CN116027025A - 一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，以总甲状腺素抗原和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用，总甲状腺素抗体和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，采用的荧光免疫层析法，与目前常见的检测总甲状腺素的方法如，酶联免疫法/化学发光法相比，不仅大大缩短了检测时间、降低检测成本，还提高了检测灵敏度，与同类方法比较，具有标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定等优点。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断免疫层析检测领域，尤其是涉及一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清、血浆以及全血样本中总甲状腺素。
背景技术
总甲状腺素(TT4)是由甲状腺分泌的一种激素，是血清中与蛋白结合的T4与游离T4的总量，TT4浓度升高出现甲亢，TT4浓度降低，出现甲减，为甲状腺功能体外试验的灵敏指标，可在一定程度上反映甲状腺功能状态，为临床诊断甲亢、甲减提供依据。
目前临床上用于测定TT4的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。过去以放免为代表的总甲状腺素(TT4)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的。
因此，亟需一种特异性高、灵敏度强的总甲状腺素试剂盒及其制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明为了解决现有技术灵敏度不够、线性窄、特异性较差，无法精确的监测血液中的总甲状腺素含量的变化的技术问题，提供一种特异性高、灵敏度强、标记过程简单、结果准确且稳定的总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒。
本发明的第二个目的是提供总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：
一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述结合垫中含有荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
所述检测线上包被有总甲状腺素抗原，包被浓度为0.8-1.2mg/ml；
所述质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/ml。
优选的，荧光微球标记总甲状腺素标记抗体，步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
d.加入总甲状腺素标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
优选的，荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
d.加入羊抗鸡IgY抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
优选的，所述标记用的荧光微球为南京微测生物科技有限公司粒径为300nm的Eu-荧光微球。
优选的，总甲状腺素标记抗体的标记量为10μg，羊抗鸡IgY标记抗体标记量为16μg。
优选的，标记抗体溶液喷量为3-5μL/cm；
包被工作液喷量为0.8-1.2μL/cm。
优选的，所述结合垫上荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体中，荧光微球与总甲状腺素单标记抗体的投料比为20:1；
所述结合垫上荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体中，荧光微球与羊抗鸡IgY抗体的投料比为25:2。
优选的，所述稀释液的配方为：0.05％的Proclin 300；0.1M PBS缓冲液，pH7.4。
为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案是：
一种上述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括采用以下步骤制备试剂盒：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将总甲状腺素抗原、鸡IgY抗体分别按0.8-1.2mg/mL浓度配制包被工作液，按0.8-1.2mg/mL包被量，用金标划线机将其划到NC膜上的检测线和质控线后干燥；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照3-5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试剂卡。
