CN115389761A - 一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法，以胰岛素单克隆抗体以及鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，胰岛素单克隆抗体以及羊抗鸡IgY抗体混合作为荧光微球标记抗体，采用荧光免疫层析法，与目前常用的胰岛素检测法如：酶联免疫分析(ELISA)/放射免疫分析(RIA)相比，不仅大大缩短了检测时间、降低检测成本，还提高了检测灵敏度，与同类方法相比，具有标记过程简单、灵敏度搞、结果准确等优点，通过设计实验选定了合适的试纸制备用材，制备工艺简单，制备得到的试剂盒检测灵敏度高，结果准确且稳定，检测成本低，产品使用简便，制造成本低，适合量产。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断免疫层析领域，涉及一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血液中胰岛素含量。
背景技术
胰岛素(INS)，是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，能同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，外源性胰岛素主要用于糖尿病的治疗。血胰岛素水平的检测可评估胰岛功能，用于糖尿病的诊断及分型，也是胰岛细胞瘤诊断、疗效观察和预后判断的指标。
传统胰岛素含量的检测方法通常需要大型、昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，并且检测只能在实验室中进行，检测时间长，费时费力。
荧光免疫层析具有成本低、操作简单、快捷、方便携带等优点，是医学体外诊断领域重要的一部分，同时，鉴于评估胰岛功能，用于糖尿病的诊断及分型，因而开发一种高灵敏度、高精密度的INS免疫荧光定量检测试剂盒具有广阔的市场价值，市面上急需一种具有高灵敏度、高精密度以及操作简便的胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、准确性好的胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒。
本申请采用如下方案，一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，包括胰岛素检测卡、稀释液和芯片，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板和沿依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线；
检测线包被有INS单克隆抗体，包被浓度为1.0-1.2mg/ml；
质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为1.0mg/ml；
结合垫喷涂荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的标记抗体溶液具体为有荧光微球标记的INS单克隆抗体和含有荧光标记微球的羊抗鸡IgY抗体混合。
优选的，所述的荧光微球为长沙美牛羟基化粒径为300nm的时间分辨荧光微球。
优选的，标记抗体溶液喷量为4μL/cm。
优选的，包被液配方为：1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS。
优选的，荧光微球标记INS抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm的条件下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入INS抗体10μg后混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.进行离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
优选的，荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm的条件下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入羊抗鸡IgY抗体10μg后混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.进行离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
优选的，稀释液配方为：0.01M PBS pH7.4和0.05％的Proclin 300。
本发明的另一目的在于提供一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、准确性好的胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法。
