时固相载体上的酶与待检目标物的量呈一定的比例，加入酶底物催化显色后，根据颜色深浅对目标物浓度进行定性或定量分析。但是ELISA方法存在以下缺点:一、ELISA法检测一般需要3-4h才能出结果；二、ELISA由于加样量不一致，加样时间长短不一，洗涤条件，操作人员不一致，会导致测定重复差值大，重复性差；三、ELISA法检测时需要使用多种仪器设备或试剂，操作步骤相对复杂，需经过相关实验仪器培训的人员操作；四、ELISA法制作成本高，制作耗材、使用样本量、试剂用量及试剂种类等相对较多且价格昂贵；五、ELISA法的储运温度2-8℃，要求较高；六、ELISA法测试要凑够96样本，测试不便；七、ELISA加样相对复杂，容易发生孔间污染，从而导致假阳性结果，影响测试的准确性。

基于上述酶联免疫法存在的缺点，胶体金免疫层析法因其测试时间短、准确度好、重复性好、操作简单、成本低等优点得到广泛应用。胶体金免疫分析技术(CGIA)是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫分析技术，胶体金具有很大的比表面积及良好的生物相容性，可以与被标记物通过物理吸附进行非共价结合，其标记技术具有简单快速和无污染等优点，且结果检测不需昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至通过肉眼即可辨别鉴定。凭借以上优点，基于胶体金的检测技术一度成为研究的热点，尤其是胶体金免疫层析试纸条已被广泛使用。目前关于胶体金免疫层析试纸条的问问题主要在于如何提高其精确度以及降低其低检测限值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术存在的不足，提供一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条及其制备方法以及使用方法，本发明提供的试纸条重复性好，准确度高，且具有较低的检测下限值。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:

一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤:

(1)制备胶体金溶液:

以柠檬酸三钠作为还原剂制备粒径为30nm的胶体金溶液；

(2)胶体金-抗体复合物的制备:

采用K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8-8.5，采用重悬液将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，将稀释后的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体溶液和胶体金溶液混合，摇床振荡5-15min后加入10w/v％BSA溶液，继续摇床振荡15-25min，之后在4℃下进行一次低速离心处理，收集上清液，上清液继续在4℃下进行第二次高速离心处理，收集沉淀，得到的沉淀用重悬液重悬，得第一分散液，其OD值为36-40；

采用K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8.5-9.2，采用重悬液将小鼠IgG抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，将稀释后的小鼠IgG抗体溶液和胶体金溶液混合，摇床振荡5-15min后加入10w/v％BSA溶液，继续摇床振荡15-25min，之后在4℃下进行一次低速离心处理，收集上清液，上清液继续在4℃下进行第二次高速离心处理，收集沉淀，得到的沉淀用重悬液重悬，得第二分散液，其OD值为27-28；将第一分散液和第二分散液混合，得胶体金-抗体复合物。

(3)金标垫的制备:

将聚酯膜放入由Na₂HPO₄·12H₂O、BSA、Triton X-100、Proclin 300组成的缓冲液中浸泡，之后取出干燥，得预处理聚酯膜；然后采用喷金仪将步骤(2)制得的胶体金-抗体复合物均匀喷涂在预处理聚酯膜上，然后进行干燥，得金标垫，采用铝箔袋密封干燥保存，备用；

(4)样品垫的制备:

将玻璃纤维膜放入由Na₂B₄O₇·10H₂O、BSA、NaCl、SDS-L、Proclin300、表面活性剂S9、Tween-20组成的缓冲液中浸泡，取出后干燥，得样品垫，铝箔袋密封干燥保存备用；

(5)包被膜的制备:

使用由Na₂HPO₄·12H₂O、表面活性剂S9组成的包被液将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，然后采用喷膜仪将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线，得检测线；采用包被液将抗鼠多克隆抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，然后采用喷膜仪将抗鼠多克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线，得控制线；

(6)组装:

将吸水垫、样品垫、硝酸纤维素膜、金标垫粘在PVC底板上，且硝酸纤维素膜的一端与吸水垫有部分重叠，所述金标垫的两端分别与样品垫、硝酸纤维素膜有部分重叠，然后切条组装。