优选的，样品垫处理液配方，按100ml计算，由以下组分配制：抗人RBC抗体1mg、2mg阻断剂001、牛血清白蛋白1g、0.5mL Tween-20、0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液100mL。
本试剂盒测定的原理：采用竞争法，利用荧光免疫层析的技术原理。测试时，样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，样本中的TT4抗原与标记垫上荧光标记TT4单克隆抗体结合形成反应复合物。在毛细效应下进行层析，过量的荧光标记抗体沿着硝酸纤维素膜向前移动，与检测线包被的TT4抗原结合；样本中的TT4浓度与复合物荧光强度成反比，根据设定的标准曲线，干式荧光免疫检测仪将检测的荧光信号值转换成样本中TT4浓度。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
1、本申请提供一种总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，以总甲状腺素抗原和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，总甲状腺素抗体和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，采用的荧光免疫层析法，与目前常见的检测总甲状腺素的方法如，酶联免疫法/化学发光法相比，不仅大大缩短了检测时间、降低检测成本，还提高了检测灵敏度，与同类方法比较，具有标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定等优点。
2、本申请提供的一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，通过选定合适原料、合理设计各材料用量、选取最适反应条件，制备工艺简单，制备得到产品标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定，检测成本低，产品使用简便，成本低廉，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1本申请中不同厂家的抗体制备试剂卡T/C比较；
图2本申请中不同厂家的荧光微球制备试剂卡T/C比较；
图3本申请中不同T线、C线标记抗体投料组合梯度比结果；
图4本申请中不同包被工作液喷量梯度比结果；
图5本申请中100uL在不同时间测试T/C结果；
图6本申请实施例中试剂卡的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式说明本发明的具体技术方案：
实施例1：
一种总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线；
检测线上包被有总甲状腺素抗原，包被浓度为0.8-1.2mg/ml；
质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/ml；
结合垫上喷涂有荧光微球标记的抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为含有荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体混合。
实施例2：
一种总甲状腺素(TT4)荧光免疫层析测定试剂盒的制备方法，包括采用以下步骤制备试剂卡：
步骤1：在NC膜上设置T和C线，将总甲状腺素抗原、鸡IgY包被抗体分别按1.0mg/mL浓度配制包被工作液，按1.0μL/cm包被量，用金标划线机将其划到NC膜上，将NC膜放置在湿度≤30％，(37±2)℃电热鼓风干燥箱中干燥(16～24h)；
步骤2：将复溶好的荧光微球标记抗体溶液用喷金划线机按照5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上，在湿度≤30％，(37±2)℃环境下干燥(16～24h)；
步骤3：设置浸纸压垫机轮轴高度，倒入样品垫处理液，处理好的样品垫放置于晾架上湿度≤30％，(37±2)℃环境下干燥过夜(16～24h)；
步骤4：如图1将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC粘性底板上，NC膜在最底，每个组分间需重叠约2mm及以上进行组装，将制备的实验材料组装成试剂卡备用。
其中，复溶好的荧光微球标记抗体溶液包括荧光微球标记总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体以1:1混合。
其中，抗体浓度测定：用超纯水对质控线抗体对作适当的稀释后，用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。
荧光微球标记TT4标记抗体，包括步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
d.加入总甲状腺素标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
