CN115248308B - 聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用，属于体外诊断试剂技术领域。所述免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳米颗粒‑抗体/抗原复合物，所述复合物为利用聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基与抗体或抗原偶联制得。聚左旋多巴纳米颗粒表面的羧基基团与蛋白质共价结合形成稳定的复合物，且不影响蛋白生物活性，聚左旋多巴纳米微球聚集产生肉眼可见的黑色，相较于胶体金的红色，其显色度更高，因此可以作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。

Description

聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及聚左旋多巴纳米颗粒作为免疫标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用。

背景技术

标记免疫技术的原理是利用荧光素、放射性同位素、酶等标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应检测相应的抗原或抗体。抗原抗体反应的专一性和标记物的放大效应保证了标记免疫技术的特异性和灵敏度。

免疫层析检测技术(Lateral Flow Immunoassay，LFIA)是20世纪80年代初发展起来的免疫检测技术，其工作原理为：将针对待测抗原的一种特异性抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜(NC)上作为检测区(T区)，另一种特异性抗体与标记物偶联，固定在结合垫上。当待测物样本加到试纸条一端的样本垫上，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的标记物试剂后相互反应，再移动到T区时，待测物与标记物试剂的结合物与T区相应抗体结合而被截留，聚集于T区形成有颜色的条带。

免疫标记技术中标记物性能是影响检测结果准确性和灵敏度的关键因素。胶体金是免疫层析技术中最常用到的标记物，胶体金是金单质(Au)的水溶胶，胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不破坏其生物活性，可以与蛋白质等非共价结合，形成胶体金标记物。胶体金颗粒可以呈现一定的颜色，因此作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。胶体金免疫层析法一般为定性或半定量检测，快速方便，反馈迅速，但是稳定性不足，检测结果灵敏度较差。鉴于此，一些发光材料包括荧光、上转磷光、化学发光材料等以及磁性材料被相继研究开发，大大提升检测灵敏度，但是发光材料类标记物在检测时往往需要精密仪器，操作步骤复杂、耗费时间长，不适用即时检测和现场应用。

鉴于胶体金免疫层析试纸条操作方便、直观以及反馈迅速的特点，利用胶体金进行标记的检测试纸条仍是目前应用于现场即时检测的主流商品，然而制备胶体金的氯金酸价格昂贵，而且检测试纸条在市场上流通存在重金属污染的问题。

因此，开发一种能够替代胶体金、制造成本更低且具有优异显色性的标记物应用于免疫层析检测试纸是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型纳米颗粒进行抗体或抗原的标记应用到免疫层析检测中，从而降低试纸制造成本，提高试纸检测灵敏度，进一步为试纸的半定量或定量检测提供可能性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了聚左旋多巴纳米颗粒作为标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用。

进一步的，免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳米颗粒-抗体/抗原复合物，所述复合物为利用聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基与抗体或抗原偶联制得。

免疫层析检测试纸条由PVC底板以及粘贴在PVC底板上沿层析方向依次铺设的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组成，样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧。本发明将聚左旋多巴纳米颗粒与标记抗体或抗原偶联，包被于结合垫上，提供了一种新型的免疫层析检测试纸条。

聚左旋多巴纳米颗粒为左旋多巴单体自聚合形成的纳米颗粒，聚左旋多巴纳米颗粒表面存在大量羧基基团，可以与蛋白质共价结合，形成稳定的复合物，同时共价结合不破坏蛋白质生物活性。另外，聚左旋多巴纳米微球聚集产生肉眼可见的黑色，因此，聚左旋多巴纳米颗粒可以作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。本发明研究表明，大粒径聚左旋纳米颗粒的聚集可以产生高强度的黑色从而显著提升检测灵敏度。

进一步的，所述聚左旋多巴纳米颗粒-抗体/抗原复合物的制备方法包括：首先利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基，然后加入抗体或抗原偶联，再加入封闭液封闭制得所述复合物。

进一步的，所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得。

制备过程中，将左旋多巴单体与金属离子络合剂混合于水中，在金属离子的络合作用下，加速左旋多巴单体的自聚合过程。所述金属离子络合剂包括但不限于镍离子、三价铁离子、镁离子、钙离子或钴离子。

优选的，反应体系中，左旋多巴单体的浓度为0.5～1mg/mL。

优选的，所述金属离子络合剂为醋酸镍。

研究表明，聚左旋多巴纳米颗粒的粒径分布(PDI)以及粒径大小影响到后续的检测性能，在相同的目标物质浓度下，粒径越大的纳米颗粒显色效果越好。优选的，所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。