作为上述技术方案的优选，稀释后的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2):100，和/或所述10w/v％BSA溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2)::10，和/或稀释后的小鼠IgG抗体溶液和胶体金溶液的体积比为1::(20-30)，和/或所述10w/v％BSA溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2):10。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述重悬液的pH为7.4，所述重悬液包括10w/v％蔗糖，1w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述一次离心处理的离心转速为2000rpm，一次离心处理的离心时间为10-20min；和/或所述二次离心处理的离心转速为11000rpm，所述二次离心处理的离心时间为40-50min。

进一步的，所述第一分散液和第二分散液的体积比为1:(1-2)。

作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，喷涂时喷金仪的喷量为4-5μl/cm；所述缓冲液包括10mM Na₂HPO₄·12H₂O，3w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100，0.01v/v％Proclin300。

作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述缓冲液包括20mM Na₂B₄O₇·10H₂O，1w/v％BSA，0.8w/v％NaCl，0.05v/v％SDS-L，0.01v/v％Proclin300，0.5-5v/v％表面活性剂S9，0.1-0.5v/v％Tween-20。

作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，检测线和控制线平行，检测线以及控制线制备时喷膜仪的喷量均为0.5-1μl/cm，和/或所述检测线和质控线间距为0.3-0.8cm。

作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，所述包被液包括20mM Na₂HPO₄·12H₂O，表面活性剂S9:0.5-5v/v％。

作为上述技术方案的优选，步骤(3)、(4)、(5)中，干燥的温度为30-40℃，步骤(3)、(4)、(5)中干燥的时间分别为1-3h、10-15h、10-15h；和/或步骤(3)、(4)中浸泡的时间分别为1-3h、4-6h。

为了更好的解决上述技术问题，本发明还公开了以下技术方案:

一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板，所述PVC底板上依次设置有样品垫、金标垫、包被膜、吸水垫；所述样品垫和吸水垫分别设置在PVC底板的两端，所述金标垫的一端压在所述样品垫的下方，所述硝酸纤维素膜的两端分别压在所述金标垫以及吸水垫的下方；

所述金标垫上包被有胶体金标记的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体和小鼠IgG抗体混合物；所述包被膜包括硝酸纤维素膜以及设置在硝酸纤维素膜上的包被中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体的检测线、包被羊抗鼠多克隆抗体的控制线，所述检测线靠近金标垫，所述控制线靠近样品垫。

本发明还公开了一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的使用方法，具体包括以下步骤:

S1:将标准品干粉从4℃条件下取出后放室温平衡15min，小心打开瓶盖并根据瓶上标示的装置规格加纯水复溶，室温静置5min后，轻晃瓶体使标准品干粉充分溶解，得标准品溶液；

S2:将标准品溶液用由Tris-base、NaCl、Proclin-300、BSA、Tween-20、阻断剂HIER、HCl组成的定标品稀释液逐级稀释至20、40、80、160、320、640倍，得不同浓度的待测样品；

S3:向试纸条的点样孔中加入100μl不同浓度的待测样品，15分钟后将试纸条插入胶体金试纸定量分析仪中进行测试，得T/C值，保存实验数据；

S4:以标准品溶液浓度的log值为横坐标，以T/C值的log值为纵坐标绘制得到标准曲线。

作为上述技术方案的优选，所述定标品稀释液包括50mM Tris-base，0.15M NaCl，0.1v/v％Proclin-300，1.5w/v％BSA，0.01-0.1v/v％Tween-20，0.1-1v/v％阻断剂HIER，且加入盐酸调节pH至7-8。

由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果:

(1)本发明提供的试纸条采用了双抗夹心法的原理:胶体金与一抗进行偶联，制备获得的金标抗体喷涂于结合垫；检测时，样品液滴加在样品垫，之后与结合垫的金标抗体反应，形成的复合物在NC膜上在毛细管作用下向前泳动；当复合物泳动至NC膜上喷有二抗的检测线时，被捕获抗体捕获，形成双抗夹心免疫复合物(胶体金--一抗--抗原--二抗)；检测线因标记物的积累而显色，其颜色的深浅即可反映样品液中待测物的多少。经过检测线未结合游离的标记抗体或抗原抗体免疫复合物继续向前泳动，到达控制线(即C线)时，与控制线上的二抗结合，形成复合物，质控线显色，操作简单，准确度高。不需要借助酶标检测仪等仪器，胶体金所使用的仪器体积相对较小，更方便运输与携带。

