CN119375492A - Hnl在制备用于鉴定血流感染的试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明HNL在制备用于鉴定血流感染的试剂中的用途，属于精准医疗领域，提供了HNL在用于诊断患者是否存在血流感染的检测试剂盒中的用途，所述患者为慢性乙型肝炎肝硬化，所述检测试剂盒通过检测取自所述患者的血液、血浆或血清样品中HNL含量水平是否超出设定的cut‑off值来诊断是否存在细菌性血流感染；本发明意外的通过HNL实现了对于合并特种原发疾病慢性乙肝肝硬化的细菌性血流感染诊断，并且诊断结果灵敏度90.6%和特异性100%均处于优异水平，具有较大的临床价值和产业化前景。

Description

HNL在制备用于鉴定血流感染的试剂中的用途

技术领域

本发明涉及精准医疗领域，具体涉及疾病诊断生物标志物领域，特别涉及HNL在制备用于鉴定血流感染的试剂中的用途。

背景技术

人中性粒细胞载脂蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL），是储存在中性粒细胞二级颗粒中的一种分泌型糖蛋白，而且是中性粒细胞二级颗粒的主要成分。在细菌性感染的检测领域，行业内所述的HNL通常特指HNL的45-KD同源二聚体，本发明中也遵从这一行业习惯，即本发明中的HNL特指HNL45-KD同源二聚体。由于参与急性细菌感染过程的中性粒细胞特异分泌HNL45-KD同源二聚体，因此对诊断细菌感染有较高的灵敏性和特异性。此外，广泛应用于临床HNL的25-KD单体形式称为NGAL，主要由肾小管上皮细胞产生，当肾脏发生损伤或病变时，肾小管上皮细胞大量释放NGAL到尿液或血液，使之成为早期且敏感的肾损伤标志物，进而可以通过检测尿液或血液中NGAL的含量来辅助判断肾脏的损伤或病变与否和病情进展。NGAL该单体形式还能够与肿瘤患者中高表达的MMP-9聚合形成135-KD异源二聚体，因此，也有部分研究通过检测分析这一异源二聚体的含量变化来辅助判断和监控患者肿瘤疾病的进展。

当人外周血中性粒细胞受到刺激而活化时，HNL可由细胞内释放到细胞外。当发生急性细菌感染时，血液中HNL的浓度可在1-2小时内明显升高。HNL可进一步诱导白细胞内颗粒释放，趋化炎症细胞聚集，消灭病原微生物，在炎症损伤中表现为抗炎抑菌作用。

鉴于HNL的作用机制，HNL已经被开发为如败血症、炎症等诊断的生物标志物。其通过检测个体的血清等样品中HNL的含量水平，并将之与正常人的HNL含量水平相比较，来诊断相应病症。

如公开号WO9529404A1的PCT国际专利申请即提供了HNL作为生物标志物诊断人类炎症特别是细菌感染引起的炎症中的用途。WO9529404A1中进一步披露了健康人血清中HNL水平为37.95-190.87 μg/L，为了区分病毒感染和细菌感染患者设置了3个临界值190μg/L、155 μg/L和100μg/L。其中，以临界值设定为155 μg/L时，灵敏度和特异性均相对能够接受。

S.Y.Xu等（S.Y.Xu et al. The development of an assay for humanneutrophit lipocalin(HNL) to be used as a specific marker of neutrophilactivity in vivo and vitro. Journal of Immunological Methods 171(1994)245-252）也建立了一种以RIA法测定生物标志物HNL含量的方法，其公开了健康人血清和血浆中HNL水平为37.95-190.87 μg/L（平均水平78.4 μg/L），其中血浆中HNL水平为30.51-105.8μg/L（平均水平50.65 μg/L），血清中的HNL含量水平显著高于血浆。

在前述文献披露研究的基础上，中国已经核准上市了HNL检测的医疗器械产品，例如吉械注准20162400304，其主要的预期用途涉及辅助细菌感染或脓毒血症的早期诊断、细菌感染与病毒感染的鉴别诊断等临床应用，产品说明书中记载了用于诊断的正常参考值为≤115.55 ng/mL。