聚左旋多巴纳米颗粒制备过程中，反应体系中金属离子含量越高，所制备的纳米颗粒粒径相对更大。优选的，左旋多巴单体与金属离子络合剂的摩尔比为20～112：1。

优选的，左旋多巴单体与醋酸镍的摩尔比为25～60：1；反应温度为75℃，反应时间为15小时。

本发明中，与聚左旋多巴纳米颗粒偶联的抗体/抗原为特异性结合待测目标物质的抗体/抗原，可以根据待测目标物质选择相应的抗体或抗原，进而制得用于检测目标物质的免疫层析检测试纸条。

制备结合垫时，将偶联有特异性抗体/抗原的聚左旋多巴纳米颗粒喷涂于预处理后的结合垫上，干燥后制得结合垫。优选的，结合垫采用奥斯龙8964玻纤。结合垫处理液为磷酸缓冲液、稳定剂和再溶解剂的混合溶液，pH为7～8。

制备层析膜时，选择对应的抗体、双抗稀释于包被稀释液中，沿层析方向依次平行间隔设置检测线和质控线，干燥后制得层析膜。优选的，层析膜采用硝酸纤维素膜。包被稀释液为磷酸缓冲液、蔗糖的混合溶液，pH为7.4。

优选的，样品垫采用奥斯龙8964玻纤，样品垫处理液为Tris缓冲液、洗涤剂、封闭剂和防腐剂的混合溶液，pH为7～8。

具体的，本发明提供了一种新型炎症标志物降钙素原(procalcitonin，PCT)检测试纸条，PCT在区分细菌和病毒感染方面具有良好的敏感性，对抗生素治疗监测具有极大的指导价值。在严重感染和脓毒症的辅助诊断中PCT是最好的指标，也可作为脓毒症的一个早期标志物。

所述PCT检测试纸条包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述结合垫上包被有检测微球，所述检测微球为表面包被有PCT标记抗体的聚左旋多巴纳米颗粒。

其中，结合垫的制备包括：首先制备聚左旋多巴纳米颗粒，再通过聚左旋多巴纳米颗粒上存在的羧基基团与PCT标记抗体进行偶联得到聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物，然后将聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物包被于结合垫上。

层析膜的制备包括：用包被稀释液将PCT包被抗体和羊抗鼠IgG双抗分别稀释成2mg/mL、1mg/mL的包被液；然后分别于贴在PVC底板上的硝酸纤维素膜上间隔5mm划线，分别得到检测线和质控线，划膜参数都为1μL/cm，划膜结束后，置于相对湿度30～50％，37℃环境下干燥16～48h。

进一步的，所述的新型PCT检测试纸条的制备方法包括以下步骤：

(1)制备结合垫：首先采用左旋多巴单体与醋酸镍制备聚左旋多巴纳米颗粒，然后利用MES缓冲溶液清洗聚左旋多巴纳米颗粒，并将体系pH调至5.5～6.7，利用EDC与NHS活化微球表面羧基，与PCT标记抗体偶联，再用酪蛋白溶液进行封闭处理制得聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物；最后将聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物喷涂于预处理后的结合垫上；

(2)制备层析膜：在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷PCT包被抗体制备检测线，在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷涂羊抗鼠lgG双抗制备质控线；检测线与质控线平行且相距5毫米；

(3)试纸条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、层析膜及吸水垫，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧，得试剂条。

优选的，采用的PCT标记抗体的浓度为0.13mg/mL，采用的PCT包被抗体的浓度为2mg/mL，采用的羊抗鼠IgG双抗的浓度为1mg/mL。

进一步的，本发明还提供了所述新型PCT检测试纸条用于定量检测PCT的方法，具体的，取待测样本加入PBS缓冲液，混合10s后，加样层析，测定检测线和质控线的灰度比值，根据标准曲线计算样品中PCT的浓度值。

本发明还提供了一种新型人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸条，HCG是孕妇胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，检测HCG水平可以判断是否怀孕。所述HCG检测试纸条包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述结合垫上包被有由聚左旋多巴纳米颗粒标记的β-HCG单克隆抗体。

所述新型HCG检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备结合垫：首先采用左旋多巴单体与醋酸镍制备聚左旋多巴纳米颗粒，然后利用PBS缓冲溶液清洗聚左旋多巴纳米颗粒，并将体系pH调至7～8，利用EDC与NHS活化微球表面羧基，与β-HCG单克隆抗体偶联，再用酪蛋白溶液进行封闭处理制得聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体复合物；最后将聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体复合物喷涂于预处理后的结合垫上；