(2)本发明提供的试纸条的检测时间更短，效率更高，保存时间较长；本发明的胶体金试纸条受外界干扰小，检测结果更可靠，且在测试时样品前处理过程简单，操作人员更易牢记和熟练相关步骤，降低实验操作误差；本发明试纸条在检测时所需试剂和样品量较少，性价比更高，可用来筛选大批量样品，应用范围更广。

(3)本发明在制备试纸条中的样品垫时，在处理液中加入了一定量的表面活性剂S9和Tween-20，在制备包被膜的包被液中加入一定量的表面活性剂S9，上述设置大大提高了试纸条的测试准确度，使得试纸条的最低检测限值大大降低，提高了试纸条的测量范围。这主要是由于表面活性剂S9既具有良好的界面活性，又兼备阴、阳离子表面活性剂的优点，同时还具有良好的乳化能力、分散能力和抗静电作用等优点。S9表面活性剂既不易受无机电解质的影响，又无浊点现象，而且无论吸附到正电荷还是负电荷的界面上都不会形成疏水表面。本发明将一定量的表面活性剂S9和Tween-20加入到制备样品垫的处理液中，使得样品在样品垫上更均匀均匀分布，且可有效控制样本的液流速度，从而提高测试结果的准确性。此外，本发明还在制备包被膜的包被液中加入一定量的表面活性剂S9，其具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，可减少NC膜对被检测物质和金标的吸收，背景干净且无T线反白现象，进而提高测试精确度，还在一定程度上降低了最低检测限；适量S9的添加可以在一定程度上提高测试的灵敏度，即有增色作用(线条强度增加)；S9为非溶血性，不会有溶血作用，不会造成红细胞释放，跑板背景红的现象，也适用于全血检测的产品，提高了试纸条的应用范围。

(4)本发明在绘制标准曲线中定标品稀释液中添加一定量的Tween-20和阻断剂HIER；这主要是由于在免疫双抗体夹心反应中，部分检测样本中存在某些抗体，能够结合异种动物抗体，将捕获抗体和检测抗体不通过抗原形成夹心，而直接连接在一起形成假阳性结果；或者分别结合捕获抗体和检测抗体，造成无法产生夹心，形成假阴性的结果。而本发明提供的试纸条在检测时，定标品稀释液中的阻断剂HIER可与产生干扰的抗体充分结合，从而阻断其与检测用的捕获抗体或标记抗体的结合，从而保证标准曲线的精确度，进而提高检测结果的精确度。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例和对比例中，胶体金试纸定量分析仪为苏州和迈精密仪器有限公司的GIC-M6；聚酯膜购于上海杰一生物科技股份有限公司；玻璃纤维膜购于杭州华润实业有限公司；硝酸纤维素膜为印度MDI 140BP；吸水垫购于上海杰一生物科技股份有限公司；PVC底板购于上海杰一生物科技股份有限公司；中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体购于菲鹏生物科技有限公司；小鼠IgG抗体购于杭州博岳生物科技有限公司；中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体购于菲鹏生物科技有限公司；羊抗鼠多克隆抗体购于杭州博岳生物科技有限公司。

下述实施例以及对比例中其他所用到的物质无特殊要求，市场均有销售，只要满足质量标准均可用来实施。

下述制备工艺条件中如无特殊说明，均为现有技术中常规操作。

下述实施例以及对比例中:

重悬液包括10w/v％蔗糖，1w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100，其pH为7.4；

第一缓冲液包括10mM Na₂HPO₄·12H₂O，3w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100，0.01v/v％Proclin 300；

第二缓冲液包括20mM Na₂B₄O₇·10H₂O，1w/v％BSA，0.8w/v％NaCl，0.05v/v％SDS-L，0.01v/v％Proclin300，表面活性剂S9:0.5v/v％，Tween-20:0.1v/v％；

包被液包括20mM Na₂HPO₄·12H₂O，表面活性剂S9:0.5v/v％，

实施例1

一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤:

(1)胶体金-抗体复合物的制备

将粒径为30nm的胶体金溶液用0.1M K₂CO₃调节pH为8.2，将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体用重悬液稀释后加入到胶体金溶液中，控制中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体稀释液与胶体金溶液的体积比为1:100，摇床振荡10min后加入胶体金体积10％的BSA溶液，继续摇床振荡20min；之后在4℃、2000rpm的条件下离心17min后弃去沉淀，上清液在4℃、11000rpm的条件下下继续离心45min后弃去上清，得到的沉淀用重悬液重悬得第一分散液，其OD值为38；