然而，到目前为止，对于HNL的检测及诊断应用仍以健康人的含量水平为基准参考。究其原因，仍不清楚原发性疾病的存在是否影响以及如何影响HNL的浓度。相关的原发疾病可能额外增加免疫系统的负担，而不同的原发疾病种类对于免疫系统的负担影响不同。因此此时，与不存在相关原发疾病患者群体细菌感染后的HNL含量水平相比，存在相关原发疾病的患者群体在细菌感染后，其HNL含量的平均水平有可能整体升高，有可能整体下降，亦有可能呈现无规律的、不稳定的部分患者升高、部分患者下降、部分患者保持与不存在相关原发疾病患者群体细菌感染后相当的HNL含量水平。因此，在如此复杂的影响情况下，如果仍然按照健康人群的cut-off值标准进行细菌感染与否的诊断，就极大可能出现诊断“假阴”或者“假阳”的诊断结果。更有甚者，此类患者中，HNL浓度极度不恒定，以至于无法在此类患者中应用。比较典型的例子是合并血液病的患者，由于血液中的HNL是由中性粒细胞分泌，HNL含量的高低直接与中性粒细胞的数量相关，此类原发疾病会导致中性粒细胞的数量极度异常，严重影响HNL的血液浓度。因此，诸如吉械注准20162400304等已经获批上市的诊断试剂盒的使用说明书中也都有“中性粒细胞减少症合并感染时，HNL因释放减少而不增高或仅轻度增高”的类似提醒记载，以明确该上市HNL检测试剂盒对于合并原发疾病的细菌感染诊断时的局限性。这也进一步反应了对于合并存在原发疾病的患者人群使用HNL作为生物标志物诊断细菌感染的复杂性和不可预期性。

肝硬化患者的肝脏受到了不同程度的损伤且存在与之相关的免疫缺陷，这与患者网状内皮系统严重受损、补体系统缺陷、T淋巴细胞和B淋巴细胞缺陷、免疫球蛋白和巨噬细胞吞噬功能缺陷等因素有关。肝硬化患者存在的免疫缺陷，易因为各种病原体进入机体血液系统引发粒细胞减少，免疫力降低等全身炎症反应。而一旦发生细菌的血流感染，细菌在血液中持续繁殖，产生大量毒素，造成广泛的组织损害，严重者威胁患者生命。

几乎所有肝硬化患者都伴随着白细胞减少，这进一步严重影响到HNL的血液浓度变化，继而影响此类合并原发疾病肝硬化患者采用HNL作为生物标志物进行血流感染与否的诊断准确性。具体的示例是，在本发明的前期研究中，以药监局批准上市的HNL检测试剂盒（吉械注准20162400304）诊断肝硬化患者是否存在细菌性血流感染。按照该试剂盒说明书提供的cut-off值115.55 ng/ml作为临界值诊断，灵敏性极差，几乎86%以上肝硬化血流感染患者都“假阴”被误诊为非感染人群。

然而，不止如此，对于合并肝硬化原始疾病的患者，以HNL作为生物标志物进行血流感染的诊断，还面临着更大的挑战。正如前文所述，不存在相关原发疾病肝硬化患者群体细菌感染后的HNL含量水平相比，存在原发疾病肝硬化的患者群体在细菌感染后，其HNL含量的平均水平有可能整体升高，有可能整体下降，亦有可能呈现无规律的、不稳定的部分患者升高、部分患者下降、部分患者保持与不存在相关原发疾病肝硬化患者群体细菌感染后相当的HNL含量水平。基于此，鉴于合并肝硬化患者人群细菌性血流感染后整体HNL含量水平的变化不确定性，想要通过简单的调整cut-off值即适用合并肝硬化患者人群的血流感染诊断按照常规思路是不可行的、不可预期诊断效果的。

综合以上，如何在早期即高特异性、高灵敏度的诊断出合并肝硬化的患者是否存在血流感染，以便于更有针对性地进行抗生素等临床治疗，避免败血症性休克发生，这是非常迫切的临床需求。

发明内容

为了满足迫切的、未满足的临床需求，本发明提供了生物标志物HNL在特定合并原发疾病种类的患者人群中诊断是否存在细菌性血流感染的用途，特别指明的，该特定合并原发疾病的种类为慢性乙型肝炎肝硬化。在此基础上，本发明还相应提供了一系列的相关用途以及相应的HNL检测试剂盒。

本发明的第一个方面提供HNL或其特异性结合物在制备用于区分受试者是否存在细菌性血流感染的检测试剂中的用途，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者；所述检测试剂在检测反应中的cut-off值为50~59 ng/mL。