(2)制备层析膜：在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷α-多克隆抗体制备检测线，在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷涂羊抗鼠IgG双抗制备质控线；检测线与质控线平行且相距5毫米；

(3)试纸条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、层析膜及吸水垫，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧，得试剂条。

优选的，采用的β-HCG单克隆抗体的浓度为0.2mg/mL，采用的α-多克隆抗体的浓度为1mg/mL，采用的羊抗鼠IgG双抗的浓度为0.5mg/mL。

本发明中制备的新型HCG检测试纸条的宽度为4mm，检测线处包被α-多克隆抗体的量由α-多克隆抗体的浓度和α-多克隆抗体的喷点量共同决定，质控线处包被羊抗鼠IgG双抗的量由羊抗鼠IgG双抗的浓度和羊抗鼠IgG双抗的喷点量共同决定。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明应用的聚左旋多巴纳米颗粒表面存在大量羧基基团，可以用来与抗体或抗原进行偶联，得到更稳定的免疫复合物。

(2)与现有的胶体金技术相比，本发明制备聚左旋多巴纳米颗粒的左旋多巴单体价格约为氯金酸的百分之一，成本优势明显；聚左旋多巴纳米颗粒聚集产生肉眼可见的黑色，相较于胶体金的红色，其显色度更高，适合肉眼观测或进行半定量与定量分析。

(3)聚左旋多巴纳米颗粒的制备流程简单方便。

附图说明

图1为本发明提供的检测试纸条的结构示意图。

图2为本发明提供的检测卡的结构示意图。

图3为实施例1中聚左旋多巴纳米颗粒制备的反应式及实物图。

图4为实施例1中聚左旋多巴纳米颗粒的DLS粒径分析图。

图5为实施例1中聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体免疫复合物的DLS粒径分析图。

图6为实施例1中新型HCG检测试纸条的验证结果说明。

图7为实施例1制备的新型HCG检测试纸条检测不同浓度的β-HCG抗原溶液的结果图。

图8为实施例1中不同粒径的聚左旋多巴纳米颗粒制备的新型HCG检测试纸条的检测结果。

图9为实施例2中聚左旋多巴纳米颗粒的DLS粒径分析图。

图10为实施例2中聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物的DLS粒径分析图。

图11为实施例2中PCT定量检测试纸条检测PCT标准液的标准曲线。

图12为实施例2中PCT定量检测试纸条和胶体金检测试纸条检测PCT标准液的对比图，其中第一行为实施例2制备的PCT定量检测试纸条，第二行为胶体金检测试纸条，从左到右依次为检测浓度为0.1μg/L、5μg/L、10μg/L、31μg/L的PCT抗原溶液。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下述实施例中β-HCG单克隆抗体、α-多克隆抗体与羊抗鼠IgG双抗都购自华阳正龙生化制品研究室，皆为无色液体。

PCT标记抗体、PCT包被抗体与羊抗鼠IgG双抗都购自蓝炬生物技术(杭州)有限公司，皆为无色液体。

硝酸纤维素膜购自赛多利斯，外感为白色、质地均匀、膜表面平整无瑕疵、膜边缘整齐无扭曲变形。

奥斯龙8964玻纤购自上海金标生物科技有限公司，其纤维结构分布均匀、致密、平直、周围边缘无脏痕、污垢、灰尘。

左旋多巴购自麦克林。

四水合醋酸镍购自广东光华科技股份有限公司。

实施例中涉及的化合物英文缩写说明如下：

EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；MES：2-(N-吗啉)乙磺酸。

实施例1HCG检测试纸条

一、新型HCG检测试纸条的组成

如图1所示，免疫层析检测试纸条包括样品垫1，聚合物纳米颗粒-抗体包被的结合垫2，层析膜3以及在膜上沿层析方向依次为检测线4和质控线5，最后为吸水垫6，这些结构都沿层析方向依次排列在PVC板7上。样品垫2和吸水垫6分别设于PVC板7两端，层析膜3设于PVC板7中部，在层析膜3与样品垫1之间设有聚合物纳米颗粒-抗体包被的结合垫2；所述聚合物纳米颗粒-抗体包被的结合垫2一端与样品垫1互相叠加，另一端与层析膜3互相叠加；所述层析膜3上沿层析方向依次平行间隔设置有检测线4和质控线5。