采用K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至9.0，采用重悬液将小鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，将稀释后的小鼠IgG抗体溶液和胶体金溶液混合，控制稀释后的小鼠IgG抗体溶液与胶体金溶液的体积比为1:25，摇床振荡10min后加入10w/v％BSA溶液，控制10w/v％BSA与胶体金体积比1:10，继续摇床振荡20min，之后在4℃、离心转速为2000rpm的条件下进行一次离心处理17min，收集上清液，上清液继续在4℃、离心转速为11000rpm的条件下进行二次离心处理45min，收集沉淀，得到的沉淀用重悬液重悬，得第二分散液，其OD值为27；将第一分散液和第二分散液以体积比为1:1的比例混合均匀制得胶体金-抗体复合物；

(2)金标垫的制备

将制作金标垫的材料聚酯膜放入第一缓冲液中浸泡2h，取出后于37℃干燥2h；然后将胶体金-抗体复合物用喷金仪均匀的铺在经过预处理的金标垫上，喷量控制在4.5ul/cm，之后于37℃干燥2h，得金标垫，铝箔袋密封干燥保存备用；

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜放入第二缓冲液中浸泡5h，取出后于37℃干燥过夜，得样品垫，铝箔袋密封干燥保存，备用；

(4)包被膜的制备

采用包被液将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体稀释，然后采用喷膜仪以喷量为0.8μl/cm的条件将其在硝酸纤维素膜上划线，干燥箱内37℃干燥12h，得检测线；采用包被液将羊抗鼠多克隆抗体稀释，采用喷膜仪以0.8μl/cm的条件将其在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测线平行，然后在干燥箱内37℃干燥12h，得控制线；

(5)试纸条的组装

将吸水垫、样品垫、硝酸纤维素膜、金标垫粘在PVC底板上，且硝酸纤维素膜的一端与吸水垫有部分重叠，所述金标垫的两端分别与样品垫、硝酸纤维素膜有部分重叠，然后切条组装。

实施例2

标准曲线的建立

S1:标准品干粉的溶解

将标准品干粉从4℃条件下取出后放室温平衡15min，小心打开瓶盖并根据瓶上标示的装置规格加纯水复溶，室温静置5min后，轻晃瓶体使标准品干粉充分溶解，待标准品干粉完全溶解后得标准品溶液，取样完毕及时置于4℃条件下保存；

S2:将标准品溶液用定标品稀释液逐级稀释至20、40、80、160、320、640倍，制得不同浓度的待测样品，分别即为A1、A2、A3、A4、A5、A6；定标品稀释液包括50mM Tris-base，0.15M NaCl，0.1％ Proclin-300，1.5％ BSA，Tween-20:0.01％，阻断剂HIER:0.1％，且加入盐酸调节pH为7.8。

S3:向试纸条的点样孔中分别加入100μl待测样品A1、A2、A3、A4、A5、A6，15分钟后将实施例1制得的试纸条插入胶体金试纸定量分析仪中进行测试，得T/C值，保存实验数据；

S4:以标准品溶液浓度的log值为横坐标，以T/C值的log值为纵坐标绘制得到标准曲线。

对比例1

制备样品垫时第二缓冲溶液中不加入表面活性剂S9以及Tween-20，其他条件和实施例1相同。

对比例2

制备包被膜时包被液中不添加表面活性剂S9，其他条件和实施例1相同。

对比例3

建立标准曲线时，定标品稀释液中不添加Tween-20和阻断剂HIER，其他条件和实施例2相同。

应用测试方法一

实施例1以及对比例1-2制得的试纸条的具体使用方法如下:

(1)实验前，将待测样本和检测试剂从储存条件下取出，平衡至室温；

(2)用定标品稀释液将待测样品进行200倍稀释，充分混匀，得待测溶液；

(3)打开铝箔袋包装，取出检测卡，水平放置于实验台上；

(4)确认ID卡与检测试纸条的批号相匹配；

(5)打开胶体金试纸定量分析仪，插入试剂盒配套ID卡，检查检测项目、试剂信息与使用试剂是否一致；

(6)取步骤(2)制得的待测溶液加入到检测卡加样孔中；

(7)室温下反应15分钟，将检测卡插入胶体金试纸定量分析仪的卡槽内检测，仪器通过ID卡中内置校准曲线及加样体积，自动计算出样本中中性粒细胞载脂蛋白(HNL)的浓度含量，读取并打印测试结果。