g.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀。
荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
d.加入羊抗鸡IgY抗体16μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
g.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀。
进一步地，本申请检测线(即T线)的包被抗体和标记抗体选择广州核源生物科技有限公司的TT4标记单克隆抗体01和TT4包被抗原T4-BSA 02作为标记的优选抗体和包被的优选抗原，线性梯度最优，且T/C精密性更好，检测线(即T线)包被抗体、检测线标记抗体的选择如下：
使用广州核源生物科技有限公司、Medix Biochemica、霍尔姆斯(北京)生物科技有限公司、北京德奥平生物技术有限公司、杭州博岳生物技术股份有限公司生产的TT4抗体或T4-BSA按照表1的组合情况进行搭配，同时根据各产家使用浓度结合免疫荧光法通常使用的浓度，用超纯水对TT4抗体或TT4-BSA对作适当的稀释后，用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。制作试剂卡对企业参考品进行测试，以企业参考品为研究材料，以企业质控品的线性梯度和紫外分光法测定浓度来筛选最佳的检测线包被抗原、标记抗体。
将各厂家原料制备的实验材料组装成试剂卡后，用企业参考品进行评估，性能比较如表2所示。
表1不同的组合情况(T线)
表2不同组合试剂卡性能比较(T线)
从表2、图1可以看出，不同厂家抗体制备试剂卡测试企业参考品线性梯度差异较大，其中组合4的线性梯度较好。选择广州核源生物科技有限公司的TT4标记单克隆抗体01和TT4包被抗原T4-BSA 02作为标记的优选抗体和包被的优选抗原。
进一步地，本申请的质控线(即C线)包被抗体、质控线标记抗体选择广州核源生物科技有限公司的鸡IgY和羊抗鸡IgY作为质控线包被抗体，其T/C精密性较好，质控线(即C线)包被抗体、质控线标记抗体选择如下：
使用上海领潮生物科技有限公司的鼠IgG、羊抗鼠IgG和广州核源生物科技有限公司的鸡IgY、羊抗鸡IgY抗体按通常使用的浓度，用超纯水对T4单克隆抗体和T4-BSA作适当的稀释后,用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。制作试剂卡对企业参考品进行测试，以企业参考品为研究材料，以企业质控品的线性梯度、精密性和紫外分光法测定浓度来筛选最佳的质控包被抗体、标记抗体，测试结果如表3和表4所示。
表3不同厂家抗体制备试剂卡检测结果(C线)
表4不同厂家抗体制备试剂卡检测结果精密度(C线)
进一步地，本申请的荧光微球选择南京微测生物的Eu-荧光纳米微球300nm作为标记用荧光微球，线性梯度28.44最优，且T/C精密性均＜5％，荧光微球的选择如下：
对南京微测生物科技有限公司的Eu-荧光纳米微球粒径约200nm、300nm和长沙美牛生物科技有限公司羟基化荧光纳米微球200nm、300nm四种测试粒径、荧光强度和PDI系数，然后将四种荧光微球分别标记TT4标记抗体、羊抗鸡IgY标记抗体，制备结合垫做成试剂卡，用企业参考品检测，不同厂家荧光微球制备试剂卡检测结果如表5所示。
表5不同厂家荧光微球制备试剂卡检测结果
从表5和图2可以看出南京微测300nm线性梯度28.44最优，且T/C精密性均＜5％，因此选用南京微测生物的Eu-荧光纳米微球300nm作为标记用荧光微球。
进一步地，标记保存液配方按100ml配制：牛血清白蛋白2g、蔗糖2g、酪蛋白钠盐0.5g、海藻盐5g、Proclin 300 0.1mL、0.02M pH8.0 Tris缓冲液100mL，标记缓冲液的确定如下：
按照表6配制4种不同的标记保存液进行标记保存标记物，并制备结合垫，按前面实验确定的生物材料制备成不同的试剂卡。观察标记物保存状态，并制备结合垫组装试剂卡测试企业参考品。检测结果如表7所示，根据检测结果，最终选取配方4(按100mL配制：牛血清白蛋白2g、蔗糖2g、酪蛋白钠盐0.5g、海藻糖5g、Proclin 300 0.1mL、0.02M pH8.0Tris缓冲液100mL)作为本申请TT4测定试剂盒(荧光免疫层析法)的标记保存液配方。
表6 4种不同的标记保存液
表7不同配方标记保存液标记物制备试剂卡检测结果
| 参考品浓度(ng/mL) | 240 | 120 | 60 | 30 | 10 |
| 配方1T/C CV | 5.31％ | 6.44％ | 6.33％ | 4.09％ | 7.32％ |
| 配方2T/C CV | 5.67％ | 5.29％ | 6.82％ | 9.38％ | 4.96％ |
| 配方3T/C CV | 7.13％ | 4.01％ | 8.17％ | 6.99％ | 8.16％ |
| 配方4T/C CV | 4.58％ | 5.78％ | 4.52％ | 4.44％ | 3.46％ |