进一步地，其中，所述区分是通过检测取自所述受试者体液样本中的待测样品中HNL含量水平是否超出设定的cut-off值来诊断是否存在细菌性血流感染。

进一步地，其特征在于，所述检测的cut-off值为54~56ng/mL，优选的，为55ng/mL。

进一步地，所述的取自受试者的体液样本为血液、血清、血浆、优选为血清。

进一步地，所述特异性结合物为特异性结合HNL的抗体或抗体片段。

进一步地，所述检测试剂被用于检测方法为电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法；优选的，为ELISA法或胶体金免疫层析法。

本发明的第二个方面是提供HNL或其特异性结合物在制备用于判断受试者是否存在细菌性血流感染的细菌性血流感染严重程度的检测试剂中的用途，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者，所述检测试剂通过检测取自所述受试者体液样本中HNL含量水平超出设定的cut-off值的多少来判断细菌性血流感染严重程度，所述检测的cut-off值为50~59ng/mL。

进一步地，其特征在于，所述检测的cut-off值为54~56ng/mL，优选的为55ng/mL。

进一步地，所述的取自受试者的体液样本为血液、血清、血浆、优选为血清。

进一步地，所述特异性结合物为特异性结合HNL的抗体或抗体片段。

进一步地，所述检测试剂被用于检测方法为电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法；优选的，为ELISA法或胶体金免疫层析法。

本发明的第三个方面是提供HNL或其特异性结合物在制备用于评估受试者存在细菌性血流感染的抗生素治疗预后的检测试剂中的用途，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者，所述检测试剂通过在抗生素治疗前检测取自所述受试者体液样品中HNL含量水平超出设定的cut-off值来诊断存在细菌性血流感染，所述检测试剂盒的cut-off值为50~59ng/mL；并且所述检测试剂通过在抗生素治疗后再次检测取自所述受试者体液样品中HNL含量水平，并与该患者抗生素治疗前的HNL含量水平检测结果相比较来评估所施用抗生素的治疗预后。

进一步地，其特征在于，所述检测的cut-off值为54~56 ng/mL,优选为55ng/mL。

进一步地，所述的取自受试者的体液样本为血液、血清、血浆、优选为血清。

进一步地，所述特异性结合物为特异性结合HNL的抗体或抗体片段。

进一步地，所述检测试剂被用于检测方法为电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法；优选的，为ELISA法或胶体金免疫层析法。

本发明的第四个方面是提供一种HNL检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含特异性结合HNL的结合物、标准品以及缓冲液，以及警戒线标记，所述警戒线标记包括对应于样品HNL含量为 cut-off值时的检测结果样式；所述警戒线标记还包含对应于样品HNL含量大于50~59ng/mL时的检测结果的突出醒目标记。

进一步地，所述的试剂盒被用于检测方法为电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法；优选的，为ELISA法或胶体金免疫层析法；

进一步地，所述警戒线标记还包含对应于样品HNL含量大于54~56ng/mL时的检测结果的突出醒目标记。

进一步地，所述警戒线标记还包含对应于样品HNL含量大于55ng/mL时的检测结果的突出醒目标记。

本发明的有益效果包括：

本发明首次将HNL应用于区分慢性乙肝肝硬化的细菌性血流感染的检测和区分，为疾病的细分治疗和评估治疗效果提供了有效的支撑。具体的，所述检测试剂通过检测取自所述患者的血液、血浆或血清样品中HNL含量水平是否超出设定的cut-off值来诊断是否存在细菌性血流感染。本发明意外的通过HNL实现了对于合并特种原发疾病慢性乙肝肝硬化的细菌性血流感染诊断，并且诊断结果灵敏度90.6%和特异性100%均处于优异水平，具有较大的临床价值和产业化前景。

附图说明

图1示出了71例慢性乙肝肝硬化患者是否存在细菌性血流感染的数据分析曲线图，其中A为ROC曲线，B为数据分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的构思及产生的技术效果作进一步阐述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1 利用HNL水平检测非乙型肝炎肝硬化患者是否存在血流感染的试验

如无额外特别备注说明，本发明所述试验例中所用到的试剂药剂皆为普通市售产品。所使用仪器也为行业通用设备仪器。未列出的临床实验具体手段也均参考国家相关标准和行业通常做法进行。这些在本发明中不再一一详细赘述。