正常参考值为≤130ng/mL，当测得的浓度小于130ng/mL时，该样本为阴性，当测得的浓度大于或等于130ng/mL时，该样本为阳性。

应用测试方法二

采用对比例3制得的标准曲线，其他条件和应用测试方法一相同。

应用实施例一

将上述实施例1制得的试纸条分别各取5人份，每个批次检测5份不同浓度的阴性参考品，将对比例1和对比例2制得的试纸条各取5人份，分别应用测试方法一的方法、应用测试方法二的方法分别检测5份不同浓度的阴性参考品，每个阴性参考品样本测定1次，15min后检测结果，统计各检测试纸条的阴性参考品误差率。如表1所示。

表1

应用实施例二

将各批次的本发明实施例1的检测试纸条分别各取5人份，对阳性参考品进行检测，将对比例1和对比例2制得的检测试纸条分别各取5人份，分别采用应用测试方法一、应用测试方法二对阳性参考品进行检测，每个阳性参考品样本测定1次，保证结果的正确，15min后检测结果，将各批次参考品检测结果与正常参考值进行比较，从而统计各检测试纸条的阳性参考品符合率，结果如表2所示。

表2

应用实施例三

将各批次的实施例1制得的检测试纸条分别取10份，分别取10份对比例1以及对比例2制得的检测试纸条，对最低检测限进行检测，15min后检测结果，结果如表3所示。

表3

批号	最低检测限浓度(ng/mL)	实际测得浓度均值(ng/mL)
			20230901	28	28.67
20230902	28	27.75
			20230903	28	29.06
对比例1	40	40.72
			对比例2	40	39.98

从上述表1、表2、表3测试结果可以看出，本发明提供的试纸条的精确度更高，尤其是在检测低浓度样品时，相对于对比例1和对比例2提供的试纸条，本发明提供的试纸条具有更低的误差率。而且本发明制得的试纸条灵敏度更高，具有更低的检测限。

此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤:

(1)制备胶体金溶液:

以柠檬酸三钠作为还原剂制备粒径为30nm的胶体金溶液；

(2)胶体金-抗体复合物的制备:

采用K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8-8.5，采用重悬液将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，将稀释后的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体溶液和胶体金溶液混合，摇床振荡5-15min后加入10w/v％BSA溶液，继续摇床振荡15-25min，之后在4℃下进行一次低速离心处理，收集上清液，上清液继续在4℃下进行第二次高速离心处理，收集沉淀，得到的沉淀用重悬液重悬，得第一分散液，其OD值为36-40；

采用K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8.5-9.2，采用重悬液将小鼠IgG抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，将稀释后的小鼠IgG抗体溶液和胶体金溶液混合，摇床振荡5-15min后加入10w/v％BSA溶液，继续摇床振荡15-25min，之后在4℃下进行一次低速离心处理，收集上清液，上清液继续在4℃下进行第二次高速离心处理，收集沉淀，得到的沉淀用重悬液重悬，得第二分散液，其OD值为27-28；将第一分散液和第二分散液混合，得胶体金-抗体复合物；

(3)金标垫的制备:

将聚酯膜放入由Na₂HPO₄·12H₂O、BSA、Triton X-100、Proclin 300组成的缓冲液中浸泡，之后取出干燥，得预处理聚酯膜；然后采用喷金仪将步骤(2)制得的胶体金-抗体复合物均匀喷涂在预处理聚酯膜上，然后进行干燥，得金标垫，采用铝箔袋密封干燥保存，备用；

(4)样品垫的制备:

将玻璃纤维膜放入由Na₂B₄O₇·10H₂O、BSA、NaCl、SDS-L、Proclin300、表面活性剂S9、Tween-20组成的缓冲液中浸泡，取出后干燥，得样品垫，铝箔袋密封干燥保存备用；

(5)包被膜的制备:

使用由Na₂HPO₄·12H₂O、表面活性剂S9组成的包被液将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，然后采用喷膜仪将中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线，得检测线；采用包被液将抗鼠多克隆抗体稀释至0.5-1.5mg/ml，然后采用喷膜仪将抗鼠多克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线，得控制线；

(6)组装:

将吸水垫、样品垫、硝酸纤维素膜、金标垫粘在PVC底板上，且硝酸纤维素膜的一端与吸水垫有部分重叠，所述金标垫的两端分别与样品垫、硝酸纤维素膜有部分重叠，然后切条组装。

2.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，稀释后的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2):100，和/或所述10w/v％BSA溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2):10，和/或稀释后的小鼠IgG抗体溶液和胶体金溶液的体积比为1:(20-30)，和/或所述10w/v％BSA溶液与胶体金溶液的体积比为(1-2):10，和/或所述重悬液的pH为7.4，所述重悬液包括10w/v％蔗糖，1w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100。

3.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述一次离心处理的离心转速为2000rpm，一次离心处理的离心时间为10-20min；和/或所述二次离心处理的离心转速为11000rpm，所述二次离心处理的离心时间为40-50min。

4.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，喷涂时喷金仪的喷量为4-5μl/cm；所述缓冲液包括10mMNa₂HPO₄·12H₂O，3w/v％BSA，0.1v/v％Triton X-100，0.01v/v％Proclin 300。

5.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，所述缓冲液包括20mM Na₂B₄O₇·10H₂O，1w/v％BSA，0.8w/v％NaCl，0.05v/v％SDS-L，0.01v/v％Proclin300，0.5-5v/v％表面活性剂S9，0.1-0.5v/v％Tween-20；所述检测线和控制线平行，检测线以及控制线制备时喷膜仪的喷量均为0.5-1μl/cm，和/或所述检测线和质控线间距为0.3-0.8cm。

6.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(5)中，所述包被液包括20mM Na₂HPO₄·12H₂O，表面活性剂S9:0.5-5v/v％。

7.根据权利要求1所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:步骤(3)、(4)、(5)中，干燥的温度为30-40℃，步骤(3)、(4)、(5)中干燥的时间分别为1-3h、10-15h、10-15h；和/或步骤(3)、(4)中浸泡的时间分别为1-3h、4-6h。

8.根据权利要求1至7任一所述的方法制得的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条，其特征在于:包括PVC底板，所述PVC底板上依次设置有样品垫、金标垫、包被膜、吸水垫；所述样品垫和吸水垫分别设置在PVC底板的两端，所述金标垫的一端压在所述样品垫的下方，所述硝酸纤维素膜的两端分别压在所述金标垫以及吸水垫的下方；

所述金标垫上包被有胶体金标记的中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体II抗体和小鼠IgG抗体混合物；所述包被膜包括硝酸纤维素膜以及设置在硝酸纤维素膜上的包被中性粒细胞载脂蛋白单克隆抗体Ⅰ抗体的检测线、包被羊抗鼠多克隆抗体的控制线，所述检测线靠近金标垫，所述控制线靠近样品垫。

9.根据权利要求8所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的使用方法，其特征在于，包括以下步骤:

S1:将标准品干粉从4℃条件下取出后放室温平衡15min，小心打开瓶盖并根据瓶上标示的装置规格加纯水复溶，室温静置5min后，轻晃瓶体使标准品干粉充分溶解，得标准品溶液；

S2:将标准品溶液用由Tris-base、NaCl、Proclin-300、BSA、Tween-20、阻断剂HIER、HCl组成的定标品稀释液逐级稀释至20、40、80、160、320、640倍，得不同浓度的待测样品；

S3:向试纸条的点样孔中加入100μl不同浓度的待测样品，15分钟后将试纸条插入胶体金试纸定量分析仪中进行测试，得T/C值，保存实验数据；

S4:以标准品溶液浓度的log值为横坐标，以T/C值的log值为纵坐标绘制得到标准曲线。

10.根据权利要求9所述的一种高特异性、高灵敏度HNL检测用胶体金免疫层析试纸条的使用方法，所述定标品稀释液包括50mM Tris-base，0.15M NaCl，0.1v/v％Proclin-300，1.5w/v％BSA，0.01-0.1v/v％Tween-20，0.1-1v/v％阻断剂HIER，且加入盐酸调节pH至7-8。