通过表7可见，Tris缓冲液比PBS缓冲液保存更稳定，pH8.0荧光微球释放效果好，且T/C精密性均＜6％，选择配方4(按100mL配制：牛血清白蛋白2g、蔗糖2g、酪蛋白钠盐0.5g、海藻糖5g、Proclin 300 0.1mL、0.02M pH8.0 Tris缓冲液100mL)作为本申请TT4测定试剂盒(荧光免疫层析法)的标记保存液配方。
进一步地，包被液选择含1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS，制成试剂条后，选择包被液为澄清液体、无晶体析出和线性梯度好，包被液pH为7.4线性梯度高，包被液的选择如下：
按表8分别将包被抗体TT4、鸡IgY用4种配方的包被液稀释至包被浓度，制成试剂条后，选择包被液为澄清液体、无晶体析出和线性梯度好的缓冲液作为包被液，测试结果如表9所示。
表8四种不同的包被液
| 蔗糖(g) | 缓冲液 | |
| 包被1 | 1.00 | 0.01M pH7.4 PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被2 | 1.00 | 0.01M pH8.0PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被3 | 1.00 | 0.02M pH7.4 PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被4 | 1.00 | 0.02M pH8.0PBS缓冲液100mL溶解 |
表9不同包被液制备试剂卡检测结果
由表9可以看出，包被1线性梯度27.65，T/C精密性均＜6％，包被液pH值对线性梯度有较大影响，包被液pH为7.4时，线性梯度高，所以选定包被液的pH值为7.4；包被液离子强度对检测结果基本没有影响。综合考虑，选择含1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS作为包被液的最终配方。
进一步地，样品垫处理液配方按100mL配制：抗人RBC抗体1mg、2mg阻断剂001、牛血清白蛋白1g、0.5mL Tween-20、0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液100mL，此配置抗干扰能力较强，样品垫处理液配方的确定：
以0.2M硼酸硼砂缓冲液(pH8.0)为缓冲体系，按表10配制4种不同的样品垫处理液，研究抗人RBC抗体对红细胞拦截效果和阻断剂001对特异性的影响，从而确定样品垫处理液的配方，设置浸纸压垫机轮轴高度，分别倒入四种样品垫处理液，处理好的样品垫放置晾架上干燥过夜(16～24h)。
表10不同样品垫处理液测试添加干扰物的参考品的效果
将各厂家原料制备的实验材料组装成试剂卡后与未添加过抗人RBC抗体和阻断剂001的试剂卡同时实验，用添加干扰物的健康人样本不假阳、全血样本不爬膜进行评估，结果如表11所示。
表11不同样品垫处理液测试添加干扰物的参考品的效果
从上表11可以看出，10mg、20mg的阻断剂001均有效拦截红细胞，20mg阻断剂001测试添加干扰物的参考品和未添加干扰物的参考品T/C无明显差异，抗干扰能力较强，样品垫处理液2、样品垫处理液3均符合要求，综合成本因素，最终选择样品垫处理液3为样品垫处理液配方(按100mL配制：抗人RBC抗体10mg、20mg阻断剂001、牛血清白蛋白10g、5mL Tween-20、0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液1000mL)为样品垫处理液配方。
进一步地，本申请选择TT4标记抗体投料10μg，羊抗鸡IgY标记抗体浓度16μg组合投料，即荧光微球：抗体＝20:1为T线投料比；荧光微球：抗体＝25:2为C线投料比，此配置浓度梯度比66.1，相对最好，灵敏度较高、线性较好，且精密性均＜6％，T线标记抗体投料比及C线标记抗体投料比的确定如下：
按表12将T线抗体标记量设置为5μg、10μg、20μg，C线抗体标记量设置为8μg、16μg、32μg进行正交叉实验，制备成9组不同试剂卡，分别检测TT4浓度为0.3mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的TT4参考品，精密性结果如表13所示。
表12 T线、C线投料组合情况
表13不同T线、C线标记抗体投料比T/C精密性结果
| T/C CV | 240ng/mL | 120ng/mL | 60ng/mL | 30ng/mL | 10ng/mL |
| 组合1 | 9.06％ | 8.36％ | 5.87％ | 6.89％ | 6.80％ |
| 组合2 | 4.04％ | 4.97％ | 5.64％ | 6.18％ | 7.47％ |
| 组合3 | 6.01％ | 6.26％ | 8.98％ | 8.64％ | 7.88％ |
| 组合4 | 8.29％ | 7.25％ | 9.42％ | 9.32％ | 6.72％ |
| 组合5 | 5.37％ | 3.90％ | 4.70％ | 5.07％ | 3.26％ |
| 组合6 | 6.76％ | 6.00％ | 5.46％ | 6.14％ | 7.59％ |