本实施例的HCG检测试纸条的结合垫2上包被有聚左旋多巴纳米颗粒标记的β-HCG单克隆抗体，结合垫为奥斯龙8964玻纤。检测线4处包被有α-多克隆抗体，质控线5处包被羊抗鼠IgG双抗。层析膜3上的检测线4和质控线5保持相互平行状态且相距5mm，所用层析膜为硝酸纤维素膜。

制作完毕的试纸条布设在的检测卡内，试纸条放在由塑料上壳和塑料下壳插合而成的塑料外壳中，即得到检测卡，塑料上壳设有两个开孔，加样孔8和观察窗9，如图2所示。

二、新型HCG检测试纸条的制备方法

步骤1、制备聚左旋多巴纳米颗粒

将120mg左旋多巴与2.7mg醋酸镍混合在120mL超纯水中，在75℃下搅拌反应15小时后离心得到聚左旋多巴纳米颗粒，将其重悬于水中，使其固含约为3％，反应式与聚合物实物如图3。

图4为得到的聚左旋多巴纳米颗粒的粒径分析图，其平均粒径为203.7nm，PDI为0.002。

步骤2、聚左旋多巴纳米颗粒与β-HCG单克隆抗体的偶联

利用PBS缓冲溶液将体系pH调至7-8之间，利用EDC与NHS活化微球表面羧基使其与单抗偶联，然后用10％酪蛋白溶液进行封闭处理，最后将免疫复合物保存于特别制备的保存液中。

图5为免疫复合物的DLS粒径分析图，其平均粒径为256.6nm，PDI为0.047。

步骤3、样品垫与结合垫的预处理

按照以下配比配成样品垫处理液：0.04mol/L Tris、4g/L Pvp10、3g/L T-Casein、4g/L S9、1％Tween20、0.8g/L PC-300、超纯水为溶剂，pH调节在7-8间，然后将样品垫置于处理液中浸没3秒钟，后置于37℃烘箱内干燥24h，待用。

按照以下配比配成结合垫处理液：15％蔗糖、0.5％酪蛋白酸钠、0.5％Pvp30、0.02％PC-300、84％PBS(溶剂)调节pH在7-8之间，然后将结合垫置于处理液中浸没3秒钟，后置于37℃烘箱内干燥24h，待用。

将标记后的聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体免疫复合物包被在预处理后的结合垫上。

步骤4、层析膜的预处理

划膜稀释液制备：4g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠、0.28g/L磷酸二氢钾、0.2g/L防腐剂PC-300 4％蔗糖pH调节至7.4，超纯水为溶剂。

利用划膜稀释液将α-多克隆抗体和羊抗鼠IgG双抗分别稀释为1mg/mL和0.5mg/mL，并都以1uL/cm的喷涂量分别喷涂在检测线与质控线上，然后在37℃条件下干燥24h，待用。

步骤5、试纸条的组装

在PVC底板7上沿层析方法依次铺设样品垫1、结合垫2、层析膜3及吸水纸6，并且样品垫1部分搭接在结合垫2上，结合垫2部分搭接在分析膜3的一侧，吸水纸6部分搭接在层析膜3的另一侧，得试剂条。

本实施例制备的新型HCG检测试纸条宽度为4mm，液体移动速度应不低于1cm/min。

三、新型HCG检测试纸条的使用方法

步骤a、将新型HCG检测试纸条、抗原稀释液和样本恢复至室温，抗原稀释液可以为商用抗原稀释液或者PBS缓冲溶液，样本为标准β-HCG抗原溶液或医用尿样。

步骤b、取50uL稀释后样本直接加到样品垫上的加样孔中；

步骤c、10～20min内研判结果；

检测结果的解释如下：

阳性：检测线与质控线都显色，表示样本中含有β-HCG抗原；

阴性：检测线不显色，质控线显色，表示样本中不含β-HCG抗原；

无效：质控线不显色，表明该新型HCG检测试纸条无效，该样本检测结果亦无效。参见图6。

四、新型HCG检测试纸条的验证

HCG标准溶液的配制。取10微升2500IU每毫升的标准β-HCG抗原溶液，加入490微升超纯水，将其稀释至50IU每毫升。再将50IU每毫升的β-HCG抗原溶液分别稀释至0.001IU每毫升、0.01IU每毫升、0.1IU每毫升、1IU每毫升以及10IU每毫升，待用。

将50μL配置好的不同浓度的β-HCG抗原溶液分别滴到样品孔，等待20min后得到的结果如图7，可以看到新型HCG检测试纸条的检测限达到了1IU/L，表现出比胶体金更好的灵敏度。具体结果列于表1中。