本发明所述试验例中所用到的HNL检测试剂盒可以通过普通市售渠道购买获得，例如可直接通过优博思（浙江）生物科技有限公司普通市售直接获取。本发明所述试验例中所用到的HNL检测试剂盒还可以采用行业内惯常的制备方法或参考相关披露的在先技术文献制备方法获取得到，例如可通过申请号为CN202310712274.2的中国发明专利申请中所记载的方法予以制备。在本发明所述试验例的具体实施时，其所用到的HNL检测试剂盒是通过优博思（浙江）生物科技有限公司普通市售获取得到的。

1. 试验对象：

随机选取重庆医科大学附属第二医院感染科的46例非乙型肝炎肝硬化患者（包括丙肝肝硬化，自免肝肝硬化以及酒精肝肝硬化患者）。

2. 试验方法：

1）以HNL检测试剂盒分别检测46例非乙型肝炎肝硬化患者的血清HNL含量水平。将HNL检测结果记录于下表1。

2）以诊断血流感染临床金标准血培养为手段(结合患者慢性肝病病史，症状，体征，及实验室检查例如乙丙肝病毒学标志物，自身免疫肝病标志物，血常规，c反应蛋白，降钙素原测试等)，辅助以影像学肝脏核磁共振及肝脏CT检查。并以多种临床常规手段，实验室检查例如肝肾功能，心肌标志物，脑损害标志物，血液培养，尿液培养及大便培养，对46例非乙型肝炎肝硬化患者病情情况进行临床确诊，确定其真实病情是否存在血流感染，并将临床确诊结果记录于下表1。

3）结合表1中各病例的常规手段临床确诊结果，对表1中展示的HNL检测浓度结果作统计学分析。

表1

3. 结果分析：

统计表1数据：

对于该特种合并原发病症非乙肝肝硬化患者，HNL检测结果甄别诊断血流感染和非血流感染的两组数据在统计学上没有显著差异。

而即便也以50 ng/mL设置为诊断阈值（cut-off值）。21例临床确诊血流感染的非乙肝肝硬化患者，HNL检测后正确诊断的仅为7例，计算灵敏度为33.3%。25例临床确诊非血流感染的非乙肝肝硬化患者，HNL检测后正确诊断的仅为19例，计算特异性为76%。其灵敏度和特异性，特别是灵敏度难以满足临床需求。

实施例2：利用HNL水平检测乙型肝炎肝硬化患者是否存在血流感染的试验

1. 试验对象

随机选取重庆医科大学附属第二医院感染科的71例慢性乙型肝炎肝硬化患者。

2. 试验方法及结果

1）以HNL检测试剂盒分别检测71例慢性乙型肝炎肝硬化患者的血清HNL含量水平。以HNL含量为55 ng/mL为诊断阈值。若检测结果显示个体样品中HNL含量大于上述诊断阈值，则标记为血流感染。若个体样品中HNL含量不大于上述诊断阈值，则标记为非血流感染。

将HNL检测结果以及以55 ng/mL为诊断阈值的诊断标记结果记录于下表2。

2）以诊断血流感染临床金标准血培养为手段(结合患者慢性肝病病史，症状，体征，及实验室检查例如乙丙肝病毒学标志物，自身免疫肝病标志物，血常规，c反应蛋白，降钙素原测试等)，辅助以影像学肝脏核磁共振及肝脏CT检查。并以多种临床常规手段，实验室检查例如肝肾功能，心肌标志物，脑损害标志物，血液培养，尿液培养及大便培养，对71例慢性乙型肝炎肝硬化患者病情情况进行临床确诊，确定其真实病情是否存在血流感染，并将临床确诊结果记录于下表2。

3）比较对比表2中展示的HNL检测试剂盒诊断标记结果与常规手段临床确诊结果差异，统计检测灵敏度和特异性。

表2

3. 结果分析

统计表2数据：

临床确诊32例慢性乙型肝炎肝硬化患者存在血流感染，其中HNL检测后正确诊断标记出29例；临床确诊39例慢性乙型肝炎肝硬化患者不存在血流感染（非血流感染），其中HNL检测后正确诊断标记出39例。

将表2的数据进行统计分析，得到图1A所示的结果，通过SPSS软件进行数据分析，用55 ng/mL作为诊断阈值（cut-off值）,可以很好的将慢性乙肝肝硬化的。采用本申请的试剂盒对于所有71例慢性乙型肝炎肝硬化患者，HNL检测后从中甄别诊断出血流感染的灵敏度和特异性分别为90.6％和100％，AUC为0.97（图1B），优于目前的方法。