本发明技术方案如下：一种上述的胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括采用以下步骤制备试纸条：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将INS单克隆抗体、鸡IgY抗体分别按1.0-1.2mg/ml和1.0mg/ml浓度配制包被工作液，按1.0-1.2mg/ml包被量用金标划线机将它们分别划到NC膜上，将NC膜放置在电热鼓风干燥箱中干燥16～24h；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照4μL/cm喷量，将其喷到结合垫后干燥；
步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试纸条。
优选的，样品垫处理液由以下组分配制：10mg抗人RBC抗体、20mg阻断剂001、10g牛血清白蛋白、5mlTween-20以及1000ml 0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液。
优选的，标记保存液由以下组分配制：20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素、海藻糖50g、0.5ml的Proclin 300以及0.02M pH为8.0的Tris缓冲液1000ml。
本试剂盒测定的原理：采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理。测试时，样品于稀释液混合均匀，并滴加到试纸条的加样孔中，在毛细作用下进行层析，样本中的胰岛素与荧光标记的胰岛素单克隆抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的胰岛素单克隆抗体捕获，并形成“抗体－抗原－荧光抗体”复合物；样本中的胰岛素浓度与复合物荧光强度成正比，根据芯片中的标准曲线，可以将样本中胰岛素的浓度计算出来。
本发明与现有技术相比，本申请有如下优点：
本申请提供的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，以胰岛素单克隆抗体以及鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用抗体，胰岛素单克隆抗体以及羊抗鸡IgY抗体混合作为荧光微球标记抗体，采用荧光免疫层析法，与目前常用的胰岛素检测法如：酶联免疫分析(ELISA)/放射免疫分析(RIA)相比，具有灵敏度高、检测时间短、操作简便、特异性强、准确性好的优点。并且检测的操作简单，成本较低，不局限于实验室，检测时间较短，在15分钟以内即可获取检测结果，方便快捷。
本申请提供的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，通过设计实验选定了合适的试纸制备用材，制备工艺简单，制备得到的试剂盒检测灵敏度高，结果准确且稳定，检测成本低，产品使用简便，制造成本低，适合量产。
附图说明
图1是本申请实施例中不同厂家抗体制备试剂盒T/C的比较图；
图2是本申请实施例中不同荧光微球制备试剂盒T/C的比较图；
图3是本申请实施例中不同包被液制备试剂盒T/C的比较图；
图4是本申请实施例中不同T线、C线包被浓度组合梯度比结果；
图5是本申请实施例中批号1试剂盒线性范围检测结果；
图6是本申请实施例中批号2试剂盒线性范围检测结果；
图7是本申请实施例中批号3试剂盒线性范围检测结果；
图8是本申请实施例中试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例说明本发明的具体技术方案
实施例1：
一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，包括胰岛素检测卡、稀释液和芯片，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板和沿依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线；
检测线包被有INS单克隆抗体，包被浓度为1.0-1.2mg/ml；
质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为1.0mg/ml；
所述结合垫喷涂荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的标记抗体溶液具体为有荧光微球标记的INS单克隆抗体和含有荧光标记微球的羊抗鸡IgY抗体混合。
实施例2：
一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括采用以下步骤制备试纸条：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将INS单克隆抗体、鸡IgY抗体分别按1.0-1.2mg/ml和1.0mg/ml浓度配制包被工作液，按1.0-1.2mg/ml包被量用金标划线机将它们分别划到NC膜上，将NC膜放置在电热鼓风干燥箱中干燥16～24h；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照4μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合点后干燥；
步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试纸条。