表1

同时还验证了不同粒径的纳米颗粒(170nm、240nm、320nm)在相同浓度下的显色程度，如图8所示，结果显示，在相同的抗原浓度下，粒径越大的纳米颗粒的显色效果越好。

实施例2PCT定量检测试纸条

一、新型炎症标志物PCT定量检测试纸条的组成及检测卡的组成

本实施例的炎症标志物PCT定量检测试纸条的组成结构同图1所示，具体的，试纸条结合垫2上包被有检测微球，检测微球为表面包被有PCT标记抗体的聚合物纳米颗粒；层析膜3上沿层析方向依次平行间隔设置有检测线4和质控线5，检测线4上包被有PCT特异性抗体，质控线5上包被有羊抗鼠IgG双抗。

二、新型炎症标志物PCT定量检测试纸条制备方法

具体包括以下步骤：

1、制备聚左旋多巴纳米颗粒

将200mg左旋多巴与10mg醋酸镍混合在200mL超纯水中，在75℃下搅拌反应15h。反应结束后，离心清洗三次，得到浓缩的聚左旋多巴纳米悬浮液，固含为3％。

图9为得到的聚左旋多巴纳米颗粒的粒径分析图，其粒径为251.3nm，PDI为0.149。

2、层析膜处理

配制包被液，配制方法为用划膜稀释液(pH 7.0，配方见表2)将PCT包被抗体和羊抗鼠IgG双抗分别稀释为2mg/mL和1mg/mL；用划膜仪划膜，划膜参数为1μL/cm，划1条质控线(C线)，划1条检测线(T线)，划膜结束后置于相对湿度30-50％，37℃环境下干燥16-48h。

表2划膜稀释液配方

3、标记

清洗：取1mL聚左旋多巴纳米颗粒悬浮液(固含量为3％)，17000g离心去上清，加入1mL MES缓冲液(100mM，pH6.0)，超声清洗后，离心去上清，共清洗三次；

活化：加入3μL NHS(20mg/mL)，室温反应3min，加入5μL EDC(20mg/mL)，室温反应20min，17000g离心去上清，加入900μL MES(100mM，pH6.0)和100μL超纯水，超声分散；

偶联：加入PCT标记抗体58μL，室温反应2h，17000g离心去上清；

封闭：离心沉淀加入1mL封闭液(pH 8.0，配方见表3)，室温反应2h，离心去上清；

表3封闭液配方

名称	浓度
		乙醇胺	25mM
酪蛋白	10％

保存：加入1mL保存缓冲液(pH 7.2，配方见表4)，超声分散，得到聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物的悬浮液。

图10为聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物的DLS粒径分析图，其平均粒径为343.7nm，PDI为0.257。

表4保存液配方

名称	浓度
		HEPES	25mM
酪蛋白	10g/L
		PVP	2g/L
NaN3	0.2g/L

结合垫预处理：结合垫置于结合垫处理液(pH7-8，配方见表5)中浸没3s，后置于真空干燥箱中真空干燥1h，待用。

表5结合垫处理液配方

标记：将上述的悬浮液用喷金仪喷预处理后的结合垫，结合垫为奥斯龙8964玻纤材料，置于真空干燥箱中真空干燥1h，待用。

4、样品垫预处理

样品垫置于样品垫处理液(pH7-8，配方见表6)中浸没3s，后置于真空干燥箱中真空干燥1h，待用。

表6样品垫处理液配方

名称	浓度
		Tris	0.04mol/L
PVP10	4g/L
		T-Casein	3g/L
S9	4g/L
		PC-300	0.8g/L
Tween20	1％

5、组装检测卡

试纸条组装：将硝酸纤维素膜贴于PVC底板的中部，将干燥后的结合垫贴于PVC底板上，结合垫与硝酸纤维素膜交叠1-2mm，将干燥后的样品垫贴于PVC底板上，样品垫与结合垫交叠1-2mm，最后将吸水纸贴于PVC底板的另一端，吸水纸与硝酸纤维素膜交叠1-2mm，切条机将贴好的大板斩切成4mm的小条，将试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳插合而成的塑料外壳中，即得到检测卡。