由此，不同于非乙型肝炎肝硬化患者，对于该特种合并原发病症慢性乙型肝炎肝硬化患者人群，以HNL作为生物标志物，用于血流感染的甄别，其诊断检出效果是非常优异的，临床价值突出。

制备例：制备用于诊断慢性乙型肝炎肝硬化患者是否存在细菌性血流感染的HNL检测试剂盒

本制备例的HNL检测试剂盒的基础组成及结构可由行业内惯常的制备方法或参考相关披露的在先技术文献制备方法获取得到，例如可通过申请号为CN202310712274.2的中国发明专利申请中所记载的方法予以制备。

本制备例的HNL检测试剂盒可选采用的检测方法为电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法。通常优选的是ELISA法或胶体金免疫层析法。

特别的，本制备例的HNL检测试剂盒包含有参考cut-off值，cut-off值为55 ng/mL。

为了便于临床使用，可以进一步在本制备例的HNL检测试剂盒上设计HNL的慢性乙型肝炎肝硬化血流感染的警戒线标记，所述警戒线标记例如可以是对应于样品HNL含量为55 ng/mL时的检测结果样式。在另一个具体制备例中，所述警戒线标记还包含对应于样品HNL含量55 ng/mL时的检测结果的突出醒目标记。

本制备例的HNL检测试剂盒的另外的用途例如可以是用于判断存在细菌性血流感染的慢性乙型肝炎肝硬化患者的细菌性血流感染严重程度，该检测试剂盒通过检测取自所述患者的血液、血浆或血清样品中HNL含量水平超出设定的cut-off值的多少来判断细菌性血流感染严重程度。

本制备例的HNL检测试剂盒的另外的用途例如可以是用于评估存在细菌性血流感染的慢性乙型肝炎肝硬化患者的抗生素治疗预后，所述检测试剂盒通过在抗生素治疗前检测取自所述患者的血液、血浆或血清样品中HNL含量水平超出设定的cut-off值来诊断存在细菌性血流感染，所述检测试剂盒的cut-off值为55 ng/mL；并且所述检测试剂盒通过在抗生素治疗后再次检测取自所述患者的血液、血浆或血清样品中HNL含量水平，并与该患者抗生素治疗前的HNL含量水平检测结果相比较来评估所施用抗生素的治疗预后。

以上具体实施方式涉及的试验例和实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形及改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.HNL或其特异性结合物在制备用于区分受试者是否存在细菌性血流感染的检测试剂中的用途，其特征在于，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者；所述检测试剂在检测的cut-off值为50~59ng/mL。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述区分是通过检测取自所述受试者体液样本中的待测样品中HNL含量水平是否超出设定的cut-off值来诊断是否存在细菌性血流感染。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测的cut-off值为54~57 ng/mL。

4.HNL或其特异性结合物在制备用于判断受试者是否存在细菌性血流感染严重程度的检测试剂中的用途，其特征在于，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者，所述检测试剂通过检测取自所述受试者体液样本中HNL含量水平超出设定的cut-off值的多少来判断细菌性血流感染严重程度，所述检测的cut-off值为54~57 ng/mL。

5.HNL 或其特异性结合物在制备用于评估受试者存在细菌性血流感染的抗生素治疗预后的检测试剂中的用途，其特征在于，所述受试者为慢性乙型肝炎肝硬化患者，所述检测试剂通过在抗生素治疗前检测取自所述受试者体液样品中HNL含量水平超出设定的cut-off值来诊断存在细菌性血流感染，所述检测试剂盒的cut-off值为50~59 ng/mL；并且所述检测试剂通过在抗生素治疗后再次检测取自所述受试者体液样品中HNL含量水平，并与该患者抗生素治疗前的HNL含量水平检测结果相比较来评估所施用抗生素的治疗预后。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的cut-off值为54~56ng/mL。

7.根据权利要求1~6任一项所述的用途，其特征在于，所述的cut-off值为55ng/mL。

8.根据权利要求1~6任一所述的用途，其特征在于，所述特异性结合物为特异性结合HNL的抗体或抗体片段。

9.根据权利要求2，4~5任一所述的用途，其特征在于，所述检测的体液样品取自所述受试者的血清样品。

10.一种HNL检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含特异性结合HNL的结合物、标准品以及缓冲液，以及警戒线标记，所述警戒线标记包括对应于样品HNL含量为 cut-off值时的检测结果样式；所述警戒线标记还包含对应于样品HNL含量大于54~56ng/mL时的检测结果的突出醒目标记。