| 组合7 | 5.97％ | 9.12％ | 5.60％ | 5.69％ | 5.03％ |
| 组合8 | 5.53％ | 8.90％ | 8.96％ | 6.50％ | 7.61％ |
| 组合9 | 7.36％ | 5.44％ | 5.83％ | 7.51％ | 5.70％ |
从表13，图3可以看出组合5各内部参考品浓度梯度比，相对最好，灵敏度较高、线性较好，且精密性均＜6％，。选择TT4标记抗体投料10μg，羊抗鸡IgY标记抗体浓度16μg组合投料，即荧光微球：抗体＝20:1为T线投料比；荧光微球：抗体＝25:2为C线投料比。
进一步地，TT4包被抗体浓度1.0mg/mL，鸡IgY包被抗体浓度1.0mg/mL为最终的T线、C线包被浓度，此配置检测灵敏度较高、线性较好，且精密性均＜6％，本申请包被抗体浓度的确定如下：
按表14将T线和C线包被工作液溶，T线、C线包被工作液溶以0.8μL/cm、1.0μL/cm、1.2μL/cm分别制备包被膜，组装试剂卡，用企业参考品检测评估，测试结果如表15所示；
表14不同包被工作液喷量外观
| T线、C线喷量 | 划膜后扩散痕(mm) |
| 0.8μL/cm | 0.9 |
| 1.0μL/cm | 1.0 |
| 1.2μL/cm | 1.2 |
表15不同T线、C线包被浓度组合T/C精密性结果
| T/C CV | 240ng/mL | 120ng/mL | 60ng/mL | 30ng/mL | 10ng/mL |
| 0.8uL/cm | 7.55％ | 6.47％ | 9.63％ | 9.91％ | 5.03％ |
| 1.0uL/cm | 5.44％ | 3.49％ | 5.30％ | 5.85％ | 3.45％ |
| 1.2uL/cm | 6.27％ | 8.85％ | 5.77％ | 6.67％ | 9.31％ |
从上表14表15和图4可以看出，划膜后扩散痕迹随着喷量的增加而扩大，1.0μL/cmT/C精密性均＜6％，相对最优，1.0μL/cm、1.2μL/cm线性梯度无明显差异，以外观、性能与成本综合考虑，选择1.0μL/cm为包被工作液喷量。
进一步地，标记抗体溶液喷量为4μL/cm，T/C精密性均＜6％，相对最优，各喷量线性梯度无明显差异，标记抗体溶液喷量的确定如下：
分别将荧光微球标记抗体溶液3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm上样到喷金划线机中，将其喷到剪裁后的结合垫上；干燥过夜(16～24h)，分别将制备的实验材料组装成试剂卡后，用企业参考品进行评估。
表16不同喷量T/C精密性结果
| T/C CV | 240ng/mL | 120ng/mL | 60ng/mL | 30ng/mL | 10ng/mL |
| 3uL/cm | 7.96％ | 10.00％ | 9.11％ | 7.24％ | 8.62％ |
| 4uL/cm | 5.30％ | 3.37％ | 3.90％ | 4.76％ | 5.84％ |
| 5uL/cm | 9.05％ | 9.74％ | 7.61％ | 5.23％ | 8.35％ |
从表16可以看出4uL/cm T/C精密性均＜6％，相对最优，各喷量线性梯度无明显差异，以成本与性能综合考虑，选择4uL/cm为标记抗体溶液喷量。
进一步地，反应所需的最佳时间为10mim，反应时间的确定如下：
按已确定的生产工艺进行试剂卡的制备，将制备好的检测卡按设定的反应时间，分别检测100uL在不同时间的T/C精密性。检测结果如表17所示，根据检测结果的线性水平筛选出反应所需的最佳时间为10mim。
表17 100uL在不同时间测试T/C精密性
| T/C CV | 240ng/mL | 120ng/mL | 60ng/mL | 30ng/mL | 10ng/mL |
| 5min | 8.18％ | 5.40％ | 7.05％ | 5.93％ | 9.85％ |
| 10min | 4.49％ | 5.69％ | 4.29％ | 4.13％ | 5.06％ |
| 15min | 7.75％ | 8.80％ | 9.76％ | 8.84％ | 9.09％ |
| 20min | 7.16％ | 8.02％ | 6.92％ | 7.23％ | 7.94％ |
由表17、图5可以看出在10min时反应完成，T/C较早稳定，精密性均＜6％，因此选择10min为反应时间。
按已确定的生产工艺进行试剂卡的制备，将制备好的检测卡按设定的加样量(80μL、90μL、100μL、110μL、120μL)分别检测浓度为0.3mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的TT4参考品。以层析过程快，吸水纸无荧光微球，线性梯度好且样本无溢出者为优选。最终选择样本用量为100μL作为总甲状腺素(TT4)测定试剂盒(荧光免疫层析法)的最适加样量。
将实施例制备的试剂盒进行如下性能测试：
(1)线性建立
取三批试剂分别对上述编号1～11的线性浓度样本进行测定，每份样本重复测定4次，按照以下公式(1)、(2)计算每份样本4次检测结果的平均值(M)与理论值之间的相对偏差(B)和线性相关系数(r)。