其中，荧光微球标记的INS单克隆抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.转速10000rpm下，离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入INS抗体10μg后混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
荧光标记微球的羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.转速10000rpm下，离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入羊抗鸡IgY抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.进行离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
荧光微球标记的标记抗体溶液具体为有荧光微球标记的INS抗体和含有荧光标记微球的羊抗鸡IgY抗体的1:1混合。
进一步地，本申请检测线的包被抗体以及标记抗体选择杭州隆基生物技术有限公司的INS抗体，做成的试纸条，线性梯度最优，且T/C精密性更好，检测线的包被抗体以及标记抗体选择过程如下：
实验设计方案：使用北京义翘神州生物技术有限公司、杭州隆基生物技术有限公司和上海领潮生物科技有限公司推荐的INS抗体的使用浓度结合免疫荧光法通常使用的浓度，用超纯水对INS抗体作适当的稀释后，用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。制作试纸条对企业参考品进行测试，以企业参考品为研究材料，以企业参考品的线性梯度和紫外分光法测定浓度来筛选最佳的检测线包被抗体、标记抗体。
实验方法包括以下步骤：
一.抗体浓度测定
使用超纯水对INS抗体作适当的稀释后，用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。
二.使用相同的荧光微球标记各厂家INS标记抗体，步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 0.2mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.进行离心30min(离心转速为10000rpm)；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
D.分别加入各厂家INS标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
G.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
三.制备结合垫
将步骤二制得荧光微球标记抗体溶液上样到喷金划线机中，按照4μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上，干燥过夜17h。
四.制备包被膜
将INS包被抗体按各厂家常用浓度制成包被液，用金标划线机将其划到NC膜上，将NC膜放置在电热鼓风干燥箱中干燥17h。
五.制备样品垫
设置浸纸压垫机轮轴高度，倒入样品垫处理液，处理好的样品垫放置于晾架上干燥过夜17h。
不同厂家抗体制备试剂盒性能比较检测结果如表1所示：
表1不同厂家抗体检测浓度(T线)
从上表1可以看出，紫外分光法测定各厂家抗体浓度基本符合标示的抗体浓度，相对偏差均不超过±10％，符合要求。
表2不同厂家抗体制备试剂盒性能比较(T线)
从图1和表2可以看出，不同厂家抗体制备试纸条测试企业参考品线性梯度差异较大(总梯度低至18.64，高至28.04)，其中厂家2＞厂家3＞厂家1。
表1的抗体检测浓度均符合要求，表2、图1的线性梯度差异较大(总梯度低至18.64，高至28.04)，厂家2相对最优，选择厂家2即杭州隆基生物有限公司的INS抗体对作为检测线的包被抗体和标记抗体。
进一步地，本申请的质控线包被抗体、标记抗体选择宁波迈跃的鸡IgY和羊抗鸡IgY抗体，质控线包被抗体、标记抗体的选择过程如下：使用上海领潮生物科技有限公司的鸡IgY和兔抗鸡IgY抗体、宁波迈跃生物技术股份有限公司的鸡IgY和羊抗鸡IgY抗体按通常使用的浓度，用超纯水对INS抗体作适当的稀释后，用紫外分光法测定OD260和OD280的吸光值，再计算蛋白浓度。然后制作试纸条对企业参考品进行测试，以企业参考品为研究材料，以企业参考品的线性梯度、精密性和紫外分光法测定浓度来筛选最佳的质控包被抗体、标记抗体。
实验方法步骤与检测线包被抗体、标记抗体实验过程相近
使用不同厂家质控线包被抗体制备得到的试纸条使用结果如下：
表3不同厂家抗体检测浓度(C线)
从上表3可以看出，紫外分光法测定各厂家抗体浓度基本符合标示的抗体浓度，相对偏差均不超过±10％，符合要求。
表4不同厂家抗体制备试纸条检测结果(C线)
表3的抗体检测浓度均符合要求，由表4可知，宁波迈跃(鸡IgY和羊抗鸡IgY)线性梯度45.16、T/C精密性均＜7％相对最优，选择宁波迈跃的鸡IgY和羊抗鸡IgY作为质控线包被抗体、标记抗体。
进一步地，本申请的荧光微球选择长沙美牛羟基化粒径为300nm时间分辨荧光微球作为标记用荧光微球，其制备成的试纸条线性梯度32.92，且T/C精密性均＜6％，性能最优，荧光微球的选择过程如下：对南京微测生物科技有限公司的Eu－荧光纳米微球粒径约200nm、300nm和长沙美牛的羟基化时间分辨荧光微球200nm、300nm四种测试粒径、荧光强度和PDI系数，然后将其依次标记抗体，制备结合垫做成试纸条，用企业参考品检测，