本实施例制备的检测试纸条宽度为4mm，液体移动速度不低于1cm/min。

三、新型炎症标志物PCT定量检测试纸条的使用方法

步骤a、将新型PCT检测试纸条、PBS缓冲液和血清样本恢复至室温。

步骤b、取80μL PBS缓冲液和血清的混合液样本直接加到检测卡上的加样孔中；

步骤c、检测试纸条插入分析仪的检测槽，放置15-20min；

检测结果的解释如下：

阳性：检测线与质控线都显色，表示样本中含有PCT抗原；

阴性：检测线不显色，质控线显色，表示样本中不含PCT抗原；

无效：质控线不显色，表明该新型PCT检测试纸条无效，该样本检测结果亦无效。

四、以本实施例制备的试纸条检测PCT

配制：配置不同浓度的PCT标准液，包括0.1μg/L、0.6μg/L、1μg/L、10μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L，每个浓度做三个平行样。层析反应15-20min后，采用仪器分析装置检测检测线和控制线处的灰度信号，获得相对灰度值T/C，以PCT标准液的浓度值为横坐标，以T/C为纵坐标，建立方程并拟合成标准曲线。

如图11的标准曲线可以看出，T/C相对灰度值与PCT标准液的浓度值呈现良好的线性相关性，相关系数R²＝0.9919，因此，可以通过该标准曲线对样品中的PCT浓度进行定量。

配置0.1μg/L、5μg/L、10μg/L、31μg/L的PCT抗原溶液，分别滴到样品孔，等待15-20min后得到的结果如图12，可以看到新型炎症标志物PCT定量检测试纸条表现出比胶体金(购自山东麦田生物)更好的灵敏度。

以上实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.聚左旋多巴纳米颗粒作为标记物在制备免疫层析检测试纸条中的应用，其特征在于，所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得；所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，免疫层析检测试纸条包括结合垫，所述结合垫上包被有聚左旋多巴纳米颗粒-抗体/抗原复合物，所述复合物为利用聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基与抗体或抗原偶联制得。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚左旋多巴纳米颗粒-抗体/抗原复合物的制备方法包括：首先利用EDC与NHS活化聚左旋多巴纳米颗粒表面羧基，然后加入抗体或抗原偶联，再加入封闭液封闭制得所述复合物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，左旋多巴单体与金属离子络合剂的摩尔比为20～112：1；所述金属离子络合剂为醋酸镍。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，左旋多巴单体与醋酸镍的摩尔比为25～60：1；反应温度为75℃，反应时间为15小时。

6.一种炎症标志物降钙素原检测试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上包被有检测微球，所述检测微球为表面包被有降钙素原标记抗体的聚左旋多巴纳米颗粒；所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得；所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。

7.如权利要求6所述的炎症标志物降钙素原检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备结合垫：首先采用左旋多巴单体与醋酸镍制备聚左旋多巴纳米颗粒，然后利用MES缓冲溶液清洗聚左旋多巴纳米颗粒，并将体系pH调至5.5～6.7，利用EDC与NHS活化微球表面羧基，与PCT标记抗体偶联，再用酪蛋白溶液进行封闭处理制得聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物；最后将聚左旋多巴纳米颗粒-PCT标记抗体复合物喷涂于预处理后的结合垫上；

(2)制备层析膜：在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷PCT包被抗体制备检测线，在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷涂羊抗鼠IgG双抗制备质控线；检测线与质控线平行且相距5毫米；

(3)试纸条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、层析膜及吸水垫，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧，得试剂条。

8.一种人绒毛膜促性腺激素检测试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上包被有由聚左旋多巴纳米颗粒标记的β-HCG单克隆抗体；所述聚左旋多巴纳米颗粒的制备方法包括：左旋多巴单体与金属离子络合剂混合后，在70～80℃条件下反应12～24小时制得；所述聚左旋多巴纳米颗粒的粒径为150～350nm。

9.如权利要求8所述的人绒毛膜促性腺激素检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备结合垫：首先采用左旋多巴单体与醋酸镍制备聚左旋多巴纳米颗粒，然后利用PBS缓冲溶液清洗聚左旋多巴纳米颗粒，并将体系pH调至7～8，利用EDC与NHS活化微球表面羧基，与β-HCG单克隆抗体偶联，再用酪蛋白溶液进行封闭处理制得聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体复合物；最后将聚左旋多巴纳米颗粒-β-HCG单克隆抗体复合物喷涂于预处理后的结合垫上；

(2)制备层析膜：在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷α-多克隆抗体制备检测线，在硝酸纤维素膜上采用1μL/cm的喷点量喷涂羊抗鼠IgG双抗制备质控线；检测线与质控线平行且相距5毫米；

(3)试纸条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、层析膜及吸水垫，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在层析膜的一侧，吸水垫部分搭接在层析膜的另一侧，得试剂条。