B＝(M-T)/T×100％....................(1)
式中：
B——相对偏差；
M——检测结果的平均值；
T——理论值。
式中：
n—测定样本数目；
Xi—测定样本的浓度；
Yi—4次重复测定的与测定样本浓度相对应的测定值均值；
r—线性相关系数；
i——1，2，3，……n。
检测结果如表18所示：
表18线性验证
由表18可以看出线性建立和验证均满足上述设计要求，故以在[10，240]ng/mL范围内，线性回归的相关系数r≥0.9900，作为本产品的线性性能指标。
(2)准确度性能评估
选用在质量管理体系下稳定生产的3批总甲状腺素(TT4)测定试剂盒(荧光免疫层析法)进行准确度性能评估，对测试结果进行统计分析，满足设计试验可接受标准，即作为TT4试剂盒准确度性能指标。
测定总甲状腺素企业参考品60.01ng/mL、199.97ng/mL，按照说明书中的步骤进行检测，各重复测量3次后，每次测试结果记为(Xi)，如果3次结果相对偏差都不超过±15％，即判为合格。如果大于或等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合要求，则应重新连续测试20次，并分别按照式(1)计算相对偏差，如果大于或等于19次测试的结果相对偏差都不超过±15％，即判为合格。
Bi＝(Xi-T)/T×100％...................................(1)
式中：
Bi——相对偏差；
Xi——每次测量浓度；
T——标示浓度。
测试结果如表19所示：
表19准确度测试结果
由表19看出，准确度均满足上述设计要求，故以比值应在0.850～1.150之间，作为本产品的准确度性能指标。
(3)精密度性能评估
选用在质量管理体系下稳定生产的3批总甲状腺素(TT4)测定试剂盒(荧光免疫层析法)进行精密度(分析内精密度和批间精密度)性能评估，对测试结果进行统计分析，满足设计试验可接受标准，即作为TT4试剂盒重复性和批间精密度性能指标。
重复性
取取质检合格的三批本试剂盒，由同一个操作者在同一台仪器上检测浓度为60.01ng/mL和119.97ng/mL的TT4企业参考品，每个样本重复测定2次，共检测20天。评估结束时共有60对，即120个测试结果。从每批次测量中40次数据计算出分析内精密度。从所有120个数据计算出批间精密度。从所有120个数据计算出批间变异系数，测试结果如表20、21、22、23所示。
表20低值样本内精密度实验原始数据记录
表21高值样本内精密度实验原始数据记录
表22低值样本批内精密度实验原始数据计算
表23高值样本批内精密度实验原始数据计算
通过表20-表23试验数据可看出，三个批次TT4试剂的批内变异系数(CV)应≤15％。批间变异系数(CV)应≤20％。
参考体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则，批间精密度公式为：
根据公式：
求出均值。
从上表20、表21中得出：
求出批间精密度：
从上表20、表21中得出
式中n＝检验总数，则批间变异系数
注：
(1)表示：第一批试剂20天测的结果1的总和；
(2)表示：第一批试剂20天测的结果2的总和；
(3)表示：第二批试剂20天测的结果1的总和；
(4)表示：第二批试剂20天测的结果2的总和；
(5)表示：第三批试剂20天测的结果1的总和；
(6)表示：第三批试剂20天测的结果2的总和；
(7)表示：第一批试剂20天测的(均值-结果1)平方的总和；
(8)表示：第一批试剂20天测的(均值-结果2)平方的总和；
(9)表示：第二批试剂20天测的(均值-结果1)平方的总和；
(10)表示：第二批试剂20天测的(均值-结果2)平方的总和；(11)表示：第三批试剂20天测的(均值-结果1)平方的总和；(12)表示：第三批试剂20天测的(均值-结果2)平方的总和。由以上数据分析可得批内和批间指标结果汇总如表24所示：
表24批内和批间指标结果
在重复性条件下，用本试剂盒检测2个不同水平的样本，一个低浓度水平水平5.17ng/mL及一个高浓度水平101.67ng/mL，分别重复测试10次(n＝10)，如表25所示，检测样本批内变异系数(CV)在5.06％～6.73％范围内。
表25重复性检测数据结果
用3个不同批次的本试剂盒分别测试60.01ng/mL、119.97ng/mL的样本，如表26所示，检测样本批间变异系数(CV)分别为5.75％、6.25％。
表26批间精密度检测数据结果
由上述试验结果表明，精密度均满足上述设计要求，故以批内变异系数(CV)应≤15％；批间变异系数(CV)应≤20％，作为本产品的精密度性能指标。
(4)HAMA效应评估
使用试剂卡对配制的浓度进行测试，对测试数据进行统计分析，对测试结果进行统计分析，满足设计试验可接受标准，即作为TT4的HAMA效应性能指标。检测结果如表27所示：
表27HAMA效应测试结果