实验方法包括以下步骤：
一.四种荧光微球分别标记INS标记抗体、羊抗鸡IgY标记抗体，步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 0.2mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.进行离心30min(离心转速为10000rpm)；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
D.分别加入INS标记抗体10μg、羊抗鸡IgY标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
G.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
H.将标记后的INS标记物、羊抗鸡IgY标记物按体积比1:1混合均匀，超声充分，即为荧光微球标记抗体溶液。
二.制备结合垫
荧光微球标记抗体溶液上样到喷金划线机中，按照4μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上；干燥过夜18h。
将各种原料制备的实验材料组装成试纸条后，用企业参考品进行评估。
不同厂家荧光微球制备试纸条检测结果如下表5和图2所示：
表5不同厂家荧光微球制备试纸条检测结果浓度单位：(mIU/L)
从上表5可以看出长沙美牛300nm线性梯度32.92最优，且T/C精密性均＜6％。
从图2可以看出，不同荧光微球的线性趋势有一定的差异，长沙美牛300nm线性趋势相对最优。
结合表5以及图2可知，长沙美牛羟基化荧光微球300nm，线性梯度32.92，且T/C精密性均＜6％。性能最优，所以选定长沙美牛羟基化荧光微球300nm作为标记用荧光微球。
进一步地，样品稀释液配方选择为：0.01M PBS，pH7.4以及质量分数为0.05％的Proclin300，制成试剂条后，线性梯度好，检测精密度高。
进一步地，样品垫处理液体按1000ml配制：10mg抗人RBC抗体、20mg阻断剂001、10g牛血清白蛋白、5mlTween-20以及1000ml 0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液，此配方抗干扰能力强，样品垫处理液配方确定过程如下：以0.2M硼酸硼砂缓冲液(pH8.0)为缓冲体系，分析抗人RBC抗体对红细胞拦截效果和阻断剂001对特异性的影响，从而确定样品垫处理液的配方，使用如下表6配方表配制样品垫处理液：
表6样品垫处理1-4液配方表
表7样品垫处理液1-4测试全血样本的效果
表8四种样品垫处理液测试添加干扰物的参考品的效果
由表7可知，抗人RBC抗体用量为10mg、20mg的条件下均有效拦截红细胞；
由表8可知，阻断剂001用量为10mg时，测试添加干扰物的参考品出现T/C翻倍性增长，但比未处理的样品垫试纸条T/C明显的偏低，有一定的抗干扰能力；阻断剂00120mg测试添加干扰物的参考品和未添加干扰物的参考品T/C无明显差异，抗干扰能力较强
结合表7和表8可知，抗人RBC抗体用量为10mg、20mg的条件下均有效拦截红细胞，阻断剂001用量为20mg的条件下，测试添加干扰物的参考品和未添加干扰物的参考品T/C无明显差异，抗干扰能力较强，样品垫处理液2、样品垫处理液3均符合要求，综合成本因素，最终选择样品垫处理液3为样品垫处理液配方。
进一步地，包被液的配方为含1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS，使用该配方的包被液制成的试纸条，线性梯度高，包被液离子强度对检测结果基本没有影响，包被液的配方选择过程如下，包被缓冲液的pH值、离子强度等可影响单抗与NC膜的结合能力，我们参考相关文献对包被缓冲液的pH和离子强度进行了摸索，分别将包被抗体INS、鸡IgY用4种配方的包被液稀释至包被浓度，制成试剂条后，选择包被液为澄清液体、无晶体析出和线性梯度好的缓冲液作为包被液。
表9包被液配方表
| 类型 | 蔗糖(g) | 缓冲液 |
| 包被液1 | 1.00 | 0.01MpH7.4PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被液2 | 1.00 | 0.01MpH8.0PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被液3 | 1.00 | 0.02MpH7.4PBS缓冲液100mL溶解 |
| 包被液4 | 1.00 | 0.02MpH8.0PBS缓冲液100mL溶解 |
表10不同包被液保存状态
| 类型 | 外观 |
| 包被液1 | 溶液为澄清液体，保存14天无晶体析出 |
| 包被液2 | 溶液为澄清液体，保存14天无晶体析出 |
| 包被液3 | 溶液为澄清液体，保存14天无晶体析出 |
| 包被液4 | 溶液为澄清液体，保存14天无晶体析出 |
从表10可以看出1％蔗糖液体无明显晶体析出，溶液外观良好。
表11不同包被液制备试纸条检测结果
从表11可以看出，包被1线性梯度35.96，T/C精密性均＜6％。
从表10-11、图3可以看出，包被液pH值对线性梯度有较大影响，包被液pH为7.4时，线性梯度高，所以选定包被液的pH值为7.4；包被液离子强度对检测结果基本没有影响。综合考虑，选择含1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS作为包被液的最终配方。
进一步地，选择INS包被抗体浓度1.0mg/mL，鸡IgY包被抗体浓度1.0mg/mL为最终的T线、C线包被浓度，使用该包被浓度制造得的试纸条浓度梯度比64.16好，灵敏度较高、线性较好，且精密性均＜6％，检测线质控线包被浓度选择过程如下：分别将INS包被抗体稀释至0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL制成3种T线包被液，分别将鸡IgY包被抗体稀释至0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL制成3种C线包被液用金标划线机分别将其两辆组合后分别划到NC膜上，共存在9中组合，具体组合如下表12：
表12T线、C线包被浓度组合情况
表13不同T线、C线包被浓度组合T/C精密性结果
由表13和图4可知，组合5各企业参考品浓度梯度比64.16相对最好，灵敏度较高、线性较好，且精密性均＜6％。选择INS包被抗体浓度1.0mg/mL，鸡IgY包被抗体浓度1.0mg/mL为最终的T线、C线包被浓度。
进一步地，使用北京孚博生物科技有限公司的胰岛素抗原配制的参考品为企业参考品，制成的查参考品保存时间长稳定性好，可节约时间成本，参考品编号1～5用于评估胰岛素抗体等原料和试纸条的其它研发过程。
本申请提供的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒使用方法如下：
1.使用广州蓝勃AFS-1000干式荧光免疫分析仪，测试在10～30℃室温下进行。
2.打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；
3.用移液器吸取100μL样本，加入到稀释液中，上下颠倒混匀；
4.打开铝箔袋，取出检测卡，水平放置于桌面上；
5.用移液器吸取稀释后混匀的样本100μL，加入到检测卡的加样孔中；
6.在配套仪器上选择样本类型“血浆或血清”；
7.即时测试：待室温反应15min后，将检测卡放入仪器卡槽中，选择“即时测试”模式，点击“测试”；标准测试：将检测卡放入仪器卡槽中，选择“标准测试”模式，点击“测试”，仪器自动计时，计时结束后，自动测试并显示结果；
点击“打印”，可打印检测结果报告。
将实施例制备的试剂盒进行如下性能测试：
1.试纸条分析性能的最低检出限评估:
使用实施例中制备的试纸条，用0mIU/L INS参考品重复测定20次，其相对T/C平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对的数值，将其带入剂量-反应曲线或零浓度校准品与相邻校准品浓度的T/C值进行两点回归拟合得出的一次方程中，得出相应浓度值，即为产品的最低检出限。
按使用方法，使用该仪器用0mIU/L INS参考品重复测定20次；
检测结果如下：
表14检测结果(T/C)值
由表14试验数据可看出，三个批次的胰岛素(INS)测定试剂盒(荧光免疫层析法)的空白限结果分别为：0.53mIU/L、0.54mIU/L、0.49mIU/L均满足上述设计要求，故以不大于2.0mIU/L，作为本产品的最低检出限性能指标。
2.试剂盒分析性能的线性评估：
使用实施例中的试剂盒，对线性样本进行测试，按照《CLSI EP6-A定量检测方法的线性评价：统计方法》对测试数据进行统计分析，满足设计试验可接受标准，即作为INS试剂盒线性性能指标。
线性分析步骤如下：
A.线性样本的配制：
B.低浓度样本配制：收集浓度2.0mIU/L的人血清样本；
C.高浓度样本配制：将经过处理的阴性血清基质，添加适量的胰岛素抗原配制成浓度约为200mIU/L作为高浓度样本。
D.各浓度样本制备方法：
将高、低浓度样本按照表15混合成11个浓度，用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11表示每个浓度样本。
线性的建立：
取三批试剂分别对上述编号1～11的线性浓度样本进行测定，每份样本重复测定4次，按照以下公式(1)、(2)计算每份样本4次检测结果的平均值(M)与理论值之间的相对偏差(B)和线性相关系数(r)。
B＝(M-T)/T×100％....................(1)式中：
B——相对偏差；M——检测结果的平均值；T——理论值。
r——回归系数；Xi——理论浓度；Yi——理论浓度相对应的4次重复检测结果的均值；
i——1，2，3，……n。
线性的验证：
取三批试剂分别对浓度为1.98mIU/L、10mIU/L、50mIU/L、100mIU/L、160.15mIU/L的浓度点进行测定，每份样本重复测定3次，按照以下公式(2)计算每份样本3次检测结果的平均值(M)和线性相关系数(r)。
表15各样品浓度
表16批号1试纸条测试结果单位：mIU/L
表17批号2试纸条测试结果单位：mIU/L
表18批号3试纸条测试结果单位：mIU/L
由表16-18可知，线性样本10(180.20mIU/L)和线性样本11(200.00mIU/L)的测试结果均值的相对偏差都超过15％，不符合要求，排除这两个浓度点；由图5-图7可知，三批试剂呈线性关系，在[2，160]mIU/L线性范围内，相关系数r分别为0.9983、0.9973、0.9965。由此可知，线性样本1～线性样本9的测试结果同时满足上述接受条件，即本测定试剂线性范围确定为[2，160]mIU/L。
表19批号1试纸条相关系数单位：mIU/L
表20批号2试纸条相关系数单位：mIU/L
表21批号3试纸条相关系数单位：mIU/L
由表19-21可知，在[2，160]mIU/L范围内，三个批次的胰岛素(INS)测定试纸条(荧光免疫层析法)的相关系数(r)测试结果均大于0.9900。
由上述数据表明，线性建立和验证均满足上述设计要求，故以在[2，160]mIU/L范围内，线性回归的相关系数r≥0.9900，作为本产品的线性性能指标。
3.试纸条分析性能的准确度评估：
使用实施例中制备得到的批号分别为批号1、批号2、批号3的试纸条，根据设定的可接受标准，按照技术要求的检测方法测试试纸条的准确度。
表22实验用材料
对准确度参考品的检测，步骤如下：
测定胰岛素企业参考品约为10.02mIU/L、100.10mIU/L，按照说明书中的步骤进行检测，各重复测量3次后，其平均值结果记为M，计算其实测值的均值与理论值之比。
B＝M/T..................................(1)
式中：B—比值；M—测量浓度的均值；T—理论浓度。
检测结果如下：
表23准确度测试结果
由表23可知，准确度均满足上述设计要求，故以测值的均值与理论值之比0.85～1.15之间，作为本产品的准确度性能指标。
4.试纸条分析性能的精密度评估：
使用实施例中制备得到的批号分别为批号1、批号2、批号3的试纸条，对重复性参考品进行测试，按照《CLSI EP5-A2文件《定量测量方法的精密度性能评价—批准指南第二版》对测试数据进行统计分析，设计可接受标准，按照技术要求的检测方法对重复性参考品进行验证，满足可接受标准，即作为INS试纸条分析内精密度和批间精密度性能指标。
表24实验用材
主要分析步骤：取质检合格的三批本试纸条，由同一个操作者在同一台仪器上检测浓度为10.02mIU/L和100.10mIU/L的INS企业参考品，每个样本重复测定2次，共检测20天。评估结束时共有60对，即120个测试结果。从每批次测量中40次数据计算出批内精密度。从所有120个数据计算出批间精密度。
检测结果如下：
表25分析内精密度检测数据结果浓度单位为mIU/L
表26批间精密度检测数据结果浓度单位为mIU/L
表27精密度分析结果汇总表
由表25-27可知，三个批次胰岛素(INS)测定试纸条(荧光免疫层析法)的批内变异系数(CV)检测结果均≤15％。批间变异系数(CV)均≤20％，精密度均满足上述设计要求，故以批内变异系数(CV)应≤15％；批间变异系数(CV)应≤20％，作为本产品的精密度性能指标。
5.试纸条分析性能的分析特异性评估：
使用实施例中制备得到的批号分别为批号1、批号2、批号3的试纸条，参考《CLSIEP7-A2临床生化干扰测试；批准指南-第二版》制定实验，对测试结果进行统计分析，满足设计试验可接受标准，即作为INS分析特异性性能指标。
表28实验用材
实验步骤：
A.交叉样本制备及储存方法：
胰岛素原(Pro-Insulin)：用阴性血清基质将购自于广州核源生物科技有限公司的胰岛素原稀释至10ng/mL；
C肽(C-Peptide)：用阴性血清基质将购自于广州核源生物科技有限公司的C肽稀释至20ng/mL，分别分装后，封口储存于-20℃。
B.内外源性干扰物质样本制备及储存方法：
内源性干扰测试样本的配制：
在血清样本中分别加入胆红素，使其终浓度为7.5mg/dL、15mg/dL、30mg/dL、60mg/dL；加入甘油三酯，使其终浓度为250mg/dL、500mg/dL、1000mg/dL、2000mg/dL；加入抗坏血酸，使其终浓度为125mg/dL、250mg/dL、500mg/dL、1000mg/dL；且INS终浓度为10mIU/L和100mIU/L。
外源性干扰测试样本的配制：
用血清收集管、快速血清收集管、肝素锂抗凝管、EDTA-K2抗凝管、柠檬酸钠抗凝管收集健康志愿者血液，分别加入INS至终浓度10mIU/L和100mIU/L,分装，封口储存于-20℃。
检测方法如下：
a.检测浓度为10ng/mL的胰岛素原(Pro-Insulin)、20ng/mL的C-肽(C-Peptide)的特异性参考品，各重复3次，得出与本试剂的交叉反应值。
b.对配制好的内源性干扰物质和外源性干扰物质进行检测，每种干扰物浓度重复测试3次，计算测试浓度相对偏差(％)。
检测结果如下：
表29各批号交叉反应测试结果
通过表29可知，三个批次的胰岛素(INS)测定试纸条(荧光免疫层析法)与10ng/mL的胰岛素原(Pro-Insulin)、20ng/mL的C-肽(C-Peptide)的交叉反应值均不高于2.0mIU/L。
表30内源性干扰物质胆红素试验测试结果。
表31内源性干扰物质甘油三酯试验测试结果
表32内源性干扰物质抗坏血酸试验测试结果
由表30-32可知，三个批次的胰岛素(INS)测定试纸条(荧光免疫层析法)测试样本中的胆红素≤30mg/dL、抗坏血酸≤500mg/dL、甘油三酯≤1000mg/dL，准确度偏差均≤±15％。
表33外源性干扰物质血清试验测试结果
表34外源性干扰物质血浆试验测试结果
由表33-34可知，三个批次的胰岛素(INS)测定试纸条(荧光免疫层析法)测试用血清收集管、快速血清收集管、肝素锂抗凝管、EDTA-K2抗凝管、柠檬酸钠抗凝管收集的样本，相对偏差均不超过±15％。
由上表29-34可知：在胆红素≤30mg/dL、抗坏血酸≤500mg/dL、甘油三酯≤1000mg/dL、和用血清收集管、快速血清收集管、肝素锂抗凝管、EDTA-K2抗凝管、柠檬酸钠抗凝管收集的样本对测试结果均无影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，包括胰岛素检测卡、稀释液和芯片，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板和沿依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，其特征在于：
检测线包被有INS单克隆抗体，包被浓度为1.0-1.2mg/ml；
质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为1.0mg/ml；
所述结合垫喷涂荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的标记抗体溶液具体为有荧光微球标记的INS抗体和含有荧光标记微球的羊抗鸡IgY抗体混合。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述的荧光微球为长沙美牛羟基化粒径为300nm的时间分辨荧光微球。
3.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，标记抗体溶液喷量为4μL/cm。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，包被液配方为：1％蔗糖pH7.4的0.01M PBS。
5.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，荧光微球标记INS抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm的条件下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入INS标记抗体10μg后混匀，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.进行离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
6.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，荧光标记微球羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
A.取2ml离心管加入标记缓冲液MES 0.2ml；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm的条件下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液200μL后超声振荡；
D.加入羊抗鸡IgY抗体10μg后混匀，旋转混匀反应30min；
E.标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.进行离心30min；弃去上清液，加入标记保存液0.2ml超声；
G.将标记物移入新的用0.8ml标记保存液清洗过的2ml离心管中，涡旋混匀。
7.根据权利要求1所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，稀释液配方为：0.01M PBS pH7.4和0.05％的Proclin 300。
8.一种如权利要求1-7任意一项所述的胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括采用以下步骤制备试纸条：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将INS单克隆抗体、鸡IgY抗体分别按1.0-1.2mg/ml和1.0mg/ml浓度配制包被工作液，按1.0-1.2mg/ml包被量用金标划线机将它们分别划到NC膜上，将NC膜放置在电热鼓风干燥箱中干燥16～24h；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照4μL/cm喷量，将其喷到结合垫后干燥；
步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试纸条。
9.根据权利要求8所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，样品垫处理液由以下组分配制：10mg抗人RBC抗体、20mg阻断剂001、10g牛血清白蛋白、5mlTween-20以及1000ml 0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液。
10.根据权利要求8所述的一种胰岛素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，标记保存液由以下组分配制：20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素、海藻糖50g、0.5ml的Proclin 300以及0.02M pH为8.0的Tris缓冲液1000ml。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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