本申请提供一种总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，以总甲状腺素抗原和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线，总甲状腺素抗体和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，采用的荧光免疫层析法，与目前常见的检测总甲状腺素的方法如，酶联免疫法/免疫增强比浊法相比，不仅大大缩短了检测时间、降低检测成本，还提高了检测灵敏度，与同类方法比较，具有标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定等优点，提供的一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，通过选定合适原料、合理设计各材料用量、选取最适反应条件，制备工艺简单，制备得到产品标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定，检测成本低，产品使用简便，成本低廉，适合推广。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，其特征在于：所述结合垫中含有荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
所述检测线上包被有总甲状腺素抗原，包被浓度为0.8-1.2mg/ml；
所述质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/ml。
2.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：荧光微球标记总甲状腺素标记抗体，步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
d.加入总甲状腺素标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
3.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
d.加入羊抗鸡IgY抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
4.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：标记抗体溶液喷量为3-5μL/cm；
包被工作液喷量为0.8-1.2μL/cm。
5.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：所述结合垫上荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体中，荧光微球与总甲状腺素单标记抗体的投料比为20:1；
所述结合垫上荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体中，荧光微球与羊抗鸡IgY抗体的投料比为25:2。
6.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：所述标记用的荧光微球为南京微测生物科技有限公司粒径为300nm的Eu-荧光微球。
7.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：总甲状腺素标记抗体的标记量为10μg，羊抗鸡IgY标记抗体标记量为16μg。
8.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：所述稀释液的配方为：0.05％的Proclin 300；0.1M PBS缓冲液，pH7.4。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括采用以下步骤制备试剂盒：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将总甲状腺素抗原、鸡IgY抗体分别按0.8-1.2mg/mL浓度配制包被工作液，按0.8-1.2mg/mL包被量，用金标划线机将其划到NC膜上的检测线和质控线后干燥；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照3-5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试剂卡。
10.根据权利要求9所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，样品垫处理液配方，按100ml计算，由以下组分配制：抗人RBC抗体1mg、2mg阻断剂001、牛血清白蛋白1g、0.5mL Tween-20、0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液100mL。
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| CN202310153333.7A CN116027025A (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